WO1994012658A1 - Process for producing foreign protein - Google Patents

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WO1994012658A1
WO1994012658A1 PCT/JP1993/001723 JP9301723W WO9412658A1 WO 1994012658 A1 WO1994012658 A1 WO 1994012658A1 JP 9301723 W JP9301723 W JP 9301723W WO 9412658 A1 WO9412658 A1 WO 9412658A1
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serum
cell
fusion
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Kiyoto Nishiyama
Yuji Ishikawa
Kazuhiko Kimachi
Hiroaki Maeda
Sachio Tokiyoshi
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Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a foreign protein, comprising efficiently expressing and recovering a foreign gene prepared by genetic recombination or the like. Specifically, a method for producing an exogenous protein of interest, especially a recombinant antibody, by serum-free culture using fusion cells obtained by fusing mouse myeloma and lymphoid cells as host cells About.
  • a fused cell cultivable in a medium (generally referred to as a hybrid cell, but a hybrid cell used as a host cell for expressing a foreign protein which is a feature of the present invention is referred to as a fused cell in the present specification) is used as a host cell.
  • a fused cell cultivable in a medium generally referred to as a hybrid cell, but a hybrid cell used as a host cell for expressing a foreign protein which is a feature of the present invention is referred to as a fused cell in the present specification
  • a host cell By expressing the antibody gene in the fused cells, it was found that the desired recombinant antibody was prepared extremely efficiently, and the present invention was completed.
  • mice myeloma Some methods for producing antibodies by genetic recombination using mouse myeloma cells have been reported to date. ⁇ The methods known so far use the parent strain (myeloma) for hybridoma production. They simply used it as a host cell, incorporated a foreign gene into it, and expressed antibodies. However, when such a mouse myeloma itself is used as a host cell for expressing a foreign gene, it is difficult to prepare a cell suitable for culturing in a serum-free medium, and it is difficult to prepare a serum-supplemented medium. It was considered extremely difficult to prepare host cells that could grow equally and had stable gene expression efficiency.
  • a typical mouse myeoma cell line is the P3X63Ag8.653 strain.
  • This cell line is a host for gene expression that is excellent in terms of exogenous gene transfer and high expression efficiency.
  • adaptation of the P3X63 Ag8.653 strain to a serum-free medium was not easy, and the growth was variable depending on the transformant, and it did not grow in a serum-free medium but only in a serum-supplemented medium. I could not grow.
  • these cells themselves show cholesterol-dependent nutritional requirements, and it is necessary to add LDL, YLP (yolk lipopin tin), ribosomes, etc. to the medium for long-term passage.
  • LDL low lipopin tin
  • ribosomes etc.
  • the present inventors prepared a fused cell obtained by fusing such mouse myeloma and lymphoid cells and adapting to a cell that can be cultured in a serum-free medium, and using this as a host cell for expressing a foreign gene. It was also found that transduced cells that can efficiently express foreign genes and that can be cultured in a serum-free medium and that stably express the desired foreign genes can be prepared.
  • the lymphoid cells used for preparing such a fusion cell need to be cells having a property adaptable to serum-free culture after fusion.
  • myeloma cells Of the hybrid cells generally prepared for the production of monoclonal antibodies from cells and lymphoid cells, cells adapted or adaptable to serum-free culture are effectively used.
  • a cell suitable for a cell to be fused with mouse myeloma in the present invention includes a hybrid cell Sp20 cell (ATCC No. CRL 1581).
  • mouse myelose used for preparing the fused cells in the present invention Most preferred is mouse myeloma P3X63Ag8.653 strain (ATCC number CRL 1580).
  • the present inventors have conducted various studies on cell lines used for the preparation of fusion cells capable of efficiently expressing a recombinant antibody gene. It was confirmed that it was the best from the viewpoint of introducing
  • the method for producing a foreign gene using a fused cell cultivable in a serum-free medium obtained by fusing a mouse myeloma and a lymphoid cell of the present invention as a host for expressing a foreign gene is described in detail below.
  • the fused cells obtained by selection in a serum-free medium and a series of clonings are used.
  • a fusion cell capable of growing in a serum medium and capable of stably expressing an exogenous antibody gene is produced, and the fusion cell is used as a host cell.
  • the foreign protein prepared by the production method of the present invention includes, but is not particularly limited to, various useful proteins such as an antigen protein, a bioactive protein, and an enzyme.
  • the antibody is produced by gene recombination. Very useful in some cases.
  • Such antibodies are extremely suitable for the expression of various recombinant antibodies, such as chimeric antibodies and V region-modified antibodies [CDR-modified antibodies (reshaping antibodies)], and efficiently produce the desired recombinant antibodies.
  • FIG. 1 shows the structure of an IgG-L chain expression vector as an example of a foreign gene used in a gene transfer test.
  • FIG. 2 shows the structure of the IgG-H chain expression vector used for transformation in Example 4.
  • FIG. 3 shows the structure of an IgG-L chain expression vector used for transformation in Example 4.
  • Figure 4 shows the growth and expression levels of the transformants established using the fused cells in serum-free culture.
  • the basic composition of a medium used for suspension culture of mammalian cells is a RPM 1-16-1 medium containing 10% fetal bovine serum, for example.
  • the fused cells produced in the present invention have the same cell growth and recombinant antibody producing ability in a serum-free medium as shown below in a serum-free medium having a low total protein content.
  • Ham F12 medium Dulbecco's modified MEM medium: RPMI 1640 medium mixed at a ratio of 1: 1: 2 or 2: 1: 1 is used as a basal medium. Add the ones from Table 1 above. table 1
  • lymphoid cells used in the present invention normal lymphoid cells obtained from peripheral blood lymphocytes, lymph nodes, spleen, etc. can be used, but lymphoid hybrid cells typified by Sp20 are effective. It is commonly used.
  • Cell fusion is performed using such a lymphoid cell and mouse myeloma (preferably P3X63Ag8. 653) in the presence of a cell fusion agent (such as polyethylene glycol) at room temperature.
  • the cell fusion method is performed by a general method. For example, 1 or 10 10 7 ? 3 63 eight 2 8.
  • lm RPM RPMI 1640 medium was added dropwise over 1 minute, lm 1 medium was added again over 1 minute, and then PEG (polyethylene glycol) was diluted with 8 ml 1 RPMI 1640 medium. Collect cells by centrifugation at 1200 rpm for 0 min. After cell fusion, the cells were cultured in a serum-free medium containing 1% fetal bovine serum for about one week, and then cultured in the complete serum-free medium described above. The unfused P3.653 strain gradually died. Eventually, the fused cells continue to proliferate without dying.
  • a fused cell capable of growing in a serum-free medium is easily obtained, and the antibody in the culture supernatant can be obtained by a suitable assay such as EIA using an antibody labeled with a radioisotope or an enzyme-labeled antibody.
  • the method can be used for screening. Since the present invention aims to express a foreign gene, particularly a recombinant antibody gene, a fusion cell that does not secrete a host-derived antibody is selected from the fusion cells that can grow in this serum-free medium. Screening can be carried out by the screening method described above, but whether it is suitable as a recombinant host can be confirmed by conducting the following gene transfer test.
  • the cells are fused by the usual method, suspended in a serum-free medium, inoculated into a 24-well culture plate, and replaced with a fresh serum-free medium every three days, and the culture is continued for about 2 months. In the meantime, after the fusion, a part of the culture supernatant is collected on the 3rd, 14th and 21st days, and the antibody production is examined by EIA or the like. After about 10, after obtaining a pool of fused cells that can be grown in serum-free medium, select well-growing cells and perform cloning by limiting dilution in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum. . Select a single clone cell from the 96-well plate and expand to a 24-well plate.
  • an appropriate expression plasmid vector for example, a plasmid vector that expresses the L chain of the antibody, Fig. 1
  • an appropriate gene transfer agent DEAE dextran, calcium phosphate, ribofuctin, etc.
  • the total volume is 0.3 ml.
  • a foreign gene was introduced into the mouse myeloma from the beginning, and the resulting recombinant was used to transform normal lymphoid cells or other hybrid cells. It is possible to produce a recombinant which can be propagated in a serum-free medium, which is the object of the present invention, even if it is fused. That is, the introduction of a foreign gene can be performed before or after the step of obtaining a fused cell.
  • the foreign gene was introduced prior to cell fusion, selection was performed in a serum-free medium to kill mouse myeloma (eg, P3X63 Ag8.653) -derived cells, followed by 1% fetal calf serum.
  • the cells are cultured in a selection medium (containing MTX and G418) supplemented with to obtain antibody-producing cells.
  • the cells thus obtained can be gradually adapted to a serum-free medium.
  • a cell line such as Sp20 When a cell line such as Sp20 is used as a cell fusion partner, it is appropriate to introduce a G418 resistance gene expression unit or the like into the mouse myeloma P3X63Ag8.653 in advance as a fusion selection marker. Fusion cells can be easily selected by culturing in a selection medium. When these gene transfer agents were used, it was confirmed that mouse Mye ichima P 3X63 Ag8.653 efficiently incorporated foreign genes, but Sp 2Z0 cells themselves hardly incorporated foreign genes.
  • the ability of gene transfer as a host cell is an important requirement in addition to good transformation efficiency and the possibility of serum-free culture, as well as the ability to produce large amounts of the desired gene product. Therefore, it is important to test the expression ability of the host cell in advance, and select the cell with the highest expression ability as the host. Should.
  • the expression ability of the cells is assayed by introducing the appropriate gene and transforming the cells, and then measuring the amount of the transformants expressed on the culture supernatant, on the cell surface or in the cells.
  • Table 2 shows that 26 fusion cells and their parental strains (P3X63Ag8.653 and Sp2 / 0) were transformed with plasmids as shown in Figure 2 and Figure 3, selected by G418, and cultured.
  • Disadvantages of gene amplification are, first of all, time-consuming to expand, and generally require several months to obtain high-expressing strains.
  • the second is the problem of the stability of the amplified gene. If cultivation is performed without adding a selection reagent such as MTX or MSX, the gene may drop out and the production may decrease to the same level as before amplification. is there. Therefore, the ability to add these selective reagents during the culture period or a stable cell line had to be cloned.
  • transformed cells using the fusion cell line established according to the present invention already had the same expression ability as the above-mentioned cell line without gene amplification.
  • the present inventors have heretofore P3-X63Ag8. 653 and although S P 2/0 cells were revealed originating antibody genes, Ri less der even if several pg / cells day as it has a high expression ability, gene amplification There was no example in which a high yield was given as in the fusion cell created this time, and such a high yield was first achieved using this fusion cell. Therefore, if transformation is performed using this fused cell, an expression cell with a high production amount can be easily obtained without performing gene amplification.
  • these cells can be used to amplify genes using reagents such as MTX and MSX to further increase expression products.
  • reagents such as MTX and MSX to further increase expression products.
  • the spleen was removed from non-immunized mice, and the spleen cells were aseptically suspended in 10 mL of serum-free RPMI 1640 medium containing no serum. This was transferred to a centrifuge tube to precipitate connective tissue and the like, and the cell suspension of the supernatant was collected. To this splenocyte centrifugal sediment was added 0.5 mL of a growth medium containing fetal bovine serum, and then 10 mL of a 10-diluted medium was quickly suspended in a pipette. Erythrocyte removal was performed by hypotonic treatment for 20 seconds. After hypotonic treatment, immediately add 1 OmL of 2x concentrated medium, well suspend cells in a well, and further add growth medium.
  • a transformant previously prepared by introducing an antibody gene expression vector containing the DHFR gene expression unit and the G418 resistance gene expression unit into the P3X63 Ag8.653 strain, and the Sp2Z0 strain (ATCC No. 1581) Were fused in a serum-free medium, and cultured in the above-mentioned serum-free medium containing MTX (metretrexate). After about 2 weeks, a peroxidase-labeled anti-IgG antibody was used. The antibody in the culture supernatant was examined by the EIA method. As a result, non-fused transformants could not grow in serum-free medium and died.
  • the sp20 strain that did not fuse was unable to grow in a serum-free medium containing MTX and G418 and died.
  • the fused cells survived in a serum-free medium containing MTX, and as a result, the target antibody A clone expressing a large amount of was obtained very efficiently.
  • the fused cells had to be cultured in a selective medium such as a HAT medium, which required a long time for cloning.
  • the target clone was obtained in a short time.
  • the mouse hybridoma Sp2 / 0 strain readily adapts to serum-free media, allowing for serum-free culture at the production level.
  • the Sp20 strain since the Sp20 strain is non-secretory, it has both characteristics of growth of Sp2 / 0 and high gene transfer rate and high expression efficiency of P3X63Ag8.653 by fusion with P3X63Ag8.653. There is a host for foreign gene transfer.
  • culture was performed for about 2 months in a 24-well plate of a serum-free medium while changing the medium.
  • a well-growing pool was selected and cloned in RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum.
  • a well of a single clone of the fused cells was selected from the 96-well plate, and the cells were expanded to a 24-well plate.
  • serum-free medium containing 5% fetal calf serum
  • the medium was replaced with a complete serum-free medium.
  • the cell number of the obtained fused cell clone was counted, and a gene transfer test was performed using lipofectin.
  • FIGS. 2 and 3 show the structure of the expression vector encoding the recombinant antibody H and L chains.
  • introduction of these two types of expressed genes was attempted into the cell of clone number 34. That was transflector
  • BRL Lipofectin
  • transformants were selected on RPMI1640 medium containing lmg / ml G418, 0.25x10- ? M MTX, and 5% fetal bovine serum. After selection, the transformed cells were cloned by the limiting dilution method to obtain antibody-producing cells (designated "83-2-10").
  • Example 4 The 83-2-10 cells obtained in Example 4 were subjected to large-scale culture at 600 liters in a serum-free medium.
  • FIG. 4 shows the growth curve of the cells and the change in the amount of antibody expressed in the culture supernatant. This cell grew well even in serum-free medium, the highest reaching cell density of 1. 45xl0 6 cells / ml. In addition, 1 said that the amount of antibody produced per cell was 20 pg / cells day.
  • Example 6 The expression vector encoding the H chain and L chain of the c- recombinant antibody, which was examined for the gene amplification ability of the expression cells using the fusion cells obtained above, was cloned from the fusion cells obtained in Example 3. No. 34 cells were introduced. That is, the antibody H chain gene pSV2 neo, also the antibody L chain gene into pSV2-dhfr, expression Burasumi de 1 0 g incorporating, Lipo: fectin (BRL) 5 0 I and mix 1 0 6 The cells were transfused. Lmg / ml G418 than 3 days, were selected transformants RPMI1640 medium containing 0. 25xlO- 7 M MTX, 5% fetal bovine serum. After the selection, the transformed cells were cloned by the limiting dilution method to obtain antibody-producing cells SP119-2, 3, 7, 10, 15 and 16.
  • clone number 34 cells are cells that can be used sufficiently for gene amplification.
  • the production method of the present invention when a foreign gene, particularly a recombinant antibody gene is expressed, it becomes possible to stably produce a large amount of a desired recombinant antibody or the like in a serum-free medium by serum-free culture, Purification of the desired foreign protein becomes extremely easy, providing an unprecedented method for producing a foreign protein.

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Description

明 細 書 外来蛋白質の産生方法 技術分野
本発明は、 遺伝子組換え等により調製される外来遺伝子を効率よく発現 させ、 回収することからなる外来蛋白質の産生方法に関する。 詳細には、 マウスミエローマとリンパ系細胞とを融合して得られる融合細胞を発現宿 主細胞として用い、 無血清培養により目的の外来蛋白質、 特に組換え抗体 を産生させる優れた外来蛋白質の産生方法に関する。
発明の背景
近年の細胞融合技術の発展によってモノクローナル抗体の産業上の利用 が期待されている。 しかしマウス型の抗体以外の異種の抗体はマウス、 ラッ ト等のげつ歯類のミエローマ細胞株と異種細胞を用いた融合では、 雑種細 胞 （ハイプリ ドーマ） において該当する異種の抗体の染色体が急速に消失 する現象がみられ、 安定な抗体産生細胞を得ることは極めて困難であつた。 さらに、 げっ歯類以外の同種のミエローマ細胞株や B細胞株を用いた細胞 融合も試みられているが満足する結果は得られていない。
一方、 近年遺伝子組換え技術の発展に伴い、 遺伝子のクローニングが容 易となってきた。 抗体に関しても、 遺伝子レベルでの解析が進み、 抗体遣 伝子を単離することにより染色体レベルでの脱落を起こさずに適当な宿主 細胞でこれを発現させることが可能となった。 しかし抗体遺伝子の導入に より発現させる抗体の産生量は一般に細胞融合法で得られる雑種細胞のそ れよりも低く実用的ではなかった。 この問題を解決するために D H F R遺 伝子等を用いた遺伝子の増幅系等が用いられるが一般にマウス由来の細胞 系では D M ( D o u b l e M i n u t e s ) として宿主染色体に組み込 まれず外来性遺伝子は不安定であると言われている。 またマウス細胞を用 いた D H F R遺伝子増幅系に関するいくつかの報告はあるがその安定性に ついては触れられていない。
遺伝子組換えによる抗体産生技術に関しては、 工業的レベルにおいても 実用可能な発現系という観点から満足するものがなく、 組換え抗体遺伝子 の発現および精製の両面から組換え抗体の優れた産生方法の開発が望まれ ている。
発明の開示
このような状況の中で、 本発明者らは、 無血清培養を用いた組換え抗体 の産生方法という観点から、 鋭意研究を重ねた結果、 マウスミエローマと リンパ系細胞とから調製される無血清培地で培養可能な融合細胞 （一般に は雑種細胞とも呼べるが 本発明の特徴となる外来蛋白質の発現用宿主細 胞として用いられる雑種細胞を本明細書では融合細胞と呼ぶ） を宿主細胞 として用い、 該融合細胞内で抗体遺伝子を発現させることにより、 目的の 組換え抗体が極めて効率よく調製されることを見いだし本発明を完成する に至った。
マウスミエローマ細胞を利用した遺伝子組換えによる抗体の製造方法は、 これまでにも一部報告されているカ^ これまでに知られている方法は、 ハ イブリ ドーマ作製用の親株 （ミエローマ） をそのまま宿主細胞として用い、 これに外来遺伝子を組み込み、 抗体を発現させたに過ぎない。 しかし、 こ のようなマウスミエローマ自体を外来遺伝子の発現させるための宿主細胞 に用いた場合には、 特に無血清培地での培養に適した細胞を調製すること が困難であり、 血清添加培地と同等に増殖可能で、 かつ安定な遺伝子発現 効率を兼ね備えた宿主細胞を調製することは極めて困難と考えられた。 マウスミエ口一マ細胞の代表的なものとして、 P3X63Ag8. 65 3株が挙げられるが、 この細胞株は、 外来遺伝子導入のしゃすさと発現効 率の高さから優れた遺伝子発現の宿主である。 ところが上述した通り、 P 3X63 Ag 8. 653株の無血清培地への順化は容易ではなく形質転換 体によつて増殖性が様々であり、無血清培地では増殖せず血清添加培地中 でしか生育できなかった。 これまで発明者らが調べた結果によれば、 この 細胞自体はコレステロール依存性栄養要求を示し LDL、 YLP (卵黄リ ポプ口ティン） 、 リボソーム等の培地への添加が長期継代には必要である 力 この様にして培地中のコレステロール含量を高めた培地でも増殖は完 全に血清添加培地と同等ではなく、 それ以外の未知の因子が必要である。 これまでのところ該細胞の血清中の増殖因子については不明である。
そこで本発明者らは、 このようなマウスミエローマとリンパ系細胞とを 融合させ無血清培地で培養可能な細胞に順化した融合細胞を調製し、 これ を外来遺伝子の発現宿主細胞として用いたところ、 外来遺伝子も効率よく 発現し、 しかも無血清培地においても培養可能な、 目的の外来遺伝子を安 定に発現する形質導入細胞を調製できることを見いだした。 本発明におい て、 このような融合細胞を調製する際に用いられるリンパ系細胞は、 融合 した後に無血清培養に順応可能な性状を有した細胞であることが必要であ り、 例えば、 ミエローマ細胞とリンパ系細胞とから一般にモノクローナル 抗体産生用に調製される雑種細胞 （ハイプリ ドーマ） のうち、 無血清培養 に順化した細胞または順化可能な細胞が効果的に用いられる。 このような 雑種細胞のうち、 本発明の中でマウスミエローマと融合される細胞に適し た細胞としては、 雑種細胞 Sp2 0細胞 （ATCC番号 CRL 1581) が挙げられる。
また、 本発明における融合細胞の調製に用いられる上記マウスミエロー マの最も好ましいものとして、 マウスミエローマ P 3 X 63 A g 8. 65 3株 （ATCC番号 CRL 1580) が挙げられる。 本発明者らが、 組換 え抗体遺伝子を効率よく発現できる融合細胞の調製に用いられる細胞株に ついて種々検討を行った結果、 種々のマウスミエローマの中でも上記マウ スミエローマ P3X63Ag8. 653株が外来遺伝子の導入という観点 から最も優れていることが確認された。
さらに工業レベルでの外来蛋白質、 例えば組換え抗体の大量調製を実現 するためには、
(1)低コス卜で目的産物の精製が容易な無血清培地で増殖可能であるこ と。
(2) 目的産物を高産生できること。
(3)浮遊培養系でスケールアップが容易であること。
等の条件を満足しなければならな 、。
本発明のマウスミエローマとリンパ系細胞とを融合して得られる無血清 培地で培養可能な融合細胞を外来遺伝子の発現宿主として用いる外来遺伝 子の産生方法は、 マウスミエ口一マと （例えば、 P3X63Ag8. 65 3株） とリンパ系細胞とを混合し、 ポリエチレングリコール等の融合剤を 加えて細胞融合して得られた融合細胞を無血清培地中での選択と一連のク ローニングを行うことによって無血清培地中で生育可能かつ外来性の抗体 遺伝子を安定して発現させることのできる融合細胞を作出し、 該細胞を宿 主細胞として用いることを特徴とし、 この融合細胞を用いて目的の外来遺 伝子を発現せしめることにより、 所望の外来蛋白質を無血清培地中から回 収することが可能な優れた外来蛋白質の産生方法である。 このような本発 明の産生方法は、 上記のいずれの条件をも克服することが可能な産生方法 である。 本発明の産生方法により、 調製される外来蛋白質としては、 種々の有用 蛋白質、 例えば抗原蛋白質、 生理活性蛋白質および酵素等特に限定される ものではないが、 特に遣伝子組換えにより抗体を産生させる場合に於て極 めて有用である。 このような抗体は、 キメラ抗体、 V領域改変抗体 [ C D R改変抗体 （reshaping 抗体） ] 等の種々の遺伝子組換え抗体の発現に極 めて適しており、 目的の組換え抗体を効率よく産生することが可能である c 図面の簡単な説明
図 1は遺伝子導入試験に用いられる外来遺伝子の一例としての I g G— L鎖発現ベクターの構造を示す。
図 2は実施例 4で形質転換に用いられた IgG-H鎖発現べクターの構造を 示す。
図 3は実施例 4で形質転換に用いられた IgG- L鎖発現べクターの構造を 示す。
図 4は融合細胞を用いて確立された形質転換体の無血清培養での増殖性 と発現量を示す。
発明を実施するための最良の形態
以下、 組換え抗体の産生を例にとって、 さらに詳細に説明する。
一般に、 ほ乳類動物細胞の浮遊培養に用いられる培地の基本組成は 1 0 %の牛胎児血清を含む R P M 1 - 1 6 4 0培地等が常用される。 本発明で 作製される融合細胞は以下に示すような総蛋白含量の低い無血清培地にて 血清添加培地と同等の細胞増殖性と組換え抗体産生能を有している。
無血清培地の組成
基礎培地としてハム F 1 2培地： ダルべッコ改変 M E M培地： R P M I 1 6 4 0培地を 1 ： 1 ： 2または 2 ： 1 ： 1の比率で混合したものを用い、 これに添加物として次の表 1のものを加える。 表 1
添加物 最終濃度
トランスフェリ ン 丄. Omg/m 1 ェタノールァミ ン 0.02 OmM
2—メルカプトエタノール 0.025mM
亜セレン酸 0.013mg/ 1 抗生物質 適 量
ビタミン混合
ピオチン 2. Omg/ 1
D—パントテン酸カルシウム 2.0
塩化コリ ン 2.0
2.0
イノシトール 4.0
ニコチンアミ ド 2.0
塩酸ピリ ドキシン 2.0
リボフラビン 0.2
塩酸チアミン 2.0 さらに DHFR遺伝子増幅系を用いる場合にはメ ト トレキサート （MT X) を 10— 7M程度、 G418耐性遺伝子を組み込んで用いる場台には G 418を0. 5mgZm 1程度加えることが可能である。
本発明に用いられるリンパ系細胞は末梢血リンパ球、 リンパ節、 脾臓な どから得られる正常リンパ系細胞も利用可能であるが、 S p 2 0に代表 されるようなリンパ系雑種細胞が効果的に用いられる。 細胞融合はこのよ うなリ ンパ系細胞とマウスミエローマ （好ましくは、 P3X63Ag8. 653) を細胞融合剤 （ポリエチレングリコール等） の存在下、 常温で混 合して行われる。 細胞融合法は一般的な方法で行われる。 例えば、 1ない し 10 107個の？3 63八28. 653に対し正常リンパ系細胞な ら 1ないじ 5X108個、 S p 2ノ0ならば 1ないし 10X107個の細胞 を混合し 1500 r pm5分間遠心して細胞を沈澱させ、 さらに血清を含 まない RPM 11640培地の 40m 1を加え、 1500 r pml 0分間 遠心して細胞を洗浄する。 細胞ペレツ トをよく解したのち、 45%ポリエ チレングリコール （1500から 4000の重合度） を 1分間に lm 1の 速度で滴下し、 ゆつく りと 1分間混合する。 さらに lm〗の RPMI 16 40培地を 1分間かけて滴下し、 再度 lm 1の培地を 1分間かけて滴下し たのち、 8m 1の RPM I 1640培地で P EG (ポリエチレングリコー ル） を希釈し、 1200 rpml 0分間遠心して細胞を回収する。 細胞融 合後、 1%牛胎児血清を含む無血清培地にて 1週間程培養したのち、 上記 の完全無血清培地中で培養すると、 融合しなかった P 3. 653株は徐々 に死滅してゆき、 融合細胞は死滅しないで増殖を続ける。 この様にして無 血清培地中で増殖可能な融合細胞は容易に獲得され、 更に培養上清中の抗 体を、 放射性同位体で標識した抗体もしくは酵素標識抗体を利用した E I A等の適当なアツセィ法を用いて、 スクリーニングすることができる。 本発明は、 外来性の遺伝子、 特に組換え抗体遺伝子を発現せしめること を目的としているので、 この無血清培地で増殖可能な該融合細胞の中から 宿主由来の抗体を分泌していない融合細胞を上記の様なスクリ一ニング法 で選別することができるが、 組換え体の宿主として適切であるか否かは以 下の様な遺伝子導入試験を実施することによって確かめることが可能であ 遺伝子導入試験 通常の方法で細胞融合し、 無血清培地に浮遊させて 24穴培養プレート に接種したのち、 3日おきに新鮮な無血清培地で培地交換し約 2ヶ月ほど 培養を続ける。 その間に融合後 3曰め、 14日め、 21曰めに培養上清を 一部採取して E I A等で抗体産生を調べる。 約 10曰後、 無血清培地で増 殖可能な融合細胞のプールが得られたら、 増殖のよいゥエルを選んで 10 %の牛胎児血清を含む RPMI 1640培地にて限界希釈法によるクロー ニングを行う。 96穴プレー卜より単一クローンのゥュルを選んで 24穴 プレー卜へ拡張を行う。 増えてきたら最初 5%牛胎児血清を含む無血清培 地で培地交換を行い、 徐々に牛胎児血清濃度を下げ無 清培地に切り替え て行く。 生き残ったゥエルの細胞密度を計測し、 別の 24穴プレートに 2 XI 05c e 1 1 s/mlの密度で細胞をまき込み遺伝子導入試験に供す る。 残りの細胞は試験の結果が判明するまでそのまま無血清培地中で培養 を続ける。 遺伝子導入試験は 24穴プレー卜にまき込んだ細胞がゥ ルの 底に沈むのを待って、 上清を 0. 3m 1静かに抜いて容量を 0. 3mlZ ゥエルに合わせる。 滅菌蒸留水に溶解した適当な発現プラスミ ドベクター (例えば、 抗体の L鎖を発現せしめるプラスミ ドベクター等、 図 1) と適 当な遺伝子導入剤 （DEAEデキストラン、 燐酸カルシウム、 リボフュク チン等） を混ぜ合わせ 0. 3mlとする。 室温で 15分静置したのち 0. 01mlずつこれを 24穴プレー卜の細胞へ滴下し、 37°Cで 5ないし 2 4時間培養する。 培養後 0. 3m Iの 20%牛胎児血清を含む無血清培地 を添加し 2ないし 3曰間培養したのち、 培養上清を適当なアツセィ法を用 いて遺伝子の発現を調べる。
目的産物の発現効率の高い融合細胞プールを選別し、 さらに 96穴マイ クロプレートを使つた限界希釈法によるクローニングを実施して再び同様 な遺伝子導入試験を繰り返すことによつて遺伝子組換え体の宿主として適 切な融合細胞クロ一ンを獲得することができる。
以上のように、 得られた融合細胞株に外来遺伝子を導入する場合のほか、 最初からマウスミエローマに外来遺伝子を導入しておき、 得られた組換え 体を正常リンパ系細胞あるいは他の雑種細胞と融合しても本発明の目的と する無血清培地で増殖可能な遺伝子組換え体を作出せしめることが可能で ある。 すなわち、 外来遺伝子の導入は融合細胞を獲得する工程の前後いず れでも実施することができる。 外来遺伝子の導入を細胞融合の前に実施し た場合には、 まず無血清培地で選択を行いマウスミエローマ （例えば、 P 3X63 Ag 8. 653) 由来の細胞を死滅させ、 その後 1%牛胎児血清 を添加した選択培地 （MTX、 G418を含有する） で培養して抗体産生 細胞を得る。 こうして獲得された細胞は徐々に無血清培地に順化せしめる ことができる。 なお、 たくさんの形質転換体を得ようとするときは、 細胞 融合の後で外来遺伝子導入を実施する方法が、 細胞融合の手間を省くこと ができるため便利である。
細胞融合の相手として S p 2 0等のセルラインを用いる時には、 融合 の選択マーカーとして G418耐性遺伝子発現ュニッ ト等をあらかじめマ ウスミエローマ P3X63Ag8. 653に導入しておけば、 融合後、 適 当な選択培地で培養することによって融合細胞を簡単に選択可能である。 これら遺伝子導入剤を用いるとマウスミエ口一マ P 3X63 Ag 8. 65 3は効率的に外来遺伝子を取り込むが、 S p 2Z0細胞自体は殆ど外来遣 伝子を取り込まないことが確認された。
遺伝子導入の宿主細胞としての能力としては、 形質転換効率が良いこと、 無血清培養が可能であることのほかに、 目的の遺伝子産物を多量に産生し 得ることも重要な要件となる。 したがって、 宿主細胞の発現能力を事前に 検定しておくことが重要で、 最も発現能力の高い細胞を宿主として選択す べきである。 細胞の発現能力は適当な遺伝子を導入して形質転換した後に、 形質転換体の培養上清、 細胞表面もしくは細胞内に発現する量を測定する ことによって検定される。 例えば、 表 2は 2 6種類の融合細胞とその親株 (P3X63Ag8. 653および Sp2/0) を図 2および図 3で示されたようなプラス ミ ドで形質転換し、 G418で選別した後に培養上清中に発現する組換え蛋白 量を酵素抗体法で測定した結果である。 2 6種類の融合細胞のうちのほと んどはそれぞれの親株よりも高い発現能力を示し、 中でもクローン 3 4細 胞は高い産生量を有していた。 したがって、 クローン 3 4細胞のような細 胞が外来遺伝子の発現の宿主細胞としては最も適当であると考えられた。 そしてこの細胞を宿主細胞として図 4に示す発現遺伝子によって抗体を発 現させたところ、 細胞 1個あたり 20pg/cells dayという多量の抗体を産生 していた。
従来、 マウスミエローマ細胞系で多量の抗体分子を発現させるためには 遺伝子増幅等による別の細胞育種手段を講じる必要があった。 例えば、 Gi lliesら （BioTecnology，7, p799(1989)) は抗破傷風毒素抗体遺伝子を SP2/ 0細胞に導入し形質転換体を得、 MTXで遺伝子増幅を行って産生量を数倍上 昇させた。 この細胞の発現量は約 20pg/cells day/mlであった。 Robbingto nら (BioTecnology, 10, pl69(1992)) もミエローマ細胞に抗体遺伝子を発 現させ 9. 5-15pg/cells dayの産生能力を有する形質転換体を得て L、るが、 この場合もグルタミンシンセターゼ遺伝子増幅を利用することによって達 成された値である。
遺伝子増幅の欠点としては、 第一に增幅するために時間がかかり、 一般 的には高発現株を得るためには数力月の期間が必要となる。 第二は増幅さ れた遺伝子の安定性の問題で、 MTXや MSXのような選択試薬を添加せずに培 養すると遺伝子の脱落が起こり産生量が増幅前と同程度に低下する場合が ある。 そのため培養期間中にこれらの選択試薬を添加しておく力、、 もしく は安定な細胞株をクローニングしなければならなかつた。
これに対し、 本発明により確立された融合細胞株を用いた形質転換細胞 は遺伝子増幅を行わずとも既に前述の細胞株と同程度の発現能力を有して いた。 本発明者らはこれまで P3-X63Ag8. 653や SP2/0細胞に抗体遺伝子を発 現させたが、 高い発現能を有するものでも数 pg/cells dayかそれ以下であ り、 遺伝子増幅なしで今回作成した融合細胞のように高い産生量を与えた 例はなく、 この融合細胞を用いて初めてかかる高産生量が達成された。 従つ て、 この融合細胞を用いて形質転換を行えば遺伝子増幅を行わずとも簡単 に高い産生量の発現細胞を得ることができる。
またこの細胞は MTXや MSXのような試薬を用いて遺伝子増幅を行い、 さら に発現産物を増加させることも可能である。 例えば実施例 6に示すように 形質転換体の培養中の MTX濃度を上昇することによって遺伝子増幅を行つ たところ、 多いもので 1 0倍の組換え蛋白の発現增加が観察された。
以下、 本発明を実施例に従いさらに詳細に説明するが、 本発明は以下の 実施例に何等限定されるものではない。
実施例
実施例 1
免疫されていないマウスより脾臓を摘出し無菌的に血清を含まない 1 0 m Lの R P M I 1 6 4 0培地に脾臓細胞を浮遊させた。 これを遠心管に移 し結合組織等を沈殿させた後、 上清の細胞浮遊液を集めた。 この脾細胞遠 心沈渣を牛胎児血清を含む増殖培地の 0 . 5 m Lを添加し、 次に 1 0希釈 培地 1 O m Lをすばやくピぺッ トにて懸濁し、 室温で 1 5ないし 2 0秒間 処理の低張処理により赤血球除去を施した。 低張処理後、 2倍濃縮培地を 1 O m L速やかに添加し、 よく ピぺッ 卜で細胞を懸濁し、 さらに増殖培地 を 10ないし 2 OmL加えて遠心 （1500 r pm， 5分間） し、 脾細胞 沈渣を得た。 これに 20ないし 3 OmLの増殖培地を添加し、 ピペッ トに てよく混合した後、 遠心 （1500 r pm、 5分間、 室温） して正常リ ン パ系細胞を調製した。 このマウス由来の脾細胞 1ないし 5 XI 08個と P 3X63Ag 8. 653株 1ないし 10X107個を、 5ないし 10 ： 1 の細胞比率にて混合した。 これに血清を含まない RPM I 1640培地の
40mlを加え、 1500 rpml 0分間遠心して細胞を洗浄する。 細胞 沈渣をピぺッ 卜でよく懸濁したのち、 45%ポリエチレングリコール （1
500から 4000の重合度） を 1分間に lm 1の速度で滴下し、 ゆつく りと 1分間混合した。 次に、 1mlの RPMI 1640培地を 1分間かけ て滴下し、 さらに lm 1の培地を 1分間かけて滴下したのち、 8mlの R PM I 1640培地で PEG (ポリエチレングリコール） を希釈し、 12 00 r pml 0分間遠心して細胞を回収する。 細胞融合後、 10%牛胎児 血清を含む HAT培地 （ピポキサンチン 'アミノプテリン 'チミジン含有） で数週間培養したのち、 上記の完全無血清培地中で培養すると、 融合しな かった P 3. 653株は徐々に死滅してゆき、 融合細胞は死滅せず増殖を 続けた。 この結果、 無血清培地中で増殖可能な融合細胞を獲得することが できた。
実施例 2
予め DHFR遺伝子発現ュニッ トおよび G 418耐性遺伝子発現ュニッ トを含む抗体遺伝子発現ベクターを P 3X63 Ag 8. 653株に導入し て作製しておいた形質転換体と S p 2Z0株 （ATCC番号 1581) を 細胞融合して、 無血清培地にて選択を行い、 さらに MTX (メ ト トレキセ ート） を含む上記無血清培地中で培養し、 約 2週間後に、 ペルォキシダー ゼ標識抗 I gG抗体を用いた E I A法を行って培養上清の抗体を調べた。 その結果、 融合していない形質転換体は無血清培地中では増殖できずに死 滅した。 一方融合しなかった S p 2 0株は、 MTXおよび G418を含 む無血清培地中で生育できずに死滅し、 融合細胞は MTXを含む無血清培 地で生存し、 その結果、 目的の抗体を大量に発現するクローンを極めて効 率よく得ることができた。 また、 実施例 1では融合細胞を HAT培地等の 選択培地で培養しなければならずクローニングに時間を要したが、 実施例 2では短時間に目的のクローンを得ることができた。
実施例 3
マウスハイプリ ドーマ S p 2/0株は無血清培地に容易に順化し、 製造 レベルでの無血清培養を可能にする。 しかも S p 2 0株は抗体非分泌で あるから、 P3X63Ag 8. 653との融合によって S p 2/0の増殖 性と P3X63Ag8. 653の高遺伝子導入率及び高発現効率の両者の 特性を持った外来遺伝子導入用の宿主ができる。
本発明の方法に準じて両者を細胞融合したのち、 24穴プレー卜の無血 清培地中で培地交換をしながら約 2ヶ月間培養を行った。 増殖のよいプ一 ルを選んで、 10%牛胎児血清を含む RPM I 1640培地にてクロー二 ングを実施した。 96穴プレートより融合細胞単一クローンのゥエルを選 んで 24穴プレー卜へ細胞を拡張した。 5%牛胎児血清を含む無血清培地 で増殖してきたら、 完全無血清培地で培地交換していった。 得られた融合 細胞クローンについて細胞数を計測し、 リポフエクチンを用いて遺伝子導 入試験を実施した。 その結果、 無血清培地で増殖し、 かつ P3X63Ag 8. 653株と同等の発現効率を示すものが獲得された （表 2) 。 対照と して、 P3X63Ag8. 653自体では、 無血清培地中で増殖できず、 S p 2 0では増殖性は有するが抗体産生能は著しく低かった。 2
クローン番号 二次スクリ —ニング G418含有培地 抗 hCkEIA：増殖性 でのコロニー数
6 . 796 + + + 20
7 . 174 3
8 . 426 14
10 . 271 16
13 . 188 3
14 . 616 3
16 . 143 1
17 . 053 0
18 . 363 0
20 . 379 + + + 7
23 . 065 0
25 . 131 2
27 . 690 2
30 . 111 0
31 . 448 18
33 . 894 13
34 1. 529 19
37 . 157 0
38 . 128 + + + 9
40 . 336 0
41 . 059 0
44 . 413 0
45 . 720 + + + 6
47 . 031 0
50 . 835 10
51 . 274 9
P3X63Ag8.653 . 069 0
Sp2/0 . 085 0 上記で得られた融合細胞を利用して、 D H F R遺伝子を組み込んだ組換 え抗体を作製し、 抗体産生の安定性を調べた。 クローンによって抗体産生 能の安定性は様々であるが、 上記のうち比較的安定なクローンは、 MT X 存在下において 6 0 0 Lスケールまでの大量培養を行ったが、 抗体の産生 能の低下は認められなかった。
実施例 4
上記で得られた融合細胞を利用して組換え蛋白質の発現能力を調べた。 図 2および図 3は組換え抗体 H鎖および L鎖をコードする発現べクタ一の 構造を示している。 実施例 3で得られた融合細胞のうち、 クローン番号 3 4の細胞にこれら 2種類の発現遺伝子導入を試みた。 すなわち、 抗体 Hお よび L鎖発現プラスミ ド 1 0 gを Lipofectin(BRL) 5 0 1 と混ぜて 1 0 6個の細胞にトランスフヱクシヨンした。 3日目より lmg/mlG418， 0. 25x1 0-?M MTX, 5%牛胎児血清を含む RPMI1640培地で形質転換体を選別した。 選 別後、 形質転換細胞を限界希釈法によりクロ一ニングし抗体産生細胞 （「8 3 - 2-10」と命名) を得た。
この細胞を無血清培地で培養した力 細胞は死滅することなく良好に增 殖した。 小スケールでの培養の結果では、 最高到達細胞密度は 1. 5xl06/ml (生存率 9 2 %) 、 倍加時間はおよそ 1 6時間であった。
実施例 5
実施例 4で得た 83- 2- 10細胞を無血清培地で 600リッ トルの大スケール培 養を試みた。 図 4は細胞の増殖曲線および培養上清中に発現される抗体量 の推移を示したものである。 本細胞は無血清培地中でも良好に増殖し、 最 高到達細胞密度は 1. 45xl06cells/mlであった。 また 1曰 1細胞あたりの抗 体産生量は 20pg/cells dayであった。
実施例 6 上記で得られた融合細胞を利用した発現細胞の遺伝子増幅能力を調べた c 組換え抗体 H鎖および L鎖をコ一ドする発現ベクターを、 実施例 3で得ら れた融合細胞のうちクローン番号 3 4の細胞に導入した。 すなわち、 pSV2 -neoに抗体 H鎖遺伝子を、 また pSV2-dhfrに抗体 L鎖遺伝子を、 組み込ん だ発現ブラスミ ド 1 0 gを、 Lipo:fectin(BRL) 5 0 I と混ぜて 1 0 6個 の細胞にトランスフヱクシヨンした。 3日目より lmg/ml G418, 0. 25xlO— 7M MTX, 5%牛胎児血清を含む RPMI1640培地で形質転換体を選別した。 選別後、 形質転換細胞を限界希釈法によりクローニングし、 抗体産生細胞 SP119-2, 3, 7, 10, 15および 16を得た。
次にこれら 6種類の細胞を、 lnig/mlG418, lxlO" 7M MTX, 5%牛胎児血清を 含む BPMI1640培地で培養した。 1力月後、 耐性株の培養上清中に発現する 抗体濃度を酵素抗体法で測定し、 遺伝子増幅前のそれと比較した。 下記表 3にその結果を示す。
表 3
細胞名 抗体産生量増加率 '
SP119-2 1. 42
3 2. 81
7 7. 42
10 2. 50
15 10. 47
16 1. 05
a)0. 25xl0— 7M MTX耐性株の発現量に対する 1X10— 7M MTX耐性株の 発現量の比 上記から明らかなように、 培地中の MTX濃度を 4倍に上昇させ遺伝子増 幅を行うことによって、 多いもので 1 0倍の抗体発現量の増加が観察され た。
これらのことよりクロ一ン番号 3 4細胞は遺伝子増幅にも充分使える細 胞であることが分かった。
従って、 実施例 4、 5に示した 82-3-10細胞を遺伝子増幅させればさら に高い発現量が期待できる。
産業上の利用可能性
本発明の産生方法により、 外来遺伝子、 特に組換え抗体遺伝子を発現さ せる場合に、 無血清培養により目的の組換え抗体等を無血清培地中に大量 に安定的に産生させることが可能となり、 目的の外来蛋白質の精製が極め て容易となり、 これまでにない優れた外来蛋白質の産生方法が提供される

Claims

請 求 の 範 囲
1 . マウスミエローマとリンパ系細胞とを融合して得られる無血清培地 で培養可能な融合細胞を発現宿主細胞として用い、 該融合細胞を無血清培 地で培養することにより、 該融合細胞に組み込まれた外来蛋白質産生遺伝 子を発現させ、 培地中から該外来蛋白質を回収することを特徴とする外来 蛋白質の産生方法。
2. 外来蛋白質産生遺伝子が、 融合される前のマウスミエ口一マに組み 込まれる請求項 1の産生方法。
3. 外来蛋白質産生遺伝子が、 融合された後の融合細胞に組み込まれる 請求項 1の産生方法。
4. マウスミエローマが、 P 3 X 6 3 A g 8. 6 5 3株である請求項 1 の産生方法。
5. リンパ系細胞が、 ミエローマとリンパ系細胞とから調製された、 無 血清培地で培養可能な雑種細胞 （ハイプリ ドーマ） である請求項 1の産生 方法。
6. 無血清培地で培養可能な雑種細胞が、 雑種細胞 S p 2 0株である 請求項 5の産生方法。
7. 外来蛋白質が、 組換え抗体である請求項 1の産生方法。
8. 組換え抗体が、 そのアミノ酸配列として、 マウス以外の動物種の抗 体由来のァミノ酸配列を少なくともその一部に有する請求項 7の産生方法 c
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