JPH0221795B2

JPH0221795B2 -

Info

Publication number: JPH0221795B2
Application number: JP56091265A
Authority: JP
Inventors: Juichi Yamamura; Chuzo Kishimoto
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1981-06-12
Filing date: 1981-06-12
Publication date: 1990-05-16
Also published as: JPS57206383A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なヒトＴ細胞ライン、更に詳しく
はヒトＴ細胞交雑（融合）細胞ライン殊にＴ細胞
増殖因子を分泌するヒトＴ細胞交雑細胞ラインの
確立方法に関する。ヒトの免疫系に含まれるリンパ球は、Ｔ細胞即
ち胸腺由来細胞と、Ｂ細胞即ち骨随由来細胞とに
大別される。上記Ｂ細胞は、抗体を分泌すること
が知られており、従来細胞融合技術を利用して上
記Ｂ細胞の交雑細胞即ち抗体産生Ｂ細胞と新細胞
としての骨随腫瘍細胞（ミエローマ）との交雑細
胞（ハイブリドーマ）を作製し、該ハイブリドー
マより単一クローン由来の抗体（モノクロナル抗
体）を生産する技術が確立されている〔「臨床科
学」第16巻第９号第1108−1114（1980年）参照〕。一方Ｔ細胞は免疫応答の調節における中心的役
割を果すものであり、その特性については尚不明
な点が多いが、抗体産性を抑制する因子、異種細
胞の分裂を引起す因子（インターロイキンス）等
の数多くの液性免疫因子（リンホカイン類）を分
泌するものである。しかしながら之等Ｔ細胞の細
胞融合技術の応用による交雑細胞の作成は、現在
わずかマウスＴ細胞につき報告されているにすぎ
ず、ヒトＴ細胞融合技術は非常に遅れており、未
だ成功した例がない。本発明者らはかかるヒトＴ細胞融合技術を確立
することを目的として種々研究を重ねた結果、ま
ずヒトＴ細胞との融合特性を有し且つ融合細胞を
選択するための培地に感受性を有し、しかも永代
培養可能な親細胞株を確立し、該親細胞株を利用
してヒトＴ細胞交雑細胞の作成に成功し、ここに
本発明を完成するに至つた。即ち本発明はヒポキサンチン−グアニン−ホス
ホリボシルトランスフエラーゼ（HGPRT）欠
損ヒト白血病性Ｔ細胞と正常ヒトＴ細胞とを融合
促進剤を用いて融合させることを特徴とするヒト
Ｔ交雑細胞ラインの生産方法に係るものである。本発明の交雑細胞株は継代培養できるものであ
り、該交雑細胞株の確立によれば、ヒトＴ細胞が
放出する数多くの液性免疫因子即ち細胞間相互作
用をメデイエートする可溶性因子の生体外での大
量生産が可能となり、従来尚充分には解明されて
いない之等可溶性因子の化学的及び生物学的特性
の解析が可能となり、之等の臨床面への応用、該
臨床面での効果の究明進歩に大きく寄与する。ま
た上記ヒトＴ細胞交雑細胞ラインの確立は、ヒト
Ｔ細胞における細胞膜表面抗原やＴ細胞抗原レセ
プターの解析、Ｔ細胞サブセツトの検索、Ｔ細胞
自体の分化、増殖、活性化等の細胞学的及び免疫
学的研究にも極めて有力な手段を提供するもので
ある。本発明方法に用いられる親規な親細胞株は、ヒ
ト白血病性Ｔ細胞株より誘導されるものであり、
HGPRTを欠損している点において特徴付けられ
る。その細胞学的及びその他の諸性質を示せば次
の通りである。 (1) 形態学的特徴：径は正常ヒト末梢血Ｔ細胞の約２〜３倍であ
り、ほぼ球形をなす。細胞内における核の占め
る割合は大で、原形質が僅かに認められる。原
形質内には僅かの顆粒が認められる。時として
偽足様の突起を出す場合がある。 (2) 染色体数： 0.1μｇ／ml濃度のコルヒチン存在下に細胞を
37℃下３時間培養し、遠沈後0.075M−KClで
処理し、メタノール：エタノール＝３：１の固
定液を用いスライドガラス上に固定後の核染色
体数を、1000倍の油浸レンズを用いた顕微鏡観
察により計数した結果、100個の細胞の分裂中
期において各細胞の核染色体数は、下記第１表
の通り69〜87の間にあり、平均78である。

【表】 (3) Ｔ細胞特異抗原発現性：各細胞を５×10⁵個濃度に調整し、100μの
適当な濃度のモノクロナル抗体（0.1mg／0.5ml
の抗−Leu1、抗−Leu2A及び抗−Leu3A抗体
の原液を、夫々100倍、10倍及び10倍に希釈し
て100μとして用いた）と、４℃下30分間イ
ンキユベート後、細胞を５％胎児牛血清
（FCS）を含むMEM培地〔財団法人阪大微研〕
で洗浄し、FITC（fluorescein isothiocyanate）
−結合−ウサギ抗マウス免疫グロブリン
〔Miles−Yeda LTD.、Israel〕と反応させ、
Ｔ細胞特異抗原発現性を関接免疫螢光抗体法に
より測定した。尚各モノクロナル抗体はベクト
ンデイキンソン社〔Becton Dickinson Co.、
Sunnyvale、Ca〕より得た〔J.Exp.Med.、
153、310−323（1981）〕。200個の細胞について
調べた結果抗−Leu1及び抗−Leu3A抗体に対
し95％以上が陽性であり、抗−Leu2A抗体に
対し１％以下が陽性であつた。 (4) ロゼツト形成：抗体補体感作ヒツジ赤血球（EAC）におけ
るロゼツト形成を、200個の細胞につき、400倍
の顕微鏡下で測定した結果１％以下が陽性であ
る。 (5) Ｂ細胞マーカー発現性： FITC−結合マウス抗ヒト−免疫グロブリン
（Behring werke AG、Marburg）を用いた直
接免疫螢光抗体法により解析した表面免疫グロ
ブリン（Ig）は、１％以下陽性である。モノクロナル−抗−DR抗体（Becton−
Dickinson Co.）を用いた間接免疫螢光抗体法
により解析したヒトHLA−DR抗原（DR）は、
１％以下陽性である。またビールス（Epstein−Barr virus）でト
ランスフオームしたヒトＢ細胞株（CESS、ス
ローン・ケタリング癌研究所のピーターラルフ
博士より入手）により免疫されたマウス脾細胞
とミエローマP3U₁、（Elbert Einstein College
of Medicinより入手）との細胞融合株から得
た〔G.Kohler and C.Milstein、Nature、256、
495、1975参照〕モノクロナル抗ヒトＢ細胞抗
体を用い、間接免疫螢光抗体法により解析し
た、ヒトＢ細胞特異抗原（Ｂ抗原）の表現性
は、１％以下が陽性である。尚上記抗体はＢ細
胞乃至そのラインとは反応するが、Ｔ細胞乃至
そのラインとは反応しない。 (6) HLA表現型細胞を抗HLA血清（東京医科大学、笹月教
授より入手）と30分間37℃で培養後、本発明の
親細胞で吸収した家兎補体（ベリタス）と、60
分間インキユベートして細胞の生存率を調べた
結果、HLA表現型はA2、A11、B8、B37、
Bw22を示す。 (7) 増殖性：８−アザグアニン（８−AG、100μM）、10
％胎児牛血清（FCS）、５×10^-5M2−メルカプ
トエタノール及び１ｍＭグルタミンを含む
RPMI1640培地（Flow Laboratories）におい
て良好に増殖する。 (8) 増殖条件：一般に36〜38℃の温度条件下及びPH7.2〜7.3
の条件下で良好に増殖する。また５％炭酸ガス
及び95％空気のインキユベーター内での培養が
好適である。 (9) 継代培養：限界なく継代培養が可能である。 (10) 凍結保存：液体窒素中で容易に長期間保存できる。 (11) ８−アザグアニン耐性：８−アザグアニン（100μM）に耐性があり、
ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン
を含む培地（HAT培地）で死滅する。このこ
とから本細胞はHGPRT欠損株であることが判
る。 (12) マイトジエン反応性：コンカナバリンＡ（Con Ａ）10〜100μｇ／ml
の添加及び植物性赤血球凝集素、フイトヘモア
グルケニン（PHA）の１〜10％添加により、
分裂増殖は部分的に抑制される。ポツクウイー
ドアイトジエン（PWM）及びプロテインＡ
（Pro Ａ）は、いかなる濃度においても本細胞
株の分裂増殖に影響を与えない。之等のことを添付の第１図乃至第４図に示す。
各図は夫々２×10⁴個の本細胞株を、種々の濃度
のマイトジエン（第１図はCon Ａ、第２図は
PHA、第３図はPWM及び第４図はPro Ａを
夫々用いたものである）と共にRPMI1640＋10％
FCS内で60時間培養し、培養の最後の12時間に
0.2μCiの3H−チミジン（3H−TdR）を加え、培
養細胞をグラスフアイバーストリツプ（ラボサ
イエンス社）に集め、3H−TdRのデオキシリボ
核酸分画への取り込みを液体シンチレーシヨンカ
ウンターでカウントした結果を、各３度繰返した
平均値（S.D.は10％以下）でプロツトしたもので
あり、図中横軸は各マイトジエンの濃度及び縦軸
は取り込まれた3H−TdRのカウント数（C.P.M.
×10^-5）を示す。また各図における（●――●）
は本細胞株を、また（Γ――Γ）は、後述するク
ローン24A（本発明ヒトＴ細胞融合細胞株のひと
つのクローン）における結果を示す。上記諸性質を有するHGPRT欠損ヒト白血病性
Ｔ細胞株は、例えばヒト白血病性Ｔ細胞（CCRF
−CEM）〔J.KAPLAN、T.C.SHOPE and W.D.
PETERSON、Jr.、J.Exp.Med.139、1070−
1076、1974参照〕を起源とし、これを10％FCS含
有RPMI1640培地に８−アザグアニン（８−AG）
を添加した培地で培養し、８−AG添加量を順次
増加させていくことにより収得できる。より具体
的には例えばまず2μMの８−AGを添加した培地
で１週間培養し、生存細胞を次に16μMの８−
AGを含む培地で１週間培養し、その後同様に８
−AG濃度を２倍づつ増加させた培地で順次培養
し、最終的に８−AG濃度を100μMとした培地に
生存する８−AG耐性細胞株を得る。かくして得
られる細胞株は、その後100μMの８−AG含有培
地で強い増殖性を示し、この培地で継代培養でき
る。またHGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞株は、上
記に代え６−チオグアニン（最終濃度67μM）又
は６−メルカプトプリンリボシツド（最終濃度
1μM）を用い、上記と同様に培養することによ
つても収得できる。かくして親細胞株としてのHGPRT欠損細胞ラ
インを得る。これは上記した諸性質を有し、文献
未載の新しいＴ細胞ラインであり、永代培養で
き、またほぼ永久的に凍結保存できる。上記HGPRT欠損細胞ラインの培養は、各種の
栄養培地で行ない得る。利用できる栄養培地は、
本質的には合成培地であるが、血清のような天然
から得られる成分を含んでいてもよく、該培地と
しては例えばRPMI1640培地（Flow
Laboratories社）を、FCS、ウマ血清等の血清補
液を用いて改質した培地、又は血清を含まないイ
スコブ（Iscove）改質培地を用いて改質したドル
ベツコ（Dulbecco）改質培地等が有利に用い得
る。上記培地で増殖される細胞はまた例えばFCS
含有イーグル最低必須培地（MEM）培地等の当
該分野で細胞培養に一般に用いられている各種の
培地で短期間の適応で容易に増殖する。上記各種
培地には、特に８−AGの添加を必要としない
が、通常好ましくは８−AGを添加しておくのが
よい。また上記各種培地での培養条件は、通常の
細胞培養に利用される条件でよい。一般には約36
〜38℃下に３〜５日毎に液交換を行なうことによ
り細胞を良好に増殖させることができる。上記細胞株は、工業技術院微生物工業技術研究
所への寄託が受付けられなかつたが、本発明者ら
により、常に分離可能な状態にて保存されてい
る。更に上記細胞株は、現在本発明者らによりア
メリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（ATCC）に寄託申請手続中である。本発明の上記親細胞株としてのHGPRT欠損Ｔ
細胞株と正常ヒトＴ細胞との細胞融合方法におい
て利用できるヒトＴ細胞は特に制限はなく、例え
ば未梢血、骨随、リンパ節、脾臓、扁桃腺、胸腺
等に由来する各種Ｔ細胞をいずれも例示できる。
之等Ｔ細胞は、通常知られている各種の分離手段
例えば物理的方法、化学的方法及び表面膜法によ
り単離精製され、本発明の細胞融合に供し得る。
また之等Ｔ細胞は、細胞融合に先立ち融合効率を
高めるために、公知の種々のマイトジエンで刺激
することができる。マイトジエンとしては、Ｔ細
胞に感受性を持つ各種のものが利用でき、この例
としては、例えばコンカナバリンＡ（Con Ａ、シ
グマ社）、精製ツベルクリン（PPD、阪大癌研究
所、高津博士）、プロテインＡ（Pro Ａ、フアル
マシア社）、フイトヘモグルチニン（PHA、デイ
フコ社）、ポツクウイードマイトジエン
（PWM、ギブコ社）等挙げることができる。更
に之等Ｔ細胞は、リンパ球混合培養法（Mixed
Lymphocyte Culture）を用いて活性化すること
もできる。上記ヒトＴ細胞及びマイトジエン刺激
Ｔ細胞の製造の詳細は後述する実施例に示す通り
である。本発明のHGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞と上
記ヒトＴ細胞との融合反応は、基本的には公知の
細胞融合方法と同様であり、融合促進剤の存在下
に適当な培地内で行なわれる。融合促進剤として
は例えばセンダイウイルス（HVJ）等のウイル
スを用いてもよいが、近年開発されたポリエチレ
ングリコール（PEG）を用いるのが好ましい。
該PEGとしては平均分子量1000〜6000程度のも
のが好ましく、これは培地に約30〜60W／Ｖ％の
濃度で存在させるのが適当である。また培地とし
ては、上記した親細胞株の増殖に用いられるよう
なMEM培地、そのドルベツコ改質培地、
RPMI1640培地、その他のこの種の細胞培養に利
用される通常の各種培地を利用できる。また上記
細胞融合用培地には所望により融合効率を高める
ための補助剤として例えばジメチルスルホキシド
等を添加してもよい。上記細胞融合に当り用いる親細胞と、ヒトＴ細
胞との使用量比は、特に制限はないが一般には親
細胞数に対しヒトＴ細胞数を約１〜10倍用いるこ
とができる。好ましい細胞融合は例えば次の如く
して行なわれる。即ち親細胞株とヒトＴ細胞との
所定量を適当な培地内でよく混ぜ、遠沈後上清を
除去し、予め37℃に加温したPEG溶液の適当量
を加えてまぜ合せる。これにより細胞融合反応が
開始される。以後適当な培地を逐次添加し、遠沈
させ、上清をすてる操作を繰返すことにより所望
の融合細胞の出現が認められる。所望融合細胞の分離は、上記細胞融合後の細胞
を、通常の雑種選別用培地で培養することにより
行なわれる。この選別用培地は、親細胞は増殖し
得ず、目的とする交雑細胞のみが増殖し得る培地
（ヒトＴ細胞は本来増殖し得ない）であり、その
代表例としては例えばヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む培地（HAT培地）を
例示できる。該HAT培地としては、例えば10％
FCS含有MEM培地に、アミノプテリン４×
10^-7M、ヒポキサンチン１×10^-4M、チミジン
1.6×10^-5M及びグリシン３×10^-6Mを添加した
培地が例示できる。該HAT培地での細胞の培養
は、通常の限界希釈法に従い目的とする交雑細胞
以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するに充分な
時間通常約数日〜数週間程行なわれる。これによ
り目的とするヒトＴ細胞融合細胞のみが選択的に
増殖する。かくして得られる融合細胞は、核形（核染色体
数）細胞表面の表現型、マイトジエン反応性、リ
ンホカイン産生能等において、親細胞株、ヒトＴ
細胞とは明らかに異なる新しい特性を具備してい
る。この融合細胞は、前記と同様の適当な培地中
で増殖維持することができるがHAT培地による
選別後、ヒポキサンチン及びチミジンを含むHT
培地で１〜２週間培養した後、通常の培地に移す
方が好ましい。その特性を後述する実施例により
得られた融合細胞を例にとり、親細胞株
（HGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞、以下CEM−
AGRとする）との対比において示せば、下記第
２表の通りである。

【表】尚第２表中頻度は次式により示されるものであ
る。確立された交雑細胞を含むウ
エル数／細胞融合直後の細胞２×10⁵個を接種したウエ
ル数また、染色体数、Ｔ細胞特異抗原発現性、ロゼ
ツト形成及びＢ細胞マーカー発現性は、夫々親細
胞につき前述した方法により測定されたものであ
り、各項における記号は夫々次のことを示す。＋＋……95％以上の細胞が陽性を示す。 −……１％以下の細胞が陽性を示す。 ND……未測定上記第２表を参考として、本発明のヒトＴ細胞
交雑細胞ラインの各種特性を、親細胞株につき上
記した各項目(1)〜(12)と共にその他の特性をまとめ
れば次の通りである。 (1) 形態学的特徴；各融合細胞のクローン毎に若干相違するが、
本質的には親細胞株を類似しており、その大き
さは親細胞株よりやや大きく（1.2〜1.5倍）、
細胞表面上にヒゲ様の突起を多数出しているも
のが多い。 (2) 核形（核染色体数）；各クローン毎に異なるが平均染色体数は、86
〜94の範囲にある。これは親細胞のそれが78で
あるのに対し明らかに多い。 (3)〜(5)；大部分のクローンにおいて親細胞と同一であ
る。 (6) HLA表現型；すべてのクローンにおいて親細胞のそれは発
現されており、各クローンは他に該親細胞以外
のヒトＴ細胞のHLA表現型の１以上を発現し
ている。 (7)〜(10)；すべてのクローンにおいて親細胞のそれと
略々同一である。 (11) ８−アザグアニン耐性；すべてのクローンは８−AG耐性を示さな
い。 (12) マイトジエン反応性； ConAとPHAに関しては、親細胞株と同様の
又はそれ以上の反応性を示す。親細胞株は
PWMに全く反応しないがPWMに反応するク
ローンがかなり見い出される。 (13) Ｔ細胞増殖因子活性；クローンNo.24−Ａは、後述する実施例に示す
方法において、Ｔ細胞増殖因子（TCGF）活性
を示す。上記した諸特性より、本発明によれば新規なヒ
トＴ細胞交雑細胞ラインが確立されることが明ら
かである。殊にこの交雑細胞ラインの確立は、得
られる各クローンが親細胞株と対比して、いずれ
も８−AG耐性を示さないこと、核染色体数が増
加していること、HLA表現型において親細胞株
以外の表現型が発現されること等において確証さ
れる。また上記した如きヒトＴ細胞交雑細胞株は、こ
れを常法に従い通常の培地で増殖させることによ
り、クローン化することができ、これにより夫々
単一の融合細胞株に分離することができる。かく
して得られる各融合細胞株は、いずれもヒトＴ細
胞の少なくとも１つの核染色体を保有するもので
あり、また継代培養による増殖が可能でしかも凍
結保存できる所から、これを増殖させることによ
りヒトＴ細胞のより詳細な研究解明が行ない得
る。また之等クローンには、従来ヒトＴ細胞より
分泌され免疫応答の調節における重要な役割を演
じることの知られている数多くのリンホカイン類
の産生能を有するものが存在しており、従つて該
クローンの確立により生体外で容易迅速にしかも
多量のリンホカイン類を収得することが可能であ
る。これは各種の免疫系疾患の診断や治療に新し
い方法を提供し得るものである。本発明に従い確立単離されたひとつのヒトＴ細
胞融合細胞株（クローンNo.24−Ａ）につき更に詳
述すれば次の通りである。即ちこの細胞融合株ク
ローンは、後述する実施例に示す通り親細胞株
と、ヒト末梢血リンパ球のＴ細胞との細胞融合に
より得られたひとつの交雑細胞株であり、これは
上記した交雑細胞株に共通する各種性質を有す
る。殊にその核染色体数は79−97（平均89）であ
る。HLA表現型は、A2、AW24、A11、B5、
B8、B37及びBW22であり、親細胞株のそれ
（A2、A11、B8、B37、BW22）の他にヒトＴ細
胞のそれ（A2、AW24、B5、B40）のうちのB40
を除くすべてを発現している。またこのクローン
細胞株は、第１図乃至第４図に示す各マイトジエ
ンに対する反応性を示し、即ち１％のPHA濃度
で分裂増殖をほぼ完全に抑制され、0.5〜１％の
PWM濃度で分裂増殖が抑制される。更にこのクローン細胞株は、強力なTCGF活性
を示す点において特徴付けられる。之等の特性は
実施例及び添付の第５図及び第６図に示す通りで
ある。このように上記ひとつのクローン細胞株は、こ
れを前記した適当な培地中で培養させることによ
り、その培養上澄からＴ細胞増殖因子（TCGF）
を回収することができる。この方法の詳細は後記
実施例に示す。本発明者らは、この新しいTCGF産生能を有す
る融合細胞株についても、前記親細胞株と同様微
工研への寄託が受付けられなかつたため、自ら分
譲可能な状態に保持すると共に、ATCCにその寄
託を申請中である。以下本発明を更に詳しく説明するため、親細胞
株の製造例、ヒトＴ細胞の単離調製例、之等の各
細胞の融合例及び得られた融合株についての試験
例を実施例として詳述する。実施例１ HGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞の製造ヒト白血病Ｔ細胞株CCRF−CEMは、Dr
Minowada RPMI、Buffaloより入手し、これを
10％FCSを含むRPMI1640培地（Flow
Laboratories社）に培養維持した。上記CCRF−CEM細胞を、まず2μMの８−AG
を含むRPMI1640＋10％FCS培地に１×10⁶個／
mlの細胞濃度で浮遊させ、培養ボトル（コーニン
グ社）にその10mlを取り、ボトルを横にした状態
で、５％炭酸ガス及び95％空気の通気条件下、37
℃でインキユベーター内で１週間培養した。その
後生存細胞を取り出し、上記の２倍濃度即ち
4μMの８−AGを含む同一培地に１×10⁶個／ml
濃度となる様に浮遊させ、同様にして１週間培養
した。上記のように１週間毎に培地に添加させる
８−AG濃度を約２倍づつ（２→４→８→16→32
→50→75→100μMとした）増加させ、夫々の培
地で生存する細胞を順次培養して、最終的に８−
AG100μMを存在させた培地で生存する細胞を得
た。かくして約８週間を経て所望の８−AG耐性
株を得た。これを「CEM−AG^Rとする。この株
はその後同濃度（100μM）の８−AGを含む
RPMI1640＋10％FCS培地にて強い増殖を示し、
この培地で継代培養により維持されている。また
その細胞学的及びその他の特性は前述した通りで
あつた。実施例２ヒト細胞の単離調製 (1) 末梢血Ｔ細胞健康な成人よりヘパリン採血して得た血液50
mlを「フイコール−バツク」（フアルマシア・
ジヤパン株式会社）で遠心分離して、末梢血リ
ンパ球５×10⁷を単離した。該リンパ球からの
Ｔ細胞の単離は、ノイラミニダーゼ処理羊赤血
球（SRBC）でロゼツト化することにより行な
つた〔T.HIRANO、T.KURITANI、T.
KISHIMOTO and T.YAMAMURA、J.
Immunol.、119、1235〜1241（1977）〕。かくし
て得られた末梢血Ｔ細胞を「非刺激PBL−Ｔ」
とする。また上記非刺激PBL−Ｔの１×10⁶個／mlに
対して、10μｇ／mlのConA、25μｇ／mlのPPD
及び10μｇ／mlのProAで夫々48時間刺激させ
て、刺激Ｔ細胞を調整する。之等を夫々
「ConA刺激PBL−Ｔ」、「PPD刺激PBL−Ｔ」
及び「ProA刺激PBL−Ｔ」とする。 (2) 口蓋扁桃Ｔ細胞慢性扁桃炎患者の扁桃切除術で得たヒト口蓋
扁桃より採取した扁桃腺を、ヘパリン10単位／
ml及びアンホテリシンＢ（三共株式会社）4μ
ｇ／mlを含むMEM培地にて細切し、扁桃細胞
を取り出した。この細胞を「フイコール−パツ
ク」を用い遠心分離し、５×10⁸個の扁桃リン
パ球を単離した。以後上記(1)と同様にノイラミ
ニダーゼ処理羊赤血球にてロゼツト化して扁桃
Ｔ細胞２×10⁸を単離した。この細胞１×10⁶
個／mlMEMを次いで10μｇ／mlのConAで48時
間刺激し、刺激扁桃Ｔ細胞を得た。これを
「ConA刺激Tonsil−Ｔ」とする。 (3) 胸腺滲出液Ｔ細胞肺結核の患者より胸腺滲出液のリンパ様細胞
を分離した。即ち肺結核患者の胸膜滲出液（胸
水）を穿刺法により100ml採取し、これを
1500rpm、５分の遠沈後ヘパリン10単位／mlを
含有するMEMにて２回洗浄し、「フイコール
−ハイパツク」（フアルマシア・ジヤパン株式
会社）で遠心分離し、胸水リンパ球３×10⁸個
を単離した。以後上記(1)と同様にして、胸水Ｔ
細胞を得、その１×10⁶個／mlを25μｇ／mlの
PPDで48時間刺激した。かくして得られた細
胞を「PPD刺激PF−Ｔ」とする。実施例３親細胞−ヒトＴ細胞融合親細胞CEM−AG^Rは、融合の３日前より毎日
培地（RPMI1640＋10％FCS＋100μM8−AG）を
交換して、増殖が活発な状態に保持しておいた。上記CEM−AG^Rの１×10⁷個と、上記実施例２
で得た各ヒトＴ細胞の夫々２×10⁷個とを細胞融
合に利用した。即ち上記各細胞を、予め37℃加温
保持したFCSを含まないMEM培地で３回洗浄
し、次いで50mlのコニカルチユーブに移しよく混
合し、1000rpmで10分遠沈した。上清を除去して
得られた細胞ペレツトを軽く振とうし、その上に
37℃に加温した45％PEG−6000（コツホライト
社）の0.3mlを注いだ。30秒間よく振とうした後、
５％炭酸ガス及び95％空気の炭酸ガスインキユベ
ーター内で、37℃下に６分間静置した。これに
FCSを含まないMEM（予め37℃に加温）を１分
間に２mlの速度で総計12ml加えた。更にMEM25
mlをすばやく加えた後800rpm、10分間遠沈し、
上清を除去した。これに20％FCS含有RPMI1640
培地（予め37℃に加温）の50mlを静かに加えて
CEM−AG^R濃度を２×10⁵個／mlとし、これをマ
イクロカルチヤープレート（リンブロ社）の直
径２cmの各ウエル50個に夫々１mlづつ分注した。
24時間後上清の半分をすてHAT培地（ヒポキサ
ンチン（シグマ社）１×10^-4M、アミノプテリン
（シグマ社）４×10^-7M及びチミジン（シグマ社）
1.6×10^-5Mを含むRPMI1640＋20％FCS培地）１
mlを各ウエルに加えた。２日毎に同様の操作を繰
返し、２〜４週間５％炭酸ガスインキユベーター
内で37℃下に培養した。増殖する細胞株を次いで
アミノプテリン(A)を含まないHT培地（HAT培
地よりＡを除いたもの）に移し、更に１週間培養
後、HATを含まないRPMI1640＋10％FCS培地
（正常培地）に移し、以後常法に従いクローニン
グ化した。即ち交雑細胞を正常培地中で５個／ml
となるように希釈しこれをフアルコンマイクロプ
レートに0.2ml／ウエルづつ分注し、２〜３日お
きに上清を半分すて、予め37℃に加温した培地を
加え、上記細胞の増殖をつづけた。かくして交雑
細胞株の単一クローンを得た。得られたクローン
中の代表的ヒトＴ細胞交雑細胞株は、前述した第
２表に示す特性を有していた。実施例４ヒトＴ細胞交雑細胞上清の製造 (1) 無刺激で得た上清上記実施例３で得た交雑細胞クローンNo.24−
Ａの細胞を、RPMI1640＋10％FCS培地を用い
て１×10⁵個／ml濃度に調整し、これをマイク
ロカルチヤプレート（リンブロ社）の直径２cm
のウエルにて２日間、37℃下、５％炭酸ガスイ
ンキユベーター内で培養した。3000rpm10分遠
沈して培養上清を採取し、これを0.45μミリポ
ア・フイルターにて滅菌過し、この上清中の
リンホカイン活性の有無を検討した。 (2) ConA刺激で得た上清上記において用いた培地はConA1μｇ／mlを
添加する以外は、上記(1)と同様にして、上清を
得、これをリンホカイン活性測定に供した。実施例５ヒトＴ細胞交雑細胞上清のリンホカイン産生能上記実施例４で得た各上清のリンホカイン産生
能を次の通り試験した。＜TCGF活性試験１＞生後５〜６週間のBALB／Ｃマウス（静岡実
験動物）から胸腺細胞を取出し、細切して胸腺細
胞を得、これをMEMにて２回洗浄し、10％FCS
を含むRPMI1640培地にて１×10⁶個／ml濃度の
細胞液を調整した。この胸腺細胞浮遊液0.1ml
（１×10⁵個細胞）に、上記実施例４で得た交雑細
胞の上清を加え0.2ml容平板マイクロプレート
（フアルコン社）内で2μｇ／mlのConAの刺激下、
³H−チミジン（ ³H−TdR）0.5μCi／ウエルを
６時間を要して与え培養を行なつた。培養３日後
の分裂増殖を ³H−TdRの取り込みにより調べ
た。同一試験を親細胞株であるCEM−AG^Rの培
養上清についても行なつた。結果を第５図に示
す。第５図中縦軸は取り込まれた ³H−TdRカウ
ント数（C.P.M.×10^-3）を示す。また横軸のＡ
は、何らの培養上清をも添加しない場合、Ｂは、
実施例４の(1)及びこれと同様にして得たCEM−
AG^Rの各上澄を添加した場合（斜線を入れないも
のが実施例４(1)で得た上清及び斜線で示すものが
CEM−AG^Rの上清である。以下同じ）、Ｃは実施
例４の(2)及びこれと同様にして得たCEM−AG^R
上清の場合及びＤは培養上清の替わりに1μｇ／
mlのConAのみを用いた場合を夫々示す。各Ａ〜
Ｄ共結果は３度同一試験を繰返した平均±S.D.で
示す。上記第５図より、クローンNo.24−Ａの培養
上清（図中斜線を付していないＢ及びＣ群）は、
ConAで刺激されたマウス胸腺細胞の有意な分裂
増殖を誘発し、殊にこの作用はクローンNo.24−Ａ
をConAで刺激して上清Ｃ群で著しく強いことが
判る。これに対しCEM−AG^Rは、非刺激上澄及
びConA刺激上清のいづれにおいても分裂増殖誘
発因子を産生しないことが判る。＜TCGF活性試験２＞実施例４の(1)で得た上清50mlを濃縮後セフアデ
ツクスＧ−100カラム（フアルマシア社）に通し、
分子量約13000〜20000の分画を得、これを「アミ
コンYM−５」メンブランス（Amicon
Corporation、Lexington、Mass）で５mlに濃縮
して半精製上澄を得た。同様にして親細胞株
CEM−AG^Rの半精製上澄を得た。一方正常ヒト末梢血Ｔ細胞とマイトマイシン処
理CESS（EB−ウイルスでトランスフオームした
ヒトＢ細胞、スローン・ケタリング癌研究所のピ
ーターラルフ博士より入手）とをリンパ球混合培
養（MLC）し、TCGF（ヒト扁桃リンパ球１×
10⁶個／mlを0.1％PHAの存在下で２日間培養し、
培養上清を粗製TCGFとして用いた）によつて16
週間培養、増殖させたTCGF依存性ヒト細胞障害
性Ｔ細胞株を用意した。上記TCGF依存性ヒト細胞障害性Ｔ細胞株の３
×10³個を、上記で得た半精製上澄の存在下に、
24時間培養し（37℃、CO₂インキユベーター内、
RPMI1640＋10％FCS培地）し、0.5μCiの ³H−
TdRを５〜８時間をかけて与え、上記半精製上
澄の連続希釈によつて、該 ³H−TdRの取り込み
量をカウントし、TCGF活性を調べた。結果を第
６図に示す。第６図において横軸は希釈上清原液
を１とし、その希釈濃度（希釈倍率）を示し、０
はコントロールとして上澄を加えない場合を、ま
た斜線を入れた値は、上記で得た半精製上清を、
斜線を入れない値ははCEM−AG^Rの半精製上清
を示す。また縦軸は取り込まれた ³H−TdRのカ
ウント数（C.P.M.×10^-3）を示す。すべての結
果は、同一試験を３度繰返した平均±SDで示す
ものである。第６図より本発明のクローンNo.24−Ａの培養上
清中の分子量13000〜20000の半精製分画は、
TCGF依存性ヒト障害性Ｔ細胞株の増殖を維持す
ることができ、その活性は、液性因子の濃度に依
存することが判る。一方親細胞株CEM−AG^Rか
ら得られる同様の分子量を持つ分画は、どの濃度
においても上記増殖活性を示さないことが判る。

【図面の簡単な説明】

第１図乃至第４図は、親細胞株CEM−AG^R及
び本発明により得られるＴ細胞融合株クローンNo.
24−Ａの夫々のマイトジエン反応性を示すグラフ
並びに第５図及び第６図は本発明により得られる
Ｔ細胞融合株クローンNo.24−ＡのTCGF活性を示
すグラフを夫々示す。

Claims

【特許請求の範囲】１ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシル
トランスフエラーゼ（HGPRT）欠損ヒト白血病
性Ｔ細胞と正常ヒトＴ細胞とを融合促進剤を用い
て融合させることを特徴とするヒトＴ交雑細胞ラ
インの生産方法。２ HGPRT欠損ヒト白血病性Ｔ細胞と正常ヒト
Ｔ細胞との融合後に、交雑細胞を雑種選別用培地
で選択的に増殖させる特許請求の範囲第１項記載
の方法。３雑種選別用培地がヒポキサンチン、アミノプ
テリン及びチミジンを含む培地である特許請求の
範囲第２項記載の方法。４交雑細胞をクローン化してＴ細胞増殖因子産
生能を有する交雑細胞ラインを得る特許請求の範
囲第２項記載の方法。