JP2599123B2 - 新規なヒトｂセル・リンパ芽球細胞変異株 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、たとえば、人の抗原性疾患の予防、治療、
診断などの医学及び薬学分野や生化学的試薬、生体高分
子の精製試薬など薬理学分野、生化学分野等の如き広い
分野において有用な抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生
産をヒト対外で工業的に行うことを可能とするヒト／ヒ
ト・ハイブリドーマの創製、その他各種の融合細胞株の
形成に利用できる融合パートナー（Fusion partner）と
して有用な新規なヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株に
関する。

本発明はまた、この新規なヒトＢセル・リンパ芽球細
胞変異株を利用して創製される抗原特異的ヒト免疫グロ
ブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブリドーマ、更には該ハ
イブリドーマが生産する抗原特異的ヒト免疫グロブリン
にも関する。

更に詳しくは、本発明はヒトＢセル・リンパ芽球細胞
から導かれた変異株であつて、且つ下記（ｉ）〜（ｖ） （ｉ）６−チオグアニン耐性である、 （ii）ウワバイン耐性である、 （iii）HATO含有培地で死滅する、 （iv）免疫グロブリンIgG及びIgMを実質的に生産しな
い、 （ｖ）基礎培地RDF中にインシュリン、トランスフエリ
ン、セレニウム、エタノールアミン、β−メルカプトエ
タノール及び血清アルブミンを含む無血清培地において
増殖可能である、 の形質（phenotype）特性を有することを特徴とするヒ
トＢセル・リンパ芽球細胞変異株に関する。

本発明はまた、この新規なヒトＢセル・リンパ芽球細
胞変異株を融合パートナーとするヒト／ヒト・ハイブリ
ドーマ、たとえば、ヒト胃癌患者のヒトリンパ球細胞の
如き悪性腫瘍患者のヒトリンパ球細胞と該融合パートナ
ーとのヒト／ヒト融合細胞株である抗原特異的ヒト免疫
グロブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブリドーマ、更に
は、このようなヒト／ヒト・ハイブリドーマが生産する
抗原特異的ヒト免疫グロブリンにも関する。

従来、ヒト／ヒト・ハイブリドーマの形成に利用でき
るヒトリンパ系株化細胞についていくつか知られてい
る。そのような融合パートナーとして利用できるヒトリ
ンパ系株化細胞の例としては、Immunology Today,vol.
4、No.3、1983、73頁のTABLE IIに記載のSKO−007（Ig
ε，λ）、TM−H2（Igλ，κ）、DHMC（Igγ，λ）、GM
1500（Igγ2,κ）、KR−４（Igγ，κ）、LICR−LON−H
My2（Igγ1,κ）、GM0467.3（Igμ，λ）、H351.1（Ig
μ，κ）、UC729−６（Igμ，κ）、GM4672（Igγ2,
κ）などを挙げることができる。しかしながら、これら
従来の公知のヒトリンパ系株化細胞は、上記文献のTABL
E IIに記載され、上記にカツコで示したように、程度の
差こそあれ免疫グロブリンを実質的に生産する点で、そ
の融合パートナーとしての利用に好ましい株とは言い難
く、その利用に制約をうける。その理由は、これらの融
合パートナーと例えば癌患者のヒトリンパ球細胞とから
導かれるヒト／ヒト・ハイブリドーマが生産するヒト免
疫グロブリンは、該融合パートナーが本来生産する免疫
グロブリンが、該癌患者のヒトリンパ球細胞に由来する
目的とする免疫グロブリンに混入したポリ・クロナリテ
イ（poly−clonality）形態で得られるため、目的とす
る免疫グロブリンの単一性（mono−clonality）が失わ
れるからである。

本発明者は、上述のような制約から解放された融合パ
ートナーを創製すべく研究を行つてきた。

その結果、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞から導かれた
変異株であつて、免疫グロブリンを実質的に生産しない
新しいヒトリンパ系株化細胞を創製することに成功し
た。

本発明者は、それ自体公知のヒトＢセル・リンパ芽球
細胞WI−L2〔微工研寄託受託拒否通知書、通知番号:60
微寄文第1621号〕から、薬剤耐性化手法を利用した特定
の変異株形成操作を経て、それ自体増殖能を有するが免
疫グロブリンを実質的に生産しない新規ヒトリンパ系株
化細胞を創製し且つこの新規ヒトＢセル・リンパ芽球細
胞変異株は、ヒト／ヒト・ハイブリドーマの創製その他
各種の融合細胞株の形成に利用できる融合パートナーと
して、前述の如き制約から解放された単一性の高い免疫
グロブリンの生産を可能とする融合細胞株の形成に有用
な新規ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株であることを
発見した。

更に、本発明者は、このヒトＢセル・リンパ芽球細胞
変異株を用いて、ヒト胃癌患者のヒトリンパ芽球細胞と
該ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株とのヒト／ヒト融
合細胞株である抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒ
ト／ヒト・ハイブリドーマの創製に成功し、且つ該抗原
特異的ヒト免疫グロブリンの生産に成功した。

従つて、本発明の目的は、医学、薬理学、生化学分野
等の広い分野において有用な新規ヒトＢセル・リンパ芽
球細胞変異株を提供するにある。

本発明の他の目的は、上記新規ヒトＢセル・リンパ芽
球細胞変異株と悪性腫瘍患者のヒトリンパ球細胞から導
かれる抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト
・ハイブリドーマ、更にはその生産する抗原特異的ヒト
免疫グロブリンを提供するにある。

本発明によれば、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞から導
かれた変異株であつて、且つ下記（ｉ）〜（ｖ） （ｉ）６−チオグアニン耐性である、 （ii）ウワバイン耐性である、 （iii）HATO（ヒポキサンチン、アメソプテリン、チミ
ジン及びウワバイン）含有培地で死滅する、 （iv）免疫グロブリンIgG及びIgMを実質的に生産しな
い、 （ｖ）基礎培地RDF中にインシュリン、トランスフエリ
ン、セレニウム、エタノールアミン、β−メルカプトエ
タノール及び牛血清アルブミンを含む無血清培地におい
て増殖可能である、 の形質特性を有することを特徴とするヒトＢセル・リン
パ芽球細胞変異株が提供できる。

本発明の新規Ｂセル・リンパ芽球細胞変異株は、例え
ば、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞を無血清培地で培養適
応させ、適応した細胞群から実質的に免疫グロブリン生
産能を欠如する細胞をスクリーニングし、他のスクリー
ニングした細胞を６−チオグアニン含有無血清培地で培
養適用させ、斯くて形成された６−チオグアニン耐性細
胞を突然変異剤で処理したのち、ウワバイン含有無血清
培地で培養適応させ、得られた耐性細胞を６−チオグア
ニン及びウワバインの両者を含有する無血清培地でクロ
ーン化することにより創製することができる。

この際利用する無血清培地の例としては、基礎培地RD
F（基礎培地RPMI1640:基礎培地DME:基礎培地F12＝2:1:1
の混合基礎培地）に、インシュリン、トランスフエリ
ン、セレニウム、エタノールアミン、β−メルカプトエ
タノール及び牛血清アルブミンの適量を配合した無血清
培地を好ましく例示することができる。他の無血清培地
も利用でき、培養適応させるヒトＢセル・リンパ芽球細
胞及び基礎培地の種類、上記他の配合成分の種類及びそ
れらの量などに応じて、実験的に適宜に選択、変更、決
定して利用することができる。又、利用する突然変異剤
の例としては、MNNG（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン）、EMS（メチルスルホン酸エチ
ル）、AAB（４−アミノアゾベンゼン）、AAF（２−アセ
チルアミノフルオレン）、AF−２（２−（２−フリル）
−３−（５−ニトロ−２−フリル）アクリルアミド）、
BP_ox（ベンゾピレンオキシド）、BZD（ベンチジン）、D
AB（N,N′−ジメチルアミノアゾベンゼン）、DAN（ジア
ミンアニソール）、DBA（ジベンズアントラセン）、DBE
（ジブロモエタン）、DBP（ジブロモクロロプロパ
ン）、DMN（ジメチルニトロサミン）、ENNG（Ｎ−エチ
ル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、ENU
（エチルニトロソウレア）、HFA（Ｎ−ハイドロキシ−
２−アセチル−アミノフルオレン）、3MCA（３−メチル
コランスレン）、MMS（メチルスルホン酸メチル）、2NA
（２−ナフチルアミン）、NAAAF（Ｎ−アセトオキシア
セチルアミノフルオレン）、NBA（Ｎ−ニトロソジブチ
ルアミン）、4NQO（４−ニトロキノリン−１−オキシ
ド）、OAT（ｏ−アミノアゾトルエン）、PI（プロピレ
ンイミン）、TCE（トリクロロエチレン）、TDS（トルエ
ンジアミノスルフエイト）、TOX（トキサフエン）、VC
（ビニルクロライド）などの公知変異例を例示すること
ができる。

培養適応は、例えば37℃、５％CO₂条件下で行なうこ
とができ、また、クローン化はそれ自体公知の例えば限
界稀釈法を利用して行なうことができる。培養適応手
段、スクリーニング手段、突然変異剤処理手段などの各
単位手段それ自体はよく知られており、適宜に選択利用
することができる。

上記において利用するヒトＢセル・リンパ芽球細胞の
例としては、前述したそれ自体公知のヒトＢセル・リン
パ芽球細胞WI−L2（微工研寄託受託拒否通知書、通知番
号:60微寄文第1621号）のほかに、例えば、ヒトＢセル
・リンパ芽球細胞IM−９（ATCC CCL 159）、ヒトＢセル
・リンパ芽球細胞NC−37（ATCC CCL 214）及びヒトＢセ
ル・リンパ芽球細胞CCRF−SB（ATCC CCL 120）などの如
き公知株化細胞を例示することができる。

上述のようにして得るこのできる前記（ｉ）〜（ｖ）
の形質特性を有するヒトＢセル・リンパ芽球細胞WI−L2
から導かれた変異株の１つはHIH/TO1株（微工研寄託受
託拒否通知書、通知番号:60微寄文第1198号）と命名さ
れた。

本発明によれば、上述のようにして得られるヒトＢセ
ル・リンパ芽球細胞変異株を融合パートナーとして利用
し、抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産をヒト体外で
工業的に行うことを可能とするヒト／ヒト・ハイブリド
ーマの創製を包含して、たとえば悪性腫瘍患者のヒトリ
ンパ球細胞と該変異株とのヒト／ヒト・ハイブリドーマ
の創製、その他各種の融合細胞株を創製することができ
る。

以下、そのような融合細胞株創製の一態様について述
べる。例えば、ヒト胃癌患者のヒトＢセルを用い、これ
を本発明のヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株と人間の
体外で融合させ、たとえば胃癌、肺癌、悪性黒色腫細胞
などの癌関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリ
ン生産能を有するヒト／ヒト・ハイブリドーマを産生す
ることができる。

この融合細胞を産生する融合操作それ自体はよく知ら
れており、本発明で利用することができる。例えば、液
媒中で融合促進剤の存在下に、ヒト胃癌患者のヒトＢセ
ルと本発明のヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株とを接
触させることにより行うことができる。このような融合
方法の例としては、たとえば仙台ビールス（HVJ）、ポ
リエチレングリコールなどの如き融合促進剤を用いる方
法を例示できる。更に、高電圧で電気的に融合する方法
〔例えば、U.Zimmerman et.al.,“Electric Field−Med
iated Cell Fusion" ; The Journal of Biological Phy
sics,10,43−50,1982。U.Zimmerman et.al.,“Electric
Field−Induced Cell−to−Cell Fusion" ; The Journ
al of Membrene Biology,67,165−182,1982。U.Zimmerm
an,“Electric Field Mediated Fusion and Related El
ectrical Phenomena" ; Biochimica et Biophysica Act
a 694,227−277,1982。等〕を利用して行なうこともで
きる。

前者の態様に於いては、例えば、水性媒体中、上記例
示の如き融合促進剤の存在下、所望によりおだやかな攪
拌を加えて系を均一にし、前記ヒト胃癌患者のヒトＢセ
ルと本発明変異株から成る融合細胞が産生される時間、
たとえば数分間のオーダーで両者を接触させることによ
り、所望の融合細胞を産生することができる。利用する
水性媒体の例としては、水、生理食塩水、５％ジメチル
スルホキシド水溶液、５％グリセロール水溶液などを例
示することができる。

斯くて所望の融合細胞が産生された系を、たとえば遠
心分離して細胞群を採取し、再び適当な培地たとえば10
％仔牛血清を含有させた。前記（ｖ）無血清培地にHATO
を加えた培地に、採取した該細胞群を分散させ、この分
散液を例えばマイクロ・タイター・プレートの穴に、夫
々、一定量づつ分取注入し、たとえば５％CO₂の存在
下、37℃で培養し、各穴中の培養液を例えば３日毎に新
しい培養液と取りかえ、たとえば２週間培養を続けたの
ち、顕微鏡下で融合細胞の有無を調べ、コロニーの認め
られた試料の培養液を採取し、ヒト免疫グロブリンの有
無をたとえば¹²⁵Iを用いたラジオ・イムノ・アツセイや
酵素抗体法により検出することにより、所望のコロニー
を選別することができる。

このようにして選別されたヒト免疫グロブリンの生産
の認められたコロニーを、新しい培養液に移して培養
し、融合細胞を増殖させることにより融合細胞クローン
を取得することができる。更に、必要に応じて、サブ・
クローニングして、所望のヒト胃癌、肺癌、悪性黒色腫
などの癌関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリ
ン生産性クローンを得ることができる。

上述の態様で、ヒト胃癌患者のヒトＢ−セルと本発明
ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株から産生された抗原
特異的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブリドー
マTOS/G5株の細胞生化学的性質を以下に示す。

（１）ヒト免疫グロブリンΜ（IgΜ）分泌（生産）、 （２）倍加時間（ダブリング・タイム）〔於（ｖ）無血
清培地〕約40時間、 （３）DNA含量が正常ヒトリンパ球の２倍以上、 （４）上記（１）のIgΜはヒト株化細胞KATO−III（胃
癌）に対して結合性を示す、 （５）HATO含有培地（ヒポキサンチン、アメソプテリ
ン、チミジン及びウワバイン含有培地）中で分裂増殖可
能である。

尚、相対DNA含量（正常ヒトリンパ球のDNA含量に対する
比率）は、ハイブリドーマをプロピジウム・アイオダイ
ドで染色したのち、フローサイトメーター（flow cytom
eter）で分離分析する方法によつて決定された。

本発明によれば、上述のようにして産生することので
きるたとえばヒト胃癌患者のヒトＢセルと本発明ヒトＢ
セル・リンパ芽球細胞変異株から導かれた抗原特異的免
疫グロブリン生産性ヒト／ヒト融合細胞株を利用して、
抗原特異的ヒト免疫グロブリンを得ることができる。該
抗原特異的ヒト免疫グロブリンは上記ヒト／ヒト融合細
胞株を培地に培養し、その培養物より抗原特異的ヒト免
疫グロブリンを採取することにより製造できる。

例えば、上記ヒト／ヒト融合細胞株を適当な培地たと
えば前記（ｖ）の培地で培養し、培養液を採取すること
によりヒト胃癌、肺癌、悪性黒色腫瘍の如きガン関連抗
原に特異的に結合する免疫グロブリン含有物質を得るこ
とができる。精製はたとえば、硫安分画法、アフイニテ
イークロマトグラフイー、ゲル過、イオン交換クロマ
トグラフィー、電気泳動法などの如き生体液から免疫グ
ロブリンを採取、精製する際に利用できると同様な精製
手段を利用して行なうことができる。

本発明によれば、前述した融合細胞クローン又はその
培養液からガン関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グ
ロブリン含有物質又は該免疫グロブリンを取得するに際
し、抗原性組織（例えば癌組織）を一度、免疫物質生産
能を欠如するか若しくは生産能の極めて弱い生体たとえ
ばヌード・マウス（nude mouse）などに植えつけ早期を
維持した後、その組織に対して或いは培養系にもどされ
た組織に対して反応するヒト免疫グロブリン（抗体）を
探し出し、これを分離するのが有利である。

上記ヒト／ヒトハイブリドーマの培養に利用できる培
地の例としては、前記（ｖ）の無血清培地のほかに、例
えば、基礎培地RDFに牛胎児血清、仔牛血清、成牛血
清、ヒト血清などの如き血清を含有させた培地、基礎培
地RPMI1640に上記の如き血清を含有させた培地などを例
示することができる。又、培養条件としては、たとえば
５％CO₂の存在下で37℃の条件を例示できる。

上述のようにして得ることのできる本発明のガン関連
抗原特異的ヒト免疫グロブリンの例として、前述したヒ
ト／ヒト・ハイブリドーマTOS/G5株の生産する本発明の
抗原特異的ヒト免疫グロブリンを例示できる。その特性
を以下に示す。

（イ）ヒト免疫グロブリンΜ（IgΜ）であつて、、 （ロ）ヒト株化細胞KATO−III（胃癌）及びヒト株化細
胞A549（肺癌）に対して結合力を示す、 （ハ）Ｈ鎖（heary chain）及びＬ鎖（light chain）よ
り成り、分子量が約18万である。

上記ヒト株化細胞KATO−III（胃癌）はATCC HTB103とし
て、又ヒト株化細胞A549（肺癌）はATCC CCL185としてA
TCC（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクショ
ン）から自由に入手できる。

本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンは、たとえば
ヒト胃癌、肺癌、脳腫瘍、悪性黒色腫などの如きヒト癌
への作用抗体或いはそれ自体の作用でこれら癌細胞の増
殖抑制、癌細胞の死滅を行わせたり、更に、ヒト体外で
量産されたこれらの癌組織認識抗体に補体もしくはＴ−
リンパ球（マクロフアージ）の助けをかりて癌細胞の増
殖抑制や癌細胞死滅のはたらきをさせたりすることがで
きる。更にまた、ヒト体外で量産されたこれら癌特異的
抗体をキヤリアーとして利用して、例えば化学療法剤結
合−ヒト・モノクロナル抗体、インターフエロン結合−
ヒト・モノクロナル抗体、高分子毒素結合−ヒト・モノ
クロナル抗体、薬物入りリポゾーム結合−ヒト・モノク
ロナル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制や死滅のはたら
きをさせたりするのに有用である。また、本発明のヒト
・モノクロナル抗体をキヤリアーとして利用し、これに
放射線感受性物質を結合させて患者に投与し、癌細胞に
選択的に集まる性質を利用して患部を検知し放射線療法
に利用することができる。このような癌に対する利用に
際しては、ヒト・モノクロナル抗体として完全な抗体を
用いてもよいし、抗体を化学的な手法で特異的抗原認識
部位を含むより小さな分子に切断して用いたり、或は、
そのような小さな分子もしくは特異的抗原認識部位のみ
を他の抗体の非特異的抗原認識部分と結合させて、より
有効性のある修飾ヒト・モノクロナル抗体を化学的手法
で創製して用いることもできる。

以下、実施例により、本発明の数態様について更に詳
しく説明する。

実施例１ ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株。

ヒトＢセル・リンパ芽球細胞WI−L2（微工研寄託受諾
拒否通知書、通知番号:60微寄文第1621号）を、基礎培
地RDF中にインシュリン、トランスフエリン、セレニウ
ム、エタノールアミン、β−メルカプトエタノール及び
牛血清アルブミンの適量を含有する無血清培地で培養適
応させる。該無血清培地を分注した96穴マイクロタイタ
ープレートに1cell/wellとなるように植えこみ、５％CO
₂、37℃の条件下で限界稀釈法によりクローニング操作
を行なう。約１ケ月経過後、増殖してきた50穴より免疫
グロブリンIgG及びIgMを実質的に培地中に生産していな
いクローンを１つ選び出した。

このクローンを、まず0.1μＭの６−チオグアニンを
含む前記と同様な無血清培地中で培養適応させる。培養
は５％CO₂、37℃条件下で、継代培養をくり返すごと
に、６−チオグアニン濃度を0.2μＭ、0.5μＭ、１μ
Ｍ、２μＭ、４μＭ、10μＭ、15μＭ、20μＭと段階的
に上げて行ない、最終的に20μＭの６−チオグアニン含
有無血清培地中で増殖可能な単クローンを、前記と同様
な限界稀釈法によるクローニング操作で選別する。

この細胞を、１μg/mlの突然変異剤MNNG（Ｎ−メチル
−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を含有する
基礎培地RDF中で、５％CO₂、37℃の条件下で３時間培養
した後、前記と同様な無血清培地で洗浄し、洗浄した細
胞を20μＭの６−チオグアニン及びウワバインを含む前
記と同様な無血清培地中で培養適応させる。培養は５％
CO₂、37℃の条件下で、継代培養をくり返すごとに、ウ
ワバインの濃度を0.1μＭ、0.2μＭ、0.5μＭ、１μ
Ｍ、５μＭと段階的に上げて行ない、最終的に20μＭの
６−チオグアニン及び５μＭのウワバインを含む無血清
培地中で増殖可能な単クローンを、前記と同様な限界稀
釈法によるクローニング操作で選別する。

斯くて創製されたヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株
は前記（ｉ）〜（ｖ）の形質特性を示し、HIH/TO1株と
命名された。

実施例２ 胃癌患者から手術の際に癌組織周辺のリンパ節を入手
した。リンパ節をハサミで細かく切りきざみ、内部のリ
ンパ球を培地RDF（RPMI1640:DME:F−12＝2:1:1）中に分
散させ、続いて２重のガーゼを用いて、過を行い、脂
肪層を除いた後に、液中の細胞（リンパ球＞80％）を
遠心法によつて集める。その後、癌患者由来のリンパ球
分画（ドナーＢセル）を20％牛胎児血清および、10％ジ
メチルスルホオキサイド（DMSO）を含むRDF培地中で凍
結（−130℃）し、細胞融合を行うまで保存した。

ドナーＢセルと免疫グロブリン生産能を実質的に欠損
している前記実施例１で得た親ヒトＢ−セル（HIH/TO
1）のそれぞれを１×10⁷および２×10⁷個混合し、35％
ポリエチレングリコール1500の存在下に融合を完了させ
る。その後、100×ｇ、10分間の遠心処理を行つてポリ
エチレングリコールを除き、新たに、10％牛胎児血清お
よび、ヒポキサンチン、アメソプテリン、チミジン、ウ
ワバイン（HATO）を含むRDF培地を加える。この細胞群
を含む培養液200μｌ（この中には１×10⁵個のセルを含
む）づつを96個の穴をもつミクロプレートに分注し、約
20日間、37℃、５％CO₂条件下のインキユベーターで培
養した。この間、HATO及び10％牛胎児血清を含むRDF培
地を３日に１度交換した。親Ｂ−セル（HIH/TO1）はア
メソプテリン存在下ではヒポキサンチンホスホリボシー
ルトランスフエラーゼを欠損しているため、生きること
が出来ない。またドナーＢセルは、ウワバインを含むRD
F＋10％牛胎児血清中では永続的に増殖し生きのびるこ
とができない。よつてHATOを含む培地で永続的に増殖し
た細胞はドナーＢセルと親Ｂ−セル（HIH/TO1）の融合
した細胞である。３週間培養の後、ミクロプレートの96
個の穴の中に７個のハイブリドーマのサブクローンが見
つけられた。このうちの１個のハイブリドーマサブクロ
ーンは更にクローン化されるために、集められ、新たに
10％牛胎児血清及び、HATOを含むRDF培地を加え、懸濁
させる。この細胞群を含む培養液を96個の穴をもつミク
ロプレートに各穴に３個の細胞が入るように分注し、約
１ケ月、37℃、５％CO₂条件下のインキユベーターで培
養した。この間、HATO及び10％牛胎児血清を含むRDF培
地を６日に１度交換した。生じたサブクローンのうち最
も増殖率のよいものを選び、TOS/G5と命名した。これが
ハイブリドーマであることをさらに確認するために、細
胞内DNA含量を調べた。その方法を以下に説明する。

遠心管の中に培養細胞液を入れ遠心処理により上清を
除去する。70％エタノーク溶液で30分以上固定を行う。
遠心処理により上清を除き、RNA分解酵素（RNase）溶液
を加え、静かに振盪し、RNAを分解する。37℃で30分間
反応させた後、再蒸留水で２度洗浄する。プロピデイウ
ムイオダイド（PI）を加え、室温で20分間、染色した後
再蒸留水で２度洗浄する。再蒸留水で希釈し、セルソー
ターを用いて分析した結果、TOS/G5にはドナーＢセルの
２倍以上のDNA含量が認められた。以上の結果より、TOS
/G5はハイリドーマであることが確認された。

このTOS/G5がヒト免疫グロブリン（HuIg）を産出して
いることを酵素抗体法を用いて確かめた。以下、その方
法を説明する。

ミクロタイタープレートの中に抗ヒト免疫グロブリン
抗体を滴下（50μｌ）し、37℃で１時間プレートに吸着
させる。0.3％のゼラチンを含む10mM PBS（ゼラチン緩
衝液）で３回洗浄した後、５％牛血清アルブミン溶液を
滴下（200μｌ）し、37℃で１時間吸着させる。ゼラチ
ン緩衝液で３回洗浄し、未吸着のものを除去する。次に
検液（培養上清）を滴下（50μｌ）して、37℃で１時間
反応後、ゼラチン緩衝液で３回洗浄する。ペルオキシダ
ーゼ結合ヤギ抗ヒトIg抗体を滴下（50μｌ）して、37℃
30分間反応させ、培養上清中のヒトIgと結合させる（酵
素抗体法）。ゼラチン緩衝液で３回洗浄後、過酸化水素
とｏ−フエニレジアミンを含む基質溶液を加え、暗室で
10分間反応させる。５NH₂SO₄（50μｌ）を加え反応を止
める。もしミクロプレート上にペルオキシダーゼ結合ヤ
ギ抗ヒトIg抗体が残つている場合、すなわちそれに結合
されるヒトIgが残つている場合には490nmに吸収をもつ
黄色の基質反応物が生産される。この量を吸光度計を用
いて測定し、ハイブリドーマ培養上清中に含まれるヒト
Igの量を知る。ハイブリドーマ培養上清中にヒトIgが存
在しない場合には、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIg
抗体は洗浄の段階で洗い流される。

以上の測定方法を用いた結果TOS/G5はヒトIgΜを生産
していることがわかつた（ドナーＢ−セルと同形質のI
g）。

１ケ月後にTOS/G5を24個の穴をもつミクロプレート
（2ml/穴）に植えかえた後さらに１週間培養を続けた。
その培養液の上清を採取し、種々の株化細胞を標的細胞
としてヒトハイブリドーマから生産されるIgの特異性を
調べた。その方法を以下に説明する。

ヒトの種々の株化培養細胞を、DF培地（DME:F−12＝
1:1）に10％牛胎児血清を加えた培地で培養する。細胞
の数が５×10⁶〜１×10⁷になつた段階でトリプシンを用
いて細胞をシヤーレの底面から剥がし、遠心法を用いて
細胞を集め、培地でよく洗浄する。96個の穴をもつミク
ロタイタープレートの各穴に細胞を一定数（10⁵/100μ
ｌ）ずつ分注し、37℃で１晩、プレートに吸着させる。
次に３％グルタルアルデヒド溶液を滴下（50μｌ）し、
37℃で20分間、細胞の固定を行う。遠心法（200g,10分
間）で細胞をおとし、ゼラチン緩衝液で３回洗浄した
後、１％牛血清アルブミン溶液を滴下（200μｌ）し、3
7℃で１時間プレートに吸着させる。ゼラチン緩衝液で
３回洗浄し、未吸着のものを除去する。その後、検液
（培養上清）を細胞の上に滴下（50μｌ）し、37℃で１
時間反応させ、ゼラチン緩衝液で３回洗浄する。続いて
ペルオキシダーゼ結合抗ひとIg抗体を滴下（50μｌ）
し、37℃で30分間、反応させる。ゼラチン緩衝液で３回
洗浄を行つた後、先述の酵素抗体法で述べた方法によつ
て細胞に結合する培養液中のヒトIgの量を測定する。

以上の方法によつてTOS/G5のIgΜの標的細胞特異性を
それぞれ調べた結果、TOS/G5の培養液中のIgΜは胃癌由
来の株化細胞KATO−III及びAGSに対して結合力を有して
おり、本発明者の検討によれば胃癌以外の株化細胞であ
るA549（肺癌）に対しても結合力を有する。

すなわち、ドナーＢ−セルは体内に胃癌をもつ患者か
ら採取されたものであるので、細胞融合法によつて作り
だされた自己増殖性をもつハイブリドーマのクローンか
らは、ドナーＢ−セルと同形質のかつ特定の抗原結合部
位をもつモノクロナール（単一）抗体を生産しているこ
とを示している。

約４週間後に、ハイブリドーマの培地からHATOを除き
RDFを基礎培地とする前述（ｖ）の無血清培地で培養、
倍加時間40時間で、TOS/G5は１×10⁶個/ml細胞が培地で
生育する時約１μg/mlの量でヒトIgΜを生産し続けてい
る。

ハイブリドーマの多量培養液を70％の硫酸アンモニウ
ムで沈澱させ、粗Ig分画を集めた。得られた沈澱を生理
食塩水に溶かし、ヤギ抗ヒトIgΜを結合させたセフアロ
ースを用いてアフイニテイクロマトグラフイーの手法で
IgΜを精製した。TOS/G5の培養液1lから精製したIgΜ1m
gが得られた。この精製したIgΜを標品をSDS−電気泳動
法で分析した結果、ヒトIgと同形質の分子量180,000のI
gΜを生産していることが確かめられた。

実施例３ 上記実施例２における胃癌患者とは別の胃癌患者から
入手したリンパ節を用いるほかは、実施例２と同様に行
って、実施例２と同様な抗原特異的ヒト免疫グロブリン
を生産する実施例２と同様なヒト／ヒト・ハイブリドー
マTOS/H8（微工研寄託受胎拒否通知書、通知番号:61微
寄文第844号）が得られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトＢセル・リンパ芽球細胞から導かれた
   変異株であって、且つ下記（ｉ）〜（ｖ） （ｉ）６−チオグアニン耐性である、 （ii）ウワバイン耐性である、 （iii）HATO含有培地で死滅する、 （iv）免疫グロブリンIgG及びIgMを実質的に生産しな
   い、 （ｖ）基礎培地RDF中にインシュリン、トランスフエリ
   ン、セレニウム、エタノールアミン、β−メルカプトエ
   タノール及び血清アルブミンを含む無血清培地において
   増殖可能である、 の形質特性を有することを特徴とするヒトＢセル・リン
   パ芽球細胞変異株HIH/TO1。