JPH0763363B2 - 融合細胞の取得方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、融合細胞の取得方法に関し、さ
らに詳しくは、制癌活性物質、インターェロン、インタ
ーロイキン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、モノクローナル抗体等の
各種の有用な生理活性物質の生産能を有し且つ基礎培地
で増殖可能な融合細胞の取得方法に関する。

【０００２】制癌活性物質、免疫賦活性物質、インター
フェロン、インターロイキン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、モノク
ローナル抗体等のヒトに有用な各種の生理活性物質は、
通常、ヒトの株化細胞を用いて生産されているが、これ
らの株化細胞を培養する場合、一般には、基礎培地に５
〜１０％（ｖ/ｖ）程度の仔牛血清を添加した完全細胞
培養培地や、基礎培地にインシュリン、トランスフェリ
ンなどのペプチド性成長因子を添加した完全細胞培養培
地が使用されている。

【０００３】しかしながら、かかる完全細胞培養培地を
用いる株化細胞の培養法は、高価な仔牛血清や成長因子
を使用するために有用生理活性物質の生産コストが高く
なり及び／又はロット毎の有用生理活性物質の生産量の
バラツキが大きくなる、有用生理活性物質中に異種タン
パクが混入する等の問題があり、工業的規模での培養に
は不向きである。

【０００４】そこで、本発明者らは、仔牛血清や成長因
子の添加を必要としない基礎培地で有用生理活性物質の
生産能を有する細胞を培養すれば、上記の如き問題点を
克服することができると考え、基礎培地で増殖可能な有
用物質生産性細胞を取得すべく研究を行なった。

【０００５】その結果、基礎培地で増殖可能な動物細胞
と、目的の有用生理活性物質の生産能を有し、完全培地
で増殖するが基礎培地では実質的に増殖しない動物細胞
とを融合させることによって、上記目的を達成しうるこ
とを見い出し本発明を完成するに至った。

【０００６】かくして、本発明によれば、 （ａ） 基礎培地で増殖可能な動物細胞と、 （ｂ） 有用物質の生産能を有し、完全培地で増殖する
が基礎培地では実質的に増殖しない動物細胞 を融合せしめ、そして有用物質の生産能を有し且つ基礎
培地で増殖可能な融合細胞クローンを採取することを特
徴とする有用物質の生産能を有し且つ基礎培地で増殖可
能な融合細胞の取得方法が提供される。

【０００７】以下、本発明の方法についてさらに詳細に
説明する。なお、本明細書において、「基礎培地」と
は、アミノ酸類、塩類、糖、ビタミン類、微量元素等を
含有する動物細胞の培養に関して最低限度細胞を生かす
に必要な栄養源を有する培地である。たとえば、イーグ
ルの基礎培地、ダルベッコの基礎培地、Ｌ−１５培地、
マッコイ５Ａ培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、ハムＦ−
１２培地などがあげられる。また、これらのうちのいく
つかを適当な割合で混合した培地も基礎培地に包含され
る。たとえば、ダルベッコの基礎培地とハムＦ−１２培
地を１：１で混合したＤＦ培地があげられる。また、
「完全培地」とは、基礎培地に各々の細胞の増殖、機能
発現にとって必要な栄養源を添加した培地であって、代
表的には、ウシ胎児血清を１０％（ｖ/ｖ）程度添加し
たものがあげられる。さらに血清の代わりに、アルブミ
ン、トランスフェリンなどの担体タンパク質；インスリ
ン、ステロイドホルモンなどのホルモン類；ＥＧＦなど
の細胞成長因子；コラーゲン、フィブロネクチンなどの
細胞外マトリクス物質などを基礎培地に添加して、各々
の細胞の増殖機能発現を可能とした無血清培地も完全培
地に包含される。

【０００８】さらに「有用物質」には、細胞が産生する
物質であって、ヒトを含めた動物種に対して重要な生理
活性をもつ物質が包含され、たとえば、造血因子エリス
ロポエチン、血栓溶解作用をもつＴＰＡ（ティシュー・
プラスミノーゲンアクチベーター）、ある種の癌腫に効
果があると言われているインターフェロン、ある特定の
抗原に反応するモノクローナル抗体、ヒトリンパ球を活
性化するインターロイキン、白血球の増殖を促すＣＳＦ
（コロニー・スティミュレイティング・ファクター）な
どがあげられる。

【０００９】本発明の方法の主たる特徴は、前述したと
おり、 （ａ） 基礎培地で増殖可能な動物細胞［以下、動物細
胞（ａ）という］と、 （ｂ） 有用物質の生産能をを有し、完全培地で増殖す
るが基礎培地では実質的に増殖しない動物細胞［以下、
動物細胞（ｂ）という］ とを融合せしめる点にある。

【００１０】動物細胞（ａ）としては、細胞内又は細胞
外に、自己の増殖に必要な成長因子を分泌する能力のあ
る、いわゆるオートクリナル（ａｕｔｏｃｒｉｎａｌ）
な性質を有するタイプの細胞株が包含され、例えば、Ａ
４３１（ヒト、類表皮癌）、ＨｅＬａ−Ｐ３（ヒト子宮
癌）、ＨｕＬ−１−Ｐ３（ヒト胚肝臓）、ＭＤＣＫ−Ｐ
３（イヌ肝臓）、ＭＤＢＫ−Ｐ３（ウシ肝臓）、Ｌ−Ｐ
３（マウス胚）、ＪＴＣ−２１−Ｐ３（ラット肝臓）、
ＪＴＣ−２５−Ｐ３（ラット肝臓）、ＪＴＣ−１６−Ｐ
３（ラットヘパトーマ）、ＲＳＰ−２−Ｐ３（ラット脾
臓）、ヒト赤血白血病由来細胞株Ｋ−５６２等が挙げら
れる［上記においてカッコ内は細胞起源（種、組織）を
意味する］。

【００１１】なお、本明細書において、「動物細胞」な
る語は、動物から採取したそのままの細胞のみならず、
それを遺伝子操作技術によって組み換え及び／又は融合
させることによって創製された細胞をも包含する意味で
使用する。

【００１２】上記動物細胞（ａ）と融合せしめられる動
物細胞（ｂ）は、前述した如き有用物質の生産能を有
し、完全培地で増殖する好ましくは、永久継代培養でき
るが基礎培地では実質的に増殖しないものであれば、特
に制限はなくどのような種類のものであってもよいが、
通常、少なくとも１種の選択マーカー、例えば抗生物質
耐性を有しているものが望ましい。そのような動物細胞
（ｂ）の具体例としては、インターフェロンαの生産能
をもつＢＡＬＬ−１細胞、インターフェロンαの生産能
をもつＮＡＭＡＬＷＡ細胞、種々の癌細胞由来の細胞株
に対して結合能を有するＩｇＭモノクローナル抗体の生
産能をもつＴＯＳ／Ｈ８ハイブリドーマ；ＩＬ−１の生
産能を有するＴＨＰ−１細胞又はＵ−９３７細胞；ＩＬ
−２生産能を有するＪｕｒｋａｔ細胞又はＨｕＴ−７８
細胞；ＣＳＦ、ＩＬ−２又はインターフェロンの生産能
を有するＭｏ細胞等が挙げられる。

【００１３】動物細胞（ａ）と動物細胞（ｂ）の融合は
それ自体既知の方法、例えば、Hideaki Hagiwara and J
unzo Nagao，J．Immunol，Methods，１３５、２６３−
２７１（１９９０）等の文献に記載されている方法によ
って行なうことができる。

【００１４】例えば、融合操作は、液媒中で融合促進剤
の存在下に動物細胞（ａ）と動物細胞（ｂ）とを接触さ
せることにより行なうことができる。ここで使用しうる
融合促進剤としては、例えば、仙台ウィルス（ＨＶ
Ｊ）、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。ま
た、液媒の例としては、水、生理食塩水、５％ジメチル
スルホキシド水溶液、５％グリセリン水溶液などが挙げ
られる。

【００１５】しかして、融合操作は、例えば、上記の如
き水性媒体中において、上記の如き融合促進剤の存在下
に、所望により緩かに撹拌して系を均一にし、次いで動
物細胞（ａ）と動物細胞（ｂ）とからなる融合細胞が形
成されるに充分な時間、例えば数分間のオーダーで静置
することにより目的とする融合細胞を形成せしめること
ができる。

【００１６】このようにして融合細胞が産生された系
を、例えば、遠心分離により細胞群を集め、再び適当な
基礎培地、たとえば動物細胞（ｂ）がある種の薬剤に対
する耐性を持っていれば、その薬剤を加えた基礎培地に
該細胞群を分散させ、この分散液をたとえば組織培養用
９６穴プレートに一定量ずつ分注し、たとえば５％ＣＯ
₂存在下３７℃で培養する。各穴中の培養液をたとえば
３日毎に新しい培地と交換し、たとえば２週間培養を続
けた後、顕微鏡下で融合細胞の有無を調べ、コロニーの
認められた穴の培養液を採取し、たとえば、ＥＬＩＳＡ
法を用いて培養液中の目的とする有用物質の有無を検出
する。

【００１７】有用物質の産生が認められたコロニーを新
しい培養液に移して培養し、融合細胞を増殖させること
により融合細胞クローンを得ることができる。更に、必
要に応じてサブ・クローニングして有用物質生産能のす
ぐれたクローンを得ることができる。

【００１８】以上に述べた如くして採取される本発明の
融合細胞は、動物細胞（ｂ）の形質に由来する有用物質
の生産能を有しており、しかも基礎培地で継代的に増殖
（培養）が可能なものである。

【００１９】従って、本発明の方法によって提供される
融合細胞は、従来のように、高価な仔牛血清や各種成長
因子無添加の培地で培養増殖を行なうことができ、培養
コストの大幅な低減化を図ることができる。また、本発
明によれば、各ロット各に変動する活性を有している血
清や成長因子類を採用することなく安定した細胞培養が
可能であり、培地作製時に各種成長因子類の管理、秤
量、調製操作がいらず簡便な培地作製ができる。さら
に、本発明の方法によれば、多種の未知の栄養因子を含
んでいる血清などと異なり調製時の培地組成が明らかで
あり、かつ単純であるため、細胞の増殖、有用物質の産
生に影響を与える因子の検討を容易に行なうことができ
る。また、得られる融合細胞は、基礎培地中に有用物質
を産生するため、有用物質の精製の際に血清を含む培地
や成長因子類を含む培地に比べて、除去すべき有用物質
以外の物質が圧倒的に少なく、精製工程の簡略化が可能
となる等、種々の利点がある。

【００２０】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明する。

【００２１】

【実施例】

実施例１：基礎培地で増殖可能な動物細胞Ａ４３１のク
ローニング 類表皮癌由来細胞株Ａ４３１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５５
５）より基礎培地のみで増殖するクローンを得るため
に、次のようにしてセルクローニングを行った。まず、
ハイブリドーマ・ティシュー・カルチャー・ディッシュ
（グライナー社、カタログ No.６３３１６０）に、Ａ４
３１ １０⁴個をＤＦ培地（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２＝１：
１）５ｍｌに懸濁してまいた。３７℃、５％ＣＯ₂条件
下で約１週間培養後、約３００個のウェルに細胞の増殖
が見られた。このうち、特に増殖のよいウエル１０個を
選んで、９６ウェルプレートに移し培養した。この中か
ら特に増殖の良いクローン３個を選び、２４ウェルプレ
ート、６ウェルプレート、１０ｃｍディッシュと順次培
養スケールを大きくして細胞を増やした。一部を凍結保
存後、１つのクローンを用いて増殖曲線の作成を行っ
た。このクローンをＡ４３１ｃと命名する。

【００２２】φ＝６０ｍｍの組織培養用ディッシュに、
１枚当り１０⁴個のＡ４３１ｃをまき、３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂条件下で培養を開始した。約２４時間毎に細胞の測
定を行つた。細胞の測定は、培地を吸引除去後、０.２
５％トリプラン及び０.０２％ＥＤＴＡを含むＰＢＳに
より細胞をはがし、コールターカウンターを用いて実施
した。その結果を図１に示す。培養開始後、Ａ４３１ｃ
は、約１５時間の培化速度で増殖した。５日間培養後、
培地は黄色となり増殖は止まるが、新しい培地に置きか
えると再び増殖を開始し、２×１０⁶個まで増殖しコン
フルエントに達した。

【００２３】実施例２：Ａ４３１ｃとＴＯＳ／Ｈ８ハイ
ブリドーマとの細胞融合 実施例１で得られたＡ４３１ｃとＴＯＳ／Ｈ８ハイブリ
ドーマ［Ｈｉｄｅａｋｉ Ｈａｇｉｗａｒａ ａｎｄ
Ｊｕｎｚｏ Ｎａｇａｏ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ，１３５、２６３−２７１（１９９０）参照］
の細胞融合を行った。ＴＯＳ／Ｈ８は、６−チオグアニ
ン及びウワバイン耐性のヒトリンパ芽球ＨＩＨ／ＴＯ−
１と胃癌患者由来リンパ球との細胞融合により得られた
ヒト・ヒトハイブリドーマであり、種々の癌細胞由来細
胞株に対して結合能を有するＩｇＭモノクローナル抗体
を分泌する。

【００２４】融合は Ｈａｇｉｗａｒａ らの方法［Ｈ
ｉｄｅａｋｉ Ｈａｇｉｗａｒａａｎｄ Ｊｕｎｚｏ
Ｎａｇａｏ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，１
３５、２６３−２７１（１９９０）］に従って行なっ
た。すなわち、対数増殖期のＡ４３１ｃ １．２×１０
^７個及び、ＴＯＳ／Ｈ８ ５．５×１０^６個を５０ｍｌ
の遠心チューブ内で混合し、１５００回転、１５分遠心
した。上清を除去し、細胞ペレットに５０％（ｖ／ｖ）
ポリエチレングリコール１５４０を１ｍｌ滴下する。そ
の後、２分毎に、ＤＦ培地を１ｍｌ、２ｍｌ、４ｍｌ、
８ｍｌの順に加える。５００回転、５分間の遠心後、上
清を除去し、１０ｍｌのＤＦ培地を静かに加えゆっくり
細胞ペレットをほぐす。９６ウェルプレートに細胞懸濁
液を１ウェル当り１００μｌとなるように分注し、３７
℃、５％ＣＯ_２条件下で培養する。１晩培養後１０^−６
Ｍウワバインを含むＤＦ培地を１ウェル当り１００μｌ
添加する。さらに１晩培養後、培地の交換、すなわち、
１００μｌの培地を除き、新たに、１００μｌのウアバ
インを含むＤＦ培地を添加した。その後、２〜３日毎に
培地の交換を行ないながら培養を継続した。約１ケ月培
養後、９６ウェルプレートのすべてのウェル内の細胞を
２４ウェルプレートに移し、培養を継続した。２４ウェ
ルプレートで特に増殖のよいクローン５個選んで培養ス
ケールを上げた。一部を凍結保存し、１つのクローンを
用いて限界希釈法によるクローニングを行ない６個のク
ローンを得た。この中で最も抗体産生のよかったものを
ＴｒｉＨ８と命名した。

【００２５】実施例３：ＴｒｉＨ８の基礎培地中での増
殖及び抗体産生 ＴｒｉＨ８のＤＦ培地中での増殖及び抗体産生量を調べ
た。ＤＦ培地３０ｍｌに、ＴｒｉＨ８が１ｍｌ当り１０
^５個となるように接種し、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で
培養を開始した。対象としてＴＯＳ／Ｈ８をＤＦ培地及
び１０％ＦＢＳを含むＤＦ培地で培養して比較した。約
２４時間毎に、培養液のサンプリング、細胞数の測定を
行った。細胞数の測定はコールターカウンターを用いて
行なった。抗体産生量は次の方法で測定した。イムノ・
アッセイ用９６ウェルプレート（ヌンク社）に、抗ヒト
ＩｇＭ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社）１μｇ／ｍｌを１００μ
ｌ分注後、３７℃で３０分インキュベートする。０．３
％ゼラチンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ゼラチン・バ
ッファー）により洗浄後、１％（ｗ／ｖ）ウシ・血清ア
ルブミンによりブロッキングを行なう。洗浄後、標準ヒ
トＩｇＭ及び被検サンプルを希釈したものを５０μｌ分
注し、３７℃、１時間インキュベートする。洗浄後、ペ
ルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＭ抗体（タゴ社）を１０
０μｌ分注し、３７℃、３０分インキュベートする。こ
の間に、基質溶液を作成する。１２ｍｇの塩酸ｏ−フェ
ニレンジアミンを３０ｍｌのクエン酸バッファー（ｐＨ
５．０）に溶解し、３０％Ｈ_２Ｏ_２を６μｌ加えて基質
溶液とする。洗浄後、基質溶液５０μｌ加えて暗所にて
１５分反応させる。５Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を５０μｌ添加し
て反応を止め、マイクロ・プレートリーダー（コロナ
社）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。標準曲線より
抗体濃度を決定した。増殖及び抗体産生量を図２に示
す。ＴｒｉＨ８はＤＦ培地中で３０〜４０時間の培化時
間で増殖する。ＴＯＳ／Ｈ８はＤＦ培地中ではほとんど
増殖しなかった。抗体産生に関しては特異性、生産量と
もにＴＯＳ／Ｈ８の性質を具現していた。

【００２６】次に、数代の継代培養が可能かどうかを調
べた。ＤＦ培地３０ｍｌに１０⁵個／ｍｌとなるように
ＴｒｉＨ８を接種し、３日〜４日培養後、再び１０⁵個
／ｍｌで培養を始める。これを繰り返し、各代の培養終
了時の抗体産生量を測定した結果が２５代目まで継続培
養を行なっても抗体生産が枯かつすることなく続いた。

【００２７】実施例４：ＴｒｉＨ８の細胞化学的な分析 （１）相対ＤＮＡ含量の比較 ＴｒｉＨ８がＡ４３１とＴＯＳ／Ｈ８の融合によって得
られた細胞かどうかを確かめるために、セルソーターに
よる相対ＤＮＡ含量の比較を行った。

【００２８】細胞を７０％（ｖ/ｖ）エタノールで固定
し、洗浄後、ＲＮａｓｅ処理を３７℃、３０分行った。
蒸留水で洗浄後、５０μｇ／ｍｌのプロピデイウム・ア
イオダイドを室温で２０ｍｉｎ反応させた。蒸留水で洗
浄後、適当な濃度に希釈し、セルソーターによる分析を
行った。

【００２９】ＴＯＳ／Ｈ８及びＴｒｉＨ８の分析結果を
図３に示す。ＴｒｉＨ８のピークがＴＯＳ／Ｈ８のもの
に比べて右へシフトしているのがわかる。すなわち、相
対ＤＮＡ含量が多くなっていることを示している。

【００３０】（２）細胞表面ＥＧＦリセプターの存在 Ａ４３１が細胞表面に異常に多くのＥＧＦ（上皮細胞成
長因子）リセプターを発現していることはよく知られた
事実である。ＴｒｉＨ８がＡ４３１ｃとの融合により得
られたものであれば、ＴｒｉＨ８の細胞表面にもＥＧＦ
リセプターが存在するはずである。次の方法でＴｒｉＨ
８、ＴＯＳ／Ｈ８及びＡ４３１ｃの各細胞表面のＥＧＦ
リセプターの存在を調べた。

【００３１】まず細胞をＤＦ培地で洗浄後、３．５％ホ
ルムアルデヒドで室温、５分間の固定を行った。ＰＢＳ
で洗浄後、０．５％スキムミルクで、３７℃、３０分ブ
ロッキングを行った。洗浄後、マウス抗ヒトＥＧＦリセ
プター抗体（ＵＢＩ社）を３７℃で１時間反応させた。
洗浄後ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｓｏｔｈ
ｉｏｃｙａｎａｔｅ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃ
ａｐｐｅｌ社）を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。洗浄
後、蛍光顕微鏡により観察した。その結果、ＴＯＳ／Ｈ
８ではＥＧＦ−リセプター陰性であるが、ＴｒｉＨ８、
はＥＧＦ−リセプター陽性であった。

【００３２】（３）ＥＧＦに対する反応性 Ａ４３１は細胞表面にＥＧＦリセプターを発現している
一方、培養液中にＥＧＦを添加すると増殖が抑制される
［DAVID W．BARNES，J．Cell Biol.,９３、１（１９８
２)、参照］。Ａ４３１ｃと融合して得られたＴｒｉＨ
８がＥＧＦの影響を受けるかどうか調べた。

【００３３】２４ウェルプレートに、Ａ４３１ｃ及びＴ
ｒｉＨ８を１ウェル当り１０⁴個となるようにＤＦ培地
に懸濁し、分注した。それにヒトＥＧＦ（ＵＢＩ社、N
O．０１−１０７）を０〜１０μｇ／ｍｌとなるように
添加し培養を開始した。７日間培養後、Ａ４３１ｃは培
養液を吸引除去後、プレートに付着している細胞をＥＤ
ＩＡ−トリプシン溶液によりはがし、コールターカウン
ターにより細胞数を測定した。ＴｒｉＨ８は抗体濃度測
定のために、一部培養液をサンプリングした後、コール
ターカウンターにより細胞数の測定をした。

【００３４】Ａ４３１ｃは５μｇ／ｍｌで対照の１５％
しか増殖せず、１０μｇ／ｍｌ以上ではほとんどの細胞
が死滅してしまった。一方、ＴｒｉＨ８は１μｇ／ｍｌ
以上で増殖抑制傾向が見られた。そこで、ＥＧＦ濃度を
５０μｇ／ｍｌまで上げて同様の実験を行った。対象と
してＴＯＳ／Ｈ８を用いた。ＴＯＳ／Ｈ８は血清入り培
地中での増殖に関してＥＧＦによりほとんど影響を受け
ないのに対して、ＴｒｉＨ８は１０μｇ／ｍｌで急激に
細胞が減少し、濃度が上がるにつれて増殖が抑制され
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は実施例１でクローン化されたＡ４３１ｃ
の増殖曲線（ＤＦ培地中）であり、

【図２】図２はＴｒｉＨ８及びＴＯＳ／Ｈ８のＤＦ培地
中で増殖及び抗体産生量のグラフであり、

【図３】図３はＴｒｉＨ８及びＴＯＳ／Ｈ８の相対ＤＮ
Ａ含量を比較したグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ） 基礎培地で増殖可能な動物細胞
   と、 （ｂ） 有用物質の生産能を有し、完全培地で増殖する
   が基礎培地では実質的に増殖しない動物細胞 を融合せしめ、そして有用物質の生産能を有し且つ基礎
   培地で増殖可能な融合細胞クローンを採取することを特
   徴とする有用物質の生産能を有する基礎培地で増殖可能
   な融合細胞の取得方法。