JPH02186980A - ニワトリチミジンキナーゼ欠損ｂリンパ芽細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はニワトリより得られた株化細胞、その製造方法
、この株化細胞に免疫したニワトリ脾細胞を結合した融
合細胞及びこの融合細胞を利用した抗体の製造方法に関
するものである。

〔従来の技術］ ニワトリ免疫グロブリンＩｇＧは呻乳動吻由来のＩｇＧ
との交差反応性が非常に低いことが知られている　（Ｉ
ｌａｄｇｅ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１．　Ｉｍ
ｍｎｎｏｌ、＋２Ｌ　６９９−７０７．１９８４）。ま
た、ニワトリＩｇＧはプロティンＡと結合しないことも
知られている（Ｇｕｓｓ、　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、　ＥＭ
ＢＯＪ、、　５．１５６７−１５７５．１９８６）。

さらに、ニワトリ抗体は咄乳動物血清の補体系を活性化
せずリューマチ因子とも反応しないという利点も有して
いる（Ｌａｒｓｓｏｎ、　Ａ、＋　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、
　Ｉｍ−ｍｕｎ６１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１０８．２
０５−２０８＋　１９８８）。そこで、ニワトリ抗ヒト
補体抗体を用いてｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ免疫複合体を
測定する分析法が最近確立された（Ｌ−ａｒｇｓｏｎ、
　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、　１１３９３−９９．１９８８）。これ
らの事実はニワトリ抗体が咄乳動物免疫分野において極
めて有用なものであることを示している。従って、ニワ
トリ単クローン抗体を供給できれば鳥類の免疫分野のみ
ならず噛乳動物免疫分野においても有効な手段として利
用されるものと思われる。しかるに、ニワトリ由来のニ
ワトリ単クローン抗体作成用の親細胞株はまだ樹立され
た例が知られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

ニワトリ由来（ＨＧＰＲＴ欠損、ＴＫ欠損）のＢ細胞株
を樹立し、これに免疫したニワトリ脾細胞を融合させれ
ばニワトリモノクローナル抗体を取得することができる
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者はこのような目的を達成するべく鋭意研究を行
ない、マウスミエローマ細胞と同様にニワトリＢ細胞か
らの株化を検討し、チオグアニン耐性細胞のなかから安
定生育細胞を取得した。しかしながら、このチオグアニ
ン耐性細胞はいずれもＨＡＴ　（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）耐性を有していた。さらに研究
を重ねた結果、安定して増殖可能なＨＡＴ耐性のチミジ
ンキナーゼ欠損細胞株が樹立できた。この株化細胞に免
疫したニワトリ脾細胞を融合させて培養することにより
ニワトリモノクローナル抗体を培地中に生育蓄積させる
ことができることを見出して本発明を完成するに到った
。

すなわち、本発明は、チミジンキナーゼ欠損ニワトリＢ
リンパ芽株化細胞、ニワトリＢリンパ芽細胞株を変異さ
せ、チミジン類似物質を含む培地を用いてＨＡＴ感受性
細胞株をクローニングすることを特徴とするニワトリＢ
リンパ芽細胞由来チミジンキナーゼ欠損株化細胞の製造
方法、ニワトリＢリンパ芽細胞より得られたチミジンキ
ナーゼ欠損株化細胞と免疫したニワトリ脾細胞とが融合
された融合細胞、及びこの融合細胞を細胞培養培地中で
培養することを特徴とする抗体の製造方法に関するもの
である。

チミジンキナーゼ欠損株化細胞はニワトリのＢリンパ芽
細胞より取得する。ニワトリの種類は問うところではな
いが、例えば、白色レフホン種、白色ロック種等を利用
できる。

トリＢリンパ芽細胞株はニワトリ又はＢリンパ細胞をト
リレトロウィルスで癌化させることによって得られた。

こうして得られた自己増殖性を有するＢリンパ芽細胞株
を変異処理し、チミジンキナーゼ欠損細胞を選択する。

変異は紫外線照射等の物理的手段によって行ってもよく
、エチルメタンスルホン酸、ニトロソグアニジン、ＩＣ
Ｒ−１９１等の薬剤を利、用して行なってもよい。変異
細胞からチミジンキナーゼ欠損細胞の分離は例えばトリ
フロロチミジン、ブロモデオキシウリジン等のチミジン
類似物質を含む培地で培養してクローニングすればよい
。培地は通常の細胞培養用培地でよく、例えばＰＲＭ１
１６４０培地、ダルベツコ変法イーグル培地等に牛胎児
血清等を５〜１５％添加した培地を利用すればよい。培
養条件も通常の細胞培養と同様でよく、例えば５〜１０
％程度ＣＯ□を加えた空気の雰囲気において３７〜４１
°Ｃ程度で培養すればよい。

こうして得られたチミジンキナーゼ欠損株化細胞は自己
増殖性を有しているがＨＡＴ培地中で培養すると死滅す
る。また、抗ニワトリＩｇの抗り鎖抗体及びフルオレセ
イン結合第２抗体を用いた間接蛍光抗体法により測定し
たところいずれもこのＬ鎖を合成しない。この細胞をＨ
Ｕ３Ｒ細胞と命名した。

ＨＵ３Ｒ細胞に免疫したニワ）　ＩＪ脾細胞を細胞融合
させることによりモノクローナル抗体を産生させること
ができる。この抗体は免疫する抗原の種類を変えること
によって種々のものが得られることは言うまでもない。

また、グロブリンの種類もＩｇＧ、ＩｇＭ等種々のもの
を得ることができる。

免疫方法は公知の方法によればよく、例えば目的とする
抗原をアジバントとともに数回ニワトリに注射して飼育
すりばよい。抗体発現後牌臓を摘出してポリエチレング
リコール、電気融合法、ＨＶＪウィルス等の公知の細胞
融合手段を用いて細胞を融合させる。

得られた融合細胞の培養は前述の方法と同様でよく、１
〜３０日間程度培養することによって培養上清中に目的
のモノクローナル抗体を産生、蓄積させることができる
。抗体の分離方法も公知の手段を利用すればよ（、アフ
ィニテイークロマトグラフイー、ゲル濾過、イオン交換
クロマトグラフィーなどを適宜組合せて実施すればよい
。

〔実施例〕

実施例１ ニワトリよりウィルス非産生性Ｂリンパ芽細胞ＲＥＣＣ
−ＨＵＳ株（以下、単にＨＵ３細胞と略記する。）は鳥
類細網内皮症ウィルスを用いたインビトロでの形質転換
法により樹立した。

対数増殖期にあるこのＨＵ３細胞をＩ？ＰＭＩ　１６４
０培地に２Ｘ１０Ｓセル／戚の濃度になるように浮遊さ
せ、ＣＯ，インキュベーター中（５％ＣＯ□、３８．５
°Ｃ設定）で６時間前培養した。この培養液に２４０ｐ
ｇのエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）溶液（５０■／
戚）を加えた後２４時間さらに培養を続けた。続いて、
細胞を無血清培地で３回洗浄し、１０％牛脂児血清を含
むＲＰＭＩ　１６４０培地に浮遊させて、ＣＯ□インキ
ュベーター中で２〜３日間培養を続けた。

こうして得られたＥＭＳ処理親細胞をＣ１１ｖｅらの方
法（Ｃ１ｉｖｅ、　Ｄ　ｅｔ　ａｌ、　”Ｖａｌｉｄａ
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃ−ｈａｒａｃｔｅｒｉｊａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌ５１７８Ｙ／ＴＫ”−ｍｏｕｓｅ
ｌｙｍ−ｐｈｏｍａ　ｍｕｔａｇｅｎ　ａｓｓａｙ　ｓ
ｙｓｔｅｍ　”　Ｍｕｔａｔ、　　Ｒｅｓ、　　５９＋
６１−６８．１９７９）を一部変更した方法によりトリ
フロロチミジン（ＴＰＴ）１０μｇ／ｍｌを含む軟寒天
培地（０，３５％Ｎｏｒｂｌｅ寒天）を用いてチミジン
キナーゼ（ＴＫ）欠損ＨＵ３細胞のクローンを分離した
。

こうして、ＴＰＴ耐性細胞株９株を分離した。

この９株の細胞はＨＡＴ培地で培養したところ７日以内
にいずれも完全に死滅した。９細胞株及び親細胞株の性
質を表１に示す。

表１ Ｕ３ Ｕ３Ｒ１５ １１Ｕ３Ｒ２２ １１Ｕ３Ｒ２３ ）ＩＵ３Ｒ２４ ＩＩ　Ｕ　３　Ｒ２５ １１Ｕ３Ｒ２６ Ｕ３Ｒ２７ Ｕ３Ｒ２８ Ｕ３Ｒ２９ １８，３４ ２２，３２ １８，０１ ２８，０１ ２１，７８ １８，４１ ２１，０６ １８，０４ １８，６７ １９，３５ 表１において細胞質１ｇは抗ニワトリＩｇ重軽鎖μ、γ
及びＬについてフルオレセイン結合第二抗体を用いて間
接蛍光抗体法により測定した。親細胞であるＨＵ３細胞
は大部分がＬ鎖に対して弱陽性を示した。一方、細胞質
Ｉｇ軽鎖に陽性を示したＨＵ３細胞から樹立された９つ
のＴＫ−ＨＵ３細胞はいずれもＩｇ鎖を合成しなかった
。

実施例２ ニワトリを不活性化したニューカッスル病ウィルス（Ｎ
ＤＶ）で免疫した後肺臓を摘出した。ＨＵ３Ｒ２７クロ
ーン細胞（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４８４）とこの肺臓細胞
を１：５の細胞数比で４０％（Ｗ／ｖ）ポリエチレング
リコール（Ｐ　Ｅ　０６，０００．　Ｋｏｃｈｌｉｇｋ
ｔ）及び１０μｇ／ｒｒｄｌポリーＬ−アルギニンを含
むｐＨ７，４のリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）を加
えて室温で細胞融合させた。続いて、細胞を洗浄してか
ら、１５％牛脂児血清及びＩ　Ｘｌ０−’Ｍ　２−メル
カプトエタノールを含むＲＰ旧１６４０培地に融合前の
肺細胞数として１〜５　Ｘｌ０ｂ／ｄの濃度になるよう
に浮遊させ、９６ウエルのマイクロプレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ）の各ウェルにこの細胞浮遊液を０．１ｄづつ分注
した。

２４時間後に各ウェルにＨＡＴ培地を０．１−づつ加え
、２遇間の間必要により３回毎にＨＡＴ培地を加えなが
ら培養を続けた。得られた結果を表２に示す。

表２ 合計 １０９／１２０８　　　　４０／１０９　　　　１２／
４０　　　　　７　　２ａ）細胞融合前の細胞数で表示 ｂ）細胞融合後１６日口の試験結果 Ｃ）細胞融合後１１日ローＥＬＩＳＡ法により測定した
ニット９１ｇ陽性の融合細胞数 表２に示すように細胞融合に適する肺臓細胞数は４Ｘ１
０’／ウエルであった。細胞融合後１０日以内に検出さ
れた融合細胞クローン数は１２０８ウエル中１０９クロ
ーンであった。しかし、この１０９クローンの融合細胞
の生育はいずれもＨＵ３Ｒ２７細胞と比較して不安定で
あった。検出された融合細胞のうち４３クローンは７日
前後で死滅し、残りのうち２７クローンの成育速度は徐
々に減少していった。

残りの４０クローンは安定して成育した。

この４０クローンの融合細胞についてＩｇ及び特異抗体
の成育を２種のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法でスクリーニングした
。このＥＬＩＳＡ法では抗ニワトリＩｇ（Ｇ＋Ｍ）を結
合させたＮｕｎｃ　ＥＩＡプレート、第２抗体としてワ
サビパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）結合抗ニワトリＩｇ
（Ｇ＋Ｍ）及び基質を用い、他のＥＬＩＳＡ法ではＮＤ
Ｖを結合させたＮｕｎｃ　ＥＩＡプレート、第２抗体と
してＨＲＰＯ結合抗ニワトリＩｇ（Ｇ＋Ｍ）及び基質を
用いた。表２に示すように４０融合細胞中１２が抗ニワ
トリＩｇに反応性を示し、この１２融合細胞中７がＮＤ
Ｖに対する特異抗体を産生じた。

この融合細胞から分泌されたＩｇをドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）及びウェスターンプロット法で分析し、
このＩｇがＴｇＭであることを確認した。すなわち、培
養土清液に等量の４％ＳＤＳ、１０％２−メルカプトエ
タノール、２０％グリセリン及び０．０２％ブロムフェ
ノールブルー含むｐｕｓ、ｓの０．１２５Ｍ）リス−塩
酸緩衝液を加えた。

この混合液をＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ　（
Ｌｏｎｄｏｎ）。

２２７、６８０．１９７０）に従って０．１％ＳＤＳを
含む１２．５％ポリアクリルアミドスラブゲルにかけ、
泳動分離されたポリペプチドを電気泳動的にニトロセル
ロースシートに移した。次に、ニワトリ■ｇμ（Ａ）、
γ（Ｂ）又はＬ　（Ｃ）鎖に対する特異抗体、ＨＲＰＯ
−結合第２抗体及び基質を用いた酵素抗体法によって検
出を行なった。　Ｉｇμの分子量は７６に、Ｌの分子量
は３１．５にと２８にであった。得られた泳動パターン
を第１図に示す。

〔発明の効果〕

本発明はニワトリの各種モノクローナル抗体を生産する
手段を提供するものであり、この抗体を利用して各種抗
原その他の生理活性物質を高精度で分析する方法を開発
することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例である融合細胞が分泌した抗
体の泳動パターンを示すものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ニワトリＢリンパ芽細胞株より得られたニワトリ
   単クローン抗体作成用親細胞株としてのチミジンキナー
   ゼ欠損株化細胞
2. （２）ニワトリＢリンパ芽細胞株を変異させ、チミジン
   類似物質を含む培地を用いてＨＡＴ感受性細胞株をクロ
   ーニングすることを特徴とするニワトリＢリンパ芽細胞
   由来チミジンキナーゼ欠損株化細胞の製造方法
3. （３）ニワトリＢリンパ芽細胞株より得られたチミジン
   キナーゼ欠損株化細胞と免疫したニワトリ脾細胞とが融
   合された融合細胞