JPH04152888A - 抗体，抗体産生ハイブリドーマおよび抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトモノクローナル抗基底膜抗体、該抗体を産
生ずるハイブリドーマおよび該抗体の製造法に関する。

本発明のヒトモノクローナル抗体（以下、ＭｏＡｂと略
記することがある）は天庖癒、類天庖癒、角化異常症や
、機能的異常を有するいくつかの先天性水痘症（主とし
て先天性表皮水痘症）の診断あるいはその発生機序の解
明、さらには細胞接着障害を目的とする治療（例えば癌
の転移阻止など）に有用である。

従来の技術 ケーラーとミルスタインにより開発されたハイブリドー
マを用いるＭｏＡｂの製造法は、単一特異性を示す抗体
を大量にかつ安定的に得られるという利点を有しており
、その技術は広範囲に応用されている［　Ｋ５ｈｌｅｒ
、　Ｇ、、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，：ネイチャー（
Ｎａｔｕｒｅ）、２５６．４９５（１９７５）］。特に
最近では抗原の検出・精製あるいは診断薬の開発だけで
なく、予防薬や治療薬の創製に大きく寄与しつつある。

しかし、一方で予防薬・治療薬としてＭｏＡｂを用いる
場合、ヒトにとって異種蛋白であるマウスＭｏＡｂを投
与することは、ヒト体内でのマウスＭｏＡｂに対する抗
体の産生による治療効果の低減あるいはＩｉＨなアレル
ギー反応を誘起する危険性がある。したがって予防薬・
治療薬としては、ヒトＭｏＡｂを用いるのがはるかに望
ましいが、一般にその作製技術はマウスのそれに比べて
著しく遅れており、実際の成功例も少ない。

また、実際にヒトの各種疾患に関連する抗体を得たい時
には、ヒト由来のリンパ球、特に対象とする疾患患者由
来のリンパ球を用いてヒトＭｏＡｂを作成するのが好ま
しい。

このようなヒトＭｏＡｂはヒト−ヒトハイブリドーマ、
マウス−ヒトヘテロハイブリドーマあるいはヒトリンパ
球のエプスタイン−バーウイルス（以下、ＥＢＶと略記
することがある）トランスホーマント（ヒトリンパ球を
ＥＢＶにより活性化した形質転換細胞）などにより産生
されるが、後２者は抗体産生能の安定性および増殖能に
劣るため、前者のヒト−ヒトハイブリドーマによる産生
が望ましい。

通常抗ウイルス抗体、抗菌体由来毒素抗体あるいは抗癌
抗体を作成する場合、抗体産生細胞として用いるリンパ
球は、それぞれウィルスや細菌に感染したヒト、あるい
は癌患者由来のリンパ球を用いるが、特に自己免疫病患
者由来のリンパ球は、生体の重要な成分に対する種々の
抗体−自己抗体−を産生じ、その疾患病理と密接に関わ
っていることから抗体産生細胞のソースとして貴重であ
り、疾患発生機序の解明に重要な役割を果たすことが期
待されている。天庖癒や類天庖厘のような水痘症を伴う
自己免疫疾患についても、患者血清中に種々の自己抗体
（例えば、杭表皮細胞膜抗体や抗基底膜（ｂａｓｅｍｅ
ｎｔ　　ｍｅｍｂｒａｎｅ　　ｚｏｎｅ）抗体などが出
現し、その病理に重要な関わりをもつことが示唆されて
いるが、その認識するエピトープあるいは疾患との関連
については十分に理解されていないのが現状である。

一方、本発明者らによって、ヒトモノクロナール抗基底
膜抗体を産生ずるＥＢＶトランスホーマントが確立され
ている［　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、、　８４
　。

１０５０（１９８９）］が、該ヒトンスホーマントは抗
体産生能、抗体産生安定性、増殖能等が劣るため、Ｍｏ
Ａｂを大量に調製し、産生されるＭｏＡｂの純度を向上
させることが困難であり、例えば医薬。

抗ＫＭ製用のカラムとして該ＭｏＡｂを用いる場合には
、その純度をさらに向上させ、かつ大量に調製すること
が望まれている。

発明が解決しようとする課題 本発明は、順天庖癒抗原を認識するヒトモノクロナール
抗基底膜抗体（自己抗体）を安定的に産生し、また増殖
能の優れたヒトーピトハイプ＋＋　ｙ−マ、該ハイブリ
ドーマを用いる抗体の大量製造法および該製造法によっ
て大量に調製される高純度の抗体を提供するものである
。

課題を解決するための手段 本発明者らはかかる技術的背景のもとに、ヒト基底膜反
応性ヒトＭｏＡｂを安定的に産生するヒトヒトハイブリ
ドーマを作成することを目的として鋭意研究した結果、
ウワバイン抵抗性のヒｌ−Ｂリンパ芽球様細胞株ＡＣ−
３３を、ＥＢＶで形質転換した類天疱瘡患者由来リンパ
球と融合することにより、抗体産生安定性および増殖能
の優れたハイブリドーマが得られ、ヒト抗基底膜ＭｏＡ
ｂの高純度精製品を大量に調製することが可能となるこ
とを見いだした。

すなわち本発明は、（１）ヒトモノクロナール抗基底膜
抗体、（２）ヒトモノクロナール抗基底膜抗体産生ヒト
−ヒトハイブリドーマおよび（３）該ハイブリドーマを
培地に培養し、ヒトモノクロナール抗基底膜抗体を採取
することを特徴とする抗体４１１１社）トー縛貝−←　
１ 本発明の基底膜に対するヒトモノクロナール抗体は治療
用または診断用ヒト免疫グロブリン製剤等として有用で
あり、また天庖癒、類天庖癒や角化異常症、さらには機
能的異常を有する先天性水痘症などの発生機序、関与す
る抗原の解明等に重要な知見を与える。

本発明で用いられるヒトモノクロナール抗基底膜抗体産
生ヒト細胞としては、基底膜と反応しうるヒトモノクロ
ナール抗体（好ましくはＩｇＧ型ヒトＭｏＡｂ）を産生
しうる細胞であればいずれでもよく、類天庖癒などの水
痘症を伴う自己免疫病患者由来の、例えばリンパ節、末
梢血、牌臓由来のいずれのリンパ球でも用いられるが、
特に末梢血リンパ球が好ましく用いられ、これらの患者
由来リンパ球にＥＢＶを感染させ活性化後、目的とする
抗基底膜抗体産生ヒト細胞を選別・濃縮し、この形質転
換細胞を後述する親細胞株と融合させるのがよい。

親株のヒトＢリンパ芽球様細胞としては、上記ＥＢＶ形
質転換細胞と融合させることにより目的とするヒトＭｏ
Ａｂを安定的に産生するハイブリドーマを作成しうるも
のであればいずれでもよく、公知のＨＡＴ感受性・ウワ
バイン抵抗性株ＴＡＷ−９２５（ＩＦＯ５００９５Ｘ特
開昭６３−８４４８８号公報）やＡＣ−３３（ＩＦＯ５
０１５５、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１４３）［特開平２−
４２９号公報］、あるいはＨＯ−３２３［山田幹路、村
上浩紀：発酵と工業、土５，２１８（１９８７）］また
はそれらの継代株などが用いられるが、安定した抗体産
生能と増殖能を持つハイブリドーマが効率良く得られる
ＡＣ−３３株が好都合に用いられる。

以上のようにＥＢＶ）ランスホーマントを用いる方法で
、より効率的に抗体産生ハイブリドーマを取得できるが
、かかるＥＢＶ含有液としては、例えばマーモセット細
胞Ｂ９５−８株［プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）。

７０．１９０（１９７３）］の培養上清が用いられる。

ＥＢＶトランスホーマントの調製に際しては、培地にヒ
トリンパ球を約０．５〜５ＸｌＯ’個／−１好ましくは
約ｌＸ１０’個／１１１２の濃度になるよう浮遊させ、
これに上記の８９５−８培養上清を適量加える。約３７
℃で約１時間軽く振とうし感染後、さらに約３７℃で約
５〜３０日間培養することにより、目的のヒトリンパ球
のＥＢＶ）ランスホーマントが取得できる。

ヒトＢリンパ芽球様細胞（好ましくはＡＣ−３３株）と
ヒトモノクローナル抗基底膜抗体産生ヒト細胞（好まし
くはＥＢＶ）ランスホーマント）とを融合させるために
は、これらの細胞混合浮遊液にセンダイウィルスやポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）などの融合剤を加えたり
、あるいは電気刺激を与えるなどの処理をする。ＰＥＧ
を用いる方法は好ましい方法の一例であるが、もちろん
この方法に限定されるものではない。ＰＥＧを用いる方
法において、ＰＥＧの分子量は一般に約１゜０００〜９
，０００．インキュベージ２ンは約０゜５〜３０分、Ｐ
ＥＧの濃度は約ｌＯ〜８０％などが用いられる。好まし
くは、約３５〜５５％のＰＥＧ６０００を用いて約３７
℃で５〜ｌＯ分細胞を処理するのがよい。融合細胞の選
択は、ＡＣ−３３株を親株として用いる場合、例えばＨ
ＡＴ＋ウワバイン添加培地（ＨＡ　Ｔ　Ｏ培地）などに
より実施でき、この操作で親株は死滅する。増殖してき
たハイブリドーマの培養上清を抗体価測定試験に供する
ことにより、抗体活性陽性の細胞が選別される。

ヒトモノクローナル抗基底膜抗体測定のためには種々の
方法が使用できるが、例えばヒト皮膚切片への該モノク
ローナル抗体の結合を蛍光標識第２抗体（例、ウサギ抗
ヒトＩｇＧ抗体など）でみる間接蛍光抗体標識法（以下
、ＩＩＦ法と略記することがある）が挙げられる。

抗体活性陽性ハイブリドーマは直ちにクローニングに供
されるが、これは通常限界希釈法などで容易に実施され
る。クローン化されたヒト−ヒトハイブリドーマの培養
上清については、上記の方法でその抗体価を測定し、安
定的に力価の高い抗体を産生ずるハイブリドーマを選択
することによリ、目的とするモノクローナルなノ＼イブ
リドーマを取得することができる。以上のようにして得
られるヒト−ヒトハイブリドーマとしては、例えば後述
のヒト−ヒトハイブリドーマ５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ、ヒト−
ヒトバイブリド−＝ｌＯＤ−ＨＹ−３Ｂなどが挙げられ
る。

上記した本発明のヒトモノクローナル抗基底膜抗体産生
ヒト−ヒトハイブリドーマまたはその継代株から由来す
るハイブリドーマを用いて抗体を生成、蓄積せしめ、こ
れを採取することにより抗体を製造することができる。

該抗体の生成、蓄積は、本発明の／％イブリドーマを培
養することにより行われ、培養は、通常液体培地中また
は動物の腹腔内（通常はヌードマウス等哺乳動物の腹腔
内）で行うが、以下に液体培地中での培養の一例を挙げ
る。

培地としては、例えば動物細胞培養用基礎培地［イスコ
ツ培地とハムＦ１２培地の等量混合培地（Ｉ・Ｈ培地）
やＲＰＭＩ　　１６４０培地など］に牛胎児血清（Ｆｅ
２）等を添加したものあるいはＧＩＴ培地（和光純薬工
業株式会社販売）（哺乳動物の血清を混在微生物の不活
化工程および塩析、脱塩工程を含む精製処理に付すこと
によって製造される哺乳動物血清由来の動物細胞培養用
組成物；特開昭６０−１４５０８８号公報参照）などが
挙げられ、特にＧＩＴ培地が以下に述べる抗体の精製に
関して有利に用いられる。

培養は通常約３〜６０日間、好ましくは約５〜１０日間
、約３０〜３８℃、好ましくは約３７℃で行う。

培養液中の抗体の精製については公知の生化学的手法を
組み合わせて用いることによりできる。

例えば、細胞培養液を遠心分離し、培養上清を取り出し
、塩析（通常は硫酸アンモニウムを用いる）を実施する
。得られたタンパク沈澱物を適当な溶液に溶解し、透析
後カラムクロマトグラフィー（イオン交換カラム、ゲル
ろ過カラム等）に付し、目的とする抗体を分離精製する
ことができる。以上のような分離精製操作により、例え
ば６１２の培養上清からタンパク重量比で９０％以上、
好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上の
純度のヒトモノクローナル抗基底膜抗体（好ましくはＩ
ｇＧ型ヒトＭｏＡｂ）を約１０−３０ｍｇ得ることがで
きる。

本発明の製造法により目的とするヒトＭｏＡｂの大量調
製が可能となった結果、極めて純度が高いヒトモノクロ
ーナル抗基底膜抗体を得ることができるので、例えば類
天庖厘なとの水痘症の診断薬などとして用いる場合好都
合である。また、この精製抗体標品においては、異種タ
ンパクであるウシ血清アルブミンおよびウシ血清グロブ
リンの含有量は各々約０．１％以下であり、ＥＢＶ混入
の可能性もないため、医薬などとして人体に投与する場
合、好都合である。

以上のようにして得られたヒトＭｏＡｂを蛋白分解酵素
（パパイン、ペプシンなど）処理ならびに還元剤無理な
どにより、基底膜に対する結合能を保持するＦ　ａｂ、
　Ｆ　ａｂ’、　Ｆ　（ａｂ’）ｚ断片などを得ること
ができ、本発明のヒトＭｏＡｂと同様の目的で用いるこ
とができる。

本発明により製造されるヒトモノクローナル抗基底膜抗
体はヒト皮膚組織の基底膜を特異的に認識し、これと強
く結合する。かかる抗体は均質で高力価なため、生化学
的製剤として用いるのにきわめて適している。例えば、
メンブレンフィルター等によるろ過除菌操作の後に、そ
れ自体あるいは適宜の薬理的に許容され得る担体、賦形
剤、希釈剤などと混合し、注射剤などとして製剤化する
こともできる。

以上のようにして得られたヒトＭｏＡｂ製剤は、単に天
庖厘、類天庖癒、角化異常症、先天性水痘症などの発症
機序の解明に役立つばかりでなく、これら疾患の診断に
も使用できる。また、本発明の抗体は細胞接着に重要な
機能を果たす抗原を認識しており、それを阻止する機能
を利用した医薬への応用、特に癌の転移阻止剤としても
有用である。さらに、病態動物モデルの作成への応用あ
るいは天庖厘、類天庖厘、角化異常症、先天性水痘症な
との水痘症を伴う自己免疫疾患に関連する抗原を精製す
るために用いるアフィニティー力ラムヘの応用なども考
えられる。

以下、参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

なお、実施例１に開示するヒト−ヒトハイブリドーマ５
Ｅ−ＨＹ−４Ｂおよび１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂは、平成２年
６月２６日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）にそれぞ
れ寄託番号ＩＦＯ５０２４９およびＩＦＯ５０２５０と
して寄託されており、また平成２年７月４日から通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）にそれ
ぞれ寄託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２９９４およびＦＥＲ
ＭＢＰ−２９９５として寄託されている。

一方、実施例１に開示するヒトＢリンパ芽球様細胞株Ａ
Ｃ−３３は、昭和６２年１２月１４日からＩＦＯに寄託
番号ＩＦＯ５０１５５として、またＦＲＩに寄託番号Ｆ
ＥＲＭ　　Ｐ−９７８８として寄託され、該寄託はブダ
ペスト条約に基づく寄託に切り換えられて、寄託番号Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−２１４３としてＦＲＩに保管されてい
る。

参考例Ｉ　　ＥＢＶトランスホーマントの作成類天庖漬
患者の末梢血からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用い
た比重遠心法でリンパ球を分離し、２０％ＦＣ５添加■
・Ｈ培地（■・Ｈ−２０Ｆ）に２×１０７個になるよう
に浮遊させた。

このリンパ球浮遊液ｌに対しＥＢＶを含有するＢＯ２−
８細胞培養上清を容量にしてｌＯの割合に加え、３７℃
で１時間軽く振とうしながら感染を行った。感染後、ｌ
−Ｈ−２０Ｆ培地を加え、９６ウエルマイクロプレート
にｌウェル当り８Ｘ１０’個播種し、３７℃炭酸ガス培
養器で２〜３日毎に半量ずつ新しい培地と交換し、２〜
４週間培養を行ないＥＢＶ形質転換細胞を得た。

の細胞融合 参考例１により得られるＥＢｖトランスホーマントとヒ
トＢリンパ芽球様細胞株ＡＣ−３３とをｌ：１の細胞比
になるように混合し、４５％ＰＥＧ６０００（コツホラ
イト社製）で７分間処理して細胞融合を実施した。融合
後、トランスホーマントをｌ−Ｈ−１０Ｆ培地に６Ｘ１
０３〜８ＸＩＯ’個／−になるように浮遊させ、リンプ
ロ２４ウエルマルチデイツシユに１ｍずつ播種し、３７
℃炭酸ガスインキュベーター中で培養した。２４時間後
、ＨＡＴ・ウワバイン（ヒポキサンチン：ｌ×１０−’
Ｍ、アミノプテリン：　４　Ｘ　１０−’Ｍ、チミジン
：　１．６　Ｘ　１０−’Ｍ、ウワバイン：２ＸＩＯ−
６Ｍ）含有■・Ｈ−１０Ｆ（ＨＡＴＯ）培地を１−加え
、ＨＡＴＯ選択培養を開始した。さらに３．５．７日の
奇数８後にｌ＋ａ１２ずつのＨＡＴＯ新鮮培地の交換を
実施し、ＨＡＴＯ選択培養を継続した。

（２）抗基底膜抗体産生ハイブリドーマのクローニング 実施例１−（１）に記載した細胞融合の９〜ｌＯ日後に
出現したハイブリドーマの培養上清を、後述の実施例２
に記載のＩＩＦ法に供し抗体価を測定した。次いで、特
に強い抗体活性を示したウェルを公知の限界希釈法によ
るクローニングに供した。す、なわち、ハイブリドーマ
が３個／−になるようにｌ−Ｈ−１０Ｆ培地に浮遊させ
、９６穴マイクロプレートにｌウェル当りＯ，１ｇａｌ
ｌずつ分注した。分注する際、フィーダー細胞としてＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの脚線細胞をウェル当り５ＸＩＯ’個
になるように加えた。約１０〜１５日後に細胞の増殖が
認められ、その上清を採取して抗体の有無を後述の実施
例２に記載のＩＩＦ法で測定した。

その結果、増殖能および抗体産生能の優れたヒト−ヒト
ハイブリドーマ５Ｅ−ＨＹ−４Ｂおよび１０Ｄ−ＨＹ−
８Ｂが選別・育種された。

（３）モノクローナル抗体の製造 実施例１−（２）で得られたヒト−ヒトハイブリドーマ
５Ｅ−ＨＹ−４Ｂおよび１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂをそれぞれ
ＧＩＴ培地（日本製薬（株）製造・和光純薬工業（株）
販売）に浮遊させ、３７℃で培養を継続し、順次培養容
量を増加した。得られた培養上溝６Ｑに硫酸アンモニウ
ムを４７％の濃度になるように加え、４℃で撹拌しなが
ら６０分間塩析を行ない、遠心分離（１０，０００回転
、１５分間）した。得られた沈澱物を１０ｍＭリン酸食
塩緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７，３）に溶解し、上溝を十分
量のＰＢＳで緩衝化したプロティンＡカラム（ファルマ
シア社製造）に供し、十分に洗浄後、ｐＨ３−０のＯ，
１Ｍグリシン・塩酸緩衝液で抗体画分を溶出した。溶離
抗体液は０　、１　Ｍ！ｊＩｊｌナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１０，０）で直ちに中和し、ＰＢＳに対し透析後、さ
らに限外濾過により濃縮し、以下の実験に供した。

ヒト−ヒトハイブリドーマ５Ｅ−ＨＹ−４Ｂおよび１０
Ｄ−ＨＹ−８Ｂの培養上清６Ｌから、それぞれタンパク
重量比で純度が９５％以上の１８１１１ｇおよび２１ｍ
ｇの精製ヒトモノクローナル抗基底膜抗体５　Ｅ　−Ｈ
Ｙ−４Ｂおよび１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂを取得した。抗体の
純度の確認にはラエムリらの方法［ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、２２７．６８０（１９７０）】に従い、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた。すなわ
ち硫安塩析し、ＤＥＡＥ−セルロースカラムで素通りし
た画分を、２メルカプトエタノールで還元して１０％５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル、１８０ポルト、２２時
間の条件で泳動した。その結果、分子量約５２キロダル
トン前後にＨ鎖、約２８キロダルトン前後にＬ鎖の２つ
のバンドが認められ、不純物にもとづくバンドは観察さ
れなかった。さらに、ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ［東ソ
ー（株）〕を用いるＨＰＬＣに供し、抗体の純度がいず
れも９５％以上であることを確認した。得られた抗体の
免疫グロブリンクラス、サブクラスはオフタロニー法に
よる測定で、いずれもＩｇＧ、であった。

実施例２　　ＩＩＦ法によるヒトモノクローナル抗体の
性状分析（１） 公知の技術［Ｒ，Ｅ、　Ｊｏｒｄｏｎら：アーカイブス
・オブ・デルマトロジー（Ａｒｃｈ、　Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ、ｌ　１０３　。

４８６（１９７１）］に従い、正常ヒト皮膚切片を用い
て実施例１で得られたヒトＭｏＡｂのＩＩＦ法を実施し
た。

すなわち、クリオスタット内で手術時入手した正常ヒト
皮膚の未固定６μｍ切片を作成し、まず希釈ＭｏＡｂを
３７℃で３０分間反応させ、次いで２０倍希釈ＦＩＴＣ
標識抗ヒト１ｇＧ抗血清を３０分間反応させて蛍光顕微
鏡にて観察した。その結果、５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ抗体およ
びＩ　０Ｄ−ＨＹ−８Ｂ抗体とも表皮基底膜部に線状の
陽性反応を示した。５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ抗体の正常ヒト皮
膚切片（皮膚組織）に対する反応性をＩＩＦ法によって
蛍光顕微鏡で観察した結果を第１図に示す。

さらに、正常皮膚をＩＭ　　ＮａＣＱ溶液中で４℃にて
４８時間インキュベートして表皮・真皮を刺離後、上記
と同様にしてＩＩＦ法を実施した。その結果、５Ｅ−Ｈ
Ｙ−４Ｂ抗体および１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂ抗体とも基底膜
の表皮側にのみ点状の陽性反応を示した。この結果は、
通常の類天庖厘患者の血清を用いてＩＩＦ法を実施した
時に得られる結果と同様であった。１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂ
抗体のＩＭ　　ＮａＣＭ剥離表皮（皮膚組織）に対する
反応性をＩＩＦ法によって蛍光顕微鏡で観察した結果を
第２図に示す。

いずれのＭｏＡｂも、蛍光抗体法による抗体価は５．１
２０−１０．２４０倍を示し、類天庖癒患者血清中の抗
体価（４０〜６４０倍）の約１０〜３００倍の抗体価を
示した。

ヒト表皮および５ｎｍ金コロイド標識抗ヒトＩｇＧ抗血
清を用いて、ｐｏｓｔ−ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ法により実
施例１で得られたＭｏＡｂの反応局在を検討した。

その結果、５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ抗体およびＩＯＤ・ＨＹ−
８Ｂ抗体ともに、表皮基底膜部ヘミデスモゾームの接着
板に一致して金粒子の結合が認められた。この部位は順
天庖厘患者血清の反応部位とほぼ同様であったが、血清
ではより広い範囲の反応性が認められた。

これまでの知見では、表皮デスモゾーム構成蛋白が多数
同定されており、細胞接着機構における役割が種々の研
究により解明されつつあるが、表皮へミデスモゾームの
構成蛋白は、上記反応部位である順天庖艙抗原以外には
知られていない。それ故に、これらのへミデスモゾーム
に特異的なＭｏＡｂは、ヘミデスモゾームの細胞−基質
接着における役割を解析する上で、重要かつ唯一の手段
となっている。

正常ヒト皮膚を２ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有ＰＢＳにて４８
時間インキュベートすることにより表皮を剥離した。こ
の表皮の２％５ＤＳ−トリス・塩酸緩衝液抽出液を抗原
として、免疫プロット法を実施した。すなわち、抽出液
を５％ゲルを用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥに供したのち、ニ
トロセルロース膜に転写した。３％スキムミルクでブロ
ック後、実施例１で得られたヒトモノクローナル抗体、
ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体の順に反応させ、クロロナ
フトールで陽性バンドを発色させた。

結果は第３図に示した通りであった。５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ
抗体は２３０ｋＤの単一バンドと反応したが、１０Ｄ−
ＨＹ−８Ｂ抗体は全く反応性を示さなかった。類天庖癒
患者血清を用いた免疫プロット法では、最も重要な類天
庖癒抗原と考えられている２３０ｋＤ蛋白を中心に、２
１０，２００゜１９０．１７０ｋＤ等の複数バンドが認
められた（第３図中、レーン１〜２は５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ
抗体を、レーン３は１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂ抗体を、レーン
４〜６は類天庖漬患者血清をそれぞれ用いた免疫プロッ
ト法の結果を示す）。

実施例５　免疫沈降法によるヒトモノクローナル抗体の
性状分析（４） 培養ヒト表皮細胞を１′Ｃアミノ酸で標識後、０゜５％
ＮＰ−４０（表面活性剤）含有トリス緩衝液で抽出した
。この抽出液をまず正常ヒト血清にて前沈降し、さらに
実施例１で得られたヒトＭｏＡｂに反応させたのち、ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　Ａ含有ブドウ球菌（Ｐａｎｓｏｒｂｉｎ
）で沈降させた。試料緩衝液内で１００℃、２分間加熱
後、５ＤＳ−ＰＡＧＥに供し、乾燥後オートラジオグラ
フィーを実施した。

結果は第４図に示した通りであった。５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ
抗体および１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂ抗体は共に２３０ｋＤ蛋
白を沈降した。類天庖癒患者血清もその多くがこの２３
０ｋＤ蛋白のみを沈降した（第４図中、レーン１〜３は
順天庖唐患者血清を、レーン４は５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ抗体
を、レーン５は１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂ抗体をそれぞれ用い
た免疫沈降法の結果を示す）。すなわち、実施例４に記
載の免疫プロット法の結果とも考え併せると、この２つ
のヒトＭｏＡｂはいずれも主要類天庖虐抗原である２３
０ｋＤ蛋白を認識するが、２つのＭ　ｏ　Ａ　ｂの認識
エピトープは異なり、５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ抗体は直線アミ
ノ酸１次構造のエピトープを認識するが、１０Ｄ−ＨＹ
−８Ｂ抗体は立体的な３次元エピトープを認識すると判
定された。

実施例６　蛍光抗体法によるヒトモノクローナル抗体の
性状分析（５） ５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ抗体および１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂ抗体の
認識するエピトープと、順天庖癒患者血中抗体の認識す
るエピトープとの関連を検討するため、ブロッキング蛍
光抗体法を実施した。

すなわち、実施例４に記載のヒト表皮切片をまず種々の
類天庖厘患者血清でブロック後、予めビオチン標識した
ＭｏＡｂ　５Ｅ−ＨＹ−４Ｂおよび１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂ
をそれぞれ反応させた。次に、ＦＩＴＣ（フルオレセイ
ン・インチオシアネート）標識アビジンと反応後、蛍光
顕微鏡で観察した。

５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ抗体の反応性は３０名中１７名の血清
によりブロックされ、１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂ抗体の反応性
は１８名の血清によりブロックされた。これらの結果か
ら、実施例１で得られたＭｏＡｂはいずれも順天庖厘患
者血清中に比較的広く見られる抗体種と考えられる。

公知のトリプシン・ギムザ法による染色体の解析を実施
した［「動物細胞利用実用化マニュアル」、５内田ら編
、リアライズ社刊、３３７−３４６Ｊｒ（１９８４）］
。］５Ｅ−ＨＹ−４Ｂハイプリドーは染色体数９０−９
３に分布し、９２にモードを有した。１０Ｄ−ＨＹ−８
Ｂハイプリドーマは染色体数８５−９２に分布し、８７
にモードを有した。これらのハイブリドーマはほぼ４倍
体と考えられる。

実施例８　サチンプロット法によるヒトモノクロ−ナル
抗体Ｈ鎖遺伝子再配列の解析 ヒト−ヒトハイブリドーマ５Ｅ−ＨＹ−４Ｂ。

ヒト−ヒトハイブリドーマ１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂおよびヒ
トＢリンパ芽球様細胞株ＡＣ−３３よりＤＮＡを抽出後
、制限酵素（ＥｃｏＲＩ　、ＨｉｎｄｎＩ。

ＢａｍＨＩ）にて切断した。次いでアガロース電気泳動
後、サチンプロット法によりニトロセルロース膜に転写
した。

オリゴプライマー法により３！ｐｌ［識した免疫グロブ
リンＨｆ１ｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイゼー
ションし、オートラジオグラフィーにて観察した［　Ｔ
、　Ｍａｎｉａｔｉｓら：「モレキュラー・クローニン
グ（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　）Ｊ　、
ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ刊（米国）１゜結果は第５図に示した通りで
あった。ＡＣ３３株にはｇｅｒｍ　　１ｉｎｅ　　ｂａ
ｎｄの他に特異的遺伝子再配列が見られた。さらに、５
Ｅ−ＨＹ−４Ｂおよび１０Ｄ−ＨＹ−８Ｂハイブリドー
マには、ＡＣ’−３３株のバンドに加えて、互いに異な
る特異的遺伝子再配列が見られた（第５図中、レーンｌ
は５Ｅ−ＨＹ−４Ｂハイブリドーマを、レーン２は１０
Ｄ−ＨＹ−８Ｂハイブリドーマを、レーン３はＡＣ−３
３株を用いたサチンプロット法の結果を示し、→はｇｅ
ｒｍ　　１ｉｎｅ　　ｂａｎｄを示し、二◇はＡＣ−３
３株の遺伝子再配列を示し、−および〉はそれぞれ５Ｅ
−ＨＹ−４Ｂおよび１ＯＤ−ＨＹ−８Ｂハイブリドーマ
の遺伝子再配列を示す。） これらの結果より、２種のハイブリドーマはそれぞれ２
つの遺伝子再配列を有し、またそれぞれの産生ずる免疫
グロブリンが異なることが証明された。

発明の効果 本発明のヒトモノクローナル抗基底膜抗体産生ヒト−ヒ
トハイブリドーマは、増殖能、抗体産生能および抗体産
生安定性に優れているので、ヒトモノクローナル抗基底
膜抗体を大量に効率良くしかも高純度に製造することが
でき、工業的生産上有利である。かかるハイブリドーマ
より産生される抗体は、ヒト皮膚組織における基底膜に
強く結合する性質を有するため、類天庖涜、角化異常症
、先天性表皮水痘症などの診断やその発生機序の解明に
有用である。また、細胞接着阻害能をもつことから、癌
の転移阻止にも効果を発揮し、転移抑制剤として有用で
ある。さらに、高純度に精製されたヒトモノクローナル
抗基ｆｆＥ［抗体は、類天庖厘抗原の精製に用いるアフ
ィニティーカラムを作成する際に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト正常皮膚切片（皮膚組織）に対する抗体
の反応性を示す蛍光顕微鏡写真（ＩＩＦ法）である（実
施例２参照）。 第２図は、ＬＭ　　ＮａＣＱ剥離表皮（皮膚組織）に対
する抗体の反応性を示す蛍光顕微鏡写真（ＩＩＦ法）で
ある（実施例２参照）。 第３図は、実施例４に記載の免疫プロット法の結果を示
したものである。 第４図は、実施例５に記載の免疫沈降法の結果を示した
ものである。 ｔＪ５図は実施例８に記載のサチンプロット法による免
疫グロブリンＨ鎖遺伝子再配列の解析結果を示したもの
である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトモノクローナル抗基底膜抗体を産生するヒト
   −ヒトハイブリドーマ。
2. （２）ヒトモノクローナル抗基底膜抗体産生ヒト細胞と
   ヒトＢリンパ芽球様細胞とを融合することにより得られ
   る請求項１記載のハイブリドーマ。
3. （３）ヒトモノクローナル抗基底膜抗体産生ヒト細胞が
   、類天疱瘡患者由来のリンパ球をエプスタイン−バーウ
   イルスにより活性化した形質転換細胞である請求項２記
   載のハイブリドーマ。
4. （４）ヒトＢリンパ芽球様細胞がヒトＢリンパ芽球様細
   胞株ＡＣ−３３またはその継代株である請求項２記載の
   ハイブリドーマ。
5. （５）ヒト−ヒトハイブリドーマ５Ｅ・ＨＹ−４Ｂ。
6. （６）ヒト−ヒトハイブリドーマ１０Ｄ・ＨＹ−８Ｂ。
7. （７）請求項１、２、３、４、５又は６記載のハイブリ
   ドーマを培地に培養し、ヒトモノクローナル抗基底膜抗
   体を採取することを特徴とする該抗体の製造法。
8. （８）純度９０％以上のヒトモノクローナル抗基底膜抗
   体。