JPS58216125A - ヒト抗体の産生方法 - Google Patents
ヒト抗体の産生方法Info
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- JPS58216125A JPS58216125A JP57097596A JP9759682A JPS58216125A JP S58216125 A JPS58216125 A JP S58216125A JP 57097596 A JP57097596 A JP 57097596A JP 9759682 A JP9759682 A JP 9759682A JP S58216125 A JPS58216125 A JP S58216125A
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- cells
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒ）Ｂ細胞が腫瘍化してなる細胞株を利用す
るヒト抗体の産生方法に関する。
るヒト抗体の産生方法に関する。
近年、細胞融合技術が急速な発展をとげ、ヒト抗体産生
への応用の期待が高まっている。
への応用の期待が高まっている。
従来、ヒトの抗体を産生しうる雑種細胞の研究は、大別
して以下の二つの方法によシ行なわれてきた。
して以下の二つの方法によシ行なわれてきた。
（１） マウス、ラット等のミエローマ細胞株ヲ用い
て、ヒトの抗体産生細胞との雑種細胞を作成する方法。
て、ヒトの抗体産生細胞との雑種細胞を作成する方法。
（２） ヒトのミエローマを用いて雑種細胞を作る方
法。
法。
しかし、第１の方法によるヒト細胞と異種細胞との雑種
細胞においては、ヒトの染色体が急速に消失する現象が
みられ、この場合には、安定な抗体産生雑種細胞株を獲
得することは極めて困難であった。また、第２の方法は
、細胞融合剤として最も用い易いポリエチレングリコー
ル溶液中で急速に細胞株が死滅してしまい、効果的に雑
種細胞株を獲得しえなかった。
細胞においては、ヒトの染色体が急速に消失する現象が
みられ、この場合には、安定な抗体産生雑種細胞株を獲
得することは極めて困難であった。また、第２の方法は
、細胞融合剤として最も用い易いポリエチレングリコー
ル溶液中で急速に細胞株が死滅してしまい、効果的に雑
種細胞株を獲得しえなかった。
そこで、本発明者らは、よシ効呆的にヒト抗体産生細胞
と融合可能な細胞株を種々検討し、ヒトＢ細胞が腫瘍化
し、細胞表面に免疫グロブリンを有している細胞株を用
いることによシ、ポリエチレングリコール等の細胞融合
剤による細胞傷害が少々く、より効果的に細胞融合が可
能であり、それによって得られた雑種細胞は、癌化して
いがい抗体産生細胞由来の免疫グロブリンを効果的に獲
得しうること全発見し、本発明を完成するに至った。
と融合可能な細胞株を種々検討し、ヒトＢ細胞が腫瘍化
し、細胞表面に免疫グロブリンを有している細胞株を用
いることによシ、ポリエチレングリコール等の細胞融合
剤による細胞傷害が少々く、より効果的に細胞融合が可
能であり、それによって得られた雑種細胞は、癌化して
いがい抗体産生細胞由来の免疫グロブリンを効果的に獲
得しうること全発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、ヒ）Ｂ細胞が腫瘍化し、細胞表面
に免疫グロブリンを有している細胞株（以下、これをＢ
細胞株という）と、癌化していないヒト抗体産生細胞と
を細胞融合せしめて雑種細胞を形成し、その雑種細胞株
を用いて、癌化していない抗体産生細胞由来の免疫グロ
ブリンを産生ずる方法である。
に免疫グロブリンを有している細胞株（以下、これをＢ
細胞株という）と、癌化していないヒト抗体産生細胞と
を細胞融合せしめて雑種細胞を形成し、その雑種細胞株
を用いて、癌化していない抗体産生細胞由来の免疫グロ
ブリンを産生ずる方法である。
一般に、Ｂ細胞が腫瘍化した細胞株は、補体Ｃ。
リセプター、ＩｇＧＦｃリセブター、表面免疫グロブリ
ン等の少なくとも一つを細胞膜の表面に有している浮遊
性細胞株と同定されている。本発明者らは、幾多のｉ細
胞株を比較検討したところ、少なくとも免疫グロブリン
を細胞表面に有しているＢ細胞株を用いて、雑種細胞を
形成させた場合、癌化１７ていない抗体産生細胞由来の
抗体が効果的に分泌されることを見出した。
ン等の少なくとも一つを細胞膜の表面に有している浮遊
性細胞株と同定されている。本発明者らは、幾多のｉ細
胞株を比較検討したところ、少なくとも免疫グロブリン
を細胞表面に有しているＢ細胞株を用いて、雑種細胞を
形成させた場合、癌化１７ていない抗体産生細胞由来の
抗体が効果的に分泌されることを見出した。
本発明で用いるＢ細胞株は、ヒトミエローマに対し、そ
の細胞表面に免疫グロブリンを有している点が異なる。
の細胞表面に免疫グロブリンを有している点が異なる。
細胞形態学的に言えば、表面の突起状がより多く存在す
ること、および細胞株同志の凝集性がより強いことなど
を単けることができる。
ること、および細胞株同志の凝集性がより強いことなど
を単けることができる。
本発明に用いるＢ細胞株のより好ましいものは、培養液
中に存在させたとき、該液中にＢ細胞株からの免疫グロ
ブリンの分泌が確認されるような株でめる。免疫グロブ
リンの確認は、液の上清をエンザイムイムノアツセイ法
などで検出することによって行うことができる。
中に存在させたとき、該液中にＢ細胞株からの免疫グロ
ブリンの分泌が確認されるような株でめる。免疫グロブ
リンの確認は、液の上清をエンザイムイムノアツセイ法
などで検出することによって行うことができる。
Ｂｉ胞株の平均染色体数は、ヒト正常２倍体の染色体数
である４６本に一致または近い４０〜５０本であること
が、効果的な抗体産生をする雑種株を得やすく好ましい
。
である４６本に一致または近い４０〜５０本であること
が、効果的な抗体産生をする雑種株を得やすく好ましい
。
Ｂ細胞株の対数増殖期における２倍増殖に要する時間は
、より速い方が本発明の目的に用いやすく、１２〜３６
時間の範囲にあることが好ましい。
、より速い方が本発明の目的に用いやすく、１２〜３６
時間の範囲にあることが好ましい。
マイコプラズマ感染等によシ増殖速度が低下した細胞株
は、本発明の目的には適さない。
は、本発明の目的には適さない。
本発明に用いられるＢ細胞株の例としては、ジャーナル
・オプ・ザ・ナショナル・カンサー・インステイテ−１
−−） （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏ
ｎａｌＣＡＮＣＥＲｌＮ５ＴＩＴＵＴＥ ） ４５巻（
１９６９年）第１１１９頁〜第１１２８頁に示されてい
るＲＰＭＩ−１７８８、プロシーディンゲス・オプ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ＣＡＤＥＭＹ ｏｆ ５ＣＩＥＮＣＥＳ ） Ｖｏｌ、
７１（１９７４）第８４頁〜第８８頁に示されている
ＩＭ−９、インターナショナル・ジャーナル・オプ・カ
ンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＣＡＮＣＥＲ）Ｖｏｌ、 ６ （１９７０）第
４２６頁〜第４４９頁に示された６４−１０、ＡＴＣＣ
寄託番号ＣＲＬ ８１１８、およびＢｒ１ｓｔｏｌ
７などがある。
・オプ・ザ・ナショナル・カンサー・インステイテ−１
−−） （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｉｏ
ｎａｌＣＡＮＣＥＲｌＮ５ＴＩＴＵＴＥ ） ４５巻（
１９６９年）第１１１９頁〜第１１２８頁に示されてい
るＲＰＭＩ−１７８８、プロシーディンゲス・オプ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｅ ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ＣＡＤＥＭＹ ｏｆ ５ＣＩＥＮＣＥＳ ） Ｖｏｌ、
７１（１９７４）第８４頁〜第８８頁に示されている
ＩＭ−９、インターナショナル・ジャーナル・オプ・カ
ンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ ＣＡＮＣＥＲ）Ｖｏｌ、 ６ （１９７０）第
４２６頁〜第４４９頁に示された６４−１０、ＡＴＣＣ
寄託番号ＣＲＬ ８１１８、およびＢｒ１ｓｔｏｌ
７などがある。
Ｂ細胞株は、一般に末梢血リンパ球の長期培養によシ、
もしくはエプスタイン・バール・ウィル ５ − スによるフィルス発癌によって獲得することも可能であ
る。
もしくはエプスタイン・バール・ウィル ５ − スによるフィルス発癌によって獲得することも可能であ
る。
Ｂ細胞株は、細胞融合剤であるポリエチレングリコール
との接触に際しても強い耐性を示し、ヒトミエローマに
比較して、より効果的に融合された雑種細胞を獲得する
ことができる。
との接触に際しても強い耐性を示し、ヒトミエローマに
比較して、より効果的に融合された雑種細胞を獲得する
ことができる。
Ｂ細胞株の培養に用いられる培地の基本組成は、特に制
限はないが、１０チの牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６
４０培地が常用される。
限はないが、１０チの牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６
４０培地が常用される。
本発明に用いられる癌化していないヒト抗体産生細胞は
、末梢血リンパ球、リンパ節、肺臓などから獲得可能で
あり、特に制限はないが、通常、取得しやすさから末梢
血リンパ球が用いられる。
、末梢血リンパ球、リンパ節、肺臓などから獲得可能で
あり、特に制限はないが、通常、取得しやすさから末梢
血リンパ球が用いられる。
細胞融合は、融合すべき細胞を細胞融合剤の存在下、常
温で混合すればよい。
温で混合すればよい。
細胞融合剤としては、ポリエチレングリコール溶液、不
活化センダイフィルスなど、種々知られており、特に制
限はないが、調製が簡便であるポリエチレングリコール
溶液が用いやすい。細胞融合後、融合しなかった癌化し
ていない抗体産生細 ６− 胞は、徐々に死滅してゆき、雑種細胞株の獲得に特に支
障はないが、融合しなかったＢ細胞株は死滅しないので
、それとの分離は工夫を要する。
活化センダイフィルスなど、種々知られており、特に制
限はないが、調製が簡便であるポリエチレングリコール
溶液が用いやすい。細胞融合後、融合しなかった癌化し
ていない抗体産生細 ６− 胞は、徐々に死滅してゆき、雑種細胞株の獲得に特に支
障はないが、融合しなかったＢ細胞株は死滅しないので
、それとの分離は工夫を要する。
雑種細胞株と融合しなかったＢ細胞株との分離は、寒天
培地中でのクローニング限界希釈法等を用い、個々のコ
ロニー間の性状比較により実施可能であるが、よシ用い
やすい分離法として、Ｂ細胞株からあらかじめアミノプ
テリンを含む培地中で死滅するような酵素欠損株を選択
し、細胞融合用細胞株として用いる方法がある。この方
法によれば、細胞融合後アミノプテリンを含む培地中で
培養を行うこと罠より、雑種細胞のみを選択的に増殖せ
しめられる。この酵素欠損株の選択法は、例工ばヒポキ
サンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ（以下、ＨＧＰＲＴと略記する）の欠損株を獲得する
場合は、８−アザグアニンもしくはる一チオグアニンな
どの薬剤を含む培地中で増殖できる細胞株を選択する。
培地中でのクローニング限界希釈法等を用い、個々のコ
ロニー間の性状比較により実施可能であるが、よシ用い
やすい分離法として、Ｂ細胞株からあらかじめアミノプ
テリンを含む培地中で死滅するような酵素欠損株を選択
し、細胞融合用細胞株として用いる方法がある。この方
法によれば、細胞融合後アミノプテリンを含む培地中で
培養を行うこと罠より、雑種細胞のみを選択的に増殖せ
しめられる。この酵素欠損株の選択法は、例工ばヒポキ
サンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラー
ゼ（以下、ＨＧＰＲＴと略記する）の欠損株を獲得する
場合は、８−アザグアニンもしくはる一チオグアニンな
どの薬剤を含む培地中で増殖できる細胞株を選択する。
またチミジン・カイネースの欠損株を得る場合は、５−
ブロモデオキシウリジンを含む培地中で増殖しりる細胞
株を選択する。
ブロモデオキシウリジンを含む培地中で増殖しりる細胞
株を選択する。
これらの方法は、用いようとするＢ細胞株の薬剤感受性
により必要な薬剤濃度が異なるため、まず、種々の濃度
の薬剤を含む培地にて培養を行ない、薬剤非添加時の１
／２の増殖速度を示す薬剤濃度を求め、該濃度の２０〜
１００倍濃度の薬剤濃度１で２〜６ケ月をかけて徐々に
薬剤を増加せしめることにより、酵素欠損細胞株を獲得
できる。
により必要な薬剤濃度が異なるため、まず、種々の濃度
の薬剤を含む培地にて培養を行ない、薬剤非添加時の１
／２の増殖速度を示す薬剤濃度を求め、該濃度の２０〜
１００倍濃度の薬剤濃度１で２〜６ケ月をかけて徐々に
薬剤を増加せしめることにより、酵素欠損細胞株を獲得
できる。
該細胞株はアミノプテリンを含む培地中で生存できない
。以下該細胞株をアミノプテリン感受性Ｂ細胞株と略す
。獲得された株が真にアミノプテリン感受性Ｂ細胞株で
あることを確認するために、種々の濃度のアミノプテリ
ンを含む培地中で１５日間培養を行い、確実に該細胞株
が死滅することを確認し、酵素欠損株を死滅させる薬剤
であるアミノプテリンの有効濃度を求める。該細胞株の
全てが、培養開始後１５日間で死滅するアミノプテリン
の最少濃度からその１００倍までの＃［を、細胞融合後
の選択培地のアミノプテリン濃度とすることが好ましい
。
。以下該細胞株をアミノプテリン感受性Ｂ細胞株と略す
。獲得された株が真にアミノプテリン感受性Ｂ細胞株で
あることを確認するために、種々の濃度のアミノプテリ
ンを含む培地中で１５日間培養を行い、確実に該細胞株
が死滅することを確認し、酵素欠損株を死滅させる薬剤
であるアミノプテリンの有効濃度を求める。該細胞株の
全てが、培養開始後１５日間で死滅するアミノプテリン
の最少濃度からその１００倍までの＃［を、細胞融合後
の選択培地のアミノプテリン濃度とすることが好ましい
。
より好ましいアミノプテリン感受性Ｂ細胞株としては、
前述したＢ細胞株ＲＰＭＩ−１７８８を８−アザグアニ
ンを含む培地中で選択し、アミノプテリン感受性Ｂ細胞
株（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ ８１１Ｂ）がある。該細
胞株は、平均染色体数は４５本、対数増殖期における２
倍増殖に要する時間は１８時間であり、細胞表面に免疫
グロブリンを有していると共に、その培養上清中にもそ
れが分泌されている。該細胞株は、ヒト抗体産生細胞と
の細胞融合を極めて効果的に実施できる。
前述したＢ細胞株ＲＰＭＩ−１７８８を８−アザグアニ
ンを含む培地中で選択し、アミノプテリン感受性Ｂ細胞
株（ＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ ８１１Ｂ）がある。該細
胞株は、平均染色体数は４５本、対数増殖期における２
倍増殖に要する時間は１８時間であり、細胞表面に免疫
グロブリンを有していると共に、その培養上清中にもそ
れが分泌されている。該細胞株は、ヒト抗体産生細胞と
の細胞融合を極めて効果的に実施できる。
以下、細胞融合の詳細について記載する。
ヒトの抗体産生細胞を末梢血よシ獲得する場合は、フィ
コール・コンレイ液の上部に重層せしめ、４００？、３
０分の遠心分離を施し、中間層と得られる末梢血リンパ
球分画（以下、ＰＢＬと略記する）金柑いる。その他組
織中から抗体産生細胞管獲得する場合は、組織をよく切
シきざみ、ステンレスメツシュを用いて固形成分とリン
パ球を分離し、混入した赤血球は０．１４Ｍ塩化アンモ
ニウム溶液にて溶血処理を施して除去しておく。
コール・コンレイ液の上部に重層せしめ、４００？、３
０分の遠心分離を施し、中間層と得られる末梢血リンパ
球分画（以下、ＰＢＬと略記する）金柑いる。その他組
織中から抗体産生細胞管獲得する場合は、組織をよく切
シきざみ、ステンレスメツシュを用いて固形成分とリン
パ球を分離し、混入した赤血球は０．１４Ｍ塩化アンモ
ニウム溶液にて溶血処理を施して除去しておく。
＝ ９−
このようにして得られたヒト抗体産生細胞を含む浮遊液
とアミノプテリン感受性Ｂ細胞株を混合し、遠心分離操
作で牛胎児血清等の蛋白成分を完全に除去する。
とアミノプテリン感受性Ｂ細胞株を混合し、遠心分離操
作で牛胎児血清等の蛋白成分を完全に除去する。
両細胞の混合比率は特に制限はなく、１：１の細胞比率
から一方の細胞を１００倍程度まで過剰に加えてもよい
。
から一方の細胞を１００倍程度まで過剰に加えてもよい
。
続いて細胞融合促進剤である分子量１５００〜６０００
のポリエチレングリコールを蛋白質を含まない培地もし
くは平衡塩液に溶解し、６５〜５５チとしたものを、細
胞１０７個あたり ０．１〜１−の割合でゆつくシと滴
下し２〜３分間放置後、蛋白質を含まない培地で洗浄し
、充分にポリエチレングリコールを希釈する。
のポリエチレングリコールを蛋白質を含まない培地もし
くは平衡塩液に溶解し、６５〜５５チとしたものを、細
胞１０７個あたり ０．１〜１−の割合でゆつくシと滴
下し２〜３分間放置後、蛋白質を含まない培地で洗浄し
、充分にポリエチレングリコールを希釈する。
続いて、アミノプテリン感受性Ｂ細胞を完全に死滅させ
る最少〜１００倍濃度Ｏ７ミノプテリン、および融合細
胞の増殖を促進する因子であるヒポキサンチンおよびチ
ミジンを含む培地（以下、ＨＡＴ培地と略記する）に細
胞を分散せしめ、９６穴マイクロテストプレートに分注
し、炭酸ガス培−１０− 養器中にて融合細胞の増殖をはかり、培養上清中に抗体
を放出せしめる。なお、ヒボキサンチンおよびチミジン
の濃度は細胞障害を示さない範囲ならば特に制限はない
が、それぞれ１０−４Ｍおよび１．５ Ｘ １０−５
Ｍ程度が望ましい。
る最少〜１００倍濃度Ｏ７ミノプテリン、および融合細
胞の増殖を促進する因子であるヒポキサンチンおよびチ
ミジンを含む培地（以下、ＨＡＴ培地と略記する）に細
胞を分散せしめ、９６穴マイクロテストプレートに分注
し、炭酸ガス培−１０− 養器中にて融合細胞の増殖をはかり、培養上清中に抗体
を放出せしめる。なお、ヒボキサンチンおよびチミジン
の濃度は細胞障害を示さない範囲ならば特に制限はない
が、それぞれ１０−４Ｍおよび１．５ Ｘ １０−５
Ｍ程度が望ましい。
本発明のＢ細胞株を用いる利点としては、（１）４５％
程度のポリエチレングリコール液に１０分程度接触する
際の細胞障害が極めて少ない。
程度のポリエチレングリコール液に１０分程度接触する
際の細胞障害が極めて少ない。
（２）雑種細胞の増殖が容易である。
（３）ヒト抗体産生細胞の該産生能を容易に細胞株に移
入できる。
入できる。
などがあげられる。
ヒト抗体は、一般に融合細胞の培養上清から獲得するこ
とが可能である。特定の抗体のみを獲得するためには、
例えば融合細胞株の中から特定の株を選択し、それを培
養し、そこから特異的な抗体を分離することができる。
とが可能である。特定の抗体のみを獲得するためには、
例えば融合細胞株の中から特定の株を選択し、それを培
養し、そこから特異的な抗体を分離することができる。
また、この雑種細胞株を、拒絶反応、ナチュラル・キラ
ー活性等が抑制された状態の哺乳動物の腹腔内に移植し
、増殖せしめることが可能である。ここで用いる哺乳動
物としては、ヌードマウス等の胸腺欠損動物が用いやす
い。
ー活性等が抑制された状態の哺乳動物の腹腔内に移植し
、増殖せしめることが可能である。ここで用いる哺乳動
物としては、ヌードマウス等の胸腺欠損動物が用いやす
い。
実施例１
ヒ）Ｂリンパ球由来細胞株ＲＰＭＩ−１７８８からのア
ミノプテリン感受性（）（ＧＰＲＴ欠損）Ｂ細胞の分離 ＲＰＭＩ−１７８８株を、１０％牛脂児血清を含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地にて１０ａｍまで細胞を増殖せしめ
、続いて同培地に１μｔ／−の８−アザグアニンを添加
した培地にて１０日間培養を継続し、細胞増殖速度が薬
剤無添加時の１／２以下にあることを確認した後、生細
胞集団を倒立顕微鏡下でマイクロピペットを用いて捕捉
した。
ミノプテリン感受性（）（ＧＰＲＴ欠損）Ｂ細胞の分離 ＲＰＭＩ−１７８８株を、１０％牛脂児血清を含むＲＰ
ＭＩ−１６４０培地にて１０ａｍまで細胞を増殖せしめ
、続いて同培地に１μｔ／−の８−アザグアニンを添加
した培地にて１０日間培養を継続し、細胞増殖速度が薬
剤無添加時の１／２以下にあることを確認した後、生細
胞集団を倒立顕微鏡下でマイクロピペットを用いて捕捉
した。
続いて３μｔ／ゴ、１０μ２／−１２０μｍ／−の８−
アザグアニン濃度の培地で各１５日間ずつ培養を行い、
生細胞集団をマイクロピペットを用いて移していった。
アザグアニン濃度の培地で各１５日間ずつ培養を行い、
生細胞集団をマイクロピペットを用いて移していった。
最終的に異なったクローンから得られた計２４ウェルの
細胞集団を獲得した。それぞれのウェルの一部を分けと
シ、種々の濃度のアミノプテリンを含み、１０％の牛胎
児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地にて培養を試み
たところ、４×１０−８Ｍ以上のアミノプテリンを含む
培地にて１５日間培養した場合に、２４ウエル中５ウエ
ルが死滅した。このことより、この３ウエルは酵素欠損
株でアシ、アミノプテリン感受性Ｂ細胞株であると判定
した。該アミノプテリン感受性Ｂ細胞株を死滅させるの
に十分なアミノプテリンの最少濃度は４Ｘ１０”Ｍと判
定した。このアミノプテリン感受性（ＨＧＰＲＴ欠損）
Ｂ細胞を再度分散せしめ培養を施し、１個の細胞から由
来したと考えられる細胞集団を獲得し、かつ前述のアミ
ノプテリン感受性のあることを再度確かめ、この細胞株
を以下の細胞融合に供した。
細胞集団を獲得した。それぞれのウェルの一部を分けと
シ、種々の濃度のアミノプテリンを含み、１０％の牛胎
児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地にて培養を試み
たところ、４×１０−８Ｍ以上のアミノプテリンを含む
培地にて１５日間培養した場合に、２４ウエル中５ウエ
ルが死滅した。このことより、この３ウエルは酵素欠損
株でアシ、アミノプテリン感受性Ｂ細胞株であると判定
した。該アミノプテリン感受性Ｂ細胞株を死滅させるの
に十分なアミノプテリンの最少濃度は４Ｘ１０”Ｍと判
定した。このアミノプテリン感受性（ＨＧＰＲＴ欠損）
Ｂ細胞を再度分散せしめ培養を施し、１個の細胞から由
来したと考えられる細胞集団を獲得し、かつ前述のアミ
ノプテリン感受性のあることを再度確かめ、この細胞株
を以下の細胞融合に供した。
なお、該細胞株はＡＴＣＣ−ＣＲＬ ８１１８としてア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託さ
れている。
ポリエチレングリコールに対する耐性試験細胞融合の実
施に先立ち、該細胞株がポリエチレングリコールによっ
て受ける細胞障害の程度を検討した。
施に先立ち、該細胞株がポリエチレングリコールによっ
て受ける細胞障害の程度を検討した。
−１３−
分子量２００口のポリエチレングリコールを４５チ含む
ハンクス処方平衡塩液を２−調製し、ｐＨを８．２にあ
わせた後、濾過、滅菌を施した。
ハンクス処方平衡塩液を２−調製し、ｐＨを８．２にあ
わせた後、濾過、滅菌を施した。
２ Ｘ １０？個の、良くハンクス処方平衡塩液にて洗
浄を施したＣＲＬ８１１８に、該ポリエチレングリコー
ル溶液を２分３０秒を要し徐々に滴下し、その後１分間
３７℃にて装置した。このとき用いた細胞株ＣＲＬ８１
１Ｂの細胞生存率を色素トリバンプルーの排除能にて測
定したところ、９７チと算定された。
浄を施したＣＲＬ８１１８に、該ポリエチレングリコー
ル溶液を２分３０秒を要し徐々に滴下し、その後１分間
３７℃にて装置した。このとき用いた細胞株ＣＲＬ８１
１Ｂの細胞生存率を色素トリバンプルーの排除能にて測
定したところ、９７チと算定された。
続いて、蛋白成分を含まない培地ＲＰＭＩ−１６４０を
２０耐用いて、徐々にポリエチレングリコールを希釈し
た。この細胞浮遊液をゆるやかに遠心分離し、１０−の
牛胎児血清を含む培地ＲＰＭＩ−１６４０に再浮遊せし
めた。このポリエチレングリコール処理細胞を含む培養
液を、２４大の培養用プラスチックプレートの各穴に１
０”個ずつ分注し、炭酸ガス濃度５チ、温度３７℃に設
定した炭酸ガス培養器にて３日間培養した後、該細胞株
の生存率を測定したところ、９２チであった。
２０耐用いて、徐々にポリエチレングリコールを希釈し
た。この細胞浮遊液をゆるやかに遠心分離し、１０−の
牛胎児血清を含む培地ＲＰＭＩ−１６４０に再浮遊せし
めた。このポリエチレングリコール処理細胞を含む培養
液を、２４大の培養用プラスチックプレートの各穴に１
０”個ずつ分注し、炭酸ガス濃度５チ、温度３７℃に設
定した炭酸ガス培養器にて３日間培養した後、該細胞株
の生存率を測定したところ、９２チであった。
−１４−
細胞融合
健常者末梢血２０ｖｎｌ’ｃ、抗凝固剤としてヘパリン
を用いて採血し、フィコール・コンレイ液（比重１，０
７７ ）を用いた比重遠心法により、新鮮リンパ球２
Ｘ １０？個を含む浮遊液を獲得した。
を用いて採血し、フィコール・コンレイ液（比重１，０
７７ ）を用いた比重遠心法により、新鮮リンパ球２
Ｘ １０？個を含む浮遊液を獲得した。
次いで、該リンパ球を同数の細胞株ＣＲＬ８１１８と混
和し、ハンクス処方平衡塩液にて遠心操作をくりかえし
、３回洗浄後、充分圧洗浄液を除いた。
和し、ハンクス処方平衡塩液にて遠心操作をくりかえし
、３回洗浄後、充分圧洗浄液を除いた。
細胞融合促進剤としては、分子［２０００のポリエチレ
ングリコールを４５チ含むハンクス処方平衡塩液を２−
調製し、ｐ）Ｉを８．２にあわせた後、濾過滅菌を施し
た。この融合促進剤溶液を洗浄後の両細胞混合物に、２
分６０秒を要し徐々に滴下し、その抜１分間３７℃にて
放置した。
ングリコールを４５チ含むハンクス処方平衡塩液を２−
調製し、ｐ）Ｉを８．２にあわせた後、濾過滅菌を施し
た。この融合促進剤溶液を洗浄後の両細胞混合物に、２
分６０秒を要し徐々に滴下し、その抜１分間３７℃にて
放置した。
続いて、蛋白成分を含まない培地ＲＰＭＩ−１６４０１
２０＃Ｉ７！用いて、徐々にポリエチレングリコールを
希釈した。この希釈液をゆるやかに遠心分離し、１０−
７Ｍのアミノプテリン、１０−４Ｍのヒボキサンチンお
よび１，５ Ｘ １０” Ｍのチミジンを含む培地（以
下ＨＡＴ培地第１処方）８０−でおき替えた。
２０＃Ｉ７！用いて、徐々にポリエチレングリコールを
希釈した。この希釈液をゆるやかに遠心分離し、１０−
７Ｍのアミノプテリン、１０−４Ｍのヒボキサンチンお
よび１，５ Ｘ １０” Ｍのチミジンを含む培地（以
下ＨＡＴ培地第１処方）８０−でおき替えた。
９６大の組織培養用マイクロテストプレート４枚を用意
し、各穴２００μｔずつ分注した。４日毎に培地の半量
を新鮮なＨＡＴ培地第１処方におき替え、２０日後、倒
立顕微鏡下で細胞集団の増殖が認められた。培養上清中
のヒトのＩｇＧをペルオキシダーゼ抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイ法で分析したところ、７８チの培養
穴にヒトのＩｇＧが放出されていることを確認した。
し、各穴２００μｔずつ分注した。４日毎に培地の半量
を新鮮なＨＡＴ培地第１処方におき替え、２０日後、倒
立顕微鏡下で細胞集団の増殖が認められた。培養上清中
のヒトのＩｇＧをペルオキシダーゼ抗体を用いたエンザ
イムイムノアッセイ法で分析したところ、７８チの培養
穴にヒトのＩｇＧが放出されていることを確認した。
実施例２
ヒ）Ｂ細胞由来の細胞株Ｂｒ１ｓｔｏｌ −７を用いて
、実施例１と同様の耐性株化操作を施し、アミノプテリ
ン感受性を有する細胞を分離し、株化した。
、実施例１と同様の耐性株化操作を施し、アミノプテリ
ン感受性を有する細胞を分離し、株化した。
該株のポリエチレングリコールに対する感受性を、実施
例１と同様の操作で測定した結果、実験前の生存率９４
％のところ、ポリエチレングリコール処理して３日間培
養後、８８チの生存率を示した。
例１と同様の操作で測定した結果、実験前の生存率９４
％のところ、ポリエチレングリコール処理して３日間培
養後、８８チの生存率を示した。
次に、実施例１と同様の操作で健常者のリンパ球との細
胞融合を行ったところ、２０日間培養後、３２％の培養
穴にヒトのＩｇＭが放出されていることが確認された。
胞融合を行ったところ、２０日間培養後、３２％の培養
穴にヒトのＩｇＭが放出されていることが確認された。
比較例
ヒトノミエローマ株Ｕ −２６６（Ｃ１ｉｎｉｃＣ１１
ｎｉｃａｌＥｘｐｅｒｉ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ
ｌ 、７ （１９７０）第４７７頁〜第４８９頁に示さ
れている）を用いて、実施例１と同様の方法にてアミノ
プテリン感受性細胞を分離し株化した。
ｎｉｃａｌＥｘｐｅｒｉ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏ
ｌ 、７ （１９７０）第４７７頁〜第４８９頁に示さ
れている）を用いて、実施例１と同様の方法にてアミノ
プテリン感受性細胞を分離し株化した。
該株のポリエチレングリコールに対する感受性を、実施
例１と同様の操作で測定した結果、実験前の生存率が９
３％のところ、ポリエチレングリコール処理して３日間
培養後、２５％の生存率であった。
例１と同様の操作で測定した結果、実験前の生存率が９
３％のところ、ポリエチレングリコール処理して３日間
培養後、２５％の生存率であった。
次に実施例１と同様の操作で健常者のリンノく球との細
胞融合全行ったところ、２０日間の培養後に詳細に生存
細胞を検鏡によシ検索したが、全く認められなかった。
胞融合全行ったところ、２０日間の培養後に詳細に生存
細胞を検鏡によシ検索したが、全く認められなかった。
また培養上清中のＩｇＧおよびＩｇＭを測定したが、全
く検出されな、かった。
く検出されな、かった。
−１７−
Claims (3)
- （１） ヒ）Ｂ細胞が腫瘍化し、細胞表面に免疫グロ
ブリンを有している細胞株と、癌化していないヒト抗体
産生細胞とを細胞融合して々る雑種細胞を用いることを
特徴とするヒト抗体の産生方法。 - （２） ヒ）Ｂ細胞が腫瘍化し、細胞表面に免疫グロ
ブリンを有している細胞株が、アミノプテリンを含む培
地中で生存しえないものである特許請求の範囲第１項記
載のヒト抗体の産生方法。 - （３） ヒ）Ｂ細胞が腫瘍化し、細胞表面に免疫グロ
ブリンを有している細胞株が、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ８１
１８の同定特性を有するものである特許請求の範囲第２
項記載のヒト抗体の産生方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57097596A JPS58216125A (ja) | 1982-06-09 | 1982-06-09 | ヒト抗体の産生方法 |
| DE8383105615T DE3379055D1 (en) | 1982-06-09 | 1983-06-08 | Method for producing human antibody |
| EP83105615A EP0096839B1 (en) | 1982-06-09 | 1983-06-08 | Method for producing human antibody |
| US06/750,199 US4833077A (en) | 1982-06-09 | 1985-07-01 | Method for producing human antibody |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57097596A JPS58216125A (ja) | 1982-06-09 | 1982-06-09 | ヒト抗体の産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58216125A true JPS58216125A (ja) | 1983-12-15 |
| JPH0439999B2 JPH0439999B2 (ja) | 1992-07-01 |
Family
ID=14196612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57097596A Granted JPS58216125A (ja) | 1982-06-09 | 1982-06-09 | ヒト抗体の産生方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58216125A (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6133125A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-02-17 | Morinaga & Co Ltd | ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体 |
| JPS6187630A (ja) * | 1984-10-08 | 1986-05-06 | Teijin Ltd | 単純ヘルペスウイルスに対するヒトモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| JPS61155398A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-15 | Teijin Ltd | 抗緑膿菌ヒトモノクロ−ナル抗体及びその製造法並びにそれを有効成分とする治療剤 |
| JPS61204200A (ja) * | 1984-09-26 | 1986-09-10 | Sumitomo Chem Co Ltd | ヒトモノクロ−ナル抗体およびその製法 |
| JPS6272627A (ja) * | 1985-09-27 | 1987-04-03 | Teijin Ltd | 単純ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療剤 |
| JPS62187417A (ja) * | 1985-12-10 | 1987-08-15 | ジエネテイツク システムズ コ−ポレ−シヨン | 緑膿菌血清型に対する交さ反応性かつ交さ防御性単クロ−ン性抗体 |
| JPS6467199A (en) * | 1987-09-08 | 1989-03-13 | Agency Ind Science Techn | Human igg1 type monoclonal antibody, production thereof and hybridoma capable of producing said antibody |
| RU2709531C2 (ru) * | 2010-05-28 | 2019-12-18 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ культивирования одиночной в-клетки |
-
1982
- 1982-06-09 JP JP57097596A patent/JPS58216125A/ja active Granted
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6133125A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-02-17 | Morinaga & Co Ltd | ヒト単クロ−ン性抗肺ガン細胞抗体 |
| JPH0429357B2 (ja) * | 1984-07-25 | 1992-05-18 | ||
| JPS61204200A (ja) * | 1984-09-26 | 1986-09-10 | Sumitomo Chem Co Ltd | ヒトモノクロ−ナル抗体およびその製法 |
| JPS6187630A (ja) * | 1984-10-08 | 1986-05-06 | Teijin Ltd | 単純ヘルペスウイルスに対するヒトモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| JPS61155398A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-15 | Teijin Ltd | 抗緑膿菌ヒトモノクロ−ナル抗体及びその製造法並びにそれを有効成分とする治療剤 |
| JPH0361428B2 (ja) * | 1984-12-28 | 1991-09-19 | Teijin Ltd | |
| JPS6272627A (ja) * | 1985-09-27 | 1987-04-03 | Teijin Ltd | 単純ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療剤 |
| JPS62187417A (ja) * | 1985-12-10 | 1987-08-15 | ジエネテイツク システムズ コ−ポレ−シヨン | 緑膿菌血清型に対する交さ反応性かつ交さ防御性単クロ−ン性抗体 |
| JPS6467199A (en) * | 1987-09-08 | 1989-03-13 | Agency Ind Science Techn | Human igg1 type monoclonal antibody, production thereof and hybridoma capable of producing said antibody |
| RU2709531C2 (ru) * | 2010-05-28 | 2019-12-18 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Способ культивирования одиночной в-клетки |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0439999B2 (ja) | 1992-07-01 |
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