AT398781B - Unsterbliche zellinie und deren verwendung - Google Patents

Description

AT 398 781 B

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Anwendung immunologischer Verfahren zur Gewinnung neuartiger Materialien, die zur Behandlung und Diagnose von bakteriellen Infektionen geeignet sind. Im speziellen betrifft die Erfindung eine unsterbliche Zellinie, welche einen menschlichen monoklonalen Antikörper oder bindende Fragmente davon sezerniert, welche spezifisch kreuzreaktiv sind mit einem 5 Epitop, das einen zugänglichen nicht-Kern-Kohlenhydrat-Anteil umfaßt, der sich auf mindestens zwei Serotypen zweier verschiedener Spezies verschiedener bakterieller Genera findet, wobei diese bakteriellen Spezies mindestens zwei der Spezies Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus agalactiae Gruppe B sind. io Grampositive und gramnegative Bakterien können bei infizierten Patienten lebensgefährliche Erkrankungen verursachen. Diese bakteriellen Infektionen verursachen oft eine signifikante Morbidität und Mortalität. Ein erhöhtes Auftreten derartiger Infektionen liegt bei frühgeborenen Kindern, älteren Patienten und Patienten mit ernsthaften medizinischen Beeinträchtigungen, wie Verbrennungen, chirurgischen Traumen, schlecht heilenden Wunden oder malignen Erkrankungen vor. Diese Infektionen sind typischerweise 15 nosokomen Ursprungs (d.h. spitalsbedingt) und treten vor allem bei Patienten auf, die eine längere Hospitalisierung in Verbindung mit einem chirurgischen Eingriff, einer Gefäßerkrankung oder einer Langzeitbehandlung mit immunsupprimierenden Mitteln oder Antibiotika durchgemacht haben. Außerdem sind Neugeborene, deren Immunsystem noch nicht ausgereift ist, offensichtlich sehr anfällig gegenüber neonata-ler Sepsis und Meningitis, verursacht durch bestimmte gramnegative und grampositive Bakterien. 20 Zu den bei grampositiven und gramnegativen Erkrankungen am häufigsten auftretenden Keimen gehören Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Serratia marcescens (S. marcescens), Enterobacter aerogenes und cloacae (E. aerogenes/cloacae), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Neisseria meningitidis (N, meningitidis), Streptococcus Gruppe B und Staphylococcus aureus -(S. aureus) (Sonnenwirth A.C., "The Enteric Bacilli and Similar Gram-Negative Bacteria", pp.753-790, in: 25 Microbiology, 2.ed., Davis B.D., Dulbecco R., Eisen H.N., Ginserberg H.S., Wood W.B. und McCarty M., Eds., Harper and Row (1973); McCabe W.R., "Gram-Negative Bacteremia", Adv. Intern.Med. 19, 135-138 (1974); Kreger et al., "Gram-Negative Becteremia III. Reassessment of Etiology, Epidemiology and Ecology in 612 Patients" Am.J.Med. 68, 332-343 (1980); Robbins J.B., et al. "Escherichia coli K1 Capsuiar Polysaccharide Associated With Neonatal Meningitis”, New.Engl.J.Med. 290, 1216-1220 (1974); und Hughs 30 J.M. et al., "Nosocomial Infection Surveillence, 1980-1982”, Morb.Mort.Weekly Report, 32, 1SS-16SS (1983)). Von diesen Infektionen verursachen üblicherweise einige, aber nicht alle Serotypen gewisser gramnegetiver Bakterien, z.B. E. coli, K. pneumoniae, E. aerogenes/cloacae, P. aeruginose und S. marcescens, bei Erwachsenen eine Bakteriämie. Im Gegensatz zu Erwachsenen ist der immunologisch unreife Neugeborene besonders empfindlich gegen Septikämie und Meningitis, verursacht durch die verkapselten 35 Formen von E. coli, N. meningitidis Gruppe B, Hemophilus influenzae Typ B und den fünf Stämmen von Streptococcus Gruppe B. Obwohl auch andere Bakterien diese Infektionen verursachen können, sind die oben erwähnten Bakterien die bei den angeführten Biutinfektionen vorwiegend isolierten.

Seit langer Zeit sind die Antibiotika die hauptsächlichen therapeutischen Mittel zur Kontrolle und Auslöschung grampositiver und gramnegetiver Infektionen. Des anhaltende Auftreten und die Schwere der 40 Infektionen, das fortgesetzte Auftreten antibiotika-resistenter Stämme von Bakterien und die inhärente Toxizität einiger Antibiotika zeigen jedoch die Grenzen der Antibiotikatherapie auf. Auf Grund dieser Beobachtungen wurde nach alternativen prophylaktischen und therapeutischen Wegen gesucht.

Es ist weitgehend anerkannt, daß Antikörper, die mit zugänglichen (außen liegenden) Strukturen lebender Bakterien reagieren, die Zerstörung dieser Bakterien durch einen von verschiedenen Mechanis-45 men hervorrufen können. Diese Mechanismen sind unter anderem: (1) direkte Lyse der Bakterien in Anwesenheit von Serumkomplement, (2) Bakteriostase durch Blockierung von Nährstoffrezeptoren, (3) Opsonisierung und darauffolgende Phagozytose der Bakterien in Anwesenheit oder Abwesenheit von Serumkomplement, oder (4) Verhinderung der Anheftens der Bakterien an das Wirtsgewebe (Mims C.A., "Recovery from Infection", in The Pathogenesis of Infectious Disease, pp.198-222, Mims C.A., Ed., so Academic Press (1982)). Für Bakterien, die an der Oberfläche Kohienhydratmoleküie, wie Lipopolysacchari-de (LPS) und/oder Kapseln aufweisen, scheinen die Antikörper am ehestens über den Opsonisierungs-Mechanismus zu wirken (Kaijser B. et al., "The Protective Effect Against E. coli of 0 and K Antibodies, of Different Immunoglobulin Classes", Scand.J. Immunol. 1, 276 (1972)). Antikörper, die auf die zugänglichen Kohlenhydrat-Strukturen gerichtet sind, können daher ein wirksames Mittel zur Vernichtung von Bakterien 55 darstelien.

Im allgemeinen erzeugen Säugetiere, die krankheitserregenden Bakterien ausgesetzt sind, Antikörper, die auf LPS oder Kapsel spezifisch sind. Die Antigene sind chemisch uneinheitliche, aus sich häufig wiederholenden Oligosaccharid-Molekülen bestehende Strukturen, deren Anwesenheit den Serotyp des 2

AT 398 781 B

Bakterienstamms bestimmt. Da es sich oft um die immunodominanten bakteriellen Antigene handelt, wurden von den potentiell therapeutischen Antikörpern die Serotyp-spezifischen Antikörper (gegen LPS oder Kapsel) am meisten untersucht. Wegen der begrenzten Kreuzreaktivität dieser Antikörper und der offensichtlich sehr verschiedenen Natur der Kohienhydrat-Antigene auf pathogenen grampositiven und gramnegativen Bakterien wäre es jedoch äußerst schwierig und kostspielig, eine therapeutische Zubereitung herzustellen, die nur Serotyp-spezifische Antikörper enthält (vgl. z.B. Kaijser B. und Ahlstedt S., "Protective Capacity of Antibodies Against Escherichia coli 0 and K Antigens", Infectlmmun. 17, 286-292 (1977)); und Morrison D.C. und Ryan J.L., "Bacterial Endotoxins and Host Immune Response", Adv. Immunol. 28, 293-450 (1979)). Unabhängig davon gaben jedoch verschiedene Arbeiten deutliche Hinweise darauf, daß immuntherapeutische Wege zur Behandlung gramnegativer bakterieller Krankheiten gefunden werden könnten.

Fraktioniertes menschliches Plasma, das an Immunglobulinen, die spezifische und protektive Antikörper gegen infektiöse Keime enthalten, angereichert ist, zeigte sich gegen P. aeruginosa Infektionen etwas wirksam. (Collins M.S. und Robey R.E., "Protective Activity of an Intravenous Immune Globuline (Human) Enriched in Antibody Against Lipopolysaccharide Antigens of Pseudomonas aeruginosa", Amer.J.Med. 3, 168-174 (1984)). Die Produkte sind jedoch noch nicht im Handel auf Grund verschiedener inhärenter Beschränkungen, die ihren verbreiteten Einsatz bei der Behandlung lebensbedrohlicher bakterieller Krankheiten bisher verhindert haben.

Eine solche, mit Immunglobulin-Zubereitungen zusammenhängende Beschränkung besteht darin, daß sie aus großen Plasma-Sammelproben (Pools)zubereitet werden, die nach der Anwesenheit einer begrenzten Zahl bestimmter Antikörper gewählt wurden. Typischerweise bestehen dieses Pools aus Proben von tausend Spendern, die gegen einige pathogene Bakterien niedrige Titer aufweisen können. Im besten Fall ergibt sich somit nur eine bescheidene Erhöhung im Gesamttiter an gewünschten Antikörpern.

Eine weitere derartige Beschränkung liegt darin, daß die Auswahl selbst sehr kostspielige fortgesetzte Reihenuntersuchungen der Spenderbevölkerung notwendig macht, um die gleichbleibende Qualität des Produkts zu gewährleisten. Trotz kräftiger Anstrengungen können die Hersteilungschargen noch immer zwischen den einzelnen Chargen und zwischen geographischen Regionen variieren.

Noch eine weitere derartige Beschränkung, die Immunglobulin-Zubereitungen inhärent ist, liegt darin, daß ihre Anwendung eine gleichzeitige Gabe großer Mengen von externen proteinischen Substanzen (z.B. Viren) mit sich bringt, die möglicherweise schädliche biologische Wirkungen verursachen können. Die Kombination von niedrigen Titern an den gewünschten Antikörpern und einem hohen Gehalt an körperfremden Substanzen begrenzt oft die Menge an spezifischen und damit günstigen Immunglobulinen, die dem Patienten verabreicht werden können, auf Werte die unterhalb des optimalen Bereichs liegen. 1975 berichteten Köhler und Milstein, daß gewisse Zelllinien von Mäusen mit Milzzellen von Mäusen zu Hybridomen fusioniert werden können, die reine "monoklonale" Antikörper sezernieren (Köhler G. und Milstein C., "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature 256, 495-497 (1975)). Mit dem Aufkommen dieses Verfahrens existierte die Möglichkeit, murine Antikörper gegen jede spezielle Determinante oder Determinanten auf Antigenen zu erzeugen.

Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde monoklonale Antikörper aus Mäusen gewonnen, die mit Polysaccharid aus Neisseria meningitidis Gruppe B immunisiert waren. Diese murinen IgM monoklonalen Antikörper banden sich an und opsonisierten verschiedene K1-positive Stäme von E. coli, unabhängig von ihren LPS-Serotypen (Gross a.a.O., Soderstrom a.a.O. und Gross A.S. et al., "The Importance of the K1 Capsule in Invasive Infections Caused by Escherichia coli", J.Inf.Dis. 149, 184-193 (1984)). Weiters erwiesen sich die monoklonalen Antikörper bei Mäusen als protektiv gegen potentiell letale Infektionen mit E. coli K1 und Meningokkoken Gruppe B ( Cross a.a.O. und Sunderstrom a.a.O.). In einem anderen Beispiel wurde berichtet, daß sich monoklonale Mäuse-Antikörper, spezifisch auf Typ III Gruppe B Streptococcus in einem experimentellen Infektionsmodell bei der Maus als protektiv erwiesen (Egan M.L. et al., "Protection of Mice from Experimental Infection with Type III Group B Streptococcus Using Monoclonal Antibodies", J.Exp.Med. 1, 1006-1011 (1983)).

Ein monoklonaler Mäuse-Antikörper ist zwar zur Behandlung von Mäusen brauchbar, hat aber zur Verwendung am Menschen entscheidende Nachteile. Das menschliche Immunsystem kann jeden monoklonalen Maus-Antikörper als fremdes Protein erkennen. Daraus kann sich eine beschleunigte Eliminierung des Antikörpers ergeben und demgemäß eine Abschwächung der pharmakologischen Wirksamkeit (Levy R. und Miller R.A., "Tumor Therapy with Monoclonal Antibodies", Fed.Proc. 42, 2650-2656 (1983)). Schlimmer jedoch Ist, daß dies unter Umständen zum Schock und sogar zum Tod durch allergische Reaktionen analog der "Serumkrankheit" führen könnte. In der klinischen Erfahrung zeigte es sich, daß Immunglobulin-Antworten gegen Maus-Antikörper die Verwendbarkeit dieser Antikörper bei etwa der Hälfte der Patienten, die monoklonale Maus-Antikörper zur Behandlung verschiedener Tumore erhielten, beschränkte (Sears H.F. 3

AT 398 781 B et al., "Phase I Clinical Trial of Monoclonal Antibody In Treatment of Gastrointestinal Tumor", Lancet 1_, 762-764 (1982); und Miller R.A. et al., "Monoclonal Antibody Therapeutic Trials in Seven Patients with T-Cell Lymphoma", Blood, 62, 988-995 (1983)).

Demgemäß besteht ein Bedarf an menschlichen monoklonalen Antikörpern, die gegen grampositive und 5 gremnegative bakterielle Krankheiten schützen. Die verschiedenen antigenen Eigenschaften grampositiver und gramnegativer krankheitserregender Bakterien lassen jedoch stark vermuten, daß es praktisch nicht sinnvoll wäre, Serotyp-spezifische menschliche monoklonale Antikörper gegen jedes der vielen wichtigen bakteriellen Pathogene herzustellen.

Die verschiedenen antigenen Eigenschaften gramnegativer Bakterien werden auf die variablen Bereiche io des Lipopolysaccharids (LPS) zurückgeführt, einem Molekül, das mit der äußeren Membran der gramnegativen Keime verbunden ist. Im allgemeinen betrachtet man das LPS-Molekül als aus drei Struktur-Bereichen bestehend. Der der äußeren Membran am nächsten gelegene Bereich ist der sogenannte Lipid A-Teil des LPS. Dieser strukturell konservierte Bereich besitzt die mit der gramnegativen Krankheit assoziierte Endotoxizität. Der zweite strukturelle Bereich, Kern ("Core") genannt, ist oft mit einem Lipid A über einen 2-75 Keto-3-desoxy-D-mannooctonat-Rest (KDO) verbunden und ist, ähnlich dem Lipid A-Bereich, üblicherweise nicht für den Antikörper erreichbar, falls der dritte, äußerste Bereich des LPS vorhanden ist. Obwohl dieser Bereich in einigen gramnegativen bakteriellen Spezies konserviert ist, wurden viele Abweichungen beim vollständigen Kern an Mitgliedern der Familie Enterobacteriaceae gefunden. Der äußerste Bereich eines LPS-Moleküls besteht aus repetierenden Oligosaccharid-Einheiten und wird als O-spezifische Seitenkette 20 bezeichnet. Die Zucker in diesen Oligosaccharid-Einheiten umfassen molekulare Einheiten, die Serotypspezifische strukturelle antigene Verschiedenheit aufweisen. Demgemäß bestimmen diese Zucker selbst, ihre Sequenz und ihre Bindungen die O-Seitenketten-Antigenwirkung über ihre Tertiärstruktur. Antikörper gegen diese O-Gruppen erwiesen sich im allgemeinen als Serotyp-spezifisch. Serotypen werden typischerweise definiert durch ihre Reaktivität mit monospezifischen Antisera, die nur eine bestimmte antigene 25 Determinante Bindungsfähigkeit aufweisen. Siehe allgemein Mayer et al. Meths.Microbiology, 18. 157-201 (1985).

Antisera gegen den Kern und den Lipid A-Bereich von LPS wurden hergestellt bei Versuchen, die Schutzwirkung gegen gramnegative Infektionen aufzuzeigen. Sakulramrung und Domingue, J.Inf.Dis. 151, 995-1104 (1985); McCabe et al., J.lnf. Dis., 1365, 516 (1977); und Mullan et al, Infectlmmun., 10,1195-1201 30 (1974). In jüngster Zeit wurden murine und menschliche monoklonale Antikörper hergestellt, die mit den konservierten Bereichen reaktiv waren. Obwohl diese Antikörper manchmal teilweise Wirksamkeit in vivo in maßgeschneiderten Modellsystemen aufwiesen, (Teng et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 82, 1790 (1985); und Bogard und Kung, Patentansuchen Nr. WO85/01659) konnten andere Laboratorien keine gleichwertigen Wirkungen nachweisen. Vgl. Elkins und Metcalf, Infectlmmun. 48, 597 (1985); und Gigliotti und Shenap, 35 J.Inf.Dis. 151, 1005-1011 (1985). Außerdem reagieren (binden) diese Antikörper im allgemeinen nicht mit intakten, lebensfähigen gramnegativen Bakterien oder gereinigten LPS-Molekülen. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß es zweifelhaft ist, ob der Kern oder die Lipid A-Bereiche des LPS auf Bakterien in ihrem natürlichen und infektiösen Zustand für Antikörper zugänglich sind. Es herrscht auch Übereinstimmung darüber, daß Antikörper gegen Kern oder Lipid A mit grampositiven Bakterien nicht reagieren, da 40 diese kein LPS besitzen. Angesichts dieser Ergebnisse ist es unwahrsheinlich, daß monoklonale Antikörper gegen die konservierten Kern- oder Lipid A-Bereiche von LPS bei der Behandlung menschlicher gramnegativer oder auch grampositiver bakterieller Krankheiten wirksam sind.

Es gibt somit noch immer einen eindeutigen Bedarf für menschliche monoklonale Antikörper, die breit (zwischen Genera, "inter-Genera") kreuzprotektiv gegen grampositive und gramnegative bakterielle Krank-45 heiten sind, ebenso wie für Verfahren zur praktischen Herstellung und Anwendung-derartiger Antikörper. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf durch Schaffung der Zellinien der eingangs genannten Art.

Die neuen Zellinien produzieren menschliche monoklonale Antikörper, die fähig sind, mit einer Vielzahl von bakteriellen Spezies durch Bindung an ein verfügbares Epitop, das aus einem nicht-Kern Kohlenhydrat-Anteil besteht, der an mindestens zwei verschiedenen bakteriellen Spezies vorhanden ist, zu kreuzreagie-50 ren. Dadurch werden Verfahren zur prophylaktischen Behandlung eines menschlichen Patienten möglich, der für bakterielle Infektionen anfällig ist, und zur therapeutischen Behandlung eines Patienten, der an einer derartigen Infektion leidet. Diesen Patienten gibt man eine wirksame Menge einer Zubereitung, die aus einer Vielzahl menschlicher monoklonaler Antikörper besteht, von denen mindestens einer imstande ist, mit einer antigenen nicht-Kern Kohlenhydrat-Determinante zu reagieren, die bei zwei oder mehr bakteriellen 55 Spezies gemeinsam auftritt. Die Zubereitung enthält vorzugsweise einen physiologisch verwendbaren Träger und kann außerdem eine oder mehrere der folgenden Substanzen enthalten: zusätzliche menschliche monoklonale Antikörper, die mit anderen bakteriellen Genera reagieren können; eine Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma; eine Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma, bei 4

AT 398 781 B der das Plasma von einem Menschen gewonnen wurde, der erhöhte Spiegel an Immunglobulinen aufweist, die mit einem oder mehreren bakteriellen Genera reagieren können; und eine oder mehrere antimikrobielle Substanzen.

Die bevorzugten Zellinien der oben genannten Art sind die mit den Hinterlegungsnummern ATCC Nr. CRL 5 9006, CRL 9007, CRL 9008, CRL 9009 und CRL 9239.

Die Zubereitungen, die die genannte menschlichen monoklonalen Antikörper enthalten, sind imstande, mit einer Vielzahl bakterieller Genera selektiv zu reagieren, die für nosokome, neonatale oder andere Infektionen verantwortlich sind, wobei die einzelnen Antikörper im typischen Fall mit nicht-kern Kohlenh-ydrat-Epitopen reagieren, die an mehreren bakteriellen Genera vorhanden sind. Die Zellen der erfindungs-10 gemäßen Zellinien haben identifizierbare Chromosome, in welchen die Keimlinien-DNA von ihnen oder einer Vorläuferzelle umgruppiert wurde, um einen Antikörper oder eines seiner Bindungsfragmente zu codieren, die eine Bindungsstelle für eine antigene Determinante (Epitop) aufweisen, welche verschiedene Kohlenhydrat-Moleküle gleichzeitig aufweisen, die sich auf zumindest einigen Serotypen von zwei oder mehreren bakteriellen Genera finden. Diese menschlichen monoklonalen Antikörper können in einer Vielzahl von Arten 15 verwendet werden, unter anderem zur Diagnose, Prophylaxe und Therapie bakterieller Krankheiten.

Im typischen Fall sind die Zellen der erfindungsgemäßen Zellinie solche, die zur gleichmäßigen Produktion eines menschlichen Antikörpers in Kultur fähig sind, insbesondere unsterbliche menschliche Lymphozyten, die protektive menschliche monoklonale Antikörper gegen nicht-Kern Kohlenhydrat-Determinanten auf zugänglichen Molekülen, die mindestens zwei bakteriellen Spezies gemeinsam sind, produzieren. 20 Unter "zugänglich" ist zu verstehen, daß die nicht-Kem Kohlenhydrat-Determinanten in dem verwendeten Milieu für die direkte Wechselwirkung mit den monoklonalen Antikörpern physikalisch verfügbar sind. Die so erhaltenen monoklonalen Antikörper sind zur Behandlung oder Prohpylaxe schwerer Krankheiten geeignet, die durch eine Vielzahl bakterieller Infektionen verursacht werden. Weiters sind diese nicht-Kem Kohlenhydrat-Moleküie, die in das umgebende Milieu abgegeben werden, frei, direkt mit den Antikörper-25 Molekülen zu reagieren und über das retikulo-endotheliale System eliminiert zu werden.

Die Zubereitungen, die die monoklonalen Antikörper enthalten, sind im typischen Fall brauchbar zur therapeutischen und prohylaktischen Behandlung nosokomer, neonataler und anderer Infektionen. Da nosokome Infektionen im allgemeinen vor allem von folgenden Bakterien: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/cloacae, Serratia marcescens und Streptococ-30 cus aglacticae Gruppe B verursacht werden, würden Antikörper-Zubereitungen, die gegen zwei, drei, vier oder mehr derartiger Bakterien schützen, bevorzugt. Ebenso sind für den neonatalen Einsatz, wie bei neonataler Sepsis und Meningitis, die Antikörper nach Möglichkeit spezifisch gegen zwei oder mehere der folgenden bakteriellen Keime: Escherichia coli K1, Neisseria meningitidis Gruppe B, Streptococcus aglacticae Gruppe B und Hemophilus influenzae Typ B. Andere verbreitete infektiöse Bakterien sind unter 35 anderem: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabi-lis, Proteus vulgaris, Bacteroides fragilis, Pseudomonas cepacia, Mycobacterium tuberculosis, Providencia morganii, Salmonella typhi, Pneumocystis carinii, Acinetobacter herellea, Pasturella multocida, Klebsiella oxytoca. Bezüglich weiterer, dem Fachmann bekannter relevanter pathogener Bakterien siehe Hughs J.M. et al., "Nosocomial Infection Surveillance 1980-1982”, Morb.Mort. Weekly Report, 32, 1SS-16SS (1983), und, 4o allgemein, Microbiology, 3.ed., Davis B.D, Dulbecco R., Eisen H.N., Ginserberg H.S., Wood W.B. und McCarty, M. Eds., Harper and Row (1980), die beide hier als Bezugsstelle angeführt werden. Die monoklonalen Antikörper reagieren mit einzelnen oder allen Angehörigen einer bestimmten bakteriellen Spezies, wobei die Angehörigen durch ihre Oberfiächen-Epitope, insbesondere LPS oder Kapsel-Stellen, z.B. Serotypen, unterschieden werden können. 45 Die unerwartete Entdeckung einer monoklonalen Antikörper-Kreuzreaktivität zwischen verschiedenen bakteriellen Spezies, einschließlich der oben angeführten klinisch wichtigen Spezies, ergibt ein neuartiges Mittel für therapeutische und prophylaktische Behandlungen. Durch Verwendung ausgewähiter kreuzreaktiver Antikörper in Kombination kann eine Mischung einiger weniger Antikörper zur Behandlung einer Anzahl verschiedenen Spezies infektiöser Bakterien hergestelit werden, so Als Beispiel, nicht als Einschränkung, ist eine Mischung von zwei monoklonalen Antikörpern, einer kreuzreaktiv mit mindestens zwei bakteriellen Spezies klinischer Bedeutung, und der andere kreuzreaktiv mit mindestens zwei oder drei verschiedener Spezies, bei der Behandlung gegen vier, fünf, sechs oder mehr verschiedene Spezies brauchbar. Der Zusatz eines dritten oder vierten monoklonalen Antikörpers, die jeder mit mindestens zwei klinisch relevanten Spezies kreuzreaktiv sind (selbst wenn eine oder mehrere der 55 Spezies gleich sind mit jenen, die vom ersten und/oder zweiten Antikörper erkannt werden) erhöht die Brauchbarkeit bei der Behandlung gegen fünf bis zehn oder mehr Spezies. Es kann natürlich notwendig sein, auch noch einen oder mehrere monoklonale Antikörper zuzusetzen, die jeder nur für eine einzige, ausgewählte Bakterien-Spezies spezifisch sind, zum Beispiel wenn keine mit dieser Spezies kreuzreaktiven 5

AT 398 781 B monoklonalen Antikörper verfügbar sind.

Auf diese Weise können auf Grundlage der Erfindung neue Methoden zur Behandlung bakterieller Infektionen entwickelt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer 5 pharmazeutischen Zubereitung, die zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung bakterieller Infektionen verwendet werden kann, welches Verfahren durch die Züchtung von Zellinien der oben genannten Art, Gewinnung der von der Zellinie produzierten menschlichen, monoklonalen Antikörper oder eines bindenden Fragmentes davon aus dem Kulturmedium und Kombination mindestens zweier Antikörper bzw. Fragmente derselben in vorzugsweise etwa äquimoiaren Mengen gekennzeichnet ist. io Die Behandlung bakterieller Infektionen umfaßt die Anwendung einer Zubereitung, die einen monoklonalen Antikörper enthält, der mit der bakteriellen Spezies reagiert, von der vermutet wird, daß sie die Infektion verursacht hat, wobei der monoklonale Antikörper anfänglich als mit einer anderen bakteriellen Spezies reaktiv charakterisiert war.

Ein anderes Beispiel ist ein Verfahren zur Behandlung bakterieller Infektionen durch Anwendung von 15 Zubereitungen, die eine Anzähl monoklonaler Antikörper enthalten, die mit einem beträchtlichen Anteil (d.h. über 50 %, vorzugsweise 60 % bis 80 % oder mehr, im speziellen etwa 90 %) ausgewählter, klinisch wichtiger bakterieller Spezies reaktiv sind, wobei die Zähl der Antikörper mindestens um etwa zwei niedriger ist als die Zahl der bakteriellen Spezies. Falls "n" die Zähl der bakteriellen Spezies darstellt, so enthält die Zubereitung im typischen Fall etwa n-2 Antikörper, im besonderen etwa n-4 bis n-8 oder weniger 20 Antikörper zur Behandlung gegen etwa 15 bis 20 bakterielle Spezies. In Situationen, in denen eine Behandlung gegen ein breites Spektrum (z.B. 25 bis 50 oder mehr) bakterieller Spezies gewünscht wird, enthält die Zubereitung im typischen Fall n-10 bis n-20 Antikörper oder weniger.

Die Herstellung der monoklonalen Antikörper kann durchgeführt werden, indem die Expression der Nukleinsäuresequenzen unsterblich gemacht wird, die auf Antikörper oder bindende Fragmente davon, die 25 auf ein nicht-Kern Kohlenhydrat-Epitop, das auf mehreren bakteriellen Spezies vorkommt, spezifisch sind, codieren. Typischerweise werden die monoklonalen Antikörper hergestellt durch zellgesteuerte Epstein-Barr Virus (EBV)-Transformation der von menschlichen Spendern, die den entsprechenden gramnegativen Bakterien ausgesetzt sind oder waren, erhaltenen Lymphozyten. Die so erhaltenen Antikörper-sezernieren-den Zellinien sind als kontinuierlich wachsende lymphobiastoide Zellen charakterisiert, die ein diploides 30 Karyotyp aufweisen, Epstein-Barr nuklear Antigen (EBNA) positiv sind, und monoklonale Antikörper vom Isotyp IgG, IgM, IgA oder IgD sezernieren. Der zellgesteuerte Transformationsprozess selbst ist eine Erfindung, die der Genetic Systems Corporation zu eigen ist und im Detail in der US-PS 4 464 465 beschrieben wird, welche hier als Bezugsstelle angeführt wird. Die monoklonalen Antikörper können intakt oder als Fragmente, wie etwa Fv, Fab, F(ab')2, üblicherweise aber intakt, verwendet werden. 35 Alternativ können Zellinien, die Antikörper produzieren, hergestellt werden durch Zellfusion zwischen entsprechend Arzneimittel-markierten menschlichen Myelom-, Mäuse-Myelom- oder menschlichen Lympho-blastoid-Zellen mit menschlichen B-Lymphozyten, um hybride Zellinien zu erhalten.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen monoklonalen Antikörpers zur Verfügung gestellt, der spezifisch kreuzreaktiv ist mit einem nicht-Kern-40 Kohlenhydrat-Epitop, das sich auf mindestens zwei Serotypen mindestens zweier verschiedener Spezies verschiedener bakterieller Genera findet, welches Verfahren gekennzeichnet ist durch die Züchtung der Zellinien der oben genannten Art und Gewinnung der Antikörper aus dem Kulturmedium.

Die erfindungsgemäßen Zellinien können außer für die direkte Produtkion menschlicher monoklonaler Antikörper auch noch für andere Zwecke verwendet werden. Die Zellinien können mit anderen Zellen 45 fusioniert werden {wie etwa entsprechend Arzneimittel-markierten menschlichen Myelom-, Mäuse-Myelom-oder menschlichen Lymphoblastoid-Zellen), um Hybridome zu erhalten, und so den Transfer der Gene, die die menschlichen monoklonalen Antikörper codieren, zu ermöglichen. Alternativ können die Zellinien als Quelle für DNA verwendet werden, die die Immunglobuline codiert, die isoliert und mit anderen Verfahren als der Fusion zu den Zellen transferiert werden können. Zusätzlich können die Gene, die die monoklonalen so Antikörper codieren,isoliert und entsprechend den Verfahren für rekombinante DNA verwendet werden zur Produktion des spezifischen Immunglobulins in einer Anzahl von Wirtsorganismen. Insbesondere kann durch Herstellung von cDNA-Bibliotheken aus Messenger-RNA ein einzelner cDNA Klon isoliert werden, der das Immunglobulin codiert und frei von Intronen ist, und der in einen geeigneten prokaryoten oder eukaryoten Expressionsträger plantiert werden und darauf in einen Wirtsorganismus für die Produktion im 55 großen Maßstab übergeführt werden kann.

Die lymphoblastoiden oder hybriden Zellinien können nach konventionellen Verfahren mit den Antikörpern, die an die Epitope verschiedener in der überstehenden Zellflüssigkeit gefundener bakterieller Genera binden können, geklont und untersucht werden. 6

AT 398 781 B

Die erfindungsgemäßhergesteilten monoklonalen Antikörper sind besonders brauchbar als Bestandteile von pharmazeutischen Zubereitungen, die eine therapeutische oder prophylaktische Menge von mindestens einem der genannten monoklonalen Antikörper gemeinsam mit einem pharmazeutisch brauchbaren Träger enthalten. Ein pharmazeutischer Träger kann jede kompatible, nichttoxische Substanz sein, die für die 5 Abgabe der monoklonalen Antikörper an den Patienten geeignet ist. Unter anderem kann der Träger sein steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe. Pharmazeutisch verwendbar Hilfsstoffe (Puffersubstanzen, Dispergiermittel) können in der pharmazeutischen Zubereitung ebenfalls enthalten sein. Derartige Zubereitungen können einen einzigen monoklonalen Antikörper enthalten, der mit nicht-Kern Kohlenhydrat-Epitopen kreuzreaktiv ist, die zwei oder mehr bakteriellen Spezies gemeinsam sind, welche 70 zum Beispiel nosokome und neonatale (z.B. Sepsis oder Meningitis) Infektionen verursachen. Alternativ kann eine pharmazeutische Zubereitung zwei oder mehr monoklonale Antikörper enthalten und eine Mischung ("Cocktail") bilden. So ist zum Beispiel ein Cocktail, der menschliche monoklonale Antikörper enthält, die jeder gegen zwei oder mehr gramnegative für menschliche Infektionen verantwortliche bakterielle Genera protektiv ist, gegen die große Mehrzahl der üblichen klinisch isolierten Stämme wirksam. Falls 15 gewünscht können einer oder mehrere der monoklonalen Antikörper so ausgewählt werden, daß sie auch mit grampositiven Bakterien kreuzreaktiv sind, wodurch noch breitere Anwendungen des Produkts möglich werden.

Von Interesse sind prophylaktische und/oder therapeutische Zubereitungen monoklonaler Antikörper, die mit nicht-Kern Kohlenhydrat-Determinanten reagieren können, die drei oder mehr, üblicherweise 20 mindestens fünf und im speziellen mindestens zehn, und bis zu fünfzehn und mehr bakteriellen Serotypen, das sind mindestens zwei, üblicherweise mindestens drei, im speziellen mindestens fünf und üblicherweise weniger als zehn bakterielle Genera, gemeinsam sind.

Von besonderem Interesse sind Zubereitungen monoklonaler Antikörper, die mit mindestens etwa drei, vorzugsweise mindestens etwa fünf und bis zu und einschließlich aller der folgenden nosokom-infektiösen 25 Bakterien reagieren: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aero-genes/cloacae, Serratia marcescens und Streptococcus agalactiae Gruppe B. Zur Behandlung neonataler Infektionen reagiert die Zubereitung günstigerweise mit mindestens zwei, üblicherweise mindestens drei und im speziellen mindestens vier und bis zu und einschließlich aller der folgenden infektiösen bakteriellen Genera: Escherichia coli K1, Neisseria meningitidis Gruppe B, Streptococcus agalactiae Gruppe B, Hemo-30 philus influenzae Typ B, Staphyiococcus aureus und Staphylococcus epidermidis.

Jede der Zubereitungen enthält mindestens zwei,, üblicherweise mindestens drei bis fünf und im • speziellen sechs bis zehn menschliche monoklonale Antikörper, wobei mindestens ein Antikörper mit nicht-Kern Kohlenhydrat-Epitopen (z.B. der LPS-Moleküle), die zwei oder mehr bakteriellen Genera gemeinsam sind und Schutz bieten, reagiert. Typischerweise bindet der Antikörper nicht an alle Serotypen jedes 35 Bakteriums, kann aber an zwei, drei oder mehr Serotypen binden. Es ist wünschenswert, daß mindestens ein monoklonaler Antikörper vorliegt, der an einen zugänglichen nicht-Kern Kohienhydrat-Anteil mindestens zweier Genera gramnegativer Bakterien bindet, sowie mindestens ein monoklonaler Antikörper, der an den zugänglichen Kohlenhydrat-Anteil eines gramnegativ Bakteriums und eines grampositiven Bakteriums bindet. 40 Das molare Verhältnis der verschiedenen monoklonalen Antikörper-Komponenten unterscheidet sich üblichweise voneinander um nicht mehr als den Faktor 10, im speziellen um nicht mehr als den Faktor 5, und liegt üblicherweise bei einem molaren Verhältnis von etwa 1:1 - 2 zu jeder der anderen Antikörper-Komponenten.

Die menschlichen monoklonalen Antikörper können auch einzeln Anwendung finden, insbesondere 45 wenn das Pathogen identifiziert wurde oder sich auf einen engen Bereich an Pathogenen innerhalb des Bindungsspektrum des speziellen Antikörpers beschränkt.

Die erfindungsgemäßhergesteilten menschlichen monoklonalen Antikörper können auch in Kombination mit anderen monoklonalen Antikörpern eingesetzt werden (z.B. die gemeinsam übertragene Anmeldung "Monoclonal Antibodies Cross-Reactive and Protective Against P. aeruginosa Serotypes" USSN 807 394, so eingereicht lO.Dezember 1985, die hier als Bezugsstelle angeführt wird), sowie mit vorhandenen Blutplasma-Produkten· wie im Handel erhältlichen Gammaglobulin- und Immunglobulin-Produkten, die zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung bakterieller Krankheiten beim Menschen verwendet werden. Vorzugsweise wird das Plasma für Immunglobuline von menschlichen Spendern erhalten, die erhöhte Spiegel an Immunglobulinen aufweisen, welche mit verschiedenen infektiösen bakteriellen Genera reagie-55 ren. Siehe allgemein die Zusammenfassung "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer.J.Med. 76(3a), 30.März 1984, pp 1-231, die hier als Bezugsstelle angeführt wird.

Die erfindungsgemäßhergestellten monoklonalen Antikörper können als eigens angewendete Zubereitungen verwendet werden, die gemeinsam mit Antibiotika oder antimikrobiellen Mittel gegeben werden. 7

AT 398 781 B

Typischerweise können die antimikrobiellen Mittel ein Penicillin oder Cephalosporin enthalten (z.B. Carbeni-cillin, Penicillin G oder ähnliche) in Verbindung mit einem Aminoglykosid (z.B. Gentamycin, Tobramycin, etc.), aber zahlreiche zusätzliche Mittel (z.B. Cephalosporine, Sulfonamide, etc.), die dem Fachmann wohlbekannt sind, können ebenfalls angewendet werden. 5 Die erfindungsgemäßhergesteilten menschlichen monoklonalen Antikörper und ihre pharmazeutischen Zubereitungen sind besonders geeignet für orale oder parenterale Anwendung. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zubereitungen parenteral, d.h. subkutan, intramuskulär oder intravenös angewendet. Die vorliegende Erfindung bietet somit Zubereitungen zur parenteralen Anwendung, die eine Lösung der menschlichen monoklonalen Antikörper oder einen Cocktail davon in einem verwendbaren Träger, vorzugs-io weise einem wässrigen Träger, gelöst enthalten. Es kann eine Anzahl von wässrigen Trägern verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4 % Kochsalzlösung, 0,3 % Glycin und ähnliche. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von Teilchen. Diese Zubereitungen können mittels konventioneller wohlbekannter Sterilisationsverfahren sterilisiert werden. Die Zubereitungen können pharmazeutisch verwendbare Hilfssubstanzen enthalten, falls sie zu Angleichung an physiologische Verhältnisse notwendig 75 sind, wie etwa Mittel zur Einstellung des pH-Werts und Puffersubstanzen, Mittel zur Einstellung der Toxizität und ähnliche, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlaktat, etc. Die Konzentration an Antikörper in diesen Rezepturen kann in weiten Bereichen variieren, d.h. von weniger als 0,5 %, üblicherweise bei oder mindestens etwa 1 %, bis zu 15 oder 20 Gew.-%, und wird hauptsächlich auf Grund des Flüssigkeitsvolumens, der Viskosität, etc. in Übereinstimmung mit der speziellen gewählten 20 Anwendungsart ausgewähit.

Eine typische pharmazeutische Zubereitung zur intramuskulären Injektion kann somit 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50 mg monoklonalen Antikörper enthalten. Eine typische Zubereitung zur intravenösen Infusion kann 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg monoklonaler Antikörper enthalten. Die eigentlichen Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Zubereitungen sind dem Fachmann 25 offensichtlich oder wohlbekannt und werden im Detail beschrieben zum Beispiel in Remington's Pharma-ceutical Science, 15.ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), das hier als Bezugsstelle angeführt wird.

Die erfindungsgemäßhergesteilten monoklonalen Antikörper können zur Aufbewahrung lyophilisiert und vor der Anwendung in einem geeigneten Träger wieder zubereitet werden. Dieses Verfahren erwies sich bei 30 konventionelle Immunglobulinen als wirksam und es können bekannte Verfahren zur Lyophilisierung und Wiederzubereitung angewendet werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß die Lyophilisierung und Wiederzubereitung zu einem Verlust an Antikörper-Aktivität in unterschiedlichem Ausmaß führen kann, und daß zur Kompensation die Gebrauchswerte wieder eingestellt werden müssen (bei konventionellen Immunglobulinen haben z.B. die IgM-Antikörper im allgemeinen einen größeren Aktivitätsverlust als die IgG-35 Antikörper).

Die Zubereitungen, die die vorliegenden menschlichen monoklonalen Antikörper oder einen Cocktail davon enthalten, können zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung bakterieller Infektionen angewendet werden. Bei der therapeutischen Anwendung werden die Zubereitungen einem bereits infizierten Patienten in einer Menge verabreicht, die zur Heilung oder zumindest zum teilweisen Zumstillstandbrin-40 gen der Infektion und ihrer Komplikationen ausreicht. Eine dafür ausreichende Menge wird als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Die für diese Anwendung wirksamen Mengen hängen von der Schwere der Infektion und dem allgemeinen Zustand des eigenen Immunsystems des Patienten ab, betragen jedoch im allgemeinen zwischen etwa 1 bis etwa 200 mg Antikörper je Kilogramm Körpergewicht, wobei Dosierungen von 5 bis 25 mg je Kilogramm üblicherweise verwendet werden. Es ist zu bedenken, daß die erwähnten 45 Substanzen im allgemeinen bei ernsthaften Erkrankungen angewendet werden können, d.h. lebensbedrohlichen oder potentiell lebensbedrohlichen Situationen, insbesondere Bakteriämie und Endotoxämie. In derartigen Fällen ist es, in Hinblick auf die Abwesenheit körperfremder Substanzen und die Abwesenheit von Fremdsubstanz-Abstoßungsreaktionen, die von den vorliegenden menschlichen monoklonalen Antikörpern erzielt wird, möglich und eventuell vom behandelnden Arzt gewünscht, beträchtliche Überschüsse dieser so Antikörper einzusetzen.

Bei prophylaktischen Anwendungen werden Zubereitungen, welche den erfindungsgemäßhergesteilten Antikörper oder einen Cocktail daraus enthalten, einem Patienten verabreicht, der von den entsprechenden Bakterien noch nicht infiziert wurde, um seine Widerstandfähigkeit gegen eine derartige Infektion zu stärken. Eine derartige Menge wird als "prophylaktisch wirksame Dosis" definiert. Auch bei dieser 55 Anwendung hängen die genauen Mengen von dem Gesundheitszustand des Patienten und dem allgemeinen Zustand seiner Immunität ab, liegen jedoch im allgemeinen zwischen 0,1 und 25 mg pro Kilogramm, im speziellen zwischen 0,5 und 2,5 mg pro Kilogramm. 8

ΑΤ 398 781 B

Die Zubereitungen können in einzelnen oder geteilten Dosen verabreicht werden, wobei Dosierung und Dosierungsschema vom behandelnden Arzt gewählt werden, in jedem Fall sollten die pharmazeutischen Zubereitungen eine Menge an Antikörper(n) zuführen, die ausreichend ist, um den Patienten wirksam zu behandeln. 5 Die erfindungsgemäßhergestellten monoklonalen Antikörper können auch in vitro eine weite Zahl von Anwendungen finden. So können zum Beispiel die monoklonalen Antikörper zur Typenbestimmung von Bakterien, zu Isolierung bestimmter Bakterienstämme oder ihrer Fragmente zur Herstellung von Impfstoffen und ähnlichem verwendet werden. Für diagnostische Zwecke können die monoklonalen Antikörper entweder markiert oder unmarkiert sein. io Typischerweise umfassen diagnostische Bestimmungen die Erfassung der Bildung eines Komplexes durch Bindung des monoklonalen Antikörpers an die LPS des Keims. Unmarkiert finden die Antikörper Verwendung bei Agglutinierungs-Bestimmungen. Außerdem können unmarkierte Antikörper in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (zweiten Antikörpern) verwendet werden, die mit den monoklonalen Antikörpern reaktiv sind, wie etwa Antikörper, die auf menschliches Immunglobulin spezifisch sind. Alterna-75 tiv können die monoklonalen Antikörper direkt markiert werden. Es kann eine Vielzahl von Markern verwendet werden, wie etwa Radionuklide, Fluoreszenzstoffe, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Cofaktoren, Liganden (insbesondere Haptene), etc. Es sind zahlreiche Arten von Immunoassays verfügbar und beispielsweise werden einige dieser Assays beschrieben in US-PS 3 817 827; 3 850 752; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; und 4 098 876, die alle hier als Bezugsstellen angeführt werden. 20 Die erfindungsgemäßhergestellten monoklonalen Antikörper werden im allgemeinen in Enzym-Immuno-assays verwendet, wobei diese Antikörper oder zweite Antikörper einer anderen Spezies, mit einem Enzym konjugiert werden. Wenn eine Probe, wie etwa menschliches Blut· oder ein Lysat davon, die ein oder mehrere Bakterien eines bestimmten Genus oder Serotyps enthält, mit den Antikörpern vereint wird, so entsteht zwischen den Antikörpern und den Molekülen, welche die ausgewählten Epitope aufweisen, eine 25 Bindung. Diese Zellen können sodann von den nicht gebundenen Reagentienten abgetrennt und ein zweiter Antikörper (der mit einem Enzym markiert ist) zugesetzt werden. Hierauf wird die Menge des Antikörper-Enzym-Konjugats, das spezifisch an die Zellen gebunden ist, bestimmt. Andere konventionelle Verfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind, können ebenfalls angewendet werden.

Ebenso können zur Verwendung mit den erfindungsgemäßhergestellten Antikörpern vollständige Ausrü-30 stungssätze zur Bestimmung von bakteriellen Infektionen oder der Anwesenheit eines bestimmten Antigens hergestellt werden. So kann etwa eine Zubereitung monoklonaler Antikörper entweder allein oder gemeinsam mit weiteren Antikörpern, die auf andere gramnegative Bakterien spezifisch sind, üblicherweise in lyophilisierter Form in einem Behälter angeboten werden. Die Antikörper, die mit einem Marker konjugiert oder unkonjugiert vorliegen können, sind in dem Ausrüstungssatz enthalten gemeinsam mit Puffern wie 35 Tris, Phosphat, Carbonat, etc., Stabilisatoren, Biociden, inerten Proteinen z.B. Hinderserumalbumin, oder ähnlichem. Im allgemeinen liegen diese Substanzen in einer Menge von weniger als etwa 5 Gew.-% bezogen auf die Menge wirksamer Antikörper vor, und üblicherweise in einer Gesamtmenge von mindestens etwa 0,001 Gew.-%, ebenfalls auf die Antikörper-Konzentration bezogen. Es wird häufig wünschenswert sein, ein inertes Verdünnungsmittel oder Exzipiens beizugeben, um die Wirkstoffe zu verdünnen, 40 wobei das Exzipiens in einer Menge von etwa 1 bis 99 Gew.-% der gesamten Zubereitung vorliegen kann. Wird ein zweiter Antikörper, der mit dem monoklonalen Antikörper binden kann, verwendet, so liegt er üblicherweise in einem zweiten Behältnis vor. Typischerweise ist dieser zweite Antikörper mit einem Marker konjugiert und seine Rezeptur ist analog der oben für die Antikörper beschriebenen Rezeptur.

Die folgenden experimentellen Ergebnisse und Informationen sollen zur näheren Erläuterung dienen 45 und nicht einschränkend gedacht sein.

BEISPIEL I

Dieses Beispiel zeigt Verfahren zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper, die inter-Genera so Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Genera Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Serratia marcescens (S. marcescens) und Enterobacter aerogenes (E. aerogenes) besitzen. Außerdem zeigt dieses Beispiel die protektive Wirksamkeit in vivo dieser Antikörper gegen eine potentiell tödliche Infektion homologer (kreuzreaktiver) E. coli und E. aerogenes Serotypen. 55 A. Darstellung geeigneter menschlicher Zellen

Geeignete menschliche B-Zellen (Lymphozyten) wurden erhalten aus dem peripheren Blut eines Patienten, von dem bekannt war, daß er zystische Fibrose gehabt hatte. Aus dem peripheren Blut wurden 9

AT 398 781 B mittels üblicher Zentrifugier-Verfahren auf Ficoll-Paque mononukleare Zellen abgetrennt (Boyum A., "Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human Blood", Scand.J. Clin.Lab.Invest. 21, Suppl.97, 77-89 (1968)), zweimal mit Calcium-Magnesium-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und hierauf in 1 ml 90 % fetalem Rinderserum (FBS) und 10 % Dimethylsufoxid suspendiert und bei -196eC in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Zur Transformierung der mononuklearen Zellen wurde eine Ampulle, die 5.107 Zellen enthielt, bei 37 ’C rasch aufgetaut. Die Zellsuspension wurde zu 10 ml Iscove-Medium zugefügt, das 15 % FBS enthielt, und bei Raumtemperatur 10 Minuten bei 250 g zentrifugiert. Mittels eines modifizierten E-Rosetten-Verfahrens wurden die mononuklearen Zellen von T-Zellen (Lymphozyten) befreit. Kurze Beschreibung: Die Zellen wurden wieder bis auf eine Konzentration von 1.107 Zellen/ml in PBS mit 20 % FBS bei 4°C suspendiert. Ein ml dieser Suspension wurde in ein Röhrchen mit Rundboden aus Polystyrol von 17 x 100 mm gegeben und 1.109 mit 2-Aminoäthylisothiouroniumbromid (AET) behandelte rote Blutkörperchen vom Schaf in 10 % v/v Lösung in Iscove-Medium zugefügt (Madsen M. und Johnson H.E., "A Methodological Study of E-rosette Formation Usind AET Treated Sheep Red Blood Cells", J.lmmun. Methods 27, 61-74 (1979)). Die Suspension wurde 5-10 Minuten bei 4'C kräftig gemischt, und die E-Rosetten-Zellen wurden durch 8 Minuten Zentrifugation bei 2500 g bei 4*C durch Ficoll-Paque abgetrennt. E-Rosetten-negative periphere mononukieare Blutzellen (E-PMBC), die sich an der Grenzfläche ansammelten, wurden einmal mit Iscove-Medium gewaschen und in diesem, das 15 % g/v FBS (g/ml), L-Glutamin (2 mMol/l), Natriumpyruvat (1 mMol/l), Penicillin (100 ΙΕ/ml), Streptomycin (100 ug/ml) Hypoxanthin (1.10-4· m) und Thymidin (1,6.10-5 m) enthielt, suspendiert. Dieses Medium wird im folgenden als HAT-Medium bezeichnet. B. Zellgesteuerte Transformation peripherer mononuklearer Blutzellen

Die zellgesteuerte Transformation der E-PMBC wurde erzielt durch gemeinsame Kultivierung der E-PMBC mit einer transformierenden Zellinie. Die transformierende Zellinie war eine EBNA-positive menschliche lymphoblastoide Zellinie, die aus der Äthylmethansulfonat-Mutagenese der lymphoblastoiden Zellinie GM 1500 erhalten worden war. Die Selektionierung in Anwesenheit von 30 ug/ml 6-Thioguanin machte die Zellen defizient an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase und damit HAT-sensitiv. Die Zellinie wird als 1A2-Zellinie bezeichnet und wurde am 29.März 1982 in der American Type Culture Collection (ATCC) unter ATCC Nr. CRL 8119 hinterlegt. 1A2-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in HAT-Medium suspendiert und mit den E-PMBC in einem Verhältnis von 30 1A2-Zellen pro E-PMBC vereinigt. Die Zellmischung wurde in 10 Rundboden-Mikrotiterplatten mit je 96 Mulden ("Wells") in einer Konzentration von 62 000 Zellen je Mulde und einem Volumen von 200 ul/Mulde aufgeteilt und die Kultur bei 37 *C in einer feuchten Atmosphäre, die 6 % CO2 enthielt, inkubiert. Die Kulturen wurden über fünf Tage nach der Transformation ernährt durch Ersetzen der Hälfte der überstehenden Flüssigkeit durch frisches HAT-Medium. Die Platten wurden jeden zweiten Tag auf einem umgekehrten Mikroskop auf Zeichen eines Zellwachstums untersucht. Zehn Tage nach Aufteilung der Zellmischung auf die Platten und nach dem Absterben der 1A2-Zellen auf Grund der HAT-Selektionierung, wurden die Kulturen mit im neuen Medium ernährt, das identisch war mit dem HAT-Medium, außer daß ihm die Aminopterin-Komponente fehlte. Fünfzehn Tage nach dem Aufteilen auf die Platten zeigte sich, daß 100 % der Mulden sich vermehrende Zellen enthielten, und daß in den meisten Mulden die Zellen genügende Dichte aufwiesen um sie entfernen und die überstehende Flüssigkeit auf anti-E. coli oder anti-S. marcescens Antikörper prüfen zu können. C. Bestimmung von Zellen, die spezifische Antikörper sezernieren

Die überstehenden Flüssigkeiten wurden untersucht auf die Anwesenheit von anti-E. coli oder anti-S. marcescens Antikörpern unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunosorbens-Assay-Verfahrens (ELISA) (Engvall E., "Quantitative Enzyme Immunoassay (ELISA) in Microbiology", Med.Biol. 55, 193-200 (1977)). Die Antigen-Platten bestanden aus einer Reihe von Immunion 2 Flachboden-Mikrotiterplatten mit je 96 Mulden, wobei jede Mulde eine Mischung von entweder lebensfähigen E. coli oder S. marcescens-Serotypen enthielt, die auf der Oberfläche der Mulden mit Poly-L-Lysin (PLL) fixiert waren. Kurze Beschreibung: 50 ul PLL (1 ug/ml) in PBS wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in jede Mulde gegeben. Die Platten wurden drei Mal mit PBS gewaschen, und entweder PBS oder 50 ul einer gemischten bakteriellen Suspension von O.D.660 = 0,2 zu jeder Mulde zugefügt. Die Platten wurden 60 Minuten bei 37 °C inkubiert und drei Mal mit Kochsalzlösung/0,02 % Tween 20 (NaCI/T) gewaschen, um nicht fixierte Bakterien zu entfernen. Die verschiedenen in diesem Versuch verwendeten Antigenplatten waren: 1) eine Mischung von E. coli Serotypen 01 (ATCC Nr. 23499) und 04 (ATCC Nr. 12791); 2) eine Mischung von S. 10

AT 398 781 B marcescens Serotypen 07, 015, 016 und 018 (alle Referenzstämme wurden erhalten vom Communicable Disease Center (CDC) Atlanta, GA); und 3) eine Mikrotiterplatte ohne Bakterien. Für das ELISA-Verfahren wurden die Probenmuiden zunächst mit 200 ul einer Mischung von 5 % g/v Trockenmagermilch, 0,0001 % Foam A und 0,01 % g/v Thiomersal in 500 ml PBS blockiert, um nicht-5 spezifische Proteinbindung zu verhindern. Nach 1 Stunde Inkubation bei RT wurden die Platten drei Mal mit 200 ul/Mulde/Waschung NaCI/T gewaschen. Zu jeder Mulde wurden 50 ul einer Mischung von 0,1 % Tween 20 und 0,2 % Rinderserumalbumin in PBS (PTB) zugefügt. Die überstehende Flüssigkeit der Mulden der Kulturplatte wurde in entsprechende Mulden der Antigen- und Kontroll-Platten repliziert (50 Ul/Mulde) und die Platten 30 Minuten bei RT inkubiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, die io Platten fünf Mal mit NaCI/T gewaschen und 50 ul biotinyliertes anti-humanes Ziegen-Immunglobulin (lg) (TAGO #9303040 verdünnt 1:250 in PTB) zu jeder Mulde zugefügt. Nach 30 Minuten Inkubation bei RT wurde das biotinylierte Reagens entfernt, die Platten fünf Mal mit NaCI/T gewaschen und 50 ul präformier-ter Avidin:biotinylierte Meerettich-Peroxidase Komplex (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories) zu jeder Mulde zugegeben. Nach 30 Minuten bei RT wurde das Vectastain ABC Reagens entfernt, die Mulden fünf 15 Mal mit NaCI/T gewaschen und 100 ul Substrat (0,8 mg/ml o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid in 100 mM Zitratpuffer, pH 5,0 plus 0,03 % H2O2 in entionisiertem Wasser, gemischt zu gleichen Volumsteilen unmittelbar vor der Verwendung) zu jeder Mulde zugefügt. Nach 30 Minuten Inkubation im Dunkeln wurden jeder Mulde 50 ul 3n H2SO4 zugefügt, um die Reaktion abzustoppen. Die überstehende Flüssigkeit jener Kulturen, die Antikörper enthielten, die auf die mit Bakterien beschichteten Platten reaktiv waren, wurden 20 bestimmt durch Messung der Extinktion bei 490 nm auf einem Dynatech MR 580 micro-ELISA Gerät.

Die überstehenden Kulturflüssigkeiten von sechs Transformationen wurden nach der obigen Methode analysiert, und es wurde eine Mulde bestimmt (7D7), der auf den E. coli und S. marcescens Serotyp-Platten Aktivität zeigte, nicht jedoch auf den Kontrollplatten. In weiteren ELISA-Tests mit einzelnen E. coli Serotypen wurde bestimmt, daß diese Mulde Antikörper enthielt, die mit mindestens den E. coli Serotypen 25 08 (ATCC Nr. 23504) und 075 (ATCC Nr. 12798) reagierten, nicht jedoch mit 04, 06:K2, 08:K8, 09:K9 oder 022:K13 (ATCC Nr. 12791, 19138, 23501, 23505 und 23517). Außerdem enthielt diese Mulde Antikörper, die mit den S. marcescens Serotypen 012, 013 und 015, nicht jedoch mit irgendeinem anderen der zwanzig bekannten S. marcescens LPS-Serotypen reagierten. 30 D. Klonen von Zellen, die spezifische Antikörper produzieren

Die Zeilen aus Mulde 7D7 wurden mehreren (vier) Klonungszyklen unterworfen, bis alle überstehenden Klonierungsflüssigkeiten, die mit dem obigen ELISA-Verfahren geprüft wurden, eine positive Reaktion auf die E. coli Serotypen 08 und 075 und auf die S. marcescens Serotypen 012, 013 und 015 ergaben. In 35 keinem Fall zeigte sich im Reaktivitätsmuster der überstehenden Klonierungsflüssigkeit eine Segregation, woraus geschlossen werden kann, daß die überstehende Kulturflüssigkeit aus Mulde 7D7 echte inter-Genera Kreuzreaktivität gegenüber den erwähnten E. coli und S. marcescens Serotypen aufwies und nicht mehrere Zellinien (mit einzelnen individuellen Serotyp-Reaktivitäten) enthielt. Die Zellen wurden geklont durch Begrenzung der Verdünnung in Rundboden-Platten von 96 Mulden in Abwesenheit von Nährzellen. 40 Das Medium bestand aus Iscove-Medium, das 15 % v/v FBS, L-Glutamin (2 mMol/l), Natriumpyruvat (1 mMol/l), Penicillin (100 ΙΕ/ml) und Streptomycin (100 u.g/ml) enthielt. Die Kulturen wurden alle drei Tage durch Ersetzen der Hälfte der überstehenden Flüssigkeit durch frisches Medium ernährt. Die Dichte der lymphoblastoiden Zellen war im allgemeinen 2 und 3 Wochen nach dem Aufteilen auf die Platten hoch genug zur Analyse der Spezifität gegen E coli und S. marcescens Serotypen. 45 Es wurde somit in diesem Versuch eine geklonte transformierte menschliche Zellinie erzielt, die kontinuierlich (unsterblich) ist und einen menschlichen monoklonalen Antikörper gegen eine Determinante auf der Oberfläche der erwähnten E. coli und S. marcescens Serotypen sezerniert.

Vor der Einreichung des vorliegenden Patentsansuchens wurde die kontinuierliche transformierte menschliche Zellinie, als 7D7 identifiziert, bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter 50 ATCC Nr. CRL 9009 deponiert. E. Weitere Charakterisierung der inter-Genera Kreuzreaktivität

Die Antikörper der geklonten Zellinie 7D7 wurden auf weitere inter-Genera Kreuzreaktivität mittels einer 55 Modifizierung des Standard Immunoblot-Verfahrens untersucht. Insbesondere wurde die Kreuzreaktivität gegen die Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes und E. cloacae untersucht mittels punktförmigem Aufbringen der Bakterien auf eine gegitterte Scheibe aus Nitrozellulosepapier, Reaktion der die Bakterien enthaltenden Scheibe mit dem erwähnten Antikörper und Entwicklung der Antikörper-Reaktionen mit einem 11

ÄT 398 781 B alkalische- Phosphatase/Nitroblau-Tetrazolium - Enzymsystem. Kurze Beschreibung: 1,0 ul der Bakterien (O.E.660 = 0,4) wurden je Abteilung punktförmig auf eine Nitrozelluiosepapierscheibe (Schleicher und Schüll, 37 mm Nitrozellulosescheibe, gegittert, 0,45 um) aufgebracht. Jede Scheibe kann ohne Schwierigkeiten 60 verschiedene Bakterienproben aufnehmen. Die Scheiben wurden sodann an der Luft getrocknet, 5 in 25 % v/v Isopropanol 30 Minuten lang fixiert und 10 Minuten in dem Trockenmagermilch-Reagens wie für das ELISA Verfahren beschrieben blockiert. Die blockierten Scheiben wurden drei Mal je 5 Minuten in PBS/Tween 20 gewaschen und auf die Deckel von 35 x 10 mm Gewebskulturschalen überführt. Die den Antikörper enthaltende überstehende Flüssigkeit (1,0 ml) wurde zu dem Deckel zugefügt und bei RT 60 Minuten inkubiert. Nach drei Waschungen von 5 Minuten mit PBS/Tween 20 wurden 1 - 2 ml 1:1000 (PBS) 70 verdünntes mit alkalischer Phosphatase konjugiertes anti-humanes Ziegen-Immunglobulin (TAGO, Burlinga-me, CA) 60 Minuten lang bei RT zugefügt. Die Scheiben wurden wie oben gewaschen und in 1-2 ml frischem wie folgt hergestelltem Substrat untergetaucht: 16,5 mg Bromchlorindolylphosphat und 8,5 mg Nitroblau-Tetrazolium wurden in 50 ml alkalischem Phosphatasepuffer (0,1 m Tris-HCI, pH 9,5 mit 0,1 m NaCI und 5 mM MgClz) gelöst, die Losung wurde im Dunklen aufbewahrt und unmittelbar vor Gebrauch 75 filtriert. Nach entsprechender Farbentwicklung (10-15 Minuten) wurde die Reaktion durch Abspülen der Scheibe in mehrmals erneuertem destilliertem Wasser abgestoppt. Die entwickelten Scheiben können nach dem Trocknen aufbewahrt werden.

Die Scheiben enthielten 50 K. pneumoniae Referenzstämme vom Kapseltyp, erhalten von Dr.George Kenney, University of Washington, Department of Pathobiology, Seattle, WA und der American Type 20 Culture Collection, 4 E. aerogenes isoliert aus klinischen Blutproben, und 6 E. cloacae isoliert aus klinischen Blutproben (die aus Blut isolierten Proben erhalten von Harborview Hospital, Seattle, WA). Die isolierten Proben von Enterobacter wurden typisiert (nach Spezies) unter Verwendung des API 20E Systems mit 23 standardisierten biochemischen Tests (API Analytab Products, Plainview, NY). Dieses Verfahren identifiziert Genus und Spezies gramnegativer Bakterien, aber nicht den Serotyp. Deshalb wurden die Enterobacter im 25 Gegensatz zu den E. coli, S. marcescens und K. pneumoniae nicht nach Serotyp sondern nur nach Genus und Spezies identifiziert.

Aus diesen Versuchen ergab sich, daß der 7D7-Antikörper weitere inter-Genera Kreuzreaktivität aufweist. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Serotypen: K. pneumoniae E. coli S. marcescens E. aerogenes K14, 57, 60 08,75 012,13,15 klinisch isolierte Proben

Es zeigte sich somit, daß der menschliche monoklonale Antikörper 7D7 eine inter-Genera Kreuzreaktivität aufweist gegen Bakterien, die den Spezies E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes, nicht jedoch E. cloacae angehören. F. Charakterisierung der monoklonalen Antikörper

Das Ergebnis, daß der monoklonale Antikörper mit verschiedenen bakteriellen Genera kreuzreaktiv war, ließ vermuten, daß der Antikörper gegen ein gemeinsames Protein oder Kohlenhydrat gerichtet ist. Es konnte gezeigt werden, daß diese beiden Molekülarten für die Kreuzreaktionen innerhalb eines Genus ("intra-Genus") verantwortlich sind (Mutharia L. und Hancock R.E.W., "Characterization of Two Surface-Localized Antigenic Sites on Porin Protein F of Pseudomonas aeruginosa", Canadian J.of Microbiol. 31, 381-386 (1985) und Orskov F. und Orskov I., "Serotyping of Escherichia coli", in Methods in Microbiology, Vol.14, Bergan T., Ed., Academic Press, Orlando, FL, 43-112 (1984)).

Die biochemische Charakterisierung der von dem 7D7-Antikörper erkannten Molekülarten wurde durch Immunoblot-Analyse durchgeführt. Kurze Beschreibung: Gewaschene Bakterien von einer 20 ml über Nacht gezogener Nährlösungs-Kultur (für E. coli, S. marcescens und E. aerogenes Serotypen) oder von über Nacht gewachsenen Platten (K. pneumoniae) wurden mit 1,0 ml einer Lösung extrahiert, die 64 ml 50 mM Tris, pH 7,6, 30 ml Glycerin und 0,3 g Deoxycholat (Natriumsalz), 0,14 ml Beta-Mercaptoäthanol und 6 ml entionisiertes Wasser enthielt (Schechter I. und Block K„ "Solubilization and Purification of trans-Formesyl Pyrophosphate-Squalene Synthetase", J.Biol.Chem. 246, 7690-7696 (1971)). Nach 18 Stunden Inkubieren bei 4°C wurde die Suspension 10 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und das Protein unter Verwendung des Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) quantifiziert. Von jedem Bakterium wurden zwischen 100 und 1000 ng (je nach bakteriellem Extrakt) einer Natrium-Dodecylsulfat (SDS) - Polyacrylamid - Gelelektrophorese unterworfen (Kusecek B. et al., "Lipopolysaccharides, Capsule and fimbriae as Virulence Factors Among 01, 07, 016, 018 or 075 and K1, 12

AT 398 781 B K5 or K100 Escherichia coli'*, Infection an Immunity 43, 368-379 (1984)). Die getrennten Molekülarten wurden von dem Gel auf eine Nitrozellulose-Membran (NCM) übertragen, wie anderswo beschrieben (Towbin H. et al, "Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications", Proc.Natl.Acad.Sci., 76, 4350-4354 (1979)), und der Fleck auf der NCM 1 Stunde lang in PBS-Tween blockiert (Batteiger B. et al., "The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Proteins transferred to Nitrocellulose Membranes", J.lmmunol.Meth. 55, 297-307 (1982)). Der Fleck wurde 1 Stunde bei RT in 10 ml verbrauchter überstehender Kulturflüssigkeit der 7D7-Linie inkubiert. Nach viermaligem 5 Minuten Abspülen in PBS-Tween wurde der Fleck in anti-humanem Ziegen-Ig, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, inkubiert und entwickelt, wie hier für die Bakterien-Nitrozellulosescheiben-Bestimmung beschrieben. Es wurden auf allen Spuren, die Deoxycholat-Extrakte der hier beschriebenen Bakterien enthielten, positive Reaktionen beobachtet. Auf diesen Spuren schien der 7D7-Antikörper eine Reihe von molekularen Einheiten in regelmäßigem Abstand zu erkennen, wodurch sich ein leiterartiges Muster auf dem Immunoblot ergab. Dieses Profil stand in völliger Übereinstimmung mit dem, das bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse von LPS in Anwesenheit von SDS erhalten wird, bei welchem gezeigt werden konnte, daß das von den Banden gezeigte heterogene Größenprofil durch eine Population von LPS-Molekülen verursacht wird, die sich durch Gewichtsinkremente unterscheiden, welche der Anzahl der je Molekül anwensenden O-antigenen Oligosaccharid-Seitenketteneinheiten äquivalent ist (Pavla E.T. und Makela P.H. "Lipopolysaccharide Heterogeneity in Salmonella typhimurium Analyzed by Sodium Dodecyl Sulfate/Polyacrylamide Gel Electrophoresis" Eur.J.Biochem. 107, 137-143 (1980) und Goldman R.C. und Leive L., "Heterogeneity of Antigenic-Side-Chain Length in Lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2", Eur.J.Biochem. 107,143-154 (1980)). Diese Daten geben einen Hinweis darauf, daß der monoklonale Antikörper 7D7 gegen eine antigene Determinante gerichtet ist, die den LPS-Molekülen, die auf einigen Serotypen von E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae und E. aerogenes gefunden werden, gemeinsam ist.

Zur weiteren Definierung der molekularen Natur des Antigens wurden die Deoxycholat-Extrakte vor ihrer Elektrophorese mit dem proteolytischen Enzym Proteinase K behandelt (Eberling W. et al., "Proteinase K from Tritirachium album Limber" Eur. J.Biochem. 47, 91-97 (1974)). Zur Herstellung der Probe wurden 10 ul Proteinase K zu 50 ug des Proteins der Probe zugefügt und die Mischung 60 Minuten auf 65 * C erhitzt. Die Proben wurden wie hier beschrieben der Elektrophorese und dem Immunoblot-Test unterworfen. Die beobachteten Immunoblot-Muster nach der Behandlung mit Proteinase K waren identisch mit den ohne Behandlung beobachteten und geben daher einen Hinweis darauf, daß das mit dem 7D7-Antikörper reagierende Antigen keine Proteinnatur aufweist.

Um spezifisch nachzuweisen, ob 7D7 mit einem Kohlenhydrat-Epitop reagiert, wurde die elektrotransfe-riert'e Deoxychoiat-Probe einer schonenden Perjodat-Oxidation unterworfen, bevor das Nitrozellulosepapier mit dem Antikörper zur Reaktion gebracht wurde. Von dieser Reaktion war gezeigt worden, daß sie Kohlenhydrat-Determinanten und somit ihre Reaktivität mit einem Antikörper zerstört, ohne die Proteinoder Lipid-Epitope zu verändern (Woodward M.P. et al. "Detection of Monoclonal Antibodies Specific for Carbohydrate Epitopes Using Periodate Oxidation", J. of Immunol.Methods 78, 143-153 (1985)). Kurze Beschreibung: Nachdem das, die elektrophoretisierte Probe enthaltende Nitrozellulosepapier mit PBS-Tween wie hier beschrieben blockiert wurde, wurde das Papier mit 50 mM Essigsäure-Natriumacetat Puffer pH 4,5 abgespült. Das Nitrozellulosepapier wurde in 50 mM Perjodsäure, gelöst in dem Essigsäurepuffer, 60 Minuten im Dunkeln bei RT inkubiert. Das behandelte Papier wurde drei Mal in PBS-Tween gespült und wie hier beschrieben mit dem Antikörper zur Reaktion gebracht. Die in dieser Weise behandelten Deoxycholat-Extrakte reagierten nicht mehr mit dem monoklonalen 7D7-Antikörper. Diese Daten geben einen deutlichen Hinweis darauf, daß das von diesem Antikörper erkannte Epitop ein Kohlenhydrat ist, das sich auf dem LPS-Molekül der hier beschriebenen Bakterien befindet.

Der isotyp des monoklonalen 7D7-Antikörpers wurde bestimmt mit einem ELISA-Verfahren ähnlich dem oben beschriebenen Test auf Spezifizität, außer daß biotinylisiertes anti-humanes Ziegen IgG (Gammaketten spezifisch, TAGO) oder biotinylisiertes anti-humanes Ziegen IgM (Myketten spezifisch, TAGO) als Reagens im zweiten Schritt anstatt des breiter reaktiven biotinylisierten anti-humanen Ziegen lg verwendet wurde. Beide Reagentien wurden in einer Verdünnung 1:500 verwendet und die Antigen-Platte enthielt Sammelproben (Pools) von PLL-immobiliserten E. coli 08 und 075 Stämmen. Positive Reaktionen des monoklonalen 7D7-Antikörpers mit den E. coli Stämmen zeigte sich nur mit dem Anti-lgM Reagens, woraus sich ein IgM-lsotyp des monoklonalen Antikörpers ergibt. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß bei mehrfacher Wiederholung des oben angeführten Verfahrens und darauffolgender Bestimmung der Isotypen der so erhaltenen inter-Genera kreuzreaktiven monoklonalen Antikörper zusätzliche, z.B. IgM und IgG Isotypen gefunden würden (Frosch M. et al., "NZB Mouse System For Production of Monoclonal Antibodies to Week Bacterial Antigens: Isolation of an IgG Antibody to the Polysaccharide Capsules of Escherichia coli 13

AT 398 781 B K1 and Grop Meningococci", Proc.Natl.Acad.Sci. 82,1194-1198 (1985)). G. Wirksamkeit in vitro s Die funktionelle Wirksamkeit in vitro des monoklonalen Antikörpers 7D7 wurde untersucht in einer in vitro Opsono-Phagozytose-Bestimmung, die die bakteriozide Wirksamkeit des Antikörpers in Anwesenheit und in Abwesenheit humaner Neutrophiler und humanen Komplements verglich.

Die Bakterien wurden hergestellt entweder durch Impfen von 10 ml tryptischer Soja-Nährlösung (TSB) mit 50 ul einer über Nacht gewachsenen Nährlösungskultur (für E coli, S. marcescens und E aerogenes) io oder, für K. pneumoniae, durch Aufstreifen auf eine Petrischale mit Worfel-Ferguson-Agar. Für die Nährlösungskulturen wurden die Röhrchen bei 37 “C aüf einer Schütteimaschine 3 Stunden lang inkubiert und darnach 1,5 ml der Kultur 1 Minute bei 10 000 g zentrifugiert, das verbrauchte Kulturmedium verworfen und der Feststoffkuchen in 3,5 ml bilanzierter Hank-Salzlösung, die 0,1 % Gelatine und 5 mM HEPES (HBSS/Gel) enthielt, suspendiert. Für die auf der Agar-Platte gezogenen Bakterien wurden die Kolonien von rs der Platte in steriles HBSS/Gel abgekratzt. Die bakteriellen Konzentrationen für die unter beiden Bedingungen gewachsenen Bakterien wurden durch Messung der O.D.660 und entsprechende Verdünnung (ungefähr 1:50 000) auf 3.103 Bakterien/ml gebracht. Humane Neutrophile wurden isoliert gemäß van Furth und van Zwei ("In Vitro Determination of Phagocytosis and Intracellulär Killing by Poiymorphonuclear and Mononu-clear Phagocytes", in: Handbook of Experimental Immunology, Vol.2, D.M.Weir, Ed., 2.ed., Blackwell 20 Scientific Publications, Oxford, 36.1-36.24 (1973)), mit verschiedenen Modifikationen. Eine Leukozytenschicht von 10 ml heparinisiertem Blut wurde unterschichtet mit Ficoll-Pacque und zentrifugiert. Der Kuchen von roten Blutkörperchen (RBC) wurde einmal mit RPMI 1640 Medium gewaschen und in einem gleichen Volumen PBS von 37 °C wieder suspendiert. 3 ml dieser Suspension wurden zu 6 ml 2 %igem Dextran (in 37 ’C PBS) zugefügt und die Bestandteile schonend aber gründlich durch Umdrehen des Röhrchens 25 durchgemischt. Nach 20 Minuten Inkubation bei 37’C zur Sedimentierung der RBC wurde die überstehende Flüssigkeit (die die Neutrophilen enthielt) entfernt, zweimal mit 4°C PBS und einmal mit HBSS/Gel gewaschen und in diesem zu 5.107 Neutrophile/ml suspendiert. Als Quelle für das mit E coli und S. marcescens verwendete Komplement wurde menschliches Serum zweimal an lebenden Bakterien-Pools entsprechend den in dem Versuch verwendeten Keimen adsorbiert (Bjornson A.B. und Michael J.G., 30 "Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa I. Interaction of Opsonins with the Bacterium", J.of Inf.Dis. 130 Suppl., S119-S126 (1974)). Dieses Serum wurde weiters an gekochtem Zymosan adsorbiert (Bjornson, a.a.O.), um die Serumkomponente Properidin zu entfernen, ein Molekül, das für die Aktivierung des alternativen Komplement-Reaktionswegs notwendig ist. Für opsono-phagozyti-sche Bestimmungen unter Verwendung von K. pneumoniae und E aerogenes war die Quelle für das 35 Komplement normales menschliches Serum, das bei 1 % Endkonzentration verwendet wurde.

Es wurden Platten hergestellt zu Quantifizierung der Zahl überlebender/zerstörter Bakterien, indem zunächst Platten von 24 Mulden 3-5 Stunden auf 37 °C erwärmt wurden. Es wurde eine 0,4 %ige Lösung von Agarose in TSB hergestellt durch Autoklavenbehandlung der Mischung über 5 Minuten und Abkühlen auf 50 “C in einem Wasserbad. Etwa 15 Minuten vor dem Ende der letzten inkubationsperiode bei der 40 opsonophagozytotischen Bestimmung wurde eine 24 Mulden-Platte aus dem 37 °C Inkubator genommen, auf eine Heizplatte von 42 °C gestellt, und 0,4 ml TSB/Agarose jeder Mulde zugefügt. Die Platte wurde sofort wieder in den 37 * C Inkubator gegeben, sodaß die Agarose nie unter 370 C auskühlen konnte.

Zur Bestimmung wurden 25 U.I der überstehenden Flüssigkeit der 7D7-Kultur und 25 ul eines geeigneten Bakterienstamms in zweifacher Ausführung auf eine Rundboden-Mikrotiterplatte mit 96 Mulden 4s aufgebracht und bei RT 30 Minuten inkubiert. Hierauf folgte die Zugabe von 15 ul menschlichem Komplement, 15 ul menschlichen Neutrophilen (5.106/ml) und 70ul HBSS/Gel. Die gesamte Oberfläche der Platte wurde mit steriler Watte abgewischt, ein selbstklebender Kunststoff-Plattenverschluß wurde aufgebracht, um die ganze Platte und die Bereiche zwischen den Molden sicher abzudecken, und die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37'C rotiert. Nach der Inkubation wurde die Platte 5 Minuten bei 100 g 50 zentrifugiert, der Plattenverschluß vorsichtig entfernt und die Plattenoberfläche mit steriler, in 70 %iges Äthanol getauchter Watte getrocknet. Aus jeder Mikrotiter-Mulde wurden 50 ul entfernt und zu den einzelnen Mulden der Quantifizierungs-Platten von je 24 Mulden zugefügt, die bereits 0,4 ml/Mulde geschmolzener (38 ° -40 ° C) 0,4 % TSB/Agarose enthielten. Diese Platten wurden 1 Minute auf eine Flachbett-Schütteimaschine bei 150 UpM gegeben und die Agarose 15 Minuten bei RT härten gelassen. 55 Schließlich wurde jede Mulde mit 0,4 ml TSB/Agarose überschichtet und hierauf 15 Minuten bei 4ο0 härten gelassen, bevor die Platten über Nacht bei 37 °C inkubiert wurden. Nach 18 Stunden wurden die Kolonien ausgezählt und die Daten für jede Bedingung als koloniebiidende Einheiten (CFU) registriert. 14

AT 398 781 B

Die hier verwendeten Bakterien-Serotypen wurden, mit Ausnahme von K. pneumoniae, nur in Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers 7D7, einer aktiven Quelle von Komplement und menschlichen Neutrophilen inaktiviert (Tabelle 1). Wurde dieser Versuch mit verschiedenen auf 7D7 nicht reagierenden bakteriellen Serotypen wiederholt, so ergab sich keine Zerstörung der Bakterien (Daten nicht angeführt), woraus sich die funktionelle Spezifität des monoklonalen Antikörpers 7D7 und seine Fähigkeit, Bakterien zu opsonisieren und ihre Phagozytose zu fördern, zeigt. Da die kombinierte Wirkung der Opsonine (spezifische Antikörper) und der polymorphkernigen Leukozyten (Neutrophile) anscheinend der Primärmechanismus für die Immunität gegen diese Bakterienstämme ist, läßt sich aus diesen Ergebnissen schließen, daß der Antikörper 7D7, nach geeigneter Anwendung, einen Schutz gegen potentiell letale Infektionen mit den hier beschriebenen bakteriellen Serotypen bieten kann.

Tabelle 1

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der eingegebenen Bakterien E. coli 08 und 075 + 7D7 -a 0 E. coli 08 und 075 + 6F11b + 0 E. coli 08 und 075 - 7D7 + 0 E. coli 08 und 075 + 7D7 + 85% S. marcescens 012 und 015 + 7D7 - 0 S. marcescens 012 und 015 + 6F11b + 0 S. marcescens 012 und 015 - 7D7 + 0 S. marcescens 012 und 015 + 7D7 + 85% E. aerogenes isoliert (2) + 7D7 - 0 E. aerogenes isoliert (2) + 6F11b + 0 E. aerogenes isoliert (2) - 7D7 + 0 E. aerogenes isoliert (2) + 7D7 + 85 % a (-) = hitzeinaktiviertes (56 ° C 30 Minuten) menschliches Komplement b (6F11) = überstehende Kulturflüssigkeit, die einen menschlichen monoklonalen IgM-Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher Typ 2 enthält. H. Wirksamkeit in vivo

Um die obige Hypothese zu überprüfen, wurden Untersuchungen über die Schutzwirkung an Tieren mit dem Antikörper 7D7 und mindestens einem Keim der hier beschriebenen E. coli und E. aerogenes Spezies durchgeführt. 7D7 und negative Kontroilantikörper (6F11, menschliche monoklonale IgM-Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher Immuntyp 2) wurden zunächst aus verbrauchten überstehenden Kulturflüssigkeiten durch Fällung mit festem Ammoniumsulfat (50 % Endkonzentration) konzentriert. (Good A.J. et al., "Purification of Immunoglobulins and Their Fragments", in: Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell B.B. und Shiigi S.M., Eds., W.H. Freeman and Company, San Francisco, CA (1980) 279-286). Das ausgefällte Material wurde in sterilem Wasser rekonstituiert und ausgiebig gegen PBS dialysiert.

Der IgM-Antikörper in dem Ammoniumsulfat-Niederschlag wurde durch Affinitätschromatographie auf einer Affinitätskolonne für murine monoklonale anti-humane IgM Antikörper gereinigt. Zur Herstellung der Kolonnen wurde 1 g entwässerte Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) mit 15 ml eiskalter 1 mM HCl in destilliertem Wasser gemischt. Das hydratisierte Gel wurde mit 30 ml Kupplungs-Puffer (0,1 m Carbonat (NaHCOs) in 0,5 m NaCI, pH 8,2) gewaschen, bis zur Bildung eines feuchten Kuchens abtropfen gelassen und mit dem in 1-3 ml Kupplungs-Puffer gelösten Ammoniumsalzniederschlag vereinigt. Die Gel-Suspension wurde durch Umdrehen 2 Stunden lang bei RT gemischt und darnach 5 Minuten bei 200 g zentrifugiert. Um noch freie reaktive Stellen zu blockieren, wurde die überschüssige Flüssigkeit entfernt, 10 ml 1 m Äthanolamin dem Gel zugefügt und das Mischen wie oben durchgeführt. Die Suspension wurde 5 Minuten bei 200 g zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Das Gel wurde gebrauchsfertig gemacht durch eine Naschung in 0,1 m Acetat/NaCI-Puffer (6,8 g Natriumacetat-Trihydrat und 14,6 g NaCI wurden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst, das 2,9 ml Eisessig enthielt, pH 4,0), zwei Waschungen in Kupplungs-Puffer und zwei Waschungen in PBS. Das Gel wurde in eine Säule Pharmacia C10/10 gegossen und bis zum Gebrauch bei 4'C aufbewahrt. 15

AT 398 781 B

Zur Reinigung des Immunglobulins wurden 0,5 ml des salzfraktionierten Materials mit PBS auf 2,0 ml verdünnt und auf die Affinitätssäule aufgebracht. Nach dem Aufbringen der Probe wurde die Säule mit PBS pH 8,0 gewaschen, bis der Extinktions-Monitor kein weiteres Protein im Durchfluß anzeigte. Der gebundene Antikörper wurde mit 2 m MgCk in PBS eluiert, die Proteinkonzentration jeder Fraktion wurde bei O.D.280 5 bestimmt, und die Maximum-Konzentrationen vereinigt. Die den Antikörper enthaltende Fraktion wurde auf einer G-25 Sephadex Säule entsalzt und, falls notwendig, durch Mikrokonzentrations-Zentrifugation (Centri-con 30, Amicon Corp., Danver, MA) auf 1-2 mg/ml konzentriert. Die fertige Zubereitung wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gefolgt von Anfärben der Proteine mit Silbernitrat auf Reinheit (Morrissey J.H., "Silver Stain for Proteins in Polyacrylamide Gels: A Modified Procedure with Enhanced Uniform το Sensitivity", Anal.Biochem. 1717, 307-310 (1981)) und mittels ELISA wie hier beschrieben auf Antikörper-Wirksamkeit geprüft. Für jede bakterielle Infektion wurden weibliche, gekreuzte Swiss-Webster Mäuse mit einem Gewicht zwischen 20 und 22 g in drei Gruppen zu je 10 Mäusen eingeteilt. Ein typischer Versuch verlief wie folgt:

Gruppe Bakterien Antikörper A E. coli 08 7D7 B E. coli 08 6F11 C S. marcescens 014 7D7 20

Jeder den Antikörper erhaltenden Gruppe wurden 200 U.I steriles PBS, das 25 ug gereinigten Antikörper enthielt, injiziert. Zwei Stunden später wurden alle Tiere intraperitoneal mit 300 Ul lebender Bakterien, die 3 LDso des entsprechender Bakterienstamms enthielten, infiziert. Die bakterielle Suspension wurde aus einer Nährlösungskultur im logarithmischen Wachstumsstadium zubereitet, aus der die Bakterien 25 abzentrifugiert, zweimal mit PBS gewaschen und bis zu der entsprechenden Konzentration in PBS wieder suspendiert wurden. Die Tiere wurden fünf Tage lang beobachtet. 24 bis 48 Stunden nach der Infektion waren alle Tiere in Gruppe B (nicht passender Antikörper) und Gruppe C (nicht passender Keim) tot. Im Gegensatz dazu waren alle Tiere, die den 7D7 Antikörper erhalten hatten (Gruppe A) am Leben und symptomfrei. 30 Dieses tierische Schutzmodell wurde verwendet, um die therapeutische Wirkung des 7D7 Antikörpers gegen bakterielle Infektionen mit Keimen, die den drei hier angeführten Genera angehören, aufzuzeigen. Eine Zusammenfassung der Daten wird in Tabelle 2 gegeben.

Tabelle 2 35

Infizierende Bakterien Antikörper Überleben/Infektion % Überleben E. coli 08 7D7 10/10 100 E. coli 08 6F11a 0/10 0 S. marcescens 014b 7D7 0/10 0 a der 6F11 Antikörper ist spezifisch auf Pseudomonas aeruginosa Fisher Immuntyp 2 und dient als negativer Kontrollantikörper b S. marcescens 014 reagiert nicht mit dem 7D7 Antikörper und dient als nicht 45 spezifischer Kontrollkeim 50 16 55 5

AT 398 781 B

Tabelle 2a

Antikörper % Überleben0 Tag 0 1 2 3 4 6F11 12 2 2 1 1 7D7 12 10 e 4 4 10 15 0 die Untersuchungen zur LDso und zur Schutzwirkung wurde durchgeführt mit Mäusen, die mittels Injektion von Cyclophosphamid neutropenisch gemacht worden waren wie folgt: Tag 0:150 mg/kg; Tag 2: 50 mg/kg. Am Tag 4 erhielten die Mäuse Antikörper und Bakterien wie hier beschrieben.

Diese Daten zeigen, daß der menschliche monoklonale Antikörper 7D7 Mäuse vor potentiell tödlichen Infektionen mit Bakterien schützen kann, die drei verschiedenen gramnegativen bakteriellen Spezies angehören. Da 7D7 mit einem auf der LPS vorliegenden Kohlenhydrat-Epitop reagiert, die LPS-Moleküle 20 auf K. pneumoniae jedoch weniger leicht zugänglich sind (Orskov I. und Orskov F., "Serotyping of Klebsiella", in: Methods in Microbiology, Vol. 14, Bergan T„ Ed., Academic Press, Orlando, FL (1984) 143-146), zeigte sich keine Schutzwirkung des 7D7 Antikörpers gegen K: pneumoniae (Daten nicht angeführt). Es konnte jedoch durch den inter-Genera kreuzreaktiven menschlichen monoklonalen Antikörper 7D7 gegen Infektionen durch Keime, die den gramnegativen bakteriellen Spezies E. coli und E. aerogenes angehören, 25 eine Schutzwirkung mit 25 ug gereinigtem Antikörper erzielt werden.

BEISPIEL II

Beispiel II zeigt die Verfahren zur Herstellung und Auswahl eines menschlichen monoklonalen Antikör-30 pers, der inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Angehörige der Spezies Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter aerogenes aufweist. Außerdem zeigt dieses Beispiel die opsonische Wirkung in vitro dieses Antikörpers gegen homologe S. marcescens, K. pneumoniae und E. aerogenes Serotypen. Das Verfahren aus Beispiel I (im wesentlichen wie in den Abschnitten A bis G beschrieben) wurde wiederholt, um einen menschlichen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der gegen Infektionen kreuz-35 protektiv war, die durch die hier beschriebenen Bakterien verursacht wurden, außer daß es sich als notwendig erwies, zur Charakterisierung und Bestimmung des in diesem Beispiel beschriebenen Antikörpers spezifische Modifikationen durchzuführen. Im folgenden werden die Änderungen in den Bestimmungsverfahren und die mit dem hier beschriebenen monoklonalen Antikörper erzielten Ergebnisse beschrieben. 1. Die überstehenden Kulturflüssigkeiten von sechs Transformationen wurden mittels des obigen Verfah-40 rens analysiert und ergaben die Identifizierung einer Mulde (4F10), der auf der S. marcescens Serotyp

Platte, nicht jedoch auf der E. coli oder Kontroll-Platte Wirksamkeit zeigte. In darauffolgenden ELISA-Tests mit einzelnen S. marcescens Serotypen wurde bestimmt, daß diese Mulde einen Antikörper enthielt, der mit den S. marcescens Serotypen 015 und 018 reagierte, nicht jedoch mit irgend einem anderen der 20 bekannten S. marcescens LPS Serotypen. 45 Vor der Einreichung des vorliegenden Patentsansuchens wurde die kontinuierliche transformierte menschliche Zellinie, als 4F10 identifiziert, bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter ATCC Nr. CRL 9007 deponiert. 2. Der Antikörper der geklonten 4F10 Zellinie wurde auf weitere inter-Genera Kreuzreaktivität mittels einer Modifikation des Standard Immunoblot-Verfahrens untersucht. Im speziellen wurde die Kreuzreakti- 50 vität gegen die Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes und E. cloacae untersucht, indem die Bakterien auf eine gegitterte Nitrozellulosepapierscheibe punktförmig aufgebracht, die Scheibe mit dem erwähnten Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktionen mit einem alkalische Phosphata-se/Nitroblau-Tetrazolium Enzymsystem entwickelt wurden.

Aus diesen Versuchen ergab sich, daß der Antikörper 4F10 weitere inter-Genera Kreuzreaktivität 55 aufweist. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Serotypen: 17

AT 398 78t B K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes K3,12, 29, 31,68,72 015,18 klinisch isolierte Proben

Der menschliche monoklonale Antikörper 4F10 zeigte somit inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Bakterien, die den Spezies S. marcescens, K. pneumoniae und E. aerogenes angehören. 3. Bei der Anwendung des Immunoblot-Verfahrens ergab sich, daß auf allen Spuren, die Deoxycholat-Extrakte der hier beschriebenen Bakterien enthielten, positive Reaktionen auftraten. Auf diesen Spuren schien der Antikörper 4F10 entweder ein breites Band von Komponenten oder eine Reihe von molekularen Einheiten in regelmäßigem Abstand zu erkennen, wodurch sich ein leiterartiges Muster ergab. Dieses Profil stand in völliger Übereinstimmung mit dem, das bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse von Kohlenhydrat-Anteiien erhalten wird, welche entweder eine übermäßige Molgewichts-Heterogenität aufweisen auf Grund einer sich oft wiederholenden spezifischen Zuckersequenz oder auf Grund von LPS-Molekülen, die sich durch Gewichtsinkremente unterscheiden, welche der Anzahl der O-antigenen Oligosaccharid-Seitenketteneinheiten je Molekül äquivalent sind (Vimr E.R. et al., "Use of Procaryotic-Derived Probes to Identify Poly (Sialic Acid) in Neonatal Neuronal Membranes", Proc.Natl.Acad. Sei. 8T 1971-1975 (1983); und Holden K.G. et al., "Gel Electrophoresis of Mucuous Glycoproteins, I. Effect of Gel Porosity", Biochemistry 10, 3105-3109 (1971)). Diese Daten geben einen Hinweis darauf, daß der monoklonale Antikörper 4F10 gegen eine antigene Determinante gerichtet ist, die Kohlenhydrat-Moiekü-len gemeinsam ist, die sich auf einigen Serotypen von S. marcescens, K. pneumoniae und E. aerogenes finden.

Die nach der Proteinase K-Behandlung beobachteten Immunoblotmuster waren identisch mit den ohne Behandlung beobachteten Mustern und gaben somit einen Hinweis darauf, daß das mit dem 4F10 Antikörper reagierende Antigen keine Proteinnatur aufweist.

Um im speziellen zu untersuchen, ob 4F10 mit einem Kohlenhydrat-Epitop reagiert, wurde die elektrotransferierte Deoxycholat Probe einer schonenden Perjodatoxidation unterworfen, bevor das Nitrozellulosepapier mit dem Antikörper zur Reaktion gebracht wurde. Die in dieser Weise behandelten Deoxycholat-Extrakte reagierten nicht mehr mit dem monoklonalen Antikörper 4F10. Diese Daten geben einen deutlichen Hinweis darauf, daß das von dem Antikörper erkannte Epitop ein Kohlenhydrat-Anteil ist, der sich auf Molekülen findet, die die hier beschriebenen Bakterien besitzen. 4. Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers 4F10 wurde bestimmt mit eines ELISA Verfahrens ähnlich den in Beispiel I beschriebenen Spezifitätstests, außer daß die Antigenplatte einen Pool von PLL-immobiliserten S. marcescens 015 und 018 Serotypen enthielt. Eine positive Reaktion des monoklonalen Antikörpers 4F10 mit den S. marcescens Serotypen zeigte sich nur mit dem Anti-lgM Reagens, was auf einen IgM-lsotyp für den monoklonalen Antikörper schließen läßt. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß bei mehrfacher Wiederholung des oben angeführten Verfahrens und darauffolgender Bestimmung der Isotypen der so erhaltenen, inter-Genera kreuzreaktiven monoklonalen Antikörper zusätzliche, z.B. IgM und IgG Isotypen gefunden würden. 5. Die funktionelle Wirksamkeit in vitro des monoklonalen Antikörpers 4F10 wurde untersucht in einer Opsono-Phagozytose-Bestimmung, die die bakteriozide Wirksamkeit des Antikörpers in Anwesenheit und in Abwesenheit humaner Neutrophiler und humanen Komplements verglich.

Die hier verwendeten bakteriellen Serotypen wurden nur in Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers 4F10, einer aktiven Komplement-Quelle und menschlicher Neutrophiler inaktiviert (Tabelle 3). Bei Wiederholung des Versuchs mit nicht-4FlO reaktiven bakteriellen Serotypen zeigte sich keine Zerstörung der Bakterien (Daten nicht angeführt), woraus sich die funktionelle Spezifität des monoklonalen Antikörpers 4F10 und seine Kapazität zur Opsonisierung der Bakterien und zur Förderung der Phagozytose ergab. 18

AT 398 781 B

Tabelle 3

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der eingegebenen Bakterien S. marcescens 018 und 015 + 4F10 -a 0 S. marcescens 018 und 015 + 6Fl1b + 0 S. marcescens 018 und 015 - 4F10 + 0 S. marcescens 018 und 015 + 4F10 + 85% K. pneumoniae K3 und K12 + 4F10 - 0 K. pneumoniae K3 und K12 + 6F11b + 0 K. pneumoniae K3 und K12 - 4F10 + 0 K. pneumoniae K3 und K12 + 4F10 + 60 % E. aerogenes isoliert (2) + 4F10 - 0 E. aerogenes isoliert (2) + 6F11b + 0 E. aerogenes isoliert (2) - 4F10 + 0 E. aerogenes isoliert (2) + 4F10 + 85 % a (-) = hitzeinaktiviertes (56 * C 30 Minuten) menschliches Komplement b (6F11) = überstehende Kuiturflüssigkeit, die einen menschlichen monoklonalen IgM-Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher Typ 2 enthält.

Beispiel III

Beispiel III zeigt Verfahren zur Herstellung eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der mit Polysacchariden sowohl von Escherichia coli Kapsel Typ K1, als auch von Neisseria meningitidis (N. meningitidis) Gruppe B reagiert, und zeigt außerdem die Schutzwirkung dieses Antikörpers in vivo gegen potentiell tödliche Infektionen homologer E. coli und N. meningitidis Bakterienspezies. Das Verfahren aus Beispiel I (im wesentlichen wie in den Abschnitten A bis Θ beschrieben) wurde wiederholt um einen menschlichen monoklonalen Antikörper zu produzieren,, der gegen Infektionen kreuzprotektiv war, die durch die hier beschriebenen Bakterien verursacht wurden, außer daß es sich als notwendig erwies, zur Charakterisierung und Bestimmung des in diesem Beispiel beschriebenen Antikörpers spezifische Modifikationen durchzuführen. Im folgenden werden die Änderungen in den Bestimmungsverfahren und die mit dem hier beschriebenen monoklonalen Antikörper erzielten Ergebnisse beschrieben. 1. Die überstehenden Kulturflüssigkeiten von fünf Transformationen wurden mittels des obigen Verfahrens analysiert und ergaben die Identifizierung von vier Mulden (5D4, 2C10, 9B10 und 8A8), die auf der E. coli Serotyp Platte, nicht jedoch auf der S. marcescens oder Kontroll-Platte anti-E. coli Spezifität zeigten. In darauffolgenden ELISA-Tests mit einzelnen E. coli Serotypen wurde bestimmt, daß diese Mulden Antikörper enthielten, die mit mindestens folgenden E. coli Serotypen reagierten: 01 (ATCC 23499), 07:K1 (ATCC 12792), 016:K1 (ATCC 23511) und 050 (CDC 1113-83), nicht jedoch mit 04 (ATCC 12792), 06:K2 (ATCC 19138), 08:K8 (ATCC 23501), 09:K9 (ATCC 23505) oder 022:K13 (ATCC 23517). Auf Grund des besseren Verhaltens bei dem Klonierungsverfahren und der größeren Antikörper-Produktion wurde der monoklonale Antikörper 9B10 für die weitere Analyse ausgewählt.

Vor der Einreichung des vorliegenden Patentansuchens wurde die kontinuierliche transformierte menschliche Zellinie, als 9B10 identifiziert, bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter ATCC Nr. CRL 9006 deponiert. 2. Das Ergebnis, daß die monoklonalen Antikörper von jedem der Klone mit der identischen Gruppe von E. coli O-Antigen Serotypen reagierte, gab einen Hinweise darauf, daß diese Antikörper gegen eine bakterielle Oberflächenstruktur gerichtet sind, die diesen Serotypen gemeinsam ist. Zur Definierung dieser den E. coli Serotypen gemeinsamen Oberflächenstruktur wurden verschiedene Wege beschritten. Wie beschrieben besitzen zwei (07:K1 und 016:K1) der vier E. coli Serotypen, die vom 9B10 Antikörper identifiziert wurden, den K1 Kapsel Serotyp, während die beiden anderen (01 und 050) auf ihren K-Antigen Serotyp nicht bestimmt worden waren. Es wurde somit die Möglichkeit verfolgt, daß der 9B10 Antikörper eine Reaktivität gegen das K1 Antigen aufweist, und daß die E. coli Stämme, die die O-Antigen Serotypen 01 und 050 aufweisen, ebenfalls den K1 Kapsel Serotyp besitzen.

Zum Nachweis der Anwesenheit der K1 Kapsel wurde von anderen Autoren ihre Thermolabilität ausgenützt. Das Erhitzen von K1 positiven E. coli Serotypen in einem kochenden Wasserbad bei 100*C 19

AT 398 781 B über 60 Minuten nimmt diesen Stämmen die Fähigkeit, mit Anti-K1 Seren zu reagieren und erhöht ihre Fähigkeit, mit anti-O-Antigen Seren zu reagieren (Orskov F. und Orskov I., "Serotyping of Escherichia coli”, in: Methods in Microbiology, Vol.14, T.Bergan, Ed., Academic Press, London (1984) pp.44-105). Die entgegengesetzten Wirkungen des Kochens beruhen vermutlich auf der Entfernung der Kapsel und 5 der erhöhten Zugänglichkeit des Antikörpers für Lipopolysaccharid (LPS)-Moleküle. Die E. coli K1 positiven Serotypen (07 und 016) und die nicht-K1 typisierten Serotypen (01 und 050) wurden wie beschrieben erhitzt und mit dem 9B10 Antikörper und LPS-Serotyp-spezifischen heterologen Seren (Difco Bacto-E. coli Typing Reagents) im ELISA-Verfahren zur Reaktion gebracht. Die hitzebehandelten Keime verloren alle Reaktivität mit den homologen LPS Serotypspezifischen Seren, während die nicht io behandelten (Kontroll-) Keime weiterhin eine starke Reaktivität mit den 9B10 überstehenden Kulturflüssigkeiten und eine schwache Reaktivität mit ihren entsprechenden LPS Serotyp-spezifischen Antiseren aufwiesen.

Es wurde nachgewiesen, daß das Polysaccharid (Kohlenhydrat) von Neisseria meningitidis Gruppe B Bakterien (ein Homopolymer von Sialsäure-Alpha 2,8-gebundener Poly-N-acetylneuraminsäure) Chers misch und antigenisch homogen ist mit dem E. coli K1 Polysaccharid (Grados O. und Ewing W.H. "Antigenic Relationship Between Escherichia coli and Neisseria meningitidis", J.lmmunol. 110, 262-268 (1973)). Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, daß, falls der monoklonale Antikörper 9B10 Spezifität gegenüber E coli K1 Kapsel aufweist, dieser Antikörper auch gegen N. meningitidis Gruppe B Polysaccharid Spezifität zeigen sollte, und außerdem, daß monoklonale Antikörper, die Spezifität gegen 20 das Gruppe B Polysaccharid von N. meningitidis zeigen, auch Reaktivität gegen E. coli Stämme, die die K1 Kapsel besitzen, aufweisen sollten. Es wurden zwei Versuchsprotokolle verwendet, die untersuchen sollten (1) die Fähigkeit des 9B10 Antikörpers, mit N. meningitidis zu reagieren, und (2) die Fähigkeit eines Antikörpers gegen N. meningitidis Gruppe B Polysaccharid, mit den vier 9B10-reaktiven E. coli Serotypen zu reagieren. 25 Hochgereinigtes Gruppe B Polysaccharid (Connaught Laboratories, Toronto, Canada) und lebensfähi

ge N. meningitidis Gruppe B Bakterien wurden mit dem 9B10 Antikörper in einem ELISA-Test wie beschrieben zur Reaktion gebracht. Der monoklonale Antikörper 9B10 reagierte stark mit beiden Antigen-Zubereitungen. Um die umgekehrte Spezifität zu zeigen, wurde ein handelsüblicher Meningitis-Testsatz auf N. meningitidis Gruppe B ("Directagen" Direct Antigen Detection System, Hynson, Westcott and 30 Dunning, Baltimore, MD), der Latexkügelchen verwendet, die mit murinen monoklonalen Antikörper gegen Gruppe B Polysaccharid beschichtet sind, verwendet. Bei Agglutinations-Bestimmungen unter Verwendung der 9B10-positiven E coli Serotypen, zeigten alle vier Serotypen starke Reaktivität mit den mit Antikörper beschichteten Kügelchen. Als K1-Antigen negativ bekannte E coli Serotypen waren auch in diesem Testsystem negativ. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, daß der monoklonale Antikörper 35 9B10 mit der E coji K1 Kapsel und dem typenspezifischen Kohlenhydrat auf N. meningitidis Gruppe B reagiert. Da viele dieser Bestimmungen mit intakten, lebensfähigen Bakterien durchgeführt wurden, kann weiters geschlossen werden, daß der monoklonale Antikörper 9B10 auf einen Teil eines äußerlich zugänglichen Bereichs des Poly-Sialsäure-Moleküls spezifisch ist.

3. Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers 9B10 wurde bestimmt mit eines ELISA Verfahrens ähnlich 40 den in Beispiel I beschriebenen Spezifitätstests, außer daß die Antigenplatte einen Pool von PLL immobiliserten E coli K1 positiven Serotypen enthielt. Eine positive Reaktion des monoklonalen Antikörpers 9B10 mit den K1 positiven E. coli Serotypen zeigte sich nur mit dem Anti-lgM Reagens, was auf einen IgM-lsotyp für den monoklonalen Antikörper schließen läßt. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß bei mehrfacher Wiederholung des oben angeführten Verfahrens und darauffolgender Bestimmung 45 der Isotypen der so erhaltenen, inter-Genera kreuzreaktiven monoklonalen Antikörper zusätzliche, z.B. IgM und IgG Isotypen gefunden würden. 4. Die funktionelle Wirksamkeit in vitro des monoklonalen Antikörpers 9B10 wurde untersucht in einer Opsono-Phagozytose-Bestimmung, die die bakteriozide Wirksamkeit des Antikörpers in Anwesenheit und in Abwesenheit humaner Neutrophiler und humanen Komplements verglich. so K1 positive JE. coji Serotypen wurden nur in Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers 9B10, einer aktiven Komplement-Quelle und menschlicher Neutrophiler inaktiviert (Tabelle 4). Bei Wiederholung des Versuchs mit verschiedenen K1 negativen E. coli Serotypen zeigte sich keine Zerstörung der Bakterien (Daten nicht angeführt), woraus sich die Kl -Spezifität des monoklonalen Antikörpers 9B10 und seine Kapazität zur Opsonisierung der Bakterien und zur Förderung der Phagozytose ergab. Da die kombinier-55 te Wirkung von Opsoninen (spezifischen Antikörpern) und polymorphkernigen Leukozyten (Neutrophilen) anscheinend den Primärmechanismus der Immunität gegen K1 positive E. coli Serotypen darstellt, geben diese Daten einen Hinweis darauf, daß der 9B10 Antikörper nach geeigneter Anwendung Schutz gegen eine potentiell tödliche Infektion mit E. coli K1 verkapselten Serotypen, unabhängig von ihrem 0- 20

AT 398 781 B

Antigen Serotyp bieten könnte.

Tabelle 4

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der eingegebenen Bakterien E. coli 01:K1 und 018:K1 + 9B10 -a 0 E. coli 01 :K1 und 018:K1 + 6F11b + 0 E. coli 01:K1 und 018:K1 • 9B10 + 0 E. coli 01 :K1 und 018:K1 + 9B10 + 99 % N. meningitidis Gruppe B + 9B10 - 0 N. meningitidis Gruppe B + 6F11b + 0 N. meningitidis Gruppe B - 9B10 + 0 N. meningitidis Gruppe B + 9B10 + 99% 3 (-) = hitzeinaktiviertes (56 · C 30 Minuten) menschliches Komplement b (6F11) = überstehende Kulturflüssigkeit, die einen menschlichen monoklonalen IgM-Antlkörper gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher Typ 2 enthält. 5. Um die obige Hypothese zu überprüfen, wurden Untersuchungen über die Schutzwirkung an Tieren mit dem Antikörper 9B10 und verschiedenen K1 positiven und K1 -negativen E. coji Serotypen, sowie mit N. meningitidis Gruppe B Serotypen (Stamm H313, erhalten von Dr.Carl Frasch, Laboratory of Bacterial Polysaccharides, Office of Biologics, Food and Drug Administration, Bethesda, MD) durchgeführt. Für jeden bakteriellen Provokationstest wurden weibliche, gekreuzte Swiss-Webster Mäuse mit einem Gewicht zwischen 20 und 22 g in drei Gruppen zu je 10 Mäusen eingeteilt. Ein typischer Versuch verlief wie folgt:

Gruppe Bakterien Antikörper A E. coli K1 9B10 B E. coli K1 6F11 C E. coli K2 9B10

Jeder den Antikörper erhaltenden Gruppe wurden 200 lil steriles PBS, das 25 U.g gereinigten Antikörper enthielt, injiziert. Zwei Stunden später wurden alle Tiere intraperitoneal mit 300 ul lebender Bakterien, die 3 LD50 des entsprechenden Bakterienstamms enthielten, infiziert. Die bakterielle Suspension wurde aus einer Nährlösungskultur im logarithmischen Wachstumsstadium zubereitet, aus der die Bakterien abzentrifugiert, zweimal mit PBS gewaschen und bis zu der entsprechenden Konzentration in PBS wieder suspendiert wurden. Die Tiere wurden fünf Tage lang beobachtet. 24 bis 48 Stunden nach der Infektion waren alle Tiere in Gruppe B (nicht passender Antikörper) und Gruppe C (nicht passender Keim) tot. Im Gegensatz dazu waren alle Tiere, die den 9B10 Antikörper erhalten hatten (Gruppe A) am Leben und symptomfrei.

Dieses tierische Schutzmodell wurde verwendet, um die therapeutische Wirkung des 9B10 Antikörpers gegen bakterielle Infektionen mit Keimen, die den beiden hier angeführten Spezies angehören, aufzuzeigen. Hine Zusammenfassung der Daten wird in Tabelle 5 gegeben.

AT 398 781 B

Tabelle 5

Infizierende Bakterien Antikörper Ü berleben/lnfektion % Überleben E. coli K1 9B10 10/10 100 E. coli K1 6F11a 0/10 0 E. coli K2b 9B10 0/10 0 N. meningitidis Gruppe B 9B10 5/5 100 N. meningitidis Gruppe B 6F11 0/5 0 EcoH K2 9B10 0/5 0 a der 6F11 Antikörper ist spezifisch auf Pseudomonas aeruginosa Fisher Immuntyp 2 und dient als negativer Kontrollantikörper b E. coli K2 reagiert nicht mit dem 9B10 Antikörper und dient als nicht spezifischer Kontrollkeim

Diese Daten zeigen, daß der menschliche monoklonale Antikörper 9B10 Mäuse gegen potentiell tödliche Infektionen mit Bakterien schützen kann, die zwei verschiedenen gramnegativen bakteriellen Spezies angehören. Der inter-Genera kreuzprotektive Antikörper konnte passiv gegen Keime schützen, die den gramnegativen bakteriellen Spezies E. coli und N. meningitidis Gruppe B angehörten.

BEISPIEL IV

Beispiel IV zeigt Verfahren zur Herstellung eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Spezies Escherichia coli (E. coli), Enterobacter cloacae (E. cloacae) und Streptococcus Gruppe B aufweist. Außerdem zeigt dieses Beispiel einen Antikörper, der mit Spezies kreuzreaktiv ist, die den beiden bakteriellen Hauptgruppen angehören: gramnegative (E. coli und E. cloacae) und grampositive (Streptococcus Gruppe B). Zusätzlich zeigt dieses Beispiel die Schutzwirkung in vivo dieses Antikörpers gegen eine potentiell tödliche Infektion von homologen E. coli und Streptococcus Gruppe B Serotypen. Das Verfahren von Beispiel I (im wesentlichen wie in den Abschnitten A bis G beschrieben) wurde wiederholt, um einen menschlichen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der gegen Infektionen kreuzprotektiv war, die durch die hier beschriebenen Bakterien verursacht wurden, außer daß es sich als notwendig erwies, zur Charakterisierung und Bestimmung des in diesem Beispiel beschriebenen Antikörpers spezifische Modifikationen durchzuführen. Im folgenden werden die Änderungen in den Bestimmungsverfahren und die mit dem hier beschriebenen monoklonalen Antikörper erzielten Ergebnisse beschrieben. 1. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden auf die Anwesenheit von anti-Streptococcus Gruppe B -Antikörpern unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunosorbens-Assay-Verfahrens (ELISA) wie in Beispiel I beschrieben untersucht. Die Antigenplatten bestanden aus einer Reihe von Flachboden-Immunoion 2 Mikrotiterplatten zu je 96 Mulden, wobei die Mulden Mischungen von Streptococcus Gruppe B vom Kapseltyp enthielten, die an die Plattenoberfläche mit Poly-L-Lysin (PLL) fixiert waren. Die verschiedenen in der Untersuchung verwendeten Antigen-Platten umfaßten: (1) eine Mischung von Streptococcus Gruppe B Typen la (ATCC Nr. 12400), Ib (ATCC Nr. 12401), Ic (ATCC Nr. 27591); (2) eine Mischung der Typen II (ATCC Nr. 12973) und III (klinisch isoliert, erhalten von Dr.C.Wilson, Children's Orthopedic Hospital, Dept. Infectious Disease, Seattle, WA); und (3) eine Mikrotiterplatte ohne Bakterien.

Die überstehenden Kulturflüssigkeiten von zwei Transformationen wurden nach obigem Verfahren analysiert und ergaben die Identifizierung einer Mulde (4B9), die Aktivität auf beiden Streptococcus Gruppe B Typisierungs-Platten aufwies, nicht jedoch auf den Kontrollplatten. In darauffolgenden ELISA-Tests mit einzelnen Streptococcus Gruppe B Typen wurde festgestellt, daß diese Mulde einen Antikörper enthielt, der mit allen fünf Typisierungsstämmen reagierte.

Es wurde somit in diesem Versuch eine geklonte transformierte menschliche Zellinie erhalten, die kontinuierlich (unsterblich) ist und einen menschlichen monoklonalen Antikörper gegen eine Determinante auf der Oberfläche der angeführten Streptococcus Gruppe B Typen sezerniert.

Vor der Einreichung des vorliegenden Patentansuchens wurde die kontinuierliche transformierte menschliche Zellinie, als 4B9 identifiziert, bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter ATCC Nr. CRL 9008 deponiert. 2. Der Antikörper der geklonten Zellinie 4B9 wurde auf Kreuzreaktivität gegen gramnegative und grampositive Bakterien mittels einer Modifikation des Standard-Immunoblot-Verfahrens geprüft. Insbeson- 22

AT 398 781 B dere wurde die Kreuzreaktivität gegen die Bakterien E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, Hemophilus influenzae und Staphylococcus aureus geprüft, indem die Bakterien punktförmig auf eine gegitterte Nitrozellulosepapierscheibe aufgebracht wurden und die Scheibe, die die Bakterien enthielt, mit dem erwähnten Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktionen 5 mit einem alkalische-Phosphatase/Nitroblau-Tetrazoiium Enyzymsystem (wie in Beispiel I beschrieben) entwickelt wurden.

Aus diesen Versuchen zeigte sich, daß der Antikörper 4B9 Kreuzreaktivität mit bestimmten gramnegativen bakteriellen Spezies aufweist. Dieser Antikörper reagierte mit den E. coli LPS Serotypen 04, 07, 018 und 025, und den klinisch isolierten E. cloacae. Der menschliche monoklonale Antikörper 4B9 besitzt io somit inter-Genera Kreuzreaktivität zwischen gramnegativen und grampositiven Bakterien, die den Spezies E. coli, E. cloacae und Streptococcus Gruppe B angehören. 3. Das Ergebnis, daß der monoklonale Antikörper mit einigen verschiedenen bakteriellen Genera kreuzreaktiv war, die den gramnegativen und grampositiven Bakteriengruppen angehörten, ließ vermuten, daß der Antikörper gegen ein gemeinsames Protein oder Kohlenhydrat gerichtet war. Die biochemische 15 Charakterisierung der Molekülart, die von dem 4B9 Antikörper erkannt wird, wurde mittels Immunoblot-Analyse durchgeführt. Zur Analyse der gramnegativen Genera wurden die gewaschenen Bakterien in Deoxycholat wie in Beispiel I beschrieben extrahiert. Für die grampositiven Bakterien wurden 1,0 I der 6 Stunden in modifizierter Todd-Hewitt Nährlösung (Difco, Todd-Hewitt Broth, enthält 2,8 g/l wasserfreies Natriumphosphat, pH 7,8) gezogenen Bakterien durch Zentrifugieren geerntet und dreimal mit PBS 20 gewaschen. Die Bakterien wurden neuerlich in 85 ml Protoplast-Medium (40 % Saccharose g/v in 0,03 m Kaliumphosphatpuffer, pH 6,8, der 10 mM MgCh enthält) suspendiert, und die Suspension 10 Minuten auf 37'C erwärmt. Etwa 3000 Einheiten des Mutanolysins (SIGMA) wurden zugesetzt und die Mischung bei 37 “C 90 Minuten, oder bis die OD^o der Suspension um über 90 % reduziert war, geschüttelt. Die digerierte Substanz wurde bei 2000 g 15 Minuten bei RT zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit 25 gegen PBS 48 Stunden dialysiert (Young M.K. und Mattingly S.J., "Biosynthesis of Cell Wall Peptidogly-can and Polysaccharide Antigens by Protoplasts of Type III Group B Streptococcus", J.Bact. 154, 211-220 (1983)). Das Dialysat wurde durch positive Druckdialyse durch ein PM-10 Filter (Amicon Corp., Danvers, MA) zehnfach konzentriert.

Kohlenhydrate, die an Weizenkeimagglutinin binden, wurden mittels Affinitätschromatographie auf 30 einer Weizenkeimlectin Sepharose 6MB Säule (SIGMA) gereinigt. Die hier beschriebene gebundene digerierte Substanz wurde aus der Säule mit 10 ml 0,1 m N-Acetylglucosamin eluiert und das Eluat gegen destilliertes Wasser bei 4°C dialysiert. Das affinitätsgereinigte Eluat wurde mittels Lyophiliserung getrocknet und das Trockengewicht der erhaltenen Substanz bestimmt (Gray B.M. et al "Interaction of Group B Streptococcal Type-Specific Polysaccharides with Wheat Germ Agglutinin and Other Lectins", 35 J.of Immunol.Meth. 72, 269-277 (1984)). Auf allen Spuren, die Deoxycholatextrakte der hier beschriebenen Bakterien enthielten, zeigten sich positive Reaktionen. Bei jenen Spuren, die Extrakte von gramnegativen Bakterien enthielten, erkannte der Antikörper 4B9 anscheinend eine Reihe von Moleküleinheiten, die in regelmäßigen Abständen angeordnet waren, wodurch sich ein leiterartiges Muster auf dem Immunoblot ergab. Dieses Profil war völlig übereinstimmend mit jenem, das sich bei Polyacrylamid-40 Gelelektrophorese-Analyse von LPS in Anwesenheit von SDS ergab, in welchem Fall gezeigt werden konnte, daß das von den Banden gezeigte größenheterogene Profil auf eine Population von LPS-Mofekülen zurückzuführen ist, die sich um Gewichtsinkremente unterscheiden, die der Zahl der O-antigenen Oligosaccharid-Seitenketteneinheiten je Molekül äquivalent sind (Pavla E.T. und Makela P.H., a.a.O.; und Goldmann R.D. und Leive L., a.a.O.). Auf jenen Spuren, die Extrakte von Streptococcus 45 Gruppe B Typen enthielten, schien der Antikörper 4B9 Komponenten zu erkennen, die in einem breiten Band anwesend waren. Dieses Profil war übereinstimmend mit jenem, das sich bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse von Kohlenhydrat-Anteilen ergab, die eine weitgehende Molekulargewichts-Heterogenität mit einer häufig wiederholten spezifischen Zuckersequenz aufweisen (Vmir E.R. et al, a.a.O.; und Holden K.G., a.a.O.). Diese Daten geben einen Hinweis darauf, daß der monoklonale 50 Antikörper 4B9 gegen eine antigene Determinante gerichtet ist, die verschiedenen Molekülen gemeinsam ist, welche auf einigen Serotypen von E. coli, E. cloacae und Streptococcus Gruppe B gefunden werden.

Zur weiteren Definierung der molekularen Natur des Antigens wurden die Deoxycholatextrakte mit dem proteolytischen Enzym Proteinase K .vor ihrer Elektrophorese behandelt (Eberling W., a.a.O.). Die nach der Proteinase K Behandlung beobachteten Immunoblot-Muster waren identisch mit jenen Mustern, 55 die ohne Behandlung beobachtet wurden, und dies läßt darauf schließen, daß das mit dem Antikörper 4B9 reaktive Antigen keine Proteinnatur aufweist.

Um im speziellen zu untersuchen, ob 4B9 mit einem Kohlenhydrat-Epitop reagiert, wurden die elektrotransferierten und durch Weizenkeimagglutinierungs-Affinität gereinigten Deoxycholatproben einer 23

AT 398 781 B schonenden Perjodatoxidation unterworfen, bevor das Nitrozellulosepapier mit dem Antikörper zur Reaktion gebracht wurde (vgl. Beispiel I). Die auf diese Weise behandelten aufgetragenen Deoxychola-textrakte reagierten nicht mehr mit dem monoklonalen Antikörper 4B9. Diese Daten geben einen deutlichen Hinweise darauf, daß das von diesem Antikörper erkannte Epitop ein Kohlenhydrat-Anteil ist, der sich auf Molekülen findet, die die hier beschriebenen sowohl grampositiven als auch gramnegativen Bakterien aufweisen. 4. Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers 4B9 wurde mittels eines EUSA-Verfahrens ähnlich den oben beschriebenen Spezifitätsprüfungen bestimmt, außer daß die Antigenplatte einen Pool von PLL immobilisierten Streptococcus Gruppe B Typen II und III enthielt. Eine positive Reaktion des monoklonalen Antikörpers 4B9 mit den Streptococcus Gruppe B Stämmen zeigte sich nur mit dem anti-lgM Reagens, woraus sich ein IgM Isotyp für den monoklonalen Antikörper ergibt. 5. Die funktionelle Wirksamkeit in vitro des monoklonalen Antikörpers 4B9 wurde untersucht in einer Opsono-Phagozytose-Bestimmung, die die bakteriozide Wirksamkeit des Antikörpers in Anwesenheit und in Abwesenheit humaner Neutrophiler und humanen Komplements verglich.

Die hier verwendeten Bakterienstämme wurden nur in Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers 4B9, einer aktiven Komplement-Quelle und menschlicher Neutrophiler inaktiviert (Tabelle 6). Bei Wiederholung des Versuchs mit verschiedenen nicht mit 4B9 reaktiven bakteriellen Serotypen zeigte sich keine Zerstörung der Bakterien (Daten nicht angeführt), woraus sich die funktionelle Spezifität des monoklonalen Antikörpers 4B9 und seine Kapazität zur Opsonisierung der Bakterien und zur Förderung der Phagozytose ergab. Da die kombinierte Wirkung von Opsoninen (spezifischen Antikörpern) und polymorphkernigen Leukozyten (Neutrophilen) anscheinend den Primärmechanismus der Immunität gegen diese Bakterienstämme darstellt, geben diese Daten einen Hinweis darauf, daß der 4B9 Antikörper nach geeigneter Anwendung Schutz gegen eine potentiell tödliche Infektion mit den hier beschriebenen Bakterienstämmen bieten könnte.

Tabelle 6

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der eingegebenen Bakterien E. coii 018 und 025 + 4B9 -a 0 E. coli 018 und 025 + 6F11b + 0 E. coli 018 und 025 - 4B9 + 0 E. coli 018 und 025 + 4B9 + 85% E. cioacae isoliert + 4B9 - 0 E. cioacae isoliert + 6F11 + 0 E. cioacae isoliert - 4B9 + 0 E. cioacae isoliert + 4B9 + 85 % Streptococcus Gruppe B Typ la und III + 4B9 - 0 Streptococcus Gruppe B Typ la und III + 6F11 + 0 Streptococcus Gruppe B Typ la und III - 4B9 + 0 Streptococcus Gruppe B Typ la und III + 4B9 + 85% 3 (-) = hitzeinaktiviertes (56 ” C 30 Minuten) menschliches Komplement b (6F11) = überstehende Kulturflüssigkeit; die einen menschlichen monoklonalen IgM-Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher Typ 2 enthält. 6. Um die obige Hypothese zu überprüfen, wurden Untersuchungen über die Schutzwirkung an Tieren mit dem Antikörper 4B9 und mindestens einem Keim von jedem der hier beschriebenen Genera durchgeführt. Für jeden gramnegativen bakteriellen Provokationstest wurden weibliche, gekreuzte Swiss-Webster Mäuse mit einem Gewicht zwischen 20 und 22 g in drei Gruppen zu je 10 Mäusen eingeteilt. Ein typischer Versuch verlief wie folgt: 24

AT 398 781 B

Gruppe Bakterien Antikörper A E. coli 018 4B9 B E. coii 018 6F11 C S. marcescens 014 4B9

Jeder den Antikörper erhaltenden Gruppe wurden 200 u.l steriles PBS, das 25 ug gereinigten Antikörper enthielt, injiziert. Zwei Stunden später wurden alle Tiere intraperitoneal mit 300 ul lebender Bakterien, die 3 LDso des entsprechenden Bakterienstamms enthielten, infiziert. Die bakterielle Suspension wurde aus einer Nährlösungskultur im logarithmischen Wachstumsstadium zubereitet, aus der die Bakterien abzentrifugiert, zweimal mit PBS gewaschen und bis zu der entsprechenden Konzentration in PBS wieder suspendiert wurden. Die Tiere wurden fünf Tage lang beobachtet. 24 bis 48 Stunden nach der Infektion waren alle Tiere in Gruppe B (nicht passender Antikörper) und Gruppe C (nicht passender Keim) tot. Im Gegensatz dazu waren alle Tiere, die den 9B10 Antikörper erhalten hatten (Gruppe A) am Leben und symptomfrei. Für die Studien zum Schutz gegen Streptococcus Gruppe B wurde ein Tiermodell mit neugeborenen Ratten verwendet. Gekreuzte Sprague-Dawley Ratten von weniger als 48 Stunden Alter (mit ihren Müttern gemeinsam gehalten) erhielten den Antikörper und die Bakterien im wesentlichen wie in den Mäuse-Schutzstudien beschrieben. Die hauptsächlichen Unterschiede waren wie folgt: 1) Sowohl Antikörper als auch bakterielle Infektion wurden intraperitoneal verabreicht, und 2) die impfmenge wurde auf 20 ixl reduziert.

Diese Schutzmodelle am Tier wurden verwendet, um. die therapeutische Wirkung des Antikörpers 4B9 gegen bakterielle Infektionen mit Keimen zu zeigen, die den drei hier angeführten Spezies angehören. Eine Zusammenfasung dieser Daten wird in Tabelle 7 gegeben.

Tabelle 7

Infizierende Bakterien Antikörper Überleben/Infektion % Überleben E. coli 025 4B9 10/10 100 E. coli 025 6F11a 0/10 0 S. marcescens 014b 4B9 0/10 0 Streptococcus Gruppe B la und III 4B9 10/10 100 Streptococcus Gruppe B la und III 6F11 0/10 0 S. marcescens 014 4B9 0/10 0 a der 6F11 Antikörper ist spezifisch auf Pseudomonas aeruginosa Fisher Immuntyp 2 und dient als negativer Kontrollantikörper b S. marcescens 014 reagiert nicht mit dem 4B9 Antikörper und dient als nicht spezifischer Kontrollkeim

Diese Ergebnisse zeigen, daß der menschliche monoklonale Antikörper 4B9 Mäuse und Ratten vor potentiell tödlichen Infektionen mit bakteriellen Genera schützen kann, die sowohl grampositiven wie auch gramnegativen Bakterien angehören. Die inter-Genera Kreuzreaktivität des menschlichen monoklonalen Antikörpers 4B9 ergab mit 25 ug des gereinigten Antikörpers eine Schutzwirkung gegen Infektionen mit Keimen, die dem gramnegativen Bakterien-Genus E. coli und den grampositiven Bakterien der Streptococcus Gruppe B angehören.

Beispiel V

Beispiel V zeigt Verfahren für die Herstellung und Auswahl eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Genera Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae und Enterobacter aerogenes aufweist. Weiters zeigt dieses Beispiel die opsonische Wirkung in vitro dieses Antikörpers gegen homologe S. marcescens, K. pneumoniae und E. aerogenes Serotypen. Das Verfahren aus Beispiel I (im wesentlichen wie beschrieben in Teil A bis G) wurde wiederholt, außer daß folgende spezifische Modifikationen notwendig waren, um den in diesem Beispiel beschriebenen Antikörper zu charakterisieren und zu bestimmen. Im folgenden werden die Änderungen in den Bestimmungsverfahren und die mit dem hier beschriebenen monoklonalen Antikörper erhaltenen Ergebnisse beschrieben. 25

AT 398 781 B 1. Die überstellenden Kulturflüssigkeiten von vier Transformationen wurden mit obiger Methode untersucht, und es wurde eine Mulde (7E10) identifiziert, die Bindungsaktivität mit mindestens einer der vier K. pneumoniae Serotyp-Platten, die die Kapselserotypen 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 und 55 enthielten, nicht jedoch mit der Kontrollplatte (ohne Bakterien) aufwies. Der Antikörper der 5 Zellinie 7E10 wurde auf weitere inter-Genera Kreuzreaktivität mittels einer Modifikation des Standard-Immunoblot-Verfahrens untersucht. Im speziellen wurde die Kreuzreaktivität auf die Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli und P. aeruginosa untersucht, indem die Bakterien auf eine gegitterte Nitrozellulosepaierscheibe punktförmig aufgebracht wurden und die Scheibe mit den Bakterien mit dem erwähnten Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktionen mit einem 70 alkalische-Phosphatase/Nitroblau-Tetrazolium Enzymsystem entwickelt wurden.

Aus diesen Versuchen ergab sich, daß der Antikörper 7E10 weitere inter-Genera Kreuzreaktivität aufweist. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Spezies und Serotypen: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes K2, 8, 11, 12, 13, 21,26, 29, 30, 33, 42, 68, 69 04,12 klinisch isoliert

Der menschliche monoklonale Antikörper 7E10 wies somit inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Bakterien auf, die den Genera K. pneumoniae, S. marcescens und E. aerogenes angehören. 2. Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers 7E10 wurde mittels eines ELISA-Verfahrens ähnlich den in Beispiel I beschriebenen Spezifitäts-Tests bestimmt, außer daß die Antigenplatte einen Pool von PLL (Poly-L-Lysin) immobilisierten K. pneumoniae K8 und K11 Serotypen enthielt. Eine positive Reaktion des monoklonalen Antikörpers 7E10 zeigte sich mit K. pneumoniae Serotypen nur mit dem anti-lgM Reagens, woraus sich ein IgM-lsotyp für den monoklonalen Antikörper ergibt. Es ist für den Fachmann 25 offensichtlich, daß bei mehrfacher Wiederholung des oben angeführten Verfahrens und darauffolgender Bestimmung der Isotypen der so erhaltenen, inter-Genera kreuzreaktiven monoklonalen Antikörper zusätzliche, z.B. IgM und IgG Isotypen gefunden würden. 3. Die funktionelle Wirksamkeit in vitro des monoklonalen Antikörpers 7E10 wurde untersucht in einer Opsono-Phagozytose-Bestimmung, die die bakteriozide Wirksamkeit des Antikörpers in Anwesenheit und 30 in Abwesenheit humaner Neutrophiler und humanen Komplements verglich. Die hier verwendeten Bakterien-Serotypen wurden nur in Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers 7E10, einer aktiven Komplement-Quelle und menschlichen Neutrophilen inaktiviert (Tabelle 8). Bei Wiederholung des Versuchs mit verschiedenen nicht mit 7E10 reaktiven bakteriellen Serotypen zeigte sich keine Zerstörung der Bakterien (Daten nicht angeführt), woraus sich die funktionelle Spezifität des monoklonalen Antikör-35 pers 7E10 und seine Kapazität zur Opsonisierung der Bakterien und zur Förderung der Phagozytose ergab.

Tabelle 8 40 45 50

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der eingegebenen Bakterien S. marcescens 012 + 7E10 -a 0 S. marcescens 012 + 6F11b + 0 S. marcescens 012 - 7E10 + 0 S. marcescens 012 + 7E10 + 86 % K. pneumoniae K8 und K11 + 7E10 - - 0 K. pneumoniae K8 und K11 + 6F11 + 0 K. pneumoniae K8 und K11 - 7E10 + 0 K. pneumoniae K8 und K11 + 7E10 + 94% E. aerogenes isoliert + 7E10 - 0 E. aerogenes isoliert + 6F11 + 0 E. aerogenes isoliert - 7E10 + 0 E. aerogenes isoliert + 7E10 + 60 % 3 und b = siehe Fußnoten bei Tabelle 3 26 55

AT 398 781 B

Beispiel VI

Beispiel VI zeigt Verfahren zur Herstellung und Auswahl eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Genera Serratia marcescens und Klebsiella pneumo-5 niae aufweist. Außerdem zeigt dieses Beispiel die in vitro opsonisierende Wirkung dieses Antikörpers gegen homologe S. marcescens und K. pneumoniae Serotypen. Das Verfahren von Beispiel I (im wesentlichen wie beschrieben in Teil A bis G) wurde wiederholt, außer daß es notwendig war, gewisse Modifikationen zur Charakterisierung und Bestimmung des in diesem Beispiel beschriebenen Antikörpers durchzuführen. Im folgenden werden die Änderungen in den Bestimmungsverfahren und die mit dem hier beschriebenen io monoklonalen Antikörper erzielten Ergebnisse beschrieben. 1. Die überstehenden Kulturflüssigkeiten von vier Transformationen wurden mit obiger Methode untersucht, und es wurde eine Mulde (8C9) identifiziert, die Bindungsaktivität mit mindestens einer der vier K. pneumoniae Serotyp-Platten, die die Kapselserotypen 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 und 55 enthielten, nicht jedoch mit der Kontrollplatte (ohne Bakterien) aufwies. Der Antikörper der 75 Zellinie 8C9 wurde auf weitere inter-Genera Kreuzreaktivität mittels einer Modifikation des Standard-Immunoblot-Verfahrens untersucht. Im speziellen wurde die Kreuzreaktivität auf die Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli und P. aeruginosa untersucht, indem die Bakterien auf eine gegitterte Nitrozellulosepaierscheibe punktförmig aufgebracht wurden und die Scheibe mit den Bakterien mit dem erwähnten Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktionen mit einem 20 alkalische-Phosphatase/Nitrobläu-Tetrazolium Enzymsystem entwickelt wurden.

Aus diesen Versuchen ergab sich, daß der Antikörper 8C9 weitere inter-Genera Kreuzreaktivität aufweist. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Spezies und Serotypen: K. pneumoniae S. marcescens K5, 6, 7, 14,27, 36, 55, 64 03

Der menschliche monoklonale Antikörper 8C9 wies somit inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Bakterien auf, die den Genera K. pneumoniae und S. marcescens angehören. 2. Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers 8C9 wurde mittels eines EUSA-Verfahrens ähnlich den in Beispiel I beschriebenen Spezifitäts-Tests bestimmt, außer daß die Antigenplatte einen Pool von PLL (Poly-L-Lysin) immobilisierten K. pneumoniae K14 und K27 Serotypen enthielt. Eine positive Reaktion des monoklonalen Antikörpers 8C9 zeigte sich mit K. pneumoniae Serotypen nur mit dem anti-lgM Reagens, woraus sich ein IgM-lsotyp für den monoklonalen Antikörper ergibt. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß bei mehrfacher Wiederholung des oben angeführten Verfahrens und darauffolgender Bestimmung der Isotypen der so erhaltenen, inter-Genera kreuzreaktiven monoklonalen Antikörper zusätzliche, z.B. IgM und IgG Isotypen gefunden würden. 3. Die funktionelle Wirksamkeit in vitro des monoklonalen Antikörpers 8C9 wurde untersucht in einer Opsono-Phagozytose-Bestimmung, die die bakteriozide Wirksamkeit des Antikörpers in Anwesenheit und in Abwesenheit humaner Neutrophiler und humanen Komplements verglich. Die hier verwendeten Bakterien-Serotypen wurden nur in Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers 8C9, einer aktiven Komplement-Quelle und menschlicher Neutrophiler inaktiviert (Tabelle 9). Bei Wiederholung des Versuchs mit verschiedenen nicht mit 8C9 reaktiven bakteriellen Serotypen zeigte sich keine Zerstörung der Bakterien (Daten nicht angeführt), woraus sich die funktionelle Spezifität des monoklonalen Antikörpers 8C9 und seine Kapazität zur Opsonisierung der Bakterien und zur Förderung der Phagozytose ergab. 50 27 55

AT 398 781 B

Tabelle 9

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der eingegebenen Bakterien S. marcescens 03 + 8C9 -a 0 S. marcescens 03 + 6F11b + 0 S. marcescens 03 - 8C9 + 0 S. marcescens 03 + 8C9 + 70 % K. pneumoniae K14 und 27 ·+· 8C9 - 0 K. pneumoniae K14 und 27 + 6F11 + 0 K. pneumoniae K14 und 27 - 8C9 + 0 K. pneumoniae K14 und 27 + 8C9 + 93% a und b = siehe Fußnoten bei Tabelle 3

Beispiel VII

Beispiel VII zeigt Verfahren zur Herstellung und Auswahl eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Genera Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes und Enterobacter cloacae aufweist. Außerdem zeigt dieses Beispiel die in vitro opsonisierende Wirkung dieses Antikörpers gegen homologe S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes und E. cloacae Serotypen. Das Verfahren von Beispiel I (im wesentlichen wie beschrieben in Teil A bis G) wurde wiederholt, außer daß es notwendig war, gewisse Modifikationen zur Charakterisierung und Bestimmung des in diesem Beispiel beschriebenen Antikörpers durchzuführen. In folgenden werden die Änderungen in den Bestimmungsverfahren und die mit dem hier beschriebenen monoklonalen Antikörper erzielten Ergebnisse beschrieben. 1. Die überstehenden Kulturflüssigkeiten von vier Transformationen wurden mit obiger Methode untersucht, und es wurde eine Mulde (1E4) identifiziert, die Bindungsaktivität mit mindestens einer der vier K. pneumoniae Serotyp-Platten, die die Kapselserotypen 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 und 55 enthielten, nicht jedoch mit der Kontrollplatte (ohne Bakterien) aufwies. Der Antikörper der Zellinie 1E4 wurde auf weitere inter-Genera Kreuzreaktivität mittels einer Modifikation des Standard-Immunoblot-Verfahrens untersucht. Im speziellen wurde die Kreuzreaktivität auf die Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli, E. cloacae und P. aeruginosa untersucht, indem die Bakterien auf eine gegitterte Nitrozellulosepaierscheibe punktförmig aufgebracht wurden und die Scheibe mit den Bakterien mit dem erwähnten Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktionen mit einem alkalische-Phosphatase/Nitroblau-Tetrazolium Enzymsystem entwickelt wurden. ' Aus diesen Versuchen ergab sich, daß der Antikörper 1E4 weitere inter-Genera Kreuzreaktivität aufweist. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Spezies und Serotypen: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes E. cloacae K1, 3, 8, 9,13,15, 29, 31, 33, 36, 68, 69 015 klinisch isoliert klinisch isoliert

Der menschliche monoklonale Antikörper 1E4 wies somit inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Bakterien auf, die den Spezies K. pneumoniae, S. marcescens, E. cloacae und E. aerogenes angehören. 2. Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers 1E4 wurde mittels eines ELISA-Verfahrens ähnlich den in Beispiel I beschriebenen Spezifitäts-Tests bestimmt, außer daß die Antigenplatte einen Pool von PLL (Poly-L-Lysin) immobilisierten K. pneumoniae K3 und K8 Serotypen enthielt. Eine positive Reaktion des monoklonalen Antikörpers 1E4 zeigte sich mit K. pneumoniae Serotypen nur mit dem anti-lgM Reagens, woraus sich ein IgM-lsotyp für den monoklonalen Antikörper ergibt. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß bei mehrfacher Wiederholung des oben angeführten Verfahrens und darauffolgender Bestimmung der Isotypen der so erhaltenen, inter-Genera kreuzreaktiven monoklonalen Antikörper zusätzliche, z.B. IgM und IgG Isotypen gefunden würden. 3. Die funktionelle Wirksamkeit in vitro des monoklonalen Antikörpers 1E4 wurde untersucht in einer Opsono-Phagozytose-Bestimmung, die die bakteriozide Wirksamkeit des Antikörpers in Anwesenheit und in Abwesenheit humaner Neutrophiler und humanen Komplements verglich. Die hier verwendeten 28

AT 398 781 B

Bakterien-Serotypen wurden nur in Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers 1E4, einer aktiven Komplement-Quelle und menschlicher Neutrophiler inaktiviert (Tabelle 10). Bei Wiederholung des Versuchs mit verschiedenen nicht mit 1E4 reaktiven bakteriellen Serotypen zeigte sich keine Zerstörung der Bakterien (Daten nicht angeführt), woraus sich die funktionelle Spezifität des monoklonalen Antikörpers 5 1E4 und seine Kapazität zur Opsonisierung der Bakterien und zur Förderung der Phagozytose ergab.

Tabelle 10 10 Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der eingegebenen Bakterien S. marcescens 015 + 1E4 -a 0 S. marcescens 015 + 6F11b + 0 S. marcescens 015 - 1E4 + 0 15 S. marcescens 015 + 1E4 + 86 % K. pneumoniae K3 und 29 + 1E4 - 0 K. pneumoniae K3 und 29 + 6F11 + 0 K. pneumoniae K3 und 29 - 1E4 + 0 K. pneumoniae K3 und 29 + 1E4 + 80% 20 E. aerogenes isoliert (2) + 1E4 - 0 E. aerogenes isoliert (2) + 6F11 + 0 E. aerogenes isoliert (2) - 1E4 + 0 E. aerogenes isoliert (2) + 1E4 + 80 % E. cloacae isoliert + 1E4 - 0 25 E. cloacae isoliert + 6F11 + 0 E. cloacae isoliert - 1E4 + 0 E. cloacae isoliert + 1E4 + 80% a und b = siehe Fußnoten bei Tabelle 3

Beispiel VIII

Beispiel VIII zeigt Verfahren zur Herstellung und Auswahl eines menschlichen monoklonalen Antikör-35 pers, der inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Genera Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae und Pseudomonas aeruginosa aufweist. Außerdem zeigt dieses Beispiel die in vitro opsonisierende Wirkung dieses Antikörpers gegen homologe S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes und P. aeruginosa Serotypen. Das Verfahren von Beispiel I (im wesentlichen wie beschrieben in Teil A bis G) wurde wiederholt, außer daß es notwendig war, gewisse 40 Modifikationen zur Charakterisierung und Bestimmung des in diesem Beispiel beschriebenen Antikörpers durchzuführen. Im folgenden werden die Änderungen in den Bestimmungsverfahren und die mit dem hier beschriebenen monoklonalen Antikörper erzielten Ergebnisse beschrieben. 1. Die überstehenden Kulturflüssigkeiten von vier Transformationen wurden mit obiger Methode untersucht, und es wurde eine Mulde (9D1) identifiziert, die Bindungsaktivität mit mindestens einer der vier K. 45 pneumoniae Serotyp-Platten, die die Kapselserotypen 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 und 55 enthielten, nicht jedoch mit der Kontrollplatte (ohne Bakterien) aufwies. Der Antikörper der Zellinte 9D1 wurde auf weitere inter-Genera Kreuzreaktivität mittels einer Modifikation des Standard-Immunoblot-Verfahrens untersucht, im speziellen wurde die Kreuzreaktivität auf die Bakterien K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli und P. aeruginosa untersucht, indem die Bakterien auf so eine gegitterte Nitrozellulosepaierscheibe punktförmig aufgebracht wurden und die Scheibe mit den Bakterien mit dem erwähnten Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktionen mit einem alkalische-Phosphatase/Nitroblau-Tetrazolium Enzymsystem entwickelt wurden.

Aus diesen Versuchen ergab sich, daß der Antikörper 9D1 weitere inter-Genera Kreuzreaktivität aufweist. Dieser Antikörper reagierte mit den folgenden Spezies und Serotypen: 29 55

AT 398 781 B K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes P. aeruginosa E9, 13, 15,29,33 03, 9,15,18 klinisch isoliert F6

Der menschliche monoklonale Antikörper 9D1 wies somit inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Bakterien auf, die den Spezies K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes und P. aeruginosa angehören. 2. Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers 9D1 wurde mittels eines ELISA-Verfahrens ähnlich den in Beispiel I beschriebenen Spezifitäts-Tests bestimmt, außer daß die Antigenplatte einen Pool von PLL (Poly-L-Lysin) immobilisiertem K. pneumoniae K13 Serotyp enthielt. Eine positive Reaktion des monoklo-10 nalen Antikörpers 9D1 zeigte sich mit K. pneumoniae Serotypen nur mit dem anti-lgM Reagens, woraus sich ein IgM-lsotyp für den monoklonalen Antikörper ergibt. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß bei mehrfacher Wiederholung des oben angeführten Verfahrens und darauffolgender Bestimmung der Isotypen der so erhaltenen, inter-Genera kreuzreaktiven monoklonalen Antikörper zusätzliche, z.B. IgM und IgG Isotypen gefunden würden. 75 3. Die funktionelle Wirksamkeit in vitro des monoklonalen Antikörpers 9D1 wurde untersucht in einer

Opsono-Phagozytose-Bestimmung, die die bakteriozide Wirksamkeit des Antikörpers in Anwesenheit und in Abwesenheit humaner Neutrophiler und humanen Komplements verglich. Die hier verwendeten Bakterien-Serotypen wurden nur in Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers 9D1, einer aktiven Komplement-Quelle und menschlicher Neutrophiler inaktiviert (Tabelle 11). Bei Wiederholung des Ver-20 suchs mit verschiedenen nicht mit 9D1 reaktiven bakteriellen Serotypen zeigte sich keine Zerstörung der Bakterien (Daten nicht angeführt), woraus sich die funktionelle Spezifität des monoklonalen Antikörpers 9D1 und seine Kapazität zur Opsonisierung der Bakterien und zur Förderung der Phagozytose ergab.

Tabelle 11 25 30 35 40 45

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der eingegebenen Bakterien S. marcescens 03 + 9D1 -a 0 S. marcescens 03 + 6Fl1b + 0 S. marcescens 03 - 9D1 + 0 S. marcescens 03 + 9D1 + 87 % K. pneumoniae K13 + 9D1 - 0 K. pneumoniae K13 + 6F11 + 0 K. pneumoniae K13 - 9D1 + 0 K. pneumoniae K13 + 9D1 + 50 % E. aerogenes isoliert (2) + 9D1 - 0 E. aerogenes isoliert (2) + 6F11 + 0 E. aerogenes isoliert (2) - 9D1 + 0 E. aerogenes isoliert (2) + 9D1 + 70 % P. aeruginosa F6 + 9D1 - 0 P. aeruginosa F6 + 6F11 + 0 P. aeruginosa F6 - 9D1 + 0 P. aeruginosa F6 + 9D1 + 75 % a und b = siehe Fußnoten bei Tabelle 3

Beispiel IX

Beispiel IX zeigt Verfahren zur Herstellung und Auswahl eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der inter-Genera Kreuzreaktivität gegen Mitglieder der Spezies Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Escherichia coli (E. coli) und Serratia marcescens (S. marcescens) aufweist. Außerdem zeigt dieses Beispiel die in vivo Schutzwirkung dieses Antikörpers gegen potentiell tödliche Infektionen mit homologen P. aeruginosa, E. coli und S. marcescens Serotypen. Das Verfahren von Beispiel I (im wesentlichen wie beschrieben in Teil A bis G) wurde wiederholt, um einen menschlichen monoklonalen Antikörper zu erzeugen, der gegen Infektionen kreuzprotektiv war, die durch Bakterien, mit denen er bindet, verursacht wurden. Spezifische Modifikationen des Verfahrens aus Beispiel I zur Charakterisierung und Bestimmung 30

AT 398 781 B des Antikörpers werden in diesem Beispiel beschrieben. Im folgenden werden die Änderungen in den Bestimmungsmethoden und die mit dem monoklonalen Antikörper erzielten Ergebnisse beschrieben. 1. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden untersucht auf die Anwesenheit von anti-P. aeruginosa Antikörpern unter Verwendung eines ELISA Verfahrens wie in Beispiel I beschrieben. Die Antigenplatte bestand aus einer Flachboden Immunolon 2 Mikrotiterplatte mit 96 Mulden (Dynatech, Alexandria, VA), deren Mulden eine Mischung von Poly-L-Lysin (PLL)-immobilisierten Bakterien enthielten, die den sieben P. aeruginosa Fisher Vergleichsstämmen angeh orten (Fisher M.W. et al., J.of Bacteriology 98, 835-836 (Ϊ969), ATCC Nr. 27312-27318).

Die überstehenden Kulturflüssigkeiten einer Transformation wurden nach obigem Verfahren analysiert und ergaben die Identifizierung einer Mulde, die auf der P. aeruginosa-Platte Aktivität zeigte, nicht jedoch auf der PLL Kontrollplatte. In darauffolgenden ELISA-Tests mit den siebzehn einzelnen P. aeruginosa Serotypen, die dem International Antigenic Typing Scheme (IATS, ATCC Nr. 33348-33364)-angehören, zeigte sich, daß eine Mulde 9C3 Antikörper enthielt, die mit dem IATS Serotyp Typ 1 banden (Liu P.V., lnt.J.Syst.Bacteriol. 33, 256-264 (1983); wird hier als Bezugsstelle angeführt).

Aus diesem Versuch wurde somit eine geklonte transformierte menschliche Zellinie erhalten, die kontinuierlich (unsterblich) ist und einen einzigen menschlichen monoklonalen Antikörper sezerniert, der mit einer Determinante auf der Oberfläche von P. aeruginosa IATS Typ 1 bindet.

Vor der Einreichung des vorliegenden Patentansuchens wurde die kontinuierliche transformierte menschliche Zellinie, als 9C3 identifiziert, bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter ATCC Nr. CRL 9239 deponiert. 2. Der Antikörper aus der geklonten Zellinie 9C3 wurde auch auf Kreuzreaktivität gegen gramnegative und grampositive Bakterien mittels einer Modifikation des Standard Immunoblot Verfahrens untersucht. Im speziellen wurde die Kreuzreaktivität auf die Bakterien E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E cloacae, Hemophilus influenzae und Staphylococcus aureus untersucht, indem die Bakterien auf eine gegitterte Nitrozellulosepaierscheibe punktförmig aufgebracht wurden und die Scheibe mit den Bakterien mit dem 9C3 Antikörper zur Reaktion gebracht und die Antikörper-Reaktionen mit einem aikalische-Phosphatase/Nitroblau-Tetrazolium Enzymsystem (wie in Beispiel I beschrieben) sichtbar gemacht wurden.

Aus diesen Versuchen ergab sich, daß der Antikörper 9C3 mit dem E. coli Serotyp 06 und den S. marcescens Serotypen 012 und 014 bindet. Der menschliche monoklonale Antikörper 9C3 besitzt somit inter-Genera Kreuzreaktivität zwischen den gramnegativen Bakterien, die den spezifischen Serotypen der Spezies E. coli, S. marcescens und P. aeruginosa angehören. 3. Das Ergebnis, daß der monoklonale Antikörper mit verschiedenen bakteriell Genera kreuzreaktiv war ließ vermuten, daß der Antikörper an eine gemeinsame antigene Determinante bindet. Die biochemische Charakterisierung der von dem Antikörper 9C3 erkannten Molekülart wurde mittels Immunoblot Analyse wie in Beispiel I beschrieben durchgeführt. Es zeigten sich Reaktionen in den Deoxycholat-Extrakten reaktiver Serotypen von P. aeruginosa und E coli, nicht jedoch von S. marcescens. Obwohl nicht ganz klar ist, warum der Antikörper 9C3 mit der S. marcescens Zubereitung nicht reagierte, ist es möglich, daß der Antikörper ein Konformations-Epitop erkennt, welches durch die Behandlung mit den Zubereitungen zerstört wurde. Bei den Bakterienextrakten von E. coli und P. aeruginosa schien der Antikörper 9C3 eine Reihe von Moleküleinheiten zu erkennen, die in regelmäßigem Abstand angeordnet waren und auf dem Immunoblot ein leiterartiges Muster verursachten. Dieses Profil stand völlig in Übereinstimmung mit jenem, das bei der Polyacrylamid Gelelktrophorese von LPS in Anwesenheit von SDS beobachtet wird, wo gezeigt werden konnte, daß das von den Banden gezeigte größenheterogene Profil durch eine Population von LPS Molekülen verursacht wird, die sich durch Gewichtsinkremente unterscheiden, die der Zahl der je Molekül vorhandenen O-antigenen Oligosaccharid-Seitenketten äquivalent sind (Pavla E.T. und Makela P.H., a.a.O.; und Goldman R.D. und Leive L., a.a.O.).

Zur weiteren Definierung der molekularen Natur des Antigens wurden die Deoxycholat-Extrakte vor der Elektrophorese mit dem proteolytischen Enzym Proteinase K behandelt (Eberling W., a.a.O.). Die nach der Proteinase K Behandlung beobachteten Immunoblot Muster waren identisch mit jenen, die ohne Behandlung beobachtet wurden und gaben so einen Hinweis darauf, daß das mit dem Antikörper 9C3 reagierende Antigen keine Proteinnatur aufweist. 4. Der Isotyp des monoklonalen Antikörpers 9C3 wurde bestimmt mittels eines ELISA Verfahrens ähnlich den oben beschriebenen Spezifitätstests, außer daß die Antigenplatte PLL immobilisierte P. aeruginosa Fisher Serotyp 4 Bakterien enthielt. Eine positive Reaktion des monoklonalen Antikörpers 9C3 mit dem P. aeruginosa Stamm zeigte sich nur mit dem anti-lgM Reagens, woraus sich ein IgM Isotyp des monoklonalen Antikörpers zeigt. 31

AT 398 781 B 5. Die funktionelle Wirksamkeit in vitro des monoklonalen Antikörpers 9C3 wurde untersucht in einer Opsono-Phagozytose-Bestimmung, die die bakteriozide Wirksamkeit des Antikörpers in Anwesenheit und in Abwesenheit humaner Neutrophiler und humanen Komplements verglich.

Die hier verwendeten Bakterienstämme wurden nur in Anwesenheit des monoklonalen Antikörpers 5 9C3, einer aktiven Komplement-Quelle und menschlicher Neutrophiler abgetötet (Tabelle 12). Bei

Wiederholung des Versuchs mit verschiedenen nicht mit 9C3 reaktiven bakteriellen Serotypen zeigte sich keine Zerstörung der Bakterien, woraus sich die funktionelle Spezifität des monoklonalen Antikörpers 9C3 und seine Kapazität zur Opsonisierung der Bakterien und zur Förderung der Phagozytose ergab. Da die kombinierte Wirkung von Opsoninen (spezifischen Antikörpern) und polymorphkernigen io Leukozyten (Neutrophilen) anscheinend der hauptsächliche Mechanismus der Immunität dieser Bakterienstämme ist, geben diese Daten einen Hinweis darauf, daß der Antikörper 9C3 nach geeigneter Anwendung einen Schutz gegen potentiell tödliche Infektionen mit den hier beschriebenen Bakterienstämmen bieten kann. 15 Tabelle 12 20 25 30

Bakterien Neutrophile Antikörper Komplement % Zerstörung der eingegebenen Bakterien E. coli 06 + 9C3 -a 0 E. coli 06 + 6F11b + 0 E. coli 06 - 9C3 + 0 E. coli 06 + 9C3 + 98 % S. marcescens 014 + 9C3 - 0 S. marcescens 014 + 6F11 + 0 S. marcescens 014 - 9C3 + 0 S. marcescens 014 + 9C3 + 94% P. aeruginosa Fisher 4 + 9C3 - 0 P. aeruginosa Fisher 4 + 6F11 + 0 P. aeruginosa Fisher 4 - 9C3 + 0 P. aeruginosa Fisher 4 + 9C3 + 79% a (-) = hitzeinaktiviertes (56 · C 30 Minuten) menschliches Komplement b (6F11) = überstehende Kulturflüssigkeit, die einen menschlichen monoklonalen IgM-Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa Fisher Typ 2 enthält. 35 6. Um die Schutzcharakteristik des Antikörpers 9C3 zu untersuchen, wurden Schutzstudien am Tier mit mindestens einem Keim von jedem der hier beschriebenen Genera durchgeführt. Für die Untersuchungen zur Schutzwirkung gegen P. aeruginosa Fisher 4 und S. marcescens 014 wurde das Modell der verbrannten Maus verwendet. Für jede bakterielle Infektion wurden weibliche 40 gekreuzte Swiss-Webster Mäuse mit einem Gewicht von 22-25 g in drei Gruppen zu je 7 bis 8 Mäusen eingeteilt. Ein typischer Versuch wurde wie folgt durchgeführt:

Gruppe Bakterien Antikörper A P. aeruginosa F4 9C3 B P. aeruginosa F4 6F11 C P. aeruginosa F2 9C3

Am Tag vor dem Versuch wurde jede Maus rasiert und mit einem Enthaarungsmittel behandelt, um alle Haare auf dem Rücken (Verbrennungsstelle) zu entfernen. Am Versuchstag erhielt jedes Tier in jeden Oberschenkel 0,1 ml einer anästhesierenden Kochsalzlösung, die 0,7 ml 0,85 %iges NaCI, 0,2 ml Xylazin (20 mg/ml) und 0,1 ml Ketamin (100 mg/ml) enthielt, sodaß die Dosis pro Maus 20 mg/kg Xylazin und 180 mg/kg Ketamin betrug. Die anästhesierten Mäuse erhielten mit einer Gasflamme eine Verbrennung dritten Grades von 10 % der gesamten Körperoberfläche in voller Dicke. Sofort nach dem Beibringen der Wunde wurde den Mäusen unter die Verbrennung 0,5 ml verbrauchte Kulturflüssigkeit von 4°C, die den Antikörper enthielt, gemischt mit 5-10 LDso der Bakterien injiziert. Die bakterielle Suspension wurde aus einer Nährlösungskultur in logarithmischer Wachstumsphase zubereitet, aus der die Bakterien abzentrifugiert, zweimal mit PBS gewaschen und wieder in der entsprechenden Konzentration in PBS suspendiert wurden. 32

Claims (8)

1. AT 398 781 B Die Tiere wurden zehn Tage lang beobachtet. Drei bis fünf Tage nach der Infektion waren alle Tiere in Gruppe B (nicht passender Antikörper) und Gruppe C (nicht passender Keim) tot. Im Gegensatz dazu waren alle Tiere, die den Antikörper 9C3 erhalten hatten (Gruppe A) am Leben und symptomfrei (siehe Tabelle 13). 5 Für die Schutzstudien mit E. coli 06 wurden gesunde Swiss-Webster Mäuse (20-22 g) in drei Gruppen zu je zehn Mäusen eingeteilt. Jeder den Antikörper erhaltenden Gruppe wurden 200 ml steriles PBS, das 25 mg gereinigten Antikörper enthielt, intravenös injiziert. Zwei Stunden später wurden alle Tiere intraperitoneal mit 300 ml lebender Bakterien, die 3 LDso des entsprechenden Bakterienstamms enthielten, infiziert (Ergebnisse siehe Tabelle 13). 10 Tabelle 13 Versuch Infiz. Bakterien Antikörper Überleben/Infektion % Überleben 1 P. aeruginosa F4 9C3 6/7 86 % P. aeruginosa F4 6F11a 0/7 0 P. aeruginosa F2b 9C3 0/7 0 2 E. coli 06 9C3 6/10 60 % E. coli 06 6F11 0/10 0 3 S. marcescens 014 9C3 8/8 100% S. marcescens 014 6F11 0/8 0 a der 6F11 Antikörper ist spezifisch auf Pseudomonas aeruginosa Fisher Immuntyp 2 und dient als negativer Kontrollantikörper b P. aeruginosa F2 reagiert nicht mit dem 9C3 Antikörper und dient als nicht spezifischer Kontrollkeim 75 20 Diese Ergebnisse zeigen, daß der menschliche monoklonale Antikörper 9C3 Mäuse vor potentiell 30 tödlichen Infektionen mit Bakterien, die drei gramnegativen Genera angehören, schützen kann. Der inter-Genera kreuzreaktive menschliche monoklonale Antikörper 9C3 bot Schutz mittels überstehender Kulturfiüs-sigkeiten, die den Antikörper enthielten, oder mit gereinigtem Antikörper, gegen Keime, die den gramnegativen Genera E. coli, S. marcescens und P. aeruginosa angehören. Aus dem Vorhergehenden ist es offensichtlich, daß die erfindungsgemäßen Zellinien Zubereitungen 35 menschlicher monoklonaler Antikörper und ihrer Fragmente bieten, die kreuzreaktiv auf und kreuzprotektiv gegen verschiedene bakterielle Spezies, sowohl gramnegative als auch grampositive, sind. Dies erlaubt eine erleichterte Entwicklung prophylaktischer und therapeutischer Zubereitungen, die gegen nosokome und neonatale Infektionen wirksam sein können, welche durch die meisten, wenn nicht alle bakteriellen Genera verursacht werden. Durch Kombination der Antikörper ist es möglich, eine breite Schutzwirkung gegen 40 einen großen Anteil, üblicherweise nicht gegen alle, der klinsch signifikanten Bakterien zu erzielen. Zusätzlich bieten die Zellinien Antikörper, die bei Immunassays und anderen wohlbekannten Verfahren Anwendung finden. Obwohl die vorliegende Erfindung zur näheren Erläuterung und als Beispiel im Detail beschrieben wurde, um sie besser verstehen zu können, ist es offensichtlich, daß gewisse Änderungen und Modifizierun-45 gen innerhalb des Bereichs der beigeschlossenen Ansprüche durchgeführt werden können. Patentansprüche 1. Unsterbliche Zellinie, welche einen menschlichen monoklonalen Antikörper oder bindende Fragmente so davon sezerniert, welche spezifisch kreuzreaktiv sind mit einem Epitop, das einen zugänglichen nicht- Kern-Kohlenhydrat-Anteil umfaßt, der sich auf mindestens zwei Serotypen zweier verschiedener Spezies verschiedener bakterieller Genera findet, wobei diese bakteriellen Spezies mindestens zwei der Spezies Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa und Streptococcus agalactiae Gruppe 55 B sind.
2. 2. Zellinie nach Anspruch 1, bezeichnet als ATCC Nr. CRL 9006, CRL 9007, CRL 9008, CRL 9009 und CRL.9239. 33 AT 398 781 B
3. 3. Ausrüstungssatz zur Verwendung für den Nachweis der Anwesenheit mindestens zweier Angehöriger von Spezies verschiedener bakterieller Genera, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Zubereitung monoklonaler Antikörper umfaßt, die mindestens einen monoklonalen Antikörper, der von einer Zellinie nach Anspruch 1 oder 2 erzeugt wurde, und eine Markierungssubstanz, die ein nachweisbares Signal hervorruft, kovalent an den Antikörper oder an einen zweiten Antikörper, der mit dem erwähnten monoklonalen Antikörper reagieren kann, gebunden, enthält.
4. 4. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, die zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung bakterieller Infektionen verwendet werden kann, gekennzeichnet durch die Züchtung von Zellinien nach Anspruch 1 oder 2, Gewinnung der von der Zellinie produzierten menschlichen, monoklonalen Antikörper oder eines bindenden Fragmentes davon aus dem Kulturmedium und Kombination mindestens zweier Antikörper bzw. Fragmente derselben in vorzugsweise etwa äquimolaren Mengen.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung, die zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung neonataler Sepsis oder Meningitis verwendbar ist, gekennzeichnet durch die Züchtung von Zellinien nach Anspruch 1 oder 2 und Gewinnung und Kombination mindestens zweier menschlicher monoklonaler Antikörper oder bindender Fragmente davon, die spezifisch mit einem nicht-Kern-Kohlenhydrat-Epitop reagieren, welches den Serotypen zweier oder mehrerer bakterieller Spezies verschiedener Genera gemeinsam ist, wobei diese Spezies die Spezies E. coli K1, Neisseria meningitidis und Streptococcus agalactiae Gruppe B sind.
6. 6. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen monoklonalen Antikörpers, der spezifisch kreuzreaktiv ist mit einem nicht-Kern-Kohlenhydrat-Epitop, das sich auf mindestens zwei Serotypen mindestens zweier verschiedener Spezies verschiedener bakterieller Genera findet, gekennzeichnet durch die Züchtung der Zellinien nach Anspruch 1 oder 2 und Gewinnung der Antikörper aus dem Kulturmedium.
7. 7. Verfahren zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper, die spezifisch mit einem nicht-Kern-Kohlenhydrat-Epitop binden können, welches den Serotypen zweier verschiedener bakterieller Spezies gemeinsam ist, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Scheibe umfaßt: Isolierung der B-Zellen von einem Individuum; unsterblich-Machen dieser B-Zellen, um eine Mehrzahl Antikörper-produzierenderKlone zu bilden; Durchsuchen dieser Klone auf die Produktion von Antikörpern, die spezifisch sind auf ein nicht-Kern-Kohlenhydrat-Epitop mindestens zweier verschiedener bakertieller Spezies; und Kultivierung dieser ausgewählten Klone und Ernten der von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen mittels einer EBV-Transfor-mation unsterblich gemacht werden. 34