JP4002187B2 - 抗ふけ菌免疫抗体及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ピチロスポルム オヴァレ（Pityrosporum ovale）に対する免疫抗体及びその用途に係り、より詳しくは、ふけ、脂漏性皮膚炎、アトピーの悪化要因であるピチロスポルム オヴァレ菌に特異な蛋白質を分離し、動物に免疫性を生ぜしめて抗体を形成させ、これを分離してふけ及び脂漏性皮膚炎の治療改善剤として用いることに関するものである。

ピチロスポルム オヴァレは、親油性（Lipophilic）酵母菌の一種であって、正常人の皮膚、特に頭皮に常在する菌叢の一つである。この菌はいろいろな皮膚病と関連があるが、最も代表的なものがふけと脂漏性皮膚炎である。常在性菌叢の中にピチロスポルム オヴァレの比率が７４％を超えれば鱗片、かゆみを同伴するふけ症状が現れ、ピチロスポルム オヴァレの比率が８３％を超えれば脂漏性皮膚炎を招く（Shuster, S.: Br, J. Dematol, 3, 235(1984), McGinley, K. J. et al: J Invest. Dermatol. 64, 40(1975)）ふけの異常な状態でピチロスポルム オヴァレは、丸い胚胞子状態ではなく、菌糸状態に存在するので治療するのが難しく、再発性慢性的状態となる（Mycos 1997: 40 suppll: 29-32）。

このような皮膚状態を改善するために、従来はケトコナゾール（Ketoconazole）や亜鉛ピリチオン（Zinc Pyrithion）、クリムバゾール（Climbazole）などの抗ふけ成分などを用いた製品などが使用されているが、これらはふけ菌（ピチロスポルム オヴァレ）に対する特異性が弱く、他の常在菌まで全部除去する副作用を有する。したがって、脂漏状態の頭皮にむしろ好菌であるふけ菌がさらに高い比率で再定着する可能性がある。

抗体、特に卵黄抗体を用いて病原性微生物を除去した例が何件かある。代表的なものがニキビを予防するための抗ニキビ菌抗体、及びムシ歯菌に対する抗体（大韓民国公開特許公報第１９９７−７３６０７号）があり、また、大韓民国公開特許公報第２０００−４９４９９号には、ヘリコバクタ ピロリ抗原によって免疫化された卵黄抗体を含む卵黄液を発酵乳製造に適用してこれら抗体の力価を維持すると同時に、一般微生物及び酵母の汚染を防止するすることができる殺菌方法を開示しており、これに関連した製品は既に市販されている（韓国ヤクルト社）。しかし、皮膚常在菌であるピチロスポルム オヴァレを用いた抗体や製品は今までなかった。

本発明は、ふけ、脂漏性皮膚炎、アトピーの悪化要因であるピチロスポルム オヴァレ（Pityrosporum ovale）菌だけの特異な蛋白質を分離し、これをもって産卵鶏に免疫性を生ぜしめて卵黄中に形成された抗体を分離してふけ、脂漏性皮膚炎治療改善剤として応用することをその目的とする。

本発明は、ピチロスポルム オヴァレ菌だけの特異な蛋白質を分離し、これをもって産卵鶏に免疫性を生ぜしめて卵黄中に抗体（抗ピチロスポルム オヴァレ免疫グロブリンＹ）を形成することに関する。

本発明を従来の技術と比較して要約すれば、ふけ、脂漏性皮膚炎、アトピー性皮膚炎などを誘発、悪化させる頭皮や皮膚に常在している菌を抑制したり、菌から分泌した酵素を不活性化するピチロスポルム オヴァレの抗体製造技術を利用している。抗体はそれ自体が天然物質であるので、既存の前記皮膚疾患治療剤として使用していたホルモン及び抗生剤などに比べてほとんど副作用がなく、安全な予防及び治療剤になることができる。

本発明の抗体製造方法は、次の４段階で構成される。
１。抗原の製造
２。産卵鶏に兔役性を生ぜしめ、抗ピチロスポルム オヴァレ抗体（免疫グロブリンＹ）が含まれている卵黄の製造
３。ＩｇＹ（免疫グロブリンＹ）の分離
４。ピチロスポルム オヴァレに対するＩｇＹを使用した組成物の製造

本発明は、ふけを誘発するピチロスポルム オヴァレを抗原として用いた卵黄抗体を製造し、ピチロスポルム属菌株に対する生育と活動抑制効果を有する抗ふけ組成物を提供することができる。

本発明の抗体は、ピチロスポルム オヴァレを抗原として、これを動物に注入して免疫性を生ぜしめた後、前記動物の血液又は卵より製造される。前記動物は、哺乳動物（例：うさぎ）及び家禽類などがあり、前記家禽類の好ましい例としては、鶏、鴨、七面鳥などであり、より好ましくは産卵鶏である。動物に抗原を注入し、免疫性を生ぜしめて抗体を含む卵を製造する方法は、通常の知識を有する当業者に容易に実施できることである。

本発明の好ましい一例において、抗原は、培養されたピチロスポルム オヴァレ菌の粗抽出物（crude extract）を用いたり、細胞壁成分だけを別に分離して用いることができる。ピチロスポルム オヴァレの細胞壁には、他の酵母類にはない３７ＫＤと６７ＫＤの大きさの特異蛋白質をが有していることが報告された。実際に、この蛋白質に対する単一クローン抗体を用いてこれら菌に対する結合試験を行った結果、９０％以上の高い結合率を示した（Zargari. A et al., Clin Exp Allergy 1997 May 2795）; pp.584-592）。したがって本発明者等は、ピチロスポルム オヴァレ菌の抽出物と細胞壁成分だけを別に分離して抗原として用いた。

家禽の血液には、哺乳類のＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡに相応する免疫グロブリンが各々血清ｍｌ当り５．０ｍｇ、１．２５ｍｇ、０．６１ｍｇが存在し、産卵家禽は母子免疫機能により卵を通じてひなに免疫成分が移行するため、抗体が卵に蓄積されるようになる。この三つの種類の免疫グロブリンのうちのＩｇＧだけが卵黄に存在するが、この抗体を、卵黄から由来するが故に、特にＩｇＹ（Immunoglobulin yolk）といい、ＩｇＹの濃度は卵黄ｍｌ当り約２５ｍｇ程度であって、卵黄に存在する抗体は非常に優れた多クローン抗体であることが知られている。

免疫を生ぜしめた産卵鶏から特異性抗体を得る方法は、他の哺乳動物から抗体を得る既存の方法に比べていくつかの重要な長所を有している。つまり、卵一つは、うさぎ一匹から採血した血に入っている程度と同じ位の約９０乃至１００ｍｇの抗体を有しており、免疫化された鶏から生産された卵は容易に収集することができ、哺乳動物からのように血液を採取する必要がないため、動物保護の次元より、哺乳類に比べてより大きな競争力を有しており、産卵鶏は大量飼育が容易であるので多量の抗体を同時に生産することができる。特に、産卵鶏一羽が１年間生産する卵黄から約４０ｋｇのＩｇＹが得られ、その生産性はうさぎの場合より約１２０倍高いと報告されている。また、家禽類と哺乳類との系統発生学的な差により、家禽のＩｇＹは哺乳動物のＩｇＧと交差反応をしないので、家禽を利用すれば、哺乳類抗原に対して特異性の高いＩｇＹ抗体を生産できるという潜在力を有している。つまり、このような抗原体の製造方法は、一つの卵に抗体機能を保有している均一な抗体の反復生産が可能であるので、抗体製造工程及び製品開発に標準化が可能になるという経済的な利点を有する。本発明では前記の菌株を抑制できる抗体を含有した卵を組成物の有効成分として用いることにその特徴がある。

本発明による抗原は、動物に筋肉注射、皮下注射、静脈注射、腹腔内注射又は経口投与などの方法で注入することができ、好ましい方法は筋肉注射である。抗原の１回注入量は、抗原の蛋白質量に換算した場合１０μｇ乃至１ｍｇが使用可能であるが、動物の状態や条件によって異なるように適用できる。また、抗原の投与は、卵の卵黄中に現れる特異な抗体（対応した抗原に対して特異な結合活性を有する抗体）量の推移を酵素免疫測定法などの方法で検査して、抗体量が最大値になるまで繰り返して注入する。

本発明の抗体は、前記免疫化された卵から通常の抗体分離方法によって分離されることができる。また、前記卵を粉末、乾燥して抗体として用いることができ、全卵粉末、卵黄粉末又は黄身の水溶性蛋白質化粉末でもよい。また、本発明により生産された卵黄から抗体だけを分離することができ、分離した抗体を有効性分として含むピチロスポルム オヴァレによる皮膚疾患用薬剤組成物、例えば、ふけ及び脂漏性皮膚炎の治療用組成物として用いることができる。

ピチロスポルム オヴァレの卵黄抗体の抗ふけ効果、抗脂漏性皮膚炎予防効果、アトピー皮膚改善効果などを検査するために、シャンプーと皮膚外用剤を製造して、ふけや脂漏性皮膚炎及びアトピーのある人を対象として実験をした。その結果、本発明によるふけを誘発するピチロスポルム オヴァレに対する卵黄抗体はピチロスポルム属菌株に対する生育と活動抑制効果を示し、有効な抗ふけ及び脂漏性皮膚炎組成物として使用できることがわかった。

下記の実施例により本発明をより詳細に説明するが、下記の実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明の保護範囲が下記の実施例に限定されるわけではない。

実施例１：菌体の培養
ピチロスポルム オヴァレ菌体は、Brucella broth(difco)培地に抗生剤（Skirrow’s supplement）を添加し、若干の滅菌オイルを分注して３７℃の条件で３〜４日間培養した。

実施例２：超音波処理菌の抗原物質の製造
ピチロスポルム オヴァレ抗原を分離するために用いられた菌株は、遺伝工学研究所内の遺伝子銀行より凍結乾燥されたものを購入して使用した。ピチロスポルム オヴァレは、Brucella broth(difco)培地に抗生剤（Skirrow’s supplement）を添加し、若干の滅菌オイルを分注した培地を用いて培養した。培養された菌体は３、０００×ｇで遠心分離して菌体を回収した後、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。超音波で菌体を破砕した後、１０、０００×ｇで１５分間遠心分離して破砕されていない菌体を除去し、上澄液だけを取り、１００、０００×ｇで３０分間超遠心分離して沈殿させた後、蒸溜水に懸濁して抗原として用いた。

実施例３：細胞壁成分だけの分離
培養された菌体を回収し、リン酸緩衝生理食塩水を用いて３〜５回十分に洗浄した。その後、これを同一液に懸濁した後に超音波で菌体を十分に破砕した。破砕液を多孔性セルロースやナイロンメッシュなどで濾過して不溶性の細胞壁成分を濾過したり、実施例２の方法によって遠心分離された沈殿物を用いた。

実施例４：免疫抗体が含まれた卵黄の製造
抗体生産用産卵鶏（Hy-Line Brown）は、産卵が始まって２１週齢の鶏を用いた。前記実施例２及び３で得られた各々の抗原とFreund’s complete adjuvant(Sigma chemical Co.)を同量混合して乳化し、１ｍｌずつ産卵鶏の足筋肉に注射して１次注射とした。ブースタ注射は、その後２週間隔で実施し、全て６週間（３回）注射した。卵の卵黄に移行した抗体が含まれた免疫卵を回収して、免疫抗体力価と抗原結合力を測定した。

実施例５：生産された免疫卵の卵黄抗体（ＩｇＹ）の抗原結合力の測定
生産された卵黄抗体の効果を直接的に判定してピチロスポルム オヴァレ菌に対する卵黄抗体の抗原反応程度を確認するために、ＥＬＩＳＡ法を使用した。まず、実験に用いられる卵黄抗体の精製は下記の通りである。

卵黄液５ｍｌに同量の蒸溜水５ｍｌを混合し、これに０．１５％のラムダカラギーナン（lamda carageenan）２０ｍｌを混合して常温で３０分間放置した後、３、０００×ｇ、１５分、２０℃の条件で遠心分離して上澄液だけを取った。この上澄液に１９％の硫酸ナトリウム（約３ｇ）を添加して混合した後、常温で４０分間放置した。１０、０００×ｇで１５分間遠心分離して得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液に溶解して、精製された抗体を得た。

その後、１×１０^９cell/ｍｌの濃度に希釈されたピチロスポルム オヴァレ菌１０ｍｌずつを滅菌された５本の試験管に注入した後、二種類のタイプのＩｇＹ（細胞壁成分）を濃度が１２．５、２５、５０、１００ｍｇ/ｍｌになるように添加し、ＩｇＹを添加しないものを対照群とした。添加後、３７℃で振盪培養し、２時間後に１ｍｌずつ採取して６０℃で３０分間熱処理した後、冷蔵保管して実験に用いた。反応程度は下記のＥＬＩＳＡ滴定方法によって測定してその結果は表１に示した。

実験結果は表１に示したように、細胞壁で製造したＩｇＹが高い細胞結合力を示し、２５ｍｇ/ｍｌの濃度で細胞数を半分以下に減らすことができる効果があることが証明された。

ＥＬＩＳＡ滴定方法
（１）蛋白質濃度が５μｇ/ｍｌになるように、各群のピチロスポルム オヴァレをコーティング緩衝液で希釈した後、well当り１００μｌずつ入れ、４℃で４８時間保管
（２）ブロッキング緩衝液を１００μｌずつ入れ、３７℃で２時間反応
（３）洗浄液で３回洗浄
（４）ブロッキング緩衝液で卵黄から分離したＩｇＹを１００μｇ/ｍｌになるように希釈し、well当り１００μｌずつ入れて４℃で一晩放置したり、３７℃で２時間培養
（５）洗浄液で５回洗浄
（６）Goat Ant-chicken IgY-AP Conjugateをブロッキング緩衝液で１：１０００の比で希釈し、well当り１００μｌずつ入れ、３７℃で２時間培養
（７）基質をwell当り１００μｌずつ入れ、３０℃暗所で反応
（８）洗浄液で６回洗浄
（９）１００μｌの停止液を添加
（１０）ＥＬＩＳＡリーダーで読み取り（４０５ｎｍ）

実施例６：生成されたＩｇＹを卵黄から分離する方法
抗ピチロスポルム オヴァレ菌抗体が生成された免疫卵を収集して、卵黄液５ｍｌに同量の蒸溜水５ｍｌを混合し、０．１５％のラムダカラギーナン２０ｍｌをよく混合した後、常温で３０分間放置した。前記混合液を３、０００×ｇ、１５分、２０℃の条件で遠心分離し、上澄液だけを取った。この上澄液に硫酸ナトリウムを添加して最終濃度を１９％とし完全に溶解した後、常温で４分間放置した。その後、１０、０００×ｇで１５分間遠心分離して得られた沈殿物をリン酸緩衝溶液で溶解して精製された抗体を得た。得られた抗体はBCA protein assay reagent kit(Pierce)を用いて全体の蛋白質濃度を測定した。抗体蛋白質（ＩｇＹ）の濃度は、２８０ｎｍで吸光度を測定してＩｇＹ吸光係数１．３３で除して求め、鶏ＩｇＹ（Promega）から求めた標準曲線（standard curve）で補正した。

実施例７：分離された卵黄抗体の抗ふけ菌効果の試験
抗ふけ菌効果は、スキンディスク拡散法（Skin Disc Diffusion Method）で測定した。まず、寒天プレートに試験菌を接種し、ふけ原因菌であるピチロスポルム オヴァレを好気性条件下で３７℃で２日間培養した。スキンディスクペーパーを７０％エタノールで殺菌処理した後、ケトコナゾール、亜鉛ピリチオン、クリムバゾール、サリチル酸、抗ふけ菌ＩｇＹで濃度別に処理した後、スキンディスクペーパーを寒天プレートに乗せ、３７℃で４８時間培養後に阻害領域（Inhibition zone）の大きさを３回反復測定した平均の結果を表２に示した。この阻害領域はディスク（１．２ｃｍ）を含んだクリアゾーンの大きさを示す。

比較サンプルよりはふけ菌の生成抑制効果が小さいが、ＩｇＹの分子量が大きいので同一％濃度で作用モル濃度が小さく、拡散速度が遅い点などを考慮すると、もっと効果があると判断される。

実施例８乃至実施例１１：卵黄抗体を含んだふけ防止シャンプー
以下、本発明の実施例を通じてピチロスポルム オヴァレの卵黄抗体を用いたふけ防止シャンプーを製作して、そのふけ防止効果を確認した。

下記表３に示した通りの組成比率に、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルジエタノールアミド、プロピレングリコール及び本発明によるピロクトンアミン、亜鉛ピリチオン、卵黄抗体を水に添加し、この混合物の温度が６０℃になるまで加温して均一に溶解させた後、４０℃まで冷却した。次に前記混合物に色素、パラオキシ安息香酸エステル、香料及びクエン酸を投入混合した後、室温まで冷却してシャンプー型製剤を製造した。

比較例１乃至比較例３：卵黄抗体を用いないふけ防止シャンプー
本発明によるピチロスポルム オヴァレの卵黄抗体を用いたふけ防止シャンプーと効果を比較するために、前記表３に示されているようなシャンプーを製造した。

実験例１：ふけ防止効果の臨床実験
前記実施例８〜１１及び比較例１〜３のシャンプー製品に対し、ふけ及びかゆみ症状に対する効能効果を次のような試験例によって評価した。

ふけが比較的多い男女４９名を選定し、実施例８〜１１及び比較例１〜３のシャンプー型製剤に対して一ヶ月間実験した。試験開始前に通常のシャンプーで洗髪し、３日間累積されたふけを採集して、採集されたふけの重量と、前記表３に示したシャンプー型製剤組成物で２日に１回ずつ洗髪し、試験終了後の３日間に累積されたふけの重量とを測定した。

この時累積されたふけを真空吸入装置を用いて頭皮から直接採集し、次の式によりふけの減少率を求めた。また、ふけ防止効果は、ふけ減少率が２５％以上である場合にだけ実際に効果があると判定した。

ふけ減少率（％）＝（試験開始前のふけの重量（ｍｇ）−試験開始一ヶ月後のふけの重量（ｍｇ））/試験開始前のふけの重量（ｍｇ）×１００

その試験結果は下記の表４に示した。

実験例２：微生物実験に対するふけ防止効果
前記表３の各シャンプー型製剤をコーンオイル（corn oil）が含まれているワイエム液体培地（Ym broth）に各々５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１及び０．００５重量％添加し、ピチロスポルム オヴァレを１０^５−１０^６ＣＦＵ（Colony Forming Unit）/ｍｌの量で接種して２日間培養した後、最小微生物抑制濃度（MIC, Minimal Inhibitory Concentration）を求めた。その実験結果は下記表５に示した。

Claims (3)

1. ピチロスポルム オヴァレに対する卵黄抗体を有効成分として含むふけ抑制用組成物であって、前記ピチロスポルム オヴァレに対する卵黄抗体は、抗原としてピチロスポルム オヴァレで免疫した産卵鶏の卵黄から分離されたものである、ふけ抑制用組成物。
2. 前記抗原は、ピチロスポルム オヴァレの粗抽出物又は細胞壁成分である、請求項１に記載のふけ抑制用組成物。
3. 前記抗原は、ピチロスポルム オヴァレの細胞壁表面にある３７ｋＤ、又は６７ｋＤの大きさの特異蛋白質である、請求項１に記載のふけ抑制用組成物。