BG98294A - Метод за орално лечение на инфекция причинена отнеliсовастеr - Google Patents

Abstract

С метода се предизвиква защитен имунен отговор у бозайници срещу инфекция, причинена от неliсовастеr, чрез орално приемане на имуногенно ефективно количество от неliсовастеr антиген. Създаден е и състав на ваксина.

Description

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до лечение на стомашна инфекция у бозайници, включително хора. По-специално, изобретението се отнася до метод за лечение на инфекция причинена от Helicobacter у бозайници, включително хора и до състав на ваксина и антитела подходящи за използване при такова лечение.

Предшествуващо състояние на техниката

Инфекцията на стомашния епител на човека причминена от Helicobacter pylori (Н.pylori) е главната причина за развитието на гастрит и язва и може да бъде рисков фактор за развитие на рак'на стомаха (1-3).

Този нежен S-образен грамотрицателен микроорганизъм е извлечен от стомашна тъкан на възрастни и деца с хистологична изява на гастрит или пептична язва. Свидетелство за причинната връзка между Н.pylori и гастродуоденалната болест се открива при изследване на хора - доброволци, гнотобиотични прасета и гризачи, които не са носители на патогени, при които предположението на Кох се доказва чрез причиняване на хистологично потвърден гастрит, следващ поемането На живи микроорганизми (4-11). Въпреки, че е трудна за лечение, когато се постигне радикално излекуване, лежащият в основава й гастрит се разсейва и при пациенти с дуоденална язвена болест процентът на рецидивиране на язвата спада драстично (12).

Въпреки чувствителността на инфекцията към много антимикробни агенти ин витро, ин виво дълготрайно пълно излекуване на установената

Н.ру1 or i инфекция трудно може да се постигне посредством антимикробни средства ( 18) .

Микроорганизмът се открива вътре в мукозната обвивка покриваща стомашния епителий.Това местоположение не позволява да се постигне адекватно антимикробно ниво, когато антимикробните средства се дават орално. Понастоящем повечето авторитети- препоръчват тройна терапия а именно бисмутова сол в комбинация с тетрациклин и метронидазол в продължение на 2-4 седмици. Все пак, ефективността на този или друг хемотерапевтичен режим остава под оптималната.

В момента се знае малко за ролята на мукозната имунна система на стомаха

Разположението на Ig продуциращите клетки в нормална стомашна кухина показва, че IgA плазмените клетки обхващат повече от

80% от цялата популация плазмени клетки. В допълнение броят на плазмените

IgA клетки, намиращи се в стомашната кухина е сравним с дуги мукозни мембрани (25,26). Въпреки, че известен брой изследвания разглеждат нивата на имуноглобулина в различни ендокринни флуиди, няма достъпни данни касаещи концентрацията на имуноглобулини в стомашните секрети. Нещо повече, съществуват само ограничени данни, от инфектирани с Н стомаха течност инфекцията, ефикасни за

C.z зиране с Н възбуждане вор у мишки инфекция за оценка дали така

L тират гри и възпрои

Все пак, pylori IgG нито антителата изкореняването inn и сътр. показват, че .pylori антигени и холерен на силен стомашно-чревен IgA и порчета. Но тъй като те са от Н.pylori и понеже до сега не на защитата при малки животни, които се предполага, че пациенти и/или IgA антитела във взета от след като веднъж е установена нито антибиотиците са много повторно орално имунитоксин предизвиква анти-Н.pylori отго резистентни към съществува модел не е известно защитно.

да се инфекс Н . f е 1 i s (9,10).

реакция.

ефикасно ле образуваните антитела действуват ее и сътр. съобщават за способността зачи, които не са носители на патогени зводимо документират хистологичен гастрит не се съобщава за оценка на защитната

Следователно, остава необходимостта от чение на стомашна инфекция причинена от Н.pylori, по-спе циално у хора. Настоящото изобретение се стреми да задоволи тези нужди.

Техническа същност на изобретението

Кратко описание на изобретението

Сега е намерено изненадващо, че орална имунизация на гостоприемник с Helicobacter антиген, предизвиква образуването на антитела, които действуват защитно срещу остра инфекция причинена от рода Helicobacter микроорганизми. Образуването на такива защитни антитела не може да бъде предсказано въз основа на досегашното ниво на техниката, тъй като преди настоящото изобретение, не съществува модел подходящ за оценка на защитата.

Съгласно един аспект на настоящото изобретение, създаден е метод за предизвикване у гостоприемника-бозай ник защитен имунен отговор срещу инфекция причинена от

Не 1icobacter, който обхваща орално прилагане към приемника на имуногенно ефективно количество от Helicobacterантиген, за да се предизвика защитен имунен отговор.

Съгласно друг аспект на настоящото изобретение, създаден е състав за ваксина съдържащ Не 1icobacter-антиген в количество·ефективно да възбуди човешки защитен отговор при пациенти, заедно с фармацевтичноприемлив носител.

Съгласно друг аспект на изобретението, се осигурява метод за създаване у гостоприемника-бозайник пасивна защита спрямо инфекция причинена от Helicobacter, състоящ се в орално прилагане към гостоприемника на имунологично ефективно количество

Helicobacter - специфично IgA антитяло, което му придава желаната пасивна защита.

Съгласно още един аспект на настоящото изобретение, е създадено H.felis специфично IgA или IgG моноклонално антитяло от мишки.

Съгласно още един, друг аспект на изобретението, създадена е клетъчна линия #71-G -А .

8 фигури

Описание на приложените

Изобретението се описва по-нататък в съответствие с придружаващите го фигури, в които:

Фиг.1 е представена като колонки схеми на титрите в различни серуми и секреции от несъдържащи патогени мишки, след орално имунизиране с лизат от H.felis, заедно моделът с мишки, които не са носители на H.felis, може да се използва, за оценка на концентрацията на защитни антитела след имунизация с H.felis-антиген. Фиг. 1 се отнася до резултатите получени при експерименти с модела с мишки, които не са носители на H.felis. Орално имунизиране по модела с бактериални антигени заедно с холерен ток син има за резултат повишени серумни, стомашни и интестинални тигри на H.felis антителата и защита срещу остра инфекция на стомаха от патогени от H.felis. При експерименталните групи мишки от порода Swiss-Webster, които не носят патогени (Taconic) се имунизират орално 4 или 5 пъти за период от един месец, с по 2-4 mg з^ят.рацентр&фууи<ран лизат от H.felis плюс 10 pg холерен токсин. След това мишките се заразяват орално с по приблизително 10 живи бактерии H.felis. Мишките се убиват и се събират чревните и стомашни секрети както е описано в следващите работни примери. Титрите на анти-H.felis антителата се определят посредством ELISA. Черните плътни колонки във фиг.1 представляват средните титри (± S.D.) от имунизираните мишки, а незапълнените колонки показват средните титри (+ S.D.) от контролните неимунизирани мишки

Резултатите представени графично на фиг.1 са сумирани в Таблица по-долу:

ТАБЛИЦА 1

Титър на антителата (LOG )

Серум	Стомашен	Черва IgA IgG
	IgA	IgG	IgA	IgG
Контроли	3,1	3	0	0	1,6 1,1
Имунизирани	11,8	16,8	2,1	4,25	4,5 . 4,4

Ί

Таблица 1 (продължение)

H.felis инфекция Защита

H.felis (+) H.felis (-)

Контроли 14 4 23% η = 18

Имунизирани 4 13 78% η = 17

От горните резултати може да се види, че при имунизираните мишки се' наблюдава значително по-висок титър на антитела, отколкото при контролните животни.

Фигури 2А и 2В показват резултатите от изследването за доказване на защита срещу инфекция с H.felis, чрез провеждане на експерименти с активна и пасивна имунизация. При експериментите с активна имунизация, след убиване на мишките заразени с H.felis както е описано по-горе във връзка с фиг.1 се извършват стомашни биопсии и пробите се събират. Препаратите от биопсията се изследват за наличие на H.felis чрез бърз уреазен тест и/или културална позитивност описана в следващите работни примери. Фиг. 2А показва резултатите от обединените данни от три опита (п = 18 имунизирани животни и 18 контролни животни). Черните (плътни) колонки представляват заразените имунизирани мишки, а защрихованите колонки - контролните неимунизирани мишки.

Вижда се, че от всичките 17 имунизирани животни само 4 са инфектирани, в сравнение с 14 от 18-те контролни животни. С други думи 78% от имунизираните животни са защитени от инфекцията с H.felis, в сравнение с 23% при неимунизираните животни.

Фактът, че защитата е пряк резултат от IgA антите ла се установява чрез пасивна имунизация на мишки, които не носят патогени, с H.felis - специфични IgA моноклонални антитела и сравнение на получената в резултат защита, с тази показана при мишки, на които не са давани антитела или са им давани неподходящи такива (напр. специфични за вируса на Sendai IgA моноклонални антитела). Резултатите са представени на фиг. 2В.

IgA моноклонални антитела реактивни с H.felis се изолират и субклонират съгласно имунизационния протокол подобно на описания във фиг.1. Асцити съдържащи специфични спрямо H.felis IgA моноклонални антитела получени от клетъчната линия #71-0 А приготвена както е описано в работ5 8 ните примери, или специфични спрямо вируса на Sendai IgA моноклонални антитела или физиологичен разтвор се дават орално на мишки, които не са носители на патогени в момента на инфектиране с H.felis и 4, 8 и 24 часа по-късно.

Седем дни след инфекцията мишките се убиват и стомашните препарати получени чрез биопсия мишки получават специфични към H.felis моноклонални антитела мишки не получават антитела или получават специфични към вируса на Sendai моноклонални антитела). Черните плътни колонки представят мишките, които са получили H.felis специфични моноклонални антитела, а защрихованите колон1 ки представят мишките, които са получили или специфични към вируса на Sendai моноклонални антитела или физиологи чен разтвор (несъдържащ антитела).

Тези резултати показват, че IgA сами защитават срещу инфекция от H.felis на стомашната лигавица.

Наблюдава се също, че орално приемане на H.felis антиген има за резултат значително увеличена концентрация от анти-H.felis IgA антитела както и от IgA антитела. Има много възможни обяснения на този феномен.

Първо, наблюдав а 11 о че холерният токсин може, в някои случаи, да засили двата антиген-специфични IgA и I gG отговори (22).

Второ, изследвания на клетъчния път показват, че лимфоцитите на мезентералния възел са компоненти на мукозната имунна система и могат да пораждат мукозните IgG плазмени клетки които са наблюдавани в стомашната лигавица.

Трето, поне част от наблюдавания стомашен IgG може да бъде резултат от просмукване на серумни антитела в стомашната кухина като вторично омекотява, модерира възпалението наблюдавано както контролните, така и у имунизираните животни.

Горното обсъждане е фокусирано върху употребата на антиген за лечение на инфекция от H.felis. Разбира се ,обаче, че настоящото изобретение не се ограничава

Така в обхвата на настоящото изобретение се включва лечение или профилактика на бозайници, включително хора, срещу инфекция причинена от Н.pylori, при което пациентът се имунизира орално с имунологично ефективно количество от Н.pylori антиген с оглед да се предизвика образуването на защитни антитела срещу патогена Н.pylori. За предпочитане е I-Ι. pylori да се дава заедно с мукозна добавка, например холерен токсин.

Нещо повече, в обхвата на настоящото изобретение се включва пасивната имунизация на бозайници, включително хора, срещу инфекция причинена от Н.pylori. Това се постига чрез орално приложение към пациента на ефективно количество от специфични към И.pylori антитела. За предпочитане, на пациента сс дават орално Н.pylori специфични IgA моноклонални антитела.

Ваксината съгласно изобретението се прилага орално, в количество, което лесно може да бъде определено от специалистите работещи в тази област. Така за възрастни подходящата доза е от порядъка на 10 ng до 10 mg, напр. 50 ng до 5 mg. Подобен обхват ва дозите е приложим за деца.

Както е отбелязано по-горе, подходящата мукозна добавка е холерният токсин. Други, които могат да се използуват са нетоксичните производни на холерния токсин, включително неговите В - субединици и/или конюгати от антиген плюс холерен токсин или неговата В - субединица, микрокапсули или имуностимулиращи комплекси (ISCOM’s) или липозомни или омаломощени живи вектоари като вируси или салмонелни бактерии. Количеството на използваната мукозна добавка зависи от типа на използваната мукозна добавка. Например, когато мукознатг! добавка е холерният токсин, подходящо е той да се използва в количество 5 ng до 50 ng. например 10 ng'до 35 ng. Когато се използва във вид на микрокапсули, използваното количество зависи от количеството употребено за матрицата на микрокапсулата, <за да се достигне желаната дозировка. Това зависи от умението на специалиста от тази област.

Подходящи носители и разредители са ентеросолвентни капсули и/или 0.2N NaHCO и/или физиологичен разтвор

Примери за изпълнение на изобретението

Изобретението се илюстрира по-нататък чрез следва1.1 щите неограничаващи примери.

а) Мишки

Мишките- използвани в експериментите са мишки порода Swiss Webster (на възраст 8 седмици) и са доставени от Taconic (Germantown, N.Y.). Животните, които не са носители на патогенни микроорганизми се поставят в микроизолаторни клетки при условия на стерилност и им се оставя свободен достъп до автоклавирана лабораторна храна и вода. С изключение на случайно изолирани дифтероиди. животните се поддържат в състояние на отсъствие на на имунизационния протокол.

б) Бактериални щамове

Бактерии събрани от образци от стомашна биопсия на котка се идентифицират като H.felis въз основа на морфологията им, оцветяване по Gram и.продуцирането на уреаза, каталаза и оксидаза (9). Организмите се съхраняват в 50%ен буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS). 25% глицерол; 25% загрят серум от телешки зародиш при -70°С. Бактериите използвани в следващите примери се препосяват ин витро два до три пъти след изолирането им.

в) Бактериални антигени '

Използваният щам се инокулира в Columbia агар (Difco, Detroit. MI) съдържащ 7% конска кръв и се инкубира микроаерофилно при 37°С в продължение на 5-7 дни. Организмите се събират в PBS и получената в резултат суспензия се разрушава ултразвук, за да се лизират бактериите при °C, избистря се от клетъчни отломки чрез нискоскоростно центрофугиране и сс филтрира стерилно. Тези хомогРнати от разрушени цели клетки се съхраняват като 100 μΐ аликвотни части при -70 °C докато потрябват за орално имунизиране на животните.

г) Външни мембрани

Външни мембрани се приготвят както е описано (19). Накратко, бактериални суспензии се обработват с по 1 mg рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза (Sigma Chemical, St. Louis) в 0,5 Μ Трис-EDTA буфер (pH 7,8) при 4°C непосредствено преди разрушаването с ултразвук и нискоскоростното центрофугиране както по-горе. Бактерийните обвивки след това се отделят от избистрения лизат чрез ултрацентрофугиране при 150 000 х g в продължение на един час. Външните мембрани се отделят от клетъчните обвивки чрез диференциална солубилизация в натриев н-лаурилсаркозин и се събират посредством ултрацентрофугиране. Получените в резултат . пелети се суспендират в 0,05 М фосфатен буфер (pH 7,0), разделят се на аликвотни части и се съхраняват при -704:. Протеиновата концентрация се определя по метода на Lowry за използване в ELISA (20) .

ПРИМЕР 1

Мишки се анестезират леко чрез i.p. инжектиране на

1,0 mg кетамин преди вътрешностомашна имунизация. След това препаратът от разрушени с ултразвук цели клетки плюс ΙΟμβ холерен токсин (List Biologicalsq Campbell, СА) се суспендира в 0.2 М NaHCO и 0,5 ml от него се вкарват в стомаха на мишката чрез интубация през полиетиленова торбичка, прикрепена към хиподермална спринцовка. Тази процедура се означава като орална имунизация.

За да се изпита възможността за развитие на функ13 ционален имунитет се оценяват три протокола за имунизация.

Протокол 1 се състои от 4 орални имунизации за 1 месец, съдържащи 2 mg H.felis лизат плюс холерен токсин (известна мукозна добавка). Протокол 2 увеличава H.felis до 4 mg за имунизация, плюс холерен токсин и протокол 3 се състои от 5 орални имунизации за 6 седмици, като всяка съдържа по 4 mg от H.felis лизат, плюс холерен токсин. Ако не е отбелязано друго, животните се заразяват 7-10 дни след последната имунизация и се убиват 3-7 дни по-късно.

Събират се следните тъканни течности: серум, стомашен секрет секрет от тънките черва. Тези образци след това се титрират за присъствие на анти-Н.ру1 ori антитела, чрез ензимносвързан имуносорбентен анализ

ELISA)

В допълнение вземат се и препарати от стомашна биопсия за бърз уреазен тест и култивиране.

Инфекцията се дефинира като положителна ако културата или уреазният тест виж по-долу) са положителни. Серум се получава чрез изтичане на кръв от опашната вена и оставяне на кръвта да се съсири при стайна температура. Стомашните и чревни секрети се събират по модификация на процедурата на Elson и сътр.

(21.22). Накратко, стомашният и чревният секрети от мишките се събират отделно. Стомасите и червата се отстраняват и се инжектират с 2,0 ml промивна течност на база полиетилен гликол плюс антипротеазен разтвор. Стомашната промивна течност съдържа трис-буфер, за да се неутрализира стомашната киселинност.

ELISA се извършва както следва. Миши образци се анализират за H.felis -антитела както следва. Полистиренови микротитърни плаки с 96 ямички се покриват с 100 μ 1/ ямичка от подходящ външномембранен протеин (20 mg/ml) в продължение на една нощ при 4“С. Неспецифичните места на свързване се блокират с 1% BSA в PBS в продължение на 90 минути при стайна температура и след това плаките се промиват с 0,1% BSA в PBS . Образците се тестуват двукратно при разреждане от нула до 1:512 000 и по 100 ц1 от всяко разреждане се прибавя във всяка ямичка от покритите с антитела плаки. След последващо инкубиране при стайна температура, в продължение на 90 минути, плаките се промиват три пъти с 0,1 % BSA в PBS и към всяка ямичка се прибавят по 100 μΐ от 1:1000 разреден кози анти-миши IgA ири IgG алкалнофосфатазен конюгат (Zymed, San Francisco. СА) в продължение на 90 минути. След промиване плаките се развиват 1 час с 100 μΐ за ямичка разтвор с концентрация 1 mg/ml р-нитрофенилфосфат в глицинов буфер (pH 9,6). Измерва се абсорбцията при 410 nm във всяка ямичка, като се използва апарат Dynatech MR 700 Microtiter Plate Reader. Титърът на антителата се дефинира като реципрочен на най-голямото разреждане даващо оптическа плътност от 0,05 нагоре сравнен с резултатите от ямички съдържащи антиген, инкубирани с конюгат от антиген, но несъдържащи първичната проба от антитяло (10).

Бързият уреазен тест се извършва както следва. Два образеца от стомашна биопсия по 10 mg мокро тегло от всяка мишка се поставят незабавно в 0,2 mL хранителна среда на Stuart за уреазен тест (28) и се инкубират при стайна температура. Наличието на уреаза се определя по промяната на цвета на хранителната среда от жълто до розово след 4 часа (24).

Културите се получават както следва. Препарати от биопсия на стомашната кухина се хомогенизират и се поставят на плаки с arap Columbia, съдържащ 0.5% овча кръв и се инкубират при 37“С при микроаерофилни условия (уред за генериране на газ от Oxoid Ltd., London, UK). Културата се определя като позитивна ако е видим растежът след 5 дни. Всички изолати се идентифицират като H.felis на база морфология, оцветяване по Gram и продуциране на уреаза, каталаза и оксидаза.

Въпреки малките промени в експерименталната постановка между трите групи, в имунния отговор не се забелязват отчетливи разлики. Така, данните се обобщават и геометричните средни стойности на стомашните прпомивни течности.

промивните разтвори от червата и титрите на серумните антитела от 13 контролни и имунизирани изследвани животни са дадени на таблица 1 и фи г.

разгледани по-горе.

Въпреки, че тези животни са и имунизирани и заразени, титрите на антителата не се различават значително от тези на мишките, които са имунизирани и не са заразени. При тези експерименти титрите на стомашните, чревните и серумните IgA и IgG антитела са зн.ачително по-високи от наблюдаваните у неимунизираните контролни животни. Специфично. има 4-кратно увеличение при стомашния IgA (р=0,001) , 8-кратно увеличения при чревния IgA (р=0,0038) и 350-кратно увеличение при серумния IgA (р=0,0001 ) в сравнение с неимунизираните контролни животни. Подобно, наблюдава се значително повишение на стомашния IgG (р=0,0009), чревния IgG (р=0,0001) и серумния IgG (р=0,0001).

За да се оцени защитата от инфекция причинена от

H.felis, вземат се препарати от стомашна биопсия от всички животни при убиването им и се определят чрез едновременно култивиране и бърз уреазен тест, както е описано по-горе.

В добавка, за да се определи дали контролните животни развиват хронична инфекция и дали имунизираните животни са определено H.felis - отрицателни, се заразяват допълнителен брой имунизирани и контролни животни както по-горе, но не се убиват в продължение на 4 седмици след заразяването. Степента на защита между всички имунизирани групи животни не е забележимо различна.

За да не се изключи възможна инфекция от ниска концентрация. оценката на пробите от стомашната биопсия както за положителен, така и за отрицателен растеж на H.felis не се прави до 5 дни след нанасянето на плаките. От серийните разреждания върху плаките на известен брой (чрез изброяване с хемацитометър) култури от H.felis се наблюдава, че чувствителността на тази крайна точка е приблизително 10 организми.

В по-къдни експерименти, плаките с културите от оиопсията се пазят понякога и повече от 5 дни когато плаките, които остават отрицателни за видим растеж се изстъргват и изследват чрез влажен препарат под микроскоп, понякога могат да се видят изолирани организми със спирална форма.

Идентичността на тези изолирани организми не може да се оп редели и не е определяно дали те са живи

Във всеки случай.

на база резултатите от култивирането на серийните разреждания на H.felis, се счита че пробите от биопсиите, които остават отрицателни за видим растеж след 5 дни съдържат или по-малко бактерии.

ПРИМЕР 2

IgA и Igfr моноклонални антитела специфични за

H.felis се приготвят чрез модификация на метода на Mazanec и сътр. (15). BALB/c мишки получени от Jackson Laboratory (Bar Harbor . Maine ) се имунизират интрагастрално четири пъти, в течение на период от седмици, първият път с 2 mg разрушени с ултразвук цели клетки H.felis плюс

Hg холерен токсин (Sigma Chemical

За последната имунизация холерният токсин не се поставя и мишките получават също венозно впръскване на 2

Три дни по-късно мишките се убиват и mg протеин от H.felis.

техните далачни клетки се хибридизират до клетки на SP2/0 миелома. Клонове по лучени чрез ограничено разреждане се изследват за секреция на анти-Н. f е,1 i s IgA антитела, чрез ензимносвързан имуносорбитен анализ (ELISA). Получената в резултат клетъчна линия идентифицирана като #71-G- А е намерено че е стабилно IgA

8 секретираща хибридома. След многократни субклонирания стабилни IgA и IgG сектори се инжектират интраперитонеално на BALB/c мишки и асцитната течност се събира и избистря.

Клетъчната линия #71-G- А е депозирана от 13 април,

8

1992 и се поддържа в живо състояние в лабораторията на Steven J.Czinn,M.D.,Rainbow Babies and Children’s Hospital, Room 465. Case Western University,2074 Abington Road, Cleveland,Ohio, USA 44106. Достъпа до депозита е възможен за лица определени от Щатската комисия по Патентите и Търговските марки докато трае разглеждането на настоящата заявка и всички ограничения до достъп на обществеността до депозита отпадат безвъзвратно след издаването на патент по настоящото искане.

Клетъчната линия #71-G -А е депозирана в American

8

Type Culture Collection, намираща се на12301 Parklawn Drive, Rockvilleq Maryland 20852, USA, под идентификационен номер #71-G - A . ATCC входящия номер и дата са

8 съответно ...

ПРИМЕР 3

Извършени са изследвания за пасивна имунизация както следва. Асцити съдържащи IgA моноклонални антитела продуцирани от #71-G - А (200 ц1 ) се дават интрагастрално

5 8 едновременно с 10 живи организми. Предварителни изследвания показват, че стомашните IgA титри на животните, които получават единична 200 μΐ доза от моноклонални IgA антитела клонят към нива по-ниски от тези наблюдавани в активно имунизираните животни.на 8 часа. Следователно, в течение на следващите 24 часа се дават три допълнителни дози от МАЬ. Контролните животни се заразяват идентично, но получават или физиологичен разтвор или специфични към вируса на Sendai IgA моноклонални антитела (неподходящи IgA антитела). Една седмица по-късно мишките се убиват, стомашната тъкан се инокулира в Columbia кръвно-агарни плочки и се инкубира 5 дни при 37°С. Инфекцията се определя като позитивна култура или позитивен бърз уреазен тест на Stuart.

За да се изследва дали IgA антителата, отличителният белег на мукозната имунна система биха могли сами по себе си да защитават срещу инфекция от H.felis на стомашната лигавица, се получават H.felis IgA моноклонални антитела както е описано по-горе. Част от тези антитела (#71-G -А )

8 се прилагат орално, пасивно към несъдържащи патогени мишки по време на и след заразяването с H^jfelis. Контролните животни получават или физиологичен разтвор или специфични към вируса на Sendai IgA моноклонални антитела специфични за хемаглутинин-неутраминидаза гликопротеин на вируса на Sendai (16).

Резултатите са представени на Таблица 2

ТАБЛИЦА 2

Оценка на пасивно прилагане на антитела от несъдържащи патогени мишки преди и след заразяване с H.felis

Приложени антитела

Никакви антитела-контроли

Брой мишки

Процент инфектирани

7%

Неподходящи IgA моноклонални 6

IgA-анти-Н.fе 1is моноклонални 7

87%

14%

Специфични към H.felis или вирус на Sendai IgA моноклонални антитела се дават интрагастрално 4 пъти в течение на 24 часа, конкурентно със зараза с 10 живи H.felis. Стомашни биопсии се правят седмица след заразяването и инфекцията се доказва

От 13-те вируса на Sendai чрез култура и/или бърз уразен тест.

контролни животни не получили антитела към

70% се инфектират (фиг.2В). От седемте ек спериментални животни шест са защитени и само 1 (14%) е инфектирано. По Chi Square анализа разликата е значителна (р=0.019).

Сравнение на тигрите на антителата между експерименталните групи се извършва чрез вариантен анализ и защитен Т-тест на Fisher. За защита, отсъствие или присъствие на експериментална инфекция между групите се оценява чрез Chi Square анализ.

Claims (19)

1. ПРЕТЕНЦИИ

   1. Метод за предизвикване у бозайников гостоприемник защитен имунен отговор спрямо инфекция причинена от Helicobacter, характеризиращ се с това, че към гостоприемника се прилага орално имуногенно ефективно количество от Helicobacter антиген, за да се възбуди споменатиязащитен отговор у човека.
2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че Helicobacter антигенът е Н.pylori антиген.
3. 3. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че Helicobacter антигенът е H.felis антиген.
4. 4. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че Helicobacter антигенът се прилага заедно с мукозна добавка.
5. 5. Метод съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че мукозната добавка е холерен токсин.
6. 6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че бозайникът гостоприемник е човек.
7. 7. Състав на ваксина подходяща за лечение на инфекция причинена от Helicobacter, характеризиращ се с това, че съдържа имуногенно ефективно количество от Helicobacter антиген за предизвикване на защитен имунен отговор у бозайник - гостоприемник, заедно с фармацевтичноприемлив носител или разредител.
8. 8. Състав на ваксина съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че съдържа и ефективно количество мукозна добавка.
9. 9. Състав на ваксина съгласно претенция 8, харак- i

   теризиращ се с това, че мукозната добавка е холерен токсин.
10. 10. Ваксина съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че Helicobacter антигенът е Н.pylori антиген.
11. 11. Ваксина съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че Helicobacter антигенът е H.felis антиген.
12. 12. Метод за придаване на бозайник - гостоприемник пасивна защита спрямо инфекция причинена от Helicobacter, характеризиращ се с това, че на гостоприемника се дава орално имунологично ефективно количество от Helicobacter специфични IgA антитела, за да се създаде пасивната защита у гостоприемника.
13. 13. Метод съгласно прпетенция 12. характеризиращ се с това, антителата.са H.felis специфични IgA антитела от мишки.
14. 14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че антителата са H.felis специфични IgA моноклонални антитела от мишки продуцирано чрез клетъчна линия #71-G-A .

    5 8
15. 15. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че бозайникът е човек.
16. 16. H.felis специфични IgA моноклонални антитела от мишки.
17. 17. H.felis специфични IgG моноклонални антитела от мишки.
18. 18. Клетъчна’ линия #71-G-A ^{5 8}
19. 19. Моноклонално антитяло продуцирано от клетъчна линия #71-G-A .