JPS58206532A - 単一クロ−ン性抗体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、広義にを工新規な交雑ａ胞うイン（ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ　）、さらに詳しくは
マウスと人のリンパ球Ｂ細胞、マクロファージおよび活
性化リンパ球Ｔ細胞に見い出される抗原に対する補体固
定単一クローン性（ｍｏｎｏｃｌ○ｎａｌ）抗体の生成
のための交雑細胞ライン、そのように生成された抗体、
および抗体と反応する抗原組成物に関する。

ＫＯｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ両氏は、免疫され
たマウスからの肺細胞とマウス骨髄腫との融合（ｆｕｓ
ｉ○ｎ）により均質ないわゆる単一クローン性の抗体を
つくる細胞ラインを取得できることを証明した（　ｒＮ
ａｔｕｒｅＪ第２５６巻第４９５−４９７頁（１９７５
））。この基本的な技術の提示以来、種々の交雑細胞い
わゆるハイブリドーマ類の生成およびこれらのハイブリ
ドーマ類によりつくられる単一クローン性抗体の基礎的
筒たは応用科学的研究への利用について多くの努力がナ
サれてきた。たとえばり、’Ｅ、ＹｓｉｏｎおよびＭ、
　Ｄ、　５ｃｈａｒｆｆ両氏によるｒ　Ａｎｎｕａｌ　
Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ第５０巻第６５７−６
８０頁（１９８１）およびＥ、Ｄ、５ｅｖｉｅｒ氏等に
よるｒ　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｊ第２７巻第１７９
７〜１８０６頁（１９８１）の各文献ならびにこれら文
献に引用されている文献を参照されたい。これらの文献
はハイブリドーマ類から単一クローン性抗体を生成する
ことによ’）′得られる多くの利点と同時にその操作の
複雑さを示している。一般的技術は概念的にはよく理解
されているが、各特定の場合に多くの困難があり、従っ
てそれを解決するだめの変更が要求される。事実、一定
のハイブリドーマを生成する試験の以前には、所望のハ
イブリドーマが得られるか！うか、仮りにそれが得られ
た場合抗体を生成するかどうか、あるいはまたそのよう
に生成された抗体が所望の特異性をもつかどうかは予測
し難い。成功の程度は、主として、使用する抗原のタイ
プ、免疫方法および所望の・・イブリドーマを単離する
ために使用する選択技術により影響を受ける。

マウス免疫細胞相互作用の鍵は主要組織適合遺伝子複合
体（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔＯｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔ
ｙｃｏｍｐｌｅｘ　、　ＭＨＣ）である。マウスＭＭＣ
は染色体のＨ−’２遺伝子座に存在する。免疫反応の基
幹をなす何種類かの細胞間相互作用は、ＭＨｃ内工内域
領域在する遺伝子に支配される。■領域は更Ｋ　Ｉ−Ａ
　、　　Ｉ−Ｂ　、　Ｉ−工、Ｉ−ＥおよびＩ−Ｃの各
属領域に分かれ、これら属領域の遺伝子は１８抗原（ニ
ーｒｅｇｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅ
ｎ）を発現して免疫応答の制御にきわめて重要な役割を
はたす。本明細書に云う「マウス単一クローン性抗体Ｈ
ＡＫ−７５」は前述した免疫細胞の相互作用を拘束する
免疫細胞抗原と反応する。

ヒトのＩａ抗原はＨＬＡ−ＤＲ抗原（ｎｕｎ＞ａｎ　１
ｅｕＫｏｃｙｔｅａｎｔｉｇｅｎ−Ｄ−ｒｅｌａｔｅｄ
　ａｎｔｉｇｅｎ）と呼ばれる。ヒト訃よびマウスにお
けるこれら抗原の相同性は、それぞれ主要組織適合遺伝
子複合体（ＭＨ’Ｃ）　Ｋ連鎖していること、組織内分
布が非常に類似していること、そして免役反応が類似性
していることから確かめられている。更にまた抗原薄造
のｆヒ学的注状も酷似している。すなわち、分子量３５
．０００〜５５，０（３０（ｒα碩」と呼ばれる〕と２
７、０００〜２９，０００（ｒβ項」と呼ばれるンとの
２つのサブユニットからなり、しかもＮ末端のアミノ酸
配列が同じである。

上述したよりなｆヒ学的性状を有するヒトＨＬＡ７ＤＲ
抗原分子シ工マウスＩ−Ｅ属領域の遺伝子産物に相同で
あると考えられている。しかしながら最近ヒトＨＬＡ−
ＤＲ領域妊もマウスＩ領域と同様に複数の遺伝子座が存
在することが明らかになりつつあり、その解析が試みら
れている。

と）　ＨＬＡ−ＤＲ抗原に対する単一クローン性抗体を
生成する試みはその端緒についたところであってその報
告はほとんどない。

本発明者らは種々研究の結果、Ｈ−２にとＤ領域が同一
であるが免疫応答性を異にする（すなわちＩ領域が異な
る）２つの同系（Ｃｏｎｇｅｎｅｉｃ）　７９７丁なわ
ちマウスＡ、ＴＬ（Ｈ−２ｔｌ　）およびマウスＡ、Ｔ
Ｈ（Ｈ−２ｔ２　）を用い、マウスＡ、ＴＬ　（Ｈ−２
ｔ　１）の牌および胸腺細胞を抗原としマウスＡ、ＴＨ
（Ｈ−２”　）を免疫してその抗原特異性を高めること
に成功した。更にこのように免疫したマウスから肺臓を
とり、その細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドー
マを形成させ、このハイブリドーマを培養して得た培養
上清をヒト末梢単核球およびヒトリンパ球ＢＭ胞株（Ｅ
ＢＶ−Ｗａ　）と反応させ、二重螢光染色法により解析
し、そして反応陽性融合細胞から限界希釈により単一ク
ローン性抗体意生細胞株（クローンＨＡＫ−７５）を得
る方法を確立した。

人間および動物の免疫系に含１れるリンパ球には２つの
主な群が存在する。リンパ球の第１群（骨髄誘導細胞、
すなわちＢ細胞）は抗体を分泌するものである。それら
はへモボイエチン幹細胞から発生するが、そ几らの分化
は胸腺に依存しない。鳥類においてはそれらはパーサ・
オプ・７アブリシウヌ（Ｂｕｒｓａ　ｏｆ　Ｆａｂｒｉ
ｃｉｕｓ）と呼ば几る胸腺に類似する器官において分イ
ヒしている。しかしながら哺乳動物においては同等の器
官がみられず、これらＢ細胞は骨髄で分化すると考えら
れている。リンパ球の第２群（胸腺誘導細胞、すなわち
Ｔ細胞）はやはりへモボイエチン幹細胞から胸腺におい
て分化する。胸腺にある間、分化する細胞は胸腺細胞と
呼ばれる。主熱したＴ細胞は胸腺から出て、組織、リン
−ぞ管および血流の間を循環する。これらＴ細胞は免疫
学的特異性を有し、そして組織移植時のような細胞介在
免役応答において奏効体（、ｅｆ−ｆｅｃｔｏｒ　）細
胞として直接関与する。Ｔ細胞はＢ細胞と異なり液性抗
体を分泌しない。Ｔ細胞は［ヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ　
）　Ｊ、「抑制体（５ｕｐｐｒｅｓ−ｓｏｒ）Ｊおよび
［キラー（ｋｉｌｌｅｒ　）　Ｊ　Ｔ　細胞と呼ばれる
少なくとも３種の亜型に分けられる。

ヘルパーＴｍ胞はＢ細胞の抗体産生を促進し、抑制体で
細胞はＢ細胞の抗体産生を抑制する一万、キラーＴ細胞
は異種細胞を殺す機能を有する。無ガンマグロブリン症
や自己免役疾患はこれらＴ細胞の過剰または欠乏に関連
している。

ちなみにマクロファージ（大食細胞）も同様にヘモポイ
エチン幹細胞に由来し、異物を貧食する一万で抗原をリ
ンパ球に供給し、おお１かに云えば非特異的に免役応答
に関与している。

免疫応答の制御におけるマウスｉ領域の役割は免疫生化
学的にかなりよく理解されているが、ヒトのＨＬＡ−Ｄ
Ｒ領領域関してはわずかにその亜領域と発現する抗原更
にその機能が知られはじめたにすぎない。

本発明の対象たる単一クローン性抗体ＨＡＫ−７５は、
マウスｉ領域の更に詳細な研究、Ｂ細胞とＴ細胞との分
別およびマクロファージの分析のみならず、ヒトリンパ
球亜群、ヒトＨＬＡ−ＤＲ領域、活性化Ｔ＋１１Ｂ胞の
ｒａ抗原およびその免疫生物学的意義を解析するのに碓
めて有用である。１だ、ヒ）　ＨＬＡ−ＤＲ領領域高安
病、重症筋無力症、若年性糖尿病などの自己免疫疾患に
関連していることから、ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗原に対する
単一クローン性抗体は自己免疫疾患の診断そして治療に
用いられる可能性が高い。更に筐たヒ）　ＨＬＡ−ＤＲ
抗原に対する単一クローン性抗体は組織移植の成功度に
影響することが示唆される。

従来のいわゆるポリクローナル抗体（ｐｃｌｙｃｌｏｎ
ａｌａｎｔｉｂｏｄｙ）の製造は、その特異性を高める
ための吸収および精製の工程において、きわめて多くの
困難を伴なう。吸収されかつ精製された抗血清でさえ所
望の抗体以外に多くの不純物を含有する場合が多い。ま
た同一抗原のすべての抗原決定基に対する抗体を含むた
めに各抗原決定基に対する特異的抗体の濃度が低く、特
に交叉反応性の高いヒ）　ＨＬＡ−ＤＲ抗原などの解析
には困難が多い。ノ・イブリドーマの冶養によれば特異
性の高い高純度の単一クローン性抗体が再現曲よく多量
に製造できる。前述のＥ、Ｄ、５ｅｖｉｅｒ氏らの文献
Ｃｒ　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｊ　１１ｇ２７巻第１
７９７−１８０６頁（１９８１）〕は更に先行技術によ
る従来のポリクローナル抗体の欠点および単一クローン
性抗体の利点を記載している。

本発明によれば、Ｈ−２ハブロタイブのマウス牌細胞の
みを特異的に傷害し、マウスＢＭ胞に発現するＩａ抗原
、すなわちＩ−Ａ亜領域遺伝子産物と特異的に反応し、
ヒトＢ細胞、マクロファージ、および活性化Ｔ細胞に発
現し非多型（ｎｏｎ−ｐ○１ｙｚｏｒｐΩｉｃ　）タイ
プでマウスＩ−Ａ産物と相同な抗原講造を有し、Ｔ細胞
の５％以下を傷害し、無籍微細胞ついて見出されない抗
原に対する新規な単一クローン性抗体を生成できる新規
なノ・・イブリドーマ（以下［クローンＨＡＫ−７５Ｊ
と称する）が発見された。更に単一クローン性抗坏弧−
７５は補体を固定する。

このように生成された抗体は、マウスＩ−Ｅ亜領域遺伝
子産物と特異的に反応ししかもヒ）ＥＬＡ−ＤＲ抗原と
交叉反応する先行技術の単一クローン性抗体とは異なる
交叉反応性を示す。本発明の抗体はマウスで＆Ｘ　Ｈ−
２”プロタイプのＩ−Ａ亜領域遺伝子産物に特異的であ
り、ヒトＢ細胞、マクロファージおよび活性化ＴＲＵ胞
の相同な抗原に単一特異性であり、他の免疫グロブリン
を含有しない。

従って、本発明の一つの目的は、リンパ球Ｂ細胞、マク
ロファージおよび活性化Ｔ細胞に発現してマウスＩ−Ａ
亜領域遺伝子産物に相当する抗原に対する抗体髪生成す
るノ・イブリドーマを提供することである。

本発明のさらに別の目的はこれらのノ・イブリドーマを
製造する方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、リンパ球Ｂａ胞、マクロファ
ージおよび活性１１１：Ｔ細胞に発現してマウヌＴ−Ａ
亜領域遺伝子産物に相当する抗原に対する本質的に均質
な抗体を提供することである。

本発明のその他の目的および利点は以下の記載から明ら
かになるでろろう。

前述の目的２よび利点を達成するために不発明によれば
、リンパ球Ｂ＠胞、マクロファージおよび活性化Ｔ細胞
に発現してマウスＩ−Ａ亜領域遺伝子妾物に相当する抗
原に対する新規な抗体を生成する新規なハイブリドーマ
およびこのハイブリドーマにより生成された抗体が提供
される。該ハイブリドーマ自体ｋＬ　Ｋｏｈｌｅｒおよ
びＭｉｌｓｔａｉｎ両氏の方法に一般に従って製造され
る。

マウスＡ、ＴＬ（Ｈ−２−１）の暉および胸腺ａ抱で免
役応答性を異にする同系（ｃｏｎｇｅｎｅｉｃ　）　マ
ウスＡ、ＴＨ（Ｈ，）ｔ２）を免疫した後、免疫したマ
ウスの肺細胞をマウスの骨髄腫ラインからの細胞と融合
し、そして得られたハイブリドーマ類を培養し、得られ
た培養上清をヒト末梢単核球およびヒトリンパ球Ｂ細胞
株（ｌｉ：ＢＷ−Ｗａ　）と反応させ、二重螢光染色法
により解析し、反応陽性融合細胞から限界希釈により単
一クローン性抗体童生株を確定して特性づけた。その結
果、マウスＩ−Ａ亜領域遺伝子竜物に相当する抗原に対
する抗体ＨＡＫ−７５を生成するハイブリドーマ（クロ
ーンＨＡＫ−７５）が得られた。この抗体はリンパ球Ｂ
細胞、マクロファージおよび活性化Ｔ細胞と反応するが
、Ｔ？＃Ｕ胞普たは無籍微細胞と反応しない。二重螢光
染色法により調べると、この抗体ＨＡＫ−７５はヒト、
サル、ヤギ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラットおよび
マウスの肺細胞と反応するが胸腺細胞とは反応しなかっ
た。この広い＠動程に２ける陽性反応は驚くべきもので
あり、この抗体ＨａＫ　−７５の利点を示唆している。

本発明のハイブリドーマを製造する方法をニ一般に次の
工程からなる。

Ａ、　　Ｈ−２にとＤ領域が同一であるが免疫応答性を
異にする２つの同系（ｃｏｎｇｅｎｅｉｃ　）マウスｊ
なゎちマウスＡ、ＴＬ（、Ｈ−２ｔｌ）およびマウスＡ
、　’Ｉｎ（Ｈ−２ｔりを用いろ。１ずマウスＡ、ＴＬ
（Ｈ−２ｔ１　）の膵および胸＃細胞でマウスＡ、ＴＨ
（Ｈ−２”）を免役する。免疫スケジュールそして牌お
よび胸腺細胞の濃度は適当に免役された牌細胞の有効量
を生成するように選択される。マウスＡ、ＴＬ（Ｈ−２
ｔ’　）の牌および胸腺の混含Ｓ胞２Ｘ１０’１面／マ
ウス／注射を用いて初回免疫はｌＸ１０９百日咳ワクチ
ン（ｐ６ｒ−ｔ、ｕｓＳｌｓ　ｖａｃｃｌｎｅ　）と共
に腹腔注射し、次回免疫からは百日咳ワクチアｆｔしに
前記混合細胞２Ｘ１０７個／マウス／注射を用いて７目
間隔で合計１４回免疫を行うことが有効であることがわ
かった。

Ｂ、免役したマウスから肺臓を取り出し、適当な媒体で
牌懸濁液を調製する。約マウス全肺臓当り１１Ｎｔの媒
体で十分である。これらの実験の技術は当業者には知ら
れている。

Ｃ０懸濁した牌細胞を適当な細胞ラインからのマウス骨
髄腫の細胞と適当な融合促進剤の使用により融合する。

牌細胞対骨髄＠細胞の好ましい比は約５＝１である。約
１０８個の牌細胞について０．５〜１．Ｏｄの融合媒体
が適当である。多くのマウスの骨髄腫の細胞ラインは知
られており、そして一般に徨々の寄託機関たとえばザ・
ンーク・インスティチュ、−ト・セル・ディストリビュ
ーション・センター（Ｔｈｅ　Ｂａ１ｋ　Ｉｎ５ｔｉｔ
ｕｔｅＣｅｌｌ　　ＤｉＳｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　　Ｃｅ
ｎｔｅｒ、ＬａＪｏｎａ、　　（７ａｌｉｆｏｒｎｉａ
〕から入手できる。使用する細胞ラインは好葦しくにい
わゆる「薬物抵抗性」型であって、未融合の骨髄腫細胞
が選択した培地中で生存せず、一方交雑細胞が生存する
ように培地を選択する。

最も普通に使用されろのは８−アザグアニン抵抗性の細
胞ラインであり、これは酵素ヒボキサンチンーダアニン
ホスホリボ゛シルトランス７エラーセ（ｈｙｐｏｘａｎ
ｔｈｉｎｅ　−ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂ
ｏ−ｓｙｌ　ｔｒａｌｌｓｆｅｒａｓｅ　）を欠き、そ
れゆえＨＡＴ　（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよ
びチミジン）培地中では生存しない。また使用する骨髄
腫細胞ラインはいわゆる「非分泌」型すなわちそれ自体
抗体を分泌しないことが一般に好ましいが、分泌型も便
用できる。好ましい融合促進剤は平均分子量が１０００
〜４０’００のポリエチレングリコール（商品名ｒ　Ｐ
ＥＧ　１０００　Ｊ　ｈどとして入手できるンが好まし
いが、この分野において升られている他の融合促進剤も
単独または組合せて使用できる。

Ｄ、別の容器内において、未融合の牌細胞、未融合の骨
髄腫細胞および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択的培地で希釈し、未融合の細胞
を死亡させるのに十分な時間（約１週間〕培養する。こ
の限界希釈により統計的に計算して例えば９６大のプレ
ートで各溜め（ｗｅｌｌ　）中に細胞が１〜４個単離す
るようにする。培地は薬物抵抗性（たとえば８−アザグ
アニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞ラインを支持しな
いもの（たとえばＨＡＴ培地ンである。それゆえ、未融
合の骨ｍａＩＩａ胞は死滅する。未融合の牌細胞は非悪
性であるので有限の世代をもつだけであり、ある期間（
約１週間う後、これらの未融合の牌細胞は再生しない。

これに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の悪性をも
ち、そして牌細胞の親の性質によって選択培地中で生存
できるので再生し続ける。

Ｅ、ハイブリドーマを含有する各容器（溜め）中の上清
液をヒト末梢単核球およびヒトＢ細胞株（ＥＢＶ−Ｗａ
　）とそれぞれ反応させ、更に二重螢光染色法により抗
体の生成を検出する。

Ｆ、所望の抗体を生成する反応陽性ハイブリドーマを（
たとえば限界希釈により）選択してクローンに分ける。

いったん所望のハイブリドーマを選択し、クローンに分
けると、所望の抗体は２つの方法の１つで生成させるこ
とができる。最も純粋な単一クローン性抗体は、所望の
ハイブリドーマヲ適当な培地中で適当な長さの時間試験
管内培養し、ついで所望の杭木を上−液から回収するこ
とによって生成される。適当な培地および適当な培養時
間の長さは容易に決定できる。この試験管内技術によっ
て他の特異性の免疫グロブリンを本質的に含マナい単一
特異性単一クローン性抗体を生成する。培地は外来性血
清（だとえば胎児性子牛血清）を含有するので少量の他
の免役グロブリンが存在し得る。この試験管内方法によ
れば単一クローン性抗体を約５０μｇ　／　ｍ／程度の
濃度で生成できる。

非常に高濃度の単一クローン性抗体を生成させるためＫ
は所望のハイブリドーマをマウスに注射する。ハイブリ
ドーマは適当な潜伏時間後、抗体生成の腫瘍を形成し、
その結果宿主マウスの血流および腹膜滲出液（腹水）中
に高濃度の所望の抗体（約５〜２０Ｑ／ｌ１ｌ）が生ず
る。これらの宿主マウスは正常な抗体をも血流および腹
水の中に有するが、これら正常な抗体の濃度は単一クロ
ーン性抗体濃度のわずかに約５％にすぎない。この単一
クローン性抗体の力価ハ高く（１：　ｓｏ、ｏｏｏ以上
の希釈度で活性）、そして特異性免疫グロブリン／非特
異性免疫グロブリンの比が高い（約１／２０）。従って
これらの単一クローン性抗体はその特異性を減すること
なしに希釈するだけで使用できる場合が多い。

実施例１　単一クローン性抗体の生成 Ａ）免疫および体細胞の交雑 マウスＡ、ＴＨ（Ｈ−２ｔ２）　（生後８週間９を同系
（ｃｏｎｇｅｎｅｉｃツマウスＡ、ＴＬ（Ｈ−２ｔ１　
）の牌および胸腺の混合細胞２Ｘ１０７個で腹腔内に百
日咳ワクチンＩ　Ｘ　１０９と共に免疫した。第２回目
の免疫からは百日咳ワクチンを含筐ず同じ条件で１週間
ごとに合計１４回免役した。最終回の免疫から４日後、
マウスから牌を取り出し、そしてステンレヌ鋼の網に組
織を通すことによって単一細胞の＠濁液をつくった。

細胞の融合をＫＯｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ両氏
の方法に従って実施した。牌細胞Ｉ　Ｘ　１０８個を３
５％のポリエチレングリコールｒ　ＰＥＧ２０００　Ｊ
および５％のジメチルヌルホキシトを含むＲＰＭＩ　１
６４０培地１．０Ｍ中におイ”’Ｃ２Ｘ１０７Ｍ＋７）
　？３Ｘ６３Ａｇ８　・６５３骨髄陣細胞と融合した。

この骨桶腫細１ｉｉｌ！に免疫グロブリンＧの軽鎖（ｉ
ｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　）を分泌しない。

Ｂ）ハイブリドーマの選択および成長 細胞の融合後、細胞をＨＡＴ培地中で６７℃において５
％ＣＯ２を使用して培養した。数週間後、ハイブリドー
マを含む培譬液から上清をとり、ヒト末梢単核球および
ヒトＢ細胞株（ＥＢＶ−Ｗａ　）と反応させ、二重螢光
染色法により解析し、反応陽性融合細胞を１５％の胎児
性子牛血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地で供給体（ｆ
ｅｅｄｅｒ　）細胞の存在下に培養し、２度限界希釈法
によりクローンｆヒして単一クローン性抗体産細胞株ク
ローンＨＡＫ−７５を分離した。上記の限界希釈に用い
た培地はＨＡＴを含む場合と含葦ぬ場合との両方を用い
た。

ハイブリドーマの抗坏活性の検索にはヒト末梢単核球と
エプスタイン・バーク・ｆルス（ＥＢ’Ｖ）により形質
変換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　）されたヒトＢ
＃Ｉ胞株（３ＢＶ−Ｗａ　）に対する補体依存性細胞傷
害試験を用いた。試験細胞２　Ｘ　１０６個／ゴの２０
μｔを■プレートにとり、ハイプリドーマ培養上溝漱２
０μｔを加え、３７℃で１５分間反応させた。反応後、
２％の胎児性修生血清を含むＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍａ
ｌ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　）で細胞を１
回洗った。次に補体を供給するために、２倍希釈したウ
サギ血清２０μｔを細胞に加え、３７℃で９０分反応さ
せた（マウスの試験細胞を用いた他の実施例では、ウサ
ギ血清を１０〜１２倍希釈して用い、補体反応時間は３
０分であった）。

補体反応後、細胞を上記と同じ冷ＭＥＭ培地で１回洗い
、トリパンブルー染色により死滅細胞の数を顕微鏡下に
測定した。細胞傷害率（％）を次式により計算した。な
お対照としては正常なマウス血清を用いた。

細胞傷害率（％）＝ １００Ｘ（傷害チ一対照傷害嘱〕÷〔１０〇一対照傷害
チ〕次にクローンＨＡＫ−７５の１Ｘ　１０７個細胞（
０，２Ｍ）を２．６，１０．１４−テトラメチルペンタ
デカン（Ａ１−ｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍ
ｐａｎｙから商品名ｒＰｒ　ｉｓ　ｔｉｎ　ｅ　Ｊで入
手可能ンで予め処理したマウスＢＡＬＢ／Ｃに注射によ
り腹腔内に移植した。これらマウスからの悪性腹水もク
ローンＨＡＫ−７５培養上清と共に後述の実施例にみら
れる特性づけに用いられて同様な結果を得た。凰−クロ
ーン性抗体ＨＡＫ−７５は標準技術によりＩｇＧ２ｂ亜
群であると証明された。

実施例■　単一クローン性抗坏ＨＡＫ−７５の特性づけ
Ａ）マウス牌細胞に対する細胞傷害試験Ｈ−２遺伝子座
ハブロタイブ頌に、ｂ、ｄ、ｆ。

ｒおよびＳのマウスから＋＊をなり出し、常法により牌
細胞薯濁孜をつくり、クローンＨＡＫ−７５の培養上清
液と反応させ、実施例Ｉのように補体依存性ａＩ胞傷害
試験を行った。

試験の＠来、クローンＨＡＫ−７５の培養上溝はＨ−２
遺伝子座にＨ−２にの特性をもつハブロタイブのマウス
牌細胞を特異的に傷害することが判明した。

蔓［また遺伝子座Ｉ領域に対する特異性をみるためにＥ
（−２組み俟えマウスを用いて同様な試験を行った。次
（（柵々のＨ−２ハブロタイブおよびＨ−２組み換えマ
ウス牌細胞に対するクローンＨＡＫ−７５培養上清の補
俸依存性細胞傷害性の試験結果を示す。

第　　１　　表 Ａ、ＴＬ　　ｓ　ｋ　ｋ　ｋ　ｋ　’ｘ　ｄ　４５Ａ、
ＴＨＳ　　　Ｓ　　　Ｓ　　　Ｓ　　　Ｓ　　　Ｓ　　
ｄ　　　（５Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ　ｋ　ｋ　ｋ　Ｋｋ　ｋ　
ｋ　４７Ｂ１０．Ａ　　ｋｋ　ｋ　ｋ　ｋ　ｄｄ　５１
Ｂ１０．Ａ（４ＲＪ　ｋ　’ｙ、　ｂ　ｂ　ｂ　ｂ　ｂ
　５３Ｂ１０．Ａ（５ＲＪ　ｂ　ｂ　ｂ　ｋ　ｋ　ｄ　
ｄ　１１Ｃ５７ＢＬ／６　　　ｂ　　　ｂ　　　ｏ　　
　’Ｏｂ　　　ｂ　　　’Ｄ　　　（５Ｂ１０．Ｓ　　
　　ｓ　　ｓ　　　ｓ　　　ｓ　　　ｓ　　　ｓ　　ｓ
　　　（５Ｂ１０．３（９Ｒ）ｓ　ｓ−ｋ　ｋ　ａ　ｄ
　　６ＢＡＬＢ／Ｃｄ　、まｄｄｄｄｃＬ１７Ｂ１０．
ＲＩＩＩ　　　　ｒ　　　ｒ　　　ｒ　　　ｒ　　　ｒ
　　　ｒ　　　ｒ　　　＜５Ｂ１０．Ｍ　　ｆｆ　ｆ　
ｆ　ｆ　ｆｆ　　８なお添付図面第１図においてはクロ
ーンＨＡＫ−７５の培養上清の種々の希釈率に２ける細
胞傷害性パターンを示す。

上表からも明らかなように、クローンＨＡＫ−７５培養
上清液は、Ｈ−２組み換えマウスＢ１［１，Ａおよびｓ
ｊＯ，ｈ（４Ｒ）の肺細胞に対してはそれぞれ最大限５
１％および５３％の細胞傷害を示したが、同様な組み換
えマウスＣ５７ＢＬ／６、Ｂ１０．ＳおよびＢ１０．５
（９Ｒ）の肺細胞に対してはそれぞれ〈５％、く５％お
よび６％の細胞傷害しか示さず、細胞傷害性はないと判
定された。従って単一クローン性抗体ＨＡＫ−７５はマ
ウスＩ領域の亜領域１−Ａ　。

１−Ｂ　、　　Ｉ−Ｊ　、　　Ｉ−ｇおよびＩ−Ｃのう
ち、ｌ−Ａ亜領域に存在する遺伝子に支配される抗原を
認識することがわかった。

次にリンパ球細胞畦群上の抗原の表現を調べるために、
Ｈ−２にノ・プロタイプのマウスＣ３ＨＡＩ　ｅＮ（表
１）の肺細胞をナイロンウールカラム法ヲ用いて、その
１１通り抜けるＴ細胞分画と吸着されるＢ細胞分画とて
分けた。この方法によるとＢ［胞分画は平均５０％前後
のＢ細胞を含有していた。これら細胞亜群に対する抗体
ＨＡＫ　−７５の細胞傷害試験を同様に行ったところ、
結果として主としてＢ細胞分画に表現されるＴａ（１−
へ亜領域ン抗原に対する抗体であることが明らかとなっ
た。抗体ＨＡＫ−７５はマウスＣ３Ｈ／ＨｅＮの牌由来
Ｔ細胞（ナイロンウールカラム通り抜は分画）とは明確
な反応性を示さなかった（第１図参黒）。

Ｂ）ヒドリン−々球細胞亜群に対する細胞傷害試験 健康な血液提供志願者（５０人、男女、日本人、アジア
人、白人）からへＡ　ＩＪン加ヒト末梢血を得、リンパ
球をＢｏｙｕｍ氏の方法（ｊ３ｃａｎｄ。

Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、Ｊ第２１
巻（ｓｕｐｐｌ、９７）第７７頁（１９６８）］に従い
、フィコール−・・イパツク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａ
ｑｕｅ　）密度勾配遠心分離により単離した。これをナ
イロンウールカラムを用いて、主としてＢｉｆｌＵを含
む分画とＴ細胞を含む分画とに分けた。−万、分別しな
いリンパ球から先ずプラスティックディツシュ（Ｆａｌ
ｃｏｎ　）に付着する細胞を分離した。プラステイツク
デイツンユ非付Ｈａ胞をノイラミニダーセ処理した５％
の羊の赤血球（５ＲＢＣ）でＥ−ロゼツト化した。Ｅ−
ロゼツト化した細胞をフィコール−ハイバックＬ　Ｆｌ
ｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｑｕｅ　）　孜よＶｃＭ層し、遠
心後回収したＥ＋ヘレットを０．１５５モル濃度ＮＨ４
Ｃｌ　（１０Ｍ／１０８ＩｉｆＵ胞）で処理してＴ細胞
を得た。−万、ブラヌテインク非付着細胞を、ｃｈｅｓ
ｓ氏ら〔［Ｊ、工ｍｍｕｎｏ１．　Ｊ第１１３巻第１１
１３頁（１９７４））が記載している方法に準じて、は
プシン処直ウサギ抗ヒト免役グロブリン（抗−Ｆ（ａｂ
’　）２　］コートディツシュで処理し、付着した表面
■ｇ＋（Ｂ）細胞を分離した。

これらヒトリンパ球細胞亜群に対するクローンＨＡＫ−
７５培養上清液の反応結果を他の試験細胞パネルに対す
る反応結果と共に第２表に示す。

第　　２　　表 ナイロンウール吸着細胞１　　　　　　　　３０−７０
ナイロンウ一ル通通細胞１＜５ プラスティックディツシュ吸着細胞　　　　　　　　７
５精製Ｂ細胞２　　　　　　　　　　　　　　５０−６
０精製Ｔ細胞５＜３ （注）１５０個体テストした。

２　　Ｆ（ａｂ）２ウサギ抗ヒト免疫グロブリンでコー
トしたプラスティックディツシュ から回収した。

６　羊の赤血球ロセット形成Ｔ細胞。

＼ 表尺みられるとおり、ナイロンウールカラムを用いて分
別したＢ細胞分画は約６０〜７０％、そしてＴ細胞分画
は５％以下の細胞傷害率を示した。細胞亜群上の表現を
みると、ロ七ット法により得られたＴ細胞では細胞傷害
率６％以下、ブラヌテイツクディッシュ付着細胞（マク
ロファージ）では細胞傷害率７５％、そして表面Ｉｇ”
Ｂａ胞では細胞傷害率５０〜６０％であった。

更にヒトＴ細胞に表現される１ａ抗原とクローンＨＡＫ
　−７５培養上溝液が反応するか否か調べた。

ヒトＴ細胞を他のヒト個体から得られるマイトマイシン
Ｃ処理したリンパ球と混合培養する（Ｃ１ｎｅ−ｗａｙ
　ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ　ＭＬＲ）か、Ｔ細胞を同一個
体から得られるマイトマイシン処理したＢ細胞／マクロ
ファージと６日間混合培養する（　ａｎｔｏｌｏｇｏｕ
ＢＭＬＲ）か、またはＴ細胞をコンカナバリンＡの存在
下で６日１ｉ１５培養することにより幼芽化Ｔ細胞（活
性化Ｔ細胞）を得た。混合培養の全細胞数はＩ　Ｘ　１
０６個、培地は１０％胎児性仔牛血渭および２０　ｍＭ
　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，２）を含むＲＰＭＩ　１６４
０であった。活性ｒヒＴ＃ｌ胞と抗体ＨＡＸ　−７５と
の反応の有無は二重螢光染色法により調べた。混合リン
パ球反応（ｍ１ｘｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）中の全細胞Ｉ　Ｘ　１０６個にク
ローンＨＡＫ−７５培養上屑液６０μｔを刀口え、４℃
で６０分反応させた後、２％胎児性仔牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地で細胞を３回洗い、Ｆ工ＴＣ標識したウサギ抗マ
ウス免ｆｔグロブリン１０μｔを加えて４℃において２
０分間反応させ、上記ＭＥＭ培地で細胞を３回洗った後
、細胞を顕微鏡観察した。活性化Ｔ細胞の１２〜４０優
が反応陽性であった。ワンーウエイアロジエネイツクＭ
ＬＲ培養細胞を経時的に調べたところ、クローンＨＡＫ
−７５抗体に反応する細胞は経時的に増力口し、６日目
にピークに達し２７〜４２％の陽性率であった（第２図
参照〕。

ナ 以上の結果から、クローンＨＡＫ−７５抗体は、主とし
てヒトＢ細胞、マクロファージおよび活性化Ｔ　＆ｌ］
胞上に表現されている非多型（ｎｏｎ−ｐｏｌｙ−ｍｏ
ｒｐｈｉｃ　）抗原構造を認識していることがわ力）つ
た〇 実施例ｍ Δ）単一クローン性抗体ＨＡＫ−７５と反応する可溶化
細胞抗原の解析 ヒ）Ｂ細胞株であるｇＢＶ−Ｗａを、１０％胎児性仔牛
血清を含むＲＰＭＩ　１６４ｏ　珊地で培養し、１Ｘ１
０８個細胞７２−を生理的食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ
　）で洗い、０．５％ノニデートＰ−４０（ＮＰ−４０
）で１５分間４℃で１ｌｉＪ浴比した後、１時間４，０
００　Ｘダの遠心により上清液を得た。この上清孜をレ
ンチイル−レクチンカラム（ｌｅｎｔｉｌ−１ｅｃｔｉ
ｎＣＱｌｌ１ｍｎ）にかけ、０．１モルマ／ノーヌ溶出
分画を得、Ｉａ抗原の濃縮および部分精製を行った。

この分画を０．１％ＮＰ　−４０を含ひＰＢＰに透析し
、その後減圧下にアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）膜で１０
０μｔに濃縮した。可溶化細胞抗原１００μｔをクロラ
ミンＴにより１２５工標識し、セファデックスＧ２５に
よるゲル濾過した後、１２５工標識物をクローンＨＡＫ
−７５培養上溝液から得られた精製抗体と反応させ、更
にウサギ抗マウス免役グロブリンを別えて、間接免役沈
降法により沈降物を得た。この沈降物を可溶１じした後
ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）を含′ｆＪ
１２．５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ゲル
を分切後に＆封油性を測定したところ、分子量３０，０
００（３０Ｋ）と６５，０００（５５Ｋ）の領域に２つ
のピークな現出した。これらのピークはマウスＩ−Ａ亜
領域遺伝子産物のＡＬｔ鎮およびＡβ鎖に相当ｊると考
えられる。ヒトＢ細胞株（ＥＢＶ−Ｗａ　）にラクトー
スペルオキシダーゼ法により１２５丁を標識し、同様に
可溶化した後分析しても同僚な結果な寿た。

−万、ヒトＢ細胞ＥＢＶ−Ｗａ　５　Ｘ　ｉ　０７個を
０．５ｍＣｉ３５Ｂ−メチオニンで７時間標識し、上記
と同様゛に可溶化細胞抗原を調製して間接免役沈降法に
より抗体ＨＡＫ−７５による沈降物を分析するとやはり
同じ分子量の２つのピークが検出された。なお上記実施
例で正常なマウス血清を用いた場合は該ピークは検出さ
ｎなかった（第３図参照）。

現在１で行われている血清学的および生化学的分析で（
エヒトＨＬＡ−Ｄ：Ｒ抗原分子はマウスＩ−Ｅ亜領域遺
伝子産物に相当し、特にマウスのＩａ、７に対する抗体
がヒトＨＬＡ−ＤＲ抗原と交叉反応すると考えられてい
る。実際マウス［Ｂ１０．５（７Ｒ）ｘＡ、ｃＡ）ヲマ
ウスＢ１０．ＨＴ’ｒの牌と胸腺細胞で免疫して得た血
清抗Ｉ−ＥｋＣｋＳｋはマウスＩａ、７と反応し、マウ
スｌ−Ｅ亜領域遺伝子産物に相当すると考えられるヒト
ＨＬＡ−ＤＲ抗原と又又反応丁、る。ヒトＢ細胞ＥＢＶ
−Ｗａρ）ら寿た可溶化細胞抗原を１２５１標識し、１
２５工標識物１０μｔをクローンＨＡＫ−７５培養上浦
液７０μｔで３０分間４℃において処理して反応させた
後、ウサギ抗マウス免疫グロブリンでコートされたセフ
ァロースビーズを用いて反応物を除去した。抗体ＨＡＫ
−７５非反応物に抗１−Ｅｋｃｋｓｋ血清を反応させ、
更にウサギ抗マウス免役グロブリンを加えて沈降物を得
た。対照として、抗体ＨＡＫ−７５非反応物に正常マウ
ス血清あるいはクローンＨＡＫ　−７５培養上溝液を加
えた。この沈降物を可溶化した後、ＳＤＳを含む１２．
５％ポリアクリルアミドゲルで眠気泳動処理しそして放
射活性を測定したところ、分子量２９，０００１．２９
Ｋ）および３４，０００　（３４ＫＪの領域に２つのピ
ークを検出した（第６図参照）。１２５工標識細胞抗原
を抗体ＨＡＫ−７５で処理する以前に、抗Ｉ　−Ｅｋ　
Ｃｋ　３に血清と反応させた沈降物か７らも同様な２つ
のピークが検出された（第５図参照）。

従って単一クローン性抗体ＨＡＫ−７５＆工、マウス１
−Ｅ亜領域遺伝子産物に相当するヒトＨＬＡ−ＤＲ仇原
とは異なり、マウヌｌ−Ａ亜領域遺伝子産物に相当する
ヒトリンパ球細胞亜群に選択的に表現されている抗原を
認識する。

説明の便宜上、リン、ｕ球細胞亜群に表現される抗原に
対する単一の単一クローン性抗体を生成する単一のノ・
イブリドーマについて言及してきたが、不発明はそれら
に限定されるものではない。本発明によれば抗体ＨＡＫ
−７５はマウスの工ρの４つの亜群の一つである亜群工
ｇＧ２１）に属することが決定された。免役グロブリン
Ｇのこれらの亜群は互にいわゆる「固定」領域にお（・
て異なるが、特定の抗原に対する抗体はいわゆる「可変
」領域をもち、この領域は免疫グロブリンＧのどの亜群
にそれが属するかに無関係に同一である。丁なわち、こ
こに説明した特性を示す単一クローン住抗坏は亜群工ｇ
Ｇ１、ＩｇＧ２ａ　、■ｇＧ２ｂまたはＩｇＧ５、ある
いは群ＩｇＭ？たはＩｇＡ、あるいは更にその他の既知
のＩｇ群であることができる。これらの群または亜群の
間の差異は抗体の反応パターンの選択性に影響を及ぼさ
ないが、抗体と他の物質たとえば補体またに抗マウス抗
体とのほかの反応に影響を及ぼすことがあろう。

上記に説明した抗体はＩｇ　Ｇ２ｂに特定したが、ここ
に例示した反応性のパターンを有する抗体類はそれらが
属する免疫グロブリンの群または亜群に無関係に不発明
の範囲に包含されうるものである。

更に本明細書に例示したハイブリドーマの技術を用いて
前述の単一クローン性抗体を生成する方法も本発明の範
囲に包含されろものである。

本明細書に具体的に示した免疫法、融合法および選択法
に従って先述した反応性の特性を有する抗体類を生成し
得る他の）・イブリドーマ類を得ることができよう。マ
ウスの既知の種からの既知の骨ｔｉ腫細胞系統から生成
した個々のハイブリドーマは、このハイブリドーマによ
り生成された抗体を参照する以外にはそれ以上同定でき
ないので、前述の反応性の特性を有する抗体を生成する
丁べてのハイブリドーマ類は本発明の範囲内に包含され
、これらのハイブリドーマを用いる抗体の生成方法も同
様に包含されるものでめる。

なお本発明の単一クローン江抗体を製造するためのハイ
ブリドーマは動物細胞であるために工業技術院微生物工
業技術研究所には寄託できなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は種々のＨ−２ハブロタイブおよびＨ−２組み換
えマウス由来の牌細胞に対するクローンＨＡＫ−７５４
饗上清の補体依存性細胞傷害率を示すグラフである。 第２図は一方向アロ混合リンパ球反応でヒト　′Ｔ細胞
を幼芽化（活性化）した際のクローンＨＡＫ−７５培養
上清に対する補体依存性細胞傷害率の経時豹変ｆＩＳ（
対照として免疫グロブリン使用）を示すグラフである。 第３図はヒ１Ｂｋｄ胞株ＥＢＶ−Ｗａの１２５工標識町
溶化細胞抗原をクローンＨＡＫ−７５培蓋上清より得ら
れた精製抗体または抗Ｉ−ＥｋＣｋＳｋ血清と反応させ
、間接免役沈降法により沈降物を得そ（−てＳＤＳを含
むポリアクリルアミドゲルで電気泳動処理した際の放射
活性パターンを示す。上段は１２５工標識抗原を正常マ
ウス血清で前処理した場合そして下段は１２５■標識抗
原を抗体Ｉ（ＡＫ−７５で前処理した場合のパターン番
示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）マウスの骨髄腫ラインからの細胞およびマウスＡ、
   ＴＬ（Ｈ−２”　）の牌および胸腺細胞で免疫したマウ
   スＡ、ＴＨ（Ｈ−２ｔ２）からの牌細胞の融合により形
   成されたバイブリド°−マにより生成され、そして下記
   性質すなわち ａ）Ｈ−２ハブロタイブのマウス牌細胞を特異的に傷害
   すること、 ｂ）明細書第１表および添付図面第１図に示￥Ｈ−２ハ
   ブロタイブのマウスおよびＨ−２組み換えマウスの牌細
   胞に対する細胞傷害性パターンを示し、マウスニーＡ属
   領域に存在する遺伝子座に支配されている抗原を認識す
   ること、Ｃ）マウスリンパ球Ｂ細胞に表現されているＩ
   ａ抗原と反応するがＴ細胞とは反応しないこと、 ｄ）ヒト成人男女から得られた末梢リンパ球Ｂ細胞分画
   とは約３Ｑ〜７０％、そしてＴ＃ｌ胞分画とは約５％以
   下の補体依存性細胞傷害性を示すこと、 ｅ）ヒト末梢単核球分画のうち、ノイラミニダーゼ処理
   ５ＲＢＣロゼツト法により得られたＴ細胞では細胞傷害
   率約３％以下、プラスチックディツシュ付着細胞（マク
   ロファージ）では細胞傷害率約７５チ、そしてプラスチ
   ックディツシュ非付着性でしかもペプシン処置ウサギ抗
   ヒト免疫グロブリンコートデイツンユ付着のＢ細胞では
   約５０〜６０％の細胞傷害率を示すこと、 ｆ）一方向アロ混合リンパ球反応、自己ＭＬＲおよびコ
   ンカナバリンＡ培養より得られたＴ細胞の約１２〜４０
   ％と反応し、一方向アロ混合リンパ球反応による培養細
   胞とは添付図面第２図の経時的反応パターンを示すこと
   、ｇ）　　二重螢光染色法により検索するとヒト、サル
   、ヤギ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラットおよびマウ
   スの肺細胞と反応するが胸腺細胞とは反応しないこと、 リ　ヒトＢａ胞株ｇＢＶ−Ｗａ細胞から間接免疫沈降法
   により分子量３０，０００〜４０，０００の領域に２ｍ
   の沈降物を与えろこと を有することを特徴とする、群１ｇＧの補体固定単一ク
   ローン性抗体。 ２）ハイブリドーマがハイブリドーマＨＡＫ　−７５で
   ある前記特許請求の範囲第一項記載の単一クローン性抗
   体。 幻　前記特許請求の範囲第１項記載の補体固定単一クロ
   ーン性抗体を製造するにあたり、１）マウスに、ＴＨ（
   Ｈ−２ｔ２）をマウスＨ，ＴＬ（Ｈ−２ｔりの牌および
   胸腺細胞で免疫し、 １１）免疫されたマウスから牌を取り出しそしてその肺
   細胞の懸濁液を作成し、 １１１）該肺細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合促進剤の
   存在で融合させ、 ＋Ｖ）融合した細胞を未融合の骨髄腫細胞を支持しない
   培地中で希釈しそして培養し、■）ハイブリドーマを含
   有する培養物の上清液を所望の抗体の存在について測定
   し、Ｖ＋）　　所望の抗体を生成するハイブリドーマを
   選びかつクローンに分け、そして ｖ１υ　このクローンの培養上清液から抗体を回収する ことを特徴とする方決。 ４）前記特許請求の範囲ａｘｉｇ４記載の補体固定単一
   クローン性抗体を製造するにあたり、１）マウスＡ、Ｔ
   Ｈ（Ｈ−２ｔ２）をマウスＨ，ＴＬ（Ｊ（−２ｔｉ）の
   牌および胸腺細胞で免疫し、 １１）免疫されたマウスから牌を取り出しそしてその肺
   細胞の懸濁液を作成し、 １１リ　該肺細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合促進剤の
   存在で融合させ、 １ｖ）　　融合したａ胞を未融合の骨髄腫細胞を支持し
   ない培地中で希釈しそして培養し、Ｖ）　　ハイブリド
   ーマを含有する培養物の上溝液を所望の抗体の存在につ
   いて測定し、Ｖυ　所望の抗体を生成するハイブリドー
   マを選びかつクローンに分け、 ７７７２Ｍクローンをマウスの腹腔内に移植し、そして Ｖｉｉｌ）悪性の腹水またに血清を該マウスから収得す
   る ことを特徴とする方法。 ５）マウスの骨髄腫ラインからの細胞およびマウスＡ、
   ＴＬ　（Ｈ−２”　）の牌および胸腺細胞で免疫したマ
   ウスＡ、ＴＨ（Ｈ−２ｔ２）からの肺細胞の融合により
   形成された補体固定単一クローン性抗体生−産性一・イ
   ブリド−７゜