JPS58206532A - 単一クロ−ン性抗体およびその製造方法 - Google Patents

単一クロ−ン性抗体およびその製造方法

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JPS58206532A
JPS58206532A JP8980482A JP8980482A JPS58206532A JP S58206532 A JPS58206532 A JP S58206532A JP 8980482 A JP8980482 A JP 8980482A JP 8980482 A JP8980482 A JP 8980482A JP S58206532 A JPS58206532 A JP S58206532A
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mouse
cell
cytotoxicity
antibody
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JP8980482A
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Kazuhiko Yamamoto
奥村康
Yoshihiro Kumagai
熊谷善博
Keiichi Hiramatsu
山本一彦
Yasushi Okumura
多田富雄
Tomio Tada
平松敬一
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Sanofi Aventis KK
Original Assignee
Hoechst Japan Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、広義にを工新規な交雑a胞うイン(hybr
idoma cell 1ine )、さらに詳しくは
マウスと人のリンパ球B細胞、マクロファージおよび活
性化リンパ球T細胞に見い出される抗原に対する補体固
定単一クローン性(monocl○nal)抗体の生成
のための交雑細胞ライン、そのように生成された抗体、
および抗体と反応する抗原組成物に関する。
KOhlerおよびMilstein両氏は、免疫され
たマウスからの肺細胞とマウス骨髄腫との融合(fus
i○n)により均質ないわゆる単一クローン性の抗体を
つくる細胞ラインを取得できることを証明した( rN
atureJ第256巻第495−497頁(1975
))。この基本的な技術の提示以来、種々の交雑細胞い
わゆるハイブリドーマ類の生成およびこれらのハイブリ
ドーマ類によりつくられる単一クローン性抗体の基礎的
筒たは応用科学的研究への利用について多くの努力がナ
サれてきた。たとえばり、’E、YsionおよびM、
 D、 5charff両氏によるr Annual 
Rev、 Biochem、 J第50巻第657−6
80頁(1981)およびE、D、5evier氏等に
よるr C11n、 Chem、 J第27巻第179
7〜1806頁(1981)の各文献ならびにこれら文
献に引用されている文献を参照されたい。これらの文献
はハイブリドーマ類から単一クローン性抗体を生成する
ことによ’)′得られる多くの利点と同時にその操作の
複雑さを示している。一般的技術は概念的にはよく理解
されているが、各特定の場合に多くの困難があり、従っ
てそれを解決するだめの変更が要求される。事実、一定
のハイブリドーマを生成する試験の以前には、所望のハ
イブリドーマが得られるか!うか、仮りにそれが得られ
た場合抗体を生成するかどうか、あるいはまたそのよう
に生成された抗体が所望の特異性をもつかどうかは予測
し難い。成功の程度は、主として、使用する抗原のタイ
プ、免疫方法および所望の・・イブリドーマを単離する
ために使用する選択技術により影響を受ける。
マウス免疫細胞相互作用の鍵は主要組織適合遺伝子複合
体(major histOcompatibilit
ycomplex 、 MHC)である。マウスMMC
は染色体のH−’2遺伝子座に存在する。免疫反応の基
幹をなす何種類かの細胞間相互作用は、MHc内工内域
領域在する遺伝子に支配される。■領域は更K I−A
 、  I−B 、 I−工、I−EおよびI−Cの各
属領域に分かれ、これら属領域の遺伝子は18抗原(ニ
ーregion−associated antige
n)を発現して免疫応答の制御にきわめて重要な役割を
はたす。本明細書に云う「マウス単一クローン性抗体H
AK−75」は前述した免疫細胞の相互作用を拘束する
免疫細胞抗原と反応する。
ヒトのIa抗原はHLA−DR抗原(nun>an 1
euKocyteantigen−D−related
 antigen)と呼ばれる。ヒト訃よびマウスにお
けるこれら抗原の相同性は、それぞれ主要組織適合遺伝
子複合体(MH’C) K連鎖していること、組織内分
布が非常に類似していること、そして免役反応が類似性
していることから確かめられている。更にまた抗原薄造
のfヒ学的注状も酷似している。すなわち、分子量35
.000〜55,0(30(rα碩」と呼ばれる〕と2
7、000〜29,000(rβ項」と呼ばれるンとの
2つのサブユニットからなり、しかもN末端のアミノ酸
配列が同じである。
上述したよりなfヒ学的性状を有するヒトHLA7DR
抗原分子シ工マウスI−E属領域の遺伝子産物に相同で
あると考えられている。しかしながら最近ヒトHLA−
DR領域妊もマウスI領域と同様に複数の遺伝子座が存
在することが明らかになりつつあり、その解析が試みら
れている。
と) HLA−DR抗原に対する単一クローン性抗体を
生成する試みはその端緒についたところであってその報
告はほとんどない。
本発明者らは種々研究の結果、H−2にとD領域が同一
であるが免疫応答性を異にする(すなわちI領域が異な
る)2つの同系(Congeneic) 797丁なわ
ちマウスA、TL(H−2tl )およびマウスA、T
H(H−2t2 )を用い、マウスA、TL (H−2
t 1)の牌および胸腺細胞を抗原としマウスA、TH
(H−2” )を免疫してその抗原特異性を高めること
に成功した。更にこのように免疫したマウスから肺臓を
とり、その細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドー
マを形成させ、このハイブリドーマを培養して得た培養
上清をヒト末梢単核球およびヒトリンパ球BM胞株(E
BV−Wa )と反応させ、二重螢光染色法により解析
し、そして反応陽性融合細胞から限界希釈により単一ク
ローン性抗体意生細胞株(クローンHAK−75)を得
る方法を確立した。
人間および動物の免疫系に含1れるリンパ球には2つの
主な群が存在する。リンパ球の第1群(骨髄誘導細胞、
すなわちB細胞)は抗体を分泌するものである。それら
はへモボイエチン幹細胞から発生するが、そ几らの分化
は胸腺に依存しない。鳥類においてはそれらはパーサ・
オプ・7アブリシウヌ(Bursa of Fabri
cius)と呼ば几る胸腺に類似する器官において分イ
ヒしている。しかしながら哺乳動物においては同等の器
官がみられず、これらB細胞は骨髄で分化すると考えら
れている。リンパ球の第2群(胸腺誘導細胞、すなわち
T細胞)はやはりへモボイエチン幹細胞から胸腺におい
て分化する。胸腺にある間、分化する細胞は胸腺細胞と
呼ばれる。主熱したT細胞は胸腺から出て、組織、リン
−ぞ管および血流の間を循環する。これらT細胞は免疫
学的特異性を有し、そして組織移植時のような細胞介在
免役応答において奏効体(、ef−fector )細
胞として直接関与する。T細胞はB細胞と異なり液性抗
体を分泌しない。T細胞は[ヘルパー(helper 
) J、「抑制体(5uppres−sor)Jおよび
[キラー(killer ) J T 細胞と呼ばれる
少なくとも3種の亜型に分けられる。
ヘルパーTm胞はB細胞の抗体産生を促進し、抑制体で
細胞はB細胞の抗体産生を抑制する一万、キラーT細胞
は異種細胞を殺す機能を有する。無ガンマグロブリン症
や自己免役疾患はこれらT細胞の過剰または欠乏に関連
している。
ちなみにマクロファージ(大食細胞)も同様にヘモポイ
エチン幹細胞に由来し、異物を貧食する一万で抗原をリ
ンパ球に供給し、おお1かに云えば非特異的に免役応答
に関与している。
免疫応答の制御におけるマウスi領域の役割は免疫生化
学的にかなりよく理解されているが、ヒトのHLA−D
R領領域関してはわずかにその亜領域と発現する抗原更
にその機能が知られはじめたにすぎない。
本発明の対象たる単一クローン性抗体HAK−75は、
マウスi領域の更に詳細な研究、B細胞とT細胞との分
別およびマクロファージの分析のみならず、ヒトリンパ
球亜群、ヒトHLA−DR領域、活性化T+11B胞の
ra抗原およびその免疫生物学的意義を解析するのに碓
めて有用である。1だ、ヒ) HLA−DR領領域高安
病、重症筋無力症、若年性糖尿病などの自己免疫疾患に
関連していることから、ヒトHLA−DR抗原に対する
単一クローン性抗体は自己免疫疾患の診断そして治療に
用いられる可能性が高い。更に筐たヒ) HLA−DR
抗原に対する単一クローン性抗体は組織移植の成功度に
影響することが示唆される。
従来のいわゆるポリクローナル抗体(pclyclon
alantibody)の製造は、その特異性を高める
ための吸収および精製の工程において、きわめて多くの
困難を伴なう。吸収されかつ精製された抗血清でさえ所
望の抗体以外に多くの不純物を含有する場合が多い。ま
た同一抗原のすべての抗原決定基に対する抗体を含むた
めに各抗原決定基に対する特異的抗体の濃度が低く、特
に交叉反応性の高いヒ) HLA−DR抗原などの解析
には困難が多い。ノ・イブリドーマの冶養によれば特異
性の高い高純度の単一クローン性抗体が再現曲よく多量
に製造できる。前述のE、D、5evier氏らの文献
Cr C11n、 Chem、 J 11g27巻第1
797−1806頁(1981)〕は更に先行技術によ
る従来のポリクローナル抗体の欠点および単一クローン
性抗体の利点を記載している。
本発明によれば、H−2ハブロタイブのマウス牌細胞の
みを特異的に傷害し、マウスBM胞に発現するIa抗原
、すなわちI−A亜領域遺伝子産物と特異的に反応し、
ヒトB細胞、マクロファージ、および活性化T細胞に発
現し非多型(non−p○1yzorpΩic )タイ
プでマウスI−A産物と相同な抗原講造を有し、T細胞
の5%以下を傷害し、無籍微細胞ついて見出されない抗
原に対する新規な単一クローン性抗体を生成できる新規
なノ・・イブリドーマ(以下[クローンHAK−75J
と称する)が発見された。更に単一クローン性抗坏弧−
75は補体を固定する。
このように生成された抗体は、マウスI−E亜領域遺伝
子産物と特異的に反応ししかもヒ)ELA−DR抗原と
交叉反応する先行技術の単一クローン性抗体とは異なる
交叉反応性を示す。本発明の抗体はマウスで&X H−
2”プロタイプのI−A亜領域遺伝子産物に特異的であ
り、ヒトB細胞、マクロファージおよび活性化TRU胞
の相同な抗原に単一特異性であり、他の免疫グロブリン
を含有しない。
従って、本発明の一つの目的は、リンパ球B細胞、マク
ロファージおよび活性化T細胞に発現してマウスI−A
亜領域遺伝子産物に相当する抗原に対する抗体髪生成す
るノ・イブリドーマを提供することである。
本発明のさらに別の目的はこれらのノ・イブリドーマを
製造する方法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、リンパ球Ba胞、マクロファ
ージおよび活性111:T細胞に発現してマウヌT−A
亜領域遺伝子産物に相当する抗原に対する本質的に均質
な抗体を提供することである。
本発明のその他の目的および利点は以下の記載から明ら
かになるでろろう。
前述の目的2よび利点を達成するために不発明によれば
、リンパ球B@胞、マクロファージおよび活性化T細胞
に発現してマウスI−A亜領域遺伝子妾物に相当する抗
原に対する新規な抗体を生成する新規なハイブリドーマ
およびこのハイブリドーマにより生成された抗体が提供
される。該ハイブリドーマ自体kL Kohlerおよ
びMilstain両氏の方法に一般に従って製造され
る。
マウスA、TL(H−2−1)の暉および胸腺a抱で免
役応答性を異にする同系(congeneic ) マ
ウスA、TH(H,)t2)を免疫した後、免疫したマ
ウスの肺細胞をマウスの骨髄腫ラインからの細胞と融合
し、そして得られたハイブリドーマ類を培養し、得られ
た培養上清をヒト末梢単核球およびヒトリンパ球B細胞
株(li:BW−Wa )と反応させ、二重螢光染色法
により解析し、反応陽性融合細胞から限界希釈により単
一クローン性抗体童生株を確定して特性づけた。その結
果、マウスI−A亜領域遺伝子竜物に相当する抗原に対
する抗体HAK−75を生成するハイブリドーマ(クロ
ーンHAK−75)が得られた。この抗体はリンパ球B
細胞、マクロファージおよび活性化T細胞と反応するが
、T?#U胞普たは無籍微細胞と反応しない。二重螢光
染色法により調べると、この抗体HAK−75はヒト、
サル、ヤギ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラットおよび
マウスの肺細胞と反応するが胸腺細胞とは反応しなかっ
た。この広い@動程に2ける陽性反応は驚くべきもので
あり、この抗体HaK −75の利点を示唆している。
本発明のハイブリドーマを製造する方法をニ一般に次の
工程からなる。
A、  H−2にとD領域が同一であるが免疫応答性を
異にする2つの同系(congeneic )マウスj
なゎちマウスA、TL(、H−2tl)およびマウスA
、 ’In(H−2tりを用いろ。1ずマウスA、TL
(H−2t1 )の膵および胸#細胞でマウスA、TH
(H−2”)を免役する。免疫スケジュールそして牌お
よび胸腺細胞の濃度は適当に免役された牌細胞の有効量
を生成するように選択される。マウスA、TL(H−2
t’ )の牌および胸腺の混含S胞2X10’1面/マ
ウス/注射を用いて初回免疫はlX109百日咳ワクチ
ン(p6r−t、usSls vacclne )と共
に腹腔注射し、次回免疫からは百日咳ワクチアftしに
前記混合細胞2X107個/マウス/注射を用いて7目
間隔で合計14回免疫を行うことが有効であることがわ
かった。
B、免役したマウスから肺臓を取り出し、適当な媒体で
牌懸濁液を調製する。約マウス全肺臓当り11Ntの媒
体で十分である。これらの実験の技術は当業者には知ら
れている。
C0懸濁した牌細胞を適当な細胞ラインからのマウス骨
髄腫の細胞と適当な融合促進剤の使用により融合する。
牌細胞対骨髄@細胞の好ましい比は約5=1である。約
108個の牌細胞について0.5〜1.Odの融合媒体
が適当である。多くのマウスの骨髄腫の細胞ラインは知
られており、そして一般に徨々の寄託機関たとえばザ・
ンーク・インスティチュ、−ト・セル・ディストリビュ
ーション・センター(The Ba1k In5tit
uteCell  DiStribution  Ce
nter、LaJona、  (7alifornia
〕から入手できる。使用する細胞ラインは好葦しくにい
わゆる「薬物抵抗性」型であって、未融合の骨髄腫細胞
が選択した培地中で生存せず、一方交雑細胞が生存する
ように培地を選択する。
最も普通に使用されろのは8−アザグアニン抵抗性の細
胞ラインであり、これは酵素ヒボキサンチンーダアニン
ホスホリボ゛シルトランス7エラーセ(hypoxan
thine −guanine phosphorib
o−syl trallsferase )を欠き、そ
れゆえHAT (ヒボキサンチン、アミノプテリンおよ
びチミジン)培地中では生存しない。また使用する骨髄
腫細胞ラインはいわゆる「非分泌」型すなわちそれ自体
抗体を分泌しないことが一般に好ましいが、分泌型も便
用できる。好ましい融合促進剤は平均分子量が1000
〜40’00のポリエチレングリコール(商品名r P
EG 1000 J hどとして入手できるンが好まし
いが、この分野において升られている他の融合促進剤も
単独または組合せて使用できる。
D、別の容器内において、未融合の牌細胞、未融合の骨
髄腫細胞および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択的培地で希釈し、未融合の細胞
を死亡させるのに十分な時間(約1週間〕培養する。こ
の限界希釈により統計的に計算して例えば96大のプレ
ートで各溜め(well )中に細胞が1〜4個単離す
るようにする。培地は薬物抵抗性(たとえば8−アザグ
アニン抵抗性)で未融合の骨髄腫細胞ラインを支持しな
いもの(たとえばHAT培地ンである。それゆえ、未融
合の骨maIIa胞は死滅する。未融合の牌細胞は非悪
性であるので有限の世代をもつだけであり、ある期間(
約1週間う後、これらの未融合の牌細胞は再生しない。
これに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の悪性をも
ち、そして牌細胞の親の性質によって選択培地中で生存
できるので再生し続ける。
E、ハイブリドーマを含有する各容器(溜め)中の上清
液をヒト末梢単核球およびヒトB細胞株(EBV−Wa
 )とそれぞれ反応させ、更に二重螢光染色法により抗
体の生成を検出する。
F、所望の抗体を生成する反応陽性ハイブリドーマを(
たとえば限界希釈により)選択してクローンに分ける。
いったん所望のハイブリドーマを選択し、クローンに分
けると、所望の抗体は2つの方法の1つで生成させるこ
とができる。最も純粋な単一クローン性抗体は、所望の
ハイブリドーマヲ適当な培地中で適当な長さの時間試験
管内培養し、ついで所望の杭木を上−液から回収するこ
とによって生成される。適当な培地および適当な培養時
間の長さは容易に決定できる。この試験管内技術によっ
て他の特異性の免疫グロブリンを本質的に含マナい単一
特異性単一クローン性抗体を生成する。培地は外来性血
清(だとえば胎児性子牛血清)を含有するので少量の他
の免役グロブリンが存在し得る。この試験管内方法によ
れば単一クローン性抗体を約50μg / m/程度の
濃度で生成できる。
非常に高濃度の単一クローン性抗体を生成させるためK
は所望のハイブリドーマをマウスに注射する。ハイブリ
ドーマは適当な潜伏時間後、抗体生成の腫瘍を形成し、
その結果宿主マウスの血流および腹膜滲出液(腹水)中
に高濃度の所望の抗体(約5〜20Q/l1l)が生ず
る。これらの宿主マウスは正常な抗体をも血流および腹
水の中に有するが、これら正常な抗体の濃度は単一クロ
ーン性抗体濃度のわずかに約5%にすぎない。この単一
クローン性抗体の力価ハ高く(1: so、ooo以上
の希釈度で活性)、そして特異性免疫グロブリン/非特
異性免疫グロブリンの比が高い(約1/20)。従って
これらの単一クローン性抗体はその特異性を減すること
なしに希釈するだけで使用できる場合が多い。
実施例1 単一クローン性抗体の生成 A)免疫および体細胞の交雑 マウスA、TH(H−2t2) (生後8週間9を同系
(congeneicツマウスA、TL(H−2t1 
)の牌および胸腺の混合細胞2X107個で腹腔内に百
日咳ワクチンI X 109と共に免疫した。第2回目
の免疫からは百日咳ワクチンを含筐ず同じ条件で1週間
ごとに合計14回免役した。最終回の免疫から4日後、
マウスから牌を取り出し、そしてステンレヌ鋼の網に組
織を通すことによって単一細胞の@濁液をつくった。
細胞の融合をKOhlerおよびMilstein両氏
の方法に従って実施した。牌細胞I X 108個を3
5%のポリエチレングリコールr PEG2000 J
および5%のジメチルヌルホキシトを含むRPMI 1
640培地1.0M中におイ”’C2X107M+7)
 ?3X63Ag8 ・653骨髄陣細胞と融合した。
この骨桶腫細1iil!に免疫グロブリンGの軽鎖(i
ight chain )を分泌しない。
B)ハイブリドーマの選択および成長 細胞の融合後、細胞をHAT培地中で67℃において5
%CO2を使用して培養した。数週間後、ハイブリドー
マを含む培譬液から上清をとり、ヒト末梢単核球および
ヒトB細胞株(EBV−Wa )と反応させ、二重螢光
染色法により解析し、反応陽性融合細胞を15%の胎児
性子牛血清を含むRPMI 1640培地で供給体(f
eeder )細胞の存在下に培養し、2度限界希釈法
によりクローンfヒして単一クローン性抗体産細胞株ク
ローンHAK−75を分離した。上記の限界希釈に用い
た培地はHATを含む場合と含葦ぬ場合との両方を用い
た。
ハイブリドーマの抗坏活性の検索にはヒト末梢単核球と
エプスタイン・バーク・fルス(EB’V)により形質
変換(transformation )されたヒトB
#I胞株(3BV−Wa )に対する補体依存性細胞傷
害試験を用いた。試験細胞2 X 106個/ゴの20
μtを■プレートにとり、ハイプリドーマ培養上溝漱2
0μtを加え、37℃で15分間反応させた。反応後、
2%の胎児性修生血清を含むMEM培地(Minima
l essential Medium )で細胞を1
回洗った。次に補体を供給するために、2倍希釈したウ
サギ血清20μtを細胞に加え、37℃で90分反応さ
せた(マウスの試験細胞を用いた他の実施例では、ウサ
ギ血清を10〜12倍希釈して用い、補体反応時間は3
0分であった)。
補体反応後、細胞を上記と同じ冷MEM培地で1回洗い
、トリパンブルー染色により死滅細胞の数を顕微鏡下に
測定した。細胞傷害率(%)を次式により計算した。な
お対照としては正常なマウス血清を用いた。
細胞傷害率(%)= 100X(傷害チ一対照傷害嘱〕÷〔10〇一対照傷害
チ〕次にクローンHAK−75の1X 107個細胞(
0,2M)を2.6,10.14−テトラメチルペンタ
デカン(A1−drich Chemical Com
panyから商品名rPr is tin e Jで入
手可能ンで予め処理したマウスBALB/Cに注射によ
り腹腔内に移植した。これらマウスからの悪性腹水もク
ローンHAK−75培養上清と共に後述の実施例にみら
れる特性づけに用いられて同様な結果を得た。凰−クロ
ーン性抗体HAK−75は標準技術によりIgG2b亜
群であると証明された。
実施例■ 単一クローン性抗坏HAK−75の特性づけ
A)マウス牌細胞に対する細胞傷害試験H−2遺伝子座
ハブロタイブ頌に、b、d、f。
rおよびSのマウスから+*をなり出し、常法により牌
細胞薯濁孜をつくり、クローンHAK−75の培養上清
液と反応させ、実施例Iのように補体依存性aI胞傷害
試験を行った。
試験の@来、クローンHAK−75の培養上溝はH−2
遺伝子座にH−2にの特性をもつハブロタイブのマウス
牌細胞を特異的に傷害することが判明した。
蔓[また遺伝子座I領域に対する特異性をみるためにE
(−2組み俟えマウスを用いて同様な試験を行った。次
((柵々のH−2ハブロタイブおよびH−2組み換えマ
ウス牌細胞に対するクローンHAK−75培養上清の補
俸依存性細胞傷害性の試験結果を示す。
第  1  表 A、TL  s k k k k ’x d 45A、
THS   S   S   S   S   S  
d   (5C3H/HeN k k k Kk k 
k 47B10.A  kk k k k dd 51
B10.A(4RJ k ’y、 b b b b b
 53B10.A(5RJ b b b k k d 
d 11C57BL/6   b   b   o  
 ’Ob   b   ’D   (5B10.S  
  s  s   s   s   s   s  s
   (5B10.3(9R)s s−k k a d
  6BALB/Cd 、まddddcL17B10.
RIII    r   r   r   r   r
   r   r   <5B10.M  ff f 
f f ff  8なお添付図面第1図においてはクロ
ーンHAK−75の培養上清の種々の希釈率に2ける細
胞傷害性パターンを示す。
上表からも明らかなように、クローンHAK−75培養
上清液は、H−2組み換えマウスB1[1,Aおよびs
jO,h(4R)の肺細胞に対してはそれぞれ最大限5
1%および53%の細胞傷害を示したが、同様な組み換
えマウスC57BL/6、B10.SおよびB10.5
(9R)の肺細胞に対してはそれぞれ〈5%、く5%お
よび6%の細胞傷害しか示さず、細胞傷害性はないと判
定された。従って単一クローン性抗体HAK−75はマ
ウスI領域の亜領域1−A 。
1−B 、  I−J 、  I−gおよびI−Cのう
ち、l−A亜領域に存在する遺伝子に支配される抗原を
認識することがわかった。
次にリンパ球細胞畦群上の抗原の表現を調べるために、
H−2にノ・プロタイプのマウスC3HAI eN(表
1)の肺細胞をナイロンウールカラム法ヲ用いて、その
11通り抜けるT細胞分画と吸着されるB細胞分画とて
分けた。この方法によるとB[胞分画は平均50%前後
のB細胞を含有していた。これら細胞亜群に対する抗体
HAK −75の細胞傷害試験を同様に行ったところ、
結果として主としてB細胞分画に表現されるTa(1−
へ亜領域ン抗原に対する抗体であることが明らかとなっ
た。抗体HAK−75はマウスC3H/HeNの牌由来
T細胞(ナイロンウールカラム通り抜は分画)とは明確
な反応性を示さなかった(第1図参黒)。
B)ヒドリン−々球細胞亜群に対する細胞傷害試験 健康な血液提供志願者(50人、男女、日本人、アジア
人、白人)からへA IJン加ヒト末梢血を得、リンパ
球をBoyum氏の方法(j3cand。
J、 C11n、 Lab、 Invest、J第21
巻(suppl、97)第77頁(1968)]に従い
、フィコール−・・イパツク(Ficoll−Hypa
que )密度勾配遠心分離により単離した。これをナ
イロンウールカラムを用いて、主としてBiflUを含
む分画とT細胞を含む分画とに分けた。−万、分別しな
いリンパ球から先ずプラスティックディツシュ(Fal
con )に付着する細胞を分離した。プラステイツク
デイツンユ非付Ha胞をノイラミニダーセ処理した5%
の羊の赤血球(5RBC)でE−ロゼツト化した。E−
ロゼツト化した細胞をフィコール−ハイバックL Fl
coll −Hypaque ) 孜よVcM層し、遠
心後回収したE+ヘレットを0.155モル濃度NH4
Cl (10M/108IifU胞)で処理してT細胞
を得た。−万、ブラヌテインク非付着細胞を、ches
s氏ら〔[J、工mmuno1. J第113巻第11
13頁(1974))が記載している方法に準じて、は
プシン処直ウサギ抗ヒト免役グロブリン(抗−F(ab
’ )2 ]コートディツシュで処理し、付着した表面
■g+(B)細胞を分離した。
これらヒトリンパ球細胞亜群に対するクローンHAK−
75培養上清液の反応結果を他の試験細胞パネルに対す
る反応結果と共に第2表に示す。
第  2  表 ナイロンウール吸着細胞1        30−70
ナイロンウ一ル通通細胞1<5 プラスティックディツシュ吸着細胞        7
5精製B細胞2              50−6
0精製T細胞5<3 (注)150個体テストした。
2  F(ab)2ウサギ抗ヒト免疫グロブリンでコー
トしたプラスティックディツシュ から回収した。
6 羊の赤血球ロセット形成T細胞。
\ 表尺みられるとおり、ナイロンウールカラムを用いて分
別したB細胞分画は約60〜70%、そしてT細胞分画
は5%以下の細胞傷害率を示した。細胞亜群上の表現を
みると、ロ七ット法により得られたT細胞では細胞傷害
率6%以下、ブラヌテイツクディッシュ付着細胞(マク
ロファージ)では細胞傷害率75%、そして表面Ig”
Ba胞では細胞傷害率50〜60%であった。
更にヒトT細胞に表現される1a抗原とクローンHAK
 −75培養上溝液が反応するか否か調べた。
ヒトT細胞を他のヒト個体から得られるマイトマイシン
C処理したリンパ球と混合培養する(C1ne−way
 allogeneic MLR)か、T細胞を同一個
体から得られるマイトマイシン処理したB細胞/マクロ
ファージと6日間混合培養する( antologou
BMLR)か、またはT細胞をコンカナバリンAの存在
下で6日1i15培養することにより幼芽化T細胞(活
性化T細胞)を得た。混合培養の全細胞数はI X 1
06個、培地は10%胎児性仔牛血渭および20 mM
 HEPES (pH7,2)を含むRPMI 164
0であった。活性rヒT#l胞と抗体HAX −75と
の反応の有無は二重螢光染色法により調べた。混合リン
パ球反応(m1xed lymphocyte rea
ction、MLR)中の全細胞I X 106個にク
ローンHAK−75培養上屑液60μtを刀口え、4℃
で60分反応させた後、2%胎児性仔牛血清を含むME
M培地で細胞を3回洗い、F工TC標識したウサギ抗マ
ウス免ftグロブリン10μtを加えて4℃において2
0分間反応させ、上記MEM培地で細胞を3回洗った後
、細胞を顕微鏡観察した。活性化T細胞の12〜40優
が反応陽性であった。ワンーウエイアロジエネイツクM
LR培養細胞を経時的に調べたところ、クローンHAK
−75抗体に反応する細胞は経時的に増力口し、6日目
にピークに達し27〜42%の陽性率であった(第2図
参照〕。
ナ 以上の結果から、クローンHAK−75抗体は、主とし
てヒトB細胞、マクロファージおよび活性化T &l]
胞上に表現されている非多型(non−poly−mo
rphic )抗原構造を認識していることがわ力)つ
た〇 実施例m Δ)単一クローン性抗体HAK−75と反応する可溶化
細胞抗原の解析 ヒ)B細胞株であるgBV−Waを、10%胎児性仔牛
血清を含むRPMI 164o 珊地で培養し、1X1
08個細胞72−を生理的食塩水リン酸緩衝液(PBS
 )で洗い、0.5%ノニデートP−40(NP−40
)で15分間4℃で1liJ浴比した後、1時間4,0
00 Xダの遠心により上清液を得た。この上清孜をレ
ンチイル−レクチンカラム(lentil−1ecti
nCQll1mn)にかけ、0.1モルマ/ノーヌ溶出
分画を得、Ia抗原の濃縮および部分精製を行った。
この分画を0.1%NP −40を含ひPBPに透析し
、その後減圧下にアミコン(Am1con )膜で10
0μtに濃縮した。可溶化細胞抗原100μtをクロラ
ミンTにより125工標識し、セファデックスG25に
よるゲル濾過した後、125工標識物をクローンHAK
−75培養上溝液から得られた精製抗体と反応させ、更
にウサギ抗マウス免役グロブリンを別えて、間接免役沈
降法により沈降物を得た。この沈降物を可溶1じした後
ナトリウムドデシルサルフェート(SDS)を含′fJ
12.5%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ゲル
を分切後に&封油性を測定したところ、分子量30,0
00(30K)と65,000(55K)の領域に2つ
のピークな現出した。これらのピークはマウスI−A亜
領域遺伝子産物のALt鎮およびAβ鎖に相当jると考
えられる。ヒトB細胞株(EBV−Wa )にラクトー
スペルオキシダーゼ法により125丁を標識し、同様に
可溶化した後分析しても同僚な結果な寿た。
−万、ヒトB細胞EBV−Wa 5 X i 07個を
0.5mCi35B−メチオニンで7時間標識し、上記
と同様゛に可溶化細胞抗原を調製して間接免役沈降法に
より抗体HAK−75による沈降物を分析するとやはり
同じ分子量の2つのピークが検出された。なお上記実施
例で正常なマウス血清を用いた場合は該ピークは検出さ
nなかった(第3図参照)。
現在1で行われている血清学的および生化学的分析で(
エヒトHLA−D:R抗原分子はマウスI−E亜領域遺
伝子産物に相当し、特にマウスのIa、7に対する抗体
がヒトHLA−DR抗原と交叉反応すると考えられてい
る。実際マウス[B10.5(7R)xA、cA)ヲマ
ウスB10.HT’rの牌と胸腺細胞で免疫して得た血
清抗I−EkCkSkはマウスIa、7と反応し、マウ
スl−E亜領域遺伝子産物に相当すると考えられるヒト
HLA−DR抗原と又又反応丁、る。ヒトB細胞EBV
−Waρ)ら寿た可溶化細胞抗原を1251標識し、1
25工標識物10μtをクローンHAK−75培養上浦
液70μtで30分間4℃において処理して反応させた
後、ウサギ抗マウス免疫グロブリンでコートされたセフ
ァロースビーズを用いて反応物を除去した。抗体HAK
−75非反応物に抗1−Ekcksk血清を反応させ、
更にウサギ抗マウス免役グロブリンを加えて沈降物を得
た。対照として、抗体HAK−75非反応物に正常マウ
ス血清あるいはクローンHAK −75培養上溝液を加
えた。この沈降物を可溶化した後、SDSを含む12.
5%ポリアクリルアミドゲルで眠気泳動処理しそして放
射活性を測定したところ、分子量29,0001.29
K)および34,000 (34KJの領域に2つのピ
ークを検出した(第6図参照)。125工標識細胞抗原
を抗体HAK−75で処理する以前に、抗I −Ek 
Ck 3に血清と反応させた沈降物か7らも同様な2つ
のピークが検出された(第5図参照)。
従って単一クローン性抗体HAK−75&工、マウス1
−E亜領域遺伝子産物に相当するヒトHLA−DR仇原
とは異なり、マウヌl−A亜領域遺伝子産物に相当する
ヒトリンパ球細胞亜群に選択的に表現されている抗原を
認識する。
説明の便宜上、リン、u球細胞亜群に表現される抗原に
対する単一の単一クローン性抗体を生成する単一のノ・
イブリドーマについて言及してきたが、不発明はそれら
に限定されるものではない。本発明によれば抗体HAK
−75はマウスの工ρの4つの亜群の一つである亜群工
gG21)に属することが決定された。免役グロブリン
Gのこれらの亜群は互にいわゆる「固定」領域にお(・
て異なるが、特定の抗原に対する抗体はいわゆる「可変
」領域をもち、この領域は免疫グロブリンGのどの亜群
にそれが属するかに無関係に同一である。丁なわち、こ
こに説明した特性を示す単一クローン住抗坏は亜群工g
G1、IgG2a 、■gG2bまたはIgG5、ある
いは群IgM?たはIgA、あるいは更にその他の既知
のIg群であることができる。これらの群または亜群の
間の差異は抗体の反応パターンの選択性に影響を及ぼさ
ないが、抗体と他の物質たとえば補体またに抗マウス抗
体とのほかの反応に影響を及ぼすことがあろう。
上記に説明した抗体はIg G2bに特定したが、ここ
に例示した反応性のパターンを有する抗体類はそれらが
属する免疫グロブリンの群または亜群に無関係に不発明
の範囲に包含されうるものである。
更に本明細書に例示したハイブリドーマの技術を用いて
前述の単一クローン性抗体を生成する方法も本発明の範
囲に包含されろものである。
本明細書に具体的に示した免疫法、融合法および選択法
に従って先述した反応性の特性を有する抗体類を生成し
得る他の)・イブリドーマ類を得ることができよう。マ
ウスの既知の種からの既知の骨ti腫細胞系統から生成
した個々のハイブリドーマは、このハイブリドーマによ
り生成された抗体を参照する以外にはそれ以上同定でき
ないので、前述の反応性の特性を有する抗体を生成する
丁べてのハイブリドーマ類は本発明の範囲内に包含され
、これらのハイブリドーマを用いる抗体の生成方法も同
様に包含されるものでめる。
なお本発明の単一クローン江抗体を製造するためのハイ
ブリドーマは動物細胞であるために工業技術院微生物工
業技術研究所には寄託できなかった。
【図面の簡単な説明】
第1図は種々のH−2ハブロタイブおよびH−2組み換
えマウス由来の牌細胞に対するクローンHAK−754
饗上清の補体依存性細胞傷害率を示すグラフである。 第2図は一方向アロ混合リンパ球反応でヒト ′T細胞
を幼芽化(活性化)した際のクローンHAK−75培養
上清に対する補体依存性細胞傷害率の経時豹変fIS(
対照として免疫グロブリン使用)を示すグラフである。 第3図はヒ1Bkd胞株EBV−Waの125工標識町
溶化細胞抗原をクローンHAK−75培蓋上清より得ら
れた精製抗体または抗I−EkCkSk血清と反応させ
、間接免役沈降法により沈降物を得そ(−てSDSを含
むポリアクリルアミドゲルで電気泳動処理した際の放射
活性パターンを示す。上段は125工標識抗原を正常マ
ウス血清で前処理した場合そして下段は125■標識抗
原を抗体I(AK−75で前処理した場合のパターン番
示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1)マウスの骨髄腫ラインからの細胞およびマウスA、
    TL(H−2” )の牌および胸腺細胞で免疫したマウ
    スA、TH(H−2t2)からの牌細胞の融合により形
    成されたバイブリド°−マにより生成され、そして下記
    性質すなわち a)H−2ハブロタイブのマウス牌細胞を特異的に傷害
    すること、 b)明細書第1表および添付図面第1図に示¥H−2ハ
    ブロタイブのマウスおよびH−2組み換えマウスの牌細
    胞に対する細胞傷害性パターンを示し、マウスニーA属
    領域に存在する遺伝子座に支配されている抗原を認識す
    ること、C)マウスリンパ球B細胞に表現されているI
    a抗原と反応するがT細胞とは反応しないこと、 d)ヒト成人男女から得られた末梢リンパ球B細胞分画
    とは約3Q〜70%、そしてT#l胞分画とは約5%以
    下の補体依存性細胞傷害性を示すこと、 e)ヒト末梢単核球分画のうち、ノイラミニダーゼ処理
    5RBCロゼツト法により得られたT細胞では細胞傷害
    率約3%以下、プラスチックディツシュ付着細胞(マク
    ロファージ)では細胞傷害率約75チ、そしてプラスチ
    ックディツシュ非付着性でしかもペプシン処置ウサギ抗
    ヒト免疫グロブリンコートデイツンユ付着のB細胞では
    約50〜60%の細胞傷害率を示すこと、 f)一方向アロ混合リンパ球反応、自己MLRおよびコ
    ンカナバリンA培養より得られたT細胞の約12〜40
    %と反応し、一方向アロ混合リンパ球反応による培養細
    胞とは添付図面第2図の経時的反応パターンを示すこと
    、g)  二重螢光染色法により検索するとヒト、サル
    、ヤギ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラットおよびマウ
    スの肺細胞と反応するが胸腺細胞とは反応しないこと、 リ ヒトBa胞株gBV−Wa細胞から間接免疫沈降法
    により分子量30,000〜40,000の領域に2m
    の沈降物を与えろこと を有することを特徴とする、群1gGの補体固定単一ク
    ローン性抗体。 2)ハイブリドーマがハイブリドーマHAK −75で
    ある前記特許請求の範囲第一項記載の単一クローン性抗
    体。 幻 前記特許請求の範囲第1項記載の補体固定単一クロ
    ーン性抗体を製造するにあたり、1)マウスに、TH(
    H−2t2)をマウスH,TL(H−2tりの牌および
    胸腺細胞で免疫し、 11)免疫されたマウスから牌を取り出しそしてその肺
    細胞の懸濁液を作成し、 111)該肺細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合促進剤の
    存在で融合させ、 +V)融合した細胞を未融合の骨髄腫細胞を支持しない
    培地中で希釈しそして培養し、■)ハイブリドーマを含
    有する培養物の上清液を所望の抗体の存在について測定
    し、V+)  所望の抗体を生成するハイブリドーマを
    選びかつクローンに分け、そして v1υ このクローンの培養上清液から抗体を回収する ことを特徴とする方決。 4)前記特許請求の範囲axig4記載の補体固定単一
    クローン性抗体を製造するにあたり、1)マウスA、T
    H(H−2t2)をマウスH,TL(J(−2ti)の
    牌および胸腺細胞で免疫し、 11)免疫されたマウスから牌を取り出しそしてその肺
    細胞の懸濁液を作成し、 11リ 該肺細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合促進剤の
    存在で融合させ、 1v)  融合したa胞を未融合の骨髄腫細胞を支持し
    ない培地中で希釈しそして培養し、V)  ハイブリド
    ーマを含有する培養物の上溝液を所望の抗体の存在につ
    いて測定し、Vυ 所望の抗体を生成するハイブリドー
    マを選びかつクローンに分け、 7772Mクローンをマウスの腹腔内に移植し、そして Viil)悪性の腹水またに血清を該マウスから収得す
    る ことを特徴とする方法。 5)マウスの骨髄腫ラインからの細胞およびマウスA、
    TL (H−2” )の牌および胸腺細胞で免疫したマ
    ウスA、TH(H−2t2)からの肺細胞の融合により
    形成された補体固定単一クローン性抗体生−産性一・イ
    ブリド−7゜
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