DE3843784A1 - Verfahren zum nachweis von gramnegativen mikroorganismen sowie hierfuer geeignete dna-proben und antikoerper - Google Patents

Verfahren zum nachweis von gramnegativen mikroorganismen sowie hierfuer geeignete dna-proben und antikoerper

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Description

Die äußere Zellwand gramnegativer Bakterien zeigt einen einheitlichen Aufbau; sie besteht aus Lipopolysacchariden (LPS). Der Aufbau des inneren Teils ist für LPS charakteristisch: dieser besteht aus Lipoid A, kovalent gebunden an 3-Deoxy-D-manno- octulosonat (KDO). Die Biosynthese von LPS erfolgt u. a. durch die Enzyme Lipoid A Disaccharid-Synthase und CMP-KDO-Synthase (3- Deoxy-D-manno-octulosonat-cytidyl-transferase). Das erste Enzym katalysiert die Reaktion.
UDP-2,3-diacylglucosamin + 2,3-diacylglucosamin-1-phosphat → 2,3-diacylglucosamin (beta 1 → 6) 2,3-diacylglucosamin-1- phosphat + Uridinphosphat (UDP).
Die gebildete Substanz wird in weiteren Schritten zu Lipoid A umgewandelt. In einem weiteren Schritt erfolgt die kovalente Bindung zwischen KDO und Lipoid A durch die CMP-KDO-Synthase. Grampositive Bakterien besitzen diese Enzyme nicht.
Auf genetischer Ebene ist die Basensequenz der DNA, die für beide Enzyme kodiert, bekannt; vgl. Journal of Bacteriology, Dec. 1987, p. 5727-5734, und The Journal of Bilogical Chemistry, Vol. 261, No. 34, pp. 15831-15835 (1986).
Gene lassen sich mit der sogenannten DNA-Probetechnik nachweisen und quantifizieren; vgl. R. Neumann, Naturwissenschaften 74, 125 ff. (1987). Das Prinzip beruht im wesentlichen darauf, daß zur DNA des Gens komplementäre DNA-Sequenzen, die einen Marker tragen (z. B. einen Fluoreszenzfarbstoff) unter geeigneten Bedingungen mit der DNA der Gene hybridisieren.
Aus der EP 01 74 204 sind monoklonale Antikörper bekannt, die fest an von Lipoid A der Zellwand-LPS von E. coli-Rc-Mutanten oder Salmonella-Re-Mutanten gebildete Determinanten gebunden werden und die biologischen Effekte von Endotoxinen gramnegativer Bakterien blockieren. Monoklonale Antikörper, die mindestens mit Teilen des Endotoxinkerns gramnegativer Bakterien reagieren, sind weiterhin aus der PCT-WO 84/04 458 bekannt. Entsprechendes gilt für monoklonale oder polyklonale Antiseren, die in der PCT-WO 85/02 685 beschrieben sind. Die vorgenannten Antikörper sind nicht spezifisch für die für die Enzyme Lipoid A Disaccharid- Synthase und/oder CMP-KDO-Synthase kodierenden Nukleotidsequenzen.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß der Nachweis gramnegativer Bakterien möglich ist, wenn man auf die Anwesenheit der Gene für Lipoid A Disaccharid-Synthase und/oder CMP-KDO-Synthase testet. Demgemäß ist das Verfahren der Erfindung zum Nachweis von gramnegativen Microorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DNA-Probe, die zu für die Enzyme Lipoid A Disaccharid- Synthase und/oder CMP-KDO-Synthase codierenden Nucleotidsequenzen oder 20 bis 25 Basenpaaren langen DNA-Abschnitten derselben komplementär ist, verwendet, oder daß man die für die Enzyme Lipoid A Disaccharid-Synthase und/oder CMP-KDO-Synthase kodierenden Nucleotidsequenzen der gramnegativen Erreger isoliert, kloniert und exprimiert sowie die exprimierten Enzyme isoliert, mit den Ezymen Säugetiere, insbesondere Mäuse immunisiert, aus den immunisierten Tieren polyklonale Antikörper isoliert bzw. in üblicher Weise monoklonale Antikörper herstellt und diese in üblicher Weise zur Diagnose einsetzt.
Erfindungsgemäß werden die vorgenannten Gene aus einem repräsentativen gramnegativen Bakterium, z. B. E. coli, isoliert und in ein gängiges Vektorsystem (Plasmid) kloniert. Nach Vermehrung der Plasmide in geeigneten Kulturensystemen werden sie isoliert. Aus den Plasmiden werden die Gene der beiden Enzyme oder repräsentativen Teile davon mittels geeigneter Methoden isoliert. Diese DNA bzw. Restriktionsfragmente derselben werden mit einem üblichen Marker versehen und stehen dann als DNA-Probe für das Verfahren der Erfindung zur Verfügung.
Eine hierzu brauchbare Alternative ist die Synthese von DNA- Proben. Da die Sequenz der beiden Enzyme und damit auch die Basensequenz der DNA bekannt ist, kann zu jedem beliebigen DNA- Abschnitt die basenkomplementäre Sequenz synthetisiert werden und steht als Probe zur Verfügung.
Eine weitere Möglichkeit eines gruppenspezifischen Nachweises für gramnegative Bakterien besteht erfindungsgemäß in immunologischen Nachweisverfahren. Hierzu werden die klonierten Gene der beiden Enzyme in geeigneten Systemen exprimiert und die Enzyme gereinigt. Die gereinigten Enzyme werden zur Immunisierung von Tieren, z. B. Mäusen oder Hamstern, verwendet. Für das immunologische Nachweisverfahren werden entweder polyklonale Antiseren der Tiere verwendet; alternativ können entsprechende immunkompetente Zellen dieser Tiere, z. B. Milzzellen, zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen die beiden Enzyme isoliert werden.
Mit dem Verfahren der Erfindung lassen sich gramnegative Bakterien wie Salmonella, Brucella, Escherichia, Neisseria, Serratia, Pasteurella, Proteus, Shigella, Klepsiella, Chlamydia, Rikettsia und Pseudomonas nachweisen.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiel 1 Isolierung einer DNA-Probe aus E. coli K12 für das CMP-KDO- Synthase-Gen
Die in den Klammern angegebenen Literaturstellen betreffen die jeweils eingesetzten Arbeitsmethoden.
Chromosomale E. coli DNA wird nach der Methode von Marmur (J. Marmur, P. Doty (1962), J. Mol. Biol. 5, 109) isoliert, mit Ethanol gefällt (J. A. Meyers et al (1976), J. Bact. 127, 1529), mit 70%igem Ethanol gewaschen, im Exsikkator getrocknet und in sterilem Wasser resuspendiert. 10 µg der chromosomalen DNA werden nacheinander mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI verdaut (D. Nathans, H. O. Smith (1975), Ann. Rev. Biochem. 44, 273), mit Phenol extrahiert (L. A. Salzmann, A. Weissbach (1967), J. Mol. Biol. 28, 53), wie oben Ethanol gefällt, gewaschen, getrocknet und resuspendiert. 5 µg der verdauten DNA werden mit 1 µg gleichermaßen verdauter pUR250 Plasmid-DNA (U. Rüther (1982), Nucl. Acids Res. 10, 5764), die nach der Methode von Rüther et al (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6852 (1982)) isoliert wird, mit T4 DNA-Ligase über Nacht ligiert (F. Bolivar et al (1977), Gene 2, 95), in den E. coli K12 Stamm MM82-1 (M. Mieschendahl, B. Müller-Hill (1986). J. Bact. 164, 1366) transformiert (S. N. Cohen et al (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110) und auf Vollmedium-Platten mit Ampicillin und x-gal (5-Brom-4-chlor-3- indolyl-beta-D-galaktosid) plattiert. Durch die Klonierung in die lac alpha-Region des Plasmids pUR250 wird die alpha- Komplementation des Plasmids verhindert, so daß auf x-gal haltigen Agarplatten weiße statt blaue Kolonien entstehen (K. E. Langley et al (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 1254). Weiße Transformanten werden in Grid auf einer Agarplatte ausgezogen (J. Miller (1972), Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor, NY, USA) und nach der Kolonie-Hybridisierungsmethode von Grundstein und Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961, (1975)) mit einer DNA-Probe solche Klone isoliert, die das CMP- KDO-Synthase-Gen plasmidständig tragen.
Als DNA-Probe wird eine käufliche synthetische DNA-Sequenz verwendet, die der Teilsequenz
5′GATCCGACGCTGAAGGGTATGCACTGTACTG
und ihrer komplementären Sequenz
5′GATCCAGTACAGTGCATACCCTTCAGCGTCG
oder einer anderen Teilsequenz des CMP-KDO-Gens entspricht (R. C. Goldman et al (1986), J. Biol. Chem. 261, 15831) und über BamHI- Enden in das Plasmid pUR250 kloniert wurde. Die Probe wird an ihren BamHI-Restriktionsschnittstellen mit alpha32P-Deoxyribonukleotiden radioaktiv markiert (H. Klenow, I. Henningsen (1970), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 65, 168), auf einem 12% Polyacrylamidgel vom Plasmidrest getrennt und aus dem Gel isoliert (A. Maxam, W. Gilbert (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560).
Sau3A-Restriktionsfragmente eines so erhaltenen Klones werden nach vollständiger und partieller Restriktionsverdauung mit Sau3A in die BamHI-Schnittstelle des Plasmids pUR250 subkloniert und als DNA-Probe eingesetzt.
Beispiel 2 Isolierung einer Probe für das Lipoid A Disaccharid-Synthase-Gen
Für die Isolierung einer DNA-Probe für das Gen Lipoid A Disaccharid- Synthase wird analog zu der Arbeitsweise des Beispiels 1 verfahren. Allerdings wird hier als DNA-Probe zur Isolierung des Gens eine käufliche synthetische Sequenz verwendet, die der Teilsequenz
5′AGCTTTTGCGCCAGACATATCCGGATCTCGA
und ihrer komplementären Sequenz
5′AGCTTCGAGATCCGGATATGTCTGGCGCAA
oder einer anderen Teilsequenz des Lipoid A Disaccharid-Synthase- Gens (D. N. Crowell et al (1987), J. Bact. 169, 5727) entspricht und über HindIII-Enden in das Plasmid pUR250 kloniert sowie radioaktiv markiert wird.

Claims (3)

1. Verfahren zum Nachweis von gramnegativen Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DNA-Probe, die zu für die Enzyme Lipoid A Disaccharid-Synthase und/oder CMP-KDO- Synthase codierenden Nucleotidsequenzen oder 20 bis 25 Basenpaaren langen DNA-Abschnitten derselben komplementär ist, verwendet, oder daß man die für die Enzyme Disaccharid- Synthase und/oder CMP-KDO-Synthase kodierenden Nucleotidsequenzen der gramnegativen Erreger isoliert, kloniert und exprimiert sowie die exprimierten Enzyme isoliert, mit den Enzymen Säugetiere, insbesondere Mäuse immunisiert, aus den immunisierten Tieren polyklonale Antikörper isoliert bzw. in üblicher Weise monoklonale Antikörper herstellt und diese in üblicher Weise zur Diagnose einsetzt.
2. DNA-Probe zur Verwendung in einem Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch für die Enzyme Lipoid A Disaccharid-Synthase und/oder CMP-KDO-Synthase kodierende Nukleotidsequenzen oder 20 bis 25 Basenpaare lange DNA-Abschnitte derselben.
3. Antikörper zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, erhältlich durch Isolierung der für die Enzyme Lipoid A Disaccharid-Synthase und/oder CMP-KDO-Synthase kodierenden Nukleotidsequenzen, Klonierung und Exprimierung derselben sowie Isolierung der exprimierten Enzyme, Immunisierung von Säugetieren, insbesondere Mäusen, mit den Enzymen, Isolierung von polyklonalen Antikörpern aus den immunisierten Tieren oder Herstellung von monoklonalen Antikörpern mittels üblicher Methoden.
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