JPS62500632A - ヨザル種間ハイブリド−マおよびそれに より産生される単クロ−ン性受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、ハイブリドーマがＰＩ８−ｐ３−１ｏＧ、ＡＴｃｃ　Ｈ８８４０と称され る、請求の範囲第１３項記載の細胞系。

１５、ハイブリドーマがＦ１ａ−Ｐ２−１０Ｅ、ＡＴＣＣＨ８８６４０と称され る、請求の範囲第１３項記載の細胞系。

１６、ハイブリドーマがＰＩ９−ＰＩ３−９Ｃ，ＡＴＣＣＨ８８４０と称される 、請求の範囲第１３項記載の細胞系。

１５、ハイブリドーマがＰＩ９−Ｐ９−ＬＩＢ、、ＡＴＣＣＨ８８４０と称され る、請求の範囲第１３項記載の細胞系。

１８、ハイブリドーマから分泌された、ｔａｌ　予め選んだ抗原と免疫反応し、 ｔｂｌ　ヨザル（ＡｏＬｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）の抗体に対して起され た多クローン性抗体により結合され、 （Ｃ１マウス抗体に対して起された多クローン性抗体により実質的に結合されな い ハイプリドーマ分泌単りローン性受容体分子。

１９、受容体分子が熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）シゾント またはメロゾイトのタンパク質と免疫反応する、請求の範囲第１８項記載の受容 体分子。

２０、タンパク質が、シゾントにより作られメロダイト発育中にポリペプチドフ ラグメント中ヘブロセッシングされる約１８５ｋｄの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分 子量を有する糖タンパク質である、請求の範囲第１９項記載の受容体分子。

２１、ハイブリドーマが前記予め選んだ抗原に対し免疫感作したヨザル（Ａｏｔ ｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）の抗体産生細胞と、前記抗体産生細胞とは一同 数の染色体毎細胞を含むマウス骨髄腫細胞との融合により形成される、請求の範 囲第１８項記載の受容体分子。

２２、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体産生細胞が５４または５６染色体を含む、請求 の範囲第２１項記載の受容体分子。

２３、マウス骨髄腫細胞が細胞系、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３からである、請求 の範囲第２１項記載の受容体分子。

２４、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）種間ハイブリドーマを製造する方法であって、（ａ ｌ　予め選んだ抗原により免疫感作されたヨザル（Ａｏｔｕｓｔｒｉｖｉｒｇａ Ｌｕｓ）から抗体産生細胞を採取する段階、（ｂｌ　前記細胞と骨髄腫細胞系の 細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる段階、前記骨髄腫細胞は抗体産 生細胞とほり同数の染色体毎細胞を含み、前記融合は細胞融合プロモーターの存 在下に行なわれる、 （ｃ＋　前記ハイブリドーマをハイブリドーマの成長に選択性の培地中でクロー ニングする段階、 ＋ｄ＋　前記クローニングしたハイブリドーマを、前記予め選んだ抗原と免疫反 応する受容体分子を分泌する能力について検定し、選択する段階、 （Ｑｌ　選んだハイブリドーマをモノクロニジティに対してサブクローニングす る段階、 （［１段階（ｅｌの選び、サブクローニングしたバイブリドーマを培養する段階 、および （ａ　段階（ｆ）のハイブリドーマを採取する段階、を含む方法。

２５、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体産生細胞が５４または５６染色体毎細胞を含む 、請求の範囲第２４項記載の方法。

２６、骨髄腫細胞が５８染色体毎細胞を含む、請求の範囲第２５項記載の方法。

２７、骨髄腫細胞系が非分泌性細胞である、請求の範囲第２４項記載の方法。

２８、骨髄腫細胞系がマウス骨髄腫細胞系Ｐ３Ｘ６３Δｇ８．６５３である、請 求の範囲第２７項記載の方法。

２９、予め選んだ抗原が熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）シ ゾントまたはメロゾイトとのタンパク質である、請求の範囲第２４項記載の方法 。

明　細　書 ヨザル種間ハイブリドーマおよびそれにより産生される単クローン性受容体 技術分野 本発明は種間ハイブリドーマに関し、より詳しくはヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉ ｖｉｒｇａＬｕｓ）誘導ハイブリドーマおよびそれから産生さる単クローン性受 容体（免疫グロブリン）分子、ヒト寄生体により産生される非ウィルス性寄生体 抗原と反応するヨザル（Ａｏｔｕｓ）誘導車クローン性受容体を含む、に関する 。

背　景 １９７５年コーラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）は棒組細 胞ハイブリッド形成を用いて、予め規定した抗原に対する特異抗体を分泌できる 連続細胞系を樹立できることを示した。そのような細胞系により産生された抗体 は普通に免疫感作した哺乳動物から得られる多クローン性抗血清とは基本的に異 なる。そのような細胞系またはハイブリドーマはそれぞれ、免疫感作した哺乳動 物により産生される多くの抗体の１つのみを表わす均一または単クローン性の免 疫グロブリンを産生ずる。従って、予め決定した特異性の抗体の永続的供給を与 えることができる。コーラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅ ｉｎ、Ｃ，）、（１９７５）ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６　：　４．９ ５〜４９７゜古典的ハイブリドーマ形成技術は免疫感作した動物からの致死抗体 産生Ｂリンパ球と骨髄腫細胞系から得た不死細胞との融合に基く。普通の実施に おいて、骨髄腫細胞系はそれ自体抗体を産生じない、免疫グロブリン産生のため の非産生性特異体（骨髄腫）を抗体産生細胞例えばＢリンパ球を融合させると、 免疫グロブリン産生が消滅せず、また再活性化した骨髄腫による免疫グロブリン の産生（分泌）がない。ハイブリッドは、融合のときに親細胞により生成された 免疫グロブリン鎖のみを生じた。

ハイブリドーマにより産生された単クローン性抗体はウィルスの抗原構造の説明 に広く用いられた。これらの研究は寄生体疾患におりる予防接種の可能性および 免疫の役割に注意を集中した。

しかもなお原生動物寄生体の研究はそれら生物の複雑な生活環のために困難であ った。ハイブリドーマは精製抗原を必要としないので、単クローン性抗体はヒト 寄生体疾患の研究に対する簡単で魅力的な方法を与える。

マラリアのスポロゾイトに対し、ホトシャックはか（ＰｏｔｏｃＪ＋ｊａｋ。

Ｐ、）ほか、（１９８０）ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メデイシン （Ｊ、　ＥｘＰ、　Ｍｅｄ、）　、１５１　：　１５０４〜１３、およびヨシダ （Ｙｏｓｈｉｄａ、　Ｎ、）ほか、（１９８０）→Ｊ゛イエンス＜５ｃｉｅｎｃ ｅ）２０７：７１〜７３により記載されたように、種々の抗原に対する単クロー ン性抗体をスクリーニングして保護を与えるものを決定することができ、特異釣 車クローン性抗体を用いて表面抗原を精製し、ワクチンを製造することができる 。単クローン性抗体が多くの寄生体に対して産生され、生物化学および病因の機 構を現在一層速やかに調査することができる。ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｔ 、）ほか、（１９８０）ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソーヅ（Ｊ、　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　３４　：　１４１〜５４　ｉセシー（Ｓ ｅｔｈｉ。

Ｋ、）ほか、（１９８０）ジャーナル・オプ・パラシトロジー（Ｊ。

Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、）　６６　：　１９２〜９６゜多くの場合に、これらの単 クローン性抗体を産生ずるハイブリドーマはマウス骨ｆ！腫と膵臓から分離した 抗原刺激マウスリンパ球との融合により得られた。抗原分析にある程度有用であ るけれども、ヒト寄生体に行なった奮歯動物由来の単クローン性抗体は少くとも ２つの欠点を持つ。第】に、雀歯動物は必ずしも人のように同様の寄生体の抗原 決定基に応答しない。シコラほか（Ｓｉｋｏｒａ、に、　ａｎｄ　Ｗｒｉｇｈｔ 、Ｒ，）　（１９８１）ブリティンシュ・ジャーナル・オブ・カンサー（１１ｒ 、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ）　４３　：　６９６〜７００参照。第２に、陥歯動吻単ク ローン性抗体は、それらがヒト免疫系により異質としてみられ、拒絶されるので ヒトの免疫療法における使用が限定されるであろう。オルソンはか（ＯＩｓｓｏ ｎ＋Ｌ、　ａｎｄＫａｐｌａｎ、Ｉｌ、）　（１９８０）プロシーディング・オ ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オプ・ジ・ユナイテッド ・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ｔｌｓＡ）　７７　：５４２９〜５４３１゜ 上記欠点を克服する試みは抗原刺激ヒトリンパ球とヒトまたはマウス骨髄腫との ハイブリッド形成に集中した。ヒト−ヒト種間ハイブリドーマの製造は主に、融 合すると免疫グロブリンの産生を支持するヒト骨髄腫細胞系の現在の不足により 妨げられた。コズボルはか（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｒｏｄｅｒ、Ｊ）　 （１９８３）イムツル・トウディ　（Ｉｍ＋ｍｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ）　４　 ：　７２〜７９．さらに、ヒトのリンパ球を倫理的に刺激して得ることができる 方法に制約がある。

ヒト誘導細胞融合パートナ−の不足を克服するために、ヒトリンパ球をマウス骨 髄腫細胞系と融合させてマウス−ヒト種間ハイブリッドが生成された。そのよう なハイブリドーマはフォルスマン（Ｆｏｒｓｓ＋ｗａｎ）抗原〔ナウインスキイ （Ｎｏｗｉｎｓｋｉ、Ｒ，）ほか、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１０　：　 ２３７〜２３９）　、ヒト乳癌細胞〔シュロム（Ｓｃｈｌｏｍ、Ｔ、）ほか、（ １９８０）プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステート・オブ・ジ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ）７７　：　６８４１〜６８４５ ）　、キーホールリンペットヘモシアニン〔レーン（Ｌａｎｅ、　Ｈ，）ほか（ １９８２）ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メデイシン（Ｊ、　ｌ！ｘ ｐ、　Ｍａｄ、）１５５：３３３〜３３８〕および破傷風トキソイド〔コズボル （Ｋｏｚｂｏｒ、　Ｄ、）ほか（１９８２）バイブリド−７（Ｉｌｙｂｒｉｄｏ ｍａ）、１：３２３〜３２８〕に対するヒト抗体を分泌させるために作られた。

しかし、多くのマウス−ヒト種間ハイブリドーマは優先的にヒト染色体を分離し 、それによりヒト抗体を分泌する安定な系の製造を困難な仕事にすることが認め られた。マウス−ヒトハイブリドーマからのそのようなヒト染色体の喪失は不規 則ではない。ヒト染色体１４（Ｈ鎖）および２２（Ｌ鎖−人）は優先的に保持さ れるが、染色体２（Ｌｔｎ−ｋ）は優先的に失なわれる。

ハイブリッドが適当なヒト染色体を存しても、適当な環境刺激が存在しないので しばしばヒト免疫グロブリンを分泌しない、コズボルはか（ＫｏｚｂｏｒｔＤ、 　ａｎｄ　Ｒｏｄｅｒ、Ｊ、）　、前掲、さらに抗体を産生ずるマウス−ヒトハ イブリッドはマウス免疫グロブリンおよび（または）一部マウスで一部ヒトであ る免疫グロブリンを分泌すると報告されている。ジュワーバー（Ｓｃｈｗａｂｅ ｒ、Ｊ、）　（１９７５）エクスベリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐ、　Ｃ ｅ１１．　Ｒｅｓ、）　９３　：３４３〜３５４゜ コブロウスキー（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ）ほかに対する米国特許第４．１７２．１ ２４号および第４，１９６，２６５号には腫瘍およびウィルスとそれぞれ免疫反 応する単クローン性抗体の製造が開示される。両特許は抗体産生細胞および骨髄 腫細胞を得る種が融合ハイブリドーマ細胞の製造に重要でないことを教示する。

これらの教示にもカミわらず、これらの特許が単にマウス−マウスハイブリドー マの製造を特定的に開示し、当業者はリンパ球および骨ｆＪＨＩ細胞系細胞外有 用なハイブリドーマおよびそれらの単クローン性抗体の良好な生成に重要である ことを認識している。

後記する本発明は属プラスモジウム（ＰＩａｓａ＋ｏｄｉｕｓ）の寄生体微生物 の研究の結果である。その属は現在を椎動物宿主の肝臓の実質細胞中で生ずる分 裂による■型の無性増殖（赤血球外シゾゴニー）に基いて定義され、他の特徴は 蚊宿主がアノフェレス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）の種であることである。ブルース ーシュワフト（Ｌ。

Ｊ、Ｂｒｕｃｅ−Ｃｈｗａｔｔ）　、エセンシャル・マラリオロジー（Ｅｓｓｅ ｎｔｉａｌＭａｌａｒｉｏｌｏｇｙ）、ウィリアム・ハイネマン・メディカル・ プックス、しｔｄ、、ロンドン（１９８０）、２章、−触に認められた人に感染 する４種のプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）は四日熱マラリア原虫（Ｐ 、ｍａｌａｒｉａｅ）　、三日熱マラリア原虫（Ｐ、ｖｉｖａｘ）、熱帯熱マラ リア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋＊）および卵形マラリア原虫（Ｐ、ｏｖａ ｌｅ）である。

ヒトマラリア寄生体のすべての種の生活環は実質的に同じである。それには一定 のアノフェレス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）蚊中で増殖する外生存性朋（スボロゴニ ー）およびを椎動物宿主中で増殖する内生無性期（シゾゴニー）が含まれる。後 者の期には血液中の赤血球中の発育環（赤血球シゾゴニー）並びに肝臓の実質細 胞中で起る環（赤血球外シゾゴニー）が含まれる。

赤血球シゾゴニーの初期期において寄生体は栄養型といわれる。

成長期後に栄養型はシゾゴニーの無性分裂過程により増殖する。

成熟したシゾントは完全発育形態であり、その中に核および細胞質の分節の結果 メロゾイトといわれる多くの小円形形態が生成される。

シゾゴニーの過程が終ると赤血球が破裂しメロゾイトが新券血球に侵入し、その 中で寄生体の他の世代が同じ過程により生成される、この過程は感染の過程中何 度も繰返され、その過程が宿主の免疫応答により遅くなるまで寄生生血が漸増す る。

ヒトプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）のすべての種の中で熱帯熱マラリ ア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）が最も高い病因である。非免疫患者におけ る熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染は通常急性の経過を経 験し、機敏に特異的薬物で処理しなければ、しばしば致命的に終る。

今日、マラリア感染を診断する唯一の確実な方法は血液の顕微鏡試験によるプラ スモジウム（Ｐｌａｓ”＋５ｏｄｉｕ１１）の検出である。原膜法は、それが顕 微鏡スライド表面上の赤血球の層を２０〜４０の倍率に濃縮し、それによりわず かな感染でも短時間内に示すので推奨される。寄生体は厚膜検定において容易に 検出されるけれども、この方法を用いて種に関して確認することは非常に困難で ある。

種の確認が臨床に重要であることができるので、厚膜検定は種の確認に備える薄 膜検定により補足しなければならない。標準的実施は経験専門家が適切に染色さ れた厚膜を少くとも５分間（油浸下の約１００顕微鏡視野に相当する）調べるこ とを要し、薄膜は陰性仰告が承認される前に１５〜２０分間調べねばならない。

疑わしい場合には血液膜を繰返してとり、４時間毎に調べねばならなず、専門家 の時間のかなりの消費を生ずる。厚・薄膜法はブルースーシュワット（Ｌ、Ｊ、 Ｂｒｕｃｅ−Ｃｈｗａｌ　ｔ）によりエセンシャル・マラリア感染−（Ｅｓｓｅ ｎｔｉａｌ　Ｍａｌａｒｉｏｌｏｇｙ）、ウィリアム・ハイネマン・メディカル ・ブックス、Ｌｔｄ、、ロンドン（１９８０）、７６〜９６頁に記載されている 。

免疫けい光検査、免疫血球凝集、免疫沈降および酵素結合免疫吸着法を用いる検 定は抗マラリア抗体の検出および測定に広く使用された。しかし、これらの血清 試験は、それらが血液中のマラリア寄生体の出現後数日のみ陽性になるので、急 性マラリアの診断に限定的に使用される。

一層マラリアが診断されると、寄生体生活環の種々の期の介在に用いることがで きる抗マラリア薬物のスペクトルが存在する。

暴露によりある程度免疫を得た人は免疫を有しない人より一層容易に重大な症状 から治癒または保護されることができるので、感染した人の免疫の状態は薬物の 使用に関連を存する。しかし、今日まで初期感染から絶対的な保護を与える存効 な薬物は存在しない。

マラリアにおける免疫応答の研究における顕著な進歩にもか〜わらず、なお寄生 体に対するワクチンが存在しない、マラリアの自然免疫は寄生体の無性赤血球形 態（すなわち、栄養型、シゾントおよびメロゾイト）に対して行なわれるが、必 ずしもスポロゾイトに対してではない。しかし、この領域における一層の進歩は 、これらの生活環段階に対し特有の宿主認識抗原決定基に対する特異的抗血清を 産生ずる能力のないことにより妨げられた。

発明の概要 本発明は予め選んだ抗原、例えばメロダイト発育中にポリペプチドフラグメント 中ヘブロセノシングされる熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に より産生される約１８５ｋｄの分子量を有する非つィルス性寄生体抗原糖タンパ ク質と免疫反応する単クローン性受容体分子を分泌するヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔ ｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）種間ハイブリドーマを製造する方法を意図する。該方法 には予め選んだ抗原、例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）により免疫怒作されたヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓサル）か ら抗体産生細胞例えば肺細胞または末梢Ｂリンパ球を採取する段階が含まれる０ 次いでこれらの細胞を、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体産生細胞とは一同数の染色体 筋細胞、例えば約５染色体毎細胞以内、を含む他の動物型〔非ヨザル（Ａｏｔｕ ｓ））の骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成させ；融合は細胞融合の プロモーターの存在下に行なわれる。融合は典型的には両種の細胞等数で行なわ れる。

そのように形成されたハイブリドーマは、ハイブリドーマの成長に選ばれた培地 中で、約３２〜約２Ｘ１０’細胞毎２００ミクロリツトル培地、より好ましくは 約４Ｘ１０’〜約２Ｘ１０’細胞毎２００ミクロリツトル培地でクローニング（ 平板培養および成長）される。クローン化したハイブリドーマは予め選んだ抗原 と免疫反応する受容体分子を分泌する能力について検定し、選択する。そのよう な受容体分子を分泌するハイブリドーマ、すなわち選んだハイブリドーマ、はそ の後もモノクロニジティ（ｍｏｎｏｃｌｏｎｉｃｉｔｙ）にサブクローニングさ れる。選んだサブクローニング化ハイブリドーマを培養し、採取する。培養した ハイブリドーマにより分泌される本発明の単クローン性受容体を培地から回収す る。

本発明の受容体分子を分泌する殊に好ましいハイブリドーマは、予め選んだ抗原 、例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対する抗体を分泌 するヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓサル）の細胞と、非分泌性骨 髄腫系、例えばＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３と称される細胞系からのマウス骨ｆＪ ＩＩｉ細胞との融合により製造される。核型■および■のヨザル（Ａｏｔｕｓ　 Ｌｒｉｖｉｒｇａｔｕｓサル）からの細胞はそれぞれ５４および５６染色体を含 むと叩告されている。上記骨髄腫系からの細胞は５８染色体を含むと報告されて いる。

ハイブリドーマ細胞系もまたこ−に意図される。その細胞系はヨザル（Ａｏｔｕ ｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）からの抗体産生細胞と約同数の染色体筋細胞を含 む他の動物型〔非ヨザル（Ａｏｔｕｓ）　）の骨髄腫細胞との融合により製造さ れる。骨Ｕ腫細胞系は好ましくは非分泌系例えばマウス骨髄腫系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ ８．６５３である。

ハイブリドーマ細胞系は培養したときに、クローニング後生くとも６週間単りロ ーン性受容体分子を分泌する。これらの受容体分子は＋ａ＋生物学的に活性であ り、すなわち、それらは予め選んだ抗原リガンド例えば融合ヨザル（Ａｏｔｕｓ ）細胞からの抗体が免疫反応するりガントと免疫反応する、（ｂｌヨザル（Ａｏ ｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）の抗体に対し起された多クローン性抗体によ り結合され、（Ｃ１骨髄腫細胞を得た動物型の抗体に対し起された多クローン性 抗体例えばマウス骨髄腫系が使用された場合にマウス抗体に対する抗体により実 質的に結合されない。

好ましい受容体分子はまたヒト抗体に対し起された多クローン性抗体により結合 される。

ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体産生細胞からの抗体と、および殊に好ましいハイブリ ドーマのヨザル（Ａｏｔｕｓ）単クローン性受容体と免疫反応する（それにより 結合される）抗原は熱帯熱マラリア原虫（Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のタンパク質、糖タンパク質を含む、である、最も好ま しくは、その抗原は熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）シゾン トにより作られ、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋ｍ）メロディ ト発育中にポリペプチドフラグメント中ヘプロセッシングされる５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅによる約１８５ｋｄの分子量を有する糖タンパク質である。

本発明の４種の殊に好ましいハイブリドーマ細胞系はアメリカン・タイプ・カル チャー・コレクシジン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ）により１９８４年１０月１１日に受託された。これらのハイブリ ドーマは、Ｆ１ａ−Ｐ３−１０Ｇ　５ＣＲＦ６３．０（ＡＴＣＣＨＢ８６４１） 、Ｆ１ａ−Ｐ２−１０Ｅ　５ＣＲＦ６３．０（ＡＴＣＣＨＢ８６４０）、Ｆ’１ ９−Ｐ９−１１ＢＳＣＲＦ６３．Ｏ（ＡＴＣＣＨＢ８６４２）およびＦ１９−Ｐ ２１−９ｃ　５ｃＲＦ６３．０　（八ＴＣＣＨＢ８６４３）　と称されている。

本発明はさらにハイプリドーマ分泌華りローン性受容体を意図する。これらの受 容体は（ａｌ生物学的に活性であり、ｔｂ）ヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒ ｇａｔｕｓ）の抗体に対し起された多クローン性抗体により結合され、（ｂｌ骨 Ｕ腫細胞を得た同じ動物型の非ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体に対し起された多クロ ーン性抗体、例えばマウス抗体に対する抗体により実質的に結合されない。

好ましい受容体は生物学的に活性であり、それらは、予め選んだ非ウィルス性寄 生体抗原タンパク質、例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋ｍ ）シゾントまたはメロゾイトのタンパク質と免疫反応する。より好ましい態様に おいて、受容体はメロディト発育中にポリペプチドフラグメント中ヘプロセソシ ングされる熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｌｌｌ）シゾントに より産生された１８５ｋｄ糖タンパク質に結合する。さらに好ましくは、受容体 は１８５ｋｄ塘タンパク質並びに１８５ｋｄｕＮタンパク質が熱帯熱マラリア原 虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイトによりプロセッシングされる２群 のポリペプチドの１つまたは他に結合する。殊に最も好ましい受容体はまた熱帯 熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋ｍ）のホンジュラス（Ｈｏｎｄｕ ｒａｓ）　、ケニア（Ｋｅｎｙａ）、インドシナ（Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ）、ゼネ バ（Ｇｅｎｅｖａ）およびケニア（Ｋｅｎｙａ）種の１つまたはより多くに結合 する。

発明の詳細な説明 ■、緒論 ハイブリドーマ技術の１つの大きな利点は不純な抗原でも予め決定した特異的抗 体を生ずる能力である。この視点からみてハイブリドーマ技術の単クローン性抗 体の産生に対する使用は抗体精製法と考えることができる。

動物が免疫原（抗原）で免疫感作されると、その免疫系はそれぞれ単に１つの抗 体分子を生ずるリンパ球の貯蔵所を生ずる。従って、そのような動物の血清は免 疫原になされた多くの異なる抗体を含み、すなわち、抗体は多クローン性である 。免疫原が不純であれば、多くの無関係な抗体もまた誘発されて血清中に含まれ る。

抗体を産生ずるハイブリドーマ技術は免疫感作した動物の抗体産生細胞貯蔵所に 存在する他のすべてが存在しない１つの抗体形成細胞をクローニングする。不純 物に反応する抗体を分泌する細胞は初めのスクリーニング過程中に捨てられる。

そのように分離された単クローン性細胞培養株は化学組成均一であり、１つの結 合部位イデイオタノプのみを含み、その相当する抗原決定基に対する１つのアフ ィニティーのみを示すたＱｌつの抗体を産生ずる。

寄生体感染宿主により自然に認識される免疫原決定基に行なわれる単一特異性抗 体を分泌する能力は診断および臨床努力に大きな利益であろう０本発明の前は、 そのような抗体の製造は倫理的な増殖の可能な有効な融合系を入手できなかった ので実施できなかった。

「分泌」および「産生」という用語は抗体分子が得られる細胞に関して該技術に おいてしばしば互換的に使用される。しかし、抗体を産生ずる細胞はそれらの環 境中へこれらの分子を分泌できない。こ＼に関心のある細胞はそれらの環境中へ 抗体を分泌する。

それにもか−ねらず、そのような細胞は該技術に使用される熟語に一致させて「 抗体産生」細胞としてこ＼に言及されている。

ヒトマラリアの場合に、宿主の免疫応答の実質部分がメロゾイトに対して行なわ れることが知られている。疾患の臨床症状を起すメロゾイトに対する免疫は免疫 γ−グロブリンで受動的に転写できる。コーエン（Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　）ほか 、（１９６１）ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　１９２　：　７３３〜７３５．従 って、ワクチンの開発には、ヒト保護抗体を向けることができるメロゾイトの表 面抗原を６’ｌ認および特性化することが重要である。

メロゾイト血漿膜の組成は現在調査中であるにすぎない。最近の研究により、と きどき１９０ｋｃｌまたは１９５ｋｄタンパク質として報告された１８５キロド ルトン（ｋｄ）　［クンバク質のプロセッシング生成物が感染宿主により認識さ れる抗原決定基を含むことが示された。しかし、これらの結果は催歯動物系で得 られた。それらが蕩歯動物免疫に対する主タンパク質抗原を確認するけれども、 それらは必ずしもヒト免疫に重要な特異的決定基を確認しな本発明は自然ヒト系 に密接に類似するマラリアの研究に対する典型的なモデル系を与える。サル系が サルとヒトとの間の密接な系統発生関係に基いて選ばれた。さらに、そのような 系は生寄生体感染による免疫に関し厳しい倫理的制約を有することが少ない。

この研究において、サル種ヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）が、 ヒトマラリア寄生体、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）によ り感染される能力のために寄生体宿主として選ばれた。そのような感染が、マラ リアに対するヒト応答に非常に類似するサル宿主中の免疫応答を誘発すると思わ れる。リース（Ｒｅｅｓｓ、　Ｒ，）ほか、（１９８１）アメリカン・ジャーナ ル・オプ・トロピカル・メデイシン・アンド・ハイジーン（Ａ＋ｍ、　Ｊ、　Ｔ ｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙｇ、＞　３０６　：１１６８〜１１７８゜ Ａ、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）種間ハイブリドーマ本発明は免疫受容体分子を分泌し 、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）細胞と約同数の染色体、すなわち細胞当りに約５染色体 内で同数を有する非ヨザル（Ａｏｔｕｓ）骨髄腫細胞に融合したサル、ヨザル（ Ａｏｔｕｓ）、抗体産生細胞の細胞ハイブリドーマを含む安定なハイブリドーマ 細胞系を意図する。そのように産生されたハイブリドーマはＤＮＡハイブリッド 形成技術により確認できるヨザル（ｌｌｏｔｕｓ）および非ヨザル（Ａｏｔｕｓ ）両由来の遺伝物質を含む。そのように製造されたハイブリドーマは、生物学的 に活性であってそれらが抗原例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａ ｒｕｍ）メロゾイトの表面に表現される抗原のような非ウィルス性寄生体抗原と 免疫反応する単クローン性受容体分子を分泌する。

ハイブリドーマにより分泌さる単クローン性受容体分子はヨザル（Ａｏｔｕｓ） 受容体であり、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体に対し起される多クローン性抗体によ り結合される。これらの受容体は融合に用いられた骨髄腫細胞を得た同じ動物型 からの抗体に対し起される多クローン性抗体により結合されない。従って、本発 明の殊に好ましいハイブリドーマにより分泌される単クローン性受容体は抗ヨザ ル（Ａｏｔｕｓ）サルＩｇ抗体により結合されるが、しかし、抗ヒトＩｇ抗体に より結合されない。本発明の殊に好ましいハイブリドーマの単クローン性受容体 が抗ヒトＩｇ抗体により結合されることもまた認められた。

本発明のハイブリドーマはまた安定である。「安定」という語によりハイブリド ーマが、培地中で成長させたときにクローニング後生くとも６鍔間の間その単ク ローン性受容体を分泌することを表わす。

ヨザル（Ａｏｔｕｓサル）は、ハイブリドーマの形成に融合させる骨髄腫細胞系 の細胞と約同数、すなわち５染色体内、の染色体筋細胞を有する。例えば、ヨザ ル（Ａ、　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）抜型■および抜型■はそれぞれ５４および ５６染色体を有すると報告されている〔マ（Ｍａ、Ｎ、）ほか、（１９７６）ラ ボラトリ−・アニマル・サイエンス（Ｌａｂ、＾ｎｉｍ、ｓｃｉ、）２６：１０ ２２〜１０３６）、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体産生細胞を融合させる典型的なマ ウス誘導骨髄腫（Ｐ　３　Ｘ　６３Ａｇ８．６５３）は５８染色体を含むと報告 されている。

〔ハイブリドーマ・テクニークス（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ）　、ＥＭＢＯＳＫＭＢコース（Ｃｏｕｒｓｅ）　、１９８０、バーセル、コー ルド・スプリング・／”ｔ−バー（Ｂａｓｅｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ＋　ＮＹ（１９８０）＋　ｐ、８）　。

いかなる単一理論によっても拘束されることを欲しないけれども、細胞融合パー トナ−間の染色体数かは一′調和することが本発明の種間細胞融合の安定性に対 する大部分の原因であると思われる。

本発明のハイブリドーマの模範的なＭｍは熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃ ｉｐａｒｕｍ）に対し予め免疫感作したヨザルＡｏｔｕｓ　１２７（抜型■）の 肺臓から分離したインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）抗原刺激８９７８球を用いた２つ の別の融合（融合Ｆ１８およびＦ１９）において生成された。

Ｆ１ａおよびＦ１９中に生じたハイブリドーマをクローニング（平板培養および 成長）し、初めに免疫けい光抗体技術（ＩＦＡＴ）を用いて受容体分子の分泌に ついてスクリーニングした。この技術は物質および方法、セクションＩＩ　（Ｅ ）に詳細に記載され、薄膜臨床診断技術の変形である。

略示すると、この方法において任意の分泌された抗体を顕微鏡スライド上に広げ た感染赤血球中のメロゾイトと免疫反応する能力に対し検定した。分泌抗体とメ ロゾイトとの間の免疫反応の存在はメロゾイトと免疫反応して抗体に結合した２ 次けい光抗体との混合により検定された。

ＩＦＡＴにおいて３またはより大きい初期陽性力価を有した受容体分子を分泌す るＦ１ａおよびＦ１９からのハイブリドーマの若干が表１に示される。この初期 スクリーニング検定は無関係な抗体を分泌するかまたは全く分泌しないものから 所望抗体を分泌するハイブリドーマを選ぶために考慮された。

ＴＦＡＴＩＩＩ性ハイブリドーマの多くは次いでモノクロナリティ（ｍｏｎｏｃ 　１ｏｎａ　Ｉ　ｉ　ｔｙ）についてサブクローニングされ、未知クロニジティ 　（ｃｌｏｎｉｃｉ　ｔｙ）を有するものは表１にアンダーサインが引かれてい る。所望抗原特異性を有する単クローン性抗体を産生ずるハイブリドーマ、すな わち熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイトと免疫反応 する単クローン性受容体を分泌するものを回収した。

アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシジン（ＡＴＣＣ，１２３０１゜Ｐａ ｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２）受託 番号を有する表１中の単クローン性ハイブリドーマは本発明の殊に好ましいＬＪ ｔ＝である。

スー−Ｌ マウス骨髄腫細胞に融合したヨザル （ＡｏＬｕｓ）　の　ハイブリッド ＊　アンダーラインを引いたハイプリドーマ名は未知クロニジティのハイブリド ーマを示す。

＊＊　ＴＦＡＴ＝免疫けい光抗体試験、物質および方法セクション■、Ｅに記載 。

本発明のハイブリドーマ細胞系は受容体分子として示される単クローン性抗体を 分泌する。事実ヨザル（Ａｏｔｕｓ）誘導受容体分子の分泌は本発明のハイブリ ドーマの識別特徴である。この特徴はそれらを単クローン性に対しｖａ認し、分 離し、サブクローニングすることを可能にする。

受容体は、リガンドに免疫的に結合（反応）する生物学的活性分子である０本発 明の受容体分子はイディオタイプ（抗体結合部位）を含み、完全な抗体、実質上 完全な抗体または抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド（結合部位）部分であ る。

受容体分子の生物学的活性は水性培地中、ぼり生理的ｐＨ値およびイオン強度に おけるそれらの混合物上のその抗原リガンドまたは抗原に対する受容体の結合に より証明される。好ましくは、受容体はまた約５〜約９のｐＨ範囲内で、蒸留水 ないし例えば約１モルの塩化ナトリウムのようなイオン強度で抗原リガンドに結 合する。

抗体のイディオタイプ含有ポリペプチド（抗体結合部位）は、イディオタイプを 含み、抗原リガンド例えばメロゾイトに結合する抗体分子の部分であり、抗体の ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）茸部分を含む、抗体のＦａｂおよびＦ　（ａｂ　’　 ＞を部分は該技術に良く知られ、良く知られた方法による抗体上のパパインおよ びペプシンのそれぞれの反応により製造される０例えばチオフィロポラスはか（ Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ　ａｎｄ　Ｄｉｘｏｎ）に対する米国特許第４． ３４２，５６６号参照、完全な抗体が好ましく、本発明により意図される受容体 分子の例示として使用される。

用いた「抗原」という用語は受容体分子により免疫的に結合する実体を意味する 。

用いた「免疫原」という用語は宿主動物中の抗体産生を誘発する実態を示す、あ る場合には抗原および免疫原は同一の実体であるが、他の場合には２つの実態は 異なる。免疫原および抗原が同一実態である場合に抗原という用語が使用される 。

用いた「抗原決定基」という用語は同一または関連する抗原または免疫原により 引出さた相当する受容体分子（免疫グロブリン）との特異的相互反応の原因であ る分子の構造成分を示す。

用いた「免疫原決定基」は抗原として用いたときに免疫原と結合するイディオタ イプ、抗体結合部位、を含む受容体分子の宿主中の誘発の原因である分子（エピ トープ）の構成成分を示す。

本発明は安定な種間ハイブリドーマ細胞系およびそれから単クローン性受容体分 子を製造する方法を意図する。本発明において、殊に好ましい態様の適例の受容 体分子は熱帯熱マラリア原虫（Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕ＋ａ）シゾトンまたはメロゾイトのタンパク質、糖タンパク 質を含む、と反応する。しかし、本発明の安定な種間ハイブリドーマおよびその 華クローン性受容体を製造する方法は一般的であり、例として示すハイブリドー マおよび受容体分子の製造に限定されないことを理解すべきである。

ハイブリドーマを製造する方法は予め選んだ抗原に対し免疫感作したヨザル（Ａ ｏｔｕ３サル）から抗体産生細胞を採取することにより開始される。有用な抗体 産生細胞（Ｂリンパ球）は、典型的には牌摘出により得られる肺細胞であり、ま たは静脈穿刺によるように血液から得ることができる末梢Ｂリンパ球である。リ ンパ節および骨（ａ　ｌ１ｆｆｉ細胞もまたＢリンパ球源として役立つことがで きる。

採取した抗体産生細胞は予め選んだ抗原に対する抗体を分泌する。こ＼に記載す る模範的な手順において、ヨザル（Ｉｌｏｔｕｓ）は、ｖＩ物を熱帯熱マラリア 原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｎ＋）で感染することにより能動的に免疫感作 した。感染による免疫感作が好ましいが、しかしこの方法の成功に必須であると は思われない。従って、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｎ）が こ＼に用いる予め選んだ抗原を与える。しかし、該技術に知られた生活規則を用 いる予防接種もまたこの方法に有用である。

次いで採取した抗体産生細胞を、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）の細胞とぼり同数の染色 体毎細胞を含む非ヨザル（Ａｏｔｕｓ）骨髄腫細胞の細胞と融合させる。すなわ ち、採取したヨザル（Ａｏｔｕｓ）細胞および融合に用いる骨髄腫細胞はそれぞ れ他の細胞の約５以内にある二倍体染色体数を含む。

例えば抜型■（５４の二倍体染色体）のヨザル（Ａｏｔｕｓｔｒｉｖｉｒｇａｔ ｕｓ）の細胞が抗体産生細胞である場合に、それを約４９〜約５９の二倍体染色 体を含む骨髄腫細胞と融合させることができる。同様に抜型■（５６の二倍体染 色体）のヨザル（ＡｏｔｕｓＬｒｉｖｉｒｇａ　ｔｕｓ）の細胞は約５１〜約６ １の染色体を含む骨髄腫細胞と融合させることができる。

骨髄腫細胞はヨザル（Ａｏｔｕｓサル）以外の動物からである。好ましくは骨髄 腫細胞は非分泌性である。抜型■または抜型■のヨザル（Ａｏｔｕｓ）細胞との 融合に有用である殊に好ましい骨ｔＦ！ｌ１ｆｆｉ細胞は、前記のように５８染 色体を存すると報告されているＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ１ ５８０）と命名された非分泌性マウス骨髄腫細胞系である。

細胞は典型的には抗体産生細胞と骨髄腫細胞との約１：１の割合で行なわれる。

約１０倍までの過剰の骨髄腫細胞もまた使用できる。

細胞融合は細胞融合プロモーターの存在下に行なわれる。そのような物質にはセ ンダウィルス、約５００〜約２．０００の平均分子量のポリエチレングリコール または良く知られた電流が含まれる。

融合細胞はその後、ハイブリドーマ成長に選んだ培地、例えばこ＼に用いたＨＡ Ｔ培地、中でクローニング（平板培養および成長）される。クローニングは広く 約３２〜約２０，０００（２ｘ１０４）細胞毎２００ミクロリットルの濃度で行 なわれる。

クローン化したハイブリドーマは予め選んだ抗原と免疫反応する受容体分子を分 泌する能力について検定し、選択する。記載したＴ　ＦＡＴ検定はそのような有 用な検定の１つである。用いる特定の検定は典型的には抗原および受容体分子系 の関数であり、本発明の特徴ではない。

所望の特異性の受容体を分泌するハイブリドーマ、すなわち選んだハイブリドー マ、はその後該技術に知られているようにモノクロニジティ　（ｍｏｎｏｃｌｏ ｎｉｃｉ　ｔｙ）にサブクローニングする。サブクローン化した単クローン性ハ イプリドーマを次に培養し、必要に応じ回収することができる。

より好ましい実施において、ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体産生細胞を凍結し、次い でハイブリドーマ製造工程の前記ハイブリドーマ形成融合段階のすぐ前に凍結す る。そのような細胞が典型的には培地中で速やかに死ぬので、「すぐ」という語 により凍結した細胞を解凍後できるだけ速やかに融合させることを表わす。

ハイブリドーマ製造のなお一層好ましい方法は、さらにリンパ球採取前に受容体 を産生ずるリンパ球を強化する段階を含む。強化処理は融合させるリンパ球採取 の約１週間以内、より好ましくは約３日以内にインビボ（ｉｎ　ｖｊｖｏ）抗原 刺激またはインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）抗原刺激により行なうことができる 。インビボおよびインビトロ抗原刺激の特定例は物質および方法、セクション■ （Ｂ）　、２および３に見出されるが、より一般的な論議は以下に見出すことが できる。

本発明の単クローン性受容体は本発明のハイブリドーマを培養し、分泌された受 容体分子を上澄み増殖培地から採取することにより得ることができる。既述のよ うに、単クローン性受容体分子は生物学的に活性であり、予め選んだ抗原リガン ド、例えばヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体産生細胞の抗体が反応する抗原リガンドと 免疫反応する。

例えば、こ＼に用いたヨザル（Ａｏｔｕｓサル）を熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　 ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）に対して能動的に免疫感作し、その抗体を熱帯熱マラリ ア原虫ＣＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｏ＋）シゾントまたはメロゾイトのタンパク質 、例えば前記１８５ｋｄ［タンパク質、で免疫反応した。この免疫感作サルの抗 体産生細胞の融合により製造された殊に好ましいハイブリドーマはまた熱帯熱マ ラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）シゾントまたはメロゾイトのタンパ ク質で免疫反応した。

本発明のハイブリドーマにより分泌される本発明の単クローン性受容体分子はヨ ザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）の抗体に対し生ずる多クローン性 抗体により結合される。従って、例えば本発明の受容体分子はウサギ抗ヨザル（ Ａｏｔｕｓ）　Ｉ　ｇ抗体により結合される。

逆に、本発明のハイブリドーマにより分泌される本発明の単クローン性受容体分 子は骨髄腫細胞を得る動物型の抗体に対し生ずる多クローン性抗体により実質的 に結合されない。例えば、マウス骨Ｕ腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞を融合に 使用した場合にヤギ抗マウスＩｇ抗体はＩＦＡＴ検定において本発明の分泌され た受容体と免疫反応する。

別表に表わすと、本発明の受容体分子は、（１）予め選んだ抗原すガント、例え ばヨザル（ｌｌｏｔｕｓサル）の免疫感作に用いた抗原リガンド分子に対する受 容体であり、（２）抗ヨザル（Ａｏｔｕｓ）　Ｉ　ｇ多クローン性抗体に対する リガンドであり、（３）骨髄腫系の動物型の抗体に対し生ずる多クローン性抗体 に対する実質的なリガンドでも受容体でもない、けれども最少の一般化した抗体 −抗体反応が起ることができる。

単クローン性受容体分子はまたヒト抗体に対し生ずる抗体（リガンド）により結 合される。

記載した一連の研究におけるハイブリドーマはヨザル（Ａｏ　ｔｕｓｔｒｉｖｉ ｒｇａｔｕｓ）抗体産生細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３との 融合生成物である。そのようなａ様により受容体はヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体に 対し生ずる多クローン性抗体により結合され、マウス抗体に対し生ずる抗体によ り結合されない全抗体（ｗｈｏｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり、より好ましく は、またヒト抗体に対し生ずる多クローン性抗体により結合される。

この研究に用いたハイブリドーマの製造方法はヨザル（Ａｏｔｕｓ）種サルを非 ウィルス性寄生体熱帯熱マラリア原虫ＣＰ、　ｆａｌｃｊｐａｒｕｍ）で感染で きる事実を利用する。薬物処理で感染したサルは確実な能動免疫を発現し、すな わち通常の致死寄生体投与の接種がわずかに検出できるまたは検出できない寄生 生血を生ずる。

さらに、抗体産生細胞源、例えばハイブリドーマの製造に対するＢリンパ球、と してヨザル（Ａｏｔｕｓサル）の使用はそのような源として人を用いるよりも若 干の利点を有する。サルは高度の能動免疫が得られるまで病原体で繰返し感染で きる。人における使用が容認できないアジュバント、例えばフロイント（Ｐｒｅ ｕｎｄ）をサルに用いて免疫原に対する免疫応答を改善することができる。

第３に、サルは容易に牌摘出することができる。

本発明の方法は受容体分子産生のためにリンパ球を強化する段階を含む前記２つ の別の、殊に好ましい態様を意図する。１態様において・ヨザル（Ａｏｔｕｓ） 　ｌｌＱ’ｌＦａ　Ｂリンパ球をインビボ抗原刺激により受容体産生に対して強 化させた。他の態様において、末梢血液リンパ球の強化をインビトロ刺激により 達成した。

それぞれ１つの強化法を用いる２つの融合の結果が表２に示される。融合Ａでは 、リンパ球はインビボ抗原刺激により強化し、次いで物質および方法、セクショ ンｎ　（Ｂ）２に記載される肺臓から回収した。融合Ｂでは、末梢血液リンパ球 （Ｐ　Ｂ　Ｌ）は物質および方法、セクション■（Ｂ）３に論議されるインビト ロ刺激により強化した。比較のために示したマウス−マウス融合の結果もまた表 ２に示される。

Ｌニー影 サル融合 インビボ融合　インビトロ刺激　マウス（Ａ）　（Ｂ）　農−企 牌細胞　７Ｘ１０’　−−−２Ｘ１０”ＰＢＬ　−−−、ｌＸｌ０’　−−− 接種ウェル　１３８０　６４０　２４．００抗体陽性ウェル”　９７　４０　２ ７８抗体陽性ウェル％“−ｇ　１０　１Ｂ 安定ハイブリドーマ　１４　３　１５６安定ハイブリド一マ％””　１　１　１ ０安定ハイプリドーマ／１０’　２　０．３　０．７８融合のためにウェル中 に置いたリンパ球 １１９６ウエルプレート中の寄生体または赤血球抗原に対する抗体を含むウェル の数 傘本　抗体陽性ウェルの数／ノ＼イブリッドを有するウェルの数ｉ　００ …安定なハイブリッドの数／ハイブリ・ノドを有するウェルの数×　１００ 表２はバイブリドーマの製造に対する本発明により意図された方法の使用におけ る２つの予期されない利点を示す。

第１に、好ましいインビボ強化法が比較マウス−マウス融合において得られたよ り約１０倍高い融合効率を生ずる。その結果はシコラほか（Ｓｉｋｏｒａ　ａｎ ｄ　Ｗｒｉｇｈｔ）、前掲、によるヒト−マウスおよびヒト−ラットのハイブリ ッド形成に対する融合頻度がマウス−マウスまたはラット−ラットのハイブリッ ド形成に対し同じ骨髄腫細胞を用いて認められたよりも非常に低かったとの報告 に照らして殊に意外である。

第２に、この研究において生じた安定なヨザル（Ａｏｔｕｓ）誘導ハイブリドー マがすべて熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｊｐａｒｕｍ）メロゾイト表面 抗原と反応性の単クローン性抗体を分泌した。対照的に、１５６のマウス−マウ スハイブリドーマ中の単に６つが類似の特異性を有する抗体を生じた。この６つ のハイブリドーマ中４つのみがメロゾイト表面抗原と反応した単クローン性受容 体を生じた。この結果は、マウスよりも寄生体の自然宿主のヒトに一層近似する サルの免疫応答のためであると思われる。

これらの利点は、本発明のヨザル（Ａｏｔｕｓ）ハイブリドーマ系が他の非ウィ ルス性ヒト寄生体病原体と反応性の単クローン性抗体の産生に有用であることを 示す。

表２に示される融合Ａの結果は予備タイトレージジンを初めに行なって免疫グロ ブリン産生ハイブリッドの成長を促進するが、しかし非産生ハイブリッドによる 生産体の過成長を邪魔する初期濃度を樹立することにより得られた。過成長はマ ウス−マウス融合に通常使用される細胞密度で生ずることが認められた。ヨザル （Ａ、　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）肺細胞とマウス骨ｆｆＪｉｌｌｉＰ　３　Ｘ 　６３Ａｇ８．６５３細胞との融合からの細胞を、広範には約３２〜約２ＸＬＯ ’細胞毎ウェル（培地２００ミクロリツトル）、より好ましくは約４×１０３細 胞〜約２Ｘ１０’細胞毎２００ミクロリツトル培地の濃度で、９６ウ工ル組織培 養ミクロタイタープレート〔コスタ−（Ｃａｓｔｅｒ）モデル３５９６　、Ｃａ ｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ＾〕中で培養した。肺細胞に用いた好ましい濃度は典型的 にはＰＢＬの培養に用いたものの約１／３であった。

２Ｘ１０’細胞毎ウエルの肺細胞濃度が事実上すべてのウェル中に細胞成長を生 じた。４Ｘ１０！牌細胞毎ウエルの？二度が一般にウェルの４０〜５０％に成長 を与えた。サル牌細胞を用いた後の融合は４〜５Ｘ１０３細胞毎ウエルにプレー ト中へ接種した。

融合への結果は初めに接種した１３８０ウエル中１０６７が生育可能なハイブリ ッドを発生したことを示す。これらのウェルからの培養上澄液のＩＦＡＴによる 分析、物質および方法、セクションＩＩ　（Ｅ）に詳細に記載される、は９７ウ エル中に抗メロゾイト抗原抗体の存在を示した。前記のようにこれらの上澄液中 の抗体は赤血球と反応しなかった。

次いでＩＦＡＴＩＩ性種ウェル中のつイブリッド細胞をモノクロナリティに対し サブクローニングし、２４ウエルプレート〔コスタ−（Ｃｏｓｔｅｒ）モデル３ ５２４）に継代培養した。継代培養の１１日後に２４ウエルプレートからの上澄 液をＩ　ＦＡＴにより検定すると６１ウエルがもはや抗寄生体抗体（受容体）の 検定可能量を含有しなかった。

この結果は２つの因子のためであると思われる。第１に若干のハイブリッドがイ ベント例えば遺伝子喪失、により免疫グロブリンを分泌する能力を失うことがで きる。第２に、免疫グロブリン産生細胞が非産生細胞よりも遅く複製することが 知られている。

従って、多くの産生ハイブリッドが２４ウエルプレート中に過成長したようであ る。

Ｂ、受容体分子 本発明はまた本発明のハイブリドーマ細胞系により分泌される単クローン性受容 体分子を倉口する。受容体は好ましくは既述のように完全抗体である。本発明の 殊に好ましい単クローン性受容体分子がこのセクションに論議される。

また前記のように、メロゾイトの表面抗原がマウス単クローン性抗体を用いて研 究されたのはつい最近である。これらの研究は１９０または１９５キロドルトン （１９０〜１９５ｋｄ）抗原糖タンパク質が熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃ ｉｐａｒｕｍ）シゾント中に合成され、メロゾイトの発育の最後の数時間中に一 連の別のポリペプチドフラグメントによりプロセッシングされることを示す、プ ロセッシング生成物の１つがメロゾイトの表面に現われ、ヒトマラリア免疫血清 により免疫沈降されるので、１９０〜１９５ｋｄタンパク質のポリペプチド生成 物がマラリアワクチン開発に対する重要な関心である。フリーマンはか（Ｆｒｅ ｅｍａｎ、　Ｒ，Ｒ，ａｎｄ　Ｈｏ１ｄｅｒ。

Ａ、Ａ、）　（１９８３）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイシン （Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）　１５８　：　１６４７〜５３゜我々の研究室に おいて、報告された１９０〜１９５ｋｄ前駆物質が５ＤＳ−ＰＡＧＥにより１８ ５キロドルトン（１８５ｋｄ）の見掛は相対分子量を有することが認められた。

従って、そのタンパク質は以下１８５ｋＪＩ３タンパク質として示される。

マウス単クローン性抗体を用いた研究は、１８５ｋｄ前駆物質がポリペプチドの ２つの抗原的に異なる群にプロセッシングされることを示す。群１には１２０． ０００　（１２ｋｄ＞　、９０．０００　（９０ｋｄ）　、８８．０００　（８ ８ｋｄ）　、４６．０００　（４６ｋｄ）　、および４０、　ＯＯＯ（４０ｋｄ ）の見掛は分子量の主ポリペプチドが含まれる。群２には１５２，０００　Ｎ５ ２ｋｄ＞　、１０６．００ｏ　（１０６ｋｄ）および８３．　ＯＯＯ（８３ｋｄ ）の主ポリペプチドが含まれる。

プロセッシングした群２のポリペプチド（１５２ｋｄ、　１０６ｋｄおよび８３ ｋｄポリペプチド）は検出できるグルコサミンを含まないことが認められ、群１ のポリペプチド（１２ｏｋｄ、９０　ｋｄ、　８８ｋｄ、４６ｋｄおよび４０ｋ ｄポリペプチド）グルコシル化を含むと認められた。

他の報告は、８３ｋｄポリペプチドがメロゾイトの表面にあることを示す〔フリ ーマンばか（Ｆｒｅｅｅｍａｎ、Ｒ，ａｎｄ　Ｈｏ１ｄｅｒ、Ａ、）（１９８３ ）ジャーナル・オプ・エクスベリメンタル・メディシン（Ｊ、　ＥＸＩＩ。

Ｍｅｄ、）１５８：１６４７〜１６５３Ｈハイドリツヒ　（Ｈｅｉｄｒｉｃｈ。

Ｈ，）ほか、（１９８３）ツァイトシュリフト・フェア・バラシテンクンデ（Ｚ 、　Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋａ、）　６９　：　７１５〜７２５　）が１８５ｋｄ 糖タンパク質が表面になく、１５２ｋｄおよび１０６ｋｄポリペプチドは全く不 在であることができる。我々の研究室のマウス−マウスハイブリドーマ〔ハヮー ドほか（Ｈｏｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｒｅｅｓｅ）　、前掲〕からの抗体を用いた研 究は４６ｋｄまたは４０ｋｄポリペプチドがメロゾイトの表面にあることができ ることを示す。

融合Ｆ１８およびＦ１９からのハイブリドーマにより分泌された完全抗体の形態 の受容体分子をメロゾイト抗原に関するそれらの特異性について試験した０表３ に示される最初の結果は１８５ｋｄ前駆物質糖タンパク質をプロセッシングする 群了および２の１つまたは他に対する特異性（ＲＩＰＡ結果）並びに熱帯熱マラ リア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の種間の特異性（Ｉ　ＦＡＴ結果）を 示す。

分泌された単クローン性受容体分子のそれぞれは、Ｆ１ａ−Ｐ２Ｏ−１０Ｂで示 すハイブリドーマにより分泌されたものを除いて、また１８５ｋｄｌｑタンパク 質と免疫反応した。

唐ニー１ ゛クローン　ｒ体特−性および　六−心土−４−−Ｊヨー　凹゛　回籾ビ旦紐３ 釦１ｎ旦ゝ１、　ｔ（ｏｎ　＝熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｅｉｐａｒｕ ｍ）のホンジュラス（Ｈｏｎｄｕｒａｓ）　Ｉ／ＣＤＣ（中央アフリカ）株２、 Ｋｅｎ　＝熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕａ＋）のケニア（Ｋｅ ｎｙａ）　（東アフリカ）株 ３、Ｉｎｄｏ＝熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のインドシ ナ（Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ）　＋　（ベトナム）株４、Ｇｅｎ　−熱帯熱マラリア 原虫ＣＰ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｆｆｉ）のゼネバ（Ｇｅｎｅｖａ）　（セネガル 西アフリカ）株５、Ｔａｎｚ−熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕ ｍ）のタンザニア（Ｔａｎｚａｎｉａ）　＋　（西アフリカ）株６、ＲＩＰＡ＝ 物質および方法のセクションに記載し、受容体が免疫反応するポリペプチドプロ セッシング群の検定に用いた放射免疫沈降検定。０＝単に１８５ｋｄｔ１！タン パク質の免疫沈降のみ試験した；１一群１．２一群２゜ ＊＝検定せず。

＊’に＝３５ｋｄタンパク質と免疫反応し、１８５ｋｄｌｌｉタンパク質あるい は群１または２のいずれのタンパク質とも免疫反応しない。

＋＝陽性免疫反応 一＝陰性免疫反応 ±＝疑性免疫反応 例示すると、殊に好ましいハイブリドーマＦ１８−Ｐ３−１０Ｇは、１８５ｋｄ 前駆物質および主Ｇ２プロセッシング生成物の３つのすべて、すなわち１５２ｋ ｄ、　Ｉ　Ｏ６ｋｄおよび８３ｋｄポリペプチド、に免疫的に結合（反応）する 受容体分子を分泌する。他の殊に好ましいハイブリドーマ、Ｆｌ　９−Ｐ９−１ １Ｂ、は１８５ｋｄｉｉｉ駆物質および群１の１２０ｋｄ、　９０ｋｄ、８８ｋ ｄ、　４６ｋｄおよび４０ｋｄポリペプチドブロセソシング生成物のそれぞれと 免疫反応する受容体を分泌する。ハイブリドーマＦ１８−Ｐ２−１０ＥはＳＤ、 ５−ＰＡＧＥによる約３５ｋｄの分子量を有するこれまで未知のポリペプチドに 結合し、１８５ｋｄ前駆物質あるいは群１または２のいずれかのポリペプチドに 結合しない受容体を分泌する。

表３に示される結果は、１８５ｋｄ＠駆物質分子が少くとも２つの異なる抗原（ 免疫原）決定基を含むことを示す。それらはまたプロセッシング群間に交差反応 性がないので本発明のハイブリドーマが単一特異性受容体分子を分泌することを 示す。

この研究のＦｌ８およびＦ１９ハイブリドーマにより分泌された受容体分子はま たＩＦＡＴによりそのマラリア株特異性について試験した。これらの結果もまた 表３に示され、２つの単クローン性抗体が前記のように同様のプロセッシング群 特異性を有することができるが、それらはまた群内で異なる抗原決定基を認識で きることを示す。

例えば、バイブリド−７Ｆ１９−Ｐ２１−９ＣおよびＦｌ９−Ｐ５−１１０はと もに群２の１８５ｋｄプロセンシングボリベブチド（１５２ｋｄ、　１０６ｋｄ および８３ｋｄ）を認識する受容体を産生ずる。しかし、Ｆｌ　９−Ｐ２１−９ Ｃにより認識された抗原決定基は検定した熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃ ｉｐａｒｕｍ）の５株すべての中に存在したけれども、Ｆｌ９−Ｐ５−１１Ｄに より認識された決定基はホンジュラス（Ｉｌｏｎｄｕｒａｓ）およびゼネバ（Ｇ ｅｎｅｖａ）株のみに存在した。

これらの結果は、研究した５つの主要熱帯熱マラリア原虫（Ｐ。

ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）株に共通の少くとも１つの抗原決定基の存在を示すので 、ワクチン設計に重要である。従って、広いスペクトル効率をもつために活性ワ クチンは本発明のハイブリドーマ例えばハイブリドーマＦ１９−Ｐ２１−９Ｃの 受容体が反応するものに類似する免疫原決定基を組入れるべきである。

さらに、これらの結果はまた特異性決定基の存在を示す。そのような決定基はマ ラリアの突発源を６１１　Ｆしなければならない疫学的研究に重要であることが できる。臨床的には株特異性決定基はまたマラリアの薬物耐性株の確認に重要で あることができる。

本発明のハイブリドーマにより分泌される抗体は、従って診断助剤として使用し 患者の赤血球をスクリーニングし、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａ ｒｕｍ）メロゾイトの抗原特性が存在するがどうかを決定することができる０例 えばハイブリドーマＦ１９−Ｐ２１−９Ｃにより生じた受容体を初めにＩＦＡＴ または他の検定に用いてホンジュラス（ｌｌｏｎｄｕｒａｓ）　、ケニア（Ｋｅ ｎｙａ）、インドシナ（Ｉｎｄｏｃｈｉｎａ、）、ゼネバ（Ｇｅｎｅｖａ）およ びタンザニア（Ｔａｎｚａｎｉａ）株に基く感染の存在を示すことができる。そ の後ハイブリドーマＦｌ　Ｂ−Ｐ３−１０ＧまたはＦｌ　８−Ｐ２−１０Ｂから の受容体を用いた同様の検定を用いてケニア（Ｋｅｎｙａ）、インドシナ（Ｉｎ ｄｏｃｈｉｎａ）、およびタンザニア（Ｔａｎｚａｎｉａ）　、またはホンジュ ラス（Ｉｌｏｎｄｕｒａｓ）およびタンザニア（Ｔａｎｚａｎｉａ）株をそれぞ れ排除することができる。

上記技術を用いて特定の株特異的抗原の存在を確認することにより特定株に基く 感染の存在が確認されると、患者は標準薬物療法で処置することができる。患者 はまた、本発明の受容体分子の有効量を生理的に耐えられる希釈剤例えば生理食 塩水またはリン酸塩緩衝塩水中に含む製剤で受動免疫手順で処置することができ る。用いる受容体分子はハイブリドーマＦ１８−Ｐ３−１００またはＦｌ９−Ｐ ９−１１Ｂにより生ずるもののように特定寄生体株に比較的に特異的であること ができる。患者はまた、受容体分子例えば５つの寄生体株のそれぞれと免疫反応 するハイブリドーマＦ１９−Ｐ２１−９ＣまたはＦｌ９−Ｆｌ７−６Ｅにより産 生されたものを用いて同様の受動免疫手順により処置することができる。

■物質および方法 Ａ　サル 過去１０年の間、増加した研究がサルまたはエイ１の若干のプラスモジウム（Ｐ ｌａｓｍｏｄｉｕｍ）が人に媒介できるだけでなくまたヒトマラリア寄生体を若 干の下等霊長動物、殊に新熱帯区のサルの若干の種に十分に媒介できることが示 された。従って、三日熱マラリア原虫（Ｐ、ｖｉｖａｘ）、熱帯熱マラリア原虫 （Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）および四日熱マラリア原虫（Ｐ、ＩＩＩａｌａ ｒｉａ）は今日アノフェレス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）によりヨザル（Ｃｏｌｕ＋ １ｌｂｉａｎ　ＮｉｇｈｔまたはＯｗｌ　ｍｏｎｋｅｙＡｏｔｕｓ　Ｌｒｉｖｉ ｒｇａｔｕｓ）に媒介されることができる。この研究に用いたサルはスクリップ ス・クリニック・アンド・リサーチ・ファウンデーション（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃ １１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　ＬａＪｏｌ ｌａ、　ＣＡ）に居住するヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）のコ ロニーがら得られた。

Ｂ、サルリンパ球 本発明のハイブリドーマおよび単クローン性受容体分子は免疫感作ヨザル（Ａｏ ｔｕｓ）のリンパ球を骨髄腫細胞と融合させることにより得ることができる。こ の研究において、受容体分子を分泌する免疫感作８９７８球は初めにベトナムか ら得られたＦＶＯと称された熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ）分離株で感染したヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓサル）から得 られた。我々はＦＶＯ分離株をザ・センター・フォ・ディシーズ・コントロール （ＴｈｅＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　（ＣＤＣ） ＋　Ａｔ１ａｎｔａ＋　Ｇｅｏｒｇｉａ）のＤｒ。

コリンズ（叶、Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｃｏ１１ｉｎｓ）から得た。表３に示した熱帯 熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の５株もまたＤｒ、コリンズ（Ｄ ｒ。

Ｃｏｆｆ１ｎｓ）から得た。

１．熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の増殖熱帯熱マラリア原 虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＦＶＯ分離株はトラガーはか（Ｔｒａｇａｒ　 ａｎｄ　Ｊｅｎｓｅｎ）　（１９７６）サイエンス１９３：６７３〜７５、のキ ャンドルジャー（Ｃａｎｄｌｅ　ｊａｒ）法を用いてインビトロに成長させた。

略示すれば、ヒト型０陽性赤血球をＲＰＭＩ−１６４０培地〔アービン・サイエ ンティフィック（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　１ｒｖｉｎｅ＋　ＣＡ ）製〕並びに１０％ヒト型０陽性血２９１４０ミクロダラム（μｇ）／ミクロリ ットルゲンタマイシンおよび２５ミリモル（ｍＭ）ＨＥＰＥＳ緩衝液中に５％へ マドクリットに懸濁した。感染赤血球細胞培養は、手動で１日１回交換した培地 １０ミリリツトル（ｍｌ）を有するキャンドルジャー中に保持した１００Ｘ１５ ミリメートル（ｍｍ）ペトリ皿〔サイエンティフィー／り・プロダクツ（Ｓｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔ）製〕中で増殖させた。

「キャンドルジャー」は白ろうそくを中心に置いた活栓を備えたデシケータ−で ある。デシケータ−中にペトリ皿を置いた後にろうそくを点火し、蓋をして活栓 を開いた。ろうそくが消えると活栓を閉じる。この処理はキャンドルジャー内に 低０２および高ＣＯ２含量をイ■する雰囲気を生ずる。ベトリ皿は次に３７℃で 培養した。

皿を静かに傾け、上澄液を抜出し、それを前記新ＲＰＭＩ−１６４０培地の一部 で置換することにより新培地を毎日与えた。

新券血球は３日または４日毎に加えた０割体および遊離メロゾイトを採取し、前 記のように補給したＲＰＭＩ−１６４０培地で２回洗浄し、リンパ球刺激に用い る前に３回凍結して解凍した。

熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）はまたインビボで増殖させる ことができる。この研究において、ヨザル（Ａｏｔｕｓｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ サル）　Ａｏｔｕｓ　２７をＦＶＯ分離株の静脈内注射（ｉ、ν、）により熱帯 熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｓ）で感染させた。Ａｏｔｕｓ　２ ７からの寄生生血をＡｏｔｕｓ　３３の感染に用いた。

Ａｏｔｕｓ　３３は１９８２年９月１日にｉ、ｖ、注射により感染させた。

１９８２年９月１０日にＡｏＬｕｓ　３３は１３％寄生虫血を示した。

２、インビボ抗原刺激 本発明のハイブリドーマおよび受容体分子を製造する方法の好ましい態様には受 容体分子を中枢するリンパ球を強化する処理が含まれる。この研究においてイン ビボ強化処理はヨザル（Ａｏｔｕｓｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓサル）　Ａｏｔｕｓ 　ｌ　２７　（抜型■）で行なった。

Ａｏｔｕｓ　１２７は初めに１９８２年５月１４日に熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、 　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）で感染することにより免疫させた。感染はＲＰＭＩ− １６４０培地１ｍＡ中に懸濁したＡｏｔｕｓ　２７から得た感染赤血球の０．０ ９ｍＪパック細胞容積（Ｐ　ＣＶ）の静脈注射により行なった。１９８２年５月 ２０日にＡｏｔｕｓ　１２７は解放性であったが１９８２年５月２６日におよび １９８２年５月３０日にＡｏｔｕｓ　１２７は２％寄生虫血を示した。

１９８２年６月７．８．９日にＡｏｔｕｓ　１２７に次の薬物処理をした：ダラ ブリム０．６５ミリグラム（ｍｇ）　３日すべて、およびロイコポリンを１９８ ２年６月７日に１．５＋ａｇ、　１９８２年６月８日ニ０．５１１１ｇオヨび１ ９８２年６月７日ニ０．５　ｍｇ。

１９８２年９月１日にＡｏｔｕｓ　２７血液の初期静脈注射を繰返した。１９８ ２年９月１０日に１３％寄生虫血を示すＡｏｔｕｓ　３３血液の１．　］、　ｍ ｍＡ　Ｐ　ＣＶをＡｏｔｕｓ　１２７に静脈内注射した。

約１年後、受容体分子産生リンパ球を牌摘出により採取する３日前にリンパ球を ＲＰＭＩ−１６４０培地中に１ｍｌに希釈した前記凍結し解凍した寄生体物質０ ．２　ｍ　ｌでＡｏｔｕｓ　１２７に腹腔内注射によりインビボ抗原刺激した。

その後、肺臓を無菌的に取出し、穏やかに裂きわけた。牌細胞を冷リン酸塩緩衝 塩水ＣＰ　Ｂ　Ｓ　；　１５０ｍＭ−ＮａＣｊ！および１０ｏ＋Ｍ−ＮａｚＰ　 Ｏａ　（ｐＨ７、４）　）で洗浄し、１０％ＤＭＳ０，５０％ＲＰＭＩ−１６４ ０培地および４０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）中で凍結した。融合のためｌバイア ルの約５〜ｌ０ＸＩＯ’細胞を含む牌細胞を速やかに解凍し、細胞をダルベツコ （Ｄｕ　Ｉｂｅｃｃｏ）高グリコース培地で洗浄し、すぐに後記のように融合さ せた。

３、インビトロ抗原刺激 本発明のハイプリドーマおよび受容体分子を製造する方法の他の好ましい態様に おいて、受容体分子産生リンパ球をインビトロ抗原刺激により強化した。この研 究におけるインビトロ抗原刺激リンパ球はヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇ ａｔｕｓサル）ＡｏＬｕｓ　３７　（抜型■）から得た。

Ａｏｔｕｓ　３７は初めに熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ） 分離株ＦＶＯｃ、分離株ＦＶＯから得た非瘤形成分株、またはＤｒ、コリンス（ 叶、　Ｃｏ１１ｉｎｓ）から得た、で感染することにより免疫した。

初期感染は１９８０年１０月４日に、ＲＰＭＩ−１６４０培地１、８　ｍ　ｌ中 に懸濁した１、２ｍｊ！ＰＣＶ−ＦＶＯｃ　％染赤血球（７％寄生虫血）のｉ、 ν、注射により行なった。１９８０年１０月２２日にＡｏｔｕｓ　３７は０．７ ％のピーク寄生出血を示した。

１９８１年１１月２４日、１９８２年４月２６日および１９８２年９月１日にＡ ｏｔｕｓ　３７をＲＰＭＩ−１６４０培地ＩｍＪ中の１０％寄生虫血を存するＡ ｏｔｕｓ　２７血液の０．０９ｍｔ’ＰＣＶで追加刺激した。１９８２年９月１ ０日に＾ｏｔｕｓ３７を前記のように１３％寄生虫血を有するＡｏｔｕｓ　３３ 血液の１．１　ｍ　ｆ　Ｐ　ＣＶの静脈注射で追加刺激した。約１年後、受容体 産生リンパ球を、凝固阻止剤としてヘパリンを用いて静脈穿刺により血液７ｍ／ を抜取ることにより採取した。

受容体産生末梢８９７３球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を次の方法で免疫感作したサルの血液 から分離した：　Ａｏｔｕｓ　３７血液７ｍ＋２を等容積のＰＢＳと混合した。

混合物５　ｍ　ｌを含むアリコートを５　Ｑｍｊ！コーニンク（Ｃｏｒｎｉｎｇ ）遠心分離管中でフィコールハイバック（Ｆｉｃｏｌｌ　Ｈｙｐａｑｕｅ）　１ ０　ｍ　１２上に層化した。上層をツルパル（Ｓｏｒｖａｌ）　ＲＴ　６０００ 遠心分離機中でツルパルＨ１００Ｏローターを用いて２０℃で２０分間２．　Ｏ ＯＯｒｐＩｍで回転した。遠心分離後、上層を吸出し、Ｂリンパ球含有界面を回 収してプールした。

次いで十分なＰＢＳを０℃でプールに加えて全量１５ｍｆｆ１にした。

細胞を１５００ｒｐｍで１０分間Ｏ℃で、遠心分離により２回洗浄した。ペレッ トを捕集しＰＢ３１ｍ／中に再懸濁し、前記のように遠心分離した。約２Ｘ１０ ’細胞を、１０％ウシ胎児血清、５Ｘ１０’モル（Ｍ）２−メルカプトエタノー ル（２−ＭＥ）および前記のようにキャンドルジャー培養により得た凍結し解除 した寄生虫感染赤血球４０ミクロリツトルを補給したダルベツコ高グリコース培 地１０ｍ１中に４日間懸濁した。生存ＰＢＬ、約１×１０７細胞、を洗浄し、後 記のように骨髄腫細胞と融合させた。

Ｃ骨髄腫細胞 マウス骨髄腫細胞系、Ｐ　３　Ｘ　６３Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５ ８０）およびＰ３Ｘ６３Ａｇ８　（ＡＴＣＣＴＩＢ９）を、１０％熱不活性化γ −グロブリンネ合ウマ血清（ギプコ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ。

ＮＹ）製〕を補給したダルベツコ高グリコース培地〔アービン・サイエンティフ ィック（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製〕に適用し次にその中で成長 させた。細胞は、すべての細胞融合研究前に少くとも３日間毎日継代培養して４ Ｘ１０’細胞毎ｍｌｌにした。

Ｄ、融合および単クローン性抗体分泌 本発明のハイブリドーマはサル受容体産生Ｂリンパ球と骨ｕｌ！細胞との融合に より形成した。融合はリンパ球と骨髄腫細胞とを融合プロモーター、例えばセン ダイウィルス、ポリエチレングリコール（分子量＆Ａ＞５ｏｏ〜約２，０００） または電流、の存在下に混合することにより行なった。

この研究において、インビボまたはインビトロ抗原刺激リンパ球を用いた融合を 同様に行なった。約ＩＸ］、Ｏ’　リンパ球を約等数の骨髄腫細胞とダルベツコ 血清不合培地５０ｍβ中で混合した。ツルパルＲＴ６０００遠心分離機中でツル パルＨ１００Ｏローターを用いて］、　５０　Ｑｒｐ＋ｍで１０分間遠心分離す ることにより細胞をペレット化した。生じた上澄液を吸出し、ペレットをかくは んして細胞を分散させた。

細胞にポリエチレングリコール１０００　（ポリオキシエチレン（２０））３５ ％Ｗ／ＶおよびＤ　Ｍ　Ｓ　Ｏ７，５％ｖ　／　ｖを含有するガス抜きしたＲＰ ＭＩ−１６４０培地からなる融合プロモーター１ｍｆを加えた。細胞をかくはん しながらこの溶液を徐々に約１分間にわたって加えた０次の１分にわたってＩ− （Ａ　Ｔ培地（１０％熱不活性化γ−グロブリンネ含ウマ血清、０．１１１１Ｍ ヒボキサンチン、０．００１ｍＭアミノプテリンおよび０．０３ｍＭチミジンを 含むダルベツコ高グリコース培地）１ｍｆｆを細胞と混合した０次の１分にわた ってさらにＨＡ　Ｔ培地１ｍＡを徐々に加えた０次いでさらにＨＡＴ８ｍｌを次 の２分にわたって加えた。

次いで細胞を前記のように１５０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離によりペレット化 した。上澄液を徘棄した後、細胞をＨＡＴ培地培地１０中Ａ中かに再懸濁し、下 記のように胸腺細胞を含むＨＡＴ培地４００ｍＡ！に加えた。細胞を９６ウ工ル 組織培養プレート〔コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）　）中へ、各ウェルに２００ミク ロリツトル（μｌ）のＨＡＴ細胞含有焙地を加えることにより接種し、培養した 。

インビボ抗原刺激リンパ球を用いる融合は初めに約５Ｘ１０’細胞毎ウエル（２ ００μ７りの密度で平板培養した。インビトロ抗原刺激リンパ球を用いた融合は 約１．５Ｘ１０’細胞毎ウエル（２００μ７りの初！’ＪＩ　湯度で平板培養し た。マウス−マウス融合は８Ｘ１０’細胞毎ウエル（２００μ２）の初期密度で 平板培養した。次いで融合した細胞を７％ＣＯ７を含有する増湿雰囲気中で３７ ℃で培養した。

サルリンパ球を用いた融合は融合の７日および１５日後に各ウェルから上澄み１ ００ミクロリツトルを除去し、それを、支持細胞としてＢａ１ｂ／ｃ　ＢｙＪマ ウス胸腺細胞を含む新ＨＡＴ培地１００ミクロリットルで置換することによりフ ィードした。融合後２１日およびその後退１回培地に胸腺細胞のないＨＡＴ培地 をフィードした。マウス融合培地は、融合の７日後にＢａ１ｂ／ｃ　ＢｙＪマウ ス胸腺細胞を含む新ＨＡＴ培地を、その後退に１度胸腺細胞のない新ＨＡＴ培地 をフィードした。

Ｂａ１ｂ／ｃ　ＢｙＪマウス胸腺細胞は５Ｂａｌｂ／ｃ　ＲｙＪマウスの胸腺を 、ダルベツコ培地１０ｍβ中へ裂き入れることにより調製した。胸腺細胞はツル パル遠心分離機中、前記ローター　で１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離するこ とによりペレット化した。ダルベツコ培地１０ｍ１中の再懸濁により２回洗浄し ペレット化した後、胸腺細胞を、前記のように接種またはフィードに適するよう に補給したダルベツコの培地４００ｍｌ中に再懸濁した。

Ｅ、免疫けい光抗体試験（ＩＦＡＴ） １、検定手順 熱帯熱マラリア原虫（Ｐ、　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイト抗原に特異的な ヨザル（Ａｏｔｕｓ）単クローン性抗体の存在はＩＦＡＴにより測定した。略示 すれば、９６ウエル培養からの上’ｌｆｆ？ｌ　１００　：ｉクロリットル（μ ｌ）をＰＢＳ１００ｍｊ！に加えた。希釈した上澄液１０ミクロリツトルをメロ ゾイト含有試験（ＩＦＡＴ）スライド上、室温で３０分間保温した。Ｉ　ＦＡＴ スライドを次いでＰＢＳで２回、蒸留水で２回洗浄し、室温で風乾した。

スライド上のメロゾイト抗原に結合したヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗メロゾイト抗体 をイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識ウサギ抗ヨザル（Ａｏｔｕ ｓ）免疫グロブリン抗血清１０μｌで室温で３０分間免疫反応させた。スライド を再びＰＢＳで２回、蒸留水で２回洗浄し風乾した０次いでスライドをけい光″ ａ微鏡により試験し、スライドに結合したメロゾイト抗原に結合したヨザル（Ａ ｏｔｕｓ）抗メロゾイト抗体の存在について検定した。

前記表に関連して記載したＴ　ＦＡＴ力価は陽性検定結果を得ることができた最 大ハイブリドーマ上澄希釈度の逆数である。希釈は倍率３により行なった。従っ て表１の力価は３の耳、すなわち３．９．２７および８１で示される。

ハイブリドーマにより産生された受容体分子に対する表３に示された株特異性は 顕微鏡視野中に認められたけい光メロゾイトの返信百分率により決定された。視 野が約７５％またはより高いけい光性メロゾイトを示した試験スライドを陽性（ ＋）とみなし、視野が約２０％またはより小さいけい光性メロゾイトを示したス ライドを陰性（−）とみなし、疑性（±）として示した１つの検定は約２０〜約 ７５％のけい光メロゾイト百分率を有した。

２、ウサギ抗ヨザル（ＡｏＬｕｓ）　Ｆ　Ｉ　Ｔ　Ｃ複合体ＦＩＴＣ標識つサギ 抗ヨザル（Ａｏｔｕｓ）免疫グロブリン（Ｉ　ｇ）抗体は、該技術に良く知られ た方法により調製した。略示すれば、ウサギヲヨザル（Ａｏｔｕｓ）血清Ｑ、’ ｌ　ｍ　ｌで２回免疫感作し、追加刺激し、次いで採血した。免疫感作ウサギ血 清の５０％飽和硫酸アンモニウム沈降物（４５ｍｇタンパク質毎ｍｌ）によりウ サギ抗ヨザル（Ａｏｔｕｓ）　Ｉ　ｇ約１１ｍｊ！を得た。

そのように得たウサギ抗ヨザル（Ａｏｔｕｓ）　Ｉ　ｇ抗血清はヨザル（ＡｏＬ ｕｓ）　Ｉ　ｇ　−ＣＮＢｒセファロース４Ｂ（ファルミ力・ファイン・ケミカ ルズ（Ｐｈａｒ＋＊ｉｃａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔｔ ａｗａｙ＋　ＮＪ）製〕カラムを用いてアフィニティー精製した。結合したウサ ギ抗ヨザル（Ａｏｔｕｓ）　Ｔ　ｇ抗体は０．２Ｍグリシン、０．１５　Ｍ−Ｎ ａＣＩｌ緩衝液（ｐａｌ　２．２６　）で溶出させた。ｙｇ画分く約２．０の光 学濃度）をプールしく約３５ｍｊり　、ＰＭ３０フィルター付アミファミコンセ ントレータ−〔アミコン・コーポレーション（＾−１ｃｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉ ｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ＋　Ｍ＾）製〕を用いて５ｍｆに′ａ縮し、　０．８５ ％ＮａＣｊ！に対して透析した。

透析から回収したウサギ抗体約３．３　ｍ　ｌを０．５　Ｍ炭酸基環−ｄｉ液（ ｐＨ９，５）　０．３１ｍｇで中和し、緩衝液（０，０５Ｍ炭酸塩、０．８５％ ＮａＣ１１ｐＨ９，５）５５ｍｌ中のＦＩＴＣ２，３ｍｇに対して１８時間透析 することによりインチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）標識した。生じた ウサギ抗ヨザル（Ａｏｔｕｓ）　Ｉ　ｇ−ＦＩＴＣ複合体をＰＢＳ中１：２０希 釈で前記Ｉ　ＦＴＣに用いた。

Ｆ、放射免疫沈降検定（ＲＩＰＡ） メロシイトタンバク質は次のように代謝的に標識した。略示すれば、メロゾイト キャンドルジャー培養株を前記のように、しかし３Ｈ−グルコサミン１ミリキユ リーまたは３Ｈ−チミジン１ミクロキュリーを補給して成長させた。

いずれかの同位体の存在下に１８時間成長させた後培養株は、赤血球をその増殖 培地中に再懸濁し、それをツルパルＲＴ６０００遠心分、４機中でＨ１０００Ｔ ：ｌ−ターを用いて２５０Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離することによってそれを ペレット化することにより採取した。細胞は２回ベレットを血清不合ダルベツコ 培地］、Ｏｍ１！中に再懸濁することにより洗浄した。洗浄した細胞のアリコー トになしＰＣ■赤血球５０μｌをＰＢＳで２５０μρに希釈することによりＲＩ ＰＡ検定に用いた。次いで希釈した細胞をアリコートになし５０μｌを管中に置 き次いで貯蔵のため一７０℃で凍結した。

ＲＩＰＡはまず上記アリコートの１つをＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ−ＮａＣ１ １，１％トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ−１００Ｃポリオキシアルキレン（９）オ クチルフェニルエーテル〕、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシ ル硫酸ナトリウム、２０ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）　− ＨＣｊ！、　ｐｌ−１７，４）　５ｍｌ中へ希釈することにより行なった。この 組成物はベンクマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）　Ｓ　Ｗ　５０．１０−ター中で４０． 　ＯＯＯｒｐｍで４５分遠心分離した。生じた上澄液を採取し、１００μ！アリ コートに分割した。

代謝的に放射性標識したメロシイトタンバク質は次のように本発明により産生じ た受容体分子で免疫反応させた。上記アリコートのそれぞれにサル抗メロゾイト 抗原単りローン性抗体を共有結合させたスタヒロコソカス・アウレウス（Ｓｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）タンパク質入−セファロース（Ｓｅｐｈ ａｒｒｏｓｅ）　１０μｐを加えた。反応混合物を穏やかにかくはんしながら１ 時間培養した。

抗体コートしたタンパク質入−セファロースビーズを次いでフイ７シャ＝ミクロ セントリ７ユージ（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）中で３０ 秒間遠心分離することにより反応混合物から分離した。

ビーズを、５００酵塩化ナトリウムを含むＲＩＰＡ緩衝液で１回、および澤留水 で１回洗浄した。ベレットを試料緩衝液Ｃ０，０６２５ＭトＩＪス−ＨＣ５（ｐ Ｈ６，８＞　、２％ＳＤＳ、１０％グリセリン、５％２−ＭＥおよびＯ，ＯＯ１ ％ブロモフェノールブルー〕　５０μβ中に１分間再懸濁した。その後免疫反応 生成物を分離し、レームリ　（Ｌａｅｍｍｌｉ）、１９７０、ネーチ＋　（Ｎａ ｔｕｒｅ）　２２７　：　６８０〜８３、により記載されたように９％ポリアク リルアミドゲル上でドデシル硫酸ナトリウムの存在下に（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電 気泳動により分析した。生じたゲルをコダック（Ｋｏｄａｋ）　Ｘ　ＲＰ　Ｉ　 Ｘ線フィルム〔コダック（Ｋｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）製〕を 用いてオートラジオグラフィーにより分析した。

Ｇ、受容体−抗体相互作用 マウスＩｇおよびヒトｒｇに対する抗体に用いて行なった研究は、市販調製物、 それぞれの動物型抗体に対して起された多クローン性ＦＩＴＣ標準ヤギ抗体〔タ ーボ（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）製〕を用いて行なった。略 示すれば、ＩＦＡＴ試験スライドを調製し、前記のように、本発明の受容体と反 応させた。その後ＦＩＴＣ（＋ｊ！ｍヤギ抗ヒトｒｇまたは抗マウス［ｇ抗体を ヨザル（ＡｏＬｕｓ）抗体結合メロゾイトと１＝５０希釈で混合した。スライド を保温し、洗浄し、前記のように読取った。

抗マウスｒｇ抗体は、本発明のヨザル（Ａｏｔｕｓ）受容体と免疫反応しなかっ た。各ハイブリドーマ、Ｆｌ　８−Ｐ３−１０Ｇ。

Ｆｌ８−Ｐ２−］、］ＯＥ、Ｆ１９−Ｐ９−１１ＢおよびＦｌ９−Ｐ２１−９Ｃ からの受容体分子はヤギ抗ヒ）Ｉｇ抗体により結合された。

前記は本発明の例示として意図され限定ではない。多くの変形および変更を本発 明の真の精神および範囲から逸脱することなく行なうことができる。

国際調査報告 Ｗｅｎ＋ａｌｌａ−＾””””　ＰｃＴ／Ｕｓａｓ／α２０３０′°“°−“° ”ｌＡ”＋１′””””　ＰＣＴ／ＩＪＳａ５１０２０．５０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．予め選んだ抗原と免疫反応するヨザル（Ａｏｔｕｓ）単クローン性受容体分 子の製造方法であって、 （ａ）予め選んだ抗原により免疫感作されたヨザル（Ａｏｔｕｓｔｒｉｖｉｒｇ ａｔｕｓ）から抗体産生細胞を採取する段階、（ｂ）前記細胞を骨髄腫細胞系の 細胞と融合させてハイブリドーマを形成させる段階、前記骨髄腫細胞は抗体産生 細胞とほゞ同数の染色体毎細胞を含み、前記融合は細胞融合プロモーターの存在 下に行なわれる、 （ｃ）前記ハイブリドーマをハイブリドーマの成長に選択性の培地中でクローニ ングする段階、 （ｄ）前記クローニングしたハイブリドーマを前記予め選んだ抗原と免疫反応す る受容体分子を分泌する能力について検定し、選択する段階、 （ｅ）選んだハイブリドーマをモノクロニシティに対してサブクローニングする 段階、 （ｆ）段階（ｅ）の選び、サブクローニングしたハイブリドーマを培養する段階 、および （ｇ）前記段階（ｆ）の培養したハイブリドーマにより分泌された単クローン性 受容体を採取する段階、 を含む方法。 ２．骨髄腫細胞系が非分泌性骨髄腫細胞系である、請求の範囲第１項記載の方法 。 ３．非分泌性骨髄腫細胞系がマウス骨髄腫細胞系、Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３で ある、請求の範囲第１項記載の方法。 ４．予め選んだ抗原が熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐ ａｒｕｍ）シゾントまたはメロゾイトのタンパク質である、請求の範囲第１項記 載の方法。 ５．さらに、融合のために採取する約１週間の期間内で抗原刺激により前記抗体 産生細胞を強化する段階を含む、請求の範囲第１項記載の方法。 ６．抗原刺激がインビボで行なわれる、請求の範囲第５項記載の方法。 ７．抗体産生細胞が脾細胞または末梢Ｂリンパ球である、請求の範囲第１項記載 の方法。 ８．さらに、採取した抗体産生細胞を凍結し、次いで前記凍結した細胞を前記融 合のすぐ前に凍結する段階を含む、請求の範囲第１項記載の方法。 ９．クローニング段階が約４×１０３〜２×１０４細胞毎ミリリットルの濃度で 行なわれる、請求の範囲第１項記載の方法。 １０．ヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）からの抗体産生細胞とマ ウス骨髄腫Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３からの細胞との融合により生成されたハイ ブリドーマ細胞系であって、培養すると前記細胞系がクローニング段階くとも６ 週間の間、 （ａ）予め選んだ抗原と免疫反応し、 （ｂ）ヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）の抗体に対して起された 多クローン性抗体により結合され、 （ｃ）マウス抗体に対し起された多クローン性抗体により実質的に結合されない 単クローン性受容体分子を分泌するハイブリドーマ細胞系。 １１．抗体産生細胞が脾細胞または来梢Ｂリンパ球である、請求の範囲第１０項 記載の細胞系。 １２．受容体分子がヒト抗体に対し起された多クローン性抗体により結合される 、請求の範囲第１０項記載の細胞系。 １３．予め選んだ抗原が熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）シゾ ントまたはメロゾイトのタンパク質である、請求の範囲第１０項記載の細胞系。 １４．ハイブリドーマがＦ１８−Ｐ３−１０Ｇ、ＡＴＣＣ　ＨＢ８６４１と称さ れる、請求の範囲第１３項記載の細胞系。 １５．ハイブリドーマがＦ１８−Ｐ２−１０Ｅ、ＡＴＣＣ　ＨＢ８６４０と称さ れる、請求の範囲第１３項記載の細胞系。 １６．ハイブリドーマがＦ１９−Ｐ１２−９Ｃ、ＡＴＣＣ　ＨＢ８６４３と称さ れる、請求の範囲第１３項記載の細胞系。 １５．ハイブリドーマがＦ１９−Ｐ９−１１Ｂ、ＡＴＣＣ　ＨＢ８６４２き称さ れる、請求の範囲第１３項記載の細胞系。 １８．ハイブリドーマから分泌された、（ａ）予め選んだ抗原と免疫反応し、 （ｂ）ヨザル（Ａｏｔｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）の抗体に対して起された 多クローン性抗体により結合され、 （ｃ）マウス抗体に対して起された多クローン性抗体により実質的に結合されな い ハイブリドーマ分泌単クローン性受容体分子。 １９．受容体分子が熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）シゾント またはメロゾイトのタンパク質と免疫反応する、請求の範囲第１８項記載の受容 体分子。 ２０．タンパク質が、シゾントにより作られメロゾイト発育中にポリペプチドフ ラグメント中へプロセッシングされる約１８５ｋｄのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分 子量を有する糖タンパク質である、請求の範囲第１９項記載の受容体分子。 ２１．ハイブリドーマが前記予め選んだ抗原に対し免疫感作したヨザル（Ａｏｔ ｕｓ　ｔｒｉｖｉｒｇａｔｕｓ）の抗体産生細胞と、前記抗体産生細胞とほゞ同 数の染色体毎細胞を含むマウス骨髄腫細胞との融合により形成される、請求の範 囲第１８項記載の受容体分子。 ２２．ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体産生細胞が５４または５６染色体を含む、請求 の範囲第２１項記載の受容体分子。 ２３．マウス骨髄腫細胞が細胞系、Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３からである、請求 の範囲第２１項記載の受容体分子。 ２４．ヨザル（Ａｏｔｕｓ）種間八イブリドーマを製造する方法であって、（ａ ）予め選んだ抗原により免疫感作されたヨザル（Ａｏｔｕｓｔｒｉｖｉｒｇａｔ ｕｓ）から抗体産生細胞を採取する段階、（ｂ）前記細胞と骨髄腫細胞系の細胞 とを融合させてハイブリドーマを形成させる段階、前記骨髄腫細胞は抗体産生細 胞とほゞ同数の染色体毎細胞を含み、前記融合は細胞融合プロモーターの存在下 に行なわれる、 （ｃ）前記ハイブリドーマをハイブリドーマの成長に選択性の培地中でクローニ ングする段階、 （ｄ）前記クローニングしたハイブリドーマを、前記予め選んだ抗原と免疫反応 する受容体分子を分泌する能力について検定し、選択する段階、 （ｅ）選んだハイブリドーマをモノクロニシティに対してサブクローニングする 段階、 （ｆ）段階（ｅ）の選び、サブクローニングしたハイブリドーマを培養する段階 、および （ｇ）段階（ｆ）のハイブリドーマを採取する段階、を含む方法。 ２５．ヨザル（Ａｏｔｕｓ）抗体産生細胞が５４または５６染色体毎細胞を含む 、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６．骨髄腫細胞が５８染色体毎細胞を含む、請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．骨髄腫細胞系が非分泌性細胞である、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２８．骨髄腫細胞系がマウス骨髄腫細胞系Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３である、請 求の範囲第２７項記載の方法。 ２９．予め選んだ抗原が熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）シゾ ントまたはメロゾイトとのタンパク質である、請求の範囲第２４項記載の方法。