JPH02245183A - Ａ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクローナル抗体、その産生細胞、製造法及び製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、Ａ血清型の緑膿菌（シュードモナス・エルギ
ノーザ＋Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｊｎｏｓ
ａ）に対するヒトモノクローナル抗体を大量、かつ安定
に供給することを可能とするヒトーヒ１へ・ハイブリド
ーマ細胞株と、その産生ずるヒトモノクローナル抗体お
よびそれを有効成分とする緑膿菌感染症の予防、治療用
の製剤に関するものである。

従来の技術 緑膿菌感染症は、各種基礎疾患を有する患者や免疫抑制
作用を有する薬剤の投与を受けている患者に多く発生す
る日和見感染症である。現在、緑膿菌感染症は最も治療
の困難な感染症と考えられている。すなわち、緑膿菌は
これまで常用されてきた抗生物質のほとんどすべてに対
して耐性を示すばかりでなく、近年開発された抗生物質
に対しても容易に耐性が誘導される傾向が強い。そのた
め、宿主側の緑膿菌処理能力の増強をめざした予防、治
療法の研究がなされている。

近年、緑膿菌感染症の治療に健常人の血清あるいは血漿
から精製したヒト免疫グロブリンあるいはその化学的修
飾物を有効成分とするグロブリン製剤を用いることが多
い。しかし、これらの製剤に含まれる抗体のうち緑膿菌
に対し親和性を有し、かつ、治療に有効な抗体の量は一
定せず、また、その含量が少ないため、これらの製剤の
予防、治療効果を疑問視する向きも多い。そのため、低
用量で有効なヒトモノクローナル抗体の開発が急がれて
いる。

緑膿菌は外膜上に存在するリポ多糖体 （ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、以下ＬＰＳ
と略す）分子上の〇−多糖側鎖を認識する免疫抗体、す
なわち緑膿菌の血清型特異Ｏ抗原に対する抗体を用いて
血清型別分類がなされている。緑膿菌の血清型別分類に
関しては現在でも多くの議論があるが、日本ではＡ型か
らＭ型までの１３種の血清型に分類する緑膿菌研究会分
類［Ｈｏｍｍａ、　Ｊａｐａｎ　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ
ｄ、、　３２９−３３６（１９７６））が広く用いられ
ている。臨床現場で緑膿菌感染患者より分離される緑膿
菌の血清型の割合はほぼ一定しており、１３種の血清型
のうちＡ、Ｂ、Ｅ、Ｇ、■型の５種の血清型の菌が占め
る率が高いことが知られている。

一方、緑膿菌に対するマウスモノクローナル抗体は、ケ
ーラーとミルスタインにより開発されたマウス−マウス
・ハイブリドーマ技術〔ＫδｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉ
ｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５−４９７（１９
７５））を用いて作製されて以来〔例えば、Ｈａｎｃｏ
ｃｋら、Ｉｎｆｅｃｔ　。

Ｉｍｍｕｎ、、　３７．１６６−１７１　（１９８２）
　）、型別診断への応用〔例えば、明治製菓、ＥＰ　１
０１０３９）や、感染防御に有用なヒトモノクローナル
抗体の検索のための基礎研究などに用いられてきた。

サドッフらは、緑膿菌の血清型特異ＬＰＳ分子上の〇−
多糖側鎖に対するマウスモノクローナル抗体が、マウス
の感染実験において、対応する血清型の菌による致死感
染に対して高い防御活性を有することを報告した〔５ａ
ｄｏｆｆら、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆｔｈｅ　１９８
２　Ｉｎｔｅｒｓｃ、１ｅｎｃｅ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃ
ｅ　ｏｎＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　
ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、　Ｎａ２Ｓ２（１
９８２）　）。その後の報告にも、緑膿菌の血清型特異
０抗原に対するマウスあるいはヒトモノクローナル抗体
のインビボおよびインビトロの試験系での有効性が示さ
れている 〔例えば、Ｓａｗａｄａら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄ
ｉｓ、、　１５０．５７０５７６　（１９８４）　、中
村警防ら、日本細菌学雑誌、３９゜３３７　（１９８４
）、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍ
ｕｎ、、　５４゜２３９−２４４　（１，９８６）、５
ｕｚｕｋｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
。

３１、　９５９−９６６　　（１９８７）、　Ｚｗｅｒ
ｒｎｉｋら、　Ｉｎｆｅｃｔ　。

Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　５６．　］］８７３−１８７９（
１９８８）　）。また、血清型特異的ヒトモノクローナ
ル抗体の緑膿菌感染症の予防、治療への利用については
、本発明者らによる血清型特異ＬＰＳ分子上の〇−多糖
側鎖を単独に認識する抗体が特許出願明細書〔特開昭６
０−２４８６２６号〕に、および複数の〇−多糖側鎖を
共通に認識する抗体が特許出願明細書〔国際公開番号Ｉ
ＡＯ８８１０４６６９）に、その他幾つかの特許出願明
細書〔ジエネティック　システムズ　コーポレーション
、ＥＰ　１６３４９３とＢＥ　９０５８９０、帝人株式
会社、す０８６１０３７５４、湧永製薬株式会社、特開
昭６１−０９１１３４号、メルク　エンド　カムパニー
　インコーホレーテッド、ＥＰ　２５６７１３）に記載
されている。

発明が解決しようとする問題点 ヒトモノクローナル抗体の作製は、−船釣にはヒトのＢ
細胞にエプスタイン・バー・ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢウィルスと略す）を
感染させてＥＢウィルス形質転換細胞とするか、Ｂ細胞
などのヒト抗体産生細胞と無限増殖能を有する親細胞株
を細胞融合してヒト−マウス・ヘテロハイブリドーマあ
るいはヒト−ヒト・ハイブリドーマとすることにより行
われる。

ＥＢウィルス形質転換法により作製したＥＢウィルス形
質転換細胞は一般に抗体産生量が低く、継代安定性に劣
り、また、比較的栄養要求性が高いため、無血清培地を
用いた大量培養生産には適さない。マウスミエローマを
親細胞株に用いてヒト抗体産生細胞と融合した場合、作
製されたヒト−マウス・ヘテロハイブリドーマはヒト抗
体と共にマウスの蛋白質を合成、分泌するため、ヒトへ
投与するヒトモノクローナル抗体の生産株として用いる
には必ずしも適当でない。また、ヒト染色体のみを有し
、かつ無限増殖能を有する細胞を親細胞株に用いて、ヒ
ト抗体産生細胞と融合してヒトヒト・ハイブリドーマを
作製する場合も幾つかの問題点がある。例えば、ヒトミ
エローマに由来する親細胞株とヒト抗体産生細胞の融合
効率は低い。

また、ＥＢウィルス形質転換細胞に由来する親細胞株と
ヒト抗体産生細胞の融合効率は比較的高いが、作製され
たヒト−ヒト・ハイブリドーマは抗原特異性を、有さな
い抗体を同時に産生じたり、その抗体産生量が低いもの
が多い。ヒトミエローマとＥＢウィルス形質転換細胞の
ハイブリドーマに由来する親細胞株とヒト抗体産生細胞
の融合により作製されたヒト−ヒト・ハイブリドーマは
比較的高い抗体産生量を示すが、抗原特異性が不明な抗
体を同時に産生ずる性質は解消されていない。

問題を解決するための手段 本発明者らは、Ａ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモ
ノクローナル抗体を産生ずるヒト−ヒト・ハイブリ１く
−マが作製出来ること、また、該ヒトヒト・ハイブリド
ーマが各種培地中で安定に増殖し、比較的大量の抗体産
生を長期継続すること、更には、該ヒト−ヒト・ハイブ
リドーマを培養し。

その培養物よりＡ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモ
ノクローナル抗体が調製出来ることを見いだした。

本発明者らは、これらの結果に基づき、該ヒトヒト・ハ
イブリドーマの産生する抗体の緑膿菌感染に対する防御
活性を試験し、本発明を完成するに至った。

本発明でいうヒト−ヒト・ハイブリドーマとは、ヒト染
色体のみを有し、かつ無限増殖能を有する親細胞株とヒ
ト抗体産生細胞との融合により作製されるヒト染色体の
みを有するハイブリドーマをいう。

本発明でいう選択特性とは、作製したハイブリドーマを
未融合の細胞より選別することを可能とする親細胞株の
化学的あるいは物理的な特性をいう。例えば、選択特性
として８−アザグアニンあるいは６−チオグアニン、お
よびウアバイン耐性の親細胞株を使用した場合、ヒト抗
体産生ＥＢウィルス形質転換細胞とのハイブリドーマの
みがヒボキサンチン、アザセリン、およびウアバインを
含む培養液中で生き残る。

上記選択特性を有する親細胞株は適宜選択される。また
、緑膿菌に反応性を有するヒト抗体産生細胞はヒトＢ細
胞およびその由来細胞より適宜選択される。

以下、ヒト染色体のみを有し、かつ無限増殖能と８−ア
ザグアニンおよびウアバイン耐性を有する細胞株を親細
胞株としてＡ血清型緑膿菌に反応性を有するヒト抗体産
生ＥＢウィルス形質転換細胞をヒト抗体産生細胞として
用いてヒトーヒ１〜・ハイブリドーマを作製する場合を
例にあげ、本発明を説明する。

（具体的説明） １、使用緑膿菌 本発明では便宜上、使用緑膿菌の分類を緑膿菌研究会主
催の血清型別検討委員会の決定による血清型別分類に従
うものとし、Ａ型からＭ型に属する菌株を使用している
。

Ａ型からＭ型に属する菌株は、アメリカン・タイプカル
チャーコレクション（ＡＴＣＣ）、財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）および東京大学医科学研究所から入手できる
。

２、　ヒト−ヒト・ハイブリドーマの作製本発明による
、Ａ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクローナル
抗体を産生ずるヒト−ヒト・ハイブリドーマは、ハイブ
リドーマ作製用の親細胞株ＭＰ　４１０９あるいはその
継代株とヒト抗体産生細胞を公知の方法〔成帯ｒＭＯＮ
ＯｃＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＪ　ｐ３６３．
　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ刊（１９８０）他〕に準じ
て細胞融合して作製出来る。ヒト抗体産生細胞には、緑
膿菌に対する抗体産生がみられる健常人あるいは緑膿菌
感染症既往歴のある患者の末梢血、リンパ節、扁桃腺、
牌臓や分娩時の屑帯血などから公知の方法により得られ
るＢ細胞を用いることが出来るが、Ｂ細胞にＥＢウィル
スを感染させて形質転換を行い一定期間培養後、培養上
清中に緑膿菌に反応性を有する抗体の分泌が検出された
ＥＢウィルス形質転換細胞コロニー、あるいはこれらＥ
Ｂウィルス形質転換細胞コロニーより単一に選別された
細胞株を用いることが好適である。

次に各工程につき詳細な説明を加える。

血液や上記組織などからのＢ細胞の分離および濃縮は、
フィコール・コンレイ液等の細胞分画液を用いた比重遠
心法、Ｅロゼツト形成法、パニング法などを組み合わせ
て効率的に行うことが出来る。さらには、Ｂ細胞をホー
クライードマイト−ジエン（ＰＷＭ）を添加した培養液
中で数日間培養し、Ｂ細胞を増殖させた後に細胞融合に
供することも出来る。

ＥＢウィルスによるＢ細胞の形質転換法は公知の方法〔
例えば、５ｔｅｊ、ｎｊｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、　２６
９．４２０４２２（１９７７））に準じて実施すること
が出来る。８９５８細胞（感染性のＥＢウィルスを産生
ずるマーモセット白血球由来細胞）を２０％ウシ胎児血
清（以下ＦＣ３と略す）を含むＲＰＭＩ　１６４０培地
（以下培養液と略すことがある）で培養し、遠心分離に
て得られた静止期に近い７日目の培養上清をウィルス液
とする〔小野ら、第４回日本免疫学会総会記録、３９９
４０１（１９７４）　）。Ｂ細胞を遠心分離し、吸引に
て上滑を除去して得られるペレットにウィルス液を加え
て分散後、３７°Ｃ１５％炭酸ガス存在下で３０分から
１時間インキュベーションする。培養後、遠心分離し、
吸引にて上清を除去した後、ペレットに細胞密度が１×
１０５個／ｍｌから５　Ｘ　１０’個／ｍｌとなる様に
培養液を加え、細胞を分散させる。細胞分散液を２４ウ
エル培養プレートまたは９６ウエル培養プレートの各ウ
ェルに分注し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で２週間か
ら４週間培養する。この間、３日から４日ごとに培養液
の半量を新しい培養液に交換することが望ましい。

緑膿菌に反応性を有する抗体の検出は、一般のラジオイ
ムノアッセイ法や、酵素抗体法（以下ＥＬＩＳＡ法と略
す）などの方法〔成帯「単クローン抗体」ｐ１４４、講
談社刊（１９８３）等〕により行うことが出来る。本発
明ではＥＬＩＳＡ法を用いている。すなわち、あらかじ
め緑膿菌の０．３％ホルマリン処理菌体をメンブランフ
ィルタ−に固定し、容器中で細胞の培養上清と一定時間
反応させた後、酵素標識したウサギ抗ヒト抗体を反応さ
せ、酵素反応による基質の呈色割合により目的抗体の産
生の有無および産生量を測定するドツト・イムノバイン
ディングアッセイ法（以下ＤＩＢＡ法と略す）（Ａｎａ
ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１、］９．１４２−１４７（１９８２）〕　を簡易アッ
セイ法として用いている。

ＥＢウィルス形質転換細胞の増殖コロニーが認められた
各ウェルの培養上清について上記ＥＬＩＳＡ法により、
目的抗体が存在するウェルを選別した後、このウェル中
の細胞を軟寒天法〔成帯「組織培養応用研究法Ｊ　ｐ２
８９、ソフトサイエンス社刊（１９８５）等〕あるいは
限界希釈法〔成帯「単クローン抗体」ｐ７３、講談社刊
（１９８３）等〕によりクローニングを行う。さらに、
クローニングにより細胞の増殖が認められた後、再度Ｅ
ＬＩＳＡ法によるアッセイを行う。

１回から数回のクローニングにより、目的の抗体のみを
分泌する単一細胞株を得ることが出来る。

ＭＰ　４１０９とヒト抗体産生細胞との融合は、ポリエ
チレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）などの−船釣
な融合試薬や、センダイウィルス （Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｊ、ｎａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　
ｏｆ　Ｊａｐａｎ　；　ＨＶＪ）などのウィルス粒子を
使用して行える６例えば、平均分子量１０００から６０
００程度のＰＥＧを、ＲＰＭＩ　１６４０培地やダルベ
ツコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に３０％から５
０％（Ｗ／Ｖ）の濃度に添加したものが融合液として推
奨される。また、融合効率を高めるため、ジメチルスル
ホオキサイド（ＤＭＳＯ）を添加することも望ましい。

また、電気融合装置などを用いた物理的手法によっても
行える。

例えば、ＨＰ　４１０９とＥＢウィルスによる形質転換
後目的抗体の産生が認められたウェルの細胞や、末梢血
等から分離される抗体産生細胞を１＝１から１＝１０程
度の比率で混合し、細胞融合用培地（５０％ＰＥＧと１
０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ　１．６４０培地等）を加
えて、細胞を融合させる。つぎに、融合したハイブリド
ーマのみの増殖に適した培養液（以下、選択培地と略す
）に、細胞密度が１×１０５個／ｍｌから５ＸＩＯｒ′
個／ｍｌとなる様に細胞を分散させる。細胞分散液を２
４ウエルまたは９６ウエルの培養プレートに分注し、３
７°Ｃ１５％炭酸ガス存在下で２週間から４週間培養す
る。この間、３日から５日ごとに選択培地の半量を新し
い選択培地と交換することが望ましい。この際、フィー
ダー細胞としてマウスの腹腔浸出細胞等を共存させると
ハイブリトーマの増殖を早めることが出来る。ヒト抗体
産生細胞が無限増殖能を有さない細胞（Ｂ細胞）の場合
、選択培地としてヒボキサンチン、アミノプテリン、チ
ミジンを含む培地（以下、ＨＡＴ培地と略す）あるいは
ヒポキサンチン、アザセリンを含む培地（以下、ＨＡ培
地と略す）が使用できる。また、ヒト抗体産生細胞がＥ
Ｂウィルス形質転換細胞などの無限増殖能を有する細胞
の場合、選択培地としてＨＡＴ培地にウアバインを添加
した培地（ＨＡＴ−０培地）またはＨＡ培地にウアバイ
ンを添加した培地（ＨＡ−０培地）が使用できる。ハイ
ブリドーマの増殖コロニーが認められた各ウェルの培養
上清について上記ＥＬ１．ＳＡ法により、目的抗体が存
在するウェルを選別した後、限界希釈法によりクローニ
ングを行う。

さらに、クローニングにより細胞の増殖が認められた後
、再度ＥＬＩＳＡ法によるアッセイを行う。１回から数
回のクローニングにより、目的の抗体のみを分泌する単
一細胞株を得ることが出来る。

本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマの培養は、通常の
培地を用いて行える。例えば、５Ｘ１０’個／ｍ１から
２×１０６個／ｍｌの細胞密度となるように培養液に分
散し、適当な細胞培養容器に播種した後、３７℃、５％
炭酸ガス存在下で培養できる。培養液の例としては、Ｒ
ＰＭＩ　１６４０やＤＭＥＭ等の基礎培地に、Ｆｅ２の
適量を添加したものが好適である。また、各種の低血清
あるいは無血清培地も適宜使用できる。例えば、ＮＹＳ
Ｆ　４０４無血清培地単独、あるいはＮＹＳＦ　４０４
無血清培地にウシ血清アルブミンの適量を添加したもの
が推奨される。継代培養は、３日から７日間隔で細胞の
回収と播種の操作を繰り返すとよい。

本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマの凍結保存は一般
的手法により行える。例えば、細胞を適当な細胞凍結保
存液に１×１０″′個／ｍｌから５Ｘ１０’個／ｍｌの
細胞密度となるように分散し、液体窒素あるいは液体窒
素ガス中、または、−２０℃から一８０℃の冷凍庫中で
凍結保存出来る。細胞凍結保存液には、上記基礎培地や
中性緩衝液等に動物血清、アルブミン、メチルセルロー
ス、ぶどう糖やジメチルスルホオキサイドなどを適宜添
加して用いることが推奨される。

凍結細胞の復元は一般的手法により行える。例えば、凍
結された細胞を含む保存液を温水中で急速に融解し、細
胞を培養液等で洗浄して保存液に含まれるＤＭＳＯを洗
い出した後に培養液に分散して培養を行うと良い。

培養上清中の免疫グロブリン量の測定は、般のＥＬＩＳ
Ａ法により行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法に
よる場合は、同相に抗ヒト免疫グロブリン抗体を固定し
くこの時使用される抗体を以下、固相化抗体と略す）、
培養上清の一部を反応させる。次に、酵素標識抗ヒト免
疫グロブリン抗体を反応させ、基質を加え、酵素反応に
より生じる呈色割合より培養上清中の免疫グロブリン量
の測定が行える。ヒトＩｇＭ量の測定は、固相化抗体と
して抗ヒトＩｇＭ　（ミュー鎖特異）抗体を、酵素標識
抗体としてパーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ　（ミュ
ー鎖特異）抗体を使用することにより行える。

３、　ヒ１−モノクローナル抗体の製造本発明のヒト−
ヒト・ハイブリドーマは、重鎖としでは抗体産生細胞株
由来のもののみを合成、分泌し、通常の動物細胞培養用
の培地中で長期間安定に継代、増殖が可能である。また
、培養物より抗体を精製する際に培地由来の未知の不純
物の混入の恐れのない無血清培地中でも抗体を産生ずる
能力を有しており、緑膿菌感染症の予防、治療用製剤の
組成物調製の為の原料となるヒトモノクローナル抗体を
得るのに最適である。

本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマを無血清培地中で
培養し、培養液より任意の一般的な方法、例えば、ゲル
ろ適法、イオン交換クロマトグラフィー法、ハイドロキ
シアパタイトなどを用いる吸着クロマトグラフィー法な
どの物理化学的精製法や、抗原あるいはヒトモノクロー
ナル抗体に親和性を有する物質（例えばプロティンＡや
抗ヒト免疫グロブリン抗体等）を固定化した担体を用い
るアフィニティクロマトグラフィー法や、電気泳動法、
硫酸アンモニウム塩析などの沈澱法等を組み合わせるこ
とにより、Ａ血清型緑膿菌に反応性を有する単一なヒト
モノクローナル抗体を比較的容易に高度に精製出来る。

４、　ヒトモノクローナル抗体製剤の製造本発明のＡ血
清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクローナル抗体は
、対応する血清型緑膿菌感染に対して高い防御活性を有
している。本発明のヒトモノクローナル抗体は、単独、
あるいは通常用いられる添加剤、賦形剤等を加えて液剤
あるいは凍結乾燥製剤として緑膿菌感染症の予防、治療
に供することが出来る。添加剤、賦形剤には一般に生物
製剤に用いられる天然物、化合物より適宜選択されるが
、抗体の安定性の保持にはアルブミン等の動物性蛋白質
や、デキストラン等の多糖類、アミノ酸、糖類の使用が
良好な結果を与える。また、本発明のヒトモノクローナ
ル抗体は緑膿菌や緑膿菌以外の微生物に反応性を有する
他のモノクローナル抗体やポリクローナル抗体と混合し
た製剤の作製に用いることも出来る。

５、　ヒトモノクローナル抗体による感染症の予防、治
療 実際の緑膿菌感染症の予防、治療にあたっては本発明の
ヒトモノクローナル抗体あるいはそれを含む製剤を単独
または２種以上混合するか、あるいは緑膿菌に反応性を
有する他のモノクローナル抗体あるいはそれを含む製剤
やグロブリン製剤と混合して用いてもよい。

本発明のＡ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクロ
ーナル抗体あるいはそれを含む製剤は、緑膿菌感染症の
予防、治療のために直接ヒトに投与可能である。用量、
投与経路は適宜選択されるが、用量は体重（ｋｇ）あた
り０．０１ないし１０ｍｇが好ましく、投与経路は皮内
、皮下、筋肉内、静脈内投与等を適宜選択出来る。

従って、本発明により、緑膿菌感染症の予防、治療、診
断などの広い分野に使用出来るヒトモノクローナル抗体
の工業的生産用の細胞株を提供することが可能となる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではなり１゜ 尚、ハイブリドーマ作製用の親細胞株ＭＰ　４１０９は
微工研に昭和６３年１０月２７日から寄託番号微工研条
寄第２１２９号として寄託されている。ＡおよびＦ血清
型緑膿菌に交差反応性のヒトモノクローナルＩｇＭ産生
ＥＢウィルス形質転換細胞株ＭＰ　５０４６は微工研に
昭和６２年１２月９日から寄託番号微工研条寄第１５９
９号として寄託されている。緑膿菌研究会分類標準血清
型緑膿菌として、Ａ血清型緑膿菌にはＡＴＣＣ２７５７
７（ＩＩＤ　１００１）を、Ｆ血清型緑膿菌にはＡＴＣ
Ｃ２７５８２（ＩＩＤ　１００６）を用いた。

実施例１．抗緑膿菌抗体産生ハイブリドーマの作製−１ （１）細胞融合 ＨＰ　４１０９　とＭＰ　５０４６を１０％ＦＣ３を含
むＲＰＭＩ　１６４０培地（以下、１０％ＦＣ３培養液
と略すことがある）中で増殖させ、各々集めてＲＰＭＩ
　１６４０培地で洗浄した。各々２×１０７個の細胞を
５０耐容量のプラスチック製遠心管中で混合した。遠心
分離（１７５Ｘｇ、１０分間）後、上清を吸引除去し、
細胞ペレットに直接、０．５ｍｌの５０％ＰＥＧ　（Ｍ
、　ＩＮ、　１５００、和光純薬）および１０％ＤＭＳ
Ｏを含むＲＰＭＩ　１６４０培地を静かに加えゆっくり
回転させ、細胞を融合させた。２分後、１０ｍ１のＲＰ
ＭＩ　１６４０培地を加え静かに攪拌後、遠心分離（１
７５Ｘ　ｇ、１０分間）した。上清を吸引除去し、細胞
ペレットに２０％ＦＣ８，２Ｘ　１０−’Ｍヒボキサン
チン（シグマ）、１μｇ／ｍｌアザセリン（シグマ）、
５Ｘ１０−ｔ″ＮＮウアバイングマ）を含むＲＰＭＩ　
１６４０培地（以下、ＨＡ罰培地と略すことがある）を
加えて、１×１０６個／ｍｌの密度となるように懸濁後
、９６ウエル平底培養プレートのウェル当たり０．１ｍ
ｌずつを播種（合計３８４ウエル）した。細胞は５％炭
酸ガス存在下、３７℃で静置培養した。４日後に０．１
ｍｌのＨＡ−０培地を加え、その後、３日から５日毎に
半量のＨＡ　−０培地を新しいＨＡ−０培地と交換した
。４週間から５週間後に、合計６５ウエルに細胞増殖が
認められた。

（２）抗緑膿菌抗体の検出 培養上清中の抗Ａ血清型緑膿菌ヒト抗体の有無はＤＩＢ
Ａ法で調べた。各ウェルの培養上清０，１ｍｌを、１ド
ツト当たり０．４μ＆のＡ血清型緑膿菌ＡＴＣＣ２７５
７７のホルマリン処理乾燥菌体を固定したグリラド入り
ニトロセルロース・メンブレンフィルター（３，１ｍｍ
角）と、９６ウエルＵ底マイクロプレート中で反応させ
た。室温で２時間反応させ、ついでパーオキシダーゼ標
識ウサギ抗ヒト・イムノグロブリン抗体（ダコ社）と２
時間反応後、４−クロロ−１−ナフトールを基質として
発色させ、抗原を固定したニトロセルロース・メンブレ
ンフィルター上に肉眼観察で発色が認められたものを抗
体産生が陽性と判定した。

（３）クローニング 細胞増殖が認められた６５ウエルの培養上清のうち５１
ウエルの培養上清中に抗Ａ血清型緑膿菌抗体産生が認め
られた。５１ウエルのうち増殖のよい細胞を含む１８ウ
エルを選び、ウェル中の細胞をそれぞれ個別に集め、血
球計算盤を用いて正確に細胞数を計測した。細胞をＨＡ
−０培地に分散し、２０個／ｍｌの細胞密度の細胞浮遊
液とした。あらかじめ、ウェル当たりＩ　Ｘ　１０’個
のマウス肺臓細胞を播種した９６ウエル平底培養プレー
ト（以下、フィーダープレートと称する）の各ウェルの
上滑を除去後、細胞浮遊液を各ウェル当たり０，１ｍｌ
ずつ播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養し
た。各細胞当たり１枚のフィーダープレートを使用した
。

４日後に０．１ｍｌのＨＡ−０培地を加え、その後、３
日から５日毎に半量のＨＡ−０培地を新しいＩ（Ａ−Ｑ
培地と交換した。２週間から４週間後、増殖の認められ
たウェルについて培養上清中の抗Ａ血清型緑膿菌ヒト抗
体の有無をＤＩＢＡ法で調べた。Ａ血清型緑膿菌と反応
する抗体産生が陽性と判定されたウェルの細胞を上記の
ごとく再度クローニングした。２回のクローニングによ
り緑膿菌研究会分類の血清型のＡおよびＦ血清型緑膿菌
に交差反応するヒトモノクローナル抗体を産生ずるハイ
プリドーマ阿ｐ　５１２０からＨＰ　５１３１の１２株
が得られた。

９６ウエル平底培養プレート中で十分に増殖したハイブ
リドーマを徐々に拡大培養した。細胞は７５％ＦＣ５，
１０％ＤＭＳＯ，ＲＰＭＩ　１６４０培地よりなる細胞
保存液にｌ　Ｘ　１０″個／ｍｌ密度となるように懸濁
後、２ｍｌの凍結チューブに分注した。−２０℃まで１
分間当たり１℃の速度で冷却後、液体窒素中で凍結保存
した。

（４）抗体産生量の測定 ハイブリドーマが細胞外へ分泌するＩｇＭ量の測定は以
下の様に行った。対数増殖期の細胞を集め、１０％ＦＣ
３培養液にＩ　Ｘ　１０’個／ｍｌ密度となるように懸
濁し、６ウエル培養プレートの各ウェルに１ｍｌずつ播
種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養した。２
４時間後、遠心分離（２５０ｘ　ｇ、１０分間）により
培養上清を分離し、上滑中のヒトＩｇＭ量をＥＬＩＳＡ
法にて定量した。ハイブリドーマＭＰ　５１２０からＨ
Ｐ　５１３１は、１０６個の細胞が２４時間に、６μｇ
から５６μｇのヒトＩｇＭを培養上清中に分泌した。

（５）細胞株の継代安定性の測定 細胞株の継代安定性を細胞増殖性能と抗体産生能より調
べた。

増殖の安定性は培養開始時と継代培養開始３力月後の細
胞について増殖曲線を測定することにより調べた。抗体
産生の安定性は培養開始時、培養開始１力月、２力月、
３力月の細胞のＩｇＭ抗体産生量を（４）と同様にして
ＥＬＩＳＡ法にて測定することにより調べた。

継代培養は、以下のように行った。細胞を２系列独立し
て、１０％ＦＣ５培養液に５　Ｘ　１０４個／ｍｌ密度
となるように懸濁後、底面積２５ｃｄのフラスコに４ｍ
ｌずつ播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養
した。３日から４日毎に細胞を集め、新鮮な１０％ＦＣ
５培養液に同密度となるように再度懸濁後、静置培養す
る操作を３力月間連続的に行った。

増殖曲線の測定は、以下のように行った。２系列独立し
て培養した対数増殖期の細胞を集め、１０％ＦＣ３培養
液に５Ｘ］０’個／＋＋１密度となるように懸濁後、６
ウエル培養プレートの各ウェルに１ｍｌずつ計６ウエル
に播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養した
。１日毎に、１ウエル中の培養物を集め、生細胞および
死細胞密度を計測し、更に、培養上清についてはＩｇＭ
量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。

ＭＰ　５１２］　は培養開始時および培養開始３力月の
細胞ともほぼ同様な増殖曲線を示した。増殖曲線より計
算される倍加時間は２５．５時間であった。また、１０
”個の細胞が２４時間に分泌するＩｇＭは、培養開始時
には５６μｇ、培養開始１力月後には４０μｇ、２力月
後には４５μｇ、３力月後には４２μｇで、３力月間の
継代培養中に抗体産生には大きな変化はなかった。

ＭＰ　５１２１は微工研に条寄第２２７０号として寄託
した。

実施例２．細胞の培養および抗体の精製−ＩＭＰ　５１
２１の凍結保存細胞を復元し、１０％ＦＣＳ培養液を用
いて拡大培養し、ＮＹＳＦ　４０４無血清培地〔矢部則
次、組織培養、１１，　４５８（１９８５））で更に拡
大培養の後、細胞を集め、５×１０４個／耐の密度とな
るように５００ｍｌのＮＹＳＦ　４０４無血清培地に懸
濁し、１０枚のフラスコ（底面積１７５ａ＃）に播種し
た。５日間、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養し
た。

培養物より遠心分離（４００　Ｘ　ｇ、２０分間）によ
り４８０耐の上清を得、ポアサイズ０．２２ミクロンの
メンブランフィルタ−で濾過した。

濾液に４８０耐の飽和硫酸アンモニウム溶液を加え、４
℃に放置した。翌日、これを遠心分離しく１０，ＯＯＯ
Ｘｇ、３０分間）、沈澱を集めた。５ｍｌのＰＢＳ（−
）で沈澱を溶解し、ＰＢＳ　（−）に対して十分に透析
を行い、粗ＩｇＭ画分を得た。

精製には、高速液体クロマトグラフィー用のハイドロキ
シアパタイト充填カラムを用い、１ｍ１７分の流速で分
画した。ＨＣＡ−カラム（ガードカラム；４ｍｍ　Ｘ　
１０＋＋＋ｍ、本体カラム；７．６ｍｍ　Ｘ　１００ｍ
ｍ、三井東圧化学株式会社）を、あらかじめ０．１５Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）（以下、Ａ液と略す）で十分に洗浄し
、２ｍｌの粗ＩｇＭ画分を添加した。Ａ液で１０分間、
更に７５容のＡ液に対して２５容の割合（２５％）で０
．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（以下
、Ｂ液と略す）を加えた溶液でカラムを１５分間洗浄し
た。その後、Ｂ液の割合が２５％から１００％までの直
線濃度勾配溶出を２０分間で行った。単一ピークとして
溶出したＩｇＭ画分をＰＢＳ（−）に対して十分に透析
した。４８０ｍｌの培養上清より１２．３ｍｇのＩｇＭ
（Ｎ４−２）溶液が得られた。

実施例３．抗緑膿菌抗体産生ハイブリドーマの作製−２ （１）　ＥＢウィルス液の調製 ＥＢウィルスを産生放出しているＢ９５−８細胞を、３
Ｘ１０Ｓ個／ｍｌの密度となるように２０％ＦＣ３を含
むＲＰ）ＩＩ　１６４０培地（以下、２０％ＦＣ３培養
液と略すことがある）に浮遊させ、５％炭酸ガス存在下
、３７℃で静置培養した。静止期に近い７日目の培養上
清を遠心分離（８００Ｘ　ｇ、１０分間）により集め、
ポアサイズ０．４５ミクロンのメンブランフィルタ−（
ミリポア）で濾過し、ＥＢウィルス液とした。

（２）ヒトリンパ球の調製 Ａ血清型緑膿菌に対する血清抗体活性が、ＤＩＢＡ法に
より１０００倍希釈まで陽性反応が認められた健常人か
らヘパリン加末梢血５０ｍ１を採血した。これに等量の
ＲＰＭＩ　１６４０培地を加えて２倍に希釈後、半量の
フィコール・パック（ファルマシア）上に界面が乱れな
い様に重層し、室温で遠心分離（４０゜×ｇ、３０分間
）した。遠心分離後、界面層をパスツールピペットを用
いて取り出し、等量の２０％ＦＣ５培養液を加えて、室
温で遠心分離（２５０ｘ　ｇ、１ｏ分間）した。沈澱し
た細胞を、２０％ＦＣ８培養液に懸濁後、さらに１回、
遠心分離の操作を繰り返し、ヒトリンパ球のペレット（
細胞数；　４　Ｘ　１０７個）を得た。

（３）　ＥＢウィルスによる形質転換 ヒト抗体産生細胞４　Ｘ　１０７個に対して（１）で調
製したウィルス液４０ｍ１を加えて、３７℃で１時間イ
ンキュベーションした。インキュベーション後、遠心分
離（２５０ｘ　ｇ、１０分間）により細胞を集めた。細
胞を２０％ＦＣ５培養液に分散し、５　Ｘ　１０’個／
ｍｌの密度に調整後、０．１ｍｌずつ、９６ウエル平底
培養プレートに加え、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静
置培養した。４日後にＯ，１ｍｌの２０％ＦＣ５培養液
を加え、その後、３日から５日ごとに半量の培養液を新
しい培養液で交換した。細胞増殖の認められたウェルに
ついて、実施例１．（２）と同様にして培養上清中の抗
Ａ血清型緑膿菌ヒト抗体の有無を酵素免疫測定法である
ＤＩＢＡ法で測定した。抗体産生が陽性と判定されたウ
ェルの細胞を、２４ウエル培養プレートへ拡大培養した
。

（４）クローニング 抗体検出法によりＡ血清型緑膿菌との反応性が認められ
たウェルの細胞を、６ｃｍシャーレに移した。６ｃｍシ
ャーレ中で増殖した細胞は実施例１．（３）と同様にし
て液体窒素中に凍結保存した。細胞を含む凍結チューブ
を液体窒素より取り出し、３７℃の温浴中で攪拌しなが
ら解凍し、１０耐の２０％ＦＣ３培養液に懸濁した。遠
心分離（２５０Ｘｇ、１０分間）により細胞を集め、２
ｍｌの２０％ＦＣ５培養液に分散し、６ｃｍシャーレに
播種して、５％炭酸ガス存在下、３７℃で３日間静置培
養した。増殖した細胞は軟寒天法により１度りローニン
グ操作を行った。先ず、血球計算盤を用いて正確に細胞
数を測定した後、１×１０″′個／ｍｌの密度の細胞浮
遊液とし、この細胞浮遊液０．１ｍｌを０．３％アガロ
ース（ジ−プラークアガロース、エフ・エム・シー社）
を含む培養液３０ｍ１に加え混合した。つぎに、あらか
じめ０．５％アガロースを含む培養液４ｍｌを分注して
固めた６ｃｍシャーレに、細胞および０．３％アガロー
スを含む培養液３ｍｌを分注して固めた（各細胞あたり
１０枚）。

細胞を分注した６ｃｍシャーレは５％炭酸ガス存在下、
３７℃で静置培養した。３週間から５週間後、軟寒天中
に細胞が増殖しコロニーが肉眼的に認められるようにな
ったら、各コロニーをパスツールピペットを用いて、あ
らかじめウェル当たり０．１ｍｌの２０％ＦＣ３培養液
を分注した９６ウエル平底培養プレートの各ウェルに移
し培養した。２日後に２０％ＦＣ３培養液０．１ｍｌを
加え、さらに２日後、細胞増殖の認められたウェルにつ
いて培養上清中の抗緑膿菌モノクローナル抗体の有無を
ＤＩＢＡ法で測定した。抗体産生が陽性と判断されたウ
ェルの細胞を２４ウエル培養プレートへ拡大培養した。

３日後、２４ウエル培養プレートのウェルについて、培
養上清中の抗緑膿菌抗体の有無をＤＩＢＡ法で測定した
。

このうち、培養上清中の抗緑膿菌抗体活性が高いウェル
中の細胞を順次拡大培養し、抗Ａ血清型録膿菌ヒトＩｇ
Ｍ産生ＥＢウィルス形質転換細胞コロニ！−＠　９６５
Ｎ５を得た。

（５）細胞融合 各々２×１０７個の抗Ａ血清型録膿菌ヒトＩｇＭ産生Ｅ
Ｂウィルス形質転換細胞コロニー８９６５Ｎ５とＭＰ４
１０９を用い、実施例１．と同様にして細胞融合を行っ
た。融合細胞をＨＡ−０培地にＩ　Ｘ　１０６個／ｍｌ
の密度の細胞懸濁液として、９６ウエル平底培養プレー
トのウェル当たりに０．１ｍｌずつ播種（合計３８４ウ
エル）した。細胞は５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置
培養した。４日後に０．１ｍｌのＨＡ−０培養液を加え
、その後、４日から５日毎に半量のＨＡ−０培地を新し
いＨＡ　−０培地と交換した。細胞が増殖した３５ウエ
ルについて、培養上清中の抗緑膿菌抗体の有無をＤＩＢ
Ａ法で測定した。ＩＢ５．３Ｇ１２の２ウエルの培養上
清に抗体活性を認めた。これをクローニングし、Ａ血清
型緑膿菌のみに反応するヒトモノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマＭＰ　５１３６の１株が得られた。

（６）　ＩｇＭ産生量の測定 （５）の細胞融合により取得したハイブリドーマについ
て、実施例１．（４）と同様にして抗体産生量の測定を
行った。

ハイブリドーマＭＰ　５１３６は、１０６個の細胞が２
４時間に、１３μｇのヒト■ｇＭを培養上清中に分泌し
た。

（７）細胞株の継代安定性 ＭＰ　５１３６を使用する以外は、実施例１．（５）と
同様にして細胞株の増殖性および抗体産生量の安定性を
測定した。

ＭＰ　５１３６は培養開始時および培養開始３力月の細
胞ともほぼ同様な増殖曲線を示した。増殖曲線より計算
される倍加時間は２７時間であった。また、１０６個の
細胞が２４時間に分泌するＩｇＭ　＋よ、培養開始時に
は１３μｇ、培養開始１力月後には１４μｇ、２力月後
には８μｇ、３力月後には１２μｇで、３力月間の継代
培養中に抗体産生には大きな変化はなかった。

ＭＰ　５１３６は微工研に条寄第２２７１号として寄託
した。

実施例４．細胞の培養および抗体の精製−２ＭＰ　５１
３６の凍結保存細胞を起こし、１０％ＦＣ５培養液を用
いて拡大培養し、ＮＹＳＦ　４０４無血清培地で更に拡
大培養の後、５Ｘ］、Ｏ’個／ｍｌの細胞密度となるよ
うに５０ｍ１のＮＹＳＦ　４０４無血清培地に懸濁した
。

１枚のフラスコ（底面積１７５ｄ）に播種後、５％炭酸
ガス存在下、３７℃で５日間静置培養した。細胞を集め
、５　Ｘ　１０’個／ｍｌの細胞密度となるように５０
０ｍ１のＮＹＳＦ　４０４無血清培地に懸濁し、１本の
スターリング培養フラスコ（テクネ）に播種した。５％
炭酸ガス存在下、３７℃で５日間、２０ｒｐｍで攪拌培
養した。４８５ｍ１の培養物より遠心分離（４００ｘｇ
、２０分間）により４８０ｍ１の上清を得、ポアサイズ
０．２２ミクロンのメンブランフィルタ−で濾過した。

濾液より実施例２と同様の操作により抗体を精製した。

４８０ｍ１の培養上清より１０．５ｍｇのＩｇＭ（ＮＩ
Ｏ−１）溶液が得られた。

実施例５．　ヒトモノクローナル抗体の緑膿菌感染に対
する防御活性試験 実施例２および実施例４で得られたヒトモノクローナル
抗体、Ｎ４−２、Ｎｌ０−１の緑膿菌感染に対する感染
防御活性について検討した。生後、８週から１２週令の
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌）−群５匹から１０匹に、マ
ウス１匹当たりヒトモノクローナル抗体を５０ｎｇ、５
００ｎｇ、５μｇ、５０μｇ含む溶液０．２ｍｌを腹腔
内へ投与し、２時間後にＡ血清型緑膿菌の菌液を腹腔内
へチャレンジした。対照群にはヒトモノクローナル抗体
の代わりに生理食塩液のみを投与した。Ａ血清型緑膿菌
は、ハートインフュージョン寒天平板培地に播種して、
３７℃で一夜培養した。

増殖した菌体コロニーをかきとり、生理食塩液にて希釈
後、５％ムチンを加え、マウス１匹あたり５０％致死量
（ＬＤ５ｏ値）の８．７倍のチャレンジ菌量となるよう
に調製し、菌液とした。緑膿菌をチャレンジ後、７日目
の各投与群のマウスの生存率から５０％有効投与量（Ｅ
Ｄｓｏ値）を求めた。Ｎ４−２、Ｎｌ０−１のＥｌ）、
ｏ値は、各々０．２５μｇ、　０．２μｇであった。各
ヒトモノクローナル抗体はそれぞれがＡ血清型の緑膿菌
の感染に対し高い防御活性を有していた。

実施例６．液剤の調製 実施例２で得られたＮ４−２と実施例４で得られたＮｌ
０−１を１ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン（カルビオ
社）を０．２％（ｗ／ｖ）となるようにＰＢＳ（−）に
より各々調製し、ポアサイズ０．２２ミクロンのメンブ
ランフィルタ−を用いて除菌濾過した。各抗体を別々に
バイアル当たり１ｍｌずつ無菌分注し、液剤を調製した
。

１力月間、４℃または３７℃の温度に放置した。製剤の
保存安定性はＡ血清型緑膿菌ＬＰＳに対する抗体価をＥ
ＬＩＳＡ法により測定することによって判定した。

抗体価は、次のようにして測定した。

Ａ血清型緑膿菌ＬＰＳを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
４，０）に溶解（２ｐ　ｇ／ｍｌ）　シ、ＥＩＡ用９６
ウエルプレート（グライナー社）の各ウェルあたり０．
０５ｍ１ずつ分注した。３７℃に１６時間放置し、ＬＰ
Ｓをプレートに吸着させた。液剤希釈系列をウェル中、
室温で２時間反応させた。次に、パーオキシダーゼ結合
ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（タボ社）と２時間反応後、２，
２′アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルフオ
ニツクアシド）（シグマ社）を基質として発色させ、波
長４１４ｎｍの吸光度を測定した。吸光度が０．１とな
る希釈倍率を最小自乗法を用いて計算し、これを抗体価
とした。

１力月間４℃または３７°Ｃに放置したＮ４−２および
Ｎｌ０−１の液剤の抗体価は、対照の一８０℃に保存の
液剤の抗体価と差はなく、抗体活性が保持されていた。

実施例７．　凍結乾燥製剤の調製 実施例２で得られたＮ４−２と実施例４で得られたＮｌ
０−１を１ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン（カルビオ
社）を０．２％（ｗ／ｖ）となるようにＰＢＳ（−）に
より各々調製し、ポアサイズ０．２２ミクロンのメンブ
ランフィルタ−を用いて除菌濾過した。各抗体を別々に
バイアル当たり１ｍｌずつ無菌分注し、凍結乾燥して凍
結乾燥製剤を調製した。蒸留水で再溶解し、実施例６と
同様にしてＡ血清型緑膿菌ＬＰＳに対する抗体価を測定
したところ、Ｎ４−２およびＮｌ０−１の凍結乾燥製剤
の再溶解液の抗体価は、対照の凍結乾燥未処理液の抗体
価と差はなく、抗体活性が保持されていた。

災１！宸九」 本発明によるヒト−ヒト・ハイブリドーマを適当な生産
用培地を用いて培養し、培養物より精製したヒトモノク
ローナル抗体の単品、又は２種以上の組み合わせ、ある
いは他のヒト抗体と組み合わせることにより、緑膿菌感
染症に対し優れた予防、治療効果が達成される。

本発明のＡ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクロ
ーナル抗体を産生ずるヒト−ヒト・ハイブリドーマは、
動物細胞培養用のウシ胎児血清添加培地中で長期間安定
に継代、増殖が可能である。

さらには、培養物よりヒトモノクローナル抗体を精製す
る際に培地由来の未知の不純物の混入の恐れのない無血
清培地中でも抗体を大量に産生する能力を有しており、
緑膿菌感染症の予防、治療用製剤の組成物調製の為の原
料となるヒトモノクローナル抗体を得るのに最適である
。即ち、本発明の新規ヒト−ヒト・ハイブリドーマは高
い抗体分泌能を有し、大量に培養してヒトモノクローナ
ル抗体を製造する場合に、培養期間の短縮化と製造コス
トの低減をもたらすことが出来る。

また、本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマはヒトモノ
クローナル抗体の生産用の細胞株として使用できるだけ
でなく、他の宿主細胞あるいは微生物にグロブリン遺伝
子を導入、発現させる場合のヒト抗体遺伝子調製用の材
料細胞に使用することも出来る。

代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくともＡ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモ
   ノクローナル抗体を産生するヒト−ヒト・ハイブリドー
   マとそれに由来する細胞株。 ２、ヒト染色体のみを有し、かつ無限増殖能を有する細
   胞株とヒト抗体産生細胞とのハイブリドーマである第１
   項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来する
   細胞株。 ３、ヒト染色体のみを有し、かつ無限増殖能を有する細
   胞株がハイブリドーマの選択特性を有する細胞株である
   第２項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来
   する細胞株。 ４、ハイブリドーマの選択特性を有する細胞株が微工研
   条寄第２１２９号あるいはそれに由来する細胞株である
   第３項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来
   する細胞株。 ５、ヒト抗体産生細胞がＥＢウィルス形質転換細胞であ
   る第２項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由
   来する細胞株。 ６、ＥＢウィルス形質転換細胞が微工研条寄第１５９９
   号あるいはそれに由来する細胞株である第５項記載のヒ
   ト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来する細胞株。 ７、産生するヒトモノクローナル抗体が対応する血清型
   緑膿菌の感染に対して防御的である第１項から第６項記
   載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来する細胞
   株。 ８、微工研条寄第２２７０号または条寄第２２７１号の
   ヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来する細胞株。 ９、第１項から第８項記載のヒト−ヒト・ハイブリドー
   マの作製方法。 １０、第１項から第８項記載のヒト−ヒト・ハイブリド
   ーマとそれに由来する細胞株の少なくとも１つを培養し
   、その培養物より精製することよりなるＡ血清型緑膿菌
   に反応性を有するヒトモノクローナル抗体の調製方法。 １１、第１項から第８項記載のヒト−ヒト・ハイブリド
   ーマとそれに由来する細胞株が産生するヒトモノクロー
   ナル抗体。 １２、第１０項記載の調製方法により調製したヒトモノ
   クローナル抗体。 １３、第１０項から第１２項記載のヒトモノクローナル
   抗体を少なくとも１種含有する緑膿菌感染症の予防、治
   療用の製剤。 １４、第１３項記載の製剤が液剤である緑膿菌感染症の
   予防、治療用の製剤。 １５、第１３項記載の製剤が凍結乾燥製剤である緑膿菌
   感染症の予防、治療用の製剤。 １６、第１３項から第１５項記載の予防、治療用の製剤
   を投与することを特徴とする緑膿菌感染症の予防、治療
   方法。