JPH02245184A - Ｂ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクローナル抗体、その産生細胞、製造法及び製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用公国 本発明は、Ｂ血清型の緑膿菌（シュードモナス・エルギ
ノーザ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ）に対するヒトモノクローナル抗体を大量、かつ安定
に供給することを可能とするヒト−ヒト・ハイブリドー
マ細胞株と、その産生するヒトモノクローナル抗体およ
びそれを有効成分とする緑膿菌感染症の予防、治療用の
製剤に関するものである。

貨来の技術 緑膿菌感染症は、各種基礎疾患を有する患者や免疫抑制
作用を有する薬剤の投与を受けている患者に多く発生す
る日和見感染症である。現在、緑膿菌感染症は最も治療
の困難な感染症と考えられている。すなわち、緑膿菌は
これまで常用されてきた抗生物質のほとんどすべてに対
して耐性を示すばかりでなく、近年開発された抗生物質
に対しても容易に耐性が誘導される傾向が強い。そのた
め、宿主側の緑膿菌処理能力の増強をめざした予防、治
療法の研究がなされている。

近年、緑膿菌感染症の治療に健常人の血清あるいは血漿
から精製したヒト免疫グロブリンあるいはその化学的修
飾物を有効成分とするグロブリン製剤を用いることが多
い。しかし、これらの製剤に含まれる抗体のうち緑膿菌
に対し親和性を有し、かつ、治療に有効な抗体の量は一
定せず、また、その含量が少ないため、これらの製剤の
予防、治療効果を疑問視する向きも多い。そのため、低
用量で有効なヒトモノクローナル抗体の開発が急がれて
いる。

緑膿菌は外膜上に存在するリポ多糖体 （ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、以下ＬＰＳ
と略す）分子上の〇−多糖側鎖を認識する免疫抗体、す
なわち緑膿菌の血清型特異Ｏ抗原に対する抗体を用いて
血清型別分類がなされている。緑膿菌の血清型別分類に
関しては現在でも多くの議論があるが、日本ではＡ型か
らＭ型までの１３種の血清型に分類する緑膿菌研究会分
類（Ｈｏｍｍａ、　Ｊａｐａｎ　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅ
ｄ、、　３２９−３３６（１９７６））が広く用いられ
ている。臨床現場で緑膿菌感染患者より分離される緑膿
菌の血清型の割合はほぼ一定しており、１３種の血清型
のうちＡ、Ｂ、Ｅ、Ｇ、■型の５種の血清型の菌が占め
る率が高いことが知られている。

一方、緑膿菌に対するマウスモノクローナル抗体は、ケ
ーラーとミルスタインにより開発されたマウス−マウス
・ハイブリドーマ技術（Ｋｉ５ｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅ
ｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５−４９７（１
９７５））を用いて作製されて以来〔例えば、Ｈａｎｃ
ｏｃｋら、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、、　３７．１６６−１７１　（１９８２）
　）、型別診断への応用〔例えば、明治製菓、ＥＰ　１
０１０３９］や、感染防御に有用なモノクローナル抗体
の検索のための基礎研究などに用いられてきた。

サドッフらは、緑膿菌の血清型特異ＬＰＳ分子上の〇−
多糖側鎖に対するマウスモノクローナル抗体が、マウス
の感染実験において、対応する血清型の菌による致死感
染に対して高い防御活性を有することを報告した（Ｓａ
ｄｏｆｆら、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆｔｈｅ　１９８
２　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ
　ｏｎＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａ
ｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、　Ｎｎ２５３（１９
８２）　］。その後の報告にも、緑膿菌の血清型特異０
抗原に対するマウスあるいはヒトモノクローナル抗体の
インビボおよびインビトロの試験系での有効性が示され
ている 〔例えば、Ｓａｗａｄａら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄ
ｉｓ、、　１５０．５７０５７６　（１９８４）　、中
村警防ら、日本細菌学雑誌、３９゜３３７　（１９８４
）、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍ
ｕｎ、、　５４゜２３９−２４４　（１９８６）、５ｕ
ｚｕｋｉら、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
。

３１、９５９−９６６　（１，９８７）、Ｚｗｅｒｒｎ
ｉｋら、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　５６．１８７３−１８７９　（１
９８８）　）。また、血清型特異的ヒトモノクローナル
抗体の緑膿菌感染症の予防、治療への利用については、
本発明者らによる血清型特異ＬＰＳ分子上の〇−多糖側
鎖を単独に認識する抗体が特許出願明細書〔特開昭６０
−２４８６２６号〕におよび複数の〇−多糖側鎖を共通
に認識する抗体が特許出願明細書［国際公開番号υ０８
８１０４６６９］にその他、幾つかの特許出願明細書〔
ジエネティック　システムズ　コーポレーション、ＥＰ
　１６３４９３とＢＥ　９０５８９０、帝人株式会社、
１１０８６１０３７５４、湧永製薬株式会社、特開昭６
１−０９１１３４号、メルク　エンド　カムパニー　イ
ンコーホレーテッド、ＥＰ　２５６７１３）に記載され
ている。

発明が解決しようとする問題点 ヒトモノクローナル抗体の作製は、−船釣にはヒトのＢ
細胞にエプスタイン・バー・ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ、以下ＥＢウィルスと略す）を
感染させてＥＢウィルス形質転換細胞とするか、Ｂ細胞
などのヒト抗体産生細胞と無限増殖能を有する親細胞株
を細胞融合してヒト−マウス・ヘテロハイブリドーマあ
るいはヒト−ヒト・ハイブリドーマとすることにより行
われる。

ＥＢウィルス形質転換法により作製したＥＢウィルス形
質転換細胞は一般に抗体産生量が低く、継代安定性に劣
り、また、比較的栄養要求性が高いため、無血清培地を
用いた大量培養生産には適さない。マウスミエローマを
親細胞株に用いてヒト抗体産生細胞と融合した場合、作
製されたヒト−マウス・ヘテロハイブリドーマはヒト抗
体と共にマウスの蛋白質を合成、分泌するため、ヒトへ
投与するヒトモノクローナル抗体の生産株として用いる
には必ずしも適当でない。また、ヒト染色体のみを有し
、かつ無限増殖能を有する細胞を親細胞株に用いて、ヒ
ト抗体産生細胞と融合してヒト−ヒト・ハイブリドーマ
を作製する場合も幾っがの問題点がある。例えば、ヒト
ミエローマに由来する親細胞株とヒト抗体産生細胞の融
合効率は低い。

また、ＥＢウィルス形質転換細胞に由来する親細胞株と
ヒト抗体産生細胞の融合効率は比較的高いが、作製され
たヒトーヒ１−・ハイブリドーマは抗原特異性が不明な
抗体を同時に産生したり、その抗体産生量が低いものが
多い。ヒトミエローマとＥＢウィルス形質転換細胞のハ
イブリドーマに由来する親細胞株とヒト抗体産生細胞の
融合により作製されたヒト−ヒト・ハイブリドーマは比
較的高い抗体産生量を示すが、抗原特異性を有さない抗
体を同時に産生ずる性質は解消されていない。

問題を解決するための手段 本発明者らは、Ｂ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモ
ノクローナル抗体を産生するヒト−ヒト・ハイブリドー
マが作製出来ること、また、該ヒトヒト・ハイブリドー
マが各種培地中で安定に増殖し、比較的大量の抗体産生
を長期継続すること、更には、該ヒト−ヒト・ハイブリ
ドーマを培養し、その培養物よりＢ血清型緑膿菌に反応
性を有するヒトモノクローナル抗体が調製出来ることを
見いだした。

本発明者らは、これらの結果に基づき、該ヒト−ヒト・
ハイブリドーマの産生ずる抗体の緑膿菌感染に対する防
御活性を試験し、本発明を完成するに至った。

本発明でいうヒト−ヒト・ハイブリドーマとは、ヒト染
色体のみを有し、かつ無限増殖能を有する親細胞株とヒ
ト抗体産生細胞との融合により作製されるヒト染色体の
みを有するハイブリドーマをいう。

本発明でいう選択特性とは、作製したハイブリドーマを
未融合の細胞より選別することを可能とする親細胞株の
化学的あるいは物理的な特性をいう。例えば、選択特性
として８−アザグアニンあるいは６−チオグアニン、お
よびウアバイン耐性の親細胞株を使用した場合、ヒト抗
体産生Ｆ！．Ｂウィルス形質転換細胞とのハイブリドー
マのみがヒポキサンチン、アザセリン、およびウアバイ
ンを含む培養液中で生き残る。

上記選択特性を有する親細胞株は適宜選択される。また
、緑膿菌に反応性を有するヒト抗体産生細胞はヒトＢ細
胞およびその由来細胞より適宜選択される。

以下、ヒト染色体のみを有し、かつ無限増殖能と８−ア
ザグアニンおよびウアバイン耐性を有する細胞株を親細
胞株として、Ｂ血清型緑膿菌に反応性を有するヒト抗体
産生ＥＢウィルス形質転換細胞をヒト抗体産生細胞とし
て用いてヒト−ヒト・ハイブリドーマを作製する場合を
例にあげ、本発明を説明する。

（具体的説明） １、使用緑膿菌 本発明では便宜上、使用緑膿菌の分類を緑膿菌研究会主
催の血清型別検討委員会の決定による血清型別分類に従
うものとし、Ａ型からＭ型に属する菌株を使用している
。

Ａ型からＭ型に属する菌株は、アメリカン・タイプカル
チャーコレクション（ＡＴＣＣ）、財団法人発酵研究所
（ＩＦＯ）および東京大学医科学研究所から入手できる
。

２、　ヒト−ヒト・ハイブリドーマの作製本発明による
、Ｂ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクローナル
抗体を産生ずるヒト−ヒト・ハイブリドーマは、ハイブ
リドーマ作製用の親細胞株ＭＰ　４１０９あるいはその
継代株とヒト抗体産生細胞を公知の方法〔成帯ｒＭＯＮ
ＯｃＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＪ　ｐ３６３．
　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ刊（１９８０）他〕に準じ
て細胞融合して作製出来る。ヒト抗体産生細胞には、緑
膿菌に対する抗体産生がみられる健常人あるいは緑膿菌
感染症既往歴のある患者の末梢血、リンパ節、扁桃腺、
肺臓や分娩時の膳帯血などから公知の方法により得られ
るＢ細胞を用いることが出来るが、Ｂ細胞にＥＢウィル
スを感染させて形質転換を行い一定期間培養後、培養上
清中に緑膿菌に反応性を有する抗体の分泌が検出された
ＥＢウィルス形質転換細胞コロニー、あるいはこれらＥ
Ｂウィルス形質転換細胞コロニーより単一に選別された
細胞株を用いることが好適である。

次に各工程につき詳細な説明を加える。

血液や上記組織などからのＢ細胞の分離および濃縮は、
フィコール・コンレイ液等の細胞分画液を用いた比重遠
心法、Ｅロゼツト形成法、パニング法などを組み合わせ
て効率的に行うことが出来る。さらには、Ｂ細胞をボー
クウィードマイトージェ′？（ＰＷＭ）を添加した培養
液中で数日間培養し、＝１２− Ｂ細胞を増殖させた後に細胞融合に供することも出来る
。

ＥＢウィルスによるＢ細胞の形質転換法は公知の方法〔
例えば、５ｔｅｉｎｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ、　２６９
．、４２０４２２（１９７７））に準じて実施すること
が出来る。Ｂ９５−８細胞（感染性のＥＢウィルスを産
生するマーモセット白血球由来細胞）を２０％ウシ胎児
血清（以下ＦＣ３と略す）を含むＲＰＭＩ　１６４０培
地（以下培養液と略すことがある）で培養し、遠心分離
にて得られた静止期に近い７日目の培養上清をウィルス
液とする〔小野ら、第４回日本免疫学会総会記録、３９
９−４０１（１９７４）　）。Ｂ細胞を遠心分離し、吸
引にて上清を除去して得られるペレットにウィルス液を
加えて分散後、３７℃、５％炭酸ガス存在下で３０分か
ら１時間インキュベーションする。培養後、遠心分離し
、吸引にて上清を除去した後、ペレットに細胞密、度が
Ｉ　Ｘ　１０’個／ｍｌから５　Ｘ　１０’個／ｍｌと
なる様に培養液を加え、細胞を分散させる。細胞分散液
を２４ウエル培養プレー１〜または９６ウエル培養プレ
ートの各ウェルに分注し、３７℃、５％炭酸ガス存在下
で２週間から４週間培養する。この間、３日から４日ご
とに培養液の半量を新しい培養液に交換することが望ま
しい。

緑膿菌に反応性を有する抗体の検出は、一般のラジオイ
ムノアッセイ法や、酵素抗体法（以下ＥＬＩＳＡ法と略
す）などの方法〔成帯［単クローン抗体Ｊ　ｐ１４４、
講談社刊（１９８３）等〕により行うことが出来る。本
発明ではＥＬＩＳＡ法を用いている。すなわち、あらか
じめ緑膿菌の０．３％ホルマリン処理菌体をメンブラン
フィルタ−に固定し、容器中で細胞の培養上清と一定時
間反応させた後、酵素標識したウサギ抗ヒト抗体を反応
させ、酵素反応による基質の呈色割合により目的抗体の
産生の有無および産生量を測定するドツト・イムノバイ
ンディングアッセイ法（以下ＤＩＢＡ法と略す）　［Ａ
ｎａｌ。

Ｂｊｏｃｈｅｍ、、　１１９．１４２−１４７（１９８
２）］を簡易アッセイ法として用いている。

ＥＢウィルス形質転換細胞の増殖コロニーが認められた
各ウェルの培養上清について上記ＥＬＩＳＡ法により、
目的抗体が存在するウェルを選別した後、このウェル中
の細胞を軟寒天法〔成帯「組織培養応用研究法Ｊ　ｐ２
８９、ソフトサイエンス社刊（１９８５）等〕あるいは
限界希釈法〔成帯「単クローン抗体」ｐ７３、講談社刊
（１９８３）等〕によりクローニングを行う。さらに、
クローニングにより細胞の増殖が認められた後、再度Ｅ
ＬＩＳＡ法によるアッセイを行う。

１回から数回のクローニングにより、目的の抗体のみを
分泌する単一細胞株を得ることが出来る。

Ｍｌ’　４１０９とヒト抗体産生細胞との融合は、ポリ
エチレングリコール（以下、ＰＥＧと略す）などの−船
釣な融合試薬や、センダイウィルス （Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　ｏ
ｆ　Ｊａｐａｎ　；　ＨＶＪ）などのウィルス粒子を使
用して行える。例えば、平均分子量１０００から６００
０程度のＰＥＧを、ＲＰＭＩ　１６４０培地やダルベツ
コの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に３０％から５０
％（Ｗ／Ｖ）の濃度に添加したものが融合液として推奨
される。また、融合効率を高めるため、ジメチルスルホ
オキサイド（ＤＭＳＯ）を添加することも望ましい。ま
た、電気融合装置などを用いた物理的手法によっても行
える。

例えば、ＭＰ　４１０９とＥＢウィルスによる形質転換
後目的抗体の産生が認められたウェルの細胞や、末梢血
等から分離される抗体産生細胞を１：１から１＝１０程
度の比率で混合し、細胞融合用培地（５０％ＰＥＧと１
０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ　１６４０培地等）を加え
て、細胞を融合させる。つぎに、融合したハイブリドー
マのみの増殖に適した培養液（以下、選択培地と略す）
に、細胞密度がｔｘｔｏ、’個／耐から５×１０６個／
ｍｌとなる様に細胞を分散させる。細胞分散液を２４ウ
エルまたは９６ウエルの培養プレートに分注し、３７℃
、５％炭酸ガス存在下で２週間から４週間培養する。こ
の間、３日から５日ごとに選択培地の半量を新しい選択
培地と交換することが望ましい。この際、フィーダー細
胞としてマウスの腹腔浸出細胞等を共存させるとハイブ
リドーマの増殖を早めることが出来る。ヒト抗体産生細
胞が無限増殖能を有さない細胞（Ｂ細胞）の場合、選択
培地としてヒボキサンチン、アミノプテリン、チミジン
を含む培地（以下、ＨＡＴ培地と略す）あるいはヒポキ
サンチン、アザセリンを含む培地（以下、ＨＡ培地と略
す）が使用できる。また、ヒト抗体産生細胞がＥＢウィ
ルス形質転換細胞などの無限増殖能を有する細胞の場合
、選択培地としてＨＡＴ培地にウアバインを添加した培
地（ＨＡＴ−０培地）またはＨＡ培地にウアバインを添
加した培地（ＨＡ−０培地）が使用できる。ハイブリド
ーマの増殖コロニーが認められた各ウェルの培養上清に
ついて上記ＥＬＩＳＡ法により、目的抗体が存在するウ
ェルを選別した後、限界希釈法によりクローニングを行
う。

さらに、クローニングにより細胞の増殖が認められた後
、再度ＥＬＩＳＡ法によるアッセイを行う。１回から数
回のクローニングにより、目的の抗体のみを分泌する単
一細胞株を得ることが出来る。

本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマの培養は、通常の
培地を用いて行える。例えば、５　Ｘ　１０’個／ｍｌ
から２　Ｘ　１０’個／ｍｌの細胞密度となるように培
養液に分散し、適当な細胞培養容器に播種した後、３７
℃、５％炭酸ガス存在下で培養できる。培養液の例とし
ては、ＲＰＭＩ　１６４０やＤＭＥＭ等の基礎培地に、
Ｆｅ２の適量を添加したものが好適である。また、各種
の低血清あるいは無血清培地も適宜使用できる。例えば
、ＮＹＳＦ　４０４無血清培地単独、あるいはＮＹＳＦ
　４０４無血清培地にウシ血清アルブミンの適量を添加
したものが推奨される。継代培養は、３日から７目間隔
で細胞の回収と播種の操作を繰り返すとよい。

本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマの凍結保存は一般
的手法により行える。例えば、細胞を適当な細胞凍結保
存液にＩ　Ｘ　１０５個／ｍｌから５　Ｘ　１０７個／
ｍ１の細胞密度となるように分散し、液体窒素あるいは
液体窒素ガス中、または、−２０℃から一８０℃の冷凍
庫中で凍結保存出来る。細胞凍結保存液には、上記基礎
培地や中性緩衝液等に動物血清、アルブミン、メチルセ
ルロース、ぶどう糖やジメチルスルホオキサイドなどを
適宜添加して用いることが推奨される。

凍結細胞の復元は一般的手法により行える。例えば、凍
結された細胞を含む保存液を温水中で急速に融解し、細
胞を培養液等で洗浄して保存液に含まれるＤＭＳＯを洗
い出した後に培養液に分散して培養を行うと良い。

培養上清中の免疫グロブリン量の測定は、般のＥＬＩＳ
Ａ法により行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法に
よる場合は、固相に抗ヒト免疫グロブリン抗体を固定し
くこの時使用される抗体を以下、同相化抗体と略す）、
培養上清の一部を反応させる。次に、酵素標識抗ヒト免
疫グロブリン抗体を反応させ、基質を加え、酵素反応に
より生じる呈色割合より培養上清中の免疫グロブリン量
の測定が行える。ヒトＩｇに量の測定は、固相化抗体と
して抗ヒトＩｇＭ　（ミュー鎖特異）抗体を、酵素標識
抗体とし、てパーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭ　（ミ
ュー鎖特異）抗体を使用することにより行える。

３、　ヒトモノクローナル抗体の製造 本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマは、重鎖としては
抗体産生細胞株由来のもののみを合成、分泌し、通常の
動物細胞培養用の培地中で長期間安定に継代、増殖が可
能である。また、培養物より抗体を精製する際に培地由
来の未知の不純物の混入の恐れのない無血清培地中でも
抗体を産生ずる能力を有しており、緑膿菌感染症の予防
、治療用製剤の組成物調製の為の原料となるヒトモノク
ローナル抗体を得るのに最適である。

本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマを無血清培地中で
培養し、培養液より任意の一般的な方法、例えば、ゲル
ろ過払、イオン交換クロマトグラフィー法、ハイドロキ
シアパタイトなどを用いる吸着クロマトグラフィー法な
どの物理化学的精製法や、抗原あるいはヒトモノクロー
ナル抗体に親和性を有する物質（例えばプロティンＡや
抗ヒト免疫グロブリン抗体等）を固定化した担体を用い
るアフィニティクロマトグラフィー法や、電気泳動法、
硫酸アンモニウム塩析などの沈澱法等を組み合わせるこ
とにより、Ｂ血清型緑膿菌に反応性を有する単一なヒト
モノクローナル抗体を比較的容易に高度に精製出来る。

４、　ヒトモノクローナル抗体製剤の製造本発明のＢ血
清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクローナル抗体は
、対応する血清型緑膿菌感染に対して高い防御活性を有
している。本発明のヒトモノクローナル抗体は、単独、
あるいは通常用いられる添加剤、賦形剤等を加えて液剤
あるいは凍結乾燥製剤として緑膿菌感染症の予防、治療
に供することが出来る。添加剤、賦形剤には一般に生物
製剤に用いられる天然物、化合物より適宜選択されるが
、抗体の安定性の保持にはアルブミン等の動物性蛋白質
や、デキストラン等の多糖類、アミノ酸、糖類の使用が
良好な結果を与える。また、本発明のヒトモノクローナ
ル抗体は緑膿菌や緑膿菌以外の微生物に反応性の他のモ
ノクローナル抗体やポリクローナル抗体と混合した製剤
の作製に用いることも出来る。

５、　ヒトモノクローナル抗体による感染症の予防、治
療 実際の緑膿菌感染症の予防、治療にあたっては本発明の
ヒトモノクローナル抗体あるいはそれを含む製剤を単独
または２種以上混合するか、あるいは緑膿菌に反応性を
有する他のモノクローナル抗体あるいはそれを含む製剤
やグロブリシ製剤と混合して用いてもよい。

本発明のＢ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクロ
ーナル抗体あるいはそれを含む製剤は、緑膿菌感染症の
予防、治療のために直接ヒトに投与可能である。用量、
投与経路は適宜選択されるが、用量は体重（ｋｇ）あた
り０．０１ないし１０ｍｇが好ましく、投与経路は皮内
、皮下、筋肉内、静脈内投与等を適宜選択出来る。

従って、本発明により、緑膿菌感染症の予防、治療、診
断などの広い分野に使用出来るヒトモノクローナル抗体
の工業的生産用の細胞株を提供することが可能となる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

尚、ハイブリドーマ作製用の親細胞株ＭＰ　４１０９は
微工研に昭和６３年１０月２７日から寄託番号微工研条
寄第２１２９号として寄託されている。緑膿菌研究会分
類標準血清型緑膿菌として、Ｂ血清型緑膿菌にはＡＴＣ
Ｃ２７５７８（ＩＩＤ　１００２）、ＡＴＣＣ２７５８
３（ＩＤＤ　１００７）、ＡＴＣＣ２７５８９（ＩＤＤ
　１０１３）、ＩＤＤ　５００４を用いた。

実施例１．抗緑膿菌抗体産生ハイブリドーマの作製 （１）　ＥＢウィルス液の調製 ＥＢウィルスを産生放出しているＢ９５−８細胞を、３
　Ｘ　１０’個／ｍｌの密度となるように２０％ＦＣ５
を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（以下、２０％ＦＣ３培
養液と略すことがある）に浮遊させ、５％炭酸ガス存在
下、３７℃で静置培養した。静止期に近い７日目の培養
上清を遠心分離（８００Ｘｇ、１０分間）により集め、
ポアサイズ０．４５ミクロンのメンブランフィルタ−（
ミリボア）でろ過し、ＥＢウィルス液とした。

（２）ヒトリンパ球の調製 Ｂ血清型緑膿菌に対する血清抗体活性が、ＤＩＢＡ法に
より１０００倍希釈まで陽性反応が認められた健常人か
らヘパリン加末梢血５０ｍ１を採血した。これに等量の
ＲＰＭＩ　１６４０培地を加えて２倍に希釈後、半量の
フィコール・パック（ファルマシア）上に界面が乱れな
い様に重層し、室温で遠心分離（４００Ｘｇ、３０分間
）した。遠心分離後、界面層をパスツールピペットを用
いて取り出し、等量の２０％ＦＣ５培養液を加えて、室
温で遠心分離（２５０ｘ　ｇ、１０分間）した。沈澱し
た細胞を、２０％ＦＣ３培養液に懸濁後、さらに１回、
遠心分離の操作を繰り返し、ヒトリンパ球のペレット（
細胞数；３．５　Ｘ　１０’個）を得た。

（３）　ＥＢウィルスによる形質転換 ヒト抗体産生細胞３．５　Ｘ　１０７個に対して（１）
で調製したウィルス液３５ｍ１を加えて、３７℃で１時
間インキュベーションした。インキュベーション後、遠
心分離（２５０Ｘ　ｇ、１０分間）により細胞を集めた
。

細胞を２０％ＦＣ５培養液に分散し、５　Ｘ　１０’個
／ｍｌの密度に調整後、０．１ｍｌずつ、９６ウエル平
底培養プレートに播種（合計６７２ウエル）した。細胞
は５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養した。４日後
に０．１ｍｌの２０％ＦＣ３培養液を加え、その後、３
日から５日ごとに半量の培養液を新しい培養液で交換し
た。３週間後に、すべてのウェルに細胞増殖が認められ
た。

（４）抗緑膿菌抗体の検出 培養上清中の抗Ｂ血清型緑膿菌ヒト抗体の有無はＤＩＢ
Ａ法で調べた。各ウェルの培養上清０．１ｍｌを、１ド
ツト当たり０．４μｇのＢ血清型緑膿菌ＡＴＣＣ２７５
７８のホルマリン処理乾燥菌体を固定したグリッド入り
ニトロセルロース・メンブレンフィルター（３，１ｍｍ
角）と、９６ウエルＵ底マイクロプレート中で反応させ
た。室温で２時間反応させ、ついでパーオキシダーゼ標
識ウサギ抗ヒト・イムノグロブリン抗体（ダコ社）と２
時間反応後、４−クロロ−１−ナフトールを基質として
発色させ、抗原を固定したニトロセルロース・メンブレ
ンフィルター上に肉眼観察で発色が認められたものを抗
体産生が陽性と判定した。

（５）クローニング 抗体検出法によりＢ血清型緑膿菌との反応性が認められ
た６４ウエルの細胞を、２４ウエル培養プレート、６ウ
エル培養プレート、６ｃｍシャーレへと順次拡大培養し
た。細胞増殖の認められた６ｃｍシャーレについて（４
）と同様にして培養上清中の抗Ｂ血清型緑膿菌ヒト抗体
の有無をＤＩＢＡ法で測定した。抗体産生が陽性と判定
された５２枚のうち活性の強い１６枚の６０ｎｌシヤー
レ中の細胞は軟寒天法によりクローニング操作を行った
。先ず、血球計算盤を用いて正確に細胞数を測定した後
、ｌ　Ｘ　１０’個／ｍｌの密度の細胞浮遊液とし、こ
の細胞浮遊液０．１ｍｌを０．３％アガロース（ジ−プ
ラークアガロース、エフ・エム・シー社）を含む培養液
３０ｍ１に加え混合した。つぎに、あらかじめ０．５％
アガロースを含む培養液４ｍｌを分注して固めた６ｃ、
ｍシャーレに、細胞および０．３％アガロースを含む培
養液３ｍｌを分注して固めた（各細胞あたり１０枚）。

細胞を分注した６ｃｍシャーレは５％炭酸ガス存在下、
３７℃で静置培養した。３週間から５週間後、軟寒天中
に細胞が増殖しコロニーが肉眼的に認められるようにな
ったら、各コロニーをパスツールピペットを用いて、あ
らかじめウェル当たり０．１ｍｌの２０％ＦＣ３培養液
を分注した９６ウエル平底培養プレートの各ウェルに移
し培養した。２日後に２０％ＦＣ５培養液０　、１ｍｌ
を加え、さらに２日後、細胞増殖の認められたウェルに
ついて培養上清中の抗緑膿菌モツクローナル抗体の有無
をＤＩＢＡ法で測定した。２枚の６ｃｍシャーレに由来
する軟寒天コロニーに抗体産生が認められた。これらの
コロニーを順次拡大培養し、抗Ｂ血清型緑膿菌ヒトＩｇ
Ｍを産生するＥＢウィルス形質転換細胞コロニー６Ｌ１
ＯＮ１．６Ｌ１ＯＮ２．６Ｌ１ＯＮ３．６Ｌ１ＯＮ４を
得た。

（６）細胞融合 抗Ｂ血清型録膿菌ヒトＩｇＭ産生ＥＢウィルス形質転換
細胞コロニー６Ｌ１ＯＮ２とＭＰ　４１０９を１０％Ｆ
Ｃ５を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（以下、１０％ＦＣ
３培養液と略すことがある）中で増殖させ、各々集めて
ＲＰＭＩ　１６４０培地で洗浄した。各々３　Ｘ　１０
’個の細胞を５０ｍ１容量のプラスチック製遠心管中で
混合した。遠心分離（１７５Ｘ　ｇ、１０分間）後、上
清を吸引除去し、細胞ペレットに直接、０．５ｍｌの５
０％ＰＥＧ（Ｍ、Ｗ、１５００、和光純薬）および１０
％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ　１６４０培地を静かに加え
ゆっくり回転させ、細胞を融合させた。

２分後、１０ｍ１のＲＰＭＩ　１６４０培地を加え静か
に撹拌後、遠心分離（１７５ｘ　ｇ、１０分間）した。

上清を吸引除去し、細胞ペレッ１〜に２０％ＦＣ３，２
Ｘ　１０−’Ｍヒポキサンチン（シグマ）、１μｇ／ｍ
ｌアザセリン（シグマ）、５　Ｘ　１０−ＧＭ　ウアバ
イン（シグマ）を含むＲＰＭ１１６４０培地（以下、Ｈ
Ａ−０培地と略すことがある）を加えて、Ｉ　Ｘ　１０
’個／ｍｌの密度となるように懸濁後、９６ウエル平底
培養プレートのウェル当たり０．１耐ずつを播種（合計
１９２ウエル）した。細胞は５％炭酸ガス存在下、３７
℃で静置培養した。４日後に０．１ｍｌのＨＡ−０培地
を加え、その後、３日から５日毎に半量のＨＡ−０培地
を新しいＨＡ−０培地と交換した。

４週間から５週間後に、合計２６ウエルに細胞増殖が認
められた。

（７）クローニング 細胞増殖が認められた２６ウエルの培養上清のうち２０
ウエルの培養上清中に抗Ｂ血清型緑膿菌抗体産生が認め
られた。２０ウエルの細胞をそれぞれ個別に集め、血球
計算盤を用いて正確に細胞数を計測した。細胞をＨＡ−
０培地に分散し、２０個／ｍｌの細胞密度の細胞浮遊液
とした。あらかじめ、ウェル当たり］　Ｘ　１０”個の
マウス肺臓細胞を播種した９６ウエル平底培養プレート
（以下、フィーダープレ−トと称する）の各ウェルの上
清を除去後、細胞浮遊液を各ウェル当たり０．１耐ずつ
播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養した。

各細胞光たり１枚のフィーダープレー１−を使用した。

４日後に０．１耐のＨＡ−０培地を加え、その後、３日
から５日毎に半量のＨＡ−０培地を新しいＨＡ−０培地
と交換した。２週間から４週間後、増殖の認められたウ
ェルについ・て培養上清中の抗Ｂ血清型緑膿菌ヒト抗体
の有無をＤＩＢＡ法で調べた。Ｂ血清型緑膿菌と反応す
る抗体産生が陽性と判定されたウェルの細胞を上記のご
とく再度クローニングした。２回のクローニングにより
Ｂ血清型緑膿菌（ＡＴＣＣ２７５７８、ＡＴＣＣ２７５
８３、ＡＴＣＣ２７５８９、ＩＩ［）　５００４）に反
応するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マＨＰ　５０９０からＭＰ　５０９８およびＭＰ　５１
４７の１０株が得られた。

９６ウエル平底培養プレート中で十分に増殖したハイブ
リドーマを除々に拡大培養した。細胞を７５％ＦＣ３，
１０％ＤＭＳＯ１１５％ＲＰＭＩ　１６４０培地よりな
る細胞保存液にＩ　Ｘ　１０’個／耐密度となるように
懸濁後、２ｍｌの凍結チューブに分注した。−２０℃ま
で１分間当たり１℃の速度で冷却後、液体窒素中で凍結
保存した。　（８）抗体産生量の測定ハイブリドーマが
細胞外へ分泌するＩｇＭ量の測定は以下の様に行った。

対数増殖期の細胞を集め、１０％ＦＣ３培養液にｌＸｌ
０’個／ｍｌ密度となるように懸濁し、６ウエル培養プ
レートの各ウェルに１ｍｌずつ播種し、５％炭酸ガス存
在下、３７℃で静置培養した。２４時間後、遠心分離（
２５０Ｘ　ｇ、１０分間）により培養上清を分離し、上
清中のヒトＩｇＭ量をＥＬＩＳＡ法にて定量した。ハイ
ブリドーマは、１０Ｇ個の細胞が２４時間に８μｇから
３８μｇのヒトＩｇＭを培養上清中に分泌した。

（９）細胞株の継代安定性の測定 細胞株の継代安定性を細胞増殖性能と抗体産生能より調
べた。

増殖の安定性は培養開始時と継代培養開始３力月後の細
胞について増殖曲線を測定することにより調べた。抗体
産生の安定性は培養開始時、培養開始１力月、２力月、
３力月の細胞のＩｇに抗体産　９ｑ− 少量を（８）と同様にしてＥＬＩＳＡ法にて測定するこ
とにより調へた。

継代培養は、以下のように行った。抗体産生量の多いＭ
Ｐ　５０９３、ＭＰ　５０９５、ＭＰ　５０９７につい
て２系列独立して、１０％ＦＣ５培養液に５Ｘ１０４個
／ｍｌ密度となるように懸濁後、底面積２５ｆｆｌのフ
ラスコに４ｍ１ずつ播種し、５％炭酸ガス存在下、３７
℃で静置培養した。３日から４日毎に細胞を集め、新鮮
な１０％ＦＣ３培養液に同密度となるように再度懸濁後
、静置培養する操作を３力月間連続的に行った。

増殖曲線の測定は、以下のように行った。肝５０９３、
ＭＰ　５０９５、ＭＰ　５０９７について２系列独立し
て培養した対数増殖期の細胞を集め、ｌＯ％ＦＣ３培養
液に５Ｘ１０４個／ｍｌ密度となるように懸濁後、６ウ
エル培養プレートの各ウェルに１ｍｌずつ計６ウエルに
播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養した。

１日毎に、１ウエル中の培養物を集め、生細胞および死
細胞密度を計測し、更に、培養上清についてはＩｇＭ量
をＥＬＩＳＡ法にて測定した。

各細胞株は培養開始時および培養開始３力月の細胞とも
ほぼ同様な増殖曲線を示した。増殖曲線より計算される
ＭＰ　５０９３、ＭＰ　５０９５、ＭＰ　５０９７の倍
加時間は各々２５．５．２５．２５．５時間であった。

１０’個の細胞が２４時間に分泌するＩｇ旧よ、ＭＰ　
５０９３、肝５０９５では、３力月の継代培養中に低下
した。しかし、ＭＰ　５０９７では１０’個の細胞が２
４時間に分泌する１、ｇＭＬよ、培養開始時には２０μ
ｇ、２力月後には２２μ＆、３力月後には１５μｇで、
３力月間の継代培養中に抗体産生には大きな変化はなか
った。

ＭＰ　５０９７は微工研に条寄第２２６８号として寄託
した。

実施例２．細胞の培養および抗体の精製ＭＰ　５０９７
の凍結保存細胞を復元し、１０％ＦＣ３培養液を用いて
拡大培養し、Ｎ’／ＳＦ　４０４無血清培地〔矢部則次
、組織培養、１１．４５８（１９８５）　）で更に拡大
培養の後、細胞を集め、５　Ｘ　１０４個／ｍｌの密度
となるように５００ｍ１の１ｊＹｓＦ　４０４無血清培
地に懸濁し、１０枚のフラスコ（底面積１７５ａ？）に
播種した。

５日間、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養した。

培養物より遠心分離（４００％ｇ、２０分間）によす’
１８０ｍ１の上清を得、ポアサイズ０．２２ミクロンの
メンブランフィルタ−で濾過した。

濾液に４８０ｍ１の飽和硫酸アンモニウム溶液を加え、
４℃に放置した。翌日、これを遠心分離しく］０．ＯＯ
ＯＸｇ、３０分間）、沈殿を集めた。５ｍｌのＰＢＳ（
＝）で沈殿を溶解し、ＰＢＳ（−）に対して十分に透析
を行い、粗ＩｇＭ画分を得た。

精製には、高速液体クロマトグラフィー用のハイドロキ
シアパタイト充填カラムを用い、　１　ｍｌ／分の流速
で分画した。０ＣＡ−カラム（ガードカラム；４ｍｍＸ
１０ｗｌ、本体カラム；７．６１ｗＸ　１００ｍｍ、三
井東圧化学株式会社）を、あらかじめ０．１５Ｍ塩化ナ
トリウムを含む０．０１阿リン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）（以下、Ａ液と略す）で十分に洗浄し、２耐
の粗ＩｇＭ画分を添加した。Ａ液で１０分間、更に７５
容のＡ液に対して２５容の割合（２５％）で０．２５Ｍ
　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）　（以下、Ｂ
液と略す）を加えた溶液でカラムを１５分間洗浄した。

その後、Ｂ液の割合が２５％から１００％までの直線濃
度勾配溶出を２０分間で行った。単一ピークとして溶出
したＩｇＭ画分をＰＢＳ（−）に対して十分に透析した
。４８０ｍ１の培養上清より１２．１ｍｇのＩｇＭ　（
Ｎ３−８）溶液が得られた。

実施例３．　ヒトモノクローナル抗体の緑膿菌感染に対
する防御活性試験 実施例２で得られたヒトモノクローナル抗体、Ｎ３−８
の緑膿菌感染に対する感染防御活性について検討した。

生後、８週から１２週令のマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ１雌）
−群５匹から１０匹に、マウス１回当たりヒトモノクロ
ナール抗体を５０ｎｇ、５００ｎｇ、５μｇ、５０μｇ
含む溶液０．２ｍｌを腹腔内へ投与し、２時間後にＢ血
清型緑膿菌（Ｆ−１８６０）の菌液を腹腔内へチャレン
ジした。対照群にはヒトモノクローナル抗体の代わりに
生理食塩液のみを投与した。Ｂ血清型緑膿菌は、ハート
インフュージョン寒天平板培地に播種して、３７℃で一
夜培養した。増殖した菌体コロニーをかきとり、生理食
塩液にて希釈後、５％ムチンを加え、マウス１匹あたり
５０％敷死量（ＬＤ５ｏ値）の２０倍のチャレンジ菌量
となるように調製し、菌液とした。緑膿菌をチャレンジ
後、７日Ｍ 目の各投与群のマウスの生存率から５０％有効投与量（
ＥＤｓｏ値）を求めた。Ｎ３−８のＥＤ、　ｏ値は、０
．７４μｇであった。本ヒトモノクロ−ナル５抗体はＢ
血清型の緑膿菌の感染に対し高い防御活性を有していた
。

実施例４．液剤の調製 実施例２で得られたＮ３−８を１　ｍｇ／ｍｌ、ヒト血
清アルブミン（カルビオ社）を０．２％（ｗ／ｖ）とな
るようにＰＢＳ（−）により調製し、ポアサイズ０．２
２ミクロンのメンブランフィルタ−を用いて除菌濾過し
た。

抗体をバイアル当たり１ｍｌずつ無菌分注し、液剤を調
製した。１力月間、４℃または３７℃の温度に放置した
。製剤の保存安定性はＢ血清型緑膿菌ＬＰＳに対する抗
体価をＥＬＩＳＡ法により測定することによって判定し
た。

抗体価は、次のようにして測定した。

Ｂ血清型緑膿菌（ＡＴＣＣ２７５７８）ＬＰＳをＯ，１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，０）に溶解（２μｇ／ｍｌ
）　Ｌ、ＥＩＡ用９６ウエルプレート（グライナー社）
の各ウェルあたり０．０５ｍ１ずつ分注した。、３７℃
に１６時間放置し、ＬＰＳをプレートに吸着させた。液
剤希釈系列をウェル中、室温で２時間反応させた。次に
、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（タボ社
）と２時間反応後、２，２″−アジノビス（３−エチル
ベンズチアゾリンスルフオニツクアシド）（シグマ社）
を基質として発色させ、波長４１４ｎｍの吸光度を測定
した。吸光度が０．１となる希釈倍率を最小自乗法を用
いて計算し、これを抗体価とした。

１力月間４℃または３７℃に放置したＮ３−８の抗体価
は、対照の一８０℃に保存の液剤の抗体価と差はなく、
抗体活性が保持されていた。

実施例５．凍結乾燥製剤の調製 実施例２で得られたＮ３−８を１　ｍｇ／ｍｌ、ヒト血
清アルブミン（カルビオ社）を０．２％（ｗ／ｖ）とな
るようにＰＢＳ（−）により調製し、ポアサイズ０．２
２ミクロンのメンブランフィルタ−を用いて除菌濾過し
た。

抗体をバイアル当たり１ｍｌずつ無菌分注し、凍結乾燥
して凍結乾燥製剤を調製した。蒸留水で再溶解し、実施
例４と同様にしてＢ血清型緑膿菌（ＡＴＣＣ２７５７ｇ
）　ＬＰＳに対する抗体価を測定したところ、Ｎ３−８
の凍結乾燥製剤の再溶解液の抗体価は、対照の凍結乾燥
無処理液の抗体価と差はなく、抗体活性が保持されてい
た。

見旦例例果 本発明によるヒト−ヒト・ハイブリドーマを適当な生産
用培地を用いて培養し、培養物より精製したヒトモノク
ローナル抗体の単品、又は２種以上の組み合わせ、ある
いは他のヒト抗体と組み合わせることにより、緑膿菌感
染症に対し優れた予防、治療効果が達成される。

本発明のＢ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモノクロ
ーナル抗体を産生ずるヒト−ヒト・ハイブリドーマは、
動物細胞培養用のウシ胎児血清添加培地中で長期間安定
に継代、増殖が可能である。

さらには、培養物よりヒトモノクローナル抗体を精製す
る際に培地由来の未知の不純物の混入の恐れのない無血
清培地中でも抗体を大量に産生ずる能力を有しており、
緑膿菌感染症の予防、治療用製剤の組成物調製の為の原
料となるヒトモノクローナル抗体を得るのに最適である
。即ち、本発明の新規ヒト−ヒト・ハイブリドーマは高
い抗体分泌能を有し、大量に培養してヒトモノクローナ
ル抗体を製造する場合に、培養期間の短縮化と製造コス
トの低減をもたらすことが出来る。

また、本発明のヒト−ヒト・ハイブリドーマはヒトモノ
クローナル抗体の生産用の細胞株として使用できるだけ
でなく、他の宿主細胞あるいは微生物にグロブリン遺伝
子を導入、発現させる場合のヒト抗体遺伝子調製用の材
料細胞に使用することも出来る。

代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、少なくともＢ血清型緑膿菌に反応性を有するヒトモ
   ノクローナル抗体を産生するヒト−ヒト・ハイブリドー
   マとそれに由来する細胞株。 ２、ヒト染色体のみを有し、かつ無限増殖能を有する細
   胞株とヒト抗体産生細胞とのハイブリドーマである第１
   項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来する
   細胞株。 ３、ヒト染色体のみを有し、かつ無限増殖能を有する細
   胞株がハイブリドーマの選択特性を有する細胞株である
   第２項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来
   する細胞株。 ４、ハイブリドーマの選択特性を有する細胞株が微工研
   条寄第２１２９号あるいはそれに由来する細胞株である
   第３項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来
   する細胞株。 ５、ヒト抗体産生細胞がＥＢウィルス形質転換細胞であ
   る第２項記載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由
   来する細胞株。 ６、産生するヒトモノクローナル抗体が対応する血清型
   緑膿菌の感染に対して防御的である第１項から第５項記
   載のヒト−ヒト・ハイブリドーマとそれに由来する細胞
   株。 ７、微工研条寄第２２６８号のヒト−ヒト・ハイブリド
   ーマとそれに由来する細胞株。 ８、第１項から第７項記載のヒト−ヒト・ハイブリドー
   マの作製方法。 ９、第１項から第７項記載のヒト−ヒト・ハイブリドー
   マとそれに由来する細胞株の少なくとも１つを培養し、
   その培養物より精製することよりなるＢ血清型緑膿菌に
   反応性を有するヒトモノクローナル抗体の調製方法。 １０、第１項から第７項記載のヒト−ヒト・ハイブリド
   ーマとそれに由来する細胞株が産生するヒトモノクロー
   ナル抗体。 １１、第９項記載の調製方法により調製したヒトモノク
   ローナル抗体。 １２、第９項から第１１項記載のヒトモノクローナル抗
   体を少なくとも１種含有する緑膿菌感染症の予防、治療
   用の製剤。 １３、第１２項記載の製剤が液剤である緑膿菌感染症の
   予防、治療用の製剤。 １４、第１２項記載の製剤が凍結乾燥製剤である緑膿菌
   感染症の予防、治療用の製剤。 １５、第１２項から第１４項記載の予防、治療用の製剤
   を投与することを含んでなる緑膿菌感染症の予防、治療
   方法。