DD230882A1

DD230882A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR A MONOCYTE ANTIGEN

Info

Publication number: DD230882A1
Application number: DD25465183A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Ingrid Behn; Hartmut Kupper; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1985-12-11
Also published as: DD230882B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen monoklonaler Antikoerper fuer ein Monozyten-Antigen. Sie hat die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikoerpers vom Typ BL-M/G anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieses spezifischen Antikoerpers fuer ein Zelloberflaechenantigen humaner Monozyten, Granulozyten sowie Nullzellen gestattet. Die Aufgabe wird geloest durch die Herstellung des Hybridoms H-BL-M/G und dessen anschliessende Kultivierung in vivo oder in vitro.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies for a monocyte antigen. Its object is to provide a process for the preparation of a monoclonal antibody type BL-M / G, which allows in an easily manageable manner, the cost-effective production of larger amounts of this specific antibody for a cell surface antigen of human monocytes, granulocytes and null cells. The object is achieved by the production of the hybridoma H-BL-M / G and its subsequent cultivation in vivo or in vitro.

Description

Title of the invention;

Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für ein Monozyten-AntigenProcess for the preparation of monoclonal antibodies for a monocyte antigen

Anwendungsgebiet der Erfindung A field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die mit humanen Monozyten, Granulozyten sowie Nullzellen reagieren.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies which react with human monocytes, granulocytes and null cells.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen C characteristic of the known technical solutions

Monozyten und Makrophagen spielen eine bedeutende Rolle bei verschiedenen pathogenen Immunreaktionen. Die Analyse der Punktion dieser Zellen und deren diagnostische Verwertung sind an die Verfügbarkeit von Antikörpern gegen spezifische Monozyten/Makrophagen-Antigene gekoppelt. Es hat nicht an Versuchen gefehlt, Anti-Makrophagen-Seren durch Jeno- oder Alloimmunisierung und anschließende Gewebeabsorption zu erzeugen (ÜUAJSUE, E.R., Nature 218, (1968), 36; STUaMETT, J.D. et al., J. Immunol, riß, (1976), 273ί BREARD, j. _et al., Clin. Immunol. Immunopathol. rj5, ((198O), 438). Diese Antiseren sind jedoch nur in begrenztem Maße herstellbar, nicht reproduzierbar und somit nicht standardisierbar. Eine Lösung dieser Probleme könnten die von Hybridomen sezernierten monoklonalen Antikörper darstellen.Monocytes and macrophages play an important role in various pathogenic immune reactions. Analysis of the puncture of these cells and their diagnostic use are linked to the availability of antibodies to specific monocyte / macrophage antigens. There has been no lack of attempts to generate anti-macrophage sera by jeno or alloimmunization followed by tissue absorption (UUAJSE, ER, Nature 218, (1968), 36; STUaMETT, JD et al., J. Immunol., (); 1976), 273ί BREARD, j. _e t al., Clin. Immunol. Immunopathol. RJ5, ((198o), 438). However, these antisera can be produced, not reproducible and therefore can not be standardized to a limited extent. A solution to these problems could represent the monoclonal antibodies secreted by hybridomas.

Es ist bereits bekannt, monoklonal© Antikörper herzustellen. Sie haben KÖHLER und MILSTEIl (Nature, 256, (1975), 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen ^l It is already known to monoclonal produce antibodies. You have KOHLER and MILSTEIl (Nature, 256, (1975) 495) by fusing antibody-forming cells ^l

η «r.:. 4 CiP, L * 1η «r.:. 4 CiP, L * 1

mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß: verschiedene Hybridomlinien, die .Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. So sind auch monoklonale Ratten-anti-Mausmakrophagen-Antikörper beschrieben (SPRINGER., T.A. et al., Eur. J. Immunol. 9.» (1979), 301). Diese Antikörper kreuzreagieren auch mit Antigenen, die auf humanen Monozyten und Granulozyten vorhanden sind (AlJIiE., K.A. und r. A. SPRIHGER, j. Immunol. 12£, (1980), 359). Es sind auch monoklonale Antikörper, die mit humanen Monozyten reagieren, beschrieben worden (fOT^E^ G. et al., Scand. J. Immunol. J_6, (1982), 515). Da zur Zeit nur 2 monoklonale Antikörper für Monozyten bekannt und erhältlich sind, scheint es sinnvoll, den Stand der Technik durch einen weiteren, leicht zugänglichen und preisgünstigen monoklonalen Antikörper zu bereichern.produces a hybrid cell line with a permanently growing plasmocytoma line, which grows permanently and stably emits antibodies. This principle solution has led to: various hybridoma lines producing antibodies of different specificity have been produced. Thus, monoclonal rat anti-mouse macrophage antibodies have also been described (SPRINGER, T.A. et al., Eur. J. Immunol., 9, 1979, 301). These antibodies also cross-react with antigens present on human monocytes and granulocytes (Alijei, K.A., and R. A. Springer, J. Immunol., 12l, (1980), 359). Also, monoclonal antibodies that react with human monocytes have been described (FOT ^ E ^ G et al., Scand. J. Immunol., J_6, (1982), 515). Since currently only two monoclonal monocyte monoclonal antibodies are known and available, it seems expedient to enrich the state of the art with another, easily accessible and inexpensive monoclonal antibody.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers des Typs BL-M/£ anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers für ein Zelloberflächenantigen humaner Monozyten, Granulozyten sowie Hullzellen gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einfachen und exakten Nachweistesten für humane Monozyten, Granulozyten sowie Hullzellen eignen, wobei Kreuzreaktionen mit Zelloberflächenantigenen anderer Zellen nicht vorkommen sollen.The object of the invention is to provide a method for producing a monoclonal antibody of the BL-M / £ type, which allows, in an easily controllable manner, the cost-effective production of larger amounts of this specific antibody for a cell surface antigen of human monocytes, granulocytes and Hull cells. In this case, consistent quality should be ensured, the antibody should be stable and storable and suitable for use in simple and exact detection tests for human monocytes, granulocytes and Hull cells, cross-reactions with cell surface antigens of other cells should not occur.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Herstellungsverfahren für monoklonale Antikörper anzugeben, die spezifisch mit humanen Monozyten, Granulozyten sowieThe invention has for its object to provide a production process for monoclonal antibodies specifically with human monocytes, granulocytes and

Hullzellen reagieren, wobei in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt werden soll, das unkompliziert zu handhaben ist und dessen Kultivierung technisch und ökonomisch vorteilhaft möglich ist. Die Kultivierung des Hybridoma soll zu monoklonalen Antikörpern führen, die die oben angegebenen Eigenschaften haben and in der klinischen Diagnostik eingesetzt werden können.Hull cells react, in the course of which a hybridoma is first to be produced which is uncomplicated to handle and whose cultivation is technically and economically advantageous. The cultivation of the hybridoma should lead to monoclonal antibodies which have the abovementioned properties and can be used in clinical diagnostics.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach dem an sich bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation mononukleare Zellen aus dem,peripheren Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Inkubation dieser Zellen in Plastepetrischalen werden die adhärierenden Zellen isoliert. Nach Ablösung dieser Zellen, z.B. mit einem Gummischaber, w;erden diese erfindungsgemäß zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse eingesetzt. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P 3 - X - 63 Ag 8. 653 (KEARKEY et al., J. Immunol. 1.2J3, (1979) 1548) w/erden in EPMI-I64O mit 10 % fetalem Kälberserum (MS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält CLITTLEEIELD, Science 145, (1 9 6 4 ), 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zeilklon selektioniert, der Anti= körper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-/Ul-Kulturen aufgeteilt werden. Die überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit Zelloberflächenantigenen von Monozyten, Granulozyten und Nullzellen reagieren. Hierzu werden alle Kultur-The object is achieved by first isolating mononuclear cells from the peripheral blood of healthy donors by the density gradient centrifugation method known per se. Incubation of these cells in plastic petri dishes isolates the adherent cells. After detachment of these cells, for example with a rubber scraper, they are used according to the invention for immunizing mice. Preferably 6 to 8 weeks old female Α mice are used. The immunization is carried out by repeated application of the antigen. From the spleens of such hyperimmune mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B lymphocytes of this cell mixture are fused or hybridized with mouse B myeloma cells. The necessary mouse B myeloma cells P 3 - X - 63 Ag 8.653 (KEARKEY et al., J. Immunol., 1.2J3, (1979) 1548) in EPMI-I64O with 10 % fetal calf serum (MS) bred. In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine CLITTLEEIELD, Science 145 , (1 9 6 4), 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and, according to the invention, a cell clone is selected which secretes antibodies of the desired species , The selection of the hybridoma is done by dividing the cells immediately after the fusion into a plurality of separate 200 / U1 cultures. The supernatants of cultures containing the mature hybrid cells are screened for the presence of antibodies that react with cell surface antigens of monocytes, granulocytes and null cells. For this purpose, all cultural

überstände, die mit adhärierenden Zellen,'(Monozyten) reagieren, mit Granulozyten, die durch an sich bekannte Verfahren mittels Dichtegradientenzentrifugation aus peripherem Blut gesunder Spender gewonnen werden, getestet. Die Festung der Überstände erfolgt mittels indirekter Immunfluoreszenz, wobei im Phasenkontrastverfahren zu kontrollieren ist, daß es sich um Zellen der jeweiligen Art handelt. Hur solche Kulturen werden weiter verwendet, die mit der Mehrheit der Monozyten und Granulozyten reagieren. Die Kulturüberstände werden dann mit den adhärenten Monozyten und mit den Granulozyten inkubiert und der Anteil der markierten Zellen mittels FIiEC-markiertem Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Serum bestimmt. Mit der Methode der indirekten Immunfluoreszenz wird ausgeschlossen, daß u. HD. Hybridome ausgewählt werden, deren Antikörper mit B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und Erythrozyten reagieren.supernatants which react with adherent cells (monocytes) with granulocytes obtained by per se known methods by density gradient centrifugation from peripheral blood of healthy donors. The supernatant fortress is carried out by means of indirect immunofluorescence, it being necessary to check in the phase contrast method that these are cells of the respective species. Hur such cultures are used, which react with the majority of monocytes and granulocytes. The culture supernatants are then incubated with the adherent monocytes and with the granulocytes and the proportion of labeled cells determined by FIiEC-labeled goat anti-mouse immunoglobulin serum. With the method of indirect immunofluorescence is excluded that u. HD. Hybridomas are selected whose antibodies react with B lymphocytes, T lymphocytes and erythrocytes.

Das durch diese Selektion erhaltene Hybridom H-Bl-M/GB ward rekloniert und ein Subklon wird selektioniert, der Antikörper, die zur Bestimmung humaner Monozyten, Granulozyten und Nullzellen geeignet sind, produziert. Diese überraschende und vorteilhafte Eigenschaft eröffnet sehr günstige diagnostische Möglichkeiten.The hybridoma H-Bl-M / GB obtained by this selection was recloned and a subclone is selected which produces antibodies suitable for the determination of human monocytes, granulocytes and null cells. This surprising and advantageous property opens up very favorable diagnostic possibilities.

Die Herstellung des Antikörpers erfolgt erfindungsgemäß dergestalt, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen H-BL-M/G in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen werden. Nach entsprechender Kultivierung in COp-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50 % gesättigtem (NH.igSOj versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie o. dgl. möglich. Der derart erzeugte monoklonale Antikörper BL-M/G ist potentiell in der Lage, Komplement zu binden und die Zielzellen zytotozisch zu zerstören. · -The preparation of the antibody according to the invention takes place in such a way that antibody-producing hybridoma cells H-BL-M / G are raised in a culture medium with added serum in mass culture. After appropriate cultivation in a COp-containing atmosphere, the culture medium now containing the antibody is mixed with 50 % saturated (NH.sub.SO.sub.2) and a gamma globulin fraction is obtained Further purification of the antibody is possible by methods known per se, such as gel filtration, ion exchange chromatography or the like Monoclonal antibody BL-M / G is potentially able to bind complement and cytotically destroy the target cells.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI ο. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-I64O, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 10 mM HEPES, 5 · 1G~⁵ M M-er c apt ©ethanol, 100 mg/1 Gentamyoin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20 %. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10 % zn arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35⁰G: und 38⁰G:. Vorteilhaft ist es, bei 37⁰C zu arbeiten.It is expedient, as a culture medium MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI o. to apply. Particularly favorable is the use of RPMI-I64O, which is added in a preferred embodiment of the invention with 10 mM HEPES, 5 · 1G ~ ⁵ M M-er c apt © ethanol, 100 mg / 1 gentamyoin. As a serum supplement is fetal calf serum or normal horse serum with a proportion of the culture medium of 5 to 20 %. It is advantageous to work with a serum content of 10 % . The temperature of the culture medium is between 35 ⁰ G: and 38 ⁰ G :. It is advantageous to work at 37 ⁰ C.

Der CTO«-Ge halt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10 %, insbesondere 5 %* Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.The CTO "content of the atmosphere above the culture medium is favorably 2 to 10 %, in particular 5 %. * Advantageous is a high air humidity, which can reach saturation of the atmosphere.

Die Kultivierung des Hybridoma erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Danach ist ein teilweiser Mediumwechsel notwendig. Dabei ist erneut die optimale Zelldichte einzustellen.The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days. It is advisable to cultivate for 3 to 4 days. Thereafter, a partial medium change is necessary. Here, the optimal cell density is again set.

Der monoklonale Antikörper weist das in Tabelle 1 dokumentierte Reaktionsmuster mit humanen Blutzellen auf. Die Bindung wurde mittels indirekter Radiobindungstechnik (RBT) und indirekter Immunfluoreszenz (ilP). bestimmt.The monoclonal antibody has the human blood cell response pattern documented in Table 1. Binding was performed by indirect radio-binding technique (RBT) and indirect immunofluorescence (ilP). certainly.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-M/G" in histokompatible A. χ BAIBZc-P₁-Mäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl., vorbehandelt worden sind. Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-M/G enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z.B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z.B. durch Zentrifugieren. Der zellu-In a second embodiment of the invention, the hybridoma H-BL-M / G "is injected ip into histocompatible A. χ BAIBZc-P ₁ mice It is advantageous if the mice used are injected with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan o. After ascites formation, which becomes visible through swelling, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-M / G is removed, eg by puncture -

läre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BL-M/S. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-M/G enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-M/G spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-M/G; antigenspezi- ^ fisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10 mg BL-M/G pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 2Q mg/ml. 'The lion's share consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-M / S. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-M / G is either used directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography or the like which specifically enrich the isotype of the BL-M / G, or immunoadsorption methods comprising the antibody BL-M / G; isolate antigen-specific. The ascitic fluid contains 5 to 10 mg of BL-M / G per ml of liquid in the process according to the invention. Enrichment leads to a product with an antibody content of about 2Q mg / ml. '

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z.B. mit 50 % gesättigter (IiH, >₂S0. -Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen HH.HCOo-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4⁰C haltbar ist.To prepare a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is precipitated, eg with 50 % saturated (IIH,> ₂ % solution and taken up in buffered physiological saline solution dialysing against HH.HCOO solution to a lyophilizable product which is lyophilized at +4 ⁰ C preserved.

Table 1

Bindangsmuster des monoklonalen Antikörpers BL-M/G mit verschiedenen BlutzellenBinding pattern of the monoclonal antibody BL-M / G with different blood cells

Testzellen Markierte Zellen (#); Rl¹'Test cells labeled cells (#); Rl ¹ '

< 5<5 Monozytenmonocytes >9Q> 9Q Granulozytengranulocytes >80> 80 TKLymphozytenTKLymphozyten < 2<2 B-LymphozytenB lymphocytes < 2<2 O-ZellenO cells >70> 70 Erythrozytenerythrocytes 00

RI bedeutet die relative Fluoreszenzintensität der Me mb r ananf är b ungRI means the relative fluorescence intensity of the microbial anneal

Periphere mononukleäre ZellenPeripheral mononuclear cells

1. Ausführungsbeispiel z 1st embodiment z

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridzellen (H-BL-M/G) werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1 - 5 x Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.Hybrid nitrogen cells (H-BL-M / G) are thawed and washed twice with culture medium. The cell density is adjusted to 1-5 x cells per ml of culture medium and cultured in appropriate tissue culture flasks.

Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2 g/l), Mercaptoethanol (5 χ 10~^M), Gentamycin (100 mg/1) und N-2-Hyäroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (10 mM) ergänzt wird.The culture medium consists of RPMI-1640 diluted with sodium bicarbonate (2 g / l), mercaptoethanol (5 × 10 -4 M), gentamycin (100 mg / l) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (10 mM). is supplemented.

Dieses Medium wird mitThis medium comes with

a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or

b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20 %, Als geeignet hat sich 10 % Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible proportions are 5 to 20 %, as has proved suitable 10 % serum content.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen COj-Atmosphäre bebrütet werden.The best culture conditions are achieved when the cells strength at +37 ⁰ C in a water-saturated 5% COj atmosphere are incubated.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z. T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt-, und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3 to 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z. T. adhering to the vessel wall cells can again supplied with fresh medium, and be incubated. However, it is important to pay attention to the optimal cell density. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used for sowing in new culture vessels.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklcnalen Antikörper BI-M/G. Die Konzentration des Antikörpers BL-M/G ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren für Monozyten, Granulozyten und Nullzellen (wie z.B. indirekte Immunfluoreszenz, enzyaiimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).The cell-free culture supernatants contain the monoclonal antibody BI-M / G. The concentration of the antibody BL-M / G is sufficient for the usual diagnostic detection methods for monocytes, granulocytes and null cells (such as indirect immunofluorescence, enzyme immunological detection, radio linkage techniques).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeignetenOptionally, the titer with a suitable

Technik (ζ. B. indirekte Immunfluoreszenz) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration. . Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50 % gesättigtem Ainmoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.Technique (B. B. indirect immunofluorescence) can be determined. High titre culture supernatants allow dilution to the desired working concentration. , If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50 % saturated ammonium sulfate. The gamma globulin fraction thus obtained can be further purified by further known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.).

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCU oder Glycin/HCl-Puffer pH 2.8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.If highly purified monoclonal antibodies are required, they can be separated from the calf serum or horse serum-derived accompanying proteins by immunoadsorption on carrier-fixed anti-mouse immunoglobulin antibodies and isolated again from this immunoadsorbent by gently acting desorbents (3 M KSCU or glycine / HCl buffer pH 2.8) become.

2. Ausführungsbeispiel: 2nd embodiment:

Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-M/G, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Uach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 1Cr bis 5 * 10 lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden P--Hybride der Stämme A und BALB/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 ml Paraffinum subliquidum, i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.Cells of the hybridoma H-BL-M / G, which are optionally pre-cultured in vitro, are used. After washing in serum-free physiological saline, 1Cr to 5X10 live cells are injected intraperitoneally to histocompatible mice. The histocompatible mice used are P hybrids of strains A and BALB / c, which are incubated with a tumor stimulator, here with 0.5 ml Paraffinum subliquidum, i. p. 2 weeks prior to hybridoma injection.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BI-M/G enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascites fluids containing the monoclonal antibody BI-M / G are separated by centrifugation into cellular components and ascites fluid.

Der zelluläre Anteil besteht überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-EL-M/G. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompa-The cellular portion consists predominantly of cells of the hybridoma H-EL-M / G. These hybridoma cells are washed with physiological saline and used as described above by histocomposing

tiblen Mäusen i..p. injiziert werden. Salche Passagen sind wiederholt möglich.mimicking mice i..p. be injected. Salche passages are possible repeatedly.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50 %. gesättigtem (NH.)₂ ^SO präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5 %ige NH.HCGU-Lösung dislysiert. Inschließend erfolgt dieThe immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is 50 %. saturated (NH.) ₂ ^SO and taken up in buffered saline. This solution is disiluted against 0.5% NH.HCGU solution. In conclusion, the

4 j 4 years

Lyophilisierung. Der Antikörper BL-M/G ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.Lyophilization. The antibody BL-M / G is lyophilized at +4 ⁰ C without loss of binding properties.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und lustestung mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung frischer humaner Blutmonozy-fcen und einem geeigneten FITC-markierten AntiMaus immungl ob ul ins er um bestimmt. Als Titer wird diejenige gröEte Verdünnung angegeben, bei der noch deutlich alle Monozyten markiert werden.The antibody titer is determined by preparing a serial dilution and indirect immunofluorescence using fresh human blood monocytes and a suitable FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin. The titer is given as the largest dilution at which clearly all monocytes are marked.

Ausführuna;sbeispiel Ausführuna; SExample tt

Zellen des Hybridoms H-BL-M/G werden wie in Beispiel 1 kultiviert und vermehrt. Nach Erreichen einer hinreichenden Zellanzahl werden die Hybridomzellen geerntet und mehrmals mit serumfreiem Zellzuchtmedium gewaschen.Cells of the hybridoma H-BL-M / G are cultured and propagated as in Example 1. After reaching a sufficient number of cells, the hybridoma cells are harvested and washed several times with serum-free cell culture medium.

Anschließend werden die Hybridomzellen in einer Dichte von 2 - 5 · 10 Zellen pro 1 ml in einem serumfreien Zellzuchtmedium wie z.B. RPMI-I64O, das mit NaHCO₃ (2 g/l), Mercaptoethanol (5 •'Ίο"⁵ M), Gentamycin (100 mg/1) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird, kultiviert. Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, w:enn die Zellen bei 37⁰C in einer 5 %±gen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden. Die Inkubation dauert 12-24 Stunden.Subsequently, the hybridoma cells are incubated at a density of 2-5 x 10 6 cells per 1 ml in a serum-free cell culture medium such as RPMI-I64O supplemented with NaHCO ₃ (2 g / l), mercaptoethanol (5%, ⁵ M), gentamycin (100 mg / l) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (10 mM) are cultured.The most favorable culture conditions are achieved when the cells are incubated at 37 ^° C. in a 5 % strength CO ₂ atmosphere incubation takes 12-24 hours.

Der zellfreie Kulturüberstand enthält den monoklonalen. Antikörper des jeweiligen Hybridoms H-BL-M/G ohneThe cell-free culture supernatant contains the monoclonal. Antibody of the respective hybridoma H-BL-M / G without

Serumproteine, die sonst als Mediumzusatz verwendet werden. Der monoklonale Antikörper kann durch DEAE-Ionenaustauschchromatographie oder Protein-A-Adsorption o. dgl. weiter konzentriert werden, wenn das gewünscht wird.Serum proteins otherwise used as a medium supplement. The monoclonal antibody can be further concentrated by DEAE ion exchange chromatography or protein A adsorption or the like, if desired.

Mit den erfindungsgemäß hergestellten Antikörpern BL-M/& gelingt es besser und genauer als bisher, Monozyten, Granulozyten und Uullzellen zu bestimmen. Ein weiterer wesentlicher Vorteil der geschilderten Verfahrensweise ist die Möglichkeit, das Hybridom H-BL-M/G über längere Zeit aufzubewahren und auch fZ% nach Ruhezeiten wieder zur Antikörperproduktion einzusetzen. In diesem Sinne wird durch die zur Verfügung gestellte Lehre der Stand der Technik wesentlich bereichert.With the antibodies BL-M / & produced according to the invention it is possible to determine monocytes, granulocytes and Uull cells better and more accurately than before. Another significant advantage of the described procedure is the ability to store the hybridoma H-BL-M / G for a long time and also to use fZ% after rest periods again for antibody production. In this sense, the teaching provided by the prior art significantly enriched.

Claims

invention claims

, A process for producing monoclonal antibodies for a monocyte antigen, characterized in that mice are immunized with human monocytes, lymphocytes are separated from the spleens of mice treated in this way, hybridized with mouse E myeloma cells, hybridoma cells of the type H-BL-M / G selected, the selected hybridoma cells are cultured or injected into mice, the ascites fluid removed and the antibody BL-M / G is obtained.

^) 2. Method according to item 1, characterized

that the hybridoma H-BL-M / G is recloned and that a subclone is selected which produces suitable antibodies for the determination of monocytes, granulocytes and Hull cells.

3. Method according to item 1, characterized

that 6 to 8 weeks old female Α mice are used for immunization.

4 "method according to Eünkt 1, characterized in that are used as myeloma cells of the line P 3 - X 63 Ag 8.653.

5 · The method of item 1 to 4, characterized gekennzeich- jy net that immunization of the mice by a

Series of human monocyte injections.

6. The method according to item 1 to 5, characterized in that- the last immunization 4 days before the isolation of the determined for the hybridization B-lymphocytes is made.

7. The method according to item 1 to 6, characterized in that the ratio of myeloma cells and B-lymphoblasts, which are intended for fusion, about

_{: i} 1 ε 1.

8. The method according to item 1, to 7, characterized in that in the step of separating the unhybridized myeloma cells from the hybrid cells, the culture medium used contains spleen cells of non-immunized A χ BALB / c-F .. hybrid mice.

9. The method according to item 1, characterized in that the examination of the supernatants of the growing hybrid cells containing cultures on their reaction with human monocytes, granulocytes, null cells by indirect immunofluorescence means FITC-labeled goat anti-mouse immunoglobulin serum.

10. Method according to item 1, characterized in that the tests of the supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are carried out on nonreacting with B and E lymphocytes by means of indirect immunofluorescence.

11. The method according to item 1, characterized in that antibody-producing hybridoma H-BL-M / G are grown in a culture medium in mass culture, wherein the culture medium, a serum is added, after appropriate cultivation in CCU-containing atmosphere, the now antikö'rperhaltige culture medium saturated with 50 % (HELi ₂ SO, and a gamma globulin fraction is obtained from the

^ after further workup in a conventional manner, the monoclonal antibody is isolated.

12. The method according to item 1 and 11, characterized in that the culture medium MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI or the like. Is used.

Ί3. Process according to items 1 and 11 to 12, characterized in that RPMI-I64O is used as the culture medium.

H. Method according to item 1 and 11 to 13, characterized in that the culture medium TO mM HEPES, 5 · TO ~ ^ M mercaptoethanol, 100 mg / 1 gentamycin be added.

15 · Method according to item 1 and 11 to 14, characterized in that fetal calf serum or normal horse serum are used as serum.

16. The method according to item 15, characterized in that the proportion of fetal calf serum in the culture medium about 10 %, that of the horse normal serum also about 10 %. is.

1-7. Process according to items 1 and 11 to 16, characterized in that the cultivation temperature is 35 to 38 ^° C.

18. Method according to item 1 and 11 to 17, characterized in that kβ ' is cultured at 37 ⁰ C.

19. The method according to item 1 and 11 to 18, characterized in that the COo content of the atmosphere over the culture medium is 2 to 10 % .

20. The method according to item 1 and 11 to 19, characterized in that the COg content over the culture medium is 5 % .

21. The method according to item 1 and 11 to 20, characterized in that above the, culture medium high humidity prevails, the saturation of the

Atmosphere with water vapor can reach.

22, proceed according to item 1 and 11 to 21, characterized in that cultivating is carried out for 3 to 4 days.

23. The method according to item 1, characterized in that the hybridoma H-BL-M / G is injected ip into histocompatible A χ BALB / cP ₁ mice, after ascites the Äszitesflüssigkeit is removed, the cellular components are separated, the clear Supernatant containing the monoclonal antibody BL-M / G. contains, either directly used further or is subjected to purification and enrichment operations or by precipitating the immunoglobulin fraction of the cell-free Äszitesflüssigkeit eg with 50 %

saturated (KH, ipSCh solution, taking up the precipitate in buffered saline, dialyzed against diluted EH-HCO, solution and subsequent lyophilization into a permanent storage form.

24 ·. Process according to items 1 and 23, characterized in that the separated cellular constituents, which mainly consist of cells of the hybridoma H-BL-M / G, can be washed with physiological saline solution and injected again into histocompatible mice.

Method according to items 1 and 23, characterized in that the mice used are pretreated with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like.

26. The method according to item 1, 23 and 25, characterized in that a corresponding tumor stimulator is given 3 days to 6 weeks before the hybridoma injection.

27. The method according to item 1, characterized in that the lyophilized antibody BL-M / G is stored at +4 ⁰ C.