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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren in vivo, welche
die Metastasenbildung und/oder die tumorinduzierte Lymphangiogenese
verlangsamen und/oder hemmen, sowie ein Selektionssystem hierfür und dessen
Verwendung.
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Im erwachsenen Körper spielt der Prozeß der Angiogenese,
der Gefäßneubildung,
nur noch eine geringe physiologische Rolle. Für die Ausbreitung von Krebs
in einem Säugerkörper ist
die Angiogenese jedoch von entscheidender Bedeutung. Für eine Verbreitung
eines malignen Tumors im Organismus muß dieser zunächst die
Angiogenese induzieren.
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Im folgenden wird der Begriff der "Angiogenese" ausschließlich zur
Beschreibung der Blutgefäßneubildung
verwendet.
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Zu der Gefäßneubildung gehört auch
die Lymphangiogenese, die Bildung von Lymphgefäßen. Diese stand jedoch, betreffend
die Forschung, lange Zeit im Schatten der Angiogenese. Gemeinsam
der Gefäßneubildung,
Angiogenese und Lymphangiogenese, ist die Eigenschaft, daß sie durch
den Tumor selbst initiiert und/oder verstärkt werden.
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Aufgrund der vom Tumor induzierten
wachstumsfördernden
Faktoren bilden sich neue Gefäße, Blut- und
Lymphgefäße, in der
Peripherie der Tumore. Die Krebszellen können in die feinen Kapillaren
eindringen und so über
die Blut- oder Lymphbahnen in andere Organe gelangen. Der verstärkte Eintritt
der Tumore in die Gefäße beruht
auf deren erhöhter
Dichte durch die Angiogenese und/oder Lymphangiogenese gebildeten
Gefäße.
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Damit ist auch der gefürchteten
Streuung der Tumorzellen der Weg geebnet: über die feinen Gefäße können sie
den Primärtumor
verlassen und sich andernorts als Metastasen ansiedeln.
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Demgemäß ist der kritische Punkt in
einer Erfassung und Beschreibung der Tumorprogression die Bestimmung
des metastatischen Potentials. Interessant für die klinische Anwendung ist
die Tatsache, daß sich maligne
Zellen zumindest in der Anfangsphase über die Lymphgefäße verbreiten
können
(J.Sleeman et al., in Recent Results Cancer Research, 157, 55-81,
2000). Diese Verbreitung wird verstärkt wenn der Tumor die Lymphangiogenese
stimulieren kann.
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Die Angiogenese und die Lymphangiogenese
werden durch Wachstumsfaktoren induziert, zu denen zum Beispiel
auch die vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF, vascular endothelial growth
factor) gehören.
Zwei Subtypen der VEGF-Familie, VEGF-C und VEGF-D, binden einen
Rezeptor, der fast ausschließlich
auf Lymphendothelzellen vorkommt. Dieser Rezeptor, VEGFR-3, ist
ein Tyrosin-Kinase-Rezeptor welcher die Lymphangiogenese reguliert
und wird von den beiden Subtypen VEGF-C und VEGF-D aktiviert. Wenn
ein Tumor VEGF-C und/oder VEGF-D produzieren kann, ist die Verteilung
und somit Verbreitung von Tumorzellen durch die Lymphbahnen wesentlich
erhöht.
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Beide können unter Umständen allerdings
auch den die Angiogenese regulierenden Rezeptor VEGFR-2 aktivieren
(V. Kirkin et al., in Eur. J. Biochem., 268, 5530-5540, 2001). Diese
Fähigkeit
beruht auf einer zentralen, homologen Domäne der beiden Wachstumsfaktoren
VEGF-C und VEGF-D.
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Zwei Forschergruppen ist es gelungen,
die Ausbreitung von Krebs bei Mäusen
zu stoppen, indem sie im Tumorgewebe die Lymphangiogenese blockierten.
Beide konnten mit Antikörpern
gegen die beiden Wachstumsfaktoren VEGF-C und VEGF-D diesen Prozess
Lymphangiogenese blockieren und das Wachstum der Tumore hemmen.
Stacker et al. beschreibt in einer Publikation (Nat Med, 7, 186-189,
2001) die Hemmung sowohl des Wachstums als auch der Ausbreitung
der Tumore in immuninkompetenten Nacktmäusen (SCID-Mäuse) durch
Behandlung mit Antikörper
der das VEGF-D-Molekül
blockiert. Den Nacktmäusen
wurden Tumorzellen gespritzt, die eine erhöhte Menge des Wachstumsfaktor
VEGF-D freisetzten. Dadurch entwickelten sich Geschwülste aus
den VEGF-D-Zellen, die deutlich mehr Lymphgefäße als die Tumoren in einer
Vergleichsgruppe aufwiesen.
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Ein anderes Team, Skobe et al., zeigen
in einem in Nature Medicine, 7, 192-198, 2001, veröffentlichten Beitrag,
daß in
einem zu Stacker et al. analogen Verfahren die Lymphangiogenese
in Nacktmäusen
sich durch die Gabe eines Antikörpers
für VEGF-C
stoppen lässt.
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Des weiteren wurde auch von Yanyi
et al. (J Exp Clin Cancer Res, 20, 419-28,2001), Karpanen et al. (
Cancer Research, 61, 1786-1790, 2001) und von Mattila et al. (Int
J Cancer, 98, 946-51,2002) der Zusammenhang zwischen der Aktivierung
von VEGFR-3 durch VEGF-C und der Lymphangiogenese in immuninkompetenten
Nacktmäusen
nachgewiesen.
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Bisher wurden lediglich von Mandriota
et al. (EMBO Journal, 20, 672-682. 2001) ähnliche Experimente im Tiermodell
bei Mäusen
ohne Immundefizienz durchgeführt.
Dabei wurden doppelt transgene Mäuse
verwendet, eine Kreuzung aus transgenen Mäusen, die VEGF-C in ß-Zellen des endokrinen
Pankreas unter der Kontrolle des Ratten-Insulin-Promotors (Rip) exprimieren und transgenen
Rip1Tag2-Mäusen,
die von ß-Zelllen ausgehende
Pankreastumore entwickeln.
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Bisher wurden allerdings sehr wenige
Medikamente zugelassen, oder ist nur von wenigen bekannt, daß eine klinische
Prüfung
zur Zeit durchgeführt wird.
Von den darin enthaltenen Wirkstoffen wurden die meisten nur zufällig gefunden
und identifiziert. Ein Großteil
davon sind bekannte, im Körper
anzutreffende Proteine. Ein Nachteil ist allerdings, daß sie diese
Substanzen aufgrund ihres natürliche
Vorkommens auch eine Vielzahl anderer Funktionen im Organismus erfüllen.
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Um Wirkstoffe für eine effiziente Hemmung der
Metastasenbildung und/oder der tumorinduzierten Lymphangiogenesis
zu finden ist ein Verfahren zur Identifiziereung solcher Stoffe
in vivo notwendig. Ein Tiermodell könnte das Screening einer großen Anzahl
von möglichen
Verbindungen auf ihre Eignung erlauben und dabei gleichzeitig die
Erfassung eventueller Nebenwirkungen ermöglichen.
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Die aus dem Stand der Technik bekannten
Tiermodelle haben jedoch den Nachteil, daß aufgrund des fehlenden Immunsystems
in Nackt- und SCID-Mäusen keine
Wechselwirkung des Tumors mit dem Immunsystem des Wirtorganismus
stattfinden kann. Damit unterscheidet sich das Tumorwachstum und
die Metastasierung von jenem in einem immunkompetenten Wirtskörper. Ebenso
werden in einem Organismus mit einer Immundefizienz Nebenwirkungen,
die normalerweise durch eine Immunantwort des Organismus ausgelöst wären, nicht
erfaßt.
In diesem Zusammenhang ist der Begriff Nebenwirkung nicht nur in
medizinischem Sinne, als unerwünschte
Wirkung auf ein Pharmakon zu verstehen, sondern beinhaltet auch
alle anderen Wirkungen die von dem Ausgangszustand abweichen.
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Andere aus dem Stand der Technik
bekannten Tiermodelle bieten lediglich die Möglichkeit zu einem sehr aufwendigen
Screening-Verfahren, bei dem zum Beispiel doppelt trangene Tieren
aus Kreuzungen eingesetzt werden müssen.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es daher, ein einfaches, effizientes Verfahren zur Identifizierung
von Inhibitoren der Metastasenbildung und/oder der tumorinduzierten
Lymphangiogenese in vivo zur Verfügung zu stellen, das die aus
dem Stand der Technik bekannten Nachteile nicht mehr aufweist.
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Um eindeutige und sofort verwendbare
Ergebnisse zu erzielen, muß mit
einem solchen Verfahren einerseits möglichst wenige primäre Parameter
zeitgleich untersucht werden können
und andererseits darf es nur von einer minimalen Anzahl äußerer Faktoren
abhängig
sein.
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Die erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Inhibitoren
bezüglich
ihrer Wirkung auf die spezifische Aktivierung in vivo des die Lymphangiogenese
regulierenden Zellrezeptors VEGFR-3 selektioniert werden.
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Tumorinduziert oder tumorbedingt
bedeutet im Sinne der Erfindung, daß die Lymphangiogenese unmittelbar
mit der Metastasenbildung korreliert und/oder proportional ist,
beziehungsweise umgekehrt. Erfindungsgemäß sind Inhibitoren Wirkstoffe,
welche die Aktivierung des die Lymphangiogenese regulierenden Zellrezeptors
VEGFR-3 verhindern.
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Da VEGFR-3 sowohl von VEGF-C als
auch von VEGF-D aktiviert wird und die Zahl der äußeren Parameter bei dem erfindungsgemäßen Screening
möglichst
klein sein soll, wird eine VEGF-C Mutante gemäß Sequ. ID No. 1 eingesetzt.
Durch eine Mutation an Position 152, den Austausch von
Cystein gegen eine andere Aminosäure,
verliert VEGF-C die Fähigkeit
zur Aktivierung von VEGFR-2 und wird so zum spezifischen Wachstumsfaktor
für den
Rezeptor VEGFR-3 (V. Kirkin et al., in Eur. J. Biochem., 268, 5530-5540,
2001).
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Somit werden erfindungsgemäß vorzugsweise
die Stoffe bezüglich
ihrer Wirkung auf die Hemmung der spezifischen Aktivierung in vivo
des die Lymphangiogenese regulierenden Zellrezeptoren VEGFR-3 durch den gentechnisch
veränderten
Wachstumsfaktor ΔNΔCNEGF-C/Cys152Ser,
gemäß Sequ.
ID No. 1, untersucht werden.
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In dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann der gentechnisch veränderte
Wachstumsfaktor ΔNΔCNEGF-C/Cys152Ser
in nicht oder schwach zur Bildung von Metastasen neigenden Zellen
exprimiert werden. Dadurch können
von diesen Zellen keine "eigenen", endogenen, die
Lymphangiogenese induzierenden Wachstumsfaktoren exprimiert werden.
In einer bevorzugten Ausführung
der Erfindung kann der Wachstumsfaktor ΔNΔCNEGF-C/Cys152Ser in NM-081-,
1-AS-, G-, BDX-2-, CREF-, CREF-WT-, CREF-WT-T24-Zellen
exprimiert werden. Wie aus 1 deutlich
wird, eignen sich die oben genannten Zellinien für eine Expression die Angiogenese
und/oder Lymphangiogenese induzierender Wachstumsfaktoren, da sie
endogen weder VEGF-C noch VEGF-D exprimieren. In einer besonders
bevorzugten Ausführung
der Erfindung kann der Wachstumsfaktor ΔNΔCNEGF-C/Cys152Ser in NM-081-Zellen
exprimiert werden.
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Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist, daß die
in vivo Untersuchungen in einem immunkompententen, syngenetischen
Tiermodell durchgeführt
werden kann. Durch das intakte Immunsystem der Tiere findet eine
,normale' Wechselwirkung
des Tumors mit dem Immunsystem statt. Damit ist eine Tumorprogression
gewährleistet,
die der Entwicklung der natürlichen,
also nicht absichtlich induzierten Tumoren entspricht. Bevorzugt
werden als Tiermodell immunkompentente, syngenetische Ratten oder
Mäuse eingesetzt.
Besonders bevorzugt werden Wistar Furth Ratten (NM-081), BDX-Ratten
(AS-Zellen), Kopenhagen Ratten (G-Zellen) und/oder F344 Ratten (CREF-Zellen)
eingesetzt.
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Ferner ist die einfache und eindeutige
Entscheidung über
die Wirkung der gescreenten Inhibitoren ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens,
in dem als Kriterium die Metastasenbildung und/oder die tumorbedingte
Lymphangiogenese bestimmt werden kann. Das heißt, es wird lediglich das Kriterium,
mit anderen Worten der 'finale' Parameter, untersucht,
das letztlich für
die Auswahl neuer Wirkstoffe von entscheidender Bedeutung ist.
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In dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung kann die tumorinduzierte Lymphangiogenese im Tiermodell
mit Hilfe eines spezifisch die Lymphgefäße färbenden Farbstoffs bestimmt
werden. Dafür
kann bevorzugt im Tiermodell der Farbstoffs Evan's Blue eingesetzt werden. Alternativ
dazu können
die Lymphgefäße auch mit
Hilfe immunhistochemischer Verfahren nachgewiesen werden, mittels
spezifischer Macker für
lymphatische Endothelzellen wie zum Beispiel LYVE-1, VEGFR-3 oder
Prox-1.
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Ein weiterer Vorteil der Erfindung
ist, daß als
primärer
Parameter lediglich die spezifische Aktivierung von VEGFR-3 bestimmt
wird. So wird die Anzahl der Faktoren die das Ergebnis verfälschen könnten, wie
zum Beispiel die Aktivierung von VEGFR-2 und damit Induktion der
Angiogenese, minimiert.
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Ein zusätzlicher Vorteil der vorliegenden
Erfindung ist die Verwendung nicht oder schwach zur Bildung von
Metastasen neigenden Zellen, in denen der Wachstumsfaktor ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser
exprimiert werden kann. Bevorzugt sollte eine stabile Expression
erfolgen. So können äußere Faktoren,
die ein Ergebnis verfälschen
würden,
wie die Expression konkurrierender Wachstumsfaktoren, ausgeschaltet
werden.
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Von besonderem Vorteil ist auch der
Einsatz immnunkompetenter Tiere in der vorliegenden Erfindung. Einerseits
kann dadurch eine Ergebnisverfälschung
auf ein Minimum reduziert werden, da die Tumorprogression jener
von nicht absichtlich induzierten Tumoren entspricht, andererseits
können
alle Reaktionen des Organismus, wie zum Beispiel Nebenwirkungen
auf die beim Screening eingesetzten Wirkstoffe, sofort erfaßt werden.
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Eine Verfälschung der Ergebnisse wird
auch dadurch vermieden, daß als
Kriterium lediglich die für
die Auswahl von Wirkstoffen entscheidenden finalen Parameter, nämlich die
Metastasenbildung und/oder die tumorinduzierte Lymphangiogenese
bestimmt werden.
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Die in 2 dargestellten
Ergebnisse beweisen, daß die
oben genannte Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfahren erfüllt wird,
das die beschriebenen Vorteile aufweist.
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Wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren
sind weniger die einzelnen, oben genannten Komponenten des Systems
sondern der gesamte Aufbau, also die Kombination der Komponenten,
da nur so unverfälschte
Ergebnisse gewährleistet
werden. Demgemäß ist ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein System zum Screening
von Inhibitoren auf ihre Eigenschaft, die Metastase und tumorinduzierte
Lymphangiogenese zu hemmen oder zu verhindern, bestehend aus einem
immunkompetenten Tiermodell mit nicht oder schwach zur Bildung von
Metastasen neigenden Zellen, die stabil ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser, gemäß Sequ. ID
No. 1 exprimieren.
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Dieses System und das erfindungsgemäße Verfahren
sind zur Untersuchung von Antikörper,
Agonisten, kompetitiven und nichtkompetitiven Antagonisten geeignet.
Ebenso ist das Verfahren zur Untersuchung sämtlicher Stoffklassen auf ihre
Eigenschaft zur Blockierung der Lymphangiogenesis, Blockierung des
Eintritts von Tumoren in Lymphgefäße und dadurch Unterdrückung der
Metastase, geeignet.
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Die Vorteile basieren auf dem Screening
in einem geschlossenen System, nämlich
in einem immunkompetenten Tiermodell. Ausgehend von der Verabreichung
eines Inhibitors, der erfindungsgemäß die Aktivierung des Rezeptors
VEGFR-3 verhindert, wird die Tumorprogression und/oder Lymphangiogenese
bestimmt. Somit erfolgt eine Konzentration auf die Erfassung des
finalen Parameters, des Endergebnisses. Mit anderen Worten, ob Tumorprogression
und/oder Lymphangiogenese festzustellen ist- ja oder nein. Dagegen sind
weitere Parameter, die einen Einfluß auf verschiedene Zwischenstufen
haben können,
nicht von Bedeutung. Zum Beispiel ist erfindungsgemäß nicht
relevant wie der Inhibitor wirkt, ob als Antikörper, Agonisten oder Antagonisten
oder aufgrund welcher Zwischenstufen es zu einer Blockierung der
Tumorprogression und/oder Lymphangiogenese komt. Dadurch werden
mögliche
Störungen
oder Verfälschungen
des Ergebnisses ausgeschaltet.
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Ein Beispiel für die Bestimmung der Lymphangiogenese
ist in 3 dargestellt.
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Demgemäß wird das erfindungsgemäße Verfahrens
zur Identifizierung neuer Inhibitoren welche die Metastasenbildung
und/oder die tumorinduzierte Lymphangiogenese verlangsamen und/oder
hemmen verwendet.
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Ferner kann es auch verwendet werden,
um die Auswirkung von verschiedenen Inhibitoren gleichzeitig oder
von Inhibitoren in Kombination mit anderen Wirkstoffen auf die Hemmung
der Lymphangiogenese und/oder Metastasenbildung zu untersuchen.
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Die erfindungsgemäßen Inhibitoren haben vielfältige Anwendungsmöglichkeiten.
Denkbar ist es beispielsweise, diese Inhibitoren zukünftig im
Anschluß an
eine herkömmliche
Chemo- oder Strahlentherapie oder an einen chirurgische Eingriff
einzusetzen. Eine langfristige Nachbehandlung mit solchen Inhibitoren
kann Tumorrückfällen oder
Metastasen wirksam entgegenwirken. Auch eine Kombination von Inhibitoren
mit niedrig dosierten Krebsmedikamenten wäre denkbar.
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Eine Anwendung der erfindungsgemäßen Inhibitoren
in Therapien ist besonders bei Behandlungen zu empfehlen, bei denen
das Risiko eines klinischen, chirurgischen Eingriffs zu hoch ist
oder zu hohe Kosten entstehen. Des weiteren ist ein solcher Einsatz
auch bei Tumoren zu empfehlen, bei denen bezüglich des metastatischen Potentials
ein großer
Unsicherheitsfaktor besteht.
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Beispiele:
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1. Transfektion der NM-081-ZeIIen:
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Die Zellen wurden in Kultur gehalten
gemäß Sleeman
et al., Oncogene 18, 4485-4494, 1999.
Die Transfektion wurde durchgeführt
mittels Tfx50 von Promega mit einem Expressionsvektor enthaltend ☐N☐C/VEGF-C/Cys152Ser aus der
Ratte gemäß Sequ.
ID No 1 in einem pSecTag Plasmid (Invitriogen) oder mit pSecTag
allein. Die transfizierten Zellen wurden mit Hygromycin (300 μg/ml) selektioniert.
Die Expression von ?N?C/VEGF-C/Cys152Ser in den NM-081-Zelle wurde
im Western Blot mittels Zellysaten und einem VEDF-C spezifischen
Antikörper
2634 nachgewiesen (Kirkin et al.). Eine zusätzliche Überprüfung erfolgte durch die Amplifikation
von VEGF-C mittels RT-PCR.
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Für
weitere Experimente wurden jene zwei Klone mit der gemäß Wesstern-Blotting
größten ?N?C/VEGF-C/Cys152Ser-Expression
verwendet. Als Kontrolle dienten Klone die nur mit dem pSecTag Plasmid
transfiziert wurden.
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2. RNA-Präparation
und Northern Blot
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Das Zellgewebe wurde geerntet, in
PBS gewaschen und tiefgefroren. Aus tiefgefrorenem Material, Zellen
und Tumor, wurde polyadenylierte RNA präpariert (Hofmann et al., J.
Cell. Sci. 111, 1673-1684, 1998), Die Northern Blots wurden unter
Verwendung von 1 %-igem Agarose-Formaldehydgel
und 50 μg
polyadenylierte RNA durchgeführt,
wie in Hofmann et al. beschrieben. Die Blots wurden unter hoher
Stringenz untersucht, mittels VEGF-C (GenBank accessiom no. AF010302),
VEGF-D (GenBank
accessiom no. AY032728) und GAPDH (Pstl-Fragment des Plasmids pGAPDH).
Zwischen den einzelnen Untersuchungen wurden die Blots in 0.1 %-igem
SDS bei 100°C
abgezogen und einem Film exponiert um die komplette Entfernung der Probe
zu sichern. Als Positiv-Kontrolle wurden identische Proben mit RNA
aus BRL3A Zellen und Säugergewebe
bei jedem Blot hinzugefügt,
um eine Äqulibrierung
der Signalintensität
aller Blots zu erreichen.
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3. in vivo Experimente:
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Die Zellproben (5x105 Zellen
in PBS) wurden Wistar Furth Ratten subkutan injiziert. Die Tiere
wurden regelmäßig untersucht
bis das Tumorwachstum die gesetzlich festgelegte Obergrenze erreichte.
Entweder sie verstarben vorher oder sie wurden getötet. Anschließend wurde
eine Autopsie durchgeführt
und so die Anzahl und die Größe der Tumore
und der Metastasen in den Lymphknoten und anderen Organen bestimmt.
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4. Visualisierung der
Lymphgefäße in vivo
mit Evan 's Blue
Farbstoff:
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Tumorzellen (1x106)
wurden Ratten in die Haut zwischen dem inguinalen und dem axillaren
Lymphknoten injiziert. Nachdem die Tumore eine Größe von 0.5-2.0
cm erreichten, wurden die Tiere getötet und die Tumore unter der
Haut freigelegt. Der Farbstoff (2.5 mg/ml Evan's Blue in PBS) wurden zur inguinalen
Seite des Tumors hin an mehreren Stellen in die Haut injiziert (ca.
20-50 μl
in einem Abstand von 1.5 cm vom Tumor entfernt). Die Injektion von
Farbstoff wurde so lange fortgeführt
bis alle Lymphgefäße zwischen
der Leisten- und der Achselgegend markiert waren, auch jene die
nicht in den Tumor eindringen. Anschließend wurden jene Lymphgefäße gezählt, die
in den Tumor eindringen
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Legende:
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1:
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Northern Blot Analyse der Expression
von VEGF-C und VEGF-D verschiedener Rattentumor-Zellinien aus Gewebekultur.
Als Kontrolle wird die Expression von GAPDH dargestellt ebenso die
RNA Molekülmarker. Von
allen Zellinien wird das metastatische Potential angegeben. Die
Klassifizierung der Matastase erfolgt in Abhängigkeit der Tendenz zur spontanen
Metastasierung wie folgt:
- : keine Metastasen
+ : weniger
als 25% der Tiere zeigen Metastasen
++ : 25-75% der Tiere zeigen
Metastasen
+++ : mehr als 75% der Tiere zeigen Metastasen
N
: keine Daten
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2:
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Bestimmung des metastatischen Potential
von Tumoren stammend von NM-081-Zellen stabil transfiziert mit pSecTag
(clone #1, clone #2) im Vergleich zu stabil transfizierten von NM-081-Zellen
mit ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser unter
der Kontrolle von pSecTag (VEGF-S Cys #1, VEGF-C Cys #2). Die Daten stellen
Mittelwerte aus jeweils 8 Versuchstieren dar (n = 8) und wurden
gemäß Beispiel 3 gesammelt.
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3:
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- A: Bestimmung der Lymphangiogenese durch Färbung der
Lymphgefäße mit dem
Farbstoff Evan's
Blue bei Wistar Furth Ratten, denen NM-081- Zellen mit ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser unter der
Kontrolle von pSecTag (VEGF-S Cys #1, VEGF-C Cys #2) injiziert wurden.
- B: Bestimmung der Lymphangiogenese durch Färbung der Lymphgefäße mit dem
Farbstoff Evan's
Blue bei Wistar Furth Ratten, denen NM-081-Zellen stabil transfiziert mit pSecTag
(clone #1, clone #2) injiziert wurden.
- C: Vergleich der Anzahl der Lymphgefäße induziert durch die oben
genannte Klone von NM-081-Zellen.
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SEQUENZPROTOKOLL
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