DE69930763T2

DE69930763T2 - Tgf-g beta inhibitor-peptide

Info

Publication number: DE69930763T2
Application number: DE69930763T
Authority: DE
Inventors: Ignacio Jose Ezquerro Saenz; Juan Jose Lasarte Sagastibelza; Jesus Prieto Valtuena; Francisco Mendillorri BORRAS CUESTA
Original assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Current assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Priority date: 1998-11-24
Filing date: 1999-11-23
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2019-11-24
Also published as: US20070014767A1; JP4272255B2; JP2002530431A; JP2006241166A; DE69930763D1; JP4068654B2; BR9915604A; US7528226B2; RU2232771C2; PT1132403E; BR9915604B1; AU767498B2; CA2352537A1; WO2000031135A1; US7057013B1; JP2007186519A; JP2008056685A; DK1132403T3; SI1132403T1; ATE322505T1

Description

Beschreibung des Standes der Technik
Das Zellwachstum wird von verschiedenen Proteinen aus der Gruppe der Wachstumsfaktoren reguliert (Schalch DS et al. (1979) Endocrinology 104: 1143-1151). Zu den wichtigsten Wachstumsfaktoren, die an der Zellentwicklung beteiligt sind und über autokrine und parakrine Mechanismen wirken können, gehören die Transformierenden Wachstumsfaktoren (TGFs) (Braun L. et al. (1988) Cell Biol. 85: 1539-1543; Lyons RM und Moses HL (1990) Eur. J. Biochem. 187: 467-473).
Der Ausdruck TGF wurde zuerst verwendet, um die Aktivität zu beschrieben, die von einer Zelllinie produziert wird, die mit dem Mäuse-Sarkom-Virus transformiert ist (deLarco JE und Todaro GJ (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4001-4005; Mizel SB et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2205-2208). Der Überstand dieser Zellen konnte normales Wachstum von Zellen, die zum Wachstum einen festen Träger erfordern, in Weichagar induzieren. In spezielleren Studien wurden zwei Klassen von TGF nachgewiesen, die TGFα und TGFβ genannt wurden und die wiederum Familien von verwandten Proteinen umfassen. Die TGFβ-Familie besteht aus 5 Isoformen (Brand T. und Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27: 5-18) mit dimerer Struktur (Schlunneger MP und Grutter MG (1992) Nature 358: 430-434; Brand T. und Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27: 5-18). Untersuchungen der reifen Proteine, die aus einer einzigen Spezies gereinigt wurden, zeigten einen hohen Grad der Identität zwischen ihren Sequenzen (Tabelle 1).
Tabelle 1. Homologie unter verschiedenen Typen von TGFβ

Vom Menschen stammende TGFβ1, TGFβ2 und TGFβ3, vom Huhn stammender TGFβ4 und vom Frosch stammender TGFβ5 (Roberts AB und Sporn MB, 1990).

TGFβ1 wird als Vorstufe aus 390 Aminosäuren synthetisiert, die Pre-Pro-TGFβ1 genannt wird. In einer ersten Hydrolyse wird ein hydrophobes Fragment aus 29 Aminosäuren freigesetzt, das zu Pro-TGFβ1 führt. Dann wird der reife TGFβ1 durch einen weiteren Schnitt in einem Bereich, der der terminalen Aminogruppe von TGF vorausgeht und der aus zwei Argininresten besteht, freigesetzt, was zu einem Protein aus 112 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 12 kDa führt. Um die biologisch aktive Form zu produzieren, treten zwei dieser Monomere über Disulfidbrücken zusammen, was ein Dimer von 25 kDa ergibt. Änderungen dieser Struktur verursachen einen Verlust der biologischen Funktion (Barnard JA et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032:79-87).
Verschiedene Domänen sind bekannt, die innerhalb der Struktur von TGFβ1 existieren. Es zeigt sich, dass eine dieser Domänen zwischen den Aminosäuren 40 und 82 lokalisiert ist und an der Bindung von TGFβ1 an seine Zellrezeptoren beteiligt ist (Quian SW et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6290-6294; Burmester JK et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:8628-8632).
Rezeptoren von TGFβ1 und anderen Bindungsproteinen
Fünf Typen von spezifischen Rezeptoren für TGFβ1 wurden charakterisiert (Cheifetz S et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 17225-17228 und López Casillas F. et al. (1991) Cell 67: 785-795). Diese Rezeptoren haben unterschiedliche Affinitäten zu verschiedenen Typen von TGFβ1. Rezeptoren vom Typ I, II und III werden bisher am besten verstanden (Überblick bei Attisano L et al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1222: 71-80; Derynck R. (1994) Trends Biochem. Sci. 19: 548-553; Yingling et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1242: 115-136). Rezeptoren des Typs IV (MacKay K. und Danielpour D. (1991) J. Biol. Chem. 266: 9907-9911) und des Typs V (Ichijo H. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 22459-22464) wurden ebenfalls beschrieben. Es wurde auch berichtet, dass die Transmembran- und die Cytoplasmadomäne von Endoglin (Cheifetz S et al. (1993) J. Biol. Chem. 267: 19027-19030; Bellón T. et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2340-2345; Yamashita et al. (1995) J. Biol. Chem. 269: 1995-2001; Zhang H. et al. (1996) J. Immunol. 156: 564-573) ungefähr 70% Homologie mit den Rezeptoren vom Typ III, sowohl des Menschen als auch der Ratte, aufweisen.
RIII wäre derjenige mit der Aufgabe, TGFβ1 zu binden und ihn RII, der wiederum einen Komplex mit RI bilden würde (Yamashita et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20172-20178), oder Komplexen, bei denen verschiedene Moleküle von RI mit RII kombiniert sind (Weiss G. and Massagué J. (1996) EMBO J 15:276-289), zu präsentieren. Die RII-RI-Wechselwirkung würde zu einer Phosphorylierung von RI und einer anschließenden Aktivierung seiner Serin/Threonin-Kinase führen, die mit sekundären Botenstoffen, wie den MADR2-Proteinen, phosphorylieren würde (Macías-Silva M et al., (1996) Cell 87:1215-1224).
WO 96/25178 offenbart aktive Fragmente von TGFβ aus 45 Aminosäuren. FR 2720069 offenbart die modifizierte Aminosäuresequenz eines TGFβ fast vollständig, ohne das N-terminale Ende des natürlichen Polypeptids und mit Änderungen, Mutationen oder Deletionen, im C-terminalen Ende, insbesondere in einem Phe, das durch Ile, Ala oder Ser substituiert oder sogar deletiert sein kann. WO 92/29793 offenbart Aminosäuresequenzen des TGFβ-Rezeptors, die entweder länger als 500 Aminosäuren sind, oder wenn sie kürzer als 15 Aminosäuren sind, sind sie nicht mit TGFβ oder seinen Rezeptoren verwandt.
Rolle von TGFβ1 bei der hepatischen Differenzierung und Regeneration
Die hervorgerufenen Wirkungen sind je nach dem Zeitpunkt der Entwicklung und der Art der Zelle unterschiedlich.

• Vergrößerung der extrazellulären Matrix bei Einwirkung auf die Lebersternzellen (Ito-Zellen), die Hauptquelle für Matrixproteine (Mustoe TA et al. (1987) Science 237: 1333-1336).
• Differenzierung der Epithelzellen und Hepatocyten (Florini JR et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 16509-16513).
• Hemmung des Zellwachstums während des Vorgangs der Leberregeneration. Diese Wirkung ist von großer Wichtigkeit bei der Aufrechterhaltung der Zellruhe in vivo (Kato Y et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 9552-9556).
• Hemmung der Endocytose des Rezeptors des Epithel-Wachstumsfaktors (EGF), wie in Kulturen von fetalen Ratten-Hepatocyten beobachtet wurde (Noda M. und Rodan GA (1987) J. Cell Physiol. 133: 426-437).

Rolle von TGFβ1 bei der Leberfibrose
Es hat sich gezeigt, dass TGFβ1 mit den Vorgängen der Leberfibrose im Zusammenhang steht (Czaja MJ et al. (1989) J. Cell Biol. 108; 2477-2482; Annoni G. et al. (1992) J. Hepatol. 14: 259-264) und eine Erhöhung der Produktion von Proteinen der extrazellulären Matrix durch die Lebersternzellen (Lipocyten oder Ito-Zellen) und von deren Rezeptoren verursacht sowie die Synthese der proteolytischen Enzyme, die die Matrix abbauen, hemmt (Ignotz RA und Massagué J. (1986) J. Biol. Chem. 261: 4337-4345). In der Leber induziert TGFβ1 die Synthese von Collagen und Fibronektin in den Lebersternzellen (Weiner FR (1990) Hepatology 11: 111-117). Es gibt auch eine Autoregulation durch Erhöhung seiner eigenen Synthese über eine Induktion seiner mRNA.
Es hat sich auch gezeigt, dass TGFβ1 an der erhöhten Synthese von α2-Makroglobulin beteiligt ist, das von den Hepatocyten und den aktivierten Lebersternzellen synthetisiert wird. Durch Bindung von TGFβ1 und Bewirken seiner Inaktivierung (Bachem MG (1994) Ann. NY Acad. Sci. 737: 421-424) soll α2-Makroglobulin TGFβ1 aus den extrazellulären Kompartimenten eliminieren.
Eine Untersuchung von Patienten mit chronischem Leberschaden hat gezeigt, dass es eine Korrelation zwischen der Expression von TGFβ1 und der Expression der mRNA für das Typ-I-Procollagen und den Serumkonzentrationen des Typ-III-Peptids von Procollagen gibt (Castilla A. et al. (1991) N. Engl. J. Med. 324: 933-940).
Patienten mit Leberzirrhose haben aufgrund der Komplikationen, die im Verlauf der Krankheit auftreten, wie portale Hypertension oder Leberversagen, eine kürzere Lebenserwartung als normal.
Wirkung von TGFβ1 auf die extrazelluläre Matrix
Die Wechselwirkung von TGFβ1 mit den Zellrezeptoren bewirkt:

• Aktivierung der Synthese von Procollagen, Fibronektin (Ignotz RA et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 6443-6446) und verwandter Proteine einschließlich Membranproteinen, die mit den Komponenten der extrazellulären Matrix wechselwirken können (Carter WG (1982) J. Biol. Chem. 257: 13805-13815).
• Hemmung der Synthese von proteolytischen Enzymen, die die Matrix abbauen können (Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190: 276-282).
• Stimulation der Synthese von Inhibitoren von proteolytischen Enzymen (Fukamizu H. und Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190: 276-282).

Diese Wirkungen führen zu einer Erhöhung der Wechselwirkungen der Zelle mit der extrazellulären Matrix, die zusammen mit einer größeren Umorganisation der Proteine, aus denen sie zusammengesetzt ist, zu einer Erhöhung der Gesamtmenge der extrazellulären Matrix führt (Roberts CJ et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 4586-4592). Diese Ergebnisse bestätigen, dass TGFβ1 an Vernarbungsvorgängen beteiligt ist (Fukamizu H. und Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190: 276-282; Barnard JA et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032: 79-87).
Peptide als Inhibitoren der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung
Es gibt die Möglichkeit der Verwendung von kleinen Molekülen, synthetischen Peptiden, als Analoga von Molekülen, die im Körper vorhanden sind, mit dem Ziel, ihre Funktion nachzuahmen. Von LeSateur et al. durchgeführte Studien beweisen die Möglichkeit der Verwendung von cyclisierten Analoga des Nervenwachstumsfaktors (NGF), die den β-Turn-Bereich nachbilden, der seine Bindung an den Rezeptor ermöglicht (LeSateur L. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1120-1122). Es ist auch möglich, Peptide als Antagonisten dieser Moleküle zu verwenden, die durch Blockieren des Rezeptors verhindern, dass der native Faktor mit seinem Rezeptor wechselwirkt (Lasarte JJ et al. (1994) J. Acquired Immune Deficiency Syndromes 7: 129-134; LeSateur et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 6564-6569). Frühere Studien hatten die Eignung von synthetischen Peptiden als Inhibitoren einer Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung bewiesen, auch wenn das Erkennungsepitop nicht kontinuierlich ist (Daniels AJ et al. (1995) Mol. Pharmacol. 48: 425-432). Andere Studien, die mit dem Typ-II-Rezeptor von TGFβ1 und mit Fetuin, einem Glycoprotein aus der Gruppe der Typ-II-Rezeptoren, durchgeführt wurden, haben die Möglichkeit gezeigt, cyclisierte Peptide als Inhibitoren der Wechselwirkung von TGFβ1 mit RII zu verwenden (Demetriou M. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 12755-12761). Mit dieser Cyclisierung wird es möglich, Peptide mit einer ähnlichen Struktur zu erhalten wie der, die in vivo erhalten werden könnte.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Aus den oben genannten Gründen gehen wir davon aus, dass von TGFβ1-Rezeptor Typ III oder von Endoglin abgeleitete Peptide Inhibitoren der Wirkung von TGFβ1 sein könnten. Wir beschlossen daher, diese Möglichkeit zu erforschen.
Auswahl der zu synthetisierenden Peptide
Die Peptide für die Synthese wurden abhängig davon, ob sie von TGFβ1-Rezeptor Typ III oder von Endoglin abgeleitet waren, auf unterschiedliche Weise ausgewählt.
Die Peptide wurden auf der Grundlage von Software ausgewählt, die in unserem Labor entworfen wurde. Eines der Computerprogramme vergleicht zwei Aminosäuresequenzen miteinander mit dem Ziel, partiell komplementäre Bereiche vorherzusagen. Es wurden auch andere Programme verwendet, die auf der Grundlage der Hydrophobie und Hydrophilie der Aminosäuren, die die Sequenz bilden, die Bereiche der Proteine vorhersagen können, die am meisten exponiert sein würden.
Synthese von Peptiden
Die Peptide wurden nach dem Festphasenverfahren synthetisiert (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-54), wobei Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) als vorübergehende Schutzgruppe der α-Aminogruppe verwendet wurde (Atherton et al. (1989) Journal of Chemical Society Perkins Transactions 1: 538-546). Für die Synthese kleiner Mengen einer großen Zahl von Peptiden wurde ein multipler Synthesizer verwendet, der die simultane Synthese von 96 Peptiden erlaubt (Borrás-Cuesta et al. (1991) Biologicals 19: 187-190). Die Peptide wurden bis zur Verwendung bei –80 °C im festen Zustand aufbewahrt.
Reinigung der Peptide durch HPLC
Die synthetisierten Peptide wurden durch HPLC (high performance liquid chromatography) analysiert und gereinigt, wobei man ein Waters-600E-900-System (Millipore Corp., Bedford, USA) verwendete.
Eine Säule des Typs Waters Radial-Pak^TM C₁₈ 300 Å 15 μm, 8 × 100 mm (Millipore Corp., Bedford, USA) wurde für die Analyse der Peptide durch analytische HPLC verwendet. Das Peptid wurde in einer 0,1%igen Lösung von TFA in destilliertem Wasser bis zu einer maximalen Konzentration von 1 mg/ml gelöst. Die Lösung des Peptids wurde in die Säule injiziert (100 μl) und in einem Wasser/Acetonitril-Gradienten (15) (Romil Ltd., Cambridge, USA), beide mit 0,1% TFA, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Die Fraktionen, die das Peptid enthielten, wurden anhand ihrer Extinktion bei 220 nm und 280 nm nachgewiesen (Photodioden-Array-Detektor, Waters 991, Millipore Corp., Bedford, USA).
Eine Säule des Typs Waters Delta-Pak^TM C₁₈ 300 Å 15 μm, 25 × 100 mm (Millipore Corp., Bedford, USA) wurde für die Reinigung verwendet. Das Peptid wurde aufgelöst und unter denselben Bedingungen wie im vorigen Fall injiziert (2 ml), wobei derselbe Gradient mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min verwendet wurde. Die Fraktion, die das reine Peptid enthielt, wurde in einem Kolben aufgefangen.
In-vitro-Tests. Untersuchung der Aktivität der Peptide
Zelllinien
Es wurde eine Linie verwendet, die von Nerz-Lungenepithel abgeleitet war, MV-1-Lu (CCL-64, American Type Culture Collection, Virginia, USA). Die Zellen wurden in 162-cm²-Kulturkolben (Costar Corporation, Cambridge, USA) in einem Ofen bei 37 °C unter 5% CO₂ wachsen gelassen, bis Subkonfluenz erreicht war. Ein vollständiges Medium wurde verwendet: RPMI 1640 mit L-Glutamin (GibcoBRL, Life Technologies Ltd., Paisley, Schottland), ergänzt mit 5% fetalem Kälberserum (FCS, Biological Industries, Kibbuz Belt Haemek, Israel), 10 mM HEPES (1 M HEPES-Puffer, Bio-Whittaker, Verviers, Belgien) und Antibiotika (100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin).
Test auf Hemmung des Wachstums der MV-1-Lu-Zelllinie
Die MV-1-Lu-Zellen, die gemäß der obigen Beschreibung gezüchtet wurden, wurden unter Verwendung von 5 ml Trypsin-EDTA (Biological Industries, Kibbuz Beit Haemek, Israel) aus dem Boden der Kulturkolben entnommen, in vollständigem Medium resuspendiert und 8 Minuten lang mit 1500 U/min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in vollständigem Medium bis zu einer Konzentration von 50 000 Zellen/ml resuspendiert. Um den Test durchzuführen, wurden 10 ml der Zellsuspension entnommen und in 96-Napf-Flachboden-Kulturplatten (Costar Corporation, Cambridge, USA) gegeben, wobei man 100 μl/Napf zugab, und über Nacht bei 37 °C unter 5% CO₂ inkubiert, was eine Adhäsion der Zellen am Boden der Näpfe ermöglicht. Am Ende dieser Zeit wurden die zu testenden Peptide in RPMI bis zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml in Gegenwart einer Konzentration von 200 pg/ml TGFβ1 in RPMI (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK) hinzugefügt. Die Endkonzentration von FCS im Napf betrug 2,5%. Nach 24 Stunden Inkubation wurde 1 μCi Tritium-Thymidin pro Napf hinzugefügt (25 Ci/mmol [Methyl-³H]-Thymidin, Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK) und weitere 12 Stunden inkubiert (Grubeck-Loebenstein B. et al. (1989) J. Clin. Invest. 83: 764-770; Brennan FM et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81: 278-285).
Am Ende der Inkubationszeiten wurden die Zellen mit Trypsin-EDTA aus dem Boden der Näpfe entnommen und unter Verwendung eines Handerntegeräts (Titertek-Zellernter, Skatron Instruments Inc., Sterling, USA) gewonnen, das die Zellen aufreißt und die DNA in Nitrocellulosefiltern (Filter MAT 11731, Skatron Instruments Inc., Sterling, USA) auffängt, wo sie fixiert wird. Die Filter wurden einzeln in 5-ml-Polypropylenröhrchen gegeben, und 4 ml Szintillationsflüssigkeit (Biogreen-11, Reactivos Scharlau S.A., Barcelona, Spanien) wurden hinzugefügt.
Die Aktivität jedes Röhrchens wurde 90 Sekunden lang in einem β-LKB-Szintillationszähler (Beta plate system, LKB, Uppsala, Schweden) quantifiziert.
Untersuchung der Hemmung der Bindung von TGFβ1 an die Zellrezeptoren
Selektive Markierung der Zellrezeptoren (Affinitätsmarkierung)
Die MV-1-Lu-Zellen wurden aus den Kulturkolben entnommen und 10 Minuten lang bei 37 °C mit 10 ml Lösung 1 (128 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonat bei pH 7,5, 5 mM Glucose und 1 mM EDTA) inkubiert. Die so entnommenen Zellen wurden in Lösung 2 (128 mM NaCl, 5 mM KCl, 50 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonat bei pH 7,5, 1,2 mM CaCl₂, 1,2 mM MgSO₄ und 5 mg/ml BSA) resuspendiert und durch 5 Minuten Zentrifugation mit 1000 × g gewonnen. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen mit einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in Lösung 2 resuspendiert.
Aus dieser Zellsuspension wurden 0,5-ml-Aliquote in 24-Napf-Platten (Greiner GmbH, Frickenhausen, Deutschland) angesetzt, die Peptide wurden in 50 μl einer 0,8 mg/ml Lösung hinzugefügt, dann wurde 2 Stunden lang bei 4 °C unter Rühren inkubiert. Danach wurde ¹²⁵I-TGFβ1 (2 μCi) bis zu einer Endkonzentration von 277,2 pM hinzugefügt (¹²⁵I-TGFβ1 human rekombinant 800-2200 Ci/mmol, Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK), und unter Rühren wurde weitere zwei Stunden bei 4 °C inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen übergeführt und 1 Minute lang kalt mit 12 000 × g zentrifugiert. Dann wurden sie zweimal in kalter Lösung 2 gewaschen und in 0,5 ml kalter Lösung 2, 5 μl Dimethylsulfoxid (DMSO 99,5%, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) und Disuccidmidylsuberat (DSS, Pierce Chemical Co., Rockford, USA) resuspendiert, was eine Endkonzentration von 0,25 mM DSS ergab. Die Reaktion wurde nach 15 Minuten durch Verdünnung, Zentrifugation und Waschen mit einer Lösung, die 0,25 M Saccharose, 10 mM Tris und 1 mM EDTA bei pH 7,4 enthielt, abgebrochen. Das Zellse diment wurde in 0,5 ml Triton X-100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) 1% (v/v), 10 mM Tris bei pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 μg/ml Pepstatin und 1 μg/ml Leupeptin (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) resuspendiert und 40 Minuten lang bei 4 °C inkubiert. Die in Detergens unlösliche Fraktion wird durch 15 Minuten Zentrifugation mit 12 000 × g abgetrennt. Die in Detergens löslichen (Überstand) und unlöslichen (Sediment) Fraktionen wurden bei –20 °C eingefroren (Massagué J. und Like B. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2636-2645).
Elektrophorese von Proteinen in Natriumpolyacrylamiddodecylsulfat-Gel
Die in Detergens löslichen und unlöslichen Fraktionen wurden für eine Analyse durch Elektrophorese in Acrylamid/Bisacrylamid-Gelen von 7,5% während 5-6 Stunden bei 220 Volt verwendet.
Die Proteine wurden 30 Minuten lang mit einer Lösung von Coomassie Brillant Blau^® R250 (Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg, Deutschland) in Methanol (50%), Essigsäure (10%) und destilliertem Wasser angefärbt. Anschließende Waschvorgänge wurden mit einer Lösung von Methanol (50%), Essigsäure (10%) und destilliertem Wasser während 15 Minuten bei ersten Waschen und Methanol (2,5%), Essigsäure (0,5%) und destilliertem Wasser bei den anschließenden Waschvorgängen durchgeführt, bis die Hintergrundfarbe beseitigt war.
Durchflusscytometrie
Die Hemmung der von Peptiden vermittelten Bindung von TGFβ1 an die Zellrezeptoren wurde nach dem direkten Immunfluoreszenzverfahren gemessen. Dafür wurde ein Immunfluoreszenz-Kit verwendet (Fluorokine rh TGFβ-biotin, R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Dieser Test beruht auf der Fähigkeit von biotinyliertem TGFβ1, spezifisch an die Zellrezeptoren zu binden, und der anschließenden Wechselwirkung des Biotins mit Fluorescein-markiertem Avidin, so dass die Signalintensität von der Menge des an die Zellrezeptoren gebundenen TGFβ1 abhängt.
Die in 162-cm²-Kolben gezüchteten MV-1-Lu-Zellen wurden mit Hilfe von Lösung 1 (oben beschrieben) entnommen und in physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert, um sie 5 Minuten lang mit 500 × g zu zentrifugieren. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen wiederum mit einer Konzentration von 4 × 10⁶ Zellen/ml in physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. 25 μl der Zellsuspension wurden in Borosilikatröhrchen von 12 × 75 mm gegeben, und das zu testende Peptid wurde in 40 μl RPMI-1640-Medium hinzugefügt, was eine Endkonzentration von 0,42 μg/μl ergab, sowie 10 μl biotinylierter TGFβ1. Als Kontrolle für die Spezifität wurden 10 μl eines biotinylierten Reagens, das in dem Kit mitgeliefert wird, hinzugefügt, 10 μl biotinylierter TGFβ1 wurden als positive Kontrolle hinzugefügt, und 20 μl Anti-TGFβ1-Blockierungsantikörper wurden als negative Kontrolle hinzugefügt. Zu allen Kontrollen wurde physiologische Kochsalzlösung gegeben, bis ein Gesamtvolumen von 75 μl erreicht war. Alle Röhrchen wurden 1 Stunde lang bei 4 °C im Dunkeln inkubiert.
Am Ende der Inkubationszeit wurden 10 μl Fluorescein-markiertes Avidin hinzugefügt, es wurde 30 Minuten lang bei 4 °C im Dunkeln inkubiert, und danach wurden 2 ml einer Waschlösung (RDF1) hinzugefügt, und dann erfolgte eine Zentrifugation mit 500 × g während 6 Minuten. Das Zellsediment wurde für die Cytometrie (FACScan, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Kalifornien, USA) in 0,2 ml kaltem PBS resuspendiert. Dieses Verfahren erlaubt die Messung der von jeder Zelle beim Auftreffen eines Laserstrahls emittierten Fluoreszenz mittels eines Computerprogramms (Lisys TM II, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Kalifornien, USA). 16 zeigt ein typisches Bild aus einer Analyse mit Durchflusscytometrie.
Um die Daten zur Hemmung der Bindung von TGFβ1 an die Rezeptoren zu erhalten, wurde die positive Kontrolle des Tests verwendet, um die Felder abzugrenzen, die den markierten Zellen, die an das TGFβ1-Biotin gebunden sind (M2), und den unmarkierten Zellen (M1) entsprechen. Sobald die Felder abgegrenzt waren, wurde der Prozentsatz der Zellen berechnet, der jeweils darin lokalisiert war. Dasselbe geschah mit den Daten, die erhalten wurden, wenn das Peptid mit TGFβ1-Biotin oder mit den Zellen inkubiert wurde, je nachdem, ob sie von den Rezeptoren oder dem TGFβ1 stammten. Mit diesen Daten wurde die prozentuale Hemmung jedes Peptids unter Verwendung der folgenden Formel berechnet: 100 – ((M2 Peptid – M2 Negativ) × 100/(M2 Positiv – M2 Negativ)).
In-vivo-Experimente. Experimentelles Modell der Fibrose
Männliche weiße Ratten (Albino-Wistar-Stamm) aus gleichzeitigen Würfen (5 Wochen ± 1,5 Wochen) wurden verwendet, um eine Gruppe zu erhalten, die homogen in Bezug auf Alter und Anfangsgewicht war. Während der gesamten Experimente wurden die Tiere unter Bedingungen einer konstanten Temperatur (22 °C) mit einem zwölfstündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Sie hatten freien Zugang zu Wasser und Futter.
Leberzirrhose (HC) wurde durch Inhalation von Tetrachlorkohlenstoff zweimal pro Woche während 11 Wochen induziert (López Novoa JM et al. (1976) Patología IX: 223-240; Camps J. et al. (1987) Gastroenterology 93: 498-505). Die Einwirkung von CCl₄ wurde durchgeführt, indem man Pressluft mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 Litern/min durch eine Gaswaschflasche strömen lässt. Am Anfang wurde eine Einwirkungszeit von 1 Minute verwendet, die um eine Minute pro Woche erhöht wurde, bis in der vierten Woche 4 Minuten erreicht waren. In der fünften Woche wurde kein CCl₄ verabreicht, und in der sechsten Woche wurde erneut mit einer Einwirkungszeit von 5 Minuten begonnen. Diese Einwirkungszeit wurde bis zur 11. Woche beibehalten. Eine Woche vor dem Beginn der Einwirkung von CCl₄ bis zum Ende der Versuchszeit wurden 400 mg/l Phenobarbital (Luminal^®, Bayer, Leverkusen, Deutschland) zu dem Trinkwasser gegeben. Vor Beginn der Behandlung wurde eine Woche ausgelassen, in der kein CCl₄ verabreicht wurde. Während der Behandlung wurde eine wöchentliche Dosis von CCl₄ verabreicht, wie es aufgezeichnet wurde (2).
Verteilung der Tiere
Die Tiere wurden vor Beginn des Verfahrens der Induktion der Leberzirrhose in 4 Gruppen eingeteilt.
Gesunde Kontrollen (Co): Tiere, die nicht dem Fibroseverfahren ausgesetzt worden waren.
Behandelte gesunde Kontrollen (Co + P144): Tiere, die nicht dem Fibroseverfahren ausgesetzt worden waren und denen während der letzten 3 Wochen (zeitlich zusammenfallend mit der Behandlung der Tto₂-Rattengruppe) das Peptid P144 verabreicht wurde.
Zirrhotische Kontrollen 1 (Ci₁): Tiere, die durch Inhalation von CCl₄ zweimal pro Woche dem Induktionsverfahren unterzogen wurden. Diese Tiere wurden bei Erreichen der fünften Woche in 2 Gruppen aufgeteilt:
Zirrhotische Kontrollen 1 (Ci₁): Tiere, die bis zur Woche 11 weiterhin dem Verfahren zur Induktion der Zirrhose unterzogen wurden, ohne das Peptid P144 verabreicht zu bekommen. Während des gesamten Induktionsvorgangs (Wochen 5 bis 11) wurde ihnen jeden zweiten Tag salzhaltiges Serum verabreicht.
Behandelte Zirrhotische Tiere 1 (Tto₁): Tiere, denen während des Verfahrens der Induktion der Fibrose von Woche 5 bis Woche 11 jeden zweiten Tag das von der Sequenz des Typ-III-Rezeptors abgeleitete Peptid P144 verabreicht wurde.
Zirrhotische Kontrollen 2 (Ci₂): Tiere, die weiterhin dem Verfahren der Induktion der Fibrose unterzogen wurden, ohne das Peptid P144 oder salzhaltiges Serum zu erhalten. Diese Gruppe wurde bei Erreichen der Woche 11 in 2 weitere Gruppen unterteilt:
Zirrhotische Kontrollen 2 (Ci₂): Zirrhotische Tiere, die keinerlei Behandlung unterzogen und als Kontrollen gehalten wurden. Diese Tiere erhielten 3 Wochen lang Injektionen von salzhaltigem Serum (Woche 13 bis 15).
Behandelte Zirrhotische Tiere 2 (Tto₂): Zirrhotische Tiere, die 3 Wochen lang (Woche 13 bis 15) mit dem von der Sequenz des Typ-III-Rezeptors abgeleiteten Peptid (P144) behandelt wurden.
Behandlung der Tiere

• Gruppe Tto₁: Diese Tiere erfuhren während des Fibrosevorgangs eine Behandlung. Die Behandlung mit dem Peptid begann in der fünften Woche (vor der Einwirkung von CCl₄ während 5 Minuten) und wurde bis zum Ende der elf Wochen des Zirrhose-Induktionsvorgangs fortgesetzt.
• Gruppe Tto₂: Diese Tiere erfuhren eine Behandlung nach Beendigung des Verfahrens der Induktion der Zirrhose (11 Wochen). Die Behandlung begann eine Woche nach der letzten Inhalation von CCl₄ und wurde 21 Tage lang fortgesetzt.

Vor Beginn der Behandlung und nach ihrer Beendigung wurde allen Tieren, die mit dem Peptid behandelt worden waren, Blut entnommen. Das Peptid wurde durch subkutane Injektion im abdominalen Bereich mit einer Dosis von 70 μg/Tier in 500 μl physiologischer Kochsalzlösung verabreicht.
Tötung der Tiere und Dissektion der Leber
Nach Beendigung der Behandlung der Tiere mit dem Peptid wurde die Tiere sowohl bei dem Modell mit Ratten als auch bei dem mit Mäusen durch Abtrennen des Kopfes getötet, nachdem mit einer Kapillare aus dem retroorbitalen Plexus Blut entnommen worden war.
Danach erfolgte sofort eine Dissektion der Leber und eine Entnahme von Proben.
Die Proben wurden geschnitten und für die spätere histologische Untersuchung in Formol als Fixierungslösung gelegt. Andere Fragmente wurden in Cryotubes gegeben, die in flüssigen Stickstoff eingetaucht und dann bei –80 °C gelagert wurden.
Anatomopathologische Bewertung der Leber
Eine histologische Untersuchung wurde an Fragmenten der Leber durchgeführt, die zuvor wenigstens 24 Stunden lang in Formol fixiert worden waren, woraufhin sie in Ethanol (70%) gelegt wurden.
Nach der Dehydratisierung wurden sie in Paraffinblöcke eingebettet. Aus den erhaltenen Blöcken wurden aufeinanderfolgende Schnitte mit einer Dicke von 3 μm hergestellt, wobei man ein Leitz-Rotationsmikrotom und Stahlklingen verwendete. Vor dem Anfärben wurden die Schnitte 15 Minuten lang in Xylol (AnalaR, BDH, Poole, UK) deparaffiniert, nachdem sie 15 Minuten lang bei 60 °C in einem Ofen erhitzt wurden, und sie wurden durch aufeinanderfolgende Passagen durch Alkohole mit abnehmender Konzentration von 100%, 96%, 80% und 70% und schließlich in Wasser hydratisiert. Die folgenden Farbstoffe wurden verwendet:
Haematoxylin-Eosin.
Massons Trichromfärbung (Locquin M. und Langeron, (1985) in Manual de Microscopia Ed. Labor S.A. Barcelona): verwendet einen speziellen Farbstoff für Collagenproteine (grünes Licht).
Siriusrot: Collagenspezifischer Farbstoff.
Bestätigung der Leberfibrose: Bildanalyse
Für eine Bildanalyse der erhaltenen Proben wurde ein Lichtmikroskop verwendet (Olympus BH-2, Tokyo, Japan), das an eine Videokamera (Sony DXP-950P, Sony Co., Tokyo, Japan) angeschlossen war, mit der die verschiedenen Felder jedes Präparats photographiert wurden. Aus jedem Präparat, das mit Siriusrot ange färbt war, wurden zufällig sechs Felder genommen. Die verschiedenen aufgenommenen Bilder wurden mittels eines Computerprogramms (Visilog 4.1.5, Noesis, Orsay, Frankreich) analysiert, das die Fläche der Fibrose und die Gesamtfläche des Präparats berechnet. Aus diesen Daten wurde ein Fibroseindex (Fläche der Fibrose/Gesamtfläche) für jedes Feld berechnet. Um dieses Programm verwenden zu können, war es notwendig, die Bilderfassung durch Verwendung von Polarisationsfiltern (Olympus U-POT, Tokyo, Japan) und Grünfiltern (Olympus IF550, Tokyo, Japan) zu modifizieren, was es ermöglichte, das Verfahren der Probenanalyse zu automatisieren.
Nachweis von Collagen in 14-μm-Schnitten von paraffinbehandeltem Gewebe
Die für diese Technik verwendeten 14-μm-Schnitte wurden in derselben Weise wie die zuvor erwähnten 3-μm-Schnitte erhalten. Diese Schnitte wurden 12 Stunden lang einem Verfahren zur Deparaffinierung in Xylol unterzogen. Sobald das Paraffin entfernt worden war, wurden die Proben hydratisiert, indem man sie durch verschiedene Alkoholkonzentrationen von 96%, 80% und 50% leitete und den Vorgang in destilliertem Wasser beendete.
Sobald sie hydratisiert waren, wurden sie 15 Minuten lang im Dunkeln einem Verfahren der Vorfärbung in einer Lösung von 160 mg Echtgrün FCF (Fluka Chemika-BioChemika, Buchs, Schweiz) in 160 ml gesättigter Pikrinsäure (Merck, Darmstadt, Deutschland) unterzogen. Die Proben wurden durch Eintauchen in Wasser gewaschen, bis sie das Waschwasser nicht mehr färbten. Sobald der überschüssige Farbstoff entfernt war, wurden die Proben 30 Minuten lang im Dunkeln in einer Lösung von 160 mg Direktrot 80 (Fluka Chemika-BioChemika Buchs, Schweiz) und 64 mg Echtgrün, beide Farbstoffe in 160 ml gesättigter Pikrinsäure, angefärbt. Sie wurden wiederum gewaschen, bis der überschüssige Farbstoff entfernt war, und dann wurden die Proben von den Objektträgern entfernt, indem man die Probe mit einem kleinen Spatel abkratzte. Die auf diese Weise entfernten Schnitte wurden in getrennte Röhrchen gegeben, die 3 ml einer Lösung von 0,1 N NaOH (Quimón, Montplet & Esteban S.A., Barcelona, Spanien) und Methanol (1:1) enthielten. Aliquote wurden aus den verschiedenen Röhrchen entnommen, um sie im Spektrophotometer (Lambda 2 UV/VIS Spektrophotometer, Perkin-Elmer, Norwalk, USA) bei Wellenlängen von 540 nm und 630 nm abzulesen, wobei als Blindprobe ein Aliquot der Lösung von 0,1 N NaOH und Methanol (López de León A. und Rojkind (1985) Histochem. Cytochem. 33: 737-743; Gaudio E. et al. (1993) Int. J. Exp. Path. 74: 463-469) verwendet wurde.
Im Einklang mit den Arbeiten von Gaudio E. et al. (1993) Int. J. Exp. Path. 74: 463-469, wurden die folgenden Formeln verwendet, um die Mengen des Collagen und des Gesamtprotein zu finden:
Statistische Analyse der Ergebnisse
Die in den in-vivo-Experimenten erhaltenen Daten wurden einer statistischen Analyse unterzogen. Die Normalität der quantitativen Variablen wurde durch den Shapiro-Wilks-Test überprüft.
Da die Daten nicht auf eine Normalverteilung angepasst worden waren, wurde eine nichtparametrische statistische Analyse unternommen. Ein Vergleich zwischen Gruppen wurde mittels H-Test nach Kruskal-Wallis und einen anschließenden Vergleich durch U-Test nach Mann-Whitney durchgeführt. Die Daten wurden graphisch mittels Kästchen dargestellt, wobei der Medianwert der Daten (dicke Linie innerhalb jedes Kästchens) zusammen mit dem Interquartilbereich (Höhe des Kästchens) dargestellt ist, während die "Äste" an jedem Kästchen die höchste und die niedrigste Beobachtung innerhalb eines gegebenen Interquartilbereichs darstellen.
Die Assoziation zwischen Variablen wurde mit Hilfe von Fishers exaktem Test untersucht. Eine logistische Regression wurde eingesetzt, um die Unabhängigkeit der Assoziation dieser Variablen zu untersuchen.
Ein Wert von P von kleiner oder gleich 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Alle statistischen Analysen wurden mit Hilfe des Programms SPSS für Windows V 6.1.3 bewerkstelligt.
In-vitro-Hemmung der Aktivität von TGFβ1
Test auf Hemmung des Zellwachstums der MV-1-Lu-Linie
TGFβ1 ist ein Cytokin, das das in-vitro-Wachstum der MV-1-Lu-Zelllinie hemmen kann (Grubeck-Loebenstein B. et al. (1989) J. Clin. Invest. 83: 764-770; Brennan FM et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81: 278-285), und daher wurde diese Linie zum Testen der Blockierungswirkung von Peptiden auf TGFβ1 verwendet. Nach verschiedenen Kombinationen von Medien, Zellen und Thymidin untersuchten wir die Wirkung von unterschiedlichen Konzentrationen von TGFβ1 auf den Einbau von [Methyl-³H]Thymidin durch MV-1-Lu-Zellen in Kultur, um die am besten geeigneten Bedingungen für den Test zu bestimmen. Diese Bedingungen sind in 3 gezeigt.
Sobald sowohl die optimale Konzentration von MV-1-Lu-Zellen (5000 Zellen/Napf) als auch die niedrigste Konzentration von TGFβ1, die eine Hemmung von etwa 90% ergeben kann (200 pg/ml, 18), bestimmt worden waren, wurde die inhibitorische Wirkung der synthetischen Peptide bei einer Konzentration von 200 μg/ml getestet.
In-vitro-Hemmung der Aktivität von TGFβ1 durch synthetische Peptide
Die synthetischen Peptide der Erfindung, die potentielle Inhibitoren der TGFβ1-Aktivität sind, wurden unter Verwendung der MV-1-Lu-Zelllinie getestet. Die Peptide wurden in gepuffertem RPMI-Medium, das frei von fetalem Kälberserum war, aufgelöst, und das folgende Verfahren wurde verwendet:
Die Peptide, die zur Sequenz des Rezeptors gehören oder komplementär zu den Maxima der Hydrophilie von TGFβ1 sind, wurden 30 Minuten lang in Gegenwart dieses Cytokins inkubiert und dann mit der Zellkultur kombiniert. Die von der Sequenz von TGFβ1 abgeleiteten Peptide wurden vor der Zugabe von TGFβ1 zu der Zellkultur gegeben, da sie mit den Rezeptoren der Zelloberfläche wechselwirken. Diese Inkubationen wurden in 100 μl desselben Mediums durchgeführt, wie es für die Zugabe der Zellen verwendet wurde. Die aktiven Peptide ermöglichten ein Zellwachstum bis zu einem höheren oder geringeren Grad je nach ihrer Fähigkeit, TGFβ1 zu hemmen.
Hemmung von TGFβ1 mittels Peptiden, die von TGFβ1 abgeleitet sind (vergleichend)
In einem ersten Stadium wurden überlappende Peptide synthetisiert, die von TGFβ1 abgeleitet sind. Diese Peptide (Tabelle 2) wurden in der Hoffnung synthetisiert, dass einige davon an die Zellrezeptoren binden könnten, wodurch die Bindung von natürlichem TGFβ1 an diese Rezeptoren verhindert wird.
Tabelle 2. Von TGFβ1 abgeleitete Peptide.

Die Nummer des Peptids ist zusammen mit seiner Position in der vollständigen Sequenz sowie seiner Aminosäuresequenz gezeigt. Zur Erleichterung der Synthese wurden alle Peptide mit einem am C-terminalen Ende addierten Alaninrest synthetisiert, der in der Tabelle nicht gezeigt ist.

4 zeigt die inhibitorische Wirkung der Peptide in Tabelle 6 auf die Aktivität von TGFβ1. Da TGFβ1 das Wachstum der MV-1-Lu-Zellen hemmt, führt die Hemmung dieses Cytokins durch die Peptide zur Wiederherstellung des Wachstums der MV-1-Lu-Zellen.
Wie anhand von 4 zu erkennen ist, ist das von der Sequenz von TGFβ1 abgeleitete Peptid P12 dasjenige, das eine größere inhibitorische Wirkung auf TGFβ1 aufweist. Wegen einer detaillierteren Untersuchung der inhibitorischen Wirkung des Peptids P12 wurde eine Untersuchung der Wirkung der Konzentration des Peptids auf die Hemmung des Cytokins durchgeführt, welche unten beschrieben ist.
Dosis-Wirkungs-Test der Hemmung von TGFβ1 durch das Peptid P12 (vergleichend)
Die Wirkung der Konzentration des Peptids P12 auf die Hemmung der Aktivität von TGFβ1 wurde untersucht. Da dieses Peptid im Testmedium nicht leicht löslich war, wurden Stammlösungen oder -suspensionen mit einer nominellen Konzentration des Peptids (die erreicht worden wäre, wenn das Peptid sich vollständig aufgelöst hätte) hergestellt, und Aliquote wurden daraus entnommen und filtriert oder sogar direkt für die Hemmungstests verwendet.
5 untersucht die inhibitorische Wirkung von nominellen Peptidkonzentrationen vor und nach der Filtration. Es ist zu erkennen, dass das Peptid P12 mit und ohne Filtration praktisch dieselbe Aktivität hat.
Sobald die Ergebnisse mit dem Peptid P12 erhalten worden waren, wurde beschlossen, das Peptid sowohl in N-terminaler als auch in C-terminaler Richtung zu verlängern und die Wirkung auf seine Aktivität zu untersuchen. Außerdem wurden Änderungen an seiner Sequenz vorgenommen, um seine Löslichkeit zu verbessern und die Bedeutung der beiden Cysteinreste in seiner Sequenz für die inhibitorische Aktivität von TGFβ1 zu untersuchen. Die synthetisierten Peptide sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3. Von einer Modifikation des Peptids P12 abgeleitete Peptide.
6 zeigt die Ergebnisse der Hemmung von TGFβ1 durch die Peptide in Tabelle 3.
In 6 ist zu erkennen, dass das Peptid P29 aktiv ist. Dieses Peptid umfasst das zuvor getestete Peptid P12 und hat 9 zusätzliche Aminosäuren zum N-terminalen Ende hin (4). Bei Untersuchungen, die von Quian SW et al. (1992) (proc. Natl. Acad. Sci. 89: 6290-6294) und Burmester JK et al. (1993) (Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 8628-8632) unter Verwendung von chimärischen rekombinanten Proteinen durchgeführt wurden, wurde ein Bereich von TGFβ1 identifiziert, der für die Aktivität dieses Cytokins notwendig ist (Aminosäuren 40 bis 82 in der Sequenz von reifem TGFβ1). Es wurde spekuliert, dass das Peptid P29 (Aminosäuren 34 bis 56 in der Sequenz von reifem TGFβ1), das sich über einen größeren Bereich als Peptid P12 (Aminosäuren 43 bis 56) erstreckt, im Kreislauf eine dreidimensionale Struktur annehmen könnte, die der Struktur von TGFβ1 ähnlicher ist. Aus diesem Grund wurde das Peptid P29 für Tests der Bindung an die Zellrezeptoren verwendet, die auf Affinitätsmarkierung beruhten.
Tests der Hemmung der Bindung von TGFβ1 an seine Rezeptoren durch Peptid P29 (Affinitätsmarkierung) (vergleichend)
Das Peptid P29, das von der Sequenz von TGFβ1 abgeleitet ist, wurde in Affinitätsmarkierungstests verwendet, um seine Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von TGFβ1 an seine Zellrezeptoren zu überprüfen (Abschnitt "Material und Verfahren").
Aufgrund der unterschiedlichen Aktivität der eingesetzten Chargen von ¹²⁵I-TGFβ1 wurden die in den Tests verwendeten Peptidkonzentrationen gemäß der Konzentration der in jedem Fall verwendeten ¹²⁵I-TGFβ1-Charge eingestellt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in den 7 und 8 gezeigt.
Weitere Tests wurden durchgeführt, um die minimale Konzentration zu finden, die zum Blockieren der Bindung von ¹²⁵I-TGFβ1 an die Zellrezeptoren erforderlich ist.
Hemmung von TGFβ1 durch Peptide, die von der Sequenz des Typ-III-Rezeptors der Ratte abgeleitet sind
Mit dem Ziel, neue Peptide zu finden, die Inhibitoren der Aktivität von TGFβ1 sind, wurden vom Typ-III-Rezeptor der Ratte abgeleitete Peptide synthetisiert. Einige Peptide wurden auf der Grundlage von Bereichen ihrer Sequenz gewählt, für die vorhergesagt wurde, dass sie komplementär zu Blöcken von Aminosäuren der Sequenz von TGFβ1 seien. Es wurde gehofft, dass diese Peptide an freies TGFβ1 binden, es maskieren und seine Bindung an die Zellrezeptoren verhindern könnten.
Andere Peptide wurden synthetisiert, indem man 10 Aminosäuren überlappte und einen Teil des extrazellulären Bereichs des Typ-III-Rezeptors (Aminosäuren 45 bis 410) abdeckte. Es wurde beschrieben, dass es einen löslichen Typ-III-Rezeptor gibt, der dem extrazellulären Bereich des Rezeptors entspricht, dass dieser Bereich von der Membran abgeschnitten ist und im Kreislauf als Maskierungsmittel des TGFβ1 wirkt (López Casillas F. et al. (1991) Cell 67: 785-795). Spätere Studien beschrieben zwei mögliche Bereiche der Bindung an TGFβ1, von denen einer am N-terminalen Ende des Rezeptors lokalisiert ist (López-Casillas et al. (1994) J. Cell Biol. 124: 557-568) und der andere in dem Bereich, der der Membran am nächsten liegt, zum C-terminalen Ende hin lokalisiert ist (Fukushima D. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22710-22715; Pepin MC et al. (1995) FEBS Lett 377: 368-372). Aus diesen Gründen wurden Peptide des extrazellulären Bereichs dieses Rezeptors synthetisiert, aufgrund der Annahme, dass diese Peptide in der Lage sein könnten, den zirkulierenden TGFβ1 zu maskieren.
Die synthetisierten Peptide sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4. Vom Typ-III-Rezeptor der Ratte abgeleitete Peptide.

Die Nummer des Peptids und seine Sequenz sind gezeigt. P39 bis P65 sind Peptide, von denen vorhergesagt wurde, dass sie zu TGFβ1 komplementär seien, und P66 bis P138 sind überlappende Peptide, die den extrazellulären Bereich des Rezeptors abdecken. Zur Erleichterung der Synthese wurden alle Peptide mit einem am C-terminalen Ende addierten Alaninrest synthetisiert, der in der Tabelle nicht gezeigt ist.

Die Peptide in Tabelle 4 wurden auf ihre Fähigkeit getestet, TGFβ1 im Modell der Hemmung der MV-1-Lu-Zelllinie zu blockieren. Da TGFβ1 das Wachstum dieser Linie hemmen kann, könnte die Hemmung von TGFβ1 durch die Peptide das Zellwachstum wiederherstellen. Diese Tests sind in den 9 bis 12 gezeigt.
Wie in den 9 bis 12 zu sehen ist, gibt es verschiedene Peptide, die das Wachstum der MV-1-Lu-Zelllinie mehr oder weniger stark hemmen können, aber nur Peptid P54 ist in der Lage, die Aktivität von TGFβ1 fast vollständig zu hemmen. Mit dem Ziel, eine gründlichere Untersuchung dieses Peptids durchzuführen, wurden Tests durchgeführt, wobei unterschiedliche Peptidkonzentrationen gegen eine feste Konzentration von TGFβ1 von 200 pg/ml verwendet wurden.
Dosis-Wirkungs-Test der Hemmung von TGFβ1 durch das Peptid P54
Die Wirkung der Konzentration von Peptid P54 auf die Hemmung der Aktivität von TGFβ1 wurde untersucht. Im Hinblick auf die geringe Löslichkeit dieses Peptids wurden wie im Falle von Peptid P12 Stammlösungen mit der nominellen Peptidkonzentration hergestellt, und Aliquote wurden daraus entnommen und filtriert oder sogar direkt für die Hemmungstests verwendet.
13 untersucht die inhibitorische Wirkung von nominellen Peptidkonzentrationen vor und nach der Filtration. Man erkennt, dass es im Filtrat von Peptid P54 keine messbare inhibitorische Aktivität gibt.
Nachdem die Fähigkeit von Peptid P54 zur Hemmung der Aktivität von TGFβ1 in dosisabhängiger Weise bestätigt wurde, gingen wir dazu über, neue Peptide zu synthetisieren, wobei die Sequenz von P54 als Grundlage genommen wurde, mit dem Ziel, zu versuchen, die Löslichkeit und damit die Aktivität bei niedrigeren Dosen zu verbessern. Es wurden auch zwei Peptide synthetisiert, die vom humanen Typ-III-Rezeptor abgeleitet sind. Eines dieser Peptide (P144) ist zu Peptid P54 äquivalent. Das andere Peptid (P145) ist Peptid P106 des Typ-III-Rezeptors der Ratte ähnlich, das ebenfalls Aktivität bewiesen hat. Diese neuen Peptide sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5. Peptide, die durch eine Modifikation von Peptid P54 (Peptide P139 bis P143) und des humanen Typ-III-Rezeptors (Peptide P144 und P145) abgeleitet sind.
Der Test auf Aktivität der Peptide in Tabelle 5 ist in 14 gezeigt.
Dosis-Wirkungs-Test der Hemmung von TGFβ1 durch das Peptid P144
Ein Dosis-Wirkungs-Test wurde mit dem Peptid P144, das von der Sequenz des humanen Typ-III-Rezeptors abgeleitet ist, durchgeführt, um zu testen, ob seine Aktivität von der Konzentration abhängt (15). Man erkennt, dass die Aktivität des Peptids mit der Abnahme der in den Tests verwendeten Peptidkonzentration abnimmt.
Tests der Hemmung der Bindung von TGFβ1 an seine Rezeptoren durch Peptid P144 (Affinitätsmarkierung)
Das Peptid P144, das von der Sequenz des humanen Typ-III-Rezeptors abgeleitet ist, wurde in Affinitätsmarkierungstests verwendet, um seine Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von TGFβ1 an seine Zellrezeptoren zu überprüfen (Abschnitt "Material und Verfahren").
Aufgrund der unterschiedlichen Aktivität der eingesetzten Chargen von¹²⁵I-TGFβ1 wurden die in den Tests verwendeten Peptidkonzentrationen gemäß der Konzentration der in jedem Fall verwendeten ¹²⁵I-TGFβ1-Charge eingestellt. Die Ergebnisse dieser Tests sind in 15 gezeigt.
Nach der Überprüfung der Bindung von TGFβ1 an seine Zellrezeptoren durch das Peptid P144 wurde ein neuer Test durchgeführt, um das Peptid P144 zu titrieren. Es wurde beobachtet, dass das Peptid seine Aktivität bei einer Konzentration verlor, die 2 × 10⁵ mal so groß war wie die molare Konzentration von ¹²⁵I-TGFβ1.
Hemmung von TGFβ1 durch Peptide, die von anderen Proteinen mit der Fähigkeit, an TGFβ1 zu binden, abgeleitet sind und für die eine Komplementarität zu TGFβ1 vorhergesagt wird
Die Peptide in Tabelle 6, die von Proteinen, die an TGFβ1 binden können, abgeleitet sind, wurden in dieser Reihe synthetisiert.
Tabelle 6. Peptide, die von verschiedenen Proteinen, die an TGFβ1 binden können (Typ-II-Rezeptor P146, Fetuin P147 bis P149, Endoglin P150 bis P154 und α2-Makroglobulin P155 bis P179), abgeleitet sind.

Die Nummer der Peptide ist zusammen mit seiner Position in der vollständigen Sequenz, seiner Aminosäuresequenz und seiner Herkunft gezeigt. Zur Erleichterung der Synthese wurden alle Peptide mit einem am C-terminalen Ende addierten Alaninrest synthetisiert, der in der Tabelle nicht gezeigt ist.

Die 17 und 18 zeigen die inhibitorische Aktivität der aus Tabelle 10 abgeleiteten Peptide.
Wie man in den 17 und 18 erkennt, zeigte nur das Peptid P150 eine größere Aktivität als 50%. Die Peptide P146 und P149, die von Demetriou M et al. (1996), J. Biol. Chem. 271: 12755-12761, als aktiv beschrieben worden waren, erwiesen sich jedoch unter den für diesen Test eingesetzten Bedingungen nicht als aktiv.
Messung der inhibitorischen Wirkung von synthetischen Peptiden auf die Bindung von TGFβ1 an seine Zellrezeptoren mittels Durchflusscytometrie
Vom Typ-III-Rezeptor abgeleitete Peptide wurden verwendet, um mittels Durchflusscytometrie ihre Fähigkeit zu messen, die Bindung von TGFβ1 an die Zellrezeptoren zu hemmen. Bei diesen Tests werden die Zellen mit dem Peptid inkubiert, bevor man TGFβ1-Biotin hinzufügt, welches mit Hilfe von Avidin-FITC ("Material und Verfahren") nachgewiesen wird. Dann wird die vom Avidin-FITC emittierte Fluoreszenz gemessen; diese wird direkt proportional zur Menge des an die Zellen gebundenen TGFβ1 und umgekehrt proportional zur Aktivität des Peptids sein. Die mit den relevantesten Peptiden erhaltenen Ergebnisse sind in 19 und Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7. Vergleich der inhibitorischen Aktivität einiger Peptide auf TGFβ1, gemessen durch einen Bioassay der Hemmung des Wachstums der MV-1-Lu¹-Zellen (Peptidkonzentration 200 μg/ml), wobei die Hemmung der Bindung von TGFβ1 an seine Zellrezeptoren mit Hilfe von Durchflusscytometrie² gemessen wurde (Peptidkonzentration 420 μg/ml)
In-vivo-Hemmung der Aktivität von TGFβ1
Das Peptid P144, das von der Sequenz des humanen Typ-III-Rezeptors abgeleitet ist und sich in den Bioassays der Hemmung des Wachstums der MV-1-Lu-Zelllinie als aktiv erwiesen hat, wurde in den in-vivo-Tests verwendet, um seine inhibitorische Wirkung bei der Induktion von experimenteller Zirrhose mit CCl₄ in einem Rattenmodell zu untersuchen.
Modell der experimentellen Zirrhose bei Wistar-Ratten
Bei diesem Modell wird eine Leberzirrhose durch Inhalation von Tetrachlorkohlenstoff zweimal pro Woche während 11 Wochen induziert (López Novoa JM et al. (1976) Patología IX: 223-240; Camps J. et al. (1987) Gastroenterology 93: 498-505), wie es im Abschnitt "Material und Verfahren" beschrieben ist.
Das Peptid P144 wurde gemäß zwei Vorschriften verabreicht:

1. Vorschrift 1: Das Peptid wurde während des Vorgangs der Zirrhoseinduktion (11 Wochen) jeden zweiten Tag intraperitoneal verabreicht. 20 und 21.
2. Vorschrift 2: Das Peptid wurde 3 Wochen lang jeden zweiten Tag intraperitoneal verabreicht, sobald die Zirrhose etabliert war, d.h. 12 Wochen nach Beginn der Induktion der Zirrhose. 22 und 23.

Die Produktion von Collagen bei beiden Vorschriften wurde mit zwei Techniken gemessen:
Die 24 und 25 zeigen die Gesamtcollagenproduktion, die durch Anfärben von Leberschnitten (zwei pro Tier) mit Echtgrün und Direktrot, Elution der Farbe und Ablesen mit einem Spektrophotometer ("Material und Verfahren") gemessen wurden (López de León A. und Rojkind (1985) Histochem. Cytochem. 33: 737-743; Gaudio E. et al. (1993) Int. J. Exp. Path. 74: 463-469).
Die 21 und 23 zeigen die Collagenproduktion, die durch Bildanalyse von Leberschnitten, die mit Siriusrot angefärbt waren, mittels Lichtmikroskopie ("Material und Verfahren") gemessen wurden.
Wie man in 20 erkennt, werden signifikante Unterschiede (p < 0,05) zwischen der Gruppe von Ratten, die mit dem Peptid P144 behandelt wurden (Tto₁), und der Kontrollgruppe von zirrhotischen Ratten (Ci₁) beobachtet, wenn man das Verhältnis von Collagen zu Gesamtprotein untersucht. In 27 sind die Unterschiede zwischen der Gruppe von Ratten, die mit dem Peptid P144 behandelt wurden (Tto₁), und der Kontrollgruppe von zirrhotischen Ratten (Ci₁) ebenfalls signifikant (p < 0,001), wenn die Fläche der Fibrose untersucht wird.
In den 22 und 23, die die Ergebnisse für die behandelten Ratten zeigen, sobald die Zirrhose etabliert war, ist Folgendes zu sehen: Die Unterschiede zwischen den Gruppen von Ratten, die mit dem Peptid P144 behandelt wurden (Tto₂), und den zirrhotischen Ratten ohne Behandlung (Ci₂) sind nicht signifikant, wenn man eine der beiden Techniken zur Messung der Fibrose verwendet.
Die beiden Techniken, die zum Messen von Collagen eingesetzt wurden, wurden mit Hilfe von linearer Regression miteinander verglichen, mit dem Ziel, die Zufälligkeit der Auswahl der Felder für die Untersuchung bei jedem Präparat und damit die Gültigkeit der Bildanalyse zu überprüfen, 24 und 25.
Wie man aus den 24 und 25 ersieht, gibt es eine Korrelation zwischen den beiden Techniken mit R > 0,85 in beiden Fällen, was hochsignifikant ist (F ≤ 0,001). Dies bestätigt, dass die Erfassung der Bilder für die Untersuchung völlig zufällig erfolgte, und bestätigt somit die Gültigkeit der durch Bildanalyse erhaltenen Daten.
Die 26 und 27 zeigen die Bilder, die durch Lichtmikroskopie bei zehnfacher Vergrößerung aus mit Siriusrot angefärbten Leberpräparaten erhalten wurden, die aus den Lebern von Ratten erhalten wurden, die während des Zirrhoseinduktionsvorgangs behandelt wurden (Ci₁ und Tto₁).
Die Bilder in 26 wurden erhalten, ohne irgendeine Art von Filter einzusetzen.
27 zeigt die Bilder, sobald sie mit Hilfe von spezieller Software für die Untersuchung modifiziert wurden. Diese Modifikationen bestehen in der Anwendung von zwei Filtern, einer für polarisiertes Licht und einer für grünes Licht, um die Qualität der Bilder zu verbessern und ihre automatisierte Untersuchung zu erleichtern.
Die 26 und 27 zeigen, dass es Unterschiede zwischen den Bildern, die von den zirrhotischen Ratten erhalten wurden (Ci₁), und denjenigen, die von den mit Peptid P144 behandelten Ratten erhalten wurden (Tto₁), gibt.
Die Unterschiede in der Wirksamkeit zwischen den Vorschriften 1 und 2 könnten darauf zurückzuführen sein, dass die Produktion von TGFβ1 viel geringer sein könnte, sobald die Zirrhose induziert ist (Vorschrift 2), als während des Vorgangs der Induktion der Zirrhose mit CCl₄ (Vorschrift 1) und sogar auf normalem Niveau liegen könnte, so dass die Wirkung der Behandlung mit dem Peptid P144 bei Vorschrift 2 weniger stark ausgeprägt wäre als bei Vorschrift 1.
Wenn wir die Gruppen der unbehandelten zirrhotischen Ratten am Ende des Vorgangs der Induktion der Zirrhose (Ci₁) mit den unbehandelten zirrhotischen Ratten 4 Wochen nach Ende der Induktion (Ci₂) miteinander vergleichen, finden wir, dass es signifikante Unterschiede (P = 0,016) zwischen den beiden Gruppen gibt (28), was darauf hinweisen würde, dass es einen partiellen Rückgang der Zirrhose gibt, wenn das zirrhotisierende Mittel entfernt wird, eine Beobachtung, die von verschiedenen Autoren veröffentlicht wurde (Szende-B et al. (1992) In Vivo 6: 355-361; Columbano A (1996) Carcinogenesis 17: 395-400).
Diese Unterschiede in der Wirksamkeit zwischen den beiden Vorschriften könnten auch auf die Vorschrift selbst zurückzuführen sein, da die Tiere von Vorschrift 2 nur 3 Wochen lang jeden zweiten Tag behandelt wurden, während die Tiere von Vorschrift 1 länger behandelt wurden (7 Wochen lang, ebenfalls jeden zweiten Tag).
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, TGFβ1 sowohl in vitro als auch in vivo mittels synthetischer Peptide zu hemmen, die von unterschiedlichen Proteinen abgeleitet sind. In der Zukunft wäre es von großem Interesse, zu versuchen, die biologische Aktivität dieser Peptide zu erhöhen. Dies könnte dadurch erreicht werden, dass man systematisch jede der Aminosäuren ihrer Sequenzen durch die anderen 19 ersetzt. Sobald das Peptid mit einer größeren Aktivität erreicht würde, wäre es notwendig, Mimotope (McConnell-SJ (1994) Gene 151: 115-118; Steward-MW (1995) J. Virol. 69: 7668-7673) davon herzustellen, um die mittlere Lebensdauer des Inhibitors in dem Organismus zu erhöhen.
Beschreibung der Figuren
1. Hemmung der Bindung von TGFβ1 an die MV-1-Lu-Zellen durch das Peptid P144, gemessen mittels Durchflusscytometrie. A: Bild, das bei der Untersuchung der Zellen erhalten wurde, die mit biotinyliertem TGFβ1 inkubiert und mit Avidin-FITC entwickelt wurden. B: Bild, das bei der Untersuchung der Zellen erhalten wurde, die mit Avidin-FITC ohne vorherige Zugabe von TGFβ1 inkubiert wurden. C: Bild, das bei der Untersuchung der Zellen erhalten wurde, die zuvor mit biotinyliertem TGFβ1 inkubiert, mit Peptid P144 in einer Konzentration von 0,42 μg/μl inkubiert und mit Avidin-FITC entwickelt wurden. Die emittierte Fluoreszenz ist auf der Abszisse gezeigt, während die Ordinate die Zahl der Zellen für jeden Wert der Fluoreszenz zeigt. Die Felder, die den mit TGFβ1-Biotin und Avidin-FITC markierten Zellen (M2) und den unmarkierten Zellen (M1) entsprechen, sind ebenfalls gezeigt.
2. Schematische Darstellung des Vorgangs der Zirrhoseinduktion durch CCl₄. Schwarze Pfeile zeigen an, wenn den Ratten zwei Dosen CCl₄ pro Woche verabreicht wurden, und schwarze gestrichelte Pfeile zeigen, wenn es nur eine Dosis pro Woche gab. Die grauen Pfeile zeigen eine Verabreichung des Peptids P144 an. A: gesunde Kontrollen; B: gesunde Kontrollen + P144; B₁: mit Peptid 70 μg/Tag; C: zirrhotisch; C₁ mit Kochsalzlösung; C₂ mit Peptid 70 μg/Tag; D: zirrhotisch mit CCl₄ + Phenobarbital; D₁ plus Kochsalzlösung; D₂ plus Peptid 70 μg/Tag.
3. Wirkung von TGFβ1 auf das Wachstum von MV-1-Lu-Zellen. Die Zellen werden in einer Dichte von 5000 Zellen/Napf mit den angegebenen TGFβ1-Konzentrationen in pg/ml kultiviert. Abszisse: TGFβ1-Konzentration (pg/ml); Ordinate: cpm (Zählereignisse pro Minute).
4 (vergleichend). Prozentuale Hemmung von TGFβ1 (200 pg/ml) durch Peptide aus TGFβ1. Alle Peptide wurden mit einer Konzentration von 200 μg/ml getestet. Eine Hemmung von TGFβ1 von 100% entspricht dem Wachstum von MV-1-Lu-Zellen, das in Abwesenheit von TGFβ1 erhalten wird.
5 (vergleichend). Prozentuale Hemmung der Aktivität von TGFβ1 (200 pg/ml) in Gegenwart von unterschiedlichen nominellen Konzentrationen von Peptid P12, filtriert (♦) und unfiltriert (•).
6 (vergleichend). Prozentuale Hemmung von TGFβ1 (200 pg/ml) durch Peptide aus TGFβ1. Alle Peptide wurden mit einer Konzentration von 200 μg/ml getestet. Eine Hemmung von TGFβ1 von 100% entspricht dem Wachstum von MV-1-Lu-Zellen, das in Abwesenheit von TGFβ1 erhalten wird.
7 (vergleichend). Autoradiogramm eines Affinitätsmarkierungstests der Rezeptoren von TGFβ1. Spur C1: Wirkung der Inkubation der Zellen mit einer Konzentration von 0,16 μM ¹²⁵I-TGFβ1, was einer Aktivität von 0,3 μCi entspricht (positive Kontrolle). Spur C2: Wirkung der Vorinkubation der Zellen mit einer Konzentration von nichtradioaktivem TGFβ1, die zehnmal so groß ist wie die von ¹²⁵I-TGFβ1 (negative Kontrolle). Spur C3: Vorinkubation erfolgte mit Peptid P29 in einer Konzentration, die 10⁶ mal so groß ist wie die molare Konzentration von ¹²⁵I-TGFβ1. Man erkennt, dass es eine Hemmung der Bindung von ¹²⁵I-TGFβ1 an die Zellrezeptoren vom Typ I, II und III sowohl durch Peptid P29 als auch durch nichtradioaktives TGFβ1 gibt.
8 (vergleichend). Autoradiogramm eines Affinitätsmarkierungstests der Rezeptoren von TGFβ1. Spuren C1 bis C6: Wirkung der Vorinkubation der MV-1-Lu-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Peptid P29 (10⁶, 8 × 10⁵, 6 × 10⁵, 4 × 10⁵, 2 × 10⁵ bzw. 10⁵mal die molare Konzentration von ¹²⁵I-TGFβ1), vor der Zugabe von ¹²⁵I-TGFβ1. Spur C7: Wirkung der Vorinkubation der MV-1-Lu-Zellen mit unmarkiertem TGFβ1 (10²mal die molare Konzentration von ¹²⁵I-TGFβ1), vor der Zugabe von ¹²⁵I-TGFβ1 (negative Kontrolle). Spur C8: Wirkung der Inkubation der MV-1-Lu-Zellen mit einer Konzentration von 0,42 μM ¹²⁵I-TGFβ1, was einer Aktivität von 0,4 μCi entspricht, ohne vorherige Vorinkubation (positive Kontrolle).
9. Prozentuale Hemmung von TGFβ1 (200 pg/ml) durch Rezeptorpeptide, von denen vorhergesagt wurde, dass sie komplementär zu Bereichen von TGFβ1 seien. Alle Peptide wurden mit einer Konzentration von 200 μg/ml getestet. Eine Hemmung von TGFβ1 von 100% entspricht dem Wachstum von MV-1-Lu-Zellen, das in Abwesenheit von TGFβ1 erhalten wird.
10. Prozentuale Hemmung von TGFβ1 (200 pg/ml) durch überlappende Peptide, die vom extrazellulären Bereich des Typ-III-Rezeptors abgeleitet sind. Alle Peptide wurden mit einer Konzentration von 200 μg/ml getestet. Eine Hemmung von TGFβ1 von 100% entspricht dem Wachstum von MV-1-Lu-Zellen, das in Abwesenheit von TGFβ1 erhalten wird.
11. Prozentuale Hemmung von TGFβ1 (200 pg/ml) durch überlappende Peptide, die vom extrazellulären Bereich des Typ-III-Rezeptors abgeleitet sind. Alle Peptide wurden mit einer Konzentration von 200 μg/ml getestet. Eine Hemmung von TGFβ1 von 100% entspricht dem Wachstum von MV-1-Lu-Zellen, das in Abwesenheit von TGFβ1 erhalten wird.
12. Prozentuale Hemmung von TGFβ1 (200 pg/ml) durch überlappende Peptide, die vom extrazellulären Bereich des Typ-III-Rezeptors abgeleitet sind. Alle Peptide wurden mit einer Konzentration von 200 μg/ml getestet. Eine Hemmung von TGFβ1 von 100% entspricht dem Wachstum von MV-1-Lu-Zellen, das in Abwesenheit von TGFβ1 erhalten wird.
13. Prozentuale Hemmung der Aktivität von TGFβ1 (200 pg/ml) in Gegenwart von unterschiedlichen nominellen Konzentrationen von Peptid P54, filtriert (♦) und unfiltriert (•).
14. Prozentuale Hemmung von TGFβ1 (200 pg/ml) durch Rezeptorpeptide, die durch eine Modifikation des Peptids P54 (P139 bis P143) abgeleitet sind, und der Peptide, die vom humanen Typ-III-Rezeptor abgeleitet sind (Peptide P144 und P145). Alle Peptide wurden mit einer Konzentration von 200 μg/ml getestet. Eine Hemmung von TGFβ1 von 100% entspricht dem Wachstum von MV-1-Lu-Zellen, das in Abwesenheit von TGFβ1 erhalten wird.
15. Prozentuale Hemmung der Aktivität von TGFβ1 (200 pg/ml) in Gegenwart von unterschiedlichen nominellen Konzentrationen von Peptid 144 ohne Filtration.
16. Autoradiogramm eines Affinitätsmarkierungstests der Rezeptoren von TGFβ1. Spur C1: Vorinkubation erfolgte mit Peptid P144 in einer Konzentration, die 10⁶mal so groß ist wie die molare Konzentration von ¹²⁵I-TGFβ1. Spuren C2 und C3: Wirkung der Vorinkubation der Zellen mit einer Konzentration von nichtradioaktivem TGFβ1, die zehnmal so groß ist wie die von ¹²⁵I-TGFβ1 (negative Kontrolle). Spuren C4 und C5: Wirkung der Vorinkubation der Zellen mit einer Konzentration von 0,1 μM ¹²⁵I-TGFβ1, die einer Aktivität von 0,2 μCi entspricht (positive Kontrolle). Man erkennt, dass es eine Hemmung der Bindung von ¹²⁵I-TGFβ1 an die Zellrezeptoren sowohl durch Peptid P144 als auch durch nichtradioaktives TGFβ1 gibt.
17. Prozentuale Hemmung von TGFβ1 (200 pg/ml) durch Peptide, die vom humanen Typ-II-Rezeptor (P146), Fetuin (P147 bis P149) und Endoglin (P150 bis P154) abgeleitet sind. Alle Peptide wurden mit einer Konzentration von 200 μg/ml getestet. Eine Hemmung von TGFβ1 von 100% entspricht dem Wachstum von MV-1-Lu-Zellen, das in Abwesenheit von TGFβ1 erhalten wird.
18 (vergleichend). Prozentuale Hemmung von TGFβ1 (200 pg/ml) durch Peptide, die von α2-Makroglobulin abgeleitet sind. Alle Peptide wurden mit einer Konzentration von 200 μg/ml getestet. Eine Hemmung von TGFβ1 von 100% entspricht dem Wachstum von MV-1-Lu-Zellen, das in Abwesenheit von TGFβ1 erhalten wird.
19. Prozentuale Hemmung der Bindung von TGFβ1 an MV-1-Lu-Zellen durch verschiedene synthetische Peptide. Die Hemmung wurde durch Messen des Prozentsatzes der markierten Zellen (emittieren Fluoreszenz) und der unmarkierten Zellen (emittieren keine Fluoreszenz) für jedes Peptid ("Material und Verfahren") untersucht.
20. Wirkung der Verabreichung von Peptid P144 auf die Collagensynthese während der experimentellen Zirrhoseinduktion mit CCl₄. Das Verhältnis von Collagen zu Gesamtprotein ist auf der Ordinate gezeigt. Die Abszisse zeigt die verschiedenen Gruppen von Ratten: Co = gesunde Ratten; Co + P144 gesunde Ratten, die mit dem Peptid P144 behandelt wurden; Tto₁ = Ratten, die einer Induktion der Zirrhose mit CCl₄ unterzogen wurden und denen das Peptid P144 während dieser Zeit an jedem zweiten Tag verabreicht wurde; und Ci₁ Ratten, die 11 Wochen lang einer Induktion der Zirrhose mit CCl₄ unterzogen und nicht mit dem Peptid P144 behandelt wurden.
21. Wirkung der Verabreichung von Peptid P144 auf die Collagensynthese während der experimentellen Zirrhoseinduktion mit CCl₄. Die Ordinate zeigt das Verhältnis der Fläche der Fibrose zur Gesamtfläche in mit Siriusrot angefärbten Gewebepräparaten. Die Abszisse zeigt die verschiedenen Gruppen von Ratten: Co = gesunde Ratten; Co + P144 = gesunde Ratten, die mit dem Peptid P144 behandelt wurden; Tto₁ = Ratten, die einer Induktion der Zirrhose mit CCl₄ unterzogen wurden und denen das Peptid P144 während dieser Zeit an jedem zweiten Tag verabreicht wurde; und Ci₁ = Ratten, die 11 Wochen lang einer Induktion der Zirrhose mit CCl₄ unterzogen und nicht mit dem Peptid P144 behandelt wurden.
22. Wirkung der Verabreichung von Peptid P144 auf die Collagensynthese, sobald die Zirrhose mit CCl₄ induziert wurde. Die Ordinate zeigt das Verhältnis von Collagen zu Gesamtprotein. Die Abszisse zeigt die verschiedenen Gruppen von Ratten: Co = gesunde Ratten; Co + P144 = gesunde Ratten, die mit dem Peptid P144 behandelt wurden; Tto₂ = Ratten, die einer Induktion der Zirrhose mit CCl₄ unterzogen wurden und denen das Peptid P144 am Ende dieser Zeit an jedem zweiten Tag verabreicht wurde; und Ci₂ = Ratten, die 11 Wochen lang einer Induktion der Zirrhose mit CCl₄ unterzogen und nicht mit dem Peptid P144 behandelt wurden.
23. Wirkung der Verabreichung von Peptid P144 auf die Collagensynthese, sobald die Zirrhose mit CCl₄ induziert wurde. Die Ordinate zeigt das Verhältnis der Fläche der Fibrose zur Gesamtfläche in Gewebepräparaten. Die Abszisse zeigt die verschiedenen Gruppen von Ratten: Co = gesunde Ratten; Co + P144 = gesunde Ratten, die mit dem Peptid P144 behandelt wurden; Tto₂ = Ratten, die einer Induktion der Zirrhose mit CCl₄ unterzogen wurden und denen das Peptid P144 am Ende dieser Zeit an jedem zweiten Tag verabreicht wurde; und Ci₂ = Ratten, die 11 Wochen lang einer Induktion der Zirrhose mit CCl₄ unterzogen und nicht mit dem Peptid P144 behandelt wurden.
24. Vergleich der Daten zur Menge des Collagens und der Fläche der Fibrose, die durch die beiden eingesetzten Techniken erhalten wurden. Die Abszisse zeigt die Werte des Verhältnisses der Fläche der Fibrose zur Gesamtfläche, die durch Bildanalyse erhalten wurden. Die Ordinate zeigt die Werte des Verhältnisses der Menge an Collagen in μg zur Menge des Gesamtproteins in mg, die durch spektrophotometrische Analyse von mit Direktrot und Echtgrün angefärbten Leberschnitten erhalten wurden. R² ist gezeigt (F ≤ 0,001).
25. Vergleich der Daten zur Menge des Collagens und der Fläche der Fibrose, die durch die beiden zur Untersuchung der Proben am Ende von Vorschrift 2 eingesetzten Techniken erhalten wurden. Die Abszisse zeigt die Werte des Verhältnisses der Fläche der Fibrose zur Gesamtfläche, die durch Bildanalyse erhalten wurden. Die Ordinate zeigt die Werte des Verhältnisses der Menge an Collagen in μg zur Menge des Gesamtproteins in mg, die durch spektrophotometrische Analyse von mit Direktrot und Echtgrün angefärbten Leberschnitten erhalten wurden. R² ist gezeigt (F ≤ 0,001).
26. Bilder, die repräsentativ für die 24 Felder sind, die durch Lichtmikroskopie (10fach) von mit Siriusrot angefärbten Rattenleberpräparaten erhalten wurden. Zirrhotische Ratten (Ci₁) am Ende der Induktion der Zirrhose mit CCl₄ und zirrhotische Ratten, die während der Induktion der Zirrhose mit CCl₄ mit P144 behandelt wurden (Tto₁). Verschiedene Felder wurden von Präparaten genommen, die von jedem Tier erhalten wurden (R = Ratte und C = Feld).
27. Bilder, die repräsentativ für die 24 Felder sind, die durch Lichtmikroskopie (10fach) von mit Siriusrot angefärbten Rattenleberpräparaten erhalten wurden. Zirrhotische Ratten (Ci₁) am Ende der Induktion der Zirrhose mit CCl₄ und zirrhotische Ratten, die während der Induktion der Zirrhose mit CCl₄ mit P144 behandelt wurden (Tto₁). Verschiedene Felder wurden von Präparaten genommen, die von jedem Tier erhalten wurden (R = Ratte und C = Feld). Ein Polarisations- und ein Grünfilter wurden verwendet, um die Collagenfasern zu zeigen.
28. Vergleich zwischen den beiden Gruppen der unbehandelten zirrhotischen Ratten. Ci₁ sind zirrhotische Ratten am Ende der 12 Wochen Induktion der Zirrhose mit CCl₄, Ci₂ sind zirrhotische Ratten 4 Wochen nach dem Ende des Vorgangs der Induktion der Zirrhose. P = 0,016. Ordinate: Fläche der Fibrose/Gesamtfläche.
Sequenzprotokoll

Claims

Peptidantagonist der Bindung von TGF-β1 an den Typ-III-TGF-β1-Rezeptor oder Endoglin, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid 9-15 Aminosäuren lang ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus folgenden besteht: a) einem Peptid, das ein Fragment von SEQ ID Nr. 3 umfasst, wobei das Fragment aus wenigstens 6 aufeinanderfolgenden Aminosäuren der SEQ ID Nr. 3 besteht; b) einem Peptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 3 umfasst; c) einem Peptid, das die Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6 und SEQ ID Nr. 7 besteht; und d) einem Peptid, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 8 oder SEQ ID Nr. 9 umfasst.
Verwendung wenigstens eines der Peptide gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für die Behandlung von Leberkrankheiten geeignet ist.
Verwendung wenigstens einer DNA, die für wenigstens eines der Peptide gemäß Anspruch 1 codiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zu sammensetzung, die für die Behandlung von Leberkrankheiten geeignet ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei die hergestellte pharmazeutische Zusammensetzung für die Behandlung von Leberfibrose geeignet ist.