RU2232771C2 - Пептиды, ингибирующие трансформирующий фактор роста tgfбета1 - Google Patents
Пептиды, ингибирующие трансформирующий фактор роста tgfбета1 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2232771C2 RU2232771C2 RU2001117230/04A RU2001117230A RU2232771C2 RU 2232771 C2 RU2232771 C2 RU 2232771C2 RU 2001117230/04 A RU2001117230/04 A RU 2001117230/04A RU 2001117230 A RU2001117230 A RU 2001117230A RU 2232771 C2 RU2232771 C2 RU 2232771C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- tgfβ1
- peptide
- peptides
- cells
- cirrhosis
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 218
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 106
- 230000012010 growth Effects 0.000 title abstract description 18
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 title abstract 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title description 15
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims abstract description 80
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims abstract description 66
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims abstract description 62
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 3
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract 5
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 claims description 27
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 claims description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 69
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 abstract 2
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 abstract 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 97
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 64
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 64
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 59
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 description 50
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 36
- 230000009471 action Effects 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 21
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 21
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 21
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 20
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 20
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 17
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 102000029316 human TGF-beta1 type III receptor (730-743) Human genes 0.000 description 14
- 108091022242 human TGF-beta1 type III receptor (730-743) Proteins 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100027303 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 Human genes 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 102100034681 Myeloblastin Human genes 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L Fast green FCF Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC(O)=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N formaldehyde Natural products O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001046 green dye Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 2
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 2
- 102000012085 Endoglin Human genes 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000017095 negative regulation of cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002695 phenobarbital Drugs 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical compound OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100036213 Collagen alpha-2(I) chain Human genes 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004214 Fast Green FCF Substances 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 101000875067 Homo sapiens Collagen alpha-2(I) chain Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100025751 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- YIQKLZYTHXTDDT-UHFFFAOYSA-H Sirius red F3B Chemical compound C1=CC(=CC=C1N=NC2=CC(=C(C=C2)N=NC3=C(C=C4C=C(C=CC4=C3[O-])NC(=O)NC5=CC6=CC(=C(C(=C6C=C5)[O-])N=NC7=C(C=C(C=C7)N=NC8=CC=C(C=C8)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+] YIQKLZYTHXTDDT-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108700032504 Smad2 Proteins 0.000 description 1
- 101150102611 Smad2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000010455 autoregulation Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 238000000006 cell growth inhibition assay Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 235000019240 fast green FCF Nutrition 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000018352 negative regulation of endocytosis Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000879 optical micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 208000007232 portal hypertension Diseases 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-L suberate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCCCC([O-])=O TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к синтетическим пептидам-антагонистам связывания трансформирующего фактора роста TGFβ1 с его рецепторами в организме с последовательностью, содержащей от 2 до 15 аминокислот, которые являются идентичными или схожими с аминокислотами природного трансформирующего фактора роста TGFβ1 и/или его рецепторов. Пептиды могут использоваться в качестве активных соединений для приготовления композиций, используемых при заболеваниях печени, в частности при фиброзе печени (циррозе). 1 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 табл., 28 ил.
Description
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рост клеток регулируется различными белками, относящимися к группе факторов роста (Schalch DS et al. (1979) Endocrinolody 104:1143-1151). Наиболее важные факторы роста связаны с развитием клеток и способны оказывать воздействие по аутокринному и паракринному механизмам, с участием трансформирующих факторов роста (TGFs) (Braun L. et al. (1988) Cell Biol. 85:1539-1543; Lyons RM and Moses HL (1990) Eur. J. Biochem. 187:467-473).
Термин "трансформирующий фактор роста TGF" впервые был использован для описания активности, продуцированной линией клеток, трансформированных под действием вируса саркомы у мышей или крыс (deLarco JE and Todaro GJ (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75:4001-4005; Mizel SB et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:2205-2208). Супернатант этих клеток обладал способностью индуцировать нормальный рост в мягком агаре таких клеток, для роста которых был необходим твердый носитель. Более детальные исследования выявили два класса трансформирующих факторов роста TGF, названных TGFα и TGFβ, которые, в свою очередь, включают семейства родственных белков. Семейство белков TGFβ включает 5 изоформ (Brand T. and Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27:5-18) димерной структуры (Schlunneger MP and Grutter MG (1992) Nature 358:430-434; Brand T. and Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27:5-18). Исследования зрелых очищенных белков, происходящих от одного вида, свидетельствуют о высокой степени идентичности последовательностей этих белков (таблица 1).
TGFβ1, который синтезирован как предшественник из 390 аминокислот, называют Pre-Pro-TGFβ1. При первом гидролизе высвобождается гидрофобный фрагмент, состоящий из 29 аминокислот, что приводит к появлению Pro-TGFβ1. Затем при следующем разрыве цепи на участке, который располагается перед С-концом TGFβ1 и который состоит из двух остатков аргинина, высвобождается зрелый TGFβ1 - появляется белок, состоящий из 112 аминокислот, с молекулярной массой 12 кДа. Для получения биологически активной формы два из этих мономеров соединяют вместе с помощью дисульфидных мостиков, получая при этом димер с молекулярной массой 25 кДа. Изменения этой структуры приводят к потере биологической функции (Barnard JA et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032:79-87).
Как известно, внутри структуры TGFβ1 существуют различные домены. Один из этих доменов, как обнаружено, располагается между аминокислотами 40 и 82 и участвует в связывании TGFβ1 с его клеточными рецепторами. (Quian SW et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6290-6294; Burmester JK et al. (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. 90:8628-8632).
Рецепторы трансформирующего фактора роста TGFβ1 и другие связывавшиеся белки
Охарактеризовано пять типов специфических рецепторов, связывающихся с TGFβ1 (Cheifetz S et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:17225-17228 and Lopez Casillas F. et al. (1991) Cell 67:785-795). Эти рецепторы обладают различным сродством к различным типам TGFβ1. До настоящего времени наилучшим образом изучены рецепторы типов I, II и III (обзор приведен Attisano L et. al. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1222:71-80; Derynck R. (1994) Trends Biochem. Sci. 19:548-553; Yingling et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1242:115-136). Также описаны рецепторы IV типа (МасКау К. and Daniel-pour D. (1991) J. Biol. Chem. 266:9907-9911) и рецепторы V типа Ichijo H. et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:22459-22464). Также сообщалось, что трансмембранные и цитоплазматические домены эндоглина (Cheifetz S et al. (1993) J. Biol. Chem. 267:19027-19030; Bellon T. et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2340-2345; Yamashita et al. (1995) J. Biol. Chem. 269:1995-2001; Zhang H. et al. (1996) J. Immunol. 156:564-573)) примерно на 70% схожи с рецепторами типа III, как человека, так и крысы.
RIII мог бы явиться подходящим для связывания с TGFβ1 и доставки к RII, который, в свою очередь, мог бы образовывать комплекс с RI (Yamashita et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:29172-20178) или к комплексам, в которых различные молекулы RI сочетаются с RII (Weiss G. and Massague J. (1996) EMBO J 15:276-289). RII-RI взаимодействия могли бы вызывать фософрилирование RI и последующую активацию им серин/треонинкиназы, что приводило бы к фософрилированию других молекул, несущих генетическую информацию, такого типа, как молекулы белков MADR2 (Macias-Silva M et al., (1996) Cell 87:1215-1224) (1).
Роль трансформирующего фактора роста TGFβ1 в дифференцировке и регенерации клеток печени
Оказываемое воздействие различается в зависимости от момента развития и типа клетки.
- Увеличение внеклеточного матрикса при воздействии на звездчатые клетки печени (Ito-клетки), основной источник матриксных белков (Mustce ТА et al. (1987) Science 237:1333-1336).
- Дифференцирование эпителиальных клеток и гепатоцитов (Florini JR et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:16509-16513).
- Ингибирование роста клеток в процессе регенерации печени. Этот эффект имеет огромное значение для сохранения клеточного статуса in vivo (Kato Y. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9552-9556).
- Ингибирование эндоцитоза рецепторов эпителиального фактора роста (EGF), как наблюдали в случае культуры гепатоцитов эмбриона крысы (Noda M. and Rodan GA (1987) J. Cell Physiol. 133:426-437).
Роль трансформирующего фактора роста TGFβ1 при фибриозе печени
Как было обнаружено, TGFβ1 связан с процессом фиброза печени (Czaja MJ et al. (1989) J. Cell Biol. 108:2477-2482; Annoni G. et al. (1992) J. Hepatol. 14:259-264), вызывая увеличение образования белков внеклеточного матрикса при участии звездчатых клеток печени (липоциты или Ito-клетки) или их рецепторов и ингибирование синтеза протеолитических ферментов, которые вызывают разрушение матрикса (Ignotz RA and Massague J. (1986) J. Biol. Chem. 261:4337-4345). В печени TGFβ1 индуцирует синтез коллагена и фибронектина в звездчатых клетках печени (Weiner FR (1990) Hepatology 11:111-117). Происходит также авторегуляция путем повышения его собственного синтеза, посредством индуцирования его под действием мРНК.
Также было обнаружено, что TGFβ1 связан с повышением образования α2-макроглобулина, синтезируемого гепатоцитами и активированного звездчатыми клетками печени. При связывании с TGFβ1, вызывая его инактивацию (Bachem MG (1994) Ann NY Acad. Sci. 737:421-424), а2-макроголобулин, как полагают, удаляет TGFβ1 из межклеточного пространства.
Исследования пациентов с хроническими расстройствами печени показали, что существует корреляция между экспрессией TGFβ1 и экспрессией мРНК для проколлагена типа I и уровнем в сыворотке пептида типа III проколлагена (Castilla A. et al. (1991) N. Engl. J. Med. 324:933-940).
Продолжительность жизни больных с циррозом печени меньше, чем обычная, вследствие осложнений, которые возникают при течении заболевания, таких, как портальная гипертензия и печеночная недостаточность.
Воздействие трансформирующего фактора роста TGFβ1 на межклеточный матрикс
Взаимодействие TGFβ1 с рецепторами клеток вызывает:
- Активацию синтеза проколлагена, фибронектина (Ignotz RA et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:6443-6446) и родственных белков, включая мембранные белки, способные взаимодействовать с компонентами межклеточного матрикса (Carter WG (1982) J. Biol. Chem. 257:13805-13815).
- Ингибирование синтеза протеолитических ферментов, способных вызывать разрушение матрикса (Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282).
- Стимулирование синтеза ингибиторов протеолитических ферментов (Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282).
Эти эффекты приводят к росту взаимодействия клеток с межклеточным матриксом, которые сочетаются с более выраженной перестройкой белков, из которых он состоит, и приводит к суммарному повышению количества межклеточного матрикса (Roberts CJ et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:4586-4592). Эти данные подтверждают, что TGFβ1 участвует в процессах рубцевания (Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282; Barnard JA et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032:79-87).
Пептиды в качестве ингибиторов взаимодействия лиганд-рецепторов
Существует возможность использования небольших молекул, синтетических пептидов, в качестве аналогов молекул, которые присутствуют в организме, в целях имитирования их действия. Исследования, проведенные ЛеСате с сотр. (LeSateur), показывают возможность использования циклических аналогов факторов роста нервов (NGF), имитирующих β кольцевой фрагмент, обусловливающий связывание факторов роста нервов с рецептором (LeSateur L. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:1120-1122). Также возможно использовать пептиды в качестве антагонистов этих молекул, предотвращая взаимодействие природного белка со своим рецептором блокировкой участия пептида (La-sarte JJ et al. (1994) J. Acquired Immune Deficiency Sydromes 7:129-134; LeSateur et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6564-6569). Предшествующие исследования показали возможность использования синтетических пептидов в качестве ингибиторов взаимодействия лиганд-рецептор, даже в случае, когда распознающий эпитоп не является непрерывным (Daniels AJ et al. (1995) Mol. Pharmacol. 48:425-432). Другие исследования, проведенные в отношении рецептора TGFβ1 типа II и в отношении фетуина-гликопротеина, относящегося к группе рецепторов типа II, показали возможность использования циклических пептидов в качестве ингибиторов взаимодействия TGFβ1 с RII (Demetriou М. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:12755-12761). При такой циклизации возможно получить пептиды, обладающие структурой, сходной со структурой, которая могла бы существовать in vivo.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с указанными выше причинами авторы настоящего изобретения полагали, что пептиды, полученные как из TGFβ1, так и из его рецепторов, или из белков, обладающих способностью к связыванию с TGFβ1, могли бы ингибировать действие TGFβ1. Таким образом, авторы настоящего изобретения решили рассмотреть эту возможность.
Выбор пептидов, которые необходимо синтезировать
Пептиды для синтеза выбирали различными способами, в зависимости от того, являлись ли они производными TGFβ1 или производными его рецепторов.
В случае последовательности TGFβ1, пептиды синтезировали из 15 аминокислот, которые входят в полную последовательность TGFβ1. Каждый пептид содержал 10 аминокислот подобно двум его ближайшим соседям.
В случае последовательности его рецепторов пептиды выбирали с использованием программного обеспечения, разработанного в лаборатории авторов настоящего изобретения. Одна из компьютерных программ позволяла сравнить две аминокислотные последовательности с целью предсказания частично комплементарных областей. Другие программы, которые также использовались, позволяли предсказать области белков, которые могли бы быть наиболее подвержены воздействию, исходя из гидрофобности и гидрофильности аминокислот, образующих их аминокислотную последовательность.
Синтез пептидов
Пептиды синтезировали твердофазным методом (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-54), используя флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) в качестве временной защитной группы для альфа-аминогруппы (Atherton et al. (1989) Journal of Chemical Society Perkins Transactions 1: 538-546). Для синтеза в небольшом количестве большого числа пептидов использовали многопозиционный синтезатор, позволяющий одновременно синтезировать 96 пептидов (Borras-Cuesta et al. (1991) Biologi-cals 19: 187-190). До использования пептиды хранили при температуре -80°С в твердом состоянии.
Очистка пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Синтезированные пептиды анализируют и очищают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя систему Waters 600Е-900 (Millipore Corp., Bedford, USA).
Для анализа пептидов методом аналитической ВЭЖХ используют колонку Waters Radial-Pak™ C18 300 
, 15 мкм, 8×100 мм (Millipore Corp., Bedford, USA). Пептид растворяют в 0,1% растворе трифторуксусной кислоты (TFA) в дистиллированной воде, до максимальной концентрации 1 мг/мл. Раствор пептида (100 мкл) вводят в колонку и элюируют градиентом вода/ацетонитрил (фиг.15) (Romil Ltd., Cambridge, USA), оба в 0,1% растворе TFA при скорости потока 1 мл/мин. Фракции, содержащие пептид, определяют по их поглощению при 220 нм и 280 нм (матричный фотодиодный детектор. Waters 991, Millipore Corp., Bedford, USA).
Для очистки пептидов используют колонку Waters DeltaPak™ C18 300 
, 15 мкм, 25×100 мм (Millipore Corp., Bedford, USA). Пептид растворяют и вводят (2 мл) в тех же самых условиях, как и в предыдущем случае, используя тот же самый градиент при скорости потока 5 мл/мин. Фракцию, которая содержит чистый пептид, собирают в колбу.
ТЕСТЫ IN VITRO, ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДОВ
Линии клеток
Используют линию, полученную из легочного эпителия норки, MV-1-Lu, (CCL-64, American Type Cell Culture, Virginia, USA). Клетки выращивают в колбах для культур площадью 162 см2 (Costar Corporation, Cambridge, USA) в термостате при 37°С и с 5% CO2, до слияния. Используют полную среду: RPMI 1640 с L-глутамином (CibcoBRL, Life Technologies Ltd., Paisley, Scotland), содержащую 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS, Biological Industries, Kubbutz Beit Haemek, Israel), 10 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты, HEPES (1 М HEPES Buffer, Bio-Whittaker, Verviers, Belgium) и антибиотики (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).
Тест на ингибирование роста клеток MV-1-Lu
Клетки линии MV-1-Lu, выращенные, как показано выше, удаляют со дна колбы с культурой, используя 5 мл смеси трипсин-ЭДТА (Biological Industries, Kubbitz Beit Haemek, Israel), ресуспендируют в полной среде и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 8 минут. После центрифугирования клетки ресуспендируют в полной среде до концентрации 50000 клеток в 1 мл. Для проведения теста берут 10 мл суспензии клеток и распределяют в 96-луночном плоскодонном планшете для культур клеток, помещая по 100 мкл в лунку (Costar Corporation, Cambridge, USA), и инкубируют в течение ночи при 37°С и 5% CO2, что приводит к адгезии клеток ко дну лунок. К концу указанного промежутка времени пептиды, которые необходимо исследовать, вносят в RPMI, до конечной концентрации 200 мкг/мл в присутствии TGFβ1 в RPMI в концентрации 200 пг/мл (R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Окончательная концентрация эмбриональной телячьей сыворотки в лунке составляет 2,5%. Через 24 часа инкубирования в каждую лунку добавляют 1 мкКи содержащего тритий тимидина (25 Ки/ммоль [метил-3H]-тимидин, производство фирмы "Amersham Life Science", Buckinghamshire, UK) и далее инкубируют в течение 12 часов (Grubeck-Loebenstein В. et al. (1989) J. Clin. Invest. 83:764-770; Brennan FM et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:278-285).
После окончания периода инкубирования клетки удаляют со дна лунок, используя смесь трипсин-ЭДТА, и собирают, используя ручной харвестер клеток (Titertek cell harvester, Skatron Instruments Inc., Sterling, USA), который разрушает клетки, собирая ДНК на нитроцеллюлозные фильтры (Filter MAT 11731, Skatron Instruments Inc., Sterling, USA), где осуществляют фиксацию. Фильтры помещают по отдельности в 5 мл полипропиленовые пробирки, в которые добавляют по 4 мл сцинтиллирующей жидкости (Biogreen-11, Reactivos Scharlau S.A., Barcelona, Spain). Активность каждой пробирки подсчитывают в течение 90 секунд с помощью β сцинтилляционного счетчика LKB (Beta plate system, LKB, Uppsala, Sweden).
Исследование ингибирования связывания трансформирующего фактора роста TGFβ1 с рецепторами клеток
Введение селективных меток в рецепторы клеток (введение аффинных меток)
Клетки линии MV-1-Lu удаляют со дна колбы с культурой, инкубируя их при 37°С в течение 10 минут с 10 мл раствора 1 (128 мМ NaCl, 5 мМ КСl, 25 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоната при рН 7,5, 5 мМ глюкозы и 1 мМ ЭДТА). Удаленные таким образом клетки ресуспендируют в растворе 2 (128 мМ NaCl, 5 мМ КСl, 50 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоната при рН 7,5, 1,2 мМ CaCl2, 1,2 мМ MgSO4 и 5 мг/мл БСА) и затем собирают центрифугированием при 1000×g в течение 5 минут. После центрифугирования клетки ресуспендируют в растворе 2 до концентрации 106 клеток на 1 мл.
Из полученной суспензии клеток отбирают аликвоты по 0,5 мл и помещают на 24-луночные планшеты (Greider GmbH, Frickenhausen, Germany), добавляют пептиды, в 50 мкл раствора концентрации 0,8 мг/мл, затем полученный продукт инкубируют в течение 2 часов при 4°С при перемешивании. Затем добавляют 125I-TGFβ1 (2 мкКи) до окончательной концентрации 277,2 пМ (рекомбинантный 125I-TGFβ1 человека, 800-2200 Ки/ммоль, производство фирмы "Amersham Life Science", Buckinghamshire, UK) и далее инкубируют в течение двух часов при 4°С при перемешивании.
После инкубирования клетки переносят в пробирки для центрифугирования и центрифугируют на холоде при 12000хg в течение 1 минуты. Затем дважды промывают холодным раствором 2 и ресуспендируют в 0,5 мл холодного раствора 2 с 5 мкл диметил-сульфоксида (DMSO 99,5%, производство фирмы "Sigma Chemical Co.", St. Louis, USA) и дисукцимидилсуберата (DSS, производство фирмы "Pierce Chemical Co.", Rockford, USA), устанавливая при этом окончательную концентрацию, равную 0,25 мМ DSS. Реакцию останавливают через 15 минут путем разбавления, центрифугируют и промывают раствором, содержащим 0,25 мМ сахарозы, 10 мМ Tris и 1 мМ ЭДТА при рН 7,4. Осадок клеток ресуспендируют в 0,5 мл Тритона Х-100 (производство фирмы "Bio-Rad Laboratories", Hercules, USA), 1% об./об., содержащем 10 мМ Tris при рН 7,0, 1 мМ ЭДТА, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 1 мкг/мл пепстатина и 1 мкг/мл лейпептина (производство фирмы "Sigma Chemical Co.", St. Louis, USA), и инкубируют в течение 40 минут при 4°С. Фракцию, которая нерастворима в детергенте, отделяют центрифугированием при 12000×g в течение 15 минут. Фракцию, которая растворима в детергенте (супернатант), и фракцию, которая нерастворима (осадок), замораживают при -20°С (Massague J. and Like В. (1985) J. Biol. Chem. 260:2636-2645).
Электрофорез белков в геле полиакриламида с додецилсульфатом
Фракции, растворимые и нерастворимые в детергенте, использовали для анализа методом электрофореза в гелях акриламид/бисакриламид с концентрацией 7,5% в течение 5-6 часов при напряжении 220 вольт.
Белки визуализируют окрашиванием раствором красителя кумасси бриллиантового голубого (comassie brilliant blue® (производство фирмы "Serva Feinbiochemica GmbH", Heidelberg, Germany)) в метаноле (50%), уксусной кислоте (10%) и дистиллированной воде в течение 30 минут. Последующее промывание осуществляют раствором метанола (50%), уксусной кислоты (10%) и дистиллированной воды в течение 15 минут для первого промывания, и с дальнейшими последовательными промываниями метанолом (2,5%), уксусной кислотой (0,5%) и дистиллированной водой до удаления окраски фона.
Проточная цитометрия
Ингибирование связывания TGFβ1 с рецепторами клеток при посредничестве пептидов измеряют методом прямой флуоресценции. Для этого используют флуоресцентный набор (Fluorokine rh TGFβ-biotin, R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK). Эта методика основана на способности биотинилированного TGFβ1 связываться с рецепторами клеток особым образом и последующем взаимодействии биотина с авидином, содержащим флуоресцентную метку, так что интенсивность сигнала будет зависеть от количества TGFβ1, связанного с рецепторами клеток.
Клетки линии MV-1-Lu, выращенные в колбах с площадью 162 см2, удаляют, используя раствср 1 (описанный выше) и ресуспендируют в физиологическом растворе для последующего центрифугирования при 500×g в течение 5 минут. После центрифугирования клетки опять ресуспендируют в физиологическом растворе при концентрации клеток 4×106 клеток в 1 мл. По 25 мкл этой суспензии клеток добавляют в боросиликатные пробирки размером 12×75 мм, в которые затем добавляют пептид, который необходимо исследовать, в 40 мкл среды RPMI 1640, получая при этом окончательную концентрацию 0,42 мкг/мкл, и 10 мкл биотинилированного TGFβ1. Для контроля специфичности добавляют 10 мкл биотинилированного реагента из набора, 10 мкл биотинилированного TGFβ1 добавляют в качестве положительного контроля и 20 мкл анти-TGFβ1 блокирующих антител добавляют в качестве отрицательного контроля. Физиологический раствор добавляют во все контрольные образцы до получения суммарного объема, равного 75 мкл. Все пробирки инкубируют в темноте в течение 1 часа при 4°С.
В конце периода инкубирования добавляют 10 мкл авидина, содержащего флуоресцентную метку, инкубируют в течение 30 минут в темноте при 4°С, после чего добавляют 2 мл промывочного раствора (RDF1), после чего центрифугируют при 500×g в течение 6 минут. Осадок клеток ресуспендируют в 0,2 мл холодного PBS для цитометрии (FACScan, Becton Dickinson Immummocytometry Systems, California, USA). Эта методика позволяет измерить флуоресценцию, излучаемую каждой клеткой в тех случаях, когда лазерный луч падает на нее, с помощью компьютерной программы (Lisys™ II, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, California, USA). На фиг.16 показано типичное изображение, получаемое при анализе методом проточной цитометрии.
Для того, чтобы получить данные, относящиеся к связыванию TGFβ1 с рецепторами, применяемый в тесте ″положительный контроль″ используют для установления границ областей, соответствующих меченным клеткам, которые связаны с TGFβ1-биотином (М2), и областей, которые соответствуют немеченым клеткам (M1). Как только границы областей установлены, рассчитывают процентное содержание клеток, содержащихся в каждой из них. Ту же самую процедуру осуществляют с данными, полученными в тех случаях, когда пептиды инкубируют с TGFβ1-биотином или с клетками, в зависимости от того, получены ли пептиды из рецепторов или от TGFβ1 соответственно. Используя эти данные, вычисляют величину ингибирования в процентах для каждого из пептидов, используя следующую формулу: 100-((М2 Пептид - М2 "Отрицательный контроль")·100/(М2 "Положительный контроль" - М2 "Отрицательный контроль")).
ЭКСПЕРИМЕНТЫ IN VIVO. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ФИБРОЗА
Использовали белых крыс-самцов (альбиносы линии Вистар) одного возраста (5 недель ± 1,5 недели) для того, чтобы получить группу, однородную по возрасту и исходному весу. В течение всего эксперимента животных содержали при постоянной температуре (22°С) и 12-часовом цикле освещение-темнота. Животным был предоставлен свободный доступ к воде и пище.
Цирроз печени (НС) вызывали путем ингаляций четыреххлористого водорода в течение 11 недель, два раза в неделю (
Novoa JM et al. (1976) Patologia IX:223-240; Camps J. et al. (1987) Gastroenterology 93:498-505). Выдержку под действием ССl4 осуществляли путем пропускания сжатого воздуха со скоростью 3 л/мин через промывную склянку для газов. Первоначально использовали выдержку, равную одной минуте, увеличивая затем выдержку на одну минуту в неделю, достигая 4 минут на четвертой неделе. В течение пятой недели ССl4 не вводили, а на шестой неделе начинали опять с выдержки, равной 5 минутам. Это время выдержки сохраняли вплоть до недели 11. К питьевой воде добавляли 400 мг/мл фенобарбитала (Luminal®, Bayer, Leverkusen, Germany), начиная за одну неделю до начала выдержки под действием ССl4 и вплоть до конца проведения эксперимента.
Перед началом лечения была оставлена одна неделя, в течение которой крысам не вводили ССl4. Во время лечения крысам вводили еженедельную дозу ССl4, как указано (фиг.2).
Распределение животных по группам
Перед началом индуцирования цирроза печени животные были распределены на 4 группы.
Контрольная группа здоровых животных (Со): животные, которых не подвергали процессу фиброза.
Контрольная группа здоровых животных, которых подвергали лечению (Со+Р144): животные, которых не подвергали процессу фиброза и которым вводили пептид Р144 в течение последних 3 недель (совпадающих по времени со временем лечения крыс в группе Tto2).
Контрольные группы 1 животных, подвергнутых циррозу (Ci1): животные, которых подвергали индуцированию процесса фиброза путем ингаляций ССl4 два раза в неделю. По достижению пятой недели этих животных разбили на 2 группы:
Контрольная группа 1 животных, подвергнутых циррозу (Ci1): животные, которых продолжали подвергать процессу индуцирования фиброза вплоть до недели 11 и которым не вводили пептид Р144. Этим животным на протяжении процесса индуцирования через день вводили сыворотку в солевом растворе (недели от 5 до 11).
Группа 1 животных, подвергнутых циррозу и лечению (Tto1): животные, которым вводили пептид Р144, полученный из последовательности рецептора типа III, через день, во время процесса индуцирования фиброза, недели от 5 до 11. Контрольные группы 2 животных, подвергнутых циррозу (Сi2): животные, которых продолжали подвергать процессу индуцирования фиброза, и не получавшие ни пептид Р144, ни сыворотку в солевом растворе. Эту группу по достижении недели 11 разделили на две другие группы.
Контрольная группа 2 животных, подвергнутых циррозу (Ci2): животные, подвергнутые циррозу, которые не получали какое-либо лечение, сохранялись в качестве контрольной группы. Эти животные получали инъекции сыворотки в солевом растворе в течение 3 недель (недели от 13 до 15).
Группа 2 животных, получавших лечение (Tto2): животные, подвергнутые циррозу, получавшие пептид, полученный из последовательности рецептора типа III (Р144) в течение 3 недель (недели от 13 до 15).
Лечение животных
- Группа Tro1: этих животных подвергали лечению во время процесса фиброза. Лечение с использованием пептида начали на пятой неделе (перед выдержкой под действием ССl4 в течение 5 минут) и продолжали вплоть до конца одиннадцатой недели процесса индуцирования цирроза.
- Группа Tto2: этих животных подвергали лечению после завершения процесса индуцирования цирроза (11 недель). Лечение начали через одну неделю после последней ингаляции ССl4 и продолжали в течение 21 дня.
Перед началом лечения и после его завершения у всех животных, получавших пептид, брали кровь. Пептид вводили путем подкожных инъекций в абдоминальную область в дозе 70 мкг на животное в 500 мкл физиологического раствора.
Сакрификация животных и иссечение печени
После завершения введения пептида животным, как в случае модели на крысах, так и в случае модели на мышах, животных сакрифицировали декапитацией, после взятия у них крови из заглазничного сплетения с помощью капилляра.
Сразу же после этого иссекали печень и собирали образцы.
Образцы разрезали и помещали в фиксирующий раствор - формалин для последующих гистологических исследований. Другие фрагменты помещали в криопробирки, которые помещали в жидкий азот и хранили затем при -80°С. Анатомопатологические исследования печени
Для гистологических исследований использовали фрагменты печени, предварительно зафиксированные в формалине по меньшей мере в течение 24 часов, после чего помещенные в этанол (70%).
После дегидратации препараты заделывали в парафиновые блоки. Из полученных блоков готовили последовательные срезы толщиной 3 мкм, используя дисковый микротом Лейтца и стальные лезвия. Перед окрашиванием срезы депарафинировали в ксилоле (AnalaR, BDH, Poole, UK) в течение 15 минут, после нагревания их при 60°С в термошкафу в течение 15 минут и затем гидратировали последовательными обработками спиртом понижающейся концентрации: 100%, 96%, 80% и 70%, и окончательно - водой. Использовали следующие красители:
- Гематоксилин-эозин.
- Трихромовый Мэссона (Locquin M. and Langeron, (1985) in Manual de Microscopia Ed. Labor S.A. Barcelona): Uses a specific dye for collagen proteins (green light).
- Сириус красный: краситель, специфичный для коллагена.
Подтверждение фиброза печени: анализ изображений
Для анализа изображений полученных образцов использовали оптический микроскоп (Olympus BH-2, Tokyo, Japan), соединенный с видеокамерой (Sony DXP-950P, Sony Co., Tokyo, Japan), с помощью которой получали фотографические снимки различных участков препарата. Шесть участков каждого из препаратов, выбранные случайным образом, окрашивали красителем сириус красный. Различные полученные изображения анализировали с использованием компьютерных программ (Visilog 4.1.5, Noesis, Orsay, France), которые позволяли рассчитать площадь участков, подвергнутых фиброзу, и общую площадь препарата. Из этих данных для каждого участка вычисляли показатель фиброза (площадь участков, подвергнутых фиброзу/общая площадь). Для того, чтобы использовать указанную программу, было необходимо модифицировать систему получения изображений путем использования поляризационных светофильтров (Olympus U-POT, Tokyo, Japan), и светло-зеленых фильтров (Olympus IF550, Tokyo, Japan), что позволило автоматизировать процесс анализа образцов.
Определение коллагена в срезах тканей, обработанных парафином, толщиной 14 мкм
Срезы толщиной 14 мкм, которые использовали для анализа этим методом, получали таким же способом, как и описанные выше срезы толщиной 3 мкм. Эти срезы подвергали депарафинированию в течение 12 часов в ксилоле. После того, как парафин был удален, образцы гидратировали последовательным пропусканием через спирт понижающейся концентрации: 96%, 80%, 50% и окончательно - дистиллированную воду.
После гидратации образцы подвергали предварительному окрашиванию в растворе 160 мг зеленого красителя Fast Green FCF (Fluka Chemica-BioChemica, Buchs, Switzerland) в 160 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты (Merck, Darmstadt, Germany) в течение 15 минут в темноте. Образцы промывали, погружая в воду до тех пор, пока они не перестанут окрашивать промывные воды. После того, как избыток красителя был удален, образцы окрашивали в течение 30 минут в темноте в растворе красного красителя 160 мг Direct Red 80 (Fluka Chemica-BioChemica, Buchs, Switzerland) и 64 мг зеленого красителя Fast Green, оба красителя в 160 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Образцы опять промывали, погружая в воду до тех пор, пока они не перестанут окрашивать промывные воды, и затем образцы снимали с предметного стекла, соскабливая небольшим шпателем. Снятые таким образом срезы помещали в отдельные пробирки, содержащие 3 мл 0,1 н раствора NaOH (Quimon, Montplet&Esteban S.A., Barcelona, Spain) и метанол (1:1). Отбирали аликвоты из различных пробирок для спектрофотометрического исследования (Lambda 2 UV/VIS spectrophotometer, Perkin-Elmer, Norwalk, USA) при длине волны 540 нм и 630 нм, используя в качестве раствора сравнения аликвоту смеси 0,1 н. раствора NaOH и метанола (Lopez de Leon A. and Rojkind (1985) Histochem. Cytochem. 33:737-743; Gaudio E. et al. (1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469).
Согласно работам Гаудио и сотр. (1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469), для определения количества коллагена и суммарного белка использовали следующие формулы:
Статистический анализ полученных результатов
Данные, полученные в экспериментах in vivo, были подвергнуты статистическому анализу. Соответствие количественных значений переменных нормальному распределению проверяли с помощью теста Шапиро-Вилкса.
В тех случаях, когда данные не соответствовали нормальному распределению, применяли непараметрический статистический анализ. Сравнение между группами осуществляли, используя Н критерий по Крускал-Валлис (Kruskal-Wallis) с последующим сравнением с U критерием по Манн-Уитни (Mann-Whitney). Полученные данные представлены графически в виде прямоугольников, с изображением среднего значения полученных данных (жирная линия внутри каждого прямоугольника) наряду с интерквартильной широтой (высота прямоугольника), где "усы" каждого из прямоугольников представляют наибольшее и наименьшее значение, относящееся к данной интерквартильной широте.
Связь между переменными изучали, используя точный критерий Фишера. Для определения независимости этих переменных использовали логистическую регрессию.
Значения Р, равные или меньшие 0,05, рассматривали как статистически значимые.
Все указанные методы статистического анализа осуществляли, используя программу SPSS для Windows версии 6.1.3.
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА TGFβ1 IN VITRO
Исследование ингибирования роста клеток линии MV-1-Lu
Трансформирующий фактор роста TGFβ1 представляет собой цитокин, который способен ингибировать рост клеток линии MV-1-Lu in vitro (Grubeck-Loebenstein В. et al. (1989) J. Clin. Invest. 83:764-770; Brennan FM et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:278-285), поэтому эту линию использовали для исследования блокирующего действия пептидов на TGFβ1. После различного комбинирования среды, клеток и тимидина авторы настоящего изобретения исследовали влияние различных концентраций TGFβ1 на связывание [метил-3Н] тимидина клетками линии MV-1-Lu в культуре, для того, чтобы определить наиболее подходящие условия для проведения теста. Эти условия показаны на фиг.3.
После того, как была определена оптимальная концентрация клеток линии MV-1-Lu (5000 клеток на лунку) и наименьшая концентрация TGFβ1, способная вызывать ингибирование, равное около 90% (200 пг/мл, фиг.18), ингибирующий эффект синтетических пептидов исследовали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование активности трансформирующего фактора роста TGFβ1 in vitro синтетическими пептидами
Синтетические пептиды, которые являются потенциальными ингибиторами активности TGFβ1, выбранные таким образом, как показано выше в разделе "Выбор пептидов, которые необходимо синтезировать" (как пептиды, полученные из белков, которые связываются с TGFβ1, так и пептиды, полученные из самого TGFβ1) были исследованы с использованием линии клеток MV-1-Lu. Пептиды растворяли в забуференной среде RPMI, не содержащей эмбриональную телячью сыворотку, и использовали следующую методику:
пептиды, принадлежащие последовательности рецептора или комплементарные максимумам гидрофильности TGFβ1, инкубируют в течение 30 минут в присутствии этого цитокина и соединяют с культурой клеток. Пептиды, полученные из последовательности TGFβ1, добавляют к культуре клеток перед добавлением TGFβ1, поскольку они взаимодействуют с рецепторами поверхности клеток.
Это инкубирование осуществляют в 100 мкл той же самой среды, которую использовали при добавлении клеток. Активные пептиды воздействуют на рост клеток в большей или меньшей степени в зависимости от их способности ингибировать TGFβ1.
Ингибирование активности TGFβ1 пептидами, полученными из TGFβ1
На первой стадии были синтезированы пептиды с перекрывающимися последовательностями, полученные из TGFβ1. Эти пептиды (таблица 2) были синтезированы в надежде на то, что некоторые из них могли бы связываться с рецепторами клеток, препятствуя таким образом связыванию природного TGFβ1 с этими рецепторами.
На фиг.4 показано ингибирующее действие пептидов, приведенных в таблице 6, на активность TGFβ1. Поскольку TGFβ1 ингибирует рост клеток линии MV-1-Lu, ингибирование этого цитокина пептидами приводит к изменениям в росте клеток линии MV-1-Lu.
Как можно видеть из данных, приведенных на фиг.4, пептид Р12, полученный из последовательности TGFβ1, является одним из тех пептидов, которые проявляют наибольшую ингибирующую активность в отношении TGFβ1. Для более подробного изучения ингибирующего действия пептида Р12 было проведено исследование влияния концентрации пептида на ингибирование активности цитокина, описанное ниже.
Влияние дозы пептида на ингибирование активности TGFβ1 под действием пептида Р12
Исследовали влияние концентрации пептида Р12 на ингибирование активности TGFβ1 под действием Р12. Поскольку этот пептид не очень хорошо растворяется в исследуемой среде, исходные растворы или суспензии готовили в номинальной концентрации пептида (то есть такой концентрации, которая была бы достигнута, если бы пептид растворился полностью) и брали аликвоты таких растворов или суспензий, или даже использовали такие растворы и суспензии непосредственно в исследованиях ингибирования.
На фиг.5 показана оценка ингибирующего действия номинальной концентрации пептида, до и после фильтрации. Можно видеть, что пептид Р12 как после фильтрации, так и без фильтрации обладает одинаковой активностью.
После того, как были получены данные для пептида Р12, авторы настоящего изобретения решили удлинить пептид, как со стороны N-конца, так и со стороны С-конца, и исследовать влияние этого на активность пептида. В дополнение, были внесены изменения в аминокислотную последовательность пептида для того, чтобы увеличить его растворимость и определить значение двух цистеиновых остатков в его аминокислотной последовательности для ингибирования активности TGFβ1. Структура синтезированных пептидов показана в таблице 3.
На фиг.6 показаны результаты ингибирования активности TGFβ1 под действием пептидов, приведенных в таблице 3.
Из данных, приведенных на фиг.6, можно видеть, что пептид Р29 является активным. Этот пептид включает ранее исследованный пептид Р12 и содержит 9 дополнительных аминокислот со стороны N-конца (фиг.4). Исследования, проведенные рядом авторов (Quian SW et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:6290-6294) and by Burmester JK et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:8628-8632) с использованием химерных рекомбинантных белков, идентифицированных как участок TGFβ1, который необходим для проявления активности этого цитокина (аминокислоты от 40 до 82 в последовательности зрелого полноразмерного TGFβ1). Предполагалось, что пептид Р29 (аминокислоты от 34 до 56 в последовательности зрелого полноразмерного TGFβ1), более протяженный, чем пептид Р12 (аминокислоты от 43 до 56), может приобретать трехмерную структуру, более схожую по действию со структурой TGFβ1. По этой причине пептид Р29 использовали для исследования связывания с рецепторами клеток, основанном на введении аффинных меток.
Исследование ингибирования связывания TGFβ1 с его рецепторами в присутствии пептида Р29 (введение аффинных меток)
Пептид Р29, полученный из аминокислотной последовательности TGFβ1, использовали в исследованиях, связанных с введением аффинных меток для подтверждения способности этого пептида ингибировать связывание TGFβ1 с соответствующими ему рецепторами клеток (Материалы и методы).
Вследствие различной активности использовавшихся партий 125I-TGFβ1, концентрацию пептида, использовавшегося при проведении исследования, в каждом случае приводили в соответствие с использовавшейся партией 125I-TGFβ1. Результаты этих исследований показаны на фиг. 7 и 8.
Дальнейшие исследования проводили для того, чтобы найти минимальную концентрацию, необходимую для блокирования связывания 125I-TGFβ1 с рецепторами клеток.
Ингибирование активности TGFβ1 пептидами, полученными из аминокислотной последовательности рецептора типа III крысы
С целью поиска новых пептидов, которые являются ингибиторами активности трансформирующего фактора роста TGFβ1, были синтезированы пептиды, полученные из рецептора типа III крысы. На основе строения областей аминокислотных последовательностей были выбраны некоторые пептиды, которые, как предполагалось, являются комплементарными блокам аминокислот в аминокислотной последовательности TGFβ1. Авторы настоящего изобретения надеялись, что эти пептиды будут способны к связыванию со свободным TGFβ1, связываясь с ним и предотвращая тем самым связывание TGFβ1 с рецепторами клеток.
Были синтезированы другие пептиды посредством перекрывания 10 аминокислот и "накрывания" части внеклеточной области рецептора типа III (аминокислоты от 45 до 410). Сообщалось, что существует растворимый рецептор типа III, который соответствует внеклеточной области рецептора, этот участок вырезают из мембраны и он действует как средство для вывода TGFβ1 из обращения (
Casillas F. et al. (1991) Cell 67:785-795). В более поздних работах описаны два возможных участка, ответственных за связывание с трансформирующим фактором роста TGFβ1, один из которых локализуется у N-конца рецептора (
Lopez-Casillas et al. (1994) J. Cell Biol. 124:557-568), а другой располагается в области, ближайшей к мембране, по направлению к С-концу (Fukushima D. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22710-22715; Pepin MC et al. (1995) FEBS Lett 377:368-372). На основании этого были синтезированы пептиды внеклеточной области этого рецептора, при предположении, что эти пептиды могли бы быть способны к связыванию находящегося в обороте TGFβ1.
Пептиды, приведенные в таблице 4, были исследованы в отношении их способности блокировать на модели ингибирование роста клеток линии MV-1-Lu. Поскольку TGFβ1 способен ингибировать рост клеток этой линии, ингибирование трансформирующего фактора роста TGFβ1 пептидами могло бы вернуть клеткам способность к росту. Эти исследования показаны на фиг. от 9 до 12.
Как можно видеть на фиг. от 9 до 12, существуют различные пептиды, которые способны ингибировать рост клеток линии MV-1-Lu в большей или меньшей степени, но только пептид Р54 способен почти полностью ингибировать активность TGFβ1. Для более детального изучения этого пептида были проведены исследования влияния различных концентраций пептида на активность TGFβ1 при фиксированной концентрации TGFβ1, равной 200 пг/мл.
Исследование влияния дозы на ингибирование активности TGFβ1 под действием пептида Р54
Исследовали влияние концентрации пептида Р54 на ингибирование активности TGFβ1. Вследствие низкой растворимости этого пептида готовили исходный раствор номинальной концентрации пептида, таким же образом, как и в случае пептида Р12, брали аликвоты такого раствора и фильтровали или даже использовали непосредственно в исследованиях ингибирования.
На фиг.13 показано ингибирующее действие пептида, используемого в номинальной концентрации, до и после фильтрации. Можно видеть, что при использовании фильтрата пептида Р54 не наблюдается измеримого ингибирования активности.
Подтвердив способность пептида Р54 ингибировать активность TGFβ1 таким образом, что ингибирование зависит от используемой дозы пептида, авторы настоящего изобретения перешли к синтезу новых пептидов, взяв за основу аминокислотную последовательность пептида Р54, с целью попытаться улучшить растворимость и, следовательно, увеличить активность пептида при использовании в меньших дозах. Также были синтезированы два пептида, полученные из рецептора типа III человека. Один из этих пептидов (Р144) был эквивалентен пептиду Р54. Другой пептид (Р145) сходен с пептидом Р106 рецептора типа III крысы, который также проявлял активность. Эти новые пептиды показаны в таблице 5.
Результаты исследования активности пептидов, приведенных в таблице 5, показаны на фиг.14.
Исследование влияния дозы ингибирования TGFβ1 под действием пептида Р144
Проводили исследование влияния дозы на величину достигаемого эффекта ингибирования под действием пептида Р144, полученного из последовательности рецептора типа III человека, для того, чтобы определить, зависит ли активность этого пептида от концентрации (фиг.15). Можно видеть, что активность пептида снижается при понижении концентрации пептида, используемого в тестах.
Исследование ингибирования связывания TGFβ1 с его рецепторами под действием пептида Р144 (введение аффинных меток)
Пептид Р144, полученный из последовательности рецептора типа III человека, использовали в исследованиях, связанных с введением аффинных меток, для подтверждения способности этого пептида ингибировать связывание TGFβ1 с его клеточными рецепторами (Материалы и методы).
Вследствие различной активности использовавшихся партий 125I-TGFβ1, концентрацию пептида, использовавшегося при проведении исследования, в каждом случае приводили в соответствие с использовавшейся концентрацией партии 125I-TGFβ1. Результаты этих исследований показаны на фиг.15.
После подтверждения ингибирования связывания трансформирующего фактора роста TGFβ1 с соответствующими ему рецепторами под действием пептида Р144, дальнейшие исследования проводили для того, чтобы "оттитровать" пептид Р144. Было обнаружено, что пептид теряет свою активность при концентрации, равной 2×105 молярной концентрации 125I-TGFβ1.
Ингибирование трансформирующего фактора роста TGFβ1 под действием пептидов, полученных из других белков, способных связывать трансформирующий фактор роста TGFβ1 и согласно предположениям, являющихся комплементарными трансформирующему фактору роста TGFβ1
В этой серии синтезированы пептиды, структура которых приведена в таблице 6, полученные из белков, способных к связыванию с TGFβ1.
На фиг. 17 и 18 показана ингибирующая активность пептидов, приведенных в таблице 6.
Как можно видеть на фигурах 17 и 18, только пептид Р150 проявляет активность большую, чем 50%. Однако было обнаружено, что пептиды Р146 и Р149, которые, как сообщалось Деметриу и др. (Demetriou M et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:12755-12761) обладают активностью, не проявляли активность в условиях этого исследования.
Измерения методом проточной цитометрии ингибирующего действия синтетических пептидов на связывание трансформирующего фактора роста TGFβ1 с его рецепторами
Пептиды, полученные предыдущими синтезами, как пептиды, которые были синтезированы из последовательности TGFβ1, так и пептиды, которые были синтезированы из рецептора типа III, использовали для измерения методом проточной цитометрии их способности ингибирования связывания TGFβ1 с рецепторами клеток. При проведении этих исследований клетки инкубировали с пептидом перед добавлением авидин-FITS (Материалы и методы). Затем измеряли интенсивность флуоресценции авидин-FITS: интенсивность флуоресценции будет прямо пропорциональна количеству TGFβ1, связанного с клетками, и обратно пропорциональна активности пептида. Результаты, полученные для пептидов, представляющих наибольший интерес, показаны на фиг.19 и в таблице 7.
ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА TGFβ1 IN VIVO
Пептид Р144, полученный из последовательности рецептора типа III человека, активность указанного пептида была подтверждена биоанализом ингибирования роста клеток линии MV-1-Lu, использовали в исследованиях in vivo для изучения ингибирующего действия пептида по индуцированию экспериментального цирроза под воздействием ССl4 на модели у крыс. Эксперимент, моделирующий цирроз у крыс линии Вистар
На этой модели цирроз печени индуцировали ингаляцией четыреххлористого углерода в течение 11 недель, дважды в неделю (Lopez Novoa JM et al. (1976) Patologia IX:223-240; Camps J. et al. (1987) Gastroenterology 93:498-505), как описано в "Материалы и методы".
Пептид Р144 вводили в соответствии с двумя методиками:
1. Методика 1: пептид вводили через день внутрибрюшинно в течение процесса индуцирования цирроза (11 недель). Фиг. 20 и 21.
2. Методика 2: пептид вводили через день внутрибрюшинно в течение 3 недель, после того, как цирроз сформировался, а именно, с 12 недели после начала процесса индуцирования цирроза. Фиг. 22 и 23.
Образование коллагена при использовании и первой, и второй методики определяли с помощью двух методов:
На фиг. 36 и 38 показано суммарное количество образовавшегося коллагена, измеренное путем окрашивания срезов печени (два на животное) красителями зеленым Fast Green и красным Direct Red, с последующим элюированием окраски и спектрофотометрическим детектированием (материалы и методы) (Lopez de Leon A. and Rojkind (1985) Histochem. Cytochem. 33:737-743; Gaudio E. et al. (1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469).
На фиг. 21 и 23 показано количество образовавшегося коллагена, измеренное методом анализа изображений срезов печени, окрашенных красителем сириус красный, с использованием оптического микроскопа (материалы и методы).
Как можно видеть на фиг. 20, при анализе величины соотношения коллагена к суммарному белку наблюдаются статистически значимые различия (Р<0,05) между группами крыс, получавших пептид Р144 (Tto1), и контрольной группой крыс, подвергнутых циррозу (Ci1). На фиг.37, в том случае, когда рассматривается площадь участков, подвергнутых фиброзу, также видны статистически значимые различия (Р<0,001) между группами крыс, получавших пептид Р144 (Tto1), и контрольной группой крыс, подвергнутых циррозу (Cl1).
Как можно видеть на фиг. 22 и 23, на которых приведены результаты, относящиеся к крысам, получавшим пептид после того, как цирроз сформировался, различия между группой крыс, получавших пептид Р144 (Tto2), и группой крыс, не получавших пептид (Ci2), не являются статистически значимыми в тех случаях, когда для оценки фиброза используется какая-либо из указанных двух методик.
Было проведено сравнение двух методик, использованных для определения количества коллагена, с использованием регрессионного анализа, с целью проверить случайность выбора полей для исследования в каждом из препаратов и, следовательно, проверить достоверность анализа изображений, фиг. 24 и 25.
Как можно видеть на фиг. 24 и 25, существует корреляция между двумя методиками с R>0,85 в том и другом случаях, которая является статистически значимой (F<0,001). Это подтверждает, что выбор изображений для исследования осуществлялся совершенно случайно и, таким образом, подтверждает достоверность данных, полученных методом анализа изображений.
На фиг. 26 и 27 показаны изображения, полученные в оптическом микроскопе для препаратов печени, окрашенных красителем сириус красный при увеличении 10Х, полученных из печени крыс, получавших пептид во время индуцирования процесса цирроза (Ci1 и Tto1).
Изображения, приведенные на фиг. 26, были получены без использования какого-либо фильтра.
На фиг. 27 приведены изображения, после того, как они были модифицированы для исследования с использованием специальных компьютерных программ. Эти модификации заключаются в использовании двух светофильтров, одного - поляризационного светофильтра, а другого - зеленого светофильтра, для улучшения качества изображения и облегчения их автоматизированной оценки.
Фиг. 26 и 27 позволяют обнаружить различия между изображениями препаратов, полученных от крыс, подвергнутых циррозу (Ci1), и таких же крыс, получавших пептид Р144 (Tto1).
Различия в эффективности методик 1 и 2 могут быть следствием того факта, что продуцирование TGFβ1 может быть значительно ниже в том случае, когда цирроз уже вызван (методика 2), чем во время индуцирования процесса цирроза под воздействием ССl4 (методика 1), и даже может находиться на обычном уровне, так что влияние обработки пептидом Р144 может быть менее выражено в случае использования методики 2, чем в случае использования методики 1.
При сравнении группы крыс, не получавших пептид, в конце процесса индуцирования цирроза (Сi1), с группой крыс, не получавших пептид, подвергнутых циррозу, на четвертой неделе после завершения процесса индуцирования цирроза (Ci2), авторы настоящего изобретения обнаружили, что существуют статистически значимые различия (Р=0,016) между этими двумя группами (фиг.28), которые могут означать, что имеется частичная регрессия цирроза в тех случаях, когда устраняют действие агента, вызывающего цирроз, что отмечалось рядом авторов (Szende-В et al. (1992) In Vivo 6:355-361; Columbano A (1996) Carcinogenesis 17:395-400).
Указанные различия в эффективности двух методик могут также быть следствием самих методик, т. к. согласно методике 2 животных подвергают лечению только в течение 3 недель через день, в то время как согласно методике 1 животных подвергают лечению в течение более длительного времени (7 недель, также через день).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что вполне возможно ингибировать активность трансформирующего фактора роста TGFβ1 как in vitro, так и in vivo под действием синтетических пептидов, полученных из различных белков. В будущем представляло бы большой интерес попытаться повысить биологическую активность этих пептидов. Это могло бы быть осуществлено путем систематической замены каждой из аминокислот, входящих в их последовательность, другими 19. Как только пептид с более высокой активностью будет получен, будет необходимо получить их мимеотопы (McConnell-SJ (1994) Gene 151:115-118; Steward-MW (1995) J. Virol. 69:7668-7673), для того, чтобы увеличить среднюю продолжительность жизни ингибирующего агента в организме.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг.1. Ингибирование связывания TGFβ1 с клетками линии MV-1-Lu под действием пептида Р144, измеренное методом проточной цитометрии. Изображение А, полученное при исследовании клеток, инкубированных с биотинилированным TGFβ1 и выращенных с авидин-FITC. Изображение В, полученное при исследовании клеток, инкубированных с авидин-TCFβ1 без предшествующего добавления TGFβ1. Изображение С, полученное при исследовании клеток, инкубированных с TGFβ1 и предварительно инкубированных с пептидом Р144 в концентрации 0,42 мкг/мкл, и выращенных с авидин-FITC. На оси абсцисс указано измеренное значение интенсивности флуоресценции, а на оси ординат указано количество клеток, соответствующее этому значению интенсивности флуоресценции. Также показаны области, соответствующие клеткам, меченным TGFβ1-биотином и авидин-FITC (М2), и клеткам, не содержащим метку (M1).
Фиг.2. Схематическое представление процесса цирроза под действием ССl4. Черные стрелки показывают, когда крысам вводили две недельные дозы ССl4, а черные стрелки с пунктиром показывают, когда крысам вводили одну недельную дозу. Серые стрелки показывают введение пептида Р144. А: контрольная группа здоровых крыс; В: контрольная группа здоровых крыс + Р144, B1: с пептидом в количестве 70 мкг/день; С: группа крыс, подверженных циррозу; C1 с солевым раствором; C2 с пептидом в количестве 70 мкг/день; D: группа крыс, подверженных циррозу под воздействием ССl4+фенобарбитала; D1 плюс солевой раствор; D2 плюс пептид в количестве 70 мкг/день.
Фиг.3. Влияние TGFβ1 на рост клеток линии линии MV-1-Lu. Клетки выращивали при плотности 5000 клеток на лунку и при указанной концентрации TGFβ1, пг/мл. По оси абсцисс: концентрация TGFβ1 (пг/мл); по оси ординат: число циклов в минуту (с.р.m.).
Фиг.4. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) под действием пептидов, полученных из TGFβ1. Все пептиды тестировали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование TGFβ1, равное 100%, соответствует росту клеток линии MV-1-Lu, который наблюдается в отсутствие TGFβ1.
Фиг.5. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) в присутствии пептида Р152 в различных номинальных концентрациях, с фильтрованием (◆) и без фильтрования (•).
Фиг.6. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) под действием пептидов, полученных из TGFβ1. Все пептиды тестировали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование TGFβ1, равное 100%, соответствует росту клеток линии MV-1-Lu, который наблюдается в отсутствие TGFβ1.
Фиг.7. Авторадиография, полученная при исследовании рецепторов трансформирующего фактора роста TGFβ1 с введением аффинных меток. Дорожка С1: влияние инкубирования клеток с 125I-TGFβ1 в концентрации 0,16 мкМ, которая соответствует радиоактивности 0,3 мкКи (положительный контроль). Дорожка С2: влияние предварительного инкубирования клеток с нерадиоактивным TGFβ1 в концентрации в 10 раз большей, чем концентрация 125I-TGFβ1 (положительный контроль). Дорожка С3: предварительное инкубирование осуществляли с пептидом Р29 в концентрации в 106 раз выше, чем молярная концентрация 125I-TGFβ1. Можно видеть, что наблюдается ингибирование связывания 125I-TGFβ1 с рецепторами клеток I, II и III типов как под действием пептида Р29, так и под действием нерадиоактивного TGFβ1.
Фиг.8. Авторадиография, полученная при исследовании рецепторов TGFβ1 с введением аффинных меток. Дорожки от С1 до С6: влияние предварительного инкубирования с клетками линии MV-1-Lu при различной концентрации пептида Р29 (106, 8×105, 6×105, 4×105, 2×l05 и 105 от молярной концентрации 125I-TGFβ1, соответственно), до добавления 125I-TGFβ1. Дорожка С7: влияние предварительного инкубирования клеток линии MV-1-Lu с немеченым TGFβ1 (102 от молярной концентрации 125I-TGFβ1) до добавления 125I-TGFβ1 (отрицательный контроль). Дорожка С8: влияние предварительного инкубирования клеток линии MV-1-Lu с 125I-TGFβ1 в концентрации 0,42 мкМ, соответствующей активности 0,4 мкКи, без предварительного инкубирования (положительный контроль).
Фиг.9. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) под действием пептидов, полученных из рецепторов, предположительно являвшихся комплементарными областям TGFβ1. Все пептиды тестировали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование активности TGFβ1, равное 100%, соответствует росту клеток линии MV-1-Lu, который наблюдается в отсутствие TGFβ1.
Фиг.10. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) под действием перекрывающихся пептидов, полученных из внеклеточной области рецептора типа III. Все пептиды тестировали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование TGFβ1, равное 100%, соответствует росту клеток линии MV-1-Lu, который наблюдается в отсутствие TGFβ1.
Фиг.11. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) под действием перекрывающихся пептидов, полученных из внеклеточной области рецептора типа III. Все пептиды тестировали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование TGFβ1, равное 100%, соответствует росту клеток линии MV-1-Lu, который наблюдается в отсутствие TGFβ1.
Фиг.12. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) под действием перекрывающихся пептидов, полученных из внеклеточной области рецептора типа III. Все пептиды тестировали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование TGFβ1, равное 100%, соответствует росту клеток линии MV-1-Lu, который наблюдается в отсутствие TGFβ1.
Фиг.13. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) в присутствии пептида Р54 в различных номинальных концентрациях, с фильтрованием (◆) и без фильтрования (•).
Фиг.14. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) под действием перекрывающихся пептидов, полученных при модификации пептида Р54 (от Р139 до Р143), и пептидов, полученных из рецептора типа III человека (Р144 и Р145). Все пептиды тестировали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование TGFβ1, равное 100%, соответствует росту клеток линии MV-1-Lu, который наблюдается в отсутствие TGFβ1.
Фиг.15. Процентное соотношение ингибирования активности TGFβ1 (200 пг/мл) в присутствии пептида Р144 в различных номинальных концентрациях, без фильтрования.
Фиг.16. Авторадиография, полученная при исследовании рецепторов трансформирующего фактора роста TGFβ1 с введением аффинных меток. Дорожка С1: предварительное инкубирование в присутствии пептида Р144 в концентрации в 106 раз выше, чем молярная концентрации 125I-TGFβ1. Дорожки С2 и С3: влияние предварительного инкубирования клеток с нерадиоактивным TGFβ1, присутствующим в концентрации в 10 раз выше, чем концентрация 125I-TGFβ1 (отрицательный контроль). Дорожки С4 и С5: влияние инкубирования клеток с 125I-TGFβ1 в концентрации 0,1 мкМ, которая соответствует активности 0,2 мкКи (положительный контроль). Можно видеть, что наблюдается ингибирование связывания 125I-TGFβ1 с рецепторами клеток под действием пептида Р144, так и под действием нерадиоактивного TGFβ1.
Фиг.17. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) под действием пептидов, полученных из рецептора типа II человека (Р146), из фетуина (от Р147 до Р149) и из эндоглина (от Р150 до Р154). Все пептиды тестировали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование TGFβ1, равное 100%, соответствует росту клеток линии MV-1-Lu, который наблюдается в отсутствие TGFβ1.
Фиг.18. Процентное соотношение ингибирования TGFβ1 (200 пг/мл) под действием пептидов, полученных из α2-макроглобулина. Все пептиды тестировали при концентрации 200 мкг/мл. Ингибирование TGFβ1, равное 100%, соответствует росту клеток линии MV-1-Lu, который наблюдается в отсутствие TGFβ1.
Фиг.19. Процентное соотношение ингибирования связывания TGFβ1 с клетками линии MV-1-Lu под действием различных синтетических пептидов. Ингибирование изучали путем измерения процентного соотношения меченых клеток (эмитируют флуоресценцию) и немеченых клеток (не эмитируют флуоресценцию) для каждого из пептидов (материалы и методы).
Фиг.20. Влияние введения пептида Р144 на синтез коллагена в процессе экспериментального индуцирования цирроза под воздействием ССl4. Соотношение коллагена к суммарному белку приведено на оси ординат. Абсцисса показывает различные группы крыс: Со=группа здоровых крыс; Со+Р144=группа здоровых крыс, получавших пептид Р144; Tto1=группа крыс, подвергнутых циррозу под воздействием ССl4 и получавших пептид Р144 во время этого периода через день; Ci1=группа крыс, подвергнутых индуцированию цирроза под действием ССl4 в течение 11 недель и не получавших пептид Р144.
Фиг.21. Влияние введения пептида Р144 на синтез коллагена в процессе экспериментального индуцирования цирроза под воздействием ССl4. На оси ординат показано соотношение площади участка, подверженного циррозу. к суммарной площади тканевого препарата, окрашенного красителем сириус красный. Абсцисса показывает различные группы крыс: Со=группа здоровых крыс; Со+Р144=группа здоровых крыс, получавших пептид; Tto1=группа крыс, подвергнутых циррозу под воздействием ССl4, которым вводили пептид Р144 через день в течение этого периода и Ci1=группа крыс, подвергнутых индуцированию цирроза под воздействием ССl4 в течение 11 недель и не получавших пептид Р144.
Фиг.22. Влияние введения пептида Р144 на синтез коллагена после того, как был индуцирован цирроз под воздействием ССl4. На оси ординат показано соотношение коллагена к суммарному белку. Абсцисса показывает различные группы крыс: Со=здоровые крысы; Со+Р144=здоровые крысы, получавшие пептид; Tto2=крысы, подвергнутые циррозу под воздействием ССl4, которым вводили пептид Р144 через день в конце этого периода, и Ci2 = крысы, подвергнутые индуцированию цирроза под воздействием ССl4 в течение 11 недель и не получавшие пептид Р144.
Фиг.23. Влияние введения пептида Р144 на синтез коллагена после того, как был индуцирован цирроз под воздействием CCl4. На оси ординат показано соотношение площади, подверженной циррозу к суммарной площади тканевого препарата. Абсцисса показывает различные группы крыс: Со=здоровые крысы; Со+Р144=здоровые крысы, получавшие пептид; Tto2=крысы, подвергнутые циррозу под воздействием ССl4, которым вводили пептид Р144 через день в конце этого периода, и Ci2=крысы, подвергнутые индуцированию цирроза под воздействием ССl4 в течение 11 недель и не получавшие пептид Р144.
Фиг.24. Сравнение данных, относящихся к количеству коллагена и площади участков, подверженных фиброзу, полученных двумя использованными методами. Абсцисса показывает соотношение площади участков, подверженных фиброзу, к суммарной площади, полученное методом анализа изображений. Ордината показывает величину соотношения количества коллагена, мкг, к количеству суммарного белка, мг, полученных методом спектрофотометрического анализа срезов печени, окрашенных красителями Direct Red и Fast Green. Приведено R2. (F≤0,001).
Фиг.25. Сравнение данных, относящихся к количеству коллагена и площади участков, подверженных фиброзу, полученных двумя использованными методами для образцов, полученных в конце осуществления методики 2. Абсцисса показывает соотношение площади участков, подверженных фиброзу, к суммарной площади, полученное методом анализа изображений. Ордината показывает величину соотношения количества коллагена, мкг, к количеству суммарного белка, мг, полученных методом спектрофотометрического анализа срезов печени, окрашенных красителями Direct Red и Fast Green. Приведено R2. (F≤0,001).
Фиг.26. Изображения, которые соответствуют 24 областям препаратов печени крысы, окрашенным красителем сириус красный, полученные методом оптической микроскопии (10×). Крысы, подвергнутые циррозу (Ci1), в конце индуцирования цирроза под воздействием ССl4, и крысы, подвергнутые циррозу, получавшие пептид Р144 (Tto1) в процессе индуцирования цирроза под воздействием СС14. Из препаратов, полученных для каждого животного, взяты различные области (R=крыса и С=область).
Фиг.27. Изображения, которые соответствуют 24 областям препаратов печени крысы, окрашенным красителем сириус красный, полученные методом оптической микроскопии (10×). Крысы, подвергнутые циррозу (Ci1), в конце индуцирования цирроза под воздействием ССl4, и крысы, подвергнутые циррозу, получавшие пептид Р144 (Tto1) в процессе индуцирования цирроза под воздействием ССl4. Из препаратов, полученных для каждого животного, взяты различные области (R=крыса и С=область). Для того, чтобы обнаружить коллагеновые волокна, использовали поляризованный свет и зеленый светофильтр.
Фиг.28. Сравнение двух групп крыс, подвергнутых циррозу и не получавших лечение. Ci1 относится к крысам, подвергнутым циррозу, в конце 12 недель индуцирования цирроза под воздействием ССl4, Ci2 относится к крысам, подвергнутым циррозу, на 4 неделе после завершения процесса индуцирования цирроза. Р=0,016. По оси ординат: площадь участков, подвергнутых фиброзу/общая площадь.
Claims (10)
1. Пептиды, которые являются антагонистами связывания трансформирующего фактора роста TGFβ1 с его рецепторами в организме, отличающиеся тем, что они являются синтетическими пептидами с последовательностью, содержащей от 2 до 15 аминокислот, которые являются идентичными или схожими с аминокислотами природного трансформирующего фактора роста TGFβ1 и/или его рецепторов.
2. Пептиды по п.1, отличающиеся тем, что они содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
3. Пептиды по п.1, отличающиеся тем, что они содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
4. Пептиды по п.1, отличающиеся тем, что они содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
5. Пептиды по п.1, отличающиеся тем, что они содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
6. Пептиды по п.1, отличающиеся тем, что они содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.
7. Пептиды по п.1, отличающиеся тем, что они содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
8. Пептиды по п.1, отличающиеся тем, что они содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
9. Пептиды по пп.1-8 для применения в качестве активного соединения (активных соединений) для приготовления композиции, используемой при заболеваниях печени.
10. Пептиды по п.9 для применения в качестве активного соединения (активных соединений) для приготовления композиции, используемой при фиброзе печени (циррозе).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES009802465A ES2146552B1 (es) | 1998-11-24 | 1998-11-24 | Peptidos inhibidores de tgf/31 |
| ESP9802465 | 1998-11-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001117230A RU2001117230A (ru) | 2003-05-27 |
| RU2232771C2 true RU2232771C2 (ru) | 2004-07-20 |
Family
ID=8305903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001117230/04A RU2232771C2 (ru) | 1998-11-24 | 1999-11-23 | Пептиды, ингибирующие трансформирующий фактор роста tgfбета1 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7057013B1 (ru) |
| EP (1) | EP1132403B1 (ru) |
| JP (5) | JP3836677B2 (ru) |
| CN (1) | CN1203091C (ru) |
| AT (1) | ATE322505T1 (ru) |
| AU (1) | AU767498B2 (ru) |
| BR (1) | BR9915604B1 (ru) |
| CA (1) | CA2352537C (ru) |
| CY (1) | CY1105616T1 (ru) |
| DE (1) | DE69930763T2 (ru) |
| DK (1) | DK1132403T3 (ru) |
| ES (2) | ES2146552B1 (ru) |
| PT (1) | PT1132403E (ru) |
| RU (1) | RU2232771C2 (ru) |
| SI (1) | SI1132403T1 (ru) |
| WO (1) | WO2000031135A1 (ru) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2498992C1 (ru) * | 2009-08-14 | 2013-11-20 | Энсолтек Ко., Лтд. | Новый пептид и его применение |
| RU2565539C2 (ru) * | 2010-02-18 | 2015-10-20 | Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния | АНТИТЕЛА, НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ ИНТЕГРИН ανβ8 |
| RU2712967C2 (ru) * | 2013-10-31 | 2020-02-03 | Киото Прифекчурал Паблик Юниверсити Корпорэйшн | Терапевтическое средство против заболеваний, связанных с гибелью клеток эндотелия роговицы, обусловленной состоянием эндоплазматического ретикулума |
| RU2733286C2 (ru) * | 2015-03-04 | 2020-10-01 | Джензим Корпорейшн | ДИМЕРЫ SCFV-FC, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ТРАНСФОРМИРУЮЩИМ ФАКТОРОМ РОСТА β1 С ВЫСОКОЙ АФФИННОСТЬЮ, АВИДНОСТЬЮ И СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ |
| US11730722B2 (en) | 2013-07-30 | 2023-08-22 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Corneal endothelium ECM therapeutic medicaments |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7723473B2 (en) | 1997-06-19 | 2010-05-25 | St. Louis University | Peptide antagonists of TGF-beta family members and therapeutic uses thereof |
| JP2002087938A (ja) * | 2000-09-11 | 2002-03-27 | Shiseido Co Ltd | 養毛剤及びそのスクリーニング方法 |
| AU2003234734A1 (en) * | 2002-04-29 | 2003-11-17 | Saint Louis University | Peptide antagonists of tgf-beta family members and therapeutic uses thereof |
| US8158589B2 (en) | 2003-08-22 | 2012-04-17 | Proyecto Biomedicine Cima, S.L. | Peptides with the capacity to bind to transforming growth factor β1 (TGF-β1) |
| ES2304069B1 (es) * | 2003-08-22 | 2009-08-12 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Peptidos con capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento beta 1 (tgf-b1). |
| CN101340927A (zh) * | 2005-10-24 | 2009-01-07 | 西玛生物医学信息公司 | TGF-β1抑制性多肽在制备免疫反应调节剂上的用途 |
| US7582609B2 (en) * | 2006-03-01 | 2009-09-01 | Digna Biotech, S.L. | Method for the treatment of skin fibrosis and suitable compositions for such treatment |
| KR100879239B1 (ko) * | 2007-04-19 | 2009-01-16 | (주)케어젠 | Ｔｇｆｐ－ｃａｐ 펩타이드 및 그의 용도 |
| ES2327088B1 (es) * | 2007-08-20 | 2010-07-26 | Proyecto De Biomedicina Cima S.L. | Combinaciones terapeuticas para el tratamiento de las metastasis. |
| US8946201B2 (en) * | 2007-08-27 | 2015-02-03 | Saint Louis University | Methods for inhibiting TGF-β |
| JP4630914B2 (ja) | 2008-04-14 | 2011-02-09 | 株式会社日本ハイポックス | 肝線維化抑制剤 |
| AU2009256547B2 (en) | 2008-06-13 | 2014-07-10 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Apo-A conjugates for the administration of biologically active compounds |
| EP2341913B1 (en) * | 2008-09-16 | 2014-11-19 | Saint Louis University | Method of enhancing tgf-beta signalling |
| AU2010210033A1 (en) * | 2009-02-05 | 2011-08-04 | Digna Biotech, S.L. | Pharmaceutical compositions comprising TGF- beta1 inhibitor peptides |
| ES2347627B1 (es) | 2009-03-06 | 2011-10-10 | Isdin, S.A. | Peptido para el tratamiento profilactico o terapeutico de tumores de la piel en estadios iniciales. |
| RU2012123145A (ru) | 2009-11-05 | 2013-12-10 | Проекто Де Биомедисина Сима, С.Л. | Генный конструкт (варианты), вектор и рекомбинантный вирусный геном на его основе, вирион, их фармацевтическая композиция, способ in vitro экспрессии полинуклеотида в клетке печеночной природы, лекарственное средство, способ лечения заболевания печени (варианты), индуцируемый двунаправленный оператор-промотор |
| CN102898508B (zh) * | 2011-08-12 | 2014-04-30 | 北京大学第一医院 | 封闭TGF-β受体或IL-10受体的多肽、其药物组合物及其用途 |
| KR101856114B1 (ko) | 2011-09-05 | 2018-06-20 | 가부시키가이샤 폴라 파마 | Ｅｔｆｂ의 세포 이상증식에 대한 적용 방법 및 이상증식 억제제 |
| CU24181B1 (es) * | 2012-11-09 | 2016-04-25 | Ct De Inmunología Molecular | POLIPÉPTIDOS DERIVADOS DEL TGFß |
| RS60371B1 (sr) | 2013-03-14 | 2020-07-31 | Brigham & Womens Hospital Inc | Sastavi i postupci za ekspanziju i kultivisanje epitelnih matičnih ćelija |
| CN105658672A (zh) | 2013-08-22 | 2016-06-08 | 阿塞勒隆制药公司 | TGF-β受体II型变体及其用途 |
| EP3071215B1 (en) | 2013-11-21 | 2020-01-08 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Compositions and methods for treating pulmonary hypertension |
| CA2956256A1 (en) * | 2014-08-01 | 2016-02-04 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions relating to treatment of pulmonary arterial hypertension |
| JP6773645B2 (ja) | 2014-09-03 | 2020-10-21 | ザ ブリガム アンド ウィミンズ ホスピタル，インコーポレイテッド | 聴覚障害の治療のための内耳毛細胞を生成するための組成物、システムおよび方法 |
| CN105821029A (zh) * | 2015-01-04 | 2016-08-03 | 彭霞 | 异源融合基因修饰的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法 |
| US10669528B2 (en) | 2015-06-25 | 2020-06-02 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance |
| AU2016301380B2 (en) | 2015-08-04 | 2021-07-01 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for treating myeloproliferative disorders |
| JP2019506153A (ja) | 2016-01-08 | 2019-03-07 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 分化した腸内分泌細胞およびインスリン産生細胞の作製 |
| KR101841748B1 (ko) | 2016-02-18 | 2018-05-08 | (주)케어젠 | 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도 |
| KR101791526B1 (ko) | 2016-02-18 | 2017-11-01 | (주)케어젠 | 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도 |
| US10201540B2 (en) | 2016-03-02 | 2019-02-12 | Frequency Therapeutics, Inc. | Solubilized compositions for controlled proliferation of stem cells / generating inner ear hair cells using GSK3 inhibitors: I |
| US11260130B2 (en) | 2016-03-02 | 2022-03-01 | Frequency Therapeutics, Inc. | Solubilized compositions for controlled proliferation of stem cells / generating inner ear hair cells using a GSK3 inhibitor: IV |
| US10213511B2 (en) | 2016-03-02 | 2019-02-26 | Frequency Therapeutics, Inc. | Thermoreversible compositions for administration of therapeutic agents |
| US20190119642A1 (en) | 2016-03-15 | 2019-04-25 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion |
| MX2019007890A (es) | 2016-12-30 | 2020-01-20 | Frequency Therapeutics Inc | Compuestos de 1h-pirrol-2,5-diona y metodos de uso de los mismos para inducir la auto-renovacion de celulas madre/progenitoras de soporte. |
| SI3628049T1 (sl) | 2017-05-04 | 2023-10-30 | Acceleron Pharma Inc. | Fuzijske beljakovine receptorja TGF-beta tipa II in njihova uporaba |
| KR101954214B1 (ko) * | 2017-05-23 | 2019-03-06 | (주)케어젠 | 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도 |
| JP2021518413A (ja) | 2018-03-20 | 2021-08-02 | アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ | キナーゼ阻害剤化合物及び組成物ならびに使用方法 |
| US20210254006A1 (en) | 2018-06-06 | 2021-08-19 | Ideaya Biosciences, Inc. | Methods of culturing and/or expanding stem cells and/or lineage committed progenitor cells using lactam compounds |
| WO2019234221A1 (en) | 2018-06-08 | 2019-12-12 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for stratification and treatment of a patient suffering from chronic lymphocytic leukemia |
| WO2020037323A1 (en) | 2018-08-17 | 2020-02-20 | Frequency Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for generating hair cells by upregulating jag-1 |
| EP3837351A1 (en) | 2018-08-17 | 2021-06-23 | Frequency Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for generating hair cells by downregulating foxo |
| CN109432431B (zh) | 2018-12-14 | 2020-06-30 | 中国药科大学 | 一种含有sumo抑制剂的组合物及应用 |
| CA3124700A1 (en) | 2018-12-31 | 2020-07-09 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Kinase inhibitor compounds and compositions and methods of use |
| KR102265432B1 (ko) * | 2019-08-20 | 2021-06-15 | 주식회사 케어젠 | 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 |
| CN110511285B (zh) * | 2019-08-27 | 2023-01-24 | 南京安吉生物科技有限公司 | 一种重组融合多肽及其应用 |
| CN110483648A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-22 | 南京安吉生物科技有限公司 | 一种融合多肽及其应用 |
| US20240067686A1 (en) * | 2020-12-23 | 2024-02-29 | Korea Institute Of Science And Technology | NOVEL PEPTIDE CAPABLE OF INHIBITING TGF-ß SIGNALING AND USE THEREOF |
| WO2023249439A1 (ko) * | 2022-06-22 | 2023-12-28 | 주식회사 유씨아이테라퓨틱스 | TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8927546D0 (en) * | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| EP0542971A1 (en) * | 1991-05-10 | 1993-05-26 | The Salk Institute For Biological Studies | CLONING AND RECOMBINANT PRODUCTION OF RECEPTOR(S) OF THE ACTIVIN/TGF-$g(b) SUPERFAMILY |
| FR2720069A1 (fr) * | 1994-05-19 | 1995-11-24 | Inst Nat Sante Rech Med | Dérivés de facteurs de croissance et d'hormones de la superfamille des TGFB, procédé pour leur obtention et leurs applications biologiques. |
| US5824655A (en) * | 1995-02-15 | 1998-10-20 | The University Of Utah | Anti-transforming growth factor-β gene therapy |
-
1998
- 1998-11-24 ES ES009802465A patent/ES2146552B1/es not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-11-23 US US09/831,253 patent/US7057013B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-23 BR BRPI9915604-0A patent/BR9915604B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-11-23 RU RU2001117230/04A patent/RU2232771C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-11-23 CA CA2352537A patent/CA2352537C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-23 SI SI9930897T patent/SI1132403T1/sl unknown
- 1999-11-23 AT AT99957342T patent/ATE322505T1/de active
- 1999-11-23 EP EP99957342A patent/EP1132403B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-23 AU AU15077/00A patent/AU767498B2/en not_active Ceased
- 1999-11-23 JP JP2000583961A patent/JP3836677B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-23 DK DK99957342T patent/DK1132403T3/da active
- 1999-11-23 CN CNB99813614XA patent/CN1203091C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-23 PT PT99957342T patent/PT1132403E/pt unknown
- 1999-11-23 ES ES99957342T patent/ES2262349T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-23 WO PCT/ES1999/000375 patent/WO2000031135A1/es active IP Right Grant
- 1999-11-23 DE DE69930763T patent/DE69930763T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-04-10 JP JP2006107967A patent/JP4002287B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-11 US US11/401,744 patent/US7528226B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-16 CY CY20061100805T patent/CY1105616T1/el unknown
-
2007
- 2007-02-19 JP JP2007037713A patent/JP4068654B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-02 JP JP2007259167A patent/JP4237807B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-10-20 JP JP2008269650A patent/JP4272255B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2498992C1 (ru) * | 2009-08-14 | 2013-11-20 | Энсолтек Ко., Лтд. | Новый пептид и его применение |
| RU2565539C2 (ru) * | 2010-02-18 | 2015-10-20 | Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния | АНТИТЕЛА, НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЕ ИНТЕГРИН ανβ8 |
| US11730722B2 (en) | 2013-07-30 | 2023-08-22 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Corneal endothelium ECM therapeutic medicaments |
| RU2712967C2 (ru) * | 2013-10-31 | 2020-02-03 | Киото Прифекчурал Паблик Юниверсити Корпорэйшн | Терапевтическое средство против заболеваний, связанных с гибелью клеток эндотелия роговицы, обусловленной состоянием эндоплазматического ретикулума |
| US11382904B2 (en) | 2013-10-31 | 2022-07-12 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Therapeutic drug for diseases related to endoplasmic reticulum cell death in corneal endothelium |
| RU2733286C2 (ru) * | 2015-03-04 | 2020-10-01 | Джензим Корпорейшн | ДИМЕРЫ SCFV-FC, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С ТРАНСФОРМИРУЮЩИМ ФАКТОРОМ РОСТА β1 С ВЫСОКОЙ АФФИННОСТЬЮ, АВИДНОСТЬЮ И СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4272255B2 (ja) | 2009-06-03 |
| JP3836677B2 (ja) | 2006-10-25 |
| JP4002287B2 (ja) | 2007-10-31 |
| EP1132403A1 (en) | 2001-09-12 |
| ATE322505T1 (de) | 2006-04-15 |
| CN1328569A (zh) | 2001-12-26 |
| ES2146552B1 (es) | 2001-04-16 |
| US7057013B1 (en) | 2006-06-06 |
| JP2002530431A (ja) | 2002-09-17 |
| JP4068654B2 (ja) | 2008-03-26 |
| ES2146552A1 (es) | 2000-08-01 |
| US7528226B2 (en) | 2009-05-05 |
| PT1132403E (pt) | 2006-07-31 |
| DE69930763T2 (de) | 2006-11-30 |
| DE69930763D1 (en) | 2006-05-18 |
| JP2007186519A (ja) | 2007-07-26 |
| AU1507700A (en) | 2000-06-13 |
| JP2006241166A (ja) | 2006-09-14 |
| AU767498B2 (en) | 2003-11-13 |
| DK1132403T3 (da) | 2006-08-14 |
| JP4237807B2 (ja) | 2009-03-11 |
| CA2352537A1 (en) | 2000-06-02 |
| BR9915604B1 (pt) | 2011-07-26 |
| ES2262349T3 (es) | 2006-11-16 |
| CN1203091C (zh) | 2005-05-25 |
| SI1132403T1 (sl) | 2006-08-31 |
| JP2009040796A (ja) | 2009-02-26 |
| JP2008056685A (ja) | 2008-03-13 |
| EP1132403B1 (en) | 2006-04-05 |
| CY1105616T1 (el) | 2010-07-28 |
| BR9915604A (pt) | 2001-08-07 |
| WO2000031135A1 (es) | 2000-06-02 |
| CA2352537C (en) | 2011-11-15 |
| US20070014767A1 (en) | 2007-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2232771C2 (ru) | Пептиды, ингибирующие трансформирующий фактор роста tgfбета1 | |
| Moses et al. | Identification of an inhibitor of neovascularization from cartilage | |
| KR100628697B1 (ko) | 맥관 내피 성장인자 ｄ를 발현하는 발현 벡터와 셀라인,및 흑색종을 치료하는 방법 | |
| Cox | Transforming growth factor-beta 3. | |
| Parvinen et al. | Expression of beta-nerve growth factor and its receptor in rat seminiferous epithelium: specific function at the onset of meiosis. | |
| JP2000517174A (ja) | ケラチノサイト増殖因子―２（ｋｇｆ―２または線維芽細胞増殖因子―１２、ｆｇｆ―１２） | |
| CA2343927A1 (en) | Artemin, a novel neurotrophic factor | |
| Chang et al. | Agrin inhibits neurite outgrowth but promotes attachment of embryonic motor and sensory neurons | |
| JP2012149081A (ja) | Ｔｄｆ関連化合物およびその類似体 | |
| JP4399260B2 (ja) | 神経再生ペプチドおよび脳損傷治療におけるその使用方法 | |
| JP3945846B2 (ja) | 膵臓機能改善剤 | |
| Si et al. | Extraction and purification of TGFβ and its effect on the induction of apoptosis of hepatocytes | |
| US6432410B1 (en) | Morphogenic proteins | |
| US20020128441A1 (en) | Endoderm, cardiac and neural inducing factors - murine frazzled (FRZB-1) protein | |
| MXPA01005122A (en) | TGF&bgr;1 INHIBITOR PEPTIDES | |
| WO1997040155A1 (en) | Protein mediating neuronal-glial interaction, dna encoding the same, and methods of use thereof | |
| EP0724598A1 (en) | Growth factor heterodimers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20141124 |