WO2023249439A1 - TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023249439A1
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tgf
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arginine
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정수영
서민구
안준엽
오민석
윤상원
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주식회사 유씨아이테라퓨틱스
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention relates to novel peptides capable of inhibiting TGF- ⁇ signaling and their uses.
  • TGF- ⁇ cytokine was discovered for its ability to stimulate cell colony formation (Roberts AB, et al, Proc Natl Acad Sci USA 78: 5339-43, 1981), as this process is a representative marker of cell transformation.
  • the cytokine was named transforming growth factor beta, and TGF- ⁇ ligands (TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3) are recognized as prototypes of multifunctional growth factors.
  • TGF- ⁇ is known to be an inhibitor of proliferation of epithelial, endothelial and hematopoietic cells and one of the most powerful regulators of extracellular matrix production and deposition and tissue repair cascades.
  • TGF- ⁇ is known to play a role in tumor growth, invasion, and metastasis during the cancer progression stage.
  • TGF- ⁇ is Ras-MAPK, which regulates EMT (epithelial-mesenchymal transition) in tumor cells and other cellular activities. It is known to exhibit various activities in the cancer process by activating numerous SMAD-independent signaling pathways, including PI3K-AKT.
  • One object of the present invention is to provide a novel peptide that can effectively inhibit the transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ) signaling pathway.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the peptide provided by the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide an expression vector containing the polynucleotide provided by the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide host cells and cultures thereof transfected with the expression vector provided by the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving or treating TGF- ⁇ -related diseases, comprising the peptide, polynucleotide, expression vector, host cell or culture thereof provided in the present invention as an active ingredient. I want to do it.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • the form of TGF- ⁇ expressed in mammals is TGF- ⁇ 1.
  • TGF- ⁇ 2 and TGF- ⁇ 3 are known.
  • Signaling by TGF- ⁇ plays a critical role in various biological processes and performs various functions such as cell growth inhibition, apoptosis, differentiation, and epithelial-mesenchymal transition (EMT).
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • the TGF- ⁇ signaling system is tightly regulated and plays a critical role in development and organ formation as well as maintaining cellular homeostasis. Therefore, disruption of TGF- ⁇ signaling can lead to life-threatening diseases such as cancer, fibrosis, and congenital malformations.
  • TGF- ⁇ is known to exhibit cancer-suppressing activity in the early stages of the cancerization process, but promotes cancer growth in the later stages of the cancerization process.
  • TGF- ⁇ 1 is expressed in large amounts in most cancer tissues, and it is known that cancer patients with high expression of TGF- ⁇ 1 are often malignant and have a poor prognosis.
  • TGF- ⁇ secreted from cells binds to a heterogeneous complex of two types of receptors, type I and type II receptors, to initiate signal transduction. When TGF- ⁇ binds to a type II receptor, the type I receptor recognizes it and binds to the type II receptor.
  • the type II receptor phosphorylates the GS site of the type I receptor
  • the type I receptor kinase is activated. It will happen.
  • Phosphorylated TGF- ⁇ type I receptor causes activation of Smad2 and Smad3 by phosphorylating the C-terminal serine residue of TGF- ⁇ signaling mediators, Smad2 and Smad3.
  • Activated Smad2 and Smad3 form a complex with Smad4 and move to the nucleus, where they participate in the expression of target genes.
  • TGF- ⁇ is known to play an important executive role in determining immune homeostasis and tolerance, including regulating immune tolerance and inflammatory responses by inhibiting the function and expansion of many components of the immune system. It is known that TGF- ⁇ plays an important role as a mediator of immune suppression in the tumor microenvironment. Therefore, it is known that TGF- ⁇ plays an important role in promoting cancer growth within the immune environment of a tumor, and combination treatments of cancer immunotherapy drugs and various TGF- ⁇ signaling inhibitors are being researched and developed.
  • the peptide of the present invention may bind to the TGF- ⁇ receptor (TGFBR1 and/or TGFBR2) to inhibit TGF- ⁇ signaling. Specifically, the peptide competes with TGF- ⁇ and binds to the TGF- ⁇ receptor, thereby inhibiting TGF- ⁇ signaling. It may be that TGF- ⁇ signaling is inhibited through a mechanism that prevents the binding of - ⁇ cytokines to the TGF- ⁇ receptor.
  • the peptide may inhibit TGF- ⁇ signaling by suppressing the expression level of TGF- ⁇ in cells.
  • the peptide may inhibit TGF- ⁇ signaling in cells through an auto-inhibition pathway. It may be suppressing TGF- ⁇ signaling through a mechanism that reduces the expression level or reduces the extracellular emissions of TGF- ⁇ .
  • the peptide may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the peptide contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and has 13 to 22 amino acids, preferably 14 to 20 amino acids, more preferably 16 to 20 amino acids, and most preferably 18 amino acids. It may come true.
  • the peptide contains 4 to 9 amino acids, preferably 4 to 8 amino acids, more preferably 5 to 8 amino acids, and most preferably 6 amino acids at the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It may further include 4 to 9 amino acids, preferably 4 to 8 amino acids, more preferably 5 to 8 amino acids, and most preferably 6 or 7 amino acids at the C-terminus.
  • the peptide fragment consisting of 4 to 9 amino acids at the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is referred to as the 'first peptide fragment'
  • the peptide fragment consisting of 4 to 9 amino acids at the C-terminus is referred to as 'the first peptide fragment'
  • the peptide fragment consisting of is referred to as the 'second peptide fragment'.
  • the peptide may have an isoelectric point (PI) of 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more, and 13 or less, preferably 8 or more, 8.2 or more, 8.4 or more, or 8.6 or more. , 8.8 or more, 9 or more, 9.2 or more, 9.4 or more, 9.6 or more, 9.8 or more, or 10 or more, and may be 13 or less.
  • the peptide of the present invention was designed to have the above-described isoelectric point, thereby increasing binding affinity to the TGF- ⁇ receptor and suppressing TGF- ⁇ signaling by inhibiting TGF- ⁇ activity.
  • the first peptide fragment may include at least one basic amino acid, at least one polar amino acid, or a combination thereof.
  • the second peptide fragment may include at least one basic amino acid, at least one polar amino acid, or a combination thereof.
  • the first peptide fragment is one or more amino acids selected from the group consisting of arginine (R), serine (S), lysine (K), threonine (T), glutamine (Q), and asparagine (N). It includes and may further include at least one of glycine (G) and proline (P).
  • the first peptide fragment includes one or more arginine (R), one or more serine (S), one or more glycine (G), and one or more proline (P), or arginine (R), serine (S), glycine (G), and proline (P), or may be composed of these amino acids.
  • the first peptide fragment includes one or more serine (S), one or more lysine (K), one or more glutamine (Q), one or more glycine (G), and one or more proline (P), serine (S), lysine (K), glutamine (Q), glycine (G), and proline (P), or may be composed of these amino acids.
  • the first peptide fragment may include or consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2 to 5.
  • the second peptide fragment is one or more amino acids selected from the group consisting of threonine (T), arginine (R), serine (S), lysine (K), glutamine (Q), and asparagine (N). It includes, and may further include one or more selected from the group consisting of leucine (L), aspartic acid (D), and phenylalanine (F).
  • the second peptide fragment includes one or more threonine (T), one or more arginine (R), one or more lysine (K), one or more leucine (L), and one or more as Contains partic acid (D) and one or more phenylalanines (F), or Contains threonine (T), arginine (R), lysine (K), leucine (L), aspartic acid (D), and phenylalanine (F) Alternatively, it may be composed of these amino acids.
  • the second peptide fragment includes one or more threonine (T), one or more arginine (R), one or more glutamine (Q), one or more lysine (K), and one or more leucine (L), containing one or more aspartic acids (D) and one or more phenylalanines (F), or threonine (T), arginine (R), glutamine (Q), lysine (K), leucine (L), It may contain aspartic acid (D) and phenylalanine (F), or may consist of these amino acids.
  • the third peptide fragment may include one or more lysine (K) and one or more asparagine (N).
  • the third peptide fragment may include or consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 11 to 14.
  • the fourth peptide fragment may include one or more amino acids selected from the group consisting of lysine (K), arginine (R), serine (S), threonine (T), asparagine (N), and glutamine (Q). You can.
  • the fourth peptide fragment may include one or more arginine (R), one or more serine (S), and one or more lysine (K), and arginine (R), serine (S) ) and lysine (K).
  • the fourth peptide fragment may include or consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 15 to 18.
  • sequence number sequence information 15 RSK 16 KTR 17 KQR 18 KNR
  • the peptide may include an amino acid sequence represented by the following general formula 1 shown in SEQ ID NO: 19, and preferably consists of an amino acid sequence represented by the following general formula 1 shown in SEQ ID NO: 19: You can:
  • X 1 , X 3 , X 4 and X 6 may each be independently selected from basic amino acids
  • the basic amino acid may be histidine (H), lysine (K), or arginine (R), and the polar amino acid may be serine (S), threonine (T), asparagine (N), or glutamine (Q). ) or tyrosine (Y), but is not limited thereto.
  • the peptide may include one or more amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20 to 26, and preferably may include the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 20 to 26.
  • sequences having the same activity as the peptides containing the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 20 to 26 may be included without limitation.
  • it may include an amino acid sequence having more than 80% homology or identity with the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20 to 26, but is not limited thereto.
  • the peptide contains at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 20 to 26. %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more homology or identity.
  • proteins with amino acid sequences in which some sequences are deleted, modified, substituted, or added are also included within the scope of the present application, as long as they have such homology or identity and show the corresponding efficacy to the protein.
  • homology refers to the degree of similarity of the base sequence or amino acid sequence encoding a protein. If the homology is sufficiently high, the expression product of the protein or gene may have the same or similar activity. . Additionally, homology can be expressed as a percentage based on the degree of matching to a given amino acid or base sequence. In this specification, a given amino acid sequence or base sequence and its homologous sequence having the same or similar activity are expressed as “% homology”. For example, standard software for calculating parameters such as score, identity and similarity, specifically BLAST 2.0, or hybridization used under defined stringent conditions.
  • the above-mentioned peptides provided by the present invention inhibit TGF- ⁇ signaling by binding to the TGF- ⁇ receptor or reducing the expression level or extracellular emissions of TGF- ⁇ , and treat diseases related to TGF- ⁇ signaling based on this. Or it can be prevented, and furthermore, TGF- ⁇ expressing cancer can also be effectively treated or prevented.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding the peptide of the present invention.
  • polynucleotide refers to a polymer material in which nucleotides are bonded and DNA that encodes genetic information.
  • amino acid sequence having the same or corresponding biological activity as the peptide of the sequence number substantially described as a sequence having homology to the above sequence for example, a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted, or added. It is obvious that the case of having it is also included in the scope of the present invention.
  • stringent conditions refers to conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in the literature (e.g., J. Sambrook et al., supra). For example, between genes with high homology, genes having homology of 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, especially specifically 99% or more.
  • Hybridization requires that two polynucleotides have complementary sequences, although mismatches between bases are possible depending on the stringency of hybridization.
  • the term “complementary” is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenosine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine. Accordingly, the present application may also include substantially similar polynucleotide sequences as well as isolated polynucleotide fragments that are complementary to the entire sequence.
  • the appropriate stringency to hybridize a polynucleotide depends on the length of the polynucleotide and the degree of complementarity, variables that are well known in the art (see Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • the present invention relates to an expression vector containing the polynucleotide of the present invention.
  • expression vector refers to a recombinant vector that can be introduced into a suitable host cell to express a protein of interest, and refers to a genetic construct containing essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • operably linked means that a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein of interest are functionally linked to perform a general function. Operational linkage with a recombinant vector can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cutting and ligation can be easily performed using enzymes generally known in the art. there is.
  • various types of vectors such as nanoparticles, plasmids, viruses, and cosmids can be used as recombinant expression vectors for inserting the foreign genes.
  • the type of recombinant vector is not particularly limited as long as it functions to express the desired gene and produce the desired protein in various host cells of prokaryotic and eukaryotic cells, but specifically, it has a highly active promoter and strong expression ability while maintaining a natural state. Vectors that can produce large quantities of foreign proteins of a similar form can be used.
  • Non-viral vectors for gene transfer include naked DNA, plasmids, transposons, and mRNA.
  • Non-limiting examples include pKK plasmid (Clonetech), pUC plasmid, pET plasmid (Novagen, Inc., Madison, Wis.), pRSET or pREP plasmid (Invitrogen, San Diego, Calif.), pMAL plasmid (New England Biolabs, Beverly , Mass.).
  • the promoter can be coupled to an enhancer to increase transcription efficiency.
  • the enhancer may include, but are not limited to, the RSV enhancer, the CMV enhancer, or the ⁇ -fetoprotein MERII enhancer.
  • the vector may include one or more additional polypeptides, for example, a polynucleotide encoding one or more markers and/or one or more effector molecules.
  • the host cells may include cells of mammalian, plant, insect, fungal, or cellular origin, for example, bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, and Salmonella Typhimurium; Fungal cells such as yeast cells and Pichia pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; CHO (Chinese hamster ovary cells), SP2/0 (mouse myeloma), human lymphoblastoid, COS, NSO (mouse myeloma), 293T, Bow melanoma cells, HT-1080, BHK Animal cells of (Baby Hamster Kidney cells), HEK (Human Embryonic Kidney cells) or PERC.6 (Human Retinal Cells); Or it may be a plant cell, but is not limited thereto, and suitable cell lines well known in the art can be obtained from cell line depositories such as ATCC (American Type Culture Collection).
  • ATCC American Type Culture Collection
  • the TGF- ⁇ -related diseases include diseases characterized by accumulation of extracellular matrix, diseases caused by circulating TGF- ⁇ or TGF- ⁇ activated at local sites, and immune system suppression due to endogenous TGF- ⁇ production. This may include diseases caused by, serious injuries, burns and serious illnesses, such as acute immunodeficiency resulting from viral or bacterial infections, multi-organ systemic diseases due to TGF- ⁇ production or overproduction, and TGF- ⁇ producing tumors. there is.
  • the peptide provided by the present invention effectively inhibits TGF- ⁇ signaling
  • the peptide provided by the present invention, the polynucleotide encoding the same, the expression vector containing the same, or the host cell or culture thereof transfected with the expression vector are all TGF- ⁇ .
  • -It is a ⁇ -related disease and can be applied to the treatment or prevention of various types of cancer.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil may be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives, etc. may be additionally included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited to these, but is oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral, and topical. , sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • ingredients can be used independently or in combination.
  • the proportion of these additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.1 to about 50 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the type of solvent that can be added to the cosmetic composition of the present invention is not particularly limited, but for example, water, saline solution, DMSO, or a combination thereof can be used, and carriers, excipients, or diluents include purified water, oil, and wax. , fatty acids, fatty alcohols, fatty acid esters, surfactants, humectants, thickeners, antioxidants, viscosity stabilizers, chelating agents, buffers, lower alcohols, etc., but are not limited thereto. Additionally, if necessary, it may contain whitening agents, moisturizers, vitamins, sunscreen, perfume, dyes, antibiotics, antibacterial agents, and antifungal agents.
  • it may contain moisture absorbents, thickeners, antioxidants, etc., which are widely known in the cosmetics field, and their types and amounts are known in the art.
  • providing a method for preventing, improving or treating a TGF- ⁇ related disease comprising administering the composition for preventing, improving or treating a TGF- ⁇ related disease of the present invention to an individual.
  • the description of “TGF- ⁇ -related disease” and “composition” is the same as described above.
  • the subject may include, without limitation, mammals, birds, reptiles, farmed fish, etc., including mice, livestock, and humans that develop or are at risk of developing a TGF- ⁇ -related disease.
  • the composition is not particularly limited thereto, but depending on the purpose, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, transdermal patch administration, oral administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration It can be administered through routes such as: However, when administered orally, it can be administered in an unformulated form, and since the active ingredients of the pharmaceutical composition may be denatured or decomposed by stomach acid, the oral composition must be coated with the active agent or protected from decomposition in the stomach. It can also be administered orally in formulated form or in the form of an oral patch. Additionally, the composition can be administered by any device that allows the active substance to move to target cells.
  • Figure 3 is a graph showing the results of confirming the change in the degree of luminescence through luciferase assay after treating HEK293_SBE_luc cells cultured with rhTGF- ⁇ in Example 4 with the conditioned medium of 293T cells transfected with the expression vector of UP02aTGFbR. will be.
  • the peptide of the present invention may bind to the TGF- ⁇ receptor (TGFBR1 and/or TGFBR2) to inhibit TGF- ⁇ signaling. Specifically, the peptide competes with TGF- ⁇ and binds to the TGF- ⁇ receptor, thereby inhibiting TGF- ⁇ signaling. It may be that TGF- ⁇ signaling is inhibited through a mechanism that prevents the binding of - ⁇ cytokines to the TGF- ⁇ receptor.
  • the peptide contains 4 to 9 amino acids, preferably 4 to 8 amino acids, more preferably 5 to 8 amino acids, and most preferably 6 amino acids at the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It may further include 4 to 9 amino acids, preferably 4 to 8 amino acids, more preferably 5 to 8 amino acids, and most preferably 6 or 7 amino acids at the C-terminus.
  • the isoelectric point (PI) of the peptide fragment containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 5.95. Therefore, in order for the peptide provided in the present invention to have an isoelectric point (PI) of 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more, the total isoelectric point (PI) of the first and second peptide fragments is 9 or more. , it is preferable that it is 10 or more or 11 or more.
  • the second peptide fragment may include or consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 6 to 9.
  • the peptide contains the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and has 13 to 22 amino acids, preferably 14 to 20 amino acids, more preferably 16 to 20 amino acids, and most preferably 18 amino acids. It may come true.
  • the peptide contains 1 to 5 amino acids, preferably 1 to 4 amino acids, more preferably 2 to 4 amino acids, and most preferably 3 amino acids at the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. It may further include 1 to 5 amino acids, preferably 1 to 4 amino acids, more preferably 2 to 4 amino acids, and most preferably 3 amino acids at the C-terminus.
  • the peptide fragment consisting of 1 to 5 amino acids at the N-terminus of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is referred to as the 'third peptide fragment', and the peptide fragment consisting of 1 to 5 amino acids at the C-terminus is referred to as 'the third peptide fragment'.
  • the peptide fragment consisting of is referred to as the 'fourth peptide fragment'.
  • the isoelectric point (PI) of the peptide fragment containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is 3.80. Therefore, in order for the peptide provided in the present invention to have an isoelectric point (PI) of 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more, the total isoelectric point (PI) of the third and fourth peptide fragments is 10 or more. , it is preferable that it is 11 or more or 12 or more.
  • the third peptide fragment may include or consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 11 to 14.
  • the fourth peptide fragment may include or consist of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 15 to 18.
  • the peptide may include an amino acid sequence represented by the following general formula 1 shown in SEQ ID NO: 19, and preferably consists of an amino acid sequence represented by the following general formula 1 shown in SEQ ID NO: 19: You can:
  • X 1 , X 3 , X 4 and X 6 may each be independently selected from basic amino acids
  • X 2 and X 5 may each be independently selected from polar amino acids.
  • the peptide may include one or more amino acid sequences of SEQ ID NOs. 20 to 26, or may include an amino acid sequence having more than 80% homology or identity thereto, preferably SEQ ID NO. 20. It may consist of any one of the amino acid sequences from 26 to 26.
  • the structure of the TGF- ⁇ 1 and TGF- ⁇ receptor complex (PDB ID: 3KFD) was searched on the PROTEIN DATA BANK site (https://www.rcsb.org/). The structure of the TGF- ⁇ 1 and TGF- ⁇ receptor complex was observed using Pymol software, and the amino acid sequence of SEQ ID NO. 1 involved in binding was confirmed.
  • the amino acid sequence of SEQ ID No. In order to increase the solubility of the peptide while maintaining the inhibitory function of the peptide that binds to the TGF- ⁇ receptor instead of TGF- ⁇ 1, the amino acid sequence of SEQ ID No.
  • the basic amino acid sequence was added and changed.
  • TGF Seven candidate amino acid sequences derived from TGF- ⁇ targeting the - ⁇ receptor were designed and the results are shown in Table 9.
  • the optimal peptide sequence was designed to increase the solubility of the peptide.
  • the results of calculating the isoelectric point of each fragment forming the peptide during the process are shown in Table 9.
  • a control group with a pI value of 3.12 was used. The sequence was prepared.
  • Example 1 To confirm whether the candidate peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20 to 26 produced in Example 1 can inhibit TGF- ⁇ signaling, the following experiment was performed.
  • HEK293_TGF- ⁇ /SMAD Signaling Pathway SBE Reporter Cell Line cells in which firefly luciferase is regulated according to the transcriptional activity of SMAD-responsive elements (SBE), which is TGF- ⁇ /SMAD signaling.
  • SBE SMAD-responsive elements
  • TGF- ⁇ /SMAD Signaling Pathway SBE Reporter HEK293 Cell Line Cat. 60653, BPS Bio
  • 'HEK293_SBE_luc cells' commercially available cell line products
  • HEK293_SBE_luc cells were inoculated into 100 ⁇ l of MEM-EBBS medium at a number of 5 24 hours after inoculation, the rhTGF- ⁇ solution was diluted to a final concentration of 100 pg/ml using MEM-EBBS medium and then added to each well, and the candidate peptide prepared in Example 1 was injected into MEM-EBBS medium. After diluting with EBBS medium to a final concentration of 10 ⁇ M or 50 ⁇ M, 50 ⁇ l was added to each well. The final volume for each well was 200 ⁇ l/well. After 24 hours, 100 ⁇ l of luciferase assay solution was added to each well, and the degree of luminescence was confirmed using a multiplate reader, and the results are shown in Figure 1.
  • all candidate peptides according to the present invention bind to the TGF- ⁇ receptor and effectively inhibit TGF- ⁇ signaling, while the pI value is 3.12, which is acidic. It was confirmed that the phosphorus control sequence had a low binding affinity to the TGF- ⁇ receptor and had a minimal inhibitory effect on TGF- ⁇ signaling.
  • 1 x 10 3 HEK293_SBE_luc cells were mixed with 100 ⁇ L of cell culture medium, dispensed into a white 96-well plate, and cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours. After culturing for 24 hours, the used medium was removed from each well, and 1 x 10 3 transfected 293T cells were mixed with 100 ⁇ L of culture medium containing rhTGF- ⁇ 1 (final concentration: 0.05 ng/mL) and added to the plate. Afterwards, the cells were further cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours.
  • Example 3 From the results of Example 3, the ability of cells expressing the peptide according to the present invention to inhibit TGF- ⁇ signaling was confirmed. In the following experiment, it was confirmed whether the peptide was actually secreted from the cells and exerted a TGF- ⁇ inhibitory effect. The experiment was performed in the same manner as in Example 3, but instead of co-culturing HEK293_SBE_luc cells and 293T cells transiently transfected with the gene expressing UP02aTGFbR, 100 ⁇ L of conditioned medium harvested from the 293T cells was treated with HEK293_SBE_luc cells. At this time , the conditioned medium refers to the used medium obtained after mixing 8 do.
  • HEK293_SBE_luc cells were treated with conditioned medium from 293T cells transfected with an empty vector (pcDNA3pcDNA3.4-CMV-IL2ss-mock-neo/kan-Amp).
  • the peptides according to the present invention are all very promising as therapeutic agents for various cancer-related diseases by inhibiting TGF- ⁇ signaling.
  • the present invention can be used to effectively prevent, improve, or treat TGF- ⁇ -related diseases using a novel peptide that can inhibit TGF- ⁇ signaling.

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Abstract

본 발명은 TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드는 TGF-β에 의한 신호전달 경로를 억제하거나 또는 TGF-β의 발현을 억제할 수 있는 바, TGF-β 신호전달에 의한 다양한 질환을 치료 또는 예방할 수 있다.

Description

TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도
본 발명은 TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
TGF-β 사이토카인은 세포 군체 형성을 자극하는 능력에 의해 발견되었는데 (Roberts AB, et al, Proc Natl Acad Sci USA 78: 5339-43, 1981), 이 과정이 세포 형질전환의 대표적인 표지이기 때문에 상기 사이토카인은 형질전환 성장인자 베타라고 명명되었으며, TGF-β 리간드들(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3)은 다기능성 성장인자의 원형으로서 인식되고 있다. TGF-β는 상피, 내피 및 조혈세포의 증식 저해제, 세포외 기질 생산과 침착 및 조직 수복 연쇄반응의 가장 강력한 조절 인자 중 하나로 알려져 있다.
한편, TGF-β는 암의 진행 단계에서 종양 성장, 침윤 및 전이를 하는 것으로 알려져 있으며, 구체적으로 TGF-β는 종양 세포나 다른 여러가지 세포 활성에서 EMT(epithelial-mesenchymal transition)를 조절하는 Ras-MAPK 나 PI3K-AKT를 포함해 수많은 SMAD 비의존적인 신호경로를 활성화하여 암화 과정에서 다양한 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
따라서, 최근 TGF-β가 종양 성장 및 전이를 예방 또는 치료하는 표적으로 고려되고 있으며, TGF-β에 대한 단클론 항체, 저분자화합물 (kinase inhibitor), 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (ASOs), 키메라 단백질을 포함하는 여러 가지 TGF-β 저해제가 현재 임상에서 시험되고 있다. 다만 TGF-β 신호 억제에 기초한 치료법 개발은 오랫동안 더디게 진행되고 있다.
이러한 문제를 해결하기 위해, TGF-β 신호전달 경로를 효과적으로 억제할 수 있는 치료제의 개발이 필요하다.
본 발명의 일 목적은 전환성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 경로를 효과적으로 억제할 수 있는 신규한 펩타이드를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 제공하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에서 제공하는 발현 벡터로 형질 감염된 숙주 세포와 이의 배양물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에서 제공하는 상기 펩타이드, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 발현 벡터, 상기 숙주 세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 TGF-β 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료 조성물을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 전환성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 경로를 효과적으로 억제할 수 있는 신규한 펩타이드에 관한 것이다.
본 명세서에서의 용어, "전환성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β)"란, TGF-β 초가계에 속하는 사이토카인으로서, 포유류에서 발현되는 TGF-β의 형태로는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 3가지가 알려져 있다. 상기 TGF-β에 의한 신호전달은 다양한 생물학적 과정에서 결정적인 역할을 하며 세포 성장 억제, 세포 사멸, 분화 및 상피-간충직 전이 (epithelial-mesenchymal transition, EMT)와 같은 다양한 기능을 수행한다. TGF-β 신호전달계는 엄격하게 조절되며 세포 항상성의 유지와 더불어 발생 및 기관 형성에 결정적인 역할을 한다. 따라서 TGF-β 신호 전달의 교란은 암, 섬유증 및 선천성 기형과 같은 생명을 위협하는 질환을 유발할 수 있다.
TGF-β는 암화 과정의 초기단계에서는 암 억제 활성을 나타내나, 암화 과정의 후기에는 암 성장을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 특히, TGF-β1은 대부분의 암 조직에서 다량으로 발현되며, TGF-β1의 발현이 높은 암 환자의 경우 악성인 경우가 많고 예후 또한 좋지 않은 것으로 알려져 있다. 세포에서 분비된 TGF-β는 타입 I 및 타입 II 수용체로 구성된 두가지 타입의 수용체의 이종 복합체에 결합하여 신호전달을 개시한다. TGF-β는 II 형 수용체에 결합하게 되면 I 형 수용체는 이를 인식하여 II형 수용체에 결합을 하게 되는데 이때 II형 수용체가 I형 수용체의 GS부위를 인산화 시키게 되면 I 형 수용체 키나아제(kinase)가 활성화되게 된다. 인산화된 TGF-β I 형 수용체는 Smad2 및 Smad3라는 TGF-β 신호전달 매개체의 C-말단 세린 잔기를 인산화시킴으로써 Smad2 및 Smad3의 활성화를 유발한다. 활성화된 Smad2 및 Smad3은 Smad4와 복합체를 형성하여 핵으로 이동하여 표적 유전자의 발현에 관여한다.
또한, TGF-β는 면역계의 많은 구성 요소의 기능과 확장을 저해함으로써 면역 내성과 염증 반응을 조절하는 등 면역 항상성(homeostasis)과 관용(tolerance)을 결정 짓는 중요한 집행자 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 특히 종양미세환경에서 면역 억제의 중재자로서 TGF-β가 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서, 종양의 면역 환경 내에서 TGF-β가 암의 성장 촉진에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져, 면역항암제와 다양한 TGF-β 신호전달 저해제의 병용 치료가 연구 개발되고 있다.
본 발명의 펩타이드는 TGF-β 수용체(TGFBR1 및/또는 TGFBR2)에 결합하여 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 펩타이드는 TGF-β와 경쟁하여 TGF-β 수용체에 결합함으로써 TGF-β 사이토카인이 TGF-β 수용체에 결합하는 것을 방해하는 기전을 통해 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 상기 펩타이드는 세포의 TGF-β 발현 수준 자체를 억제시켜 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 펩타이드는 자가-억제 경로(auto-inhibition pathway)를 통해 세포 내의 TGF-β 발현 수준을 감소시키거나, TGF-β의 세포외 배출량을 감소시키는 기전을 통해 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
서열번호 서열 정보
1 PYIWS
본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 13 내지 22개의 아미노산, 바람직하게는 14 내지 20개, 보다 바람직하게는 16 내지 20개의 아미노산, 가장 바람직하게는 18개의 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 4 내지 9개, 바람직하게는 4 내지 8개, 보다 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개의 아미노산을 더 포함하고, C-말단에도 4 내지 9개, 바람직하게는 4 내지 8개, 보다 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개 또는 7개의 아미노산을 더 포함할 수 있다. 이때, 본 명세서에서는 편의상, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 4 내지 9개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 단편을 ‘제1 펩타이드 단편’이라고 지칭하고, C-말단에 4 내지 9개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 단편을 ‘제2 펩타이드 단편’이라고 지칭한다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 등전점(isoelectric point; PI)이 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상이고, 13 이하인 것일 수 있고, 바람직하게는 8 이상, 8.2 이상, 8.4 이상, 8.6 이상, 8.8 이상, 9 이상, 9.2 이상, 9.4 이상, 9.6 이상, 9.8 이상 또는 10 이상이고, 그리고 13 이하인 것일 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 상기한 등전점을 갖도록 설계됨으로써, TGF-β 수용체와의 결합력이 높이고, TGF-β 활성을 억제하는 등으로 TGF-β 신호전달을 억제할 수 있도록 하였다. 반대로 펩타이드가 상기 등전점 범위를 벗어나는 경우 TGF-β 수용체와의 결합력이 현저히 감소하여, TGF-β 활성의 억제 효과나 TGF-β 신호전달의 억제 효과 또한 감소될 수 있다. 본 발명에서 펩타이드 또는 단백질의 등전점을 계산하거나 측정하기 위한 프로그램 및 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, pI는 하기로부터 이용가능한 Prot Param 소프트웨어를 사용하여 계산될 수 있다: http://web.expasy.org/protparam/
본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 단편의 등전점(PI)은 5.95이다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 펩타이드가 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상의 등전점(PI)을 가지기 위해서, 상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편의 총 등전점(PI)은 9 이상, 10 이상 또는 11 이상인 것이 바람직하다.
본 발명에서 상기 제1 펩타이드 단편은 적어도 하나의 염기성 아미노산을 포함하거나, 적어도 하나의 극성 아미노산을 포함하거나 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 제2 펩타이드 단편은 적어도 하나의 염기성 아미노산을 포함하거나, 적어도 하나의 극성 아미노산을 포함하거나 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 염기성 아미노산으로는 히스티딘(H), 라이신(K) 또는 아르기닌(R)일 수 있고, 상기 극성 아미노산으로는 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 또는 타이로신(Y)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 제1 펩타이드 단편은, 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 트레오닌(T), 글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 제1 펩타이드 단편은, 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 트레오닌(T), 글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하고, 글라이신(G) 및 프롤린(P) 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제1 펩타이드 단편은, 1개 이상의 아르기닌(R), 1개 이상의 세린(S), 1개 이상의 글라이신(G) 및 1개 이상의 프롤린(P)을 포함하거나, 아르기닌(R), 세린(S), 글라이신(G) 및 프롤린(P)을 포함하거나, 이들 아미노산으로 이루어질 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제1 펩타이드 단편은, 1개 이상의 세린(S), 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 트레오닌(T), 1개 이상의 글라이신(G) 및 1개 이상의 프롤린(P)을 포함하거나, 세린(S), 라이신(K), 트레오닌(T), 글라이신(G) 및 프롤린(P)을 포함하거나, 이들 아미노산으로 이루어질 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제1 펩타이드 단편은, 1개 이상의 세린(S), 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 글루타민(Q), 1개 이상의 글라이신(G) 및 1개 이상의 프롤린(P)을 포함하거나, 세린(S), 라이신(K), 글루타민(Q), 글라이신(G) 및 프롤린(P)을 포함하거나, 이들 아미노산으로 이루어질 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제1 펩타이드 단편은, 1개 이상의 세린(S), 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 아스파라긴(N), 1개 이상의 글라이신(G) 및 1개 이상의 프롤린(P)을 포함하거나, 세린(S), 라이신(K), 아스파라긴(N), 글라이신(G) 및 프롤린(P)을 포함하거나, 이들 아미노산으로 이루어질 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제1 펩타이드 단편은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 서열 정보
2 RSRGPS
3 KTKGPS
4 KQKGPS
5 KNKGPS
본 발명에서 상기 제2 펩타이드 단편은, 트레오닌(T), 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 제2 펩타이드 단편은, 트레오닌(T), 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하고, 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제2 펩타이드 단편은, 1개 이상의 트레오닌(T), 1개 이상의 아르기닌(R), 1개 이상의 세린(S), 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 류신(L), 1개 이상의 아스파트산(D) 및 1개 이상의 페닐알라닌(F)을 포함하거나, 트레오닌(T), 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)을 포함하거나, 이들 아미노산으로 이루어질 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제2 펩타이드 단편은, 1개 이상의 트레오닌(T), 1개 이상의 아르기닌(R), 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 류신(L), 1개 이상의 아스파트산(D) 및 1개 이상의 페닐알라닌(F)을 포함하거나, 트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)을 포함하거나, 이들 아미노산으로 이루어질 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제2 펩타이드 단편은, 1개 이상의 트레오닌(T), 1개 이상의 아르기닌(R), 1개 이상의 글루타민(Q), 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 류신(L), 1개 이상의 아스파트산(D) 및 1개 이상의 페닐알라닌(F)을 포함하거나, 트레오닌(T), 아르기닌(R), 글루타민(Q), 라이신(K), 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)을 포함하거나, 이들 아미노산으로 이루어질 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제2 펩타이드 단편은, 1개 이상의 트레오닌(T), 1개 이상의 아르기닌(R), 1개 이상의 아스파라긴(N), 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 류신(L), 1개 이상의 아스파트산(D) 및 1개 이상의 페닐알라닌(F)을 포함하거나, 트레오닌(T), 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 라이신(K), 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)을 포함하거나, 이들 아미노산으로 이루어질 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제2 펩타이드 단편은 서열번호 6 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 서열 정보
6 LDTFRSK
7 LDTFKTR
8 LDTFKQR
9 LDTFKNR
본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
서열번호 서열 정보
10 GPSPYIWSLDTF
또한, 본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 내지 4개, 가장 바람직하게는 3개의 아미노산을 더 포함하고, C-말단에도 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 내지 4개, 가장 바람직하게는 3개의 아미노산을 더 포함할 수 있다. 이때, 본 명세서에서는 편의상, 상기 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 단편을 ‘제3 펩타이드 단편’이라고 지칭하고, C-말단에 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 단편을 ‘제4 펩타이드 단편’이라고 지칭한다.
본 발명에서 상기 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 단편의 등전점(PI)은 3.80이다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 펩타이드가 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상의 등전점(PI)을 가지기 위해서, 상기 제3 펩타이드 단편 및 제4 펩타이드 단편의 총 등전점(PI)은 10 이상, 11 이상 또는 12 이상인 것이 바람직하다.
본 발명에서 상기 제3 펩타이드 단편은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 이들의 조합으로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 제4 펩타이드 단편은 염기성 아미노산, 극성 아미노산 또는 이들의 조합으로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 염기성 아미노산으로는 히스티딘(H), 라이신(K) 또는 아르기닌(R)일 수 있고, 상기 극성 아미노산으로는 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 또는 타이로신(Y)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 제3 펩타이드 단편은 라이신(K), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N) 및 글루타민(Q)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제3 펩타이드 단편은 1개 이상의 아르기닌(R) 및 1개 이상의 세린(S)을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제3 펩타이드 단편은 1개 이상의 라이신(K) 및 1개 이상의 트레오닌(T)을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제3 펩타이드 단편은 1개 이상의 라이신(K) 및 1개 이상의 글루타민(Q)을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제3 펩타이드 단편은 1개 이상의 라이신(K) 및 1개 이상의 아스파라긴(N)을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제3 펩타이드 단편은 서열번호 11 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 서열 정보
11 RSR
12 KTK
13 KQK
14 KNK
본 발명에서 상기 제4 펩타이드 단편은 라이신(K), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N) 및 글루타민(Q)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제4 펩타이드 단편은 1개 이상의 아르기닌(R), 1개 이상의 세린(S) 및 1개 이상의 라이신(K)을 포함할 수 있고, 아르기닌(R), 세린(S) 및 라이신(K)을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제4 펩타이드 단편은 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 트레오닌(T) 및 1개 이상의 아르기닌(R)을 포함할 수 있고, 라이신(K), 트레오닌(T) 및 아르 기닌(R)을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제4 펩타이드 단편은 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 글루타민(Q) 및 1개 이상의 아르기닌(R)을 포함할 수 있고, 라이신(K), 글루타민(Q) 및 아르기닌(R)을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제4 펩타이드 단편은 1개 이상의 라이신(K), 1개 이상의 아스파라긴(N) 및 1개 이상의 아르기닌(R)을 포함할 수 있고, 라이신(K), 아스파라긴(N) 및 아르기닌(R)을 포함할 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제4 펩타이드 단편은 서열번호 15 내지 18 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 서열 정보
15 RSK
16 KTR
17 KQR
18 KNR
본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 19로 기재되는 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 19로 기재되는 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다:
[일반식 1]
X1-X2-X3-G-P-S-P-Y-I-W-S-L-D-T-F-X4-X5-X6
상기 일반식 1에서, X1, X3, X4 및 X6은 각각 독립적으로 염기성 아미노산 중에서 선택될 수 있고,
X2 및 X5는 각각 독립적으로 극성 아미노산 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 염기성 아미노산으로는 히스티딘(H), 라이신(K) 또는 아르기닌(R)일 수 있고, 상기 극성 아미노산으로는 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 또는 타이로신(Y)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 20 내지 26 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 20 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 다만, 본 발명에서는 상기 서열번호 20 내지 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 동일한 활성을 갖는 서열은 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 20 내지 26의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 본원발명에서 상기 펩타이드는 상기 서열번호 20 내지 26의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
서열번호 서열 정보
20 RSRGPSPYIWSLDTFRSK
21 KTKGPSPYIWSLDTFRSK
22 KQKGPSPYIWSLDTFRSK
23 KNKGPSPYIWSLDTFRSK
24 RSRGPSPYIWSLDTFKTR
25 RSRGPSPYIWSLDTFKQR
26 RSRGPSPYIWSLDTFKNR
즉, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, '서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드'는, 이와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드'에 속할 수 있음은 자명하다.
본 명세서에서의 용어 "상동성" 이란, 단백질을 코딩하는 염기 서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 단백질 또는 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 또한, 상동성은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도에 따라 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor,New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York; Needleman, S.B. and Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453)으로 결정될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기한 펩타이드들은 TGF-β 수용체에 결합하거나, TGF-β의 발현 수준 또는 세포외 배출량을 감소시켜 TGF-β 신호전달을 억제하며, 이를 토대로 TGF-β 신호전달 관련 질환을 치료 또는 예방할 수 있고, 나아가서는 TGF-β 발현 암 또한 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 명세서에서의 용어 "폴리뉴클레오티드"란, 뉴클레오티드가 결합한 고분자 물질로서, 유전 정보를 코딩하고 있는 DNA를 의미한다.
본 발명에서 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 각 서열번호로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 펩타이드와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 펩타이드를 코딩하는 염기 서열이라면 제한 없이 포함된다. 또한 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 펩타이드와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열로, 예컨대 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가지는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 발명에서 상기 펩타이드들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 각 펩타이드들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 공지의 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기 펩타이드의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 염기 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃ 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃ 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃ 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서의 용어 "발현 벡터"란, 적당한 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.
본 발명에서 상기 외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 발현 벡터로는 나노입자, 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 이용될 수 있다.
다양한 유전자 전달 비히클은 당 분야에 공지되어 있으며, 바이러스 및 비-바이러스(예를 들어, 네이키드 DNA, 플라스미드) 벡터 둘 모두를 포함한다. 유전자 전달에 적합한 바이러스 벡터는 당업자에게 공지되어 있다. 상기 바이러스 벡터의 비제한적 예시로는 레트로바이러스 벡터 (몰로니 쥐 백혈병 바이러스 벡터 (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유도), 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유도), 이의 복제 컴피턴트, 복제 결여 및 무기력한 형태를 포함하는 아데노바이러스 (Ad) 벡터, 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40 (SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인 바 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 수두 바이러스 벡터, 하비 쥐 육종 바이러스 벡터, 쥐 유방 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터, 파보바이러스 벡터, 소아 마비 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 마라바 바이러스 벡터 및 그룹 B 아데노바이러스 에나데노툭시레브 벡터 등을 포함할 수 있다.
유전자 전달을 위한 비-바이러스 벡터는 네이키드 DNA, 플라스미드, 트랜스포존 및 mRNA 등을 포함한다. 비제한적인 예는 pKK 플라스미드(Clonetech), pUC 플라스미드, pET 플라스미드(Novagen, Inc., Madison, Wis.), pRSET 또는 pREP 플라스미드(Invitrogen, San Diego, Calif.), pMAL 플라스미드(New England Biolabs, Beverly, Mass.)를 포함한다.
본 발명의 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 또는 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 펩타이드를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 암호화 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 본 발명에서 상기 "프로모터"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자와 같은 암호화 서열의 발현을 조절하는 임의의 서열을 나타낸다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적, 유도성, 억제성, 또는 조직-특이적일 수 있다. 프로모터는 전사의 시작 및 속도가 제어되는 폴리뉴클레오타이드 서열의 영역인 제어 서열이다. 본 발명에서 상기 프로모터의 비-제한적 예시로는 라우스 육종 바이러스 (Rous sarcoma virus: RSV) LTR 프로모터 (선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, U6 프로모터, EF1알파 짧은 형태 (EFS) 프로모터, 인간 폴리펩타이드 사슬 연장 인자 (EF1a) 프로모터, P5 프로모터, Ubc 프로모터, CAG 프로모터, TRE 프로모터, UAS 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, CaMKIIa 프로모터, Gal1 프로모터, TEF1 프로모터, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, 유비퀴틴 (Ubi) 프로모터, 예컨대 유비퀴틴 C (UbiC), H1 프로모터, U6 프로모터, 알파-1-안티트립신 프로모터, 비장 병소 형성 바이러스 (spleen focus-forming virus: SFFV) 프로모터 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 프로모터는 전사 효율을 증가시키기 위해 인핸서에 커플링될 수 있다. 이때 상기 인핸서의 비-제한적 예시로는 RSV 인핸서, CMV 인핸서, 또는 α-태아 단백질 MERII 인핸서 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신호 펩타이드는 일반적으로 아미노산 15 내지 30개 범위로, 예를 들면, CD8 신호 펩타이드 (아미노산 21개), CD33 신호 펩타이드 (아미노산 17개), CD4 신호 펩타이드 (아미노산 25개), IL-2R (CD25) 신호 펩타이드 (아미노산 21개), 트립시노겐-2 신호 펩타이드 (아미노산 15개), VEGFR1 신호 펩타이드 (아미노산 26개), EGFR 신호 펩타이드 (아미노산 24개), GMCSFR 신호 펩타이드 (아미노산 22개), IgVL 신호 펩타이드, IgVK 신호 펩타이드 또는 Ig VH 신호 펩타이드 등이 있을 수 있다.
본 발명에서 상기 신호 펩타이드는 서열번호 28로 표시되는 IL-2 신호 펩타이드이거나, 서열번호 29로 표시되는 Ig 신호 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
서열번호 서열 정보
28 MYRMQLLSCIALSLALVTNS
29 METGLRWLLLVAVLKGVQCE
또한, 본 발명에서 상기 벡터는 하나 이상의 추가 폴리펩타이드, 예를 들어 하나 이상의 마커 및/또는 하나 이상의 이펙터 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 하나 이상의 마커는 형질 도입 마커, 대리 마커 및/또는 선택 마커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가 폴리펩타이드를 암호화하는 도입된 추가 핵산 서열 중에는, 예컨대 전달된 세포의 생존 능력 및/또는 기능을 촉진함으로써 요법의 효능을 개선할 수 있는 핵산 서열; 예컨대 생체 내에서 생존 또는 국소화를 평가하기 위해 세포의 평가 및/또는 선택을 위한 유전자 마커를 제공하는 핵산 서열; 문헌[Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)]에 기재된 바와 같이 예를 들어 생체 내에서 음성 선택에 세포를 예민하게 만들어 안정성을 개선하기 위한 핵산 서열이 포함되고; 또한 우성 양성 선택 가능 마커의 음성 선택 가능 마커와의 융합에서 유래된 2작용성 선택 가능 융합 유전자의 용도를 기술하는 문헌[WO 1992008796 및 WO 1994028143] 및 미국 특허 번호 제6,040,177호를 참조할 수 있다.
본 발명에서 상기 마커는 형질 도입 마커 또는 대리 마커일 수 있다. 상기 형질 도입 마커 또는 대리 마커는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(또는 유전자 컨스트럭트), 즉 본 발명의 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 세포를 검출하는데 사용될 수 있다. 여기서, 상기 형질 도입 마커는 세포의 변형을 나타내거나 확인할 수 있고, 상기 대리 마커는 상기 펩타이드 또는 단편과 함께 세포 표면 상에 공발현되도록 제조된 단백질일 수 있다. 본 발명에서 상기 대리 마커는 거의 또는 전혀 활성을 갖지 않도록 변형된 표면 단백질일 수 있다. 본 발명에서, 상기 대리 마커는 상기 펩타이드 또는 단편을 암호화하는 동일한 폴리뉴클레오타이드 상에 암호화될 수 있다. 본 발명에서 상기 펩타이드 또는 그 단편을 암호화하는 핵산 서열은, 선택적으로 자가 절단 펩타이드 또는 리보솜 건너뛰기를 야기하는 펩타이드, 예컨대 2A 서열을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명에서 상기 예시적인 대리 마커는 세포 표면 폴리펩타이드의 절단 형태, 예컨대 비기능적이며 전장 형태의 세포 표면 폴리펩타이드에 의한 신호 또는 이에 의해 일반적으로 전달되는 신호를 전달할 수 없거나 전달하지 않고/거나 내재화될 수 없거나 내재화되지 않는 절단 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 절단형 세포 표면 폴리펩타이드는, 성장 인자 또는 다른 수용체의 절단 형태, 예컨대 절단형 인간 표피 성장 인자 수용체 2(truncated human epidermal growth factor receptor 2, tHER2), 절단형 표피 성장 인자 수용체(tEGFR) 또는 전립선 특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA) 또는 이의 변형된 형태, 예컨대 절단형 PSMA(tPSMA)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, tEGFR은 항체 세툭시맙(Erbitux) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유할 수 있으며, 이는 tEGFR 작제물 및 암호화된 외인성 단백질로 조작된 세포를 확인 또는 선택하기 위해 및/또는 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거 또는 분리하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 대리 마커로는, CD34의 전부 또는 일부(예를 들어, 절단 형태), NGFR, CD19 또는 절단형 CD19, 예를 들어 절단형 비-인간 CD19를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 마커는 검출 가능한 단백질, 예컨대 형광 단백질, 예컨대 그린 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 강화된 그린 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, EGFP), 예컨대 슈퍼-폴드 GFP(super-fold GFP, sfGFP), 레드 형광 단백질(red fluorescent protein, RFP), 예컨대 tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 블루 그린 형광 단백질(blue green fluorescent protein, BFP), 강화된 블루 형광 단백질(enhanced blue fluorescent protein, EBFP) 옐로우 형광 단백질(yellow fluorescent protein, YFP) 및 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체 및 코돈-최적화되고 안정화된 및/또는 강화된 변이체를 포함한 이의 변이체이거나 이를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 마커는 효소, 예컨대 루시퍼라제, 대장균 유래 lacZ 유전자, 알칼리 포스파타제, 분비 배아 알칼리 포스파타제(secreted embryonic alkaline phosphatase, SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyl transferase, CAT), β-갈락토시다제 또는 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase, GUS)이거나 이를 포함한다. 상기 효소의 발현은, 효소의 발현 및 기능적 활성 시 검출될 수 있는 기질의 첨가로 검출될 수 있다.
본 발명에서 상기 마커는 선택 마커일 수 있다. 상기 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 대한 내성을 부여하는 폴리펩타이드거나 이를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 선택 마커는 항생제 내성 유전자일 수 있고, 비제한적 예시로는 퓨로마이신 내성 유전자, 히그로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 게네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 이의 변형된 형태이거나 이를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포 또는 이의 배양물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩타이드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포 배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩타이드(들)로 체내에서 형질주입된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 통상의 기술분야에 잘 알려져 있는 적당한 세포주들은 ATCC (American Type Culture Collection)와 같은 세포주 기탁기관으로부터 수득할 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터는 본원에 개시되거나 인용되거나 관련 기술 분야의 당업자에게 달리 공지된 방법을 사용하여 많은 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예컨대, 상기 발현 벡터는 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다.
본 발명에서는 상기한 숙주 세포로부터 발현되는 TGF-β 신호전달을 억제하는 펩타이드를 수득하기 위하여, 상기 숙주 세포의 배양 후 얻어진 배양물을 이용할 수 있다. 여기서, 상기 숙주 세포의 배양물은, 특정 세포가 배양되기에 적합한 배지에서 제조된다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 ActiPro 배지(HyClone), ExCell Advanced 유가 배치 배지(SAFC), Ham's F10(Sigma, St. Louis, MO), 최소 필수 배지(MEM, Sigma), RPMI-1640(Sigma) 및 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM, Sigma)가, 예시적인 영양 용액이다. 적합한 배지는 또한 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제5,122,469호; 제4,560,655호; 및 WO 90/03430 및 WO 87/00195에도 기재되어 있는데; 이들의 개시는 본 명세서에 참조로 포함된다. 이들 배지 중 어느 것도 혈청, 호르몬 및/또는 다른 성장 인자들(예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염(예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제(예컨대, HEPES), 뉴클레오시드(예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예컨대, 겐타마이신(gentamicin), 미량 원소(통상 마이크로몰 범위의 최종 농도로 일반적으로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 지질(예컨대, 리놀레산 또는 다른 지방산) 및 이들의 적합한 담체, 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 필요한 만큼 보충될 수 있다. 선별 마커, 예컨대 GS가 사용되는 경우, 상기 배지는 글루타민이 결핍된 것일 수 있다. 상기 열거한 종류 외에 임의의 다른 필수 보충제도 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 숙주 세포의 배양 시 다양한 배양 시스템으로, 예를 들어, 페트리 디쉬, 96 웰 플레이트, 롤러 보틀, 관류 시스템 및 바이오리액터 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 숙주 세포의 배양 시 배양 조건으로, 예컨대 온도, pH, 용존 산소(dO2) 등은, 사용되는 숙주 세포의 종류에 따라 적절히 조절할 수 있다. 하지만 일반적으로는, pH는 산(예를 들어, CO2) 또는 염기(예를 들어, Na2CO3 또는 NaOH)를 사용하여 약 6.5 내지 7.5의 수준으로 조절될 수 있다. 또한, 숙주 세포로 포유동물 세포, 특히는 CHO 세포나 293T 세포 등을 배양하는 경우, 약 30 ℃ 내지 38 ℃의 온도 하에서, 그리고 적합한 dO2는 5-90%의 공기 포화도에서 배양할 수 있다.
본 발명에서는 상기한 숙주 세포의 용해물이나 숙주 세포의 배양물로부터 본 발명에 따르는 TGF-β 신호전달을 억제하는 폴리펩타이드를 회수할 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 분리 및 정제 방법으로는 일반적인 방법을 수행할 수 있으나, 예를 들면, 컬럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 및 재결정 등에서 적절히 선택 및 조합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 펩타이드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 본 발명의 발현 벡터 또는 본 발명의 숙주 세포나 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 TGF-β 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 조성물에 포함된 펩타이드는 TGF-β 수용체에 결합하거나, TGF-β의 발현 수준 또는 세포외 배출량을 감소시키는 등으로 TGF-β 신호전달을 억제할 수 있고, 이에 따라 TGF-β 관련 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "TGF-β 관련 질환" 또는 "TGF-β 질환"은 본 발명의 TGF-β 신호전달 경로를 억제하는 펩타이드를 이용한 치료로부터 이득을 얻는 모든 장애, 질병 또는 질환을 의미하며, 이에는 개체가 질환에 걸리기 쉬운 병리 상태를 포함한 만성 및 급성 질환 또는 질병이 포함된다.
본 발명에서 상기 TGF-β 관련 질환은 세포외 매트릭스의 축적을 특징으로 하는 질병, 순환성 TGF-β 또는 국소 부위에서 활성화된 TGF-β에 의해 유발된 질병, 내인성 TGF-β 생성으로 인한 면역계 억제에 의해 유발된 질환, 중증 상해, 화상 및 중병, 예를 들어 바이러스성 또는 세균성 감염증으로부터 비롯된 급성 면역 결핍증, TGF-β 생성 또는 과생성으로 인한 다기관 전신병, 및 TGF-β 생성 종양을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 TGF-β 관련 질환의 예에는 암, 뇌 신경 질환(예를 들어 알츠하이머 치매 및 헌팅턴 질환), 섬유성 피부 질환(예를 들어 피부 경화증, CNS 병리학 반흔 조직, 피부 반흔 형성, 켈로이드 반흔 형성 및 신경 반흔 형성), 폐, 간 및 신장의 섬유성 질환(예를 들어 만성 간성 섬유증, 급성 간 손상, 간질성 폐 및 신 섬유증, 및 간경화증), 낭포성 섬유증, 심장 섬유증, 아테롬성 경화증 및 동맥경화증, 전신성 경화증, 및 안구 섬유증 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
최근 많은 연구들에서 TGF-β 신호전달 경로를 억제함으로써 암을 치료할 수 있는 것이 밝혀진 바 있다(Kim et al. J Hematol Oncol (2021) 14:55 https://doi.org/10.1186/s13045-021-01053-x). 본 발명에서 제공하는 펩타이드는 TGF-β 신호전달을 효과적으로 억제하므로, 본 발명에서 제공하는 펩타이드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터 또는 상기 발현 벡터로 형질 감염된 숙주 세포나 이의 배양물 모두 TGF-β 관련 질환으로 다양한 종류의 암에 대한 치료 또는 예방 등에 적용될 수 있다.
본 명세서에서의 용어 "암"은 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자라난 종양, 또는 종양을 형성하는 병을 의미한다. 상기 암은 TGF-β를 발현하는 암, 보다 바람직하게는 TGF-β의 과도한 활성화를 특징으로 하는 암일 수 있으며, 구체적으로 간암, 폐암, 췌장암, 비소세포성 폐암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 해당 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서의 용어 "예방"은, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 해당 질환 또는 질환의 발병 가능성이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 화장료 조성물의 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서, "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 해당 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 성인 1인당 약 0.1ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 상기 약학적 조성물에 형질 전환된 숙주 세포가 포함되는 경우, 상기 숙주 세포가 1 x 101 ~ 1 x 1050개/kg, 바람직하게는 1 x 101 ~ 1 x 1030개/kg, 보다 바람직하게는 1 x 105 ~ 1 x 1020개/kg, 가장 바람직하게는 1 x 107 ~ 1 x 109개/kg의 범위 내로 범위 내로 투여될 수 있도록 조절할 수 있다. 다만, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에서 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 크렌징밀크, 탈모제{화장용}, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누{비의료용}, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있고, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다.
그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 개체에게 본 발명의 TGF-β 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 TGF-β 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공하는 것이다. 상기 "TGF-β 관련 질환" 및 "조성물"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 상기 개체는 TGF-β 관련 질환이 발병되거나 발병할 위험이 있는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류, 파충류, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 주사제, 수액제(링겔), 캡슐제, 환제, 정제, 좌제 또는 패치의 형태로 제형화되어 투여할 수 있다. 상기 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 제형화되지 않은 형태로도 투여할 수 있고, 위산에 의하여 상기 약학적 조성물의 유효성분이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화된 형태 또는 경구용 패치형태로 구강내에 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 신규한 펩타이드는 TGF-β에 의한 신호전달 경로를 억제할 수 있는 바, TGF-β 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료하는 데에 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 2에서 HEK293_SBE_luc 세포에 rhTGF-β와 함께 본 발명의 펩타이드들을 처리한 뒤 루시퍼라제 어쎄이를 통해 발광 정도의 변화를 확인하여 TGF-β 신호전달 억제 효과를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 3에서 rhTGF-β와 함께 배양된 HEK293_SBE_luc 세포를, UP02aTGFbR 발현 벡터로 형질 감염된 293T 세포와 공배양한 뒤 루시퍼라제 어쎄이를 통해 발광 정도의 변화를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 4에서 rhTGF-β와 함께 배양된 HEK293_SBE_luc 세포에, UP02aTGFbR의 발현 벡터로 형질 감염된 293T 세포의 조건 배지를 처리한 뒤 루시퍼라제 어쎄이를 통해 발광 정도의 변화를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 5에서 rhTGF-β와 함께 배양된 HEK293_SBE_luc 세포에, Ig 신호 펩타이드-UP02aTGFbR의 발현 벡터로 형질 감염된 293T 세포의 조건 배지 또는 IL-2 신호 펩타이드-UP02aTGFbR의 발현 벡터로 형질 감염된 293T 세포의 조건 배지를 처리한 뒤 루시퍼라제 어쎄이를 통해 발광 정도의 변화를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명의 펩타이드는 TGF-β 수용체(TGFBR1 및/또는 TGFBR2)에 결합하여 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 펩타이드는 TGF-β와 경쟁하여 TGF-β 수용체에 결합함으로써 TGF-β 사이토카인이 TGF-β 수용체에 결합하는 것을 방해하는 기전을 통해 TGF-β 신호전달을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 13 내지 22개의 아미노산, 바람직하게는 14 내지 20개, 보다 바람직하게는 16 내지 20개의 아미노산, 가장 바람직하게는 18개의 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 4 내지 9개, 바람직하게는 4 내지 8개, 보다 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개의 아미노산을 더 포함하고, C-말단에도 4 내지 9개, 바람직하게는 4 내지 8개, 보다 바람직하게는 5 내지 8개, 가장 바람직하게는 6개 또는 7개의 아미노산을 더 포함할 수 있다. 이때, 본 명세서에서는 편의상, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 4 내지 9개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 단편을 ‘제1 펩타이드 단편’이라고 지칭하고, C-말단에 4 내지 9개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 단편을 ‘제2 펩타이드 단편’이라고 지칭한다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 등전점(isoelectric point; PI)이 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상이고, 13 이하인 것일 수 있고, 바람직하게는 8 이상, 8.2 이상, 8.4 이상, 8.6 이상, 8.8 이상, 9 이상, 9.2 이상, 9.4 이상, 9.6 이상, 9.8 이상 또는 10 이상이고, 그리고 13 이하인 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 단편의 등전점(PI)은 5.95이다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 펩타이드가 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상의 등전점(PI)을 가지기 위해서, 상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편의 총 등전점(PI)은 9 이상, 10 이상 또는 11 이상인 것이 바람직하다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제1 펩타이드 단편은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제2 펩타이드 단편은 서열번호 6 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 13 내지 22개의 아미노산, 바람직하게는 14 내지 20개, 보다 바람직하게는 16 내지 20개의 아미노산, 가장 바람직하게는 18개의 아미노산으로 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 내지 4개, 가장 바람직하게는 3개의 아미노산을 더 포함하고, C-말단에도 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 보다 바람직하게는 2 내지 4개, 가장 바람직하게는 3개의 아미노산을 더 포함할 수 있다. 이때, 본 명세서에서는 편의상, 상기 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 단편을 ‘제3 펩타이드 단편’이라고 지칭하고, C-말단에 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드 단편을 ‘제4 펩타이드 단편’이라고 지칭한다.
본 발명에서 상기 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 단편의 등전점(PI)은 3.80이다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 펩타이드가 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상 또는 10 이상의 등전점(PI)을 가지기 위해서, 상기 제3 펩타이드 단편 및 제4 펩타이드 단편의 총 등전점(PI)은 10 이상, 11 이상 또는 12 이상인 것이 바람직하다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제3 펩타이드 단편은 서열번호 11 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
일 예시로, 본 발명에서 상기 제4 펩타이드 단편은 서열번호 15 내지 18 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 19로 기재되는 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 19로 기재되는 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다:
[일반식 1]
X1-X2-X3-G-P-S-P-Y-I-W-S-L-D-T-F-X4-X5-X6
상기 일반식 1에서, X1, X3, X4 및 X6은 각각 독립적으로 염기성 아미노산 중에서 선택될 수 있고,
X2 및 X5는 각각 독립적으로 극성 아미노산 중에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는 서열번호 20 내지 26 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하거나, 이와 80% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게는 서열번호 20 내지 26 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] TGF-β 신호전달 억제 펩타이드 설계
TGF-β 신호전달 저해 펩타이드를 디자인하기 위하여, PROTEIN DATA BANK 사이트(https://www.rcsb.org/)에서 TGF-β1 와 TGF-β 리셉터 복합체 구조(PDB ID: 3KFD)를 찾았다. Pymol 소프트웨어를 통해 TGF-β1 와 TGF-β 리셉터 복합체 구조를 관찰하여 결합에 관여되는 서열번호 1의 아미노산 서열을 확인하였다. TGF-β1 대신 TGF-β 리셉터에 결합하는 펩타이드의 저해 기능을 유지하면서 펩타이드의 용해성(solubility)을 높이기 위해 결합에 관여되는 서열번호 1의 아미노산 서열은 유지한 체, 펩타이드 단편의 N-말단과 C-말단에 연결되는 펩타이드들의 서열 변경을 하였다. 저해 펩타이드의 타겟이 되는 TGF-β 리셉터의 세포 외 도메인(residues 34-126)의 이론 상 등전점(theoretical pI) 값을 ProtParam 서버((https://web.expasy.org/protparam/)에서 확인한 결과, 5.4 값으로 산성(acidic)인 것을 확인하였다. 결합에 방해가 될 수 있는 (-) 음 전하의 반발을 회피하면서 펩타이드의 용해성을 높이기 위하여, TGF-β1의 이론상 등전점(theoretical pI) 값인 8.6 부근 혹은 그 이상의 값이 얻어지도록 염기성의 아미노산 서열을 추가하여 변경하였다. 또한, 시스테인(cysteine)에서 세린(serin)으로의 서열 변경을 통해 이황화 결합의 형성으로 인한 펩타이드 간의 비특이적 결합의 억제, 그리고 TGF-β 리셉터와 결합하는 부분이 2차 구조를 유지 및 형성하게 하였다(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html). 이렇게 하여 TGF-β 수용체를 표적으로 하는 TGF-β 유래의 7개의 후보 아미노산 서열을 설계하여 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 다만, 상기와 같이 펩타이드의 용해성(solubility)을 높이기 위한 최적의 펩타이드 서열을 설계하는 과정 중에 펩타이드를 이루는 각 단편별 등전점을 계산한 결과를 표 9에 함께 나타내었다. 하기 실험에서 펩타이드의 등전점에 따른 TGF-β 신호전달 억제의 효과 차이를 확인하기 위하여, pI 값이 3.12인 대조군 서열을 제작하였다.
후보 펩타이드 아미노산 서열 서열번호 pI 값
UP02aTGFbR Full sequence N-term - RSRGPSPYIWSLDTFRSK - C-term 20 10.9
단편 1-1 N-term - GPSPYIWSLDTF - C-term 10 3.80
단편 1-2 N-term - RSR RSK - C-term 11 & 15 12.3
단편 2-1 N-term - PYIWS - C-term 1 5.95
단편 2-2 N-term - RSRGPS LDTFRSK - C-term 2 & 6 11.7
UP02bTGFbR Full sequence N-term - KTKGPSPYIWSLDTFRSK - C-term 21 10.0
단편 1-1 N-term - GPSPYIWSLDTF - C-term 10 3.80
단편 1-2 N-term - KTK RSK - C-term 12 & 15 11.3
단편 2-1 N-term - PYIWS - C-term 1 5.95
단편 2-2 N-term - KTKGPS LDTFRSK - C-term 3 & 6 10.3
UP02cTGFbR Full sequence N-term - KQKGPSPYIWSLDTFRSK - C-term 22 10.0
단편 1-1 N-term - GPSPYIWSLDTF - C-term 10 3.80
단편 1-2 N-term - KQK RSK - C-term 13 & 15 11.3
단편 2-1 N-term - PYIWS - C-term 1 5.95
단편 2-2 N-term - KQKGPS LDTFRSK - C-term 4 & 6 10.3
UP02dTGFbR Full sequence N-term - KNKGPSPYIWSLDTFRSK - C-term 23 10.0
단편 1-1 N-term - GPSPYIWSLDTF - C-term 10 3.8
단편 1-2 N-term - KNK RSK - C-term 14 & 15 11.3
단편 2-1 N-term - PYIWS - C-term 1 5.95
단편 2-2 N-term - KNKGPS LDTFRSK - C-term 5 & 6 10.3
UP02eTGFbR Full sequence N-term - RSRGPSPYIWSLDTFKTR - C-term 24 10.9
단편 1-1 N-term - GPSPYIWSLDTF - C-term 10 3.80
단편 1-2 N-term - RSR KTR - C-term 11 & 16 12.3
단편 2-1 N-term - PYIWS - C-term 1 5.95
단편 2-2 N-term - RSRGPS LDTFKTR - C-term 2 & 7 11.7
UP02fTGFbR Full sequence N-term - RSRGPSPYIWSLDTFKQR - C-term 25 10.9
단편 1-1 N-term - GPSPYIWSLDTF - C-term 10 3.80
단편 1-2 N-term - RSR KQR - C-term 11 & 17 12.3
단편 2-1 N-term - PYIWS - C-term 1 5.95
단편 2-2 N-term - RSRGPS LDTFKQR - C-term 2 & 8 11.7
UP02gTGFbR Full sequence N-term - RSRGPSPYIWSLDTFKNR - C-term 26 10.9
단편 1-1 N-term - GPSPYIWSLDTF - C-term 10 3.80
단편 1-2 N-term - RSR KNR - C-term 11 & 18 12.3
단편 2-1 N-term - PYIWS - C-term 1 5.95
단편 2-2 N-term - RSRGPS LDTFKNR - C-term 2 & 9 11.7
대조군 N-term - DDDGPSPYIWSLDTFDDD - C-term 27 3.12
[실시예 2] 후보 펩타이드의 TGF-β 신호전달의 억제 효과 확인
상기 실시예 1에서 제작한 서열번호 20 내지 26의 아미노산 서열로 이루어지는 후보 펩타이드들이 TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
TGF-β/SMAD 신호전달인 SMAD-반응성 요소(SMAD-responsive elements; SBE)의 전사 활성에 따라 반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase)가 조절되는 세포인 HEK293_TGF-β/SMAD Signaling Pathway SBE Reporter Cell Line을 사용하기 위하여, 상용화된 세포주 제품 중 TGF-β/SMAD Signaling Pathway SBE Reporter HEK293 Cell Line (Cat. 60653, BPS Bio)를 선정하였다(이하, ‘HEK293_SBE_luc 세포’). 96 웰 플레이트에 HEK293_SBE_luc 세포를 각 웰당 5 X 103 세포의 수로 MEM-EBBS 100 ㎕의 배지에 접종하였다. 접종 후 24 시간이 경과하였을 때 rhTGF-β 용액을 MEM-EBBS 배지를 이용하여 최종 농도가 100 pg/ml가 되도록 희석시킨 뒤 각 웰에 추가하고, 상기 실시예 1에서 제작한 후보 펩타이드를 MEM-EBBS 배지로 최종 농도가 10 μM 또는 50 μM이 되도록 희석시킨 뒤 50 ㎕의 양을 각 웰에 첨가하였다. 각 웰당 최종 부피는 200 ㎕/웰이 되도록 하였다. 24 시간 경과 후 각 웰에 루시퍼라제 어쎄이 용액을 100 ㎕ 첨가한 후 멀티 플레이트 리더(multiplate reader)를 통해 발광 정도를 확인하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
그 결과, 본 발명에 따른 후보 펩타이드들(UP02aTGFbR, UP02bTGFbR, UP02cTGFbR, UP02dTGFbR, UP02eTGFbR, UP02fTGFbR, UP02gTGFbR) 모두 TGF-β 수용체에 결합하여 TGF-β 신호전달을 효과적으로 억제하는 반면, pI 값이 3.12로 산성인 대조군 서열은 TGF-β 수용체에 대한 결합력이 떨어져 TGF-β 신호전달의 억제 효과가 미미한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] 후보 펩타이드 발현 세포의 TGF-β 저해능의 확인
상기 실시예 2의 결과로부터 본 발명에 따른 펩타이드들의 처리 시 TGF-β 신호전달이 저해됨을 확인할 수 있었다. 이하의 실험에서는 상기 펩타이드가 발현되는 세포의 TGF-β 저해능을 확인하기 위하여, 우선 5 x 105개의 293T 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 뒤 100 μg/mL의 스트렙토마이신, 100 units/mL의 페니실린, 10 %의 소태아 혈청(FBS)이 포함된 고-글루코스(high-glucose) 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco’s modified Eagle medium)에서 37 ℃에서 CO2가 5 부피% (95 % air)로 유지되는 환경에서 24 시간 동안 배양하였다. UP02aTGFbR 발현 벡터(pcDNA3.4-CMV-IL2ss-UP02aTGFbR-neo/kan-Amp) 5 ng을 PEI 또는 리포펙타민 형질 전환 시약으로 일시적 형질 감염(transient transfection) 시켰다. 한편, 1 x 103개의 HEK293_SBE_luc 세포를 100 μL의 세포 배양 배지와 섞어 흰색의 96-웰 플레이트에 분주한 후 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 배양한 뒤, 각 웰로부터 사용 배지를 제거한 후, 1 x 103개의 형질 감염된 293T 세포를 rhTGF-β1 (final concentration: 0.05 ng/mL)이 포함된 100 μL의 배양 배지와 섞어 플레이트에 추가 후 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. 추가 배양 후, ONE-Glo™ 루시퍼라제 어쎄이 시스템을 이용하여 멀티 플레이트 리더(Spectra MAX iD3) 장비로 발광 정도를 측정해 TGF-β 신호전달의 저해 정도를 확인하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 단, 비교를 위하여 Mock 대조군으로는 공벡터(pcDNA3pcDNA3.4-CMV-IL2ss-mock-neo/kan-Amp)로 형질 감염된 293T 세포를 공배양에 사용하였다.
도 2에서 보는 바와 같이, Mock 그룹과 비교하여, HEK293_SBE_luc 세포를 UP02aTGFbR 발현 벡터로 형질 감염된 293T 세포와 공배양한 그룹의 경우, 루시퍼라제 발광 수준이 대략 11 % 정도 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] 후보 펩타이드의 분비 및 TGF-β 저해능의 확인
상기 실시예 3의 결과로부터 본 발명에 따른 펩타이드를 발현하는 세포의 TGF-β 신호전달 저해능을 확인할 수 있었다. 이하의 실험에서는 상기 세포로부터 펩타이드가 실제 분비(secretion)되어 TGF-β 저해 효능을 내는 것인지 확인하였다. 실시예 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하되, HEK293_SBE_luc 세포와 UP02aTGFbR가 발현되는 유전자가 일시 형질 감염된 293T 세포를 공배양하는 대신에, 상기 293T 세포로부터 수확한 조건 배지 100 μL를 HEK293_SBE_luc 세포에 처리하였다. 이때 조건 배지는 8 x 105개의 형질 감염 293T 세포를 2 mL의 세포 배양 배지와 혼합하여 60 mm 접시에 분주한 후 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 48 시간 동안 배양한 후 얻어낸 사용 배지를 의미한다. 37 ℃, 5 % CO2 인큐베이터에서 24 시간 추가 배양 후, ONE-Glo™ 루시퍼라제 어쎄이 시스템을 이용하여 멀티 플레이트 리더(Spectra MAX iD3) 장비로 루시퍼라제 활성 정도를 측정해 그 결과를 도 3에 나타내었다. 단, 비교를 위하여 Mock 대조군으로는 공벡터(pcDNA3pcDNA3.4-CMV-IL2ss-mock-neo/kan-Amp)로 형질 감염된 293T 세포의 조건 배지를 HEK293_SBE_luc 세포에 처리하였다.
도 3에서 보는 바와 같이, HEK293_SBE_luc 세포에 Mock 그룹에서 수확한 조건 배지를 처리한 경우와 비교하여, UP02aTGFbR 발현 벡터로 형질 감염된 293T 세포로부터 수확한 조건 배지를 처리한 경우, 루시퍼라제 발광 수준이 대략 34 % 정도 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 5] 신호 펩타이드에 따른 후보 펩타이드의 분비 및 TGF-β 저해능의 비교
UP02aTGFbR 펩타이드가 형질 감염된 293T 세포로부터 세포 밖으로 분비되도록 도와주는 신호 펩타이드의 종류에 따른 TGF-β 신호전달의 저해 효과를 확인하기 위하여, UP02aTGFbR 발현 벡터 구축 시, UP02aTGFbR를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전단에 신호 펩타이드로 Ig 신호 펩타이드 또는 IL-2 신호 펩타이드의 유전자를 삽입하였다. 이후 실시예 4와 동일한 방법으로 HEK293_SBE_luc 세포에 각각의 벡터로 형질 감염된 293T 세포로부터 수확한 조건 배지를 처리한 후 루시퍼라제 활성 정도를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 단, 비교를 위하여 Mock 대조군으로는 공벡터(pcDNA3pcDNA3.4-CMV-IL2ss-mock-neo/kan-Amp)로 형질 감염된 293T 세포의 조건 배지를 HEK293_SBE_luc 세포에 처리하였다.
도 4에서 보는 바와 같이, HEK293_SBE_luc 세포에 Mock 그룹에서 수확한 조건 배지를 처리한 경우와 비교하여, Ig 신호 펩타이드가 결합된 UP02aTGFbR를 발현하도록 형질 감염된 293T 세포의 조건 배지를 처리한 경우에는 루시퍼라제 발광 수준이 대략 32 % 정도 감소하였고, IL-2 신호 펩타이드가 결합된 UP02aTGFbR를 발현하도록 형질 감염된 293T 세포의 조건 배지를 처리한 경우에는 루시퍼라제 발광 수준이 대략 37 % 정도 감소한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기한 실험으로부터 본 발명에 따르는 펩타이드들은 모두 TGF-β 신호전달을 억제하여 다양한 암-관련 질환에 대한 치료제로 매우 유망함을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드를 이용하여, TGF-β 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료하는 데에 사용될 수 있다.

Claims (24)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며 13 내지 22개의 아미노산으로 이루어지며,
    등전점(isoelectric point; PI)이 6 이상인, 전환성장인자 베타(Transforming growth factor-β, TGF-β) 신호전달 억제용 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 4 내지 9개의 아미노산으로 이루어지는 제1 펩타이드 단편을 포함하고, C-말단에 4 내지 9개의 아미노산으로 이루어지는 제2 펩타이드 단편을 포함하는, 펩타이드.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 단편 및 제2 펩타이드 단편의 총 등전점(PI)은 9 이상인, 펩타이드.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 단편은 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 트레오닌(T), 글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하고,
    상기 제2 펩타이드 단편은, 트레오닌(T), 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하는, 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 단편은, 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 트레오닌(T), 글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하고, 글라이신(G) 및 프롤린(P) 중 적어도 하나를 더 포함하고,
    상기 제2 펩타이드 단편은, 트레오닌(T), 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 글루타민(Q) 및 아스파라긴(N)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하고, 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 펩타이드.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 단편은,
    1) 아르기닌(R), 세린(S), 글라이신(G) 및 프롤린(P)을 포함하거나;
    2) 세린(S), 라이신(K), 트레오닌(T), 글라이신(G) 및 프롤린(P)을 포함하거나;
    3) 세린(S), 라이신(K), 글루타민(Q), 글라이신(G) 및 프롤린(P)을 포함하거나;
    4) 세린(S), 라이신(K), 아스파라긴(N), 글라이신(G) 및 프롤린(P)을 포함하는 것이고,
    상기 제2 펩타이드 단편은,
    5) 트레오닌(T), 아르기닌(R), 라이신(K), 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)을 포함하거나;
    6) 트레오닌(T), 아르기닌(R), 세린(S), 라이신(K), 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)을 포함하거나;
    7) 트레오닌(T), 아르기닌(R), 글루타민(Q), 라이신(K), 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)을 포함하거나;
    8) 트레오닌(T), 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 라이신(K), 류신(L), 아스파트산(D) 및 페닐알라닌(F)을 포함하는 것인, 펩타이드.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 제1 펩타이드 단편은 서열번호 2 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 제2 펩타이드 단편은 서열번호 6 내지 9 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 펩타이드.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 펩타이드.
  9. 제8항에 있어서,
    상게 펩타이드는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어지는 제3 펩타이드 단편을 포함하고, C-말단에 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어지는 제4 펩타이드 단편을 포함하는, 펩타이드.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제3 펩타이드 단편 및 제4 펩타이드 단편의 총 등전점(PI)은 10 이상인, 펩타이드.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 제3 펩타이드 단편 및 제4 펩타이드 단편은 각각 라이신(K), 아르기닌(R), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N) 및 글루타민(Q)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 포함하는, 펩타이드.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제3 펩타이드 단편은,
    1) 1개 이상의 아르기닌(R) 및 1개 이상의 세린(S)을 포함하거나;
    2) 1개 이상의 라이신(K) 및 1개 이상의 트레오닌(T)을 포함하거나;
    3) 1개 이상의 라이신(K) 및 1개 이상의 글루타민(Q)을 포함하거나;
    4) 1개 이상의 라이신(K) 및 1개 이상의 아스파라긴(N)을 포함하는 것이고,
    상기 제4 펩타이드 단편은,
    5) 아르기닌(R), 세린(S) 및 라이신(K)을 포함하거나;
    6) 라이신(K), 트레오닌(T) 및 아르기닌(R)을 포함하거나;
    7) 라이신(K), 글루타민(Q) 및 아르기닌(R)을 포함하거나;
    8) 라이신(K), 아스파라긴(N) 및 아르기닌(R)을 포함하는 것인, 펩타이드.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 제3 펩타이드 단편은 서열번호 11 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고,
    상기 제4 펩타이드 단편은 서열번호 15 내지 18 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 펩타이드.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 펩타이드:
    [일반식 1]
    X1-X2-X3-G-P-S-P-Y-I-W-S-L-D-T-F-X4-X5-X6
    상기 일반식 1에서,
    X1, X3, X4 및 X6은 각각 독립적으로 염기성 아미노산 중에서 선택될 수 있고,
    X2 및 X5는 각각 독립적으로 극성 아미노산 중에서 선택될 수 있다.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 염기성 아미노산은 히스티딘(H), 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이고, 상기 극성 아미노산으로는 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 글루타민(Q) 또는 타이로신(Y)인, 펩타이드.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 20 내지 26으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나, 상기 서열과 80% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  19. 제18항의 발현 벡터로 형질 감염된 숙주 세포 또는 이의 배양물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 펩타이드; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 감염된 숙주 세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, TGF-β 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 TGF-β 관련 질환은 암, 뇌 신경 질환, 섬유성 피부 질환, 폐 섬유증, 간 섬유증, 신장 섬유증, 낭포성 섬유증, 심장 섬유증, 아테롬성 경화증, 동맥 경화증, 전신성 경화증, 또는 안구 섬유증인, 약학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 펩타이드; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 감염된 숙주 세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, TGF-β 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  23. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 펩타이드; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 감염된 숙주 세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, TGF-β 관련 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  24. 개체에게 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 펩타이드; 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터로 형질 감염된 숙주 세포 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 TGF-β 관련 질환의 예방 또는 치료 방법.
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