JP2019533003A - ＴＧＦ−βアンタゴニストコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

本発明は、(i)TGF-βシグナリングを阻害することができる、TGF-βアンタゴニスト抗体、タンパク質、ペプチド、又は低分子などのTGF-βアンタゴニストが(ii)骨標的化部分に結合したものを含むコンジュゲートを提供する。骨標的化部分は、TGF-βアンタゴニストを骨組織に局在させる。本明細書に記載のコンジュゲートは、骨形成不全症及び他の骨病変などの、TGF-βシグナリングの上昇及び骨代謝回転の上昇と関連する様々な疾患の処置に関する治療パラダイムを提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、ペプチド及びタンパク質療法の分野に関し、骨組織に局在することができ、TGF-βシグナリング及び骨代謝回転の上昇と関連する病態を処置するためにTGF-βシグナリングを減弱させることができる治療的コンジュゲートを提供する。
トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)は、骨恒常性の重要な調節因子であり、このタンパク質の活性は、骨構築と分解の間のバランスを促進する。活性なTGF-βの上昇及び下流のシグナリングは、多様な病態に関連している。骨組織部位でのTGF-βシグナル伝達を減弱させることができる治療的化合物の開発がなおも必要である。
本発明は、ヒトの骨組織に局在する標的化部分に結合したTGF-βアンタゴニストペプチドなどのTGF-βアンタゴニストを含む治療的コンジュゲートを提供する。これらの構築物を使用して、TGF-βシグナリング及び/又は骨代謝回転の上昇と関連する病態などの多様な病態を処置することができる。TGF-βアンタゴニストタンパク質、ペプチド及び抗体などの幅広いTGF-βアンタゴニストを、本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用することができる。例えば、本発明の治療的コンジュゲートは、TGF-βに結合してこれを阻害するTGF-βアンタゴニストタンパク質、ペプチド、及び抗体などのTGF-βアンタゴニストを含み得る。一部の実施形態では、治療的コンジュゲートは、TGF-β受容体に結合してこれを阻害するタンパク質、ペプチド、又は抗体などのTGF-βアンタゴニストを含む。同様に、多様な骨標的化部分を、本明細書に記載の治療的コンジュゲートに組み込むことができる。例示的な骨標的化部分としては、ヒト骨組織に存在するタンパク質及びミネラル、例えばそれぞれコラーゲン及びヒドロキシアパタイト、に特異的に結合する部分が挙げられる。本明細書に記載の治療的コンジュゲートは、健康な対象と比較して骨代謝回転が上昇している状態などのTGF-βシグナリングの調節が異常である多様な病的状態を処置するために、患者(例えば、ヒト患者などの哺乳動物患者)に投与することができる。
第1の態様では、本発明は、標的化部分に結合したTGF-βアンタゴニストを含むコンジュゲートを提供する。標的化部分は、例えば、ヒト骨組織に存在するコラーゲンなどのタンパク質、又はヒドロキシアパタイトなどのミネラルに結合することができる。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-βに結合する。一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-βに結合してこれを中和し、例えばそれによってTGF-βシグナル伝達を抑制する。一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-βに結合するタンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子などの、タンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子を含む。例えば、一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-β又はTGF-β受容体に結合してその活性を阻害するタンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子などの、タンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子である。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-β又はTGF-β受容体に結合してその活性を阻害するタンパク質、ペプチド、又は抗体などの、タンパク質、ペプチド、又は抗体である。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-β又はTGF-β受容体に結合してその活性を阻害するペプチド又は抗体などの、ペプチド又は抗体である。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-β又はTGF-β受容体に結合してその活性を阻害する低分子などの低分子である。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストはペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列IDGVYDNAEYAERFMEENEGHIVDIHDFSLGSS(配列番号5)、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列WIWLDTNMGYRIYQEFEVT(配列番号1)、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号2の残基21〜1404のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号2の残基21〜1428のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、アミノ酸配列WIWLDTNMGSRIYQEFEVT(配列番号3)、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号4の残基21〜1404のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは配列番号4の残基21〜1428のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号4のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号6のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、RKHFPETWIWLDTNMGYRIYQEFEV(配列番号7)のアミノ酸配列、又はこれと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/若しくはこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有する配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、ANFCLGPCPYIWSLDT(配列番号8)、ANFCSGPCPYLRSADT(配列番号9)、PYIWSLDTQY(配列番号10)、PYLWSSDTQH(配列番号11)、PYLRSADTTH(配列番号12)、WSXD(配列番号13)、及びRSXD(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列であって、Xが任意の天然に存在するアミノ酸を表す、アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、これらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、TSLDATMIWTMM(配列番号15)、SNPYSAFQVDIIVDI(配列番号16)、TSLMIWTMM(配列番号17)、TSLDASIIWAMMQN(配列番号18)、SNPYSAFQVDITID(配列番号19)、EAVLILQGPPYVSWL(配列番号20)、及びLDSLSFQLGLYLSPH(配列番号21)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、これらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、TSLDASIIWAMMQN(配列番号22)、KRIWFIPRSSWYERA(配列番号23)、KRIWFIPRSSW(配列番号24)、KRIWFIPRSSW(配列番号25)、及びKRIWFIPRSSW(配列番号26)からなる群から選択されるアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、これらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号27〜49のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、これらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ペプチドは、反復優位型糖タンパク質A(glycoprotein-A repetitions predominant protein)(GARP)(配列番号50)のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、この配列と少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-β受容体に結合するペプチドを含む。一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-β受容体に結合するペプチドである。例えば、一部の実施形態では、ペプチドは、HANFCLGPCPYIWSL(配列番号51)、FCLGPCPYIWSLDT(配列番号52)、及びHEPKGYHANFCLGPCP(配列番号53)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、これらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、TGF-βのアイソフォーム(例えば、TGF-β1、TGF-β2、及び/又はTGF-β3)などのTGF-βに結合する抗体又はその抗原結合断片である。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、以下の相補性決定領域(CDR):
a.アミノ酸配列SNVIS(配列番号327)を有するCDR-H1;
b.アミノ酸配列GVIPIVDIANYAQRFKG(配列番号328)を有するCDR-H2;
c.アミノ酸配列TLGLVLDAMDY(配列番号329)を有するCDR-H3;
d.アミノ酸配列RASQSLGSSYLA(配列番号330)を有するCDR-L1;
e.アミノ酸配列GASSRAP(配列番号331)を有するCDR-L2;及び
f.アミノ酸配列QQYADSPIT(配列番号332)を有するCDR-L3
のうちの1つ以上、又は全てを含む。
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、以下の相補性決定領域(CDR):
a.アミノ酸配列SNVIS(配列番号327)を有するCDR-H1;
b.アミノ酸配列GVIPIVDIANYAQRFKG(配列番号328)を有するCDR-H2;
c.アミノ酸配列TLGLVLDAMDY(配列番号329)を有するCDR-H3;
d.アミノ酸配列RASQSLGSSYLA(配列番号330)を有するCDR-L1;
e.アミノ酸配列GASSRAP(配列番号331)を有するCDR-L2;及び
f.アミノ酸配列QQYADSPIT(配列番号332)を有するCDR-L3
を含む抗体又はその抗原結合断片に対するTGF-βの結合を競合的に阻害する。
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号327〜332の対応するCDRと少なくとも85%の配列同一性(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%、又はそれ以上の配列同一性)を有する1つ以上のCDRを含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、各々が前述のCDRと少なくとも85%の配列同一性(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%、又はそれ以上の配列同一性)を有する一組の6個のCDRを含む。
一部の実施形態では、抗体は、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSS(配列番号333)のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、又は配列番号333と少なくとも85%の配列同一性(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%、又はそれ以上の配列同一性)を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK(配列番号334)のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、又は配列番号334と少なくとも85%の配列同一性(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%、又はそれ以上の配列同一性)を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する。前述のCDR、並びに上記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体は、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第9,598,486号に記載されている。
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、ポリクローナル抗体若しくはその抗原結合断片、ヒト化抗体若しくはその抗原結合断片、二重特異性抗体若しくはその抗原結合断片、最適化抗体若しくはその抗原結合断片、二重可変免疫グロブリンドメイン、一本鎖Fv分子(scFv)、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、ナノボディ、抗体様タンパク質スキャフォールド、Fv断片、Fab断片、F(ab')2分子、又はタンデムdi-scFVである。
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の1D11抗体のヒト化抗体又はその抗原結合断片などの、ヒト化抗体又はその抗原結合断片である。
一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の1D11及び/又はGC1008抗体の最適化バリアントなどの、最適化抗体又はその抗原結合断片である。
一部の実施形態では、最適化抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の1D11及び/又はGC1008抗体の親和性成熟バリアントなどの、親和性成熟抗体又はその抗原結合断片である。
一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載のものの中でも、scFv、ダイアボディ、又はトリアボディなどの一本鎖分子である。
一部の実施形態では、抗体は、scFvである。
一部の実施形態では、標的化部分は、ヒト骨組織に存在するタンパク質に結合するペプチドなどのペプチドを含む。一部の実施形態では、標的化部分は、ヒト骨組織に存在するタンパク質に結合するペプチドなどのペプチドである。一部の実施形態では、ヒト骨組織に存在するタンパク質は、コラーゲンである。例えば、タンパク質に結合するペプチドは、配列番号54〜56のいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、タンパク質に結合するペプチドは、配列番号57〜59のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質に結合するペプチドは、配列番号56のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、タンパク質に結合するペプチドは、これらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、標的化部分は、ヒドロキシアパタイトなどのヒト骨組織に存在するミネラルに結合することができるペプチドを含む。一部の実施形態では、ミネラルに結合するペプチドは、配列番号60〜326のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ミネラルに結合するペプチドは、これらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、ヒドロキシアパタイトに結合することができる標的化部分は、ポリアニオン性ペプチドである。ポリアニオン性ペプチドは、例えばカルボキシレート、スルホネート、ホスホネート、及びホスフェートからなる群から選択される側鎖置換基を有する1つ以上のアミノ酸を含み得る。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、1つ以上のグルタメート残基(例えば、1〜25個のグルタメート残基、又はそれを超える数、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、若しくは25個、又はそれを超える数のグルタメート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、3〜20個のグルタメート残基(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個のグルタメート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、5〜15個のグルタメート残基(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のグルタメート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、8〜12個のグルタメート残基(例えば、8、9、10、11、又は12個のグルタメート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、5個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、6個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、7個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、8個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、9個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、10個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、11個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、12個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、13個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、14個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、15個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式Enのペプチドであって、Eがグルタメート残基を示し、nが1〜25の整数であるペプチドである。例えば、ポリアニオン性ペプチドは、式E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11、E12、E13、E14、E15、E16、E17、E18、E19、E20、E21、E22、E23、E24、又はE25のペプチドであり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、式XnEmXoEpのペプチドであって、Eがグルタメート残基を示し、各々のXが独立して任意の天然に存在するアミノ酸を示し、mが1〜25の整数を表し、n及びoが各々独立して0〜5の整数を表し、そしてpが1〜10の整数を表すペプチドである。
例えば、一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E2のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E3のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E4のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E5のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E6のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E7のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E8のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E9のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E10のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E11のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E12のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E13のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E14のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E15のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E16のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E17のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E18のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E19のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E20のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E21のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E22のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E23のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E24のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E25のペプチドである。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式E10のペプチドである。
一部の実施形態では、グルタメート残基は連続している。一部の実施形態では、グルタメート残基は不連続である。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、1つ以上のアスパルテート残基(例えば、1〜25個のアスパルテート残基、又はそれ以上、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、若しくは25個、又はそれ以上のアスパルテート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、3〜20個のアスパルテート残基(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個のアスパルテート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、5〜15個のアスパルテート残基(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアスパルテート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、8〜12個のアスパルテート残基(例えば、8、9、10、11、又は12個のアスパルテート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、5個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、6個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、7個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、8個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、9個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、10個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、11個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、12個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、13個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、14個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、15個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式Dnのペプチドであって、Dがアルパルテート残基を示し、nが1〜25の整数であるペプチドである。例えば、ポリアニオン性ペプチドは、式D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12、D13、D14、D15、D16、D17、D18、D19、D20、D21、D22、D23、D24、又はD25のペプチドである。一部の実施形態では、ペプチドは、式XnDmXoDpのペプチドであって、Dがアスパルテート残基を示し、各々のXが独立して任意の天然に存在するアミノ酸を示し、mが1〜25の整数を表し、n及びoが各々独立して0〜5の整数を表し、そしてpが1〜10の整数を表すペプチドである。
例えば、一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D2のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D3のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D4のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D5のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D6のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D7のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D8のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D9のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D10のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D11のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D12のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D13のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D14のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D15のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D16のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D17のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D18のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D19のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D20のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D21のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D22のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D23のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D24のペプチドである。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D25のペプチドである。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、式D10のペプチドである。
一部の実施形態では、アスパルテート残基は連続している。一部の実施形態では、アスパルテート残基は不連続である。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチド中の、生理的pHで負に荷電している側鎖を有するアミノ酸の、アミノ酸の全量に対する比率は、約0.5〜約2.0である。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、例えば共有結合によって、中でもアミド結合、ジスルフィド架橋、チオエーテル結合、又は炭素-炭素結合などによって標的化部分に直接結合している。一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、本明細書に記載のペプチド性リンカー又は合成リンカーなどのリンカーによって標的化部分に結合している。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、ペプチド性標的化部分のN末端に結合している。例えば、一部の実施形態では、ペプチド性TGF-βアンタゴニストのC末端は、ペプチド性部分のN末端に結合している。一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、標的化部分のC末端に結合している。例えば、一部の実施形態では、ペプチド性TGF-βアンタゴニストのN末端は、ペプチド性部分のC末端に結合している。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、免疫グロブリンFcドメインによって標的化部分に結合している。
一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、免疫グロブリンFcドメインのN末端に結合しており、標的化部分は、免疫グロブリンFcドメインのC末端に結合している。一部の実施形態では、TGF-βアンタゴニストは、免疫グロブリンFcドメインのC末端に結合しており、標的化部分は、免疫グロブリンFcドメインのN末端に結合している。一部の実施形態では、免疫グロブリンは、ヒトIgG、ヒトIgA、ヒトIgM、ヒトIgE、及びヒトIgDからなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、本発明の上記の態様又は実施形態のいずれか1つのコンジュゲート、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、コンジュゲートは、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、硬膜外、又は経口投与のために製剤化される。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のコンジュゲート又は医薬組成物の治療有効量を、TGF-βシグナリングの上昇と関連する疾患に罹患しているヒト患者に投与することによって、ヒト患者を処置する方法を特徴とする。一部の実施形態では、疾患は骨疾患である。
一部の実施形態では、疾患は、骨形成不全症である。例えば、疾患は、I型骨形成不全症、II型骨形成不全症、III型骨形成不全症、IV型骨形成不全症、V型骨形成不全症、VI型骨形成不全症、VII型骨形成不全症、VIII型骨形成不全症、IX型骨形成不全症、X型骨形成不全症、又はXI型骨形成不全症であり得る。
一部の実施形態では、疾患は、腎性骨ジストロフィー、副甲状腺機能亢進症誘発性骨疾患、糖尿病性骨疾患、変形性関節炎、及びステロイド誘発性骨疾患、廃用性骨粗鬆症、又は脳性麻痺である。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のコンジュゲート又は医薬組成物の治療有効量を、骨代謝回転の上昇と関連する疾患に罹患しているヒト患者に投与することによって、患者を処置する方法を特徴とする。一部の実施形態では、疾患は、マッキューン・オルブライト症候群、ゴーシェ病、高シュウ酸尿症、骨ページェット病、又は若年性ページェット病である。一部の実施形態では、疾患は、乳房又は前立腺のがんに対して二次性の骨転移などの転移性骨がんである。
一部の実施形態では、疾患は、骨粗鬆症、線維性骨異形成、カムラチ・エンゲルマン病、マルファン症候群、骨空洞性骨異形成症、常染色体優性大理石骨病、骨粗鬆症・偽グリオーマ症候群、若年性老人様皮膚萎縮骨形成異常症、先天性骨形成不全症、小頭症、又は白内障である。一部の実施形態では、疾患は、偽性副甲状腺機能低下症、鎖骨頭蓋異形成症、先天性角化不全症、滲出性硝子体網膜症1、シンメルペニング・フォイアスタイン・ミムス(Schimmelpenning-Feuerstein-Mims)症候群、プラダー・ウィリ症候群、軟骨無発生症、アントレー・ビクスラー症候群、アスパルチルグルコサミン尿症、セリアック病、脳・眼・顔・骨格症候群1、リシン尿性タンパク質不耐症、ニューロパシー、先天性角化不全症、エーラス・ダンロス症候群、骨端異形成症、ヒアリン線維腫症候群、ペロー(Perrault)症候群1、ヘモクロマトーシス、ホモシスチン尿症(例えば、シスタチオニンベータシンターゼ欠損による)、高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病、デスブクオイス(desbuquois)異形成症、多発性翼状片症候群、致死性先天性拘縮症候群1、ミトコンドリアDNA枯渇症候群6(肝脳型)、ニーマンピック病、大理石骨病、ポルフィリン症、ロスモンド・トムソン症候群、ウィルソン病、デント病1、オクシピタル・ホーン症候群、高グリセロール血症、低リン血症性くる病、ロウ眼脳腎症候群、腎尿細管症、糖尿病、小脳失調、ビタミンDヒドロキシル化欠損性くる病、ワールブルグ・ミクロ症候群1、スタブ・ヴィーデマン(Stuve-Wiedemann)症候群、青色ゴムまり様母斑症候群、シングルトン・マーテン症候群、小頭骨異形成原発性小人症、異骨硬化症、ハラーマン・ストライフ症候群、ブルック症候群1、多発性翼状片症候群(例えば、X連鎖性)、象牙質形成不全症を伴う脊椎骨幹端異形成症、ホール・リグス(Hall-Riggs)精神遅滞症候群、骨脆弱性を伴う乳児多臓器神経疾患、III型尖頭合指症、先端骨溶解症、ACTH非依存性副腎皮質大結節性過形成、精神遅滞を伴うアミノ酸尿症、関節症、骨脆弱性(例えば、頭蓋骨縫合早期癒合症、眼球突出、水頭症、及び明確な顔面特徴を伴う)、脆弱角膜症候群、脳腱黄色腫症、ネコなき症候群、半身性骨端異形成症、常染色体優性エーラス・ダンロス症候群、家族性骨異形成症、フリン・エアード症候群、老人様皮膚萎縮骨形成異常症、Ia型糖原病、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、乳児全身性ヒアリン症、多毛性骨軟骨異形成症、機能的亜鉛欠乏を伴う高亜鉛血症、低ホスファターゼ症、常染色体優性低リン血症性くる病、X連鎖性劣性低リン血症性くる病、リヒテンスタイン症候群、巨大骨端異形成症(例えば、骨粗鬆症、しわの多い皮膚及び老人様外観を伴う)、メンケス病、精神遅滞(例えば、X連鎖性シュナイダー・ロビンソン型)、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、小球状水晶体-骨幹端異形成症、モルキオ症候群a型、モルキオ症候群B型、耳軟骨骨化(例えば、知的障害、筋委縮、及び骨頭蓋骨狭窄症を伴う)、骨粗鬆症及び眼皮膚低色素症候群、骨粗鬆症・偽グリオーマ症候群、若年性骨粗鬆症、魚鱗癬及び骨折を伴う骨硬化症、卵巣形成不全1、卵巣形成不全2、卵巣形成不全3、卵巣形成不全4、下垂体腺腫、硬化性白質脳症を伴う脂肪膜性多膿疱性骨異形成、プラダー・ウィリ体型、骨減少症、オカモト型早期老化症候群、プリエト(Prieto)X連鎖精神遅滞症候群、濃化異骨症候群、パイル病、ライフェンスタイン症候群、常染色体優性遠位尿細管性アシドーシス、1型シュワルツ・ヤンペル症候群、2型シュワルツ・ヤンペル症候群、3型シュワルツ・ヤンペル症候群、4型シュワルツ・ヤンペル症候群、X連鎖性遅発性脊椎骨端異形成、又はトルグ(Torg)・ウィンチェスター症候群である。
一部の実施形態では、方法は、コンジュゲート又は医薬組成物を、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は経口、又は鼻腔内若しくは硬膜外投与によって患者に投与するステップを含む。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のコンジュゲート又は医薬組成物、並びに添付文書であってコンジュゲートの治療有効量を、TGF-βシグナリングの上昇又は骨代謝回転の上昇と関連する疾患(前述の疾患又は状態のいずれかなど)に罹患しているヒト患者に投与することによって、患者を処置するようにキットのユーザーに指示する添付文書を含む、キットを特徴とする。
定義
本明細書において使用される用語「約」は、記載の値の上下10%以内である値を指す。例えば、「約50nM」という語句は、45nM〜55nMの間(それらの端値を含む)の値を指す。
本明細書において使用される用語「親和性」は、リガンド及び受容体などの2つの分子の間の結合相互作用の強度を指す。本明細書において使用される用語「Kd」は解離定数を指すことが意図され、これは例えば、2つの分子の解離速度定数(kd)の、2つの分子の結合速度定数(ka)に対する比率から得ることができ、モル濃度(M)で表記される。ペプチド-タンパク質相互作用のKd値は、例えば当技術分野で確立された方法を使用して決定することができる。ペプチド-タンパク質相互作用のKdを決定するために使用することができる方法には、例えば、BIACORE(登録商標)システムなどのバイオセンサー技術の使用による表面プラズモン共鳴、並びに蛍光異方性偏光方法及び等温滴定型熱量測定(ITC)などの当技術分野で公知の熱量測定技術が含まれる。
本明細書において使用される「親和性成熟抗体」は、1つ以上のアミノ酸置換を有しない参照抗体(本明細書に記載の1D11又はGC1008など)と比較して、抗原(例えば、TGF-β)に対する抗体の親和性の改善をもたらす可変領域(例えば重鎖可変領域又は軽鎖可変領域)に1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体又はその断片である。抗体及びその抗原結合断片の親和性成熟方法は、当技術分野で公知であり、例えば、親和性成熟抗体及びその抗原結合断片を調製する技術に関するものでありその各々の開示が参照により本明細書に組み入れられる、Daugherty et al., Protein Engineering, Design and Selection 11:825-832(1998)、Yang et al., Journal of Molecular Biology 254:392-403(1995)、Lippow et al., Nature Biotechnology 25:1171-1176(2007)、Gram et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89:3576-3580(1992)、及びHawkins et al., Journal of Molecular Biology 226:889-896(1992)に記載されている。
本明細書において使用される用語「抗体」は、特定の抗原に特異的に結合する、又は免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を指し、これには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子工学的に作製した抗体、最適化(例えば、親和性成熟)抗体、並びに、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体(例えば、二重、三重、四重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ)、及び例えばFab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG、及びscFv断片を含む抗体の抗原結合断片を含むがこれらに限定されない抗体の他の改変型が含まれる。特に示されていない限り、用語「モノクローナル抗体」(mAb)は、インタクト分子、並びに標的タンパク質に特異的に結合することができる抗体断片(例えば、Fab及びF(ab')2断片を含む)の両方を含むことを意味する。本明細書において使用されるFab及びF(ab')2断片は、インタクト抗体のFc断片を欠如する抗体断片を指す。これらの抗体断片の例を本明細書に記載する。
本明細書において使用される用語「抗原結合断片」は、標的抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体の断片によって行われ得る。抗体断片は、例えば、Fab、F(ab')2、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、アフィボディ、ナノボディ、アプタマー、又はドメイン抗体であり得る。用語「抗原結合断片」に包含される結合断片の例には、(i)Fab断片、すなわちVL、VH、CL、及びCH1ドメインからなる一価の断片;(ii)F(ab')2断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片;(iii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体のシングルアームのVL及びVHドメインからなるFv断片;(v)VH及びVLドメインを含むdAb;(vi)VHドメインからなるdAb断片(例えば、Ward et al., Nature 341:544-546, 1989を参照されたい);(vii)VH又はVLドメインからなるdAb;(viii)単離された相補性決定領域(CDR);並びに(ix)任意選択で合成リンカーによって結合され得る2つ以上(例えば、2、3、4、5、又は6個)の単離CDRの組合せ、が含まれるがこれらに限定されない。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは、異なる遺伝子によってコードされるが、それらを、組換え法を使用して、VL及びVH領域が対を形成して一価の分子(一本鎖Fv(scFv)としても知られる、例えば、Bird et al., Science 242:423-426, 1988及びHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988を参照されたい)を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらを作製することができるようにするリンカーによって、結合させることができる。これらの抗体断片は、当業者に公知の通常の技術を使用して得ることができ、断片をインタクト抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングすることができる。抗原結合断片は、組換えDNA技術、インタクト免疫グロブリンの酵素的若しくは化学的切断、又はある特定の場合では当技術分野で公知の化学的ペプチド合成手順によって産生することができる。
本明細書において使用される用語「抗TGF-β抗体」は、TGF-β、例えばそのTGF-β1、TGF-β2、又はTGF-β3アイソフォームなどに特異的に結合することができる、重鎖若しくは軽鎖の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)、若しくはそのリガンド結合部分、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、又はその任意の部分などの(しかしこれらに限定されない)免疫グロブリンの少なくとも一部を含むタンパク質又はペプチド含有分子を指す。抗TGF-β抗体はまた、抗体CDRと構造及び溶媒アクセシビリティが類似のBC、DE、及びFG構造ループを含む10番目フィブロネクチンIII型ドメイン(10Fn3)などの抗体様タンパク質スキャフォールドを含む。10Fn3ドメインの三次構造は、IgG重鎖の可変領域の三次構造と類似し、当業者は、例えば10Fn3のBC、DE、及びFGループの残基を、抗TGF-βモノクローナル抗体のCDRH-1、CDRH-2、又はCDRH-3領域からの残基に置換することによって、抗TGF-βモノクローナル抗体のCDRをフィブロネクチンスキャフォールドに移植することができる。
本明細書において使用される用語「二重特異性抗体」は、例えば少なくとも2つの異なる抗原に結合することができる、モノクローナルの、しばしばヒト又はヒト化抗体を指す。例えば、結合特異性の1つをTGF-βに向けることができ、他方は異なる抗原に特異的に結合することができる。
本明細書において使用される用語「骨代謝回転」は、骨組織を構成するカルシウム及び他のミネラルの吸収(例えば、破骨細胞による)及び再沈着(例えば、骨芽細胞による)の二重のプロセスを指す。健康な個体では、これらのプロセスの正味の効果は、一定のミネラルバランスの維持である。正常な成長中の骨では、ミネラル沈着は、ミネラル吸収と平衡にあるが、ある特定の病的状態では、骨吸収が骨沈着を上回る。本明細書において使用される、病的な疾患又は状態に罹患している患者の文脈における用語「骨代謝回転の上昇」は、その疾患若しくは状態に罹患していない健康な対象における骨吸収及び再沈着速度、又は対象がその疾患若しくは状態と診断される前に測定した目的の対象における吸収及び再沈着速度などの参照レベルと比較した、骨吸収及び再形成速度の増加を指す。骨代謝回転を評価する方法は、例えば、血清中及び骨アルカリホスファターゼ、血清中オステオカルシン(sOC)、血清中I型コラーゲンC-テロペプチド切断産物(sCTX)、尿中遊離デオキシピリジノリン(ufDPD)、及び尿中I型コラーゲン架橋N-テロペプチド(uNTX)などの、対象における骨代謝回転の1つ以上のバイオマーカーの濃度を測定するステップ、並びに1つ以上のバイオマーカー濃度を健康な対象のバイオマーカー濃度と比較するステップを含み、それは例えば、骨代謝回転を評価するためのバイオマーカーに関するものでありその開示が参照により本明細書に組み入れられるBraga et al. Bone 34:1013-1016(2004)に記載されているとおりである。
コンジュゲートの文脈において本明細書において使用される用語「…に結合」とは、抗体、タンパク質、ポリペプチド、又はそのドメイン(例えば、TGF-βアンタゴニスト抗体、タンパク質、ポリペプチド、又はそのドメイン)などの1つの分子の、別の分子への、例えば別の抗体、タンパク質、ポリペプチド、又はそのドメイン(例えば、コラーゲン又はヒドロキシアパタイトに結合する抗体、タンパク質、ポリペプチド、又はそのドメインなどの骨標的化部分)への共有結合を指す。本明細書に記載の互いに「結合している」2つの分子は、例えばリンカーが介在することなく互いに直接結合していてもよい。或いは、互いに「結合している」2つの分子は、リンカーによって結合してもよい。例示的なリンカーとしては、本明細書において表9に記載のカップリング部分を含む合成リンカー、並びに1つ以上のグリシン、セリン、及び/又はスレオニン残基を含むリンカーなどのペプチド性リンカーが挙げられる。本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用され得るリンカーのさらなる例には、免疫グロブリンFcドメイン並びにその断片が含まれる。
本明細書において使用される用語「相補性決定領域」(CDR)は、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方に見出される超可変領域を指す。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる。抗体の超可変領域を表すアミノ酸の位置は、文脈及び当技術分野で公知の様々な定義に応じて変化し得る。可変ドメイン内の一部の位置は、これらの位置が、ある基準セットに従うと超可変領域内であると考えられるが、異なる基準セットに従うと超可変領域外であると考えられるという点においてハイブリッド超可変位置と考えることができる。これらの位置の1つ以上はまた、拡張超可変領域において見出すことができる。本明細書に記載の抗体は、これらのハイブリッド超可変位置において改変を含み得る。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、主にβ-シート構成をとる4つのフレームワーク領域が、βシート構造を連結する(一部の例ではその一部を形成する)ループを形成する3つのCDRによって連結されたものを各々含む。各々の鎖のCDRは、フレームワーク領域によって、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順で近位に一緒に保持され、他の抗体鎖からのCDRと共に抗体の標的結合部位の形成に寄与する(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD., 1987を参照されたい)。本明細書において使用される免疫グロブリンアミノ酸残基の番号付けは、特に示していない限り、Kabatらの免疫グロブリンアミノ酸残基番号付けシステムに従って実施される。
本明細書において使用される用語「コンジュゲート」は、１つにライゲーションされて(例えば、共有結合によって)単一の化合物を形成する、別個の起源からの2つ以上の領域を含む分子を指す。
本明細書において使用される用語「保存的変異」、「保存的置換」、又は「保存的アミノ酸置換」は、1つ以上のアミノ酸の、極性、静電荷電、及び立体体積などの類似の物理化学特性を示す1つ以上の異なるアミノ酸での置換を指す。これらの物理化学特性を、以下の表1において20個の天然に存在するアミノ酸に関してまとめる。
この表から、保存的アミノ酸ファミリーは、(i)G、A、V、L及びI;(ii)D及びE;(iii)C、S及びT;(iv)H、K及びR;(v)N及びQ;並びに(vi)F、Y及びWを含む。したがって、保存的変異又は置換は、1つのアミノ酸を同じアミノ酸ファミリーのメンバーで置換する置換(例えば、ThrをSerに置換又はArgをLysに置換)である。
本明細書において使用される用語「ダイアボディ」は、各々のポリペプチド鎖が、同じポリペプチド鎖のVH及びVLドメインの分子内会合を可能にするには短すぎるリンカー(例えば、5個のアミノ酸で構成されるリンカー)によって結合したVH及びVLドメインを含む、2つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体を指す。この構成により、各々のドメインは、別のポリペプチド鎖上の相補的ドメインと対を形成してホモ二量体構造を形成する。したがって、用語「トリアボディ」は、その各々が同じペプチド鎖内のVH及びVLドメインの分子内会合を可能にするには極めて短いリンカー(例えば、1〜2個のアミノ酸で構成されるリンカー)によって結合した1つのVHドメイン及び1つのVLドメインを含む3つのペプチド鎖を含む三価の抗体を指す。その本来の構造にフォールディングするために、このようにして構成されたペプチドは、隣接するペプチド鎖のVH及びVLドメインを互いに空間的に近位に配置するように、典型的に三量体化する(例えば、Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993を参照されたい)。
本明細書において使用される「二重可変ドメイン免疫グロブリン」(「DVD-Ig」)は、リンカーを介して2つのモノクローナル抗体の標的結合可変ドメインを組み合わせて四価の二重標的化単一物質を作製する抗体を指す(例えば、Gu et al., Meth. Enzymol., 502:25-41, 2012を参照されたい)。
本明細書において使用される用語「内因性」は、特定の生物(例えば、ヒト)又は生物内の特定の位置(例えば、臓器、組織、又はヒト細胞などの細胞)に天然に見出される分子(例えば、ポリペプチド、核酸、又は補因子)を記載する。
本明細書において使用される用語「外来性」は、特定の生物(例えば、ヒト)又は生物内の特定の位置(例えば、臓器、組織、又はヒト細胞などの細胞)に天然に見出されない分子(例えば、ポリペプチド、核酸、又は補因子)を記載する。外来性材料は、外部起源から生物又はそこから取り出された培養物に対して提供される材料を含む。
本明細書において使用される用語「フレームワーク領域」又は「FW領域」は、抗体又はその抗原結合断片のCDRに隣接するアミノ酸残基を含む。FW領域残基は、例えば中でもヒト抗体、ヒト化抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、Fab断片、一本鎖抗体断片、scFv断片、抗体ドメイン、及び二重特異性抗体に存在し得る。
本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、タンパク質の実質的にあらゆる部分(例えば、全てのCDR、フレームワーク領域、CL、CHドメイン(例えば、CH1、CH2、CH3)、ヒンジ、並びにVL及びVHドメイン)が、ごくマイナーな配列変化又はバリエーションのみを有しており、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である抗体を指す。ヒト抗体は、機能的に再構成されたヒト免疫グロブリン(重鎖及び/又は軽鎖)遺伝子を発現することができるヒト細胞(例えば、組換え発現によって)において又は非ヒト動物細胞若しくは原核細胞若しくは真核細胞により、産生することができる。ヒト抗体が一本鎖抗体である場合、本来のヒト抗体に見出されないリンカーペプチドを含み得る。例えば、Fvは、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とを連結する、2〜約8個のグリシン又は他のアミノ酸残基などのリンカーペプチドを含み得る。そのようなリンカーペプチドは、ヒト起源のペプチドであると考えられる。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用するファージディスプレイ方法を含む、当技術分野で周知の多様な方法によって作製することができる。ヒト抗体はまた、機能的な内因性の免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用しても産生することができる(例えば、PCT国際公開第1998/24893号、国際公開第1992/01047号、国際公開第1996/34096号、国際公開第1996/33735号、米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、第5,885,793号、第5,916,771号、及び第5,939,598号を参照されたい)。
本明細書において使用される用語「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む非ヒト抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体は、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのCDRに対応する、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。FW領域の全て又は実質的に全てもまた、ヒト免疫グロブリン配列の領域であり得る。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の少なくとも一部を含み得る。抗体をヒト化する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-7, 1988、米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号、及び第6,180,370号に記載されている。
本明細書において使用される、骨標的化部分の文脈における用語「ミネラル」は、骨に存在する無機元素で構成される、無機イオン、複合体又は化合物を指す。例示的なミネラルには、Ca2+、PO4 3-、OH-及び他の微量の無機元素が含まれるがこれらに限定されない。ミネラルは、例えば、結晶、ナノ結晶、又は非晶質ヒドロキシアパタイト(Ca10(PO4)6(OH)2)、炭酸カルシウム、並びにリン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム、又はリン酸カルシウムを含むがこれらに限定されない、酸性及び塩基性条件下でヒドロキシアパタイトと類似の溶解挙動を有するリン酸カルシウムなどの化合物を含み得る。
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核細胞、原核細胞、又はファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法を指すものではない。
本明細書において使用される用語「中和する」は、アンタゴニスト物質の作用による分子の活性の低減又は予防を指す。例えば、本明細書に記載のTGF-βアンタゴニスト抗体、タンパク質、ペプチド、又は低分子などの、TGF-βを中和することができる物質は、例えば本明細書に記載されるように、TGF-βシグナリングを抑制することができる、及び/又は骨芽細胞又は破骨細胞などの特定の細胞型に対するTGF-βの作用を抑制することができる物質である。物質がTGF-βを中和する程度を決定する例示的な方法には、後述の実施例に記載される、骨芽細胞生存率アッセイ、骨芽細胞石灰化アッセイ、コラーゲン沈着アッセイ、及びアルカリホスファターゼ活性が含まれる。
本明細書において使用される用語「最適化」抗体は、抗体の1つ以上の薬理特性の改善をもたらす、本明細書に記載の参照抗体 (例えば、TGF-β抗体1D11又はGC1008)の配列などの参照抗体配列と比較して、1つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び/又は挿入を特徴とする抗体を指す。そこから最適化抗体を調製する参照抗体と比較して改善され得る最適化抗体の例示的な特徴には、中でも、標的親和性(例えば、TGF-β又はその1つ以上のアイソフォームに対する親和性)の増強、高い標的特異性、水溶液中の凝集性向の低減、組換え発現による収率の増強、免疫原性の低減、及び熱安定性の改善が含まれるがこれらに限定されない。最適化抗体をもたらし得る参照抗体のアミノ酸の変化の例には、ジスルフィド結合形成を受けやすいシステイン残基、並びに脱アミノ化及びグリコシル化に対して感受性があるアスパラギン及びグルタミン残基などの翻訳後修飾を受ける傾向があるアミノ酸を、より高い化学的安定性を有する同配体(isosteric)アミノ酸に置換する変化が含まれる。前述の改善の1つ以上を実施するために使用することができる保存的アミノ酸置換を以下の表1に記載する。最適化抗体は、例えばADIMAB(商標)(Lebanon, NH)などのそれを専門とするサービスによって作製することができ、最適化抗体を産生するために使用することができる方法は、例えば、その各々の開示が、参照抗体から最適化抗体を調製する技術に関するので参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第2009/036379号及び米国特許第第9,354,228号に記載される。
本明細書において使用される「ペプチド」は、アミド結合によって連続的に結合した天然に存在する及び/又は非天然のアミノ酸残基などの複数のアミノ酸残基を含む一本鎖ポリアミドを指す。ペプチドの例には、全長の天然に存在するタンパク質などの全長のタンパク質のより短い断片が含まれる。
本明細書において使用される用語「パーセント(%)配列同一性」は、最大の配列同一性パーセントが得られるように(例えば、最適なアライメントのために候補及び参照配列の1つ又は両方にギャップを導入することができ、非相同配列を比較目的のために無視することができる)配列を整列させて、必要に応じてギャップを導入した(例えば、最適なアライメントのために候補配列及び参照配列の1つ又は両方にギャップを導入することができ、非相同配列は比較目的のために無視することができる)後の、参照配列のアミノ酸(又は核酸)残基と同一である候補配列のアミノ酸(又は核酸)残基のパーセンテージを指す。パーセント配列同一性を決定する目的でのアライメントは、例えば、BLAST、ALIGN、又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公開されているコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である様々な様式で行うことができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを得るために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。例えば、候補配列と比較するために整列させた参照配列は、候補配列が、候補配列の全長又は候補配列の連続するアミノ酸(又は核酸)残基の選択された部分にわたって50%〜100%の配列同一性を示すことを示し得る。比較目的のために整列させた候補配列の長さは、例えば、参照配列の長さの少なくとも30%(例えば、30%、40、50%、60%、70%、80%、90%、又は100%)であり得る。候補配列における位置が、参照配列における対応する位置と同じアミノ酸残基によって占有されている場合、分子はその位置で同一である。
本明細書において使用される用語「医薬組成物」は、哺乳動物を侵す又は侵し得る特定の疾患又は状態(例えば、本明細書に記載のTGF-β活性の上昇又は骨代謝回転の上昇と関連する疾患又は状態)を予防、処置、又は制御するために、哺乳動物などの対象、例えばヒトに投与される、本明細書に記載のコンジュゲートなどの治療的化合物を含む混合物を指す。
本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」は、妥当な利益/リスク比に釣り合って、過度の毒性、非適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応等がなく、ヒトを含む哺乳動物において使用するための担体又は媒体の適切性を指す。
本明細書において使用される用語「ポリアニオン性ペプチド」は、上記の表1に記載の、アスパルテート及びグルタメートなどの、生理的pHで負に荷電している側鎖を有するペプチド内のアミノ酸残基の量を決定することによって評価した場合に、生理的pHで正味の負電荷を有するペプチドを指す。ポリアニオン性ペプチドは、生理的pHで-1の形式電荷を示す側鎖を有する2つ以上のアミノ酸残基、及び/又は-2以下の形式電荷を示す側鎖を有する1つ以上のアミノ酸残基を含む。生理的pH(7.4)などの特定のpHでのアミノ酸残基の形式電荷は、目的のアミノ酸の側鎖官能基に適用される、ヘンダーソンハッセルバルヒの式、pH = pKa + log [A-]/[HA]を使用して決定することができ、式中「HA」は、側鎖置換基のプロトン化型を示し、「A-」は、側鎖置換基の脱プロトン化型を示す。ヘンダーソンハッセルバルヒの式は、中でもホスフェート置換基を含む側鎖などの、目的のpH(例えば、pH 7.4)で1つより多くのイオン化を受ける側鎖を含む官能基に関して同じアミノ酸に複数回適用してもよいことは当業者によって認識されるであろう。本明細書に記載のアミノ酸の形式電荷は、ヘンダーソンハッセルバルヒの式によって決定した場合にアミノ酸側鎖置換基(例えば、「HA」又は「A-」)の主要な型(すなわち化学平衡時に最高量で存在する型)の荷電を指す。
本明細書において使用される用語「試料」は、対象(例えば、本明細書に記載のTGF-β活性の上昇又は骨代謝回転の上昇と関連する疾患又は状態に罹患しているヒト対象などのヒト対象)から単離した検体(例えば、血液、血液構成要素(例えば、血清又は血漿)、尿、唾液、羊水、脳脊髄液、組織(例えば、胎盤又は皮膚)、膵液、絨毛試料、及び細胞)を指す。
本明細書において使用される用語「scFv」は、抗体からの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが結合して1つの鎖を形成している一本鎖Fv抗体を指す。scFv断片は、リンカーによって隔てられている、抗体軽鎖の可変領域(VL)(例えば、CDR-L1、CDR-L2、及び/又はCDR-L3)、及び抗体重鎖の可変領域(VH)(例えば、CDR-H1、CDR-H2、及び/又はCDR-H3)を含む。scFv断片のVL及びVH領域を結合するリンカーは、タンパク質構成アミノ酸で構成されるペプチドリンカーであり得る。scFv断片のタンパク質分解に対する耐性を増加させるため(例えば、D-アミノ酸を含むリンカー)、scFv断片の溶解度を増強させるため(例えば、ポリエチレングリコール含有リンカー又は反復グリシン及びセリン残基を含むポリペプチドなどの親水性リンカー)、分子の生物物理的安定性を改善するため(例えば、分子内又は分子間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含むリンカー)、又はscFv断片の免疫原性を減弱させるため(例えば、グリコシル化部位を含むリンカー)に、代替のリンカーを使用することができる。本明細書に記載のscFv分子の可変領域を、それらが由来する抗体分子とはアミノ酸配列が異なるように改変することができることも同様に当業者によって理解されるであろう。例えば、対応する抗体によって認識される抗原に結合するscFvの能力を保存又は増強するために、アミノ酸残基で保存的置換又は変化をもたらすヌクレオチド又はアミノ酸置換を作製する(例えば、CDR及び/又はフレームワーク領域において)ことができる。
本明細書において使用される語句「特異的に結合する」及び「結合する」は、タンパク質、及び例えば特にリガンドによって認識される他の生物学的分子の不均一集団中の特定のタンパク質、ミネラル、又は他の特定の化合物の存在を決定する結合反応を指す。タンパク質に特異的に結合するリガンド(例えば、タンパク質、ペプチド、又は低分子)は、例えば100μM未満のKDでタンパク質に結合する。例えば、タンパク質(例えば、TGF-β)に特異的に結合するペプチド(例えば、TGF-β結合性ペプチド、コラーゲン結合ペプチド、又はヒドロキシアパタイト結合ペプチド)は、最大1μM(例えば、1pM〜1μM)のKDでタンパク質に結合し得る。多様なアッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質(例えば、TGF-β又はコラーゲン)又はミネラル(例えば、ヒドロキシアパタイト)に対するリガンド(例えば、TGF-β結合性ペプチド、コラーゲン結合ペプチド、又はヒドロキシアパタイト結合ペプチドなどのペプチド)の親和性を決定してもよい。例えば、固相ELISAアッセイは、特定のタンパク質に特異的に結合するリガンドを同定するために日常的に使用される。例えば、特異的タンパク質結合を決定するために使用することができるアッセイフォーマット及び条件の記載に関して、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York(1988)及びHarlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York(1999)を参照されたい。
本明細書において使用される用語「対象」及び「患者」は、互換的であり、本明細書に記載の特定の疾患又は状態に対して処置を受ける生物を指す。対象及び患者の例として、TGF-β活性の上昇又は骨代謝回転の上昇と関連する状態などの、疾患又は状態に対して処置を受ける、ヒトなどの哺乳動物が挙げられる。
本明細書において使用される用語「標的化部分」は、特定の組織型において発現される内因性構成要素に特異的に結合するペプチドなどの化合物を指す。例えば、本明細書に記載の骨標的化部分は、骨組織の内因性構成要素に特異的に結合する、ペプチドなどの化合物を含む。骨標的化部分の文脈において、骨組織の内因性構成要素は、例えば、コラーゲンなどのタンパク質、又はヒドロキシアパタイトなどのミネラルであり得る。その特異的結合親和性により、標的化部分は、骨などの目的の特定の組織に、TGF-βアンタゴニストなどの目的の化合物を局在させることができる。
本明細書において使用される用語「TGF-βアンタゴニスト」は、TGF-βシグナリングを阻害することができる化合物(例えば、タンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子)を指す。TGF-βアンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、又は抗体、及び任意選択で1つ以上の非ペプチド性分子を含み得る。TGF-βアンタゴニストは、TGF-βに結合することができるタンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子を指す、TGF-β結合性タンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子を含み得るか、それからなり得るか、又は本質的にそれからなり得る。或いは、TGF-βアンタゴニストは、TGF-βが受容体に結合する能力を阻害するようにTGF-β受容体に結合し、それによってTGF-βシグナリングを減弱させるタンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子を含み得るか、それからなり得るか、又は本質的にそれからなり得る。TGF-βに結合する例示的なTGF-βアンタゴニスト、及びTGF-β受容体に結合する例示的なTGF-βアンタゴニストは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される。
本明細書において使用される用語「TGF-βシグナリング」は、それによってTGF-βが、1つ以上の生物学的応答に影響を及ぼすようにTGF-β受容体の細胞内活性を増強する内因性のシグナル伝達カスケードを指す。TGF-βシグナリングは、TGF-β受容体のTGF-β媒介刺激、並びに受容体関連Smadタンパク質の同時のリン酸化及び活性化を包含する。TGF-βシグナリングは、例えば、Smadタンパク質とヌクレオポリンとの間の相互作用による、1つ以上のSmad転写因子の核への移動を含む。TGF-βシグナリングは、細胞質においてSmadタンパク質を隔離し、その核への移動を防止する、受容体活性化のためのSmadアンカー(Smad Anchor for Receptor Activation;SARA)からの1つ以上のSmadタンパク質の放出を包含する。本明細書において病的な疾患又は状態に罹患している患者の文脈において使用される用語「TGF-β活性の上昇」は、その疾患若しくは状態に罹患していない健康な対象におけるTGF-βシグナリング、又は対象がその疾患若しくは状態であると診断される前に測定した目的の対象におけるTGF-βシグナリングなどの参照レベルと比較した、TGF-βシグナリングの増加を指す。TGF-βシグナリングを評価する方法は当技術分野で公知であり、例えば、TGF-βシグナル伝達カスケードによって活性化される転写因子(例えば、Smadタンパク質)によって調節されるプロモーターの制御下で目的の遺伝子の転写の程度を測定するステップ、並びに1つ以上のリン酸化Smad転写因子の濃度又は相対的レベルを測定するステップを含み得る。
本明細書において使用される、本明細書に記載のコンジュゲートなどの治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び/又は状態(例えば、本明細書に記載のTGF-β活性及び/又は骨代謝回転の上昇と関連する疾患、障害、及び/又は状態)に罹患している又は罹りやすい対象に投与した場合に、その疾患、障害、及び/又は状態の1つ以上の症状を処置、予防、及び/又はその発症を遅らせるために十分である量を指す。
本明細書において使用される、TGF-β活性及び/又は骨代謝回転の上昇と関連する疾患又は状態に罹患している対象の文脈における用語「処置する」又は「処置」は、例えば疾患又は状態と関連する表現型を軽減する意図での、本明細書に記載のTGF-βアンタゴニスト及び骨標的化部分を含むコンジュゲートの投与による処置を指す。例えば、処置の例示的な形態には、本明細書に記載のコンジュゲートなどのコンジュゲートを、骨形成不全症(例えば、I〜XI型骨形成不全症)などの骨障害に罹患している対象に、疾患の進行を低減するため、又は対象が再発性の骨折に罹患する傾向などの、疾患と関連する1つ以上の症状の重症度を減弱させるために投与することが含まれる。
図１は3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド(MTT、SIGMA-ALDRICH(商標))の生存細胞への取り込みを様々な時点で分析することによって評価した、培養マウス頭蓋冠前骨芽細胞(MC3T3-E1)の生存率に対するデカアスパラギン酸ヒドロキシアパタイト結合ペプチドにコンジュゲートした抗TGF-β抗体GC1008の効果を実証するグラフである。y軸に沿った値は、培養細胞の595nmでの吸光度を示し、これは生存細胞内に存在するミトコンドリアレダクターゼによるテトラゾリウム色素のホルマザンへの還元を示している。x軸に沿った値は、細胞培養期間において吸光度の測定を記録した時点を表す。MC3T3-E1細胞を、アスコルビン酸(AA)及びβ-グリセロリン酸(βGP)の存在下で培養した。後述の実施例に記載するように、TGF-βは、骨芽細胞の生存率に対して用量依存的に有害な効果を示した。細胞生存率は、デカアスパラギン酸とコンジュゲートした抗TGF-β抗体GC1008(図1において「D10タグ付Ab」として表す)を添加すると用量依存的にレスキュー(改善)された。 図2Aはリン酸銀沈殿及び銀沈着(後述の実施例に記載するフォンコッサ染色)によって評価した、MC3T3細胞の分化誘導によって得られた骨芽細胞培養による石灰化に対するデカアスパラギン酸ヒドロキシアパタイト結合ペプチドにコンジュゲートした抗TGF-β抗体GC1008の効果を実証する一連の画像を提供する図である。図2Bはフォンコッサ染色によって評価した、MC3T3-E1骨芽細胞培養による石灰化に対するデカアスパラギン酸ヒドロキシアパタイト結合ペプチドにコンジュゲートした抗TGF-β抗体GC1008の効果を実証する表である。図2Bは、図2Aに示した条件並びに2つのさらなる培養条件に関して観察された石灰化領域のパーセンテージを定量的に示している。 図３はMC3T3-E1骨芽細胞培養によるカルシウム沈着に対するデカアスパラギン酸ヒドロキシアパタイト結合ペプチドにコンジュゲートした抗TGF-β抗体GC1008の効果を実証するグラフである。y軸に沿った値は、アスコルビン酸及びβGPのみの存在下で培養したMC3T3-E1骨芽細胞に関して記録されたカルシウム沈着量と比較した、x軸に沿って指定された条件で観察されたカルシウム沈着のパーセンテージを表す。 図４はMC3T3-E1骨芽細胞培養によるコラーゲン沈着に対するデカアスパラギン酸ヒドロキシアパタイト結合ペプチドにコンジュゲートした抗TGF-β抗体GC1008の効果を実証するグラフである。y軸に沿った値は、アスコルビン酸及びβGPのみの存在下で培養したMC3T3-E1骨芽細胞に関して記録されたカルシウム沈着量と比較した、x軸に沿って指定された条件で観察されたコラーゲン沈着のパーセンテージを表す。 図５はp-ニトロフェニルホスフェート基質の加水分解を分光光度法によってモニターすることによって評価した、MC3T3-E1骨芽細胞培養におけるアルカリホスファターゼ活性に対するデカアスパラギン酸ヒドロキシアパタイト結合ペプチドにコンジュゲートした抗TGF-β抗体GC1008の効果を実証するグラフである。y軸に沿った値は、タンパク質1ミリグラム当たりの活性単位でアルカリホスファターゼ活性を表す。 図６は抗TGF-β抗体1D11単独及びデカアスパラギン酸ヒドロキシアパタイト結合ペプチドにコンジュゲートしたGC1008の、ヒドロキシアパタイトに対する相対的結合親和性を実証するグラフである。y軸に沿った値は、後述の実施例に記載するようにインキュベーション及び遠心分離後のヒドロキシアパタイト結晶に結合した抗体のパーセンテージを表す。 図７Ａは抗TGF-β抗体1D11の、その非改変型(「D10タグなし」)及びデカアスパラギン酸タグにコンジュゲートしたそのヒト化バリアント(GC1008)型(「D10タグ付Ab」)の、TGF-βアイソフォームTGF-β1への結合を示す表面プラズモン共鳴センソグラムである。 図７Ｂは抗TGF-β抗体1D11の、その非改変型(「D10タグなし」)及びデカアスパラギン酸タグにコンジュゲートしたそのヒト化バリアント(GC1008)型(「D10タグ付Ab」)の、TGF-βアイソフォームTGF-β2への結合を示す表面プラズモン共鳴センソグラムである。 図７Ｃは抗TGF-β抗体1D11の、その非改変型(「D10タグなし」)及びデカアスパラギン酸タグにコンジュゲートしたそのヒト化バリアント(GC1008)型(「D10タグ付Ab」)の、TGF-βアイソフォームTGF-β3への結合を示す表面プラズモン共鳴センソグラムである。
本発明は、TGF-βアンタゴニストをヒト骨などの骨組織に局在させることができる標的化部分に結合した、TGF-βアンタゴニストタンパク質、ペプチド、抗体、又は低分子などのTGF-βアンタゴニストを含む治療的コンジュゲートを提供する。本明細書に記載のコンジュゲートは、TGF-βに直接結合してこれを阻害するTGF-βアンタゴニストを含み得る。一部の実施形態では、コンジュゲートは、TGF-β受容体に結合し、それによってTGF-βが受容体に結合してシグナル伝達を増強する能力を妨害するTGF-βアンタゴニストを含む。
本発明は、TGF-β活性の上昇及び/又は骨代謝回転の上昇と関連する疾患を、TGF-βアンタゴニストによって処置することができるのみならず、これらの機能的薬剤を病的な骨組織部位に局在させることによって、これらの化合物の治療有効性を改善できるという発見に一部基づいている。これは、コラーゲン結合ドメイン又はヒドロキシアパタイト結合ドメインなどの骨標的化部分にTGF-βアンタゴニストをコンジュゲートすることによっ込むことができる様々なTGF-βアンタゴニスト及び骨標的化部分の説明を提供する。
TGF-βアンタゴニスト
本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用することができるTGF-βアンタゴニストは、TGF-βに結合して、TGF-βシグナル伝達を阻害するペプチドなどのTGF-βアンタゴニストペプチドを含む。TGF-βに結合して、TGF-βシグナリングを阻害する例示的なペプチドには、TGF-β共受容体であるCD109のエクトドメインが含まれる。このペプチドは、例えばその各々の開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,173,002号及び米国特許出願公開第2012/0079614号に詳細に記載されている。この1428残基のペプチド、並びにその断片は、哺乳動物細胞においてTGF-βシグナリングを阻害することが示されている。このペプチドの活性型は、CD109配列内の703位でチロシン(配列番号2)又はセリン(配列番号4)残基を含み得る。さらに、残基21〜1404又は21〜1428のアミノ酸配列を含む断片などのCD109の断片を、本明細書に記載のコンジュゲート及び方法の文脈においてTGF-βアンタゴニストペプチドとして使用してもよい。CD109の他の断片、例えば配列番号2及び配列番号4の694〜712位にそれぞれ対応する、アミノ酸配列WIWLDTNMGYRIYQEFEVT(配列番号1)又はWIWLDTNMGSRIYQEFEVT(配列番号3)を含む断片は、これらの配列が推定のTGF-β結合部位を含み得ることから、本明細書に記載のコンジュゲート及び方法においてTGF-βアンタゴニストとして使用することができる。本明細書に記載のコンジュゲート及び方法においてTGF-βアンタゴニストペプチドとして使用することができるCD109ペプチドのさらなる断片は、同様に推定のTGF-β結合部位を含み得る配列番号2の残基651〜683に対応するアミノ酸配列IDGVYDNAEYAERFMEENEGHIVDIHDFSLGSS(配列番号5)を含む。
本明細書に記載のコンジュゲート及び方法において使用することができるCD109のさらなる断片は、アミノ酸配列TMENVVHELELYNTGYYLGMFMNSFAVFQECGLWVLTDANLTKDYIDGVYDNAEYAERFMEENEGHIVDIHDFSLGSSPHVRKHFPETWIWLDTNMGSRIYQEFEVTVPDSITSWVATGFVISEDLGLGLTTTPVELQAFQPFFIFLNLPYSVIRGEEFAL(配列番号6)を有する、このタンパク質の161残基部分を含む。本明細書に記載のコンジュゲート及び方法において使用することができるさらなるペプチド性断片は、配列番号2の少なくとも10、15、25、50、75、100、250、500、750、1000、1250、1400個、又はそれ以上の連続アミノ酸を含み得る。本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用され得る例示的なCD109断片は、配列番号2の残基687〜711に対応するアミノ酸配列RKHFPETWIWLDTNMGYRIYQEFEV(配列番号7)を含むペプチドなどの、推定のTGF-β結合部位を含む断片を含む。
上記に加えて、本明細書に記載の組成物及び方法と共に有用であるTGF-βのペプチドアンタゴニストは、前述の配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又は前述の配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むアンタゴニストを含む。
前述のアンタゴニスト性TGF-βペプチドを、以下の表2にまとめる。
上記に加えて、本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用するためのTGF-βに結合することができるペプチドアンタゴニストは、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,723,473号に記載のペプチド、並びにこれらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むTGF-βのペプチドアンタゴニストを含む。これらのTGF-βアンタゴニストは、I型、II型、III型及びV型受容体を含むTGF-β受容体に特異的に結合する。その一部が、TGF-β1、TGF-β2、及びTGF-β3の配列におけるアミノ酸番号41〜65に対応するこれらのペプチドは、TGF-β受容体に対するTGF-β1、TGF-β2、及びTGF-β3の結合を阻害することが示されている。これらのペプチドは、TGF-β誘導増殖阻害及びTGF-β誘導PAI-1発現を減弱させることが示されている。同様に、これらのペプチド配列内で見出されるW/RXXDモチーフは、アンタゴニストペプチドの活性の特異性を決定することも示されている。これらのTGF-βアンタゴニストペプチドを以下の表3にまとめる。
本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用することができるTGF-βのさらなるペプチド性アンタゴニストは、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,057,013号に記載のペプチドアンタゴニスト、並びにこれらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むTGF-βのペプチドアンタゴニストを含む。これらのTGF-βアンタゴニストペプチドは、TGF-β又はTGF-β受容体の構造に基づいており、TGF-βシグナリングを減弱させる目的のためにTGF-β受容体に対する内因性のTGF-βの結合を妨害するように設計された。これらの合成ペプチドを以下の表4及び5にまとめる。
本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用することができるTGF-βのさらなるペプチド性アンタゴニストは、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2009/0263410号に記載のペプチドアンタゴニスト、並びにこれらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むTGF-βのペプチドアンタゴニストを含む。これらのペプチドを以下の表6にまとめる。
本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用することができるTGF-βのさらなるペプチド性アンタゴニストは、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2011/0294734号に記載のペプチドアンタゴニスト、並びにこれらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むTGF-βのペプチドアンタゴニストを含む。これらのペプチドを以下の表7にまとめる。
本明細書に記載の組成物及び方法と共に有用であるさらなるTGF-βアンタゴニストは、反復優位型糖タンパク質A(GARP)、並びにこのタンパク質と少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこのタンパク質に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むTGF-βのペプチドアンタゴニストを含む。このタンパク質のアンタゴニスト活性は、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、Wang et al., Molecular Biology of the Cell 23:1129-1139(2012)に詳細に記載されている。GARPのアミノ酸配列を以下に示す。
反復優位型糖タンパク質A(GARP):(配列番号50)
MRPQILLLLALLTLGLAAQHQDKVPCKMVDKKVSCQVLGLLQVPSVLPPDTETLDLSGNQLRSILASPLGFYTALRHLDLSTNEISFLQPGAFQALTHLEHLSLAHNRLAMATALSAGGLGPLPRVTSLDLSGNSLYSGLLERLLGEAPSLHTLSLAENSLTRLTRHTFRDMPALEQLDLHSNVLMDIEDGAFEGLPRLTHLNLSRNSLTCISDFSLQQLRVLDLSCNSIEAFQTASQPQAEFQLTWLDLRENKLLHFPDLAALPRLIYLNLSNNLIRLPTGPPQDSKGIHAPSEGWSALPLSAPSGNASGRPLSQLLNLDLSYNEIELIPDSFLEHLTSLCFLNLSRNCLRTFEARRLGSLPCLMLLDLSHNALETLELGARALGSLRTLLLQGNALRDLPPYTFANLASLQRLNLQGNRVSPCGGPDEPGPSGCVAFSGITSLRSLSLVDNEIELLRAGAFLHTPLTELDLSSNPGLEVATGALGGLEASLEVLALQGNGLMVLQVDLPCFICLKRLNLAENRLSHLPAWTQAVSLEVLDLRNNSFSLLPGSAMGGLETSLRRLYLQGNPLSCCGNGWLAAQLHQGRVDVDATQDLICRFSSQEEVSLSHVRPEDCEKGGLKNINLIIILTFILVSAILLTTLAACCCVRRQKFNQQYKA
本明細書に記載の組成物及び方法と共に有用であるさらなるTGF-βアンタゴニストの例には、TGF-βの1つ以上のアイソフォーム(米国特許第5,571,714号及びPCT特許出願国際公開第97/13844号)、TGF-β受容体に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、その断片、その誘導体、並びにTGF-β受容体に対する抗体(米国特許第5,693,607号、第6,008,011号、第6,001,969号、及び第6,010,872号並びにPCT特許出願国際公開第92/00330号、国際公開第93/09228号、国際公開第95/10610号、及び国際公開第98/48024号);潜在型関連ペプチド(国際公開第91/08291号)、大きい潜在型TGF-β(国際公開第94/09812号)、フェチュイン(米国特許第5,821,227号)、デコリン、並びにバイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、及びエンドグリンなどの他のプロテオグリカン(米国特許第5,583,103号、第5,654,270号、第5,705,609号、第5,726,149号、第5,824,655号、第5,830,847号、第6,015,693号、及びPCT特許出願国際公開第91/04748号、国際公開第91/10727号、国際公開第93/09800号、及び国際公開第94/10187号)が含まれる。
本明細書に記載の組成物及び方法と共に有用である特定のTGF-βアンタゴニストには、抗TGF-β抗体1D11、並びにその抗原結合断片、及びそのヒト、ヒト化、及びキメラバリアントが含まれる。1D11のヒト化バリアントである抗TGF-β抗体GC1008は、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第9.958,486号に記載されている。抗TGF-β抗体GC1008は、以下の相補性決定領域(CDR):
a.アミノ酸配列SNVIS(配列番号327)を有するCDR-H1;
b.アミノ酸配列GVIPIVDIANYAQRFKG(配列番号328)を有するCDR-H2;
c.アミノ酸配列TLGLVLDAMDY(配列番号329)を有するCDR-H3;
d.アミノ酸配列RASQSLGSSYLA(配列番号330)を有するCDR-L1;
e.アミノ酸配列GASSRAP(配列番号331)を有するCDR-L2;及び
f.アミノ酸配列QQYADSPIT(配列番号332)を有するCDR-L3
を含む。
抗TGF-β抗体GC1008は、以下に示す、配列番号333の配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号334のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む:
GC1008重鎖可変領域アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCASTLGLVLDAMDYWGQGTLVTVSS(配列番号333)
GC1008軽鎖可変領域アミノ酸配列
ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK(配列番号334)
本明細書に記載の組成物及び方法と共に有用である抗TGF-βアンタゴニストは、GC1008のCDRの1つ以上又は全てを含む抗体及びその抗原結合断片、並びに各々が、上記のGC1008のCDRと少なくとも85%の配列同一性(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%、又はそれ以上の配列同一性)を有する一組のCDRを含むものを含む。本明細書に記載の組成物及び方法と共に有用である例示的な抗TGF-βアンタゴニストには、中でも、モノクローナル抗体及びその抗原結合断片、ポリクローナル抗体及びその抗原結合断片、ヒト化抗体及びその抗原結合断片、二重特異性抗体及びその抗原結合断片、最適化抗体及びその抗原結合断片(例えば、親和性成熟抗体及びその抗原結合断片)、二重可変免疫グロブリンドメイン、一本鎖Fv分子(scFv)、ダイアボディ、トリアボディ、ナノボディ、抗体様タンパク質スキャフォールド、Fv断片、Fab断片、F(ab')2分子、又はタンデムdi-scFV、例えばGC1008のCDRの1つ以上又は全てを有するもの、並びに各々が上記で示されるGC1008のCDRと少なくとも85%の配列同一性(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%、又はそれ以上の配列同一性)を有する一組のCDRを含むものが含まれる。
さらに、本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用され得る抗体及びその抗原結合断片には、マウス抗体1D11と同じTGF-β上のエピトープに結合するもの、そのヒト化対応物であるGC1008、並びに1D11及びGC1008と同じ一組のCDRを有する抗体又はその抗原結合断片が含まれる。抗体又はその抗原結合断片が、1D11又はGC1008などの参照抗体と同じTGF-β上のエピトープに結合するか否かを決定するために使用することができる例示的な方法には、競合的ELISA実験又は当技術分野で公知の他の競合的結合アッセイなどの競合的結合実験が含まれる。抗体又はその抗原結合断片が、参照抗体に対するTGF-βの結合を競合的に阻害すれば、抗体又はその抗原結合断片は、1D11又はGC1008などの参照抗体と同じTGF-β上のエピトープに結合すると考えられる。抗体又はその抗原結合断片が参照抗体又はその抗原結合断片と同じTGF-β上のエピトープに結合するか否かを決定するために使用することができる競合的結合実験は、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、Nagata et al., Journal of Immunological Methods 292:141-155(2004)に記載されている。
このため、本発明に記載の組成物及び方法と共に有用である抗体及びその抗原結合断片は、以下のCDR:
a.アミノ酸配列SNVIS(配列番号327)を有するCDR-H1;
b.アミノ酸配列GVIPIVDIANYAQRFKG(配列番号328)を有するCDR-H2;
c.アミノ酸配列TLGLVLDAMDY(配列番号329)を有するCDR-H3;
d.アミノ酸配列RASQSLGSSYLA(配列番号330)を有するCDR-L1;
e.アミノ酸配列GASSRAP(配列番号331)を有するCDR-L2;及び
f.アミノ酸配列QQYADSPIT(配列番号332)を有するCDR-L3
を含む抗体又はその抗原結合断片に対するTGF-βの結合を競合的に阻害するものを含む。
本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用され得る抗体及びその抗原結合断片は、配列番号333に記載の重鎖可変領域及び/又は配列番号334に記載の軽鎖可変領域を有する抗体又はその抗原結合断片に対するTGF-βの結合を競合的に阻害するものを含む。
そのようなアンタゴニストのさらなる例には、ソマトスタチン(国際公開第98/08529号)、マンノース-6-リン酸又はマンノース-1-リン酸(米国特許第5,520,926号)、プロラクチン(PCT特許出願国際公開第97/40848号)、インスリン様成長因子II(PCT特許出願国際公開第98/17304号)、IP-10(PCT特許出願国際公開第97/00691号)、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(arg-gly-asp)含有ペプチド(米国特許第5,958,411号及びPCT特許出願国際公開第93/10808号)、並びに植物、真菌、及び細菌の抽出物(欧州特許出願第813875号、日本国特許出願第8119984号、及び米国特許第5,693,610号)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(米国特許第5,683,988号、第5,772,995号、第5,821,234号、及び第5,869,462号、並びにPCT特許出願国際公開第94/25588号)、並びにSMAD及びMAD(欧州特許出願第874046号、PCT特許出願国際公開第97/31020号、国際公開第97/38729号、国際公開第98/03663号、国際公開第98/07735号、国際公開第98/07849号、国際公開第98/45467号、国際公開第98/53068号、国際公開第98/55512号、国際公開第98/56913号、国際公開第98/53830、及び国際公開第99/50296号、及び米国特許第5,834,248号、第5,807,708号、及び第5,948,639号)、及びSki及びSno(G. Vogel, Science, 286:665(1999)及びStroschein et al., Science, 286:771-74(1999))を含むTGF-βシグナリングに関係する他の多くのタンパク質、並びにTGF-βの活性を阻害する能力を保持している上記の分子のいずれかの断片及び誘導体が含まれる。
TGF-βアンタゴニストのさらなる例は、TGF-βシグナル伝達を阻害する低分子を含む。これらの薬剤は、これらの分子のコア分子スキャフォールドに基づいて分類することができる。例えば、TGF-βシグナリング阻害剤は、分子のコア構造断片として、ジヒドロピリリピラゾール、イミダゾール、ピラゾロピリジン、ピラゾール、イミダゾピリジン、トリアゾール、ピリドピリミジン、ピロロピラゾール、イソチアゾール、又はオキサゾール官能基を含み得る。TGF-βシグナリングの低分子阻害剤の一部の非制限的な例には、当技術分野で公知である、ALK5阻害剤II(E-616452とも呼ばれる)、LY364947(ALK5阻害剤I、TbR-I阻害剤、トランスフォーミング増殖因子-b I型受容体キナーゼ阻害剤とも呼ばれる)、A83-01、及びDMH1が含まれる。本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用することができる低分子TGF-βアンタゴニストの他の例には、SB431542(4-(5-ベンゾール[1,3]ジオキソール-5-イル-4-ピリジン-2-イル-1H-イミダゾール-2-イル)-ベンズアミド水和物、4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミド水和物、4-[4-(3,4-メチレンジオキシフェニル)-5-(2-ピリジル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミド水和物、Alk5阻害剤)、ガルニセルチブ(LY2157299、Alk5阻害剤)、LY2109761(4-[2-[4-(2-ピリジン-2-イル-5,6-ジヒドロ-4H-ピロロ[1,2-b]ピラゾール-3-イル)キノリン-7-イル]オキシエチル]モルフォリン、Alk5/TGFβRII阻害剤)、SB525334(6-[2-tert-ブチル-5-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-イミダゾール-4-イル]キノキサリン、Alk5阻害剤)、GW788388(N-(オキサン-4-イル)-4-[4-(5-ピリジン-2-イル-1H-ピラゾール-4-イル)ピリジン-2-イル]ベンズアミド、Alk5阻害剤)、K02288(3-[6-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ピリジン-3-イル]フェノール、Alk4/Alk5阻害剤)、SD-208(2-(5-クロロ-2-フルオロフェニル)-N-ピリジン-4-イルプテリジン-4-アミン、Alk5阻害剤)、EW-7197(N-((4-([1,2,4]トリアゾロ[1,5-a]ピリジン-6-イル)-5-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-イミダゾール-2-イル)メチル)-2-フルオロアニリン、Alk4/Alk5阻害剤)、及びLDN-212854(5-[6-[4-(1-ピペラジニル)フェニル]ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]-キノリン、Alk4/Alk5阻害剤)が含まれる。
低分子TGF-βアンタゴニストのさらなる例には、TGF-β受容体に結合するアンタゴニスト、例えば2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5ナフチリジン、[3-(ピリジン-2-イル)-4-(4-キノイル(quinoyl))]-1H-ピラゾール、及び3-(6-メチルピリジン-2-イル)-4-(4-キノリル)-1-フェニルチオカルバモイル-1H-ピラゾールが含まれる。他の低分子阻害剤には、SB-431542(4-[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]-ベンズアミド、Halder et al., Neoplasia 7(5):509-521(2005)に記載される)、その構造を以下に示すSM16、TGFβ受容体ALK5の低分子阻害剤(Fu, K et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 28(4):665(2008))、SB-505124(Alk4/Alk5阻害剤、構造を以下に示し、Dacosta Byfield, S., et al., Molecular Pharmacology 65:744-752(2004)に記載される)、及び6-ブロモ-インジルビン-3′-オキシム(米国特許第8,298,825号に記載)が含まれるがこれらに限定されず、その各々の開示は参照により本明細書に組み入れられる。
低分子TGF-βアンタゴニストのさらなる例には、例えばその各々の開示が、TGF-βアンタゴニストに関するので参照により本明細書に組み入れられる、Callahan, J. F. et al., J. Med. Chem. 45:999-1001(2002)、Sawyer, J. S. et al., J. Med. Chem. 46:3953-3956(2003)、Gellibert, F. et al., J. Med. Chem. 47:4494-4506(2004)、Tojo, M. et al., Cancer Sci. 96:791-800(2005)、Valdimarsdottir, G. et al., APMIS 113:773-389(2005)、Petersen et al., Kidney International 73:705-715(2008)、Yingling, J. M. et al., Nature Rev. Drug Disc. 3:1011-1022(2004)、Byfield, S. D. et al., Mol. Pharmacol., 65:744-752(2004)、Dumont, N, et al., Cancer Cell 3:531-536(2003)、国際公開第2002/094833号、国際公開第2004/026865号、国際公開第2004/067530号、国際公開第209/032667号、国際公開第2004/013135号、国際公開第2003/097639号、国際公開第2007/048857号、国際公開第2007/018818号、国際公開第2006/018967号、国際公開第2005/039570号、国際公開第2000/031135号、国際公開第1999/058128号、米国特許第6,509,318号、米国特許第6,090,383号、米国特許第6,419,928号、米国特許第7,223,766号、米国特許第6,476,031号、米国特許第6,419,928号、米国特許第7,030,125号、米国特許第6,943,191号、米国特許出願公開第2005/0245520号、米国特許出願公開第2004/0147574号、米国特許出願公開第2007/0066632号、米国特許出願公開第2003/0028905号、米国特許出願公開第2005/0032835号、米国特許出願公開第2008/0108656号、米国特許出願公開第2004/015781号、米国特許出願公開第2004/0204431号、米国特許出願公開第2006/0003929号、米国特許出願公開第2007/0155722号、米国特許出願公開第2004/0138188号、及び米国特許出願公開第2009/0036382号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
コラーゲン結合ドメイン及びヒドロキシアパタイト結合ドメイン
多様なコラーゲン結合ドメイン及びヒドロキシアパタイト結合ドメインを、本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用することができる。例えば、コラーゲン結合活性を有する多様なペプチドが、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,450,272号に記載されている。その中で記載される例示的なコラーゲン結合ペプチドを、以下にまとめる。
(配列番号54)
Pro Val Tyr Pro Ile Gly Thr Glu Lys Glu Pro
Asn Asn Ser Lys Glu Thr Ala Ser Gly Pro Ile Val Pro Gly Ile Pro
Val Ser Gly Thr Ile Glu Asn Thr Ser Asp Gln Asp Tyr Phe Tyr Phe
Asp Val Ile Thr Pro Gly Glu Val Lys Ile Asp Ile Asn Lys Leu Gly
Tyr Gly Gly Ala Thr Trp Val Val Tyr Asp Glu Asn Asn Asn Ala Val
Ser Tyr Ala Thr Asp Asp Gly Gln Asn Leu Ser Gly Lys Phe Lys Ala
Asp Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr Ile His Leu Tyr Met Phe Asn Gly Ser
Tyr Met Pro Tyr Arg Ile Asn Ile Glu Gly Ser Val Gly Arg
(配列番号55)
Glu Ile Lys Asp Leu Ser Glu Asn Lys Leu Pro Val
Ile Tyr Met His Val Pro Lys Ser Gly Ala Leu Asn Gln Lys Val Val
Phe Tyr Gly Lys Gly Thr Tyr Asp Pro Asp Gly Ser Ile Ala Gly Tyr
Gln Trp Asp Phe Gly Asp Gly Ser Asp Phe Ser Ser Glu Gln Asn Pro
Ser His Val Tyr Thr Lys Lys Gly Glu Tyr Thr Val Thr Leu Arg Val
Met Asp Ser Ser Gly Gln Met Ser Glu Lys Thr Met Lys Ile Lys Ile
Thr Asp Pro Val Tyr Pro Ile Gly Thr Glu Lys Glu Pro Asn Asn Ser
Lys Glu Thr Ala Ser Gly Pro Ile Val Pro Gly Ile Pro Val Ser Gly
Thr Ile Glu Asn Thr Ser Asp Gln Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Val Ile
Thr Pro Gly Glu Val Lys Ile Asp Ile Asn Lys Leu Gly Tyr Gly Gly
Ala Thr Trp Val Val Tyr Asp Glu Asn Asn Asn Ala Val Ser Tyr Ala
Thr Asp Asp Gly Gln Asn Leu Ser Gly Lys Phe Lys Ala Asp Lys Pro
Gly Arg Tyr Tyr Ile His Leu Tyr Met Phe Asn Gly Ser Tyr Met Pro
Tyr Arg Ile Asn Ile Glu Gly Ser Val Gly Arg
本明細書に記載の組成物及び方法と共に有用であるコラーゲン結合ペプチドはまた、これらの配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するペプチドを含む。
さらに、ヒト糖タンパク質VI(GPVI)に由来するコラーゲン結合ペプチドが、例えばその開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,084,577号に記載されている。GPVIのコラーゲン結合ドメインは、例えば以下に記載の合成化学又はタンパク質発現方法論を使用して、本明細書に記載のコンジュゲートに組み込むことができる。GPVIのコラーゲン結合ドメインの配列を以下に記載する:
(配列番号56)
Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser
Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro
Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln
Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly
Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser
Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu
Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu
Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala Leu Tyr Lys Glu
Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser
Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys
Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp
Pro Leu Glu Leu Val Val Thr
本明細書に記載のコンジュゲート及び方法と共に有用であるコラーゲンペプチドは、前述のGPVI由来配列と少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこの配列の1つに関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するペプチドを含む。
さらに、ヒトフィブロネクチン由来のコラーゲン結合ペプチド(例えば、ヒトフィブロネクチンのAla260及びTrp599の間(それらの端値を含む)のアミノ酸配列に対応する約340残基のペプチド)を、本明細書に記載のコンジュゲートに組み込むことができ、これはその開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第2000/049159号に詳細に記載されている。
本明細書に記載のコンジュゲート及び方法と共に有用であるコラーゲン結合ペプチドは、前述のフィブロネクチン由来配列と少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するペプチドを含む。
骨シアロタンパク質に由来するコラーゲン結合ペプチドを、本明細書に記載のコンジュゲートに組み込むことができる。そのようなペプチドは、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第2005/082941号に詳細に記載されている。コラーゲンに結合する骨シアロタンパク質のN末端ドメインに由来する例示的な配列を以下にまとめる:
NGVFKYRPRYFLYKHAYFYPPLKRFPVQ(配列番号57)
NGVFKYRPRYFLYK(配列番号58)
HAYFYPPLKRFPVQ(配列番号59)
本明細書に記載のコンジュゲート及び方法と共に有用であるコラーゲン結合ペプチドはまた、前述の配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するペプチドを含む。
上記に加えて、本明細書に記載のコンジュゲートに組み込むことができるヒドロキシアパタイト結合ドメインは、例えばファージディスプレイ技術を使用して同定されている。そのようなペプチドは、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,022,040号に記載されている。本明細書に記載の例示的なヒドロキシアパタイト結合ドメインを以下の表8にまとめる。
本明細書に記載のコンジュゲート及び方法と共に有用であるヒドロキシアパタイト結合ペプチドはまた、前述の配列の1つと少なくとも85%(例えば、少なくとも85%、90%、95%、97%、99%、又はそれ以上)の配列同一性を有する、及び/又はこれらの配列に関して1つ以上の保存的アミノ酸置換を有するペプチドを含む。
TGF-βアンタゴニストをヒドロキシアパタイトに、そしてそれにより骨組織に局在させるために使用することができる例示的な標的化部分としては、ポリアニオン性ペプチドが挙げられ、例えばカルボキシレート、スルホネート、ホスホネート、及びホスフェートからなる群から選択される側鎖置換基を有する1つ以上のアミノ酸を含むペプチドが挙げられる。例えば、ヒドロキシアパタイト結合標的化部分は、連続する又は不連続な複数のアスパルテート又はグルタメート残基を特徴とする部分を含む。ポリアニオン性ペプチドは、中でもペプチド内の負に荷電した置換基、例えば1つ以上のカルボキシレート、スルホネート、ホスホネート、又はホスフェート置換基とヒドロキシアパタイト内に存在する正に荷電したカルシウムイオンとの間の静電気的相互作用によってヒドロキシアパタイトに結合することができる。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、1つ以上のグルタメート残基(例えば、1〜25個のグルタメート残基、又はそれ以上、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24個、又は25個、又はそれ以上のグルタメート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、3〜20個のグルタメート残基(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個のグルタメート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、5〜15個のグルタメート残基(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のグルタメート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、8〜12個のグルタメート残基(例えば、8、9、10、11、又は12個のグルタメート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、5個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、6個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、7個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、8個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、9個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、10個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、11個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、12個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、13個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、14個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、15個のグルタメート残基を含む(例えば、それからなる)。
ポリアニオン性ペプチドは、式Enのペプチドであって、Eがグルタメート残基を示し、nが1〜25の整数であるペプチドであり得る。例えば、ポリアニオン性ペプチドは、式E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8、E9、E10、E11、E12、E13、E14、E15、E16、E17、E18、E19、E20、E21、E22、E23、E24、又はE25のペプチドであり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、式XnEmXoEpのペプチドであって、Eがグルタメート残基を示し、各々のXが独立して任意の天然に存在するアミノ酸を示し、mが1〜25の整数を表し、並びにn及びoが各々独立して0〜5の整数を表し、並びにpが1〜10の整数を表すペプチドである。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、1つ以上のアスパルテート残基(例えば、1〜25個のアスパルテート残基、又はそれ以上、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個、又はそれ以上のアスパルテート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、3〜20個のアスパルテート残基(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個のアスパルテート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、5〜15個のアスパルテート残基(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個のアスパルテート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、8〜12個のアスパルテート残基(例えば、8、9、10、11、又は12個のアスパルテート残基)を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、5個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、6個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、7個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、8個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、9個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、10個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、11個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、12個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、13個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、14個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチドは、15個のアスパルテート残基を含む(例えば、それからなる)。
ポリアニオン性ペプチドは、式Dnのペプチドであって、Dがアスパルテート残基を示し、及びnが1〜25の整数であるペプチドであり得る。例えば、ポリアニオン性ペプチドは、式D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12、D13、D14、D15、D16、D17、D18、D19、D20、D21、D22、D23、D24、又はD25のペプチドであり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、式XnDmXoDpのペプチドであって、Dがアスパルテート残基を示し、各々のXが独立して任意の天然に存在するアミノ酸を示し、mが1〜25の整数を表し、並びにn及びoが各々独立して0〜5の整数を表し、並びにpが1〜10の整数を表すペプチドである。
一部の実施形態では、アスパルテート残基は、連続している。一部の実施形態では、アスパルテート残基は、不連続である。
一部の実施形態では、ポリアニオン性ペプチド中の、生理的pHで負に荷電している側鎖を有するアミノ酸の、アミノ酸の全量に対する比率は、約0.5〜約2.0である。
ペプチド合成技術
本明細書に記載のコンジュゲートの固相ペプチド合成を実施するためのシステム及びプロセスは当技術分野で公知であり、中でも例えば、その各々の開示が、固相支持体上でのペプチドの合成のためのプロトコール及び技術に関するので参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第9,169,287号、第9,388,212号、第9,206,222号、第6,028,172号、及び第5,233,044号に記載されている。固相ペプチド合成は、アミノ酸残基が、ポリマー樹脂(例えば、ポリエチレングリコール含有樹脂などの親水性樹脂、又はポリスチレンベースの樹脂などの疎水性樹脂)などの固相支持体上に固定されているペプチドに付加される公知のプロセスである。
中でもアミノ、ヒドロキシ、チオール、及びカルボキシ置換基に保護基を含むペプチドなどのペプチドは、ペプチドが固相支持体に有効に固定されるように固相支持体に結合していてもよい。例えば、ペプチドを、そのC末端を介して固相支持体に結合してもよく、それによってその後の反応のために樹脂-液体界面でペプチドを固定してもよい。
固定したペプチドにアミノ酸残基を付加するプロセスは、固定されたペプチドの少なくとも一部から保護基の少なくとも一部を除去するために、固定されたペプチドに脱保護試薬を曝露するステップを含み得る。脱保護試薬の曝露ステップは、例えば、側鎖保護基が保存されるが、N末端保護基が除去されるように構成することができる。例えば、例示的なアミノ保護基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)を含み得る。ピペリジンを含む脱保護試薬(例えば、ジメチルホルムアミド(DMF)などの適切な有機溶媒中のピペリジン溶液)を、Fmoc保護基が固定されたペプチドの少なくとも一部から除去されるように、固定されたペプチドに曝露してもよい。アミノ置換基の保護にとって適した他の保護基には、例えば、tert-ブトキシカルボニル(Boc)部分が含まれる。トリフルオロ酢酸(TFA)などの強酸を含む脱保護試薬を、イオン化プロセスによりBoc保護基を除去するためにBoc保護アミノ置換基を含む固定されたペプチドに曝露してもよい。このようにして、これらの位置の1つ以上で化学官能基を位置選択的に付加するために、ペプチドを、固定されたペプチドの1つ以上の側鎖で、又はN若しくはC末端などの特定の部位で保護及び脱保護することができる。これは、例えば、固定されたペプチドの側鎖を誘導体化するために、又はペプチドを例えばC末端からN末端へと合成するために使用することができる。
固定されたペプチドにアミノ酸残基を付加するプロセスは、例えば、保護されて活性化されたアミノ酸を、固定されたペプチドに曝露するステップを含むことができ、それによって活性化アミノ酸の少なくとも一部が、固定されたペプチドに結合し、新たに結合したアミノ酸残基を形成する。例えば、ペプチド鎖が1アミノ酸伸長するように、ペプチドを、ペプチドの脱保護されたN末端と反応する活性化アミノ酸に曝露してもよい。アミノ酸と、アミノ酸のカルボニル炭素の求電子性を増強する試薬との反応によって、アミノ酸を、脱保護されたペプチドとの反応に関して活性化することができる。例えば、ホスホニウム及びウロニウム塩は、三級塩基(例えば、中でもジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)及びトリエチルアミン(TEA))の存在下で、保護されたアミノ酸を活性化種(例えば、BOP、PyBOP、HBTU、及びTBTUは、全てHOBtエステルを生成する)に変換することができる。塩基の存在下で誘導され得るラセミ化を防止するために役立つように、他の試薬を使用することができる。これらの試薬は、高求核性の補助剤(例えば、1-ヒドロキシ-ベンゾトリアゾール(HOBt)、1-ヒドロキシ-アザベンゾトリアゾール(HOAt)、又はHOSu)又はその誘導体と共にカルボジイミド(例えば、DCC又はWSCDI)を含む。ラセミ化を防止するために利用することができる別の試薬は、TBTUである。クロロギ酸イソブチルを、補助求核試薬の存在下又は非存在下で使用する混合酸無水物法、並びにこの試薬と関連する低いラセミ化によりアジド法も同様に使用することができる。これらのタイプの化合物はまた、カルボジイミド媒介カップリング速度を増加させ、並びにアスパラギン及びグルタミン残基の脱水を防止することもできる。典型的なさらなる試薬には、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、トリエチルアミン(TEA)、又はN-メチルモルホリン(NMM)などの塩基が含まれる。これらの試薬は、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,546,350号に詳細に記載されている。
環状ペプチドは、固相ペプチド合成技術を使用して合成することができる。例えば、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ、又はチオール部分などの側鎖置換基を、樹脂に共有結合させ、アミノ酸のN末端及びC末端を溶液中で曝露したままにすることができる。N又はC末端は、例えばペプチド鎖を伸長させる反応が起こっている間に化学的に保護することができる。次に、ペプチドが樹脂に対する側鎖の結合によって固定されている間に、ペプチドの末端を選択的に脱保護して、互いにカップリングさせることができる。頭-尾環状ペプチドを合成するための技術及び試薬は当技術分野で公知であり、例えば、その開示の全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第9,388,212号及び第7,589,170号に記載されている。
コンジュゲート合成のためのリンカー
合成リンカー
例えば本明細書に記載のコンジュゲートを形成するために、多様なリンカーを使用して、ペプチド性TGF-βアンタゴニスト及び骨標的化部分における反応性残基を互いに共有結合させることができる。例示的なリンカーには、例えば、酵素加水分解、光分解、酸性条件下での加水分解、塩基性条件下での加水分解、酸化、ジスルフィド還元、求核試薬切断、又は有機金属切断によって切断され得るリンカーが含まれる(例えば、その開示が、化学的カップリングにとって適したリンカーに関するので参照により本明細書に組み入れられる、Leriche et al., Bioorg. Med. Chem., 20:571-582, 2012を参照されたい)。本明細書に記載のコンジュゲートの合成にとって有用なリンカーの例には、中でも、抗体、抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、並びにアミン及びチオール部分などの低分子内に存在する求核性置換基との反応にとって適した、マイケル型反応のアクセプター(例えば、マレイミド)、活性化エステル、電子不足カルボニル化合物、及びアルデヒドなどの求電子基を含むリンカーが含まれる。例えば、治療的コンジュゲートの合成にとって適したリンカーには、アルキル、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルリンカー、例えば開環鎖エチル、プロピル、ブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、又はデシル鎖、シクロヘキシル基、シクロペンチル基、シクロブチル基、シクロプロピル基、ピペリジニル基、モルホリノ基、又は2つの反応性部分を含むその他の基(例えば、中でもTGF-βアンタゴニストペプチド及び/又は骨標的化部分内に存在する反応性の求核性原子に置き換えることができる、ハロゲン原子、アルデヒド基、エステル基、アシルクロリド基、アシル無水物基、トシル基、メシル基、又はブロシル基)、アリール又はヘテロアリールリンカー、例えばTGF-βアンタゴニストペプチド及び/又は骨標的化部分内に存在する反応性の求核性原子に置き換えることができる2つのハロメチル基を含むベンジル、ナフチル、又はピリジル基が含まれるがこれらに限定されない。例示的なリンカーには、中でも例えば、その開示が、化学的コンジュゲーションのためのリンカーに関するので参照により本明細書に組み入れられる、Liu et al., 18:690-697, 1979に記載される、スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-L-カルボキシレート(SMCC)、N-スクシンイミジルヨードアセテート(SIA)、スルホ-SMCC、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(MBS)、スルホ-MBS、及びスクシンイミジルヨードアセテートが含まれる。さらなるリンカーには、その開示が、化学的コンジュゲーションのためのリンカーに関するので参照により本明細書に組み入れられる、Doronina et al., Bioconjugate Chem. 17:14-24, 2006に記載されている非切断型マレイミドカプロイルリンカーが含まれる。
コンジュゲートの1つの構成要素を、本明細書に記載される他方の構成要素に結合させることができるさらなるリンカーは、リンカーの1つの末端でコンジュゲートの1つの構成要素(例えば、抗体、タンパク質、ペプチド、又は低分子などのTGF-βアンタゴニスト)に共有結合し、リンカーの他方の末端で、リンカー上に存在する反応性置換基とコンジュゲートの他の構成要素(例えば、本明細書に記載の骨標的化部分)内に存在する反応性置換基との間のカップリング反応から形成される化学部分を含むリンカーを含む。コンジュゲートの構成要素内に存在し得る例示的な反応性置換基には、セリン、スレオニン、及びチロシン残基のヒドロキシル部分、リシン残基のアミノ部分、アスパラギン酸及びグルタミン酸のカルボキシル部分、並びにシステイン残基のチオール部分、並びに天然に存在しないアミノ酸のプロパルジル、アジド、ハロアリール(例えば、フルオロアリール)、ハロヘテロアリール(例えば、フルオロヘテロアリール)、ハロアルキル及びハロヘテロアルキル部分が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に記載のコンジュゲートと共に有用であるリンカーには、以下の表9に表されるカップリング反応によって形成される化学部分を含むリンカーが含まれるがこれらに限定されない。湾曲線は、コンジュゲートの各々の構成要素への結合点を指す。
ペプチド性リンカー
上記の合成リンカーに加えて、本明細書に記載のコンジュゲートの1つの構成要素の別の構成要素への結合は、ペプチドリンカーによって行うことができる。1つ以上の構成要素がペプチドリンカーによって結合しているタンパク質構成アミノ酸で構成されるTGF-βアンタゴニスト及びそのコンジュゲートは、例えば、リンカーをコードする核酸をコンジュゲートの構成要素と共に発現させることによって調製することができる。例示的なペプチドリンカーには、1つ以上のグリシン残基を含むリンカーが含まれる。そのようなリンカーは、グリシンが多様なねじれ角にアクセスできることにより、立体的にフレキシブルであり得る。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と共に有用であるペプチドリンカーは、GGG(配列番号335)などのポリグリシンを含む。ペプチド性リンカーのさらなる例には、セリン又はスレオニンなどの1つ以上の極性アミノ酸を含むリンカーが含まれる。例えば、本明細書に記載の組成物及び方法と共に有用であるリンカーには、ペプチドGGGGS(配列番号336)の1つ以上の反復配列を含むリンカーが含まれる。さらなるリンカーには、GGGGSGGGGSGGGGSG(配列番号337)、並びにリシン、アルギニン、アスパルテート、又はグルタメート残基などの1つ以上のカチオン又はアニオン残基を含むリンカーが含まれる。
宿主細胞におけるコンジュゲートの発現方法
上記の技術などの合成化学技術に加えて、本明細書に記載のコンジュゲート(例えば、TGF-βアンタゴニストが、1つ以上のペプチド結合によって骨標的化部分に結合しているタンパク質コンジュゲート)を、例えば、コンジュゲートタンパク質をコードする核酸を宿主細胞に送達することによって、宿主細胞において発現させることができる。以下の節は、コンジュゲートタンパク質を発現させる目的で、本明細書に記載の治療的コンジュゲートをコードする核酸を宿主細胞に送達する目的のために使用することができる多様な確立された技術を記載する。
トランスフェクション技術
本明細書に記載のTGF-βアンタゴニストペプチドをコードする核酸などのポリヌクレオチドを細胞(例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞)に導入するために使用することができる技術は、当技術分野で周知である。例えば、電気穿孔を使用して、目的の細胞に静電電位を印加することによって哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)を透過性にすることができる。このようにして外部電場に供したヒト細胞などの哺乳動物細胞は、その後、外来性核酸を取り込みやすくなる。哺乳動物細胞の電気穿孔は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Chu et al., Nucleic Acids Research 15:1311(1987)に詳細に記載されている。類似の技術であるNucleofection(商標)は、外来性ポリヌクレオチドの真核細胞の核への取り込みを刺激するために、電場の印加を利用する。Nucleofection(商標)及びこの技術を行うために有用なプロトコールは、例えば、その各々の開示が参照により本明細書に組み入れられる、Distler et al., Experimental Dermatology 14:315(2005)、並びに米国特許出願公開第2010/0317114号に詳細に記載されている。
目的の細胞のトランスフェクションにとって有用なさらなる技術は、スクイーズポレーション方法論を含む。この技術は、適用された応力に反応して形成する膜孔を通しての外来性DNAの取り込みを刺激するために、細胞の急速な力学的変形を誘導する。この技術は、ヒト細胞などの細胞に核酸を送達するためにベクターを必要としないという点において有利である。スクイーズポレーション技術は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Sharei et al., Journal of Visualized Experiments 81:e50980(2013)において詳細に記載されている。
リポフェクションは、細胞のトランスフェクションにとって有用な別の技術を表す。この方法は、リポソームの外部に向かって四級又はプロトン化アミンなどのカチオン性官能基を表すことが多いリポソームへの核酸の担持を伴う。これは、細胞膜のアニオン性の性質により、リポソームと細胞との間の静電相互作用を促進し、最終的に例えばリポソームと細胞膜との直接融合によって、又は複合体のエンドサイトーシスによって、外来性核酸の取り込みをもたらす。リポフェクションは、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,442,386号に詳細に記載されている。外来性核酸の取り込みを誘発するために細胞膜とのイオン相互作用を利用する類似の技術は、細胞に、カチオン性ポリマー核酸複合体を接触させるステップを含む。細胞膜との相互作用にとって好ましい陽電荷を付与するためにポリヌクレオチドに会合する例示的なカチオン分子には、活性化デンドリマー(例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Dennig, Topics in Current Chemistry 228:227(2003)に記載されている)、及びそのトランスフェクション剤としての使用が、例えばその開示が参照により本明細書に組み入れられる、Gulick et al., Current Protocols in Molecular Biology 40:I:9.2:9.2.1(1997)に詳細に記載されている、ジエチルアミノエチル(DEAE)-デキストランが含まれる。磁気ビーズは、この方法論が、核酸の取り込みを指示するために印加した磁場を利用することから、細胞を軽度にかつ効率的にトランスフェクトするために使用することができる別のツールである。この技術は、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2010/0227406号に詳細に記載されている。
細胞による外来性核酸の取り込みを誘導するために有用な別のツールは、レーザーフェクションであり、これは細胞を穏やかに透過性にしてポリヌクレオチドを細胞膜に貫通させるために、特定の波長の電磁放射線を細胞に曝露することを伴う技術である。この技術は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Rhodes et al., Methods in Cell Biology 82:309(2007)に詳細に記載されている。
微小胞は、本明細書に記載の方法に従って細胞のゲノムを改変するために使用することができる別の潜在的運搬体を表す。例えばヌクレアーゼなどのゲノム改変タンパク質による糖タンパク質VSV-Gの同時過剰発現によって誘導されている微小胞を使用して、遺伝子又は調節配列などの目的のポリヌクレオチドの共有結合による組み込みのために細胞のゲノムを調製するために、内因性のポリヌクレオチド配列の部位特異的切断をその後触媒するタンパク質を細胞に効率的に送達することができる。真核細胞の遺伝子改変のための、ゲシクルとも呼ばれるそのような小胞の使用は、例えば、Quinn et al., Genetic Modification of Target Cells by Direct Delivery of Active Protein [abstract]. In: Methylation changes in early embryonic genes in cancer [abstract], in: Proceedings of the 18th Annual Meeting of the American Society of Gene and Cell Therapy; 2015 May 13, Abstract No. 122に詳細に記載されている。
遺伝子編集技術による遺伝子の組み込み
上記に加えて、ヒト細胞などの細胞に、外来性遺伝子、例えば本明細書に記載のTGF-βアンタゴニストペプチド又はコンジュゲートをコードする外来性遺伝子を組み込むために使用することができる多様なツールが開発されている。本明細書に記載のTGF-βアンタゴニスト又はコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを細胞に組み込むために使用することができる1つのそのような方法は、トランスポゾンの使用を伴う。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドであり、5'及び3'切除部位が隣接する目的のポリヌクレオチド配列又は遺伝子を含む。トランスポゾンが細胞に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が始まり、それによってトランスポゾンから目的の遺伝子を切断する活性な酵素をもたらす。この活性は、トランスポザーゼによるトランスポゾン切除部位の部位特異的認識によって媒介される。一部の例において、これらの切除部位は、末端反復配列又は末端逆位配列であり得る。トランスポゾンから切除されると、TGF-βアンタゴニストペプチド又はコンジュゲートをコードする遺伝子は、細胞の核ゲノム内に存在する類似の切除部位のトランスポザーゼ触媒切断により、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得る。これにより、目的の遺伝子を、相補的切除部位で切断された核DNAに挿入することができ、その後TGF-βアンタゴニストペプチド又はコンジュゲートをコードする遺伝子を哺乳動物細胞ゲノムのDNAに結合させるホスホジエステル結合の共有結合によるライゲーションにより、組み込みプロセスが終了する。一部の例において、トランスポゾンはレトロトランスポゾンであり得、TGF-βアンタゴニストペプチド又はコンジュゲートをコードする遺伝子は、最初にRNA産物に転写された後、DNAに逆転写されて哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれる。例示的なトランスポゾン系には、その各々の開示が、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)などの目的の細胞への遺伝子送達に使用するためのトランスポゾンに関するものであり参照により本明細書に組み入れられるピギーバック(piggybac)トランスポゾン(例えば、国際公開第2010/085699号に詳細に記載される)、及び眠れる美女(sleeping beauty)トランスポゾン(例えば、米国特許出願公開第2005/0112764号に詳細に記載される)が含まれる。
ヒト細胞などの細胞のゲノムに本明細書に記載のTGF-βアンタゴニストペプチド又はコンジュゲートをコードする遺伝子を組み込むための別のツールは、ウイルス感染症に対する細菌及び古細菌における適応防御機構として当初発展した系であるクリスパー(clustered regularly interspaced short palindromic repeats;CRISPR)/Cas系である。CRISPR/Cas系は、プラスミドDNA内の回文反復配列及び関連するCas9ヌクレアーゼを含む。DNA及びタンパク質のこの組合せは、CRISPR座に外来性DNAを最初に組み込むことによって、目的の配列の部位特異的DNA切断を指示する。次に、これらの外来性配列を含むポリヌクレオチド及びCRISPR座の反復配列-スペーサー要素が、宿主細胞において転写されてガイドRNAを作製し、これが次に、特定の配列にアニールして、Cas9ヌクレアーゼをこの部位に局在させることができる。このようにすると、cas9を目的のDNA分子の厳密に近位にもたらす相互作用がRNA:DNAハイブリダイゼーションによって支配されることから、外来性ポリヌクレオチドに非常に部位特異的なcas9媒介DNA切断を生じることができる。その結果、CRISPR/Cas系を理論的に設計して、目的の任意のDNA分子を切断することができる。この技術は、真核細胞ゲノムを編集するために利用されており(Hwang et al., Nature Biotechnology 31:227(2013))、遺伝子をコードする遺伝子を組み込む前にDNAを切断するための、細胞ゲノムを部位特異的に編集する効率的な手段として使用することができる。遺伝子発現を調節するためのCRISPR/Casの使用は、例えば、その開示が、ゲノム編集のためのCRISPER/Cas系の使用に関するので参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,697,359号に記載されている。目的の遺伝子を組み込む前にゲノムDNAを部位特異的に切断する代替方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)の使用を含む。CRISPR/Cas系とは異なり、これらの酵素は、特定の配列に局在するガイドポリヌクレオチドを含まない。その代わりに、配列特異性は、これらの酵素内のDNA結合ドメインによって制御される。ゲノム編集応用におけるZFN及びTALENの使用は、例えばその各々の開示が、ゲノム編集のための組成物及び方法に関するので参照により本明細書に組み入れられる、Urnov et al., Nature Reviews Genetics 11:636(2010)、及びJoung et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 14:49(2013)に記載されている。
本明細書に記載のコンジュゲートをコードするポリヌクレオチドを、目的の細胞、例えば哺乳動物細胞のゲノムに組み込むために使用することができるさらなるゲノム編集技術は、ゲノムDNAを部位特異的に切断するために合理的に設計することができるARCUS(商標)メガヌクレアーゼの使用を含む。本明細書に記載のTGF-βアンタゴニストペプチド又はコンジュゲートをコードする遺伝子を哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)のゲノムに組み込むためのこれらの酵素の使用は、そのような酵素に関して確立されている明らかな構造活性相関の観点から有利である。一本鎖メガヌクレアーゼを、所望の位置でDNAを選択的に切断するヌクレアーゼを作製するためにある特定のアミノ酸位置で改変することができ、それによって哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)などの細胞の核DNAに目的の遺伝子を部位特異的に組み込むことが可能となる。これらの一本鎖ヌクレアーゼは、例えば、その各々の開示が、ゲノム編集のための組成物及び方法に関するので参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,021,867号及び米国特許第8,445,251号に十分に記載されている。
核酸送達のためのウイルスベクター
ウイルスゲノムは、細胞(例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞)のゲノムに、本明細書に記載のTGF-βアンタゴニストペプチド及びコンジュゲートをコードする外来性遺伝子を効率的に送達するために使用することができるベクターの豊富な起源を提供する。そのようなゲノム内に含まれるポリヌクレオチドが典型的に、汎用形質導入又は特殊化形質導入によって細胞のゲノムに組み込まれることから、ウイルスゲノムは、遺伝子送達にとって特に有用なベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として起こり、遺伝子組み込みを誘導するために追加のタンパク質又は試薬を必要としない。ウイルスベクターの例には、AAV、レトロウイルス、アデノウイルス(例えば、Ad5、Ad26、Ad34、Ad35、及びAd48)、パルボウイルス(例えば、アデノ随伴ウイルス)、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えばオルトミクソウイルス(例えば、インフルエンザウイルス)、ラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルス及び水疱性口内炎ウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、麻疹ウイルス及びセンダイウイルス)など、プラス鎖RNAウイルス、例えばピコルナウイルス及びアルファウイルスなど、並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、1型及び2型単純ヘルペスウイルス、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス)、及びポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ(MVA)、鶏痘ウイルス及びカナリア痘ウイルス)を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)に、本明細書に記載のTGF-βアンタゴニストペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達するために有用な他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫ウイルス、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルス(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N
. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996)が含まれる。他の例には、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マソンファイザーサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びレンチウイルスが含まれる。ベクターの他の例は、例えばその開示が、遺伝子送達に使用するためのウイルスベクターに関するので参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,801,030号に記載されている。
治療的処置の方法
本明細書に記載のコンジュゲートは、特に骨組織部位でTGF-βシグナリングを減弱させることによって、患者の状態を改善するために、TGF-β活性の上昇又は骨代謝回転の上昇と関連する疾患に罹患している哺乳動物対象(例えば、ヒト)に投与することができる。本発明のコンジュゲートは、例えば皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は経口、又は鼻腔若しくは硬膜外投与などの本明細書に記載の任意の投与経路を介して、対象に投与することができる。本明細書に記載のコンジュゲートは、賦形剤、生物学的に許容される担体と共に製剤化することができ、任意選択で、さらなる治療剤とコンジュゲートしてもよく、混合してもよく、又は個別に(例えば、連続的に)同時投与してもよい。
本明細書に記載のコンジュゲートを使用して処置することができる疾患及び状態には、骨形成不全症(OI)、例えばI型骨形成不全症、II型骨形成不全症、III型骨形成不全症、IV型骨形成不全症、V型骨形成不全症、VI型骨形成不全症、VII型骨形成不全症、VIII型骨形成不全症、XI型骨形成不全症、X型骨形成不全症、又はXI型骨形成不全症が含まれる。これらの状態は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み入れられる、Forlino, Nat. Rev. Endo. 7:540(2011)に記載されている。骨形成不全症は、骨マトリックス沈着又は恒常性に関係する1つ以上のタンパク質の欠損によって特徴付けられる一群の先天性の骨障害を包含する。表現型はOIの型によって異なるが、共通の症状には、骨及び歯の不完全な骨化、骨量減少、脆弱骨、及び病的骨折が含まれる。I型コラーゲンは、石灰化組織及び非石灰化組織の両方における最も豊富な結合組織タンパク質の1つである。I型コラーゲンの正確な合成、翻訳後修飾、及び分泌は、適切な組織の発達、維持、及び修復にとって必要である。OIの個体において同定されたほとんどの変異は、I型コラーゲン合成の低減、又はI型コラーゲンの不完全な合成及び/若しくはプロセシングをもたらす。
I型コラーゲン遺伝子の変異に加えて、コラーゲンの細胞内輸送及びプロセシングに関与する遺伝子の他の変異が、OIに罹患した個体において同定されている。これらの遺伝子は、FK506結合タンパク質10(FKBPIO)及び熱ショックタンパク質47(HSP47)(Alanay et al., 2010、Christiansen et al., 2010、Kelley et al., 2011)などの分子シャペロンを含む。分子間コラーゲン架橋遺伝子、例えばプロコラーゲン-リシン、2-オキソグルタル酸5-ジオキシゲナーゼ2(PLOD2)など、並びにコラーゲンプロリルヒドロキシラーゼファミリー遺伝子のメンバー、例えばロイシンプロリンエンリッチプロテオグリカン(leucine proline-enriched proteoglycan)(leprecan)(LEPRE1)、ペプチジルプロリルイソメラーゼB(シクロフィリンB)(CYPB)、及び軟骨関連タンパク質(CRTAP)(Morello et al., 2006、Cabral et al., 2007、Baldridge et al., 2008、van Dijk et al., 2009、Choi et al., 2009、Barnes et al., 2010、Pyott et al., 2011)において、さらなる変異が同定されている。変異はさておき、骨形態形成タンパク質(BMP)及びトランスフォーミング増殖因子β(TGFP)及びそのそれぞれの受容体などのタンパク質は、様々なOI表現型に関与していると考えられるが、その正確な作用機序は不明である(Gebken et al., 2000)。一実施形態では、TGF発現は、I型及びII型コラーゲンに結合する分子によって調節される。ある特定の実施形態では、スモールロイシンリッチプロテオグリカン(SLRP)は、TGF発現を調節する。特定の実施形態では、デコリンは、TGFP合成を調節する。ある特定の実施形態では、デコリンは、3-ヒドロキシプロリン部位がI型及び/又はII型コラーゲン分子の986位に存在しないI型又はII型コラーゲンに結合しない。
脊椎動物の骨格は、骨で構成され、これは構造、支持、保護、及びイオン輸送を調節するためのミネラル源を提供する生きた石灰化組織である。骨は、細胞及び無細胞構成要素の両方で構成される専門の結合組織である。無細胞の細胞外マトリックス(ECM)は、コラーゲン性及び非コラーゲン性タンパク質の両方を含み、その両方が石灰化プロセスに関与している。正しく分泌されて整列したECMは、適切な骨形成にとって重要である。骨形成不全症において証明されるように、ECMタンパク質がいずれも存在しない、奇形である、又は正しく整列していない場合、病態が起こる。
通常の恒常性条件下で、骨芽細胞及び破骨細胞は、共同して骨の完全性を維持するように作用する。骨沈着及び骨吸収の連携が崩れると病態が起こる。例えば、大理石骨病は、非吸収性の破骨細胞の結果として過度に密度が高く、硬い骨によって特徴付けられる骨疾患であるが、骨粗鬆症は、破骨細胞活性の増加に起因し得る脆い多孔性の骨によって特徴付けられる骨疾患である。骨組織におけるTGF-βシグナリングの上昇は、骨芽細胞活性と比較して高い破骨細胞活性をもたらし得、それによって骨形成不全症をもたらし、この状態と関連する異常な骨吸収を促進し得る。このため、破骨細胞は、治療介入の有用な標的である。本明細書に記載のコンジュゲートを使用して、TGF-βシグナリングを減弱させることによって骨吸収を調節し、それによって破骨細胞活性を減弱させ、骨芽細胞の生存率を増強し、それによって骨代謝回転恒常性を回復することができる。
組織学及び組織形態計測、原子力顕微鏡、共焦点ラマン顕微鏡、ナノインデンテーション、3点曲げ試験、X線撮像、及びマイクロコンピューター断層撮影(μ-CT)を含むいくつかの方法を使用して、骨の構造、密度、及び質を測定及び特徴付けすることができる。例えば、これらの例示的な技術を使用して、当業者は、処置の進行及び療法の有効性をモニターすることができる。例えば、上記の方法(又は当技術分野で公知の方法)の1つ以上によって決定した骨完全性の改善、骨吸収の遅延、及び骨代謝回転の恒常性の回復は、有効な治療的処置の指標であり得る。
本明細書に記載のコンジュゲートによって処置することができるさらなる疾患及び状態には、例えば、腎性骨ジストロフィー、副甲状腺機能亢進症誘発性骨疾患、糖尿病性骨疾患、変形性関節炎、ステロイド誘発性骨疾患、廃用性骨粗鬆症、及び脳性麻痺、マッキューン・オルブライト症候群、ゴーシェ病、高シュウ酸尿症、骨ページェット病、及び若年性ページェット病、転移性骨がん(例えば、転移が乳がん又は前立腺がんの二次転移である)、骨粗鬆症、線維性骨異形成、カムラチ・エンゲルマン病、マルファン症候群、骨空洞性骨異形成症、常染色体優性大理石骨病、骨粗鬆症、骨粗鬆症・偽グリオーマ症候群、若年性老人様皮膚萎縮骨形成異常症、先天性骨形成不全症、小頭症、白内障、偽性副甲状腺機能低下症、鎖骨頭蓋異形成症、先天性角化不全症、滲出性硝子体網膜症1、シンメルペニング・フォイアスタイン・ミムス症候群、プラダー・ウィリ症候群、軟骨無発生症、アントレー・ビクスラー症候群、アスパルチルグルコサミン尿症、セリアック病、脳・眼・顔・骨格症候群1、リシン尿性タンパク質不耐症、ニューロパシー、先天性角化不全症、エーラス・ダンロス症候群、骨端異形成症、ヒアリン線維腫症候群、ペロー症候群1、ヘモクロマトーシス、ホモシスチン尿症(例えば、シスタチオニンベータシンターゼ欠損による)、高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病、デスブクオイス異形成症、多発性翼状片症候群、致死性先天性拘縮症候群1、ミトコンドリアDNA枯渇症候群6(肝脳型)、ニーマンピック病、大理石骨病、ポルフィリン症、ロスモンド・トムソン症候群、ウィルソン病、デント病1、オクシピタル・ホーン症候群、高グリセロール血症、低リン血症性くる病、ロウ眼脳腎症候群、腎尿細管症、糖尿病、小脳失調、ビタミンDヒドロキシル化欠損性くる病、ワールブルグ・ミクロ症候群1、スタブ・ヴィーデマン症候群、青色ゴムまり様母斑症候群、シングルトン・マーテン症候群、小頭骨異形成原発性小人症、異骨硬化症、ハラーマン・ストライフ症候群、ブルック症候群1、多発性翼状片症候群(例えば、X連鎖性)、象牙質形成不全症を伴う脊椎骨幹端異形成症、ホール・リグス精神遅滞症候群、骨脆弱性を伴う乳児多臓器神経疾患、III型尖頭合指症、先端骨溶解症、ACTH非依存性副腎皮質大結節性過形成、精神遅滞を伴うアミノ酸尿症、関節症、骨脆弱性(例えば、頭蓋骨縫合早期癒合症、眼球突出、水頭症、及び明確な顔面特徴を伴う)、脆弱角膜症候群、脳腱黄色腫症、ネコなき症候群、半身性骨端異形成症、常染色体優性エーラス・ダンロス症候群、家族性骨異形成症、フリン・エアード症候群、老人様皮膚萎縮骨形成異常症、Ia型糖原病、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、乳児全身性ヒアリン症、多毛性骨軟骨異形成症、機能的亜鉛欠乏を伴う高亜鉛血症、低ホスファターゼ症、常染色体優性低リン血症性くる病、X連鎖性劣性低リン血症性くる病、リヒテンスタイン症候群、巨大骨端異形成症(例えば、骨粗鬆症、しわの多い皮膚及び老人様外観を伴う)、メンケス病、精神遅滞(例えば、X連鎖性シュナイダー・ロビンソン型)、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、小球状水晶体-骨幹端異形成症、モルキオ症候群a型、モルキオ症候群B型、耳軟骨骨化(例えば、知的障害、筋委縮、及び骨頭蓋骨狭窄症を伴う)、骨粗鬆症及び眼皮膚低色素症候群、骨粗鬆症・偽グリオーマ症候群、若年性骨粗鬆症、魚鱗癬及び骨折を伴う骨硬化症、卵巣形成不全1、卵巣形成不全2、卵巣形成不全3、卵巣形成不全4、下垂体腺腫、硬化性白質脳症を伴う脂肪膜性多膿疱性骨異形成、プラダー・ウィリ体型、骨減少症、オカモト型早期老化症候群、プリエトX連鎖精神遅滞症候群、濃化異骨症候群、パイル病、ライフェンスタイン症候群、常染色体優性遠位尿細管性アシドーシス、1型シュワルツ・ヤンペル症候群、2型シュワルツ・ヤンペル症候群、3型シュワルツ・ヤンペル症候群、4型シュワルツ・ヤンペル症候群、X連鎖性遅発性脊椎骨端異形成、及びトルグ・ウィンチェスター症候群が含まれる。
以下の実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法が使用され得る、作製され得る、及び評価され得る方法についての説明を当業者に提供するために述べ、本発明の純粋な例示であることが意図され、本発明者らが本発明であると考える範囲を制限しないことが意図される。
[実施例1]
骨形成不全症の処置のための骨標的化コラーゲン結合ドメインにコンジュゲートしたTGF-βアンタゴニストの投与
本明細書に記載の組成物及び方法を使用して、熟練の医師は、疾患に罹患していない健康な個体と比較したTGF-β活性の上昇及び/又は骨代謝回転の上昇と関連する疾患を処置するために、骨標的化部分に結合したTGF-βアンタゴニストペプチドを含むコンジュゲートを患者(例えば、ヒト患者)に投与することができる。例えば、熟練の医師は、血清中及び骨アルカリホスファターゼ、血清中オステオカルシン(sOC)、血清中I型コラーゲンC-テロペプチド切断産物(sCTX)、尿中遊離デオキシピリジノリン(ufDPD)、並びに尿中I型コラーゲン架橋N-テロペプチド(uNTX)などの、骨代謝回転の1つ以上のバイオマーカーの濃度を最初に評価することによって、骨形成不全症に罹患している患者を評価してもよい。これらのバイオマーカーの1つ以上が上昇しているという結果は、骨代謝回転速度の上昇のシグナルであり得るが、それは患者が、骨組織に局在することができるTGF-βアンタゴニストによる処置に特によく適し得ることを示している。熟練の医師は、処置の過程において疾患の進行をモニターするために、患者の骨折の頻度及び傾向をさらに評価してもよい。医師は、例えばヒトFcドメイン(例えば、ヒトIgG、IgE、IgM、IgA、又はIgD Fc領域)によって、骨標的化部分に結合したTGF-βアンタゴニストを含むコンジュゲートの治療有効量(例えば、TGF-βシグナリングを減弱させる及び/又は骨代謝回転を低減させるために十分な量)を、患者に投与してもよい。TGF-βアンタゴニストは、例えば本明細書に記載のCD109ペプチド又はその断片などの本明細書に記載の任意のアンタゴニストであり得る。骨標的化部分は、例えば本明細書に記載のコラーゲン結合ドメイン又はヒドロキシアパタイト結合ドメインなどの本明細書に記載の任意の骨標的化部分であり得る。
コンジュゲートは、特定の時間間隔当たり1回以上の用量(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30回、又はそれを超える)、例えば1日、1週、1月、又は1年当たり1回以上の用量で、対象に投与してもよい。患者は、療法の有効性をモニターするために、及び患者の応答に基づいて投与量を増加又は低減するために投与の間に評価してもよい。例えば、骨折の回数の低減、患者の歩行能の改善、及び/又は患者から単離した試料中の骨代謝回転の1つ以上のバイオマーカーの濃度の低減は、療法がその状態を有効に処置(治療)していることを示し得る。
療法は、例えば熟練の医師によって決定される、様々な投与経路によって患者に投与してもよい。例えば、療法は、1つ以上の反復用量で、患者に皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は経口、又は鼻腔内若しくは硬膜外投与によって投与してもよい。
療法の終了前に、医師は、療法の濃度を徐々に低減させるために、徐々により低い用量のコンジュゲートを患者に処方してもよい。療法は、治療的コンジュゲートの1回のみの投与を用い得る。或いは、療法は、例えば数日間、数週間、数ヶ月間、又は数年間継続した後終了してもよい。
[実施例2]
培養骨芽細胞における生存率、石灰化、コラーゲン沈着、及びアルカリホスファターゼ活性に対するデカアスパラギン酸骨標的化ペプチドにコンジュゲートした抗TGF-β抗体の効果
骨芽細胞培養アッセイ
骨芽細胞のin vitro培養は、生きている生物では必ずしも達成することができない様式で骨形成と関連する生物学的プロセスに関する実験を可能にする、骨芽細胞活性の試験の簡便かつ有用な方法である。確立された細胞株は、骨芽細胞のシグナリング、分化、及び石灰化に影響を及ぼす因子を調べるための安定、均一、かつ再現性のあるモデルを提供する。MC3T3-E1マウス前骨芽細胞株モデルにおいて生じるようなコラーゲン性及び非コラーゲン性タンパク質に富む細胞外マトリックスを豊富に産生する細胞培養モデルは、マトリックスの石灰化に関する根本的な疑問をin vitroで試験することができるという点において特に有用である。本研究は、特に細胞外マトリックスの分泌、構築、及び石灰化に関して、in vivoでの骨形成及び石灰化に多くの点で非常に類似していると考えられる広く受け入れられている細胞培養モデルを利用した。この骨芽細胞培養系は、多くの研究グループによって何十年も使用されており、最近、骨の構造、組成、及び特に石灰化(参照文献1)との直接比較によってさらに検証されている。本明細書において、MC3T3-E1骨芽細胞を利用して、これらの骨細胞培養物の石灰化に対するTGF-βの阻害能を評価した。
TGF-βによって処置した細胞培養物は、細胞生存率及び活性の優れた維持を示した(図1)。処置した骨芽細胞は生存して健康であり、石灰化能と共に骨芽細胞分化の多様なマーカー、特に骨芽細胞活性を同定するために一般的に使用されるバイオマーカーであるアルカリホスファターゼ及びコラーゲンを発現する(図1、4、5)。TGF-βによって培養物を処置すると、初期骨芽細胞マーカーであるアルカリホスファターゼ活性が対照と比較して低減し、この低減は、TGF-βに対する中和性のD10タグ付抗体の添加によってレスキューされた(図5)。コラーゲンの分泌及び構築は、骨芽細胞の発達及び分化の別の重要なマーカーであり、TGF-βによって処置した培養物は、培養皿において高レベルのコラーゲン性細胞外マトリックス構築を示した。D10タグ付抗体処置は、その後の石灰化に関するコラーゲンマトリックスのこの必要条件に対してほとんど影響を及ぼさなかった(図4)。このことは、細胞外マトリックスが全ての処置後、石灰化のために利用可能であることを意味している。
骨芽細胞培養物の石灰化は、TGF-βによる処置によって高度に及び有意に負の影響を受けた。TGF-βによる処置は、ミネラル(図2A及び2B)及びカルシウム定量(図3)のためのフォンコッサ染色によって評価した場合に、培養物の石灰化を強くかつ基本的に完全にブロックした。石灰化に対するこの阻害効果は、中和性のD10タグ付抗体の添加によって完全にレスキューされた(図2、3)。
ミネラル結合アッセイ
無細胞ミネラル結合アッセイを使用して、タンパク質のミネラルに対する結合に関する直接評価を得ることができる。このために、骨のミネラル(ヒドロキシアパタイトと呼ばれるリン酸カルシウム無機相)を、骨のミネラル相に非常によく近似する高度に純粋な合成ミネラル調製物を使用してin vitroで表すことができる。これらの調製物により、標準的なインキュベーションステップを使用したタンパク質結合アッセイを容易に行うことができ、次いで溶液(上清)から目的のタンパク質の枯渇を典型的に測定するルーチンの生化学アッセイを使用してミネラル結合量の評価を行うことができる(参照文献2〜4)。これらの測定では、全てのタンパク質結合の正確な定量、そして直接可視化(撮像)アプローチも使用される。
D10タグ付抗体及び合成ヒドロキシアパタイト結晶を使用して、ミネラル結合比較アッセイを実施し、ウシ血清アルブミン測定も同様に行って、タンパク質のミネラルに対する非特異的結合を評価した。ミネラル結合反応の定量により、D10タグ付抗体が、タグなしの対照抗体(1D11)と比較して顕著に増強されたヒドロキシアパタイト結合親和性を示すことが明らかとなった(図6)。
まとめると、これらの実験の結果は、骨標的化部分にコンジュゲートしたTGF-βアンタゴニストの、骨形成不全症などの骨代謝回転の上昇と関連する状態を改善する能力を、証明している。骨標的化部分にコンジュゲートしたTGF-βアンタゴニストは、この障害及び他の骨障害を処置するための有用なパラダイムとなる。
材料及び方法
細胞培養
マウス頭蓋冠前骨芽細胞(MC3T3-E1、サブクローン14)を、アスコルビン酸(AA)及びL-グルタミン(Life Technology)を欠如し、10%ウシ胎児血清(FBS)(Hyclone)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質、L-グルタミン及びL-アスパラギン酸を補充した最小基本培地(MEM)において、37℃及び5% CO2の湿潤環境中で培養した。
全ての実験に関して、細胞を50,000個/cm2で播種した。成熟骨芽細胞への細胞の分化を、播種(0日)の24時間後に、50μg/mlアスコルビン酸(AA)＋10mM β-グリセロリン酸(βGP)(Sigma)だけを添加することによって、又はそれに加えて組換えヒトトランスフォーミング増殖因子ベータ1(rhTGF-β1、R&D Systems)を、10μg/mlカスタムメイドD10タグ付抗体(Genzyme)と共に又は当該抗体を使用せずに添加することによって、誘導した。補充物質を添加した培地によって、最大16日間、細胞を2日毎に処置した。
細胞生存率
細胞生存率は、3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロミド(MTT, Sigma)の生存細胞への取り込みを、異なる時点(0、2、4、6、8、及び16日目)で分析することによって全ての試薬の存在下で試験した。
細胞培養における骨芽細胞分化及び石灰化アッセイ
フォンコッサ染色(硝酸銀)による石灰化アッセイ及びカルシウムキット定量。培養16日後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS、Wisent)で1回洗浄後、95%エタノールによって37℃で10分間固定した。細胞層を二段蒸留水によって2回水和させた後、5%硝酸銀溶液(フォンコッサ染色、Fisher)と共に37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、硝酸銀溶液をすすいで除去し、細胞培養ウェルを蒸留水で2回洗浄し、直射日光に2時間曝露した。培養物にミネラルが沈着すると、茶色がかった黒色になる。石灰化の定量は、ウェルのスキャン及びImage Jソフトウェアを使用して行い、染色密度を記録した。
カルシウム濃度を、遠心沈降させた細胞/マトリックスペレット(6、8、及び15日目)の0.5M HCl抽出物から1時間インキュベーション後に、市販のカルシウムキット(Sekisui Diagnostics)を使用して測定した。
ピクロシリウスレッド染色によるI型コラーゲンの定量
細胞をPBSによって2回洗浄後、ブアン液(75%飽和ピクリン酸、3.7%ホルムアルデヒド、5%氷酢酸)によって室温で1時間固定した。細胞を2回洗浄し、蒸留H2Oによって15分間インキュベートし、過剰量のブアン液を除去した。I型コラーゲン(COL I)を、飽和ピクリン酸(Sigma)中の2mg/mlシリウスレッド染色溶液と共に室温で軽く攪拌しながら1時間インキュベートすることにより染色してコラーゲンをピンク色/赤色/紫色に染色し、次に細胞を0.01N HClの2回洗浄に曝露して、未結合色素を除去した。コラーゲン測定のために結合した色素を定量するために、試料を0.1N NaOHに溶解して、結合した色素を放出させた。較正のために、播種して一晩乾燥させ、上記のように染色したラット尾腱のI型コラーゲン(Sigma)を使用して連続希釈液の検量線を生成する。コラーゲン標準物質及び試料について3回の反復実験を行い、放出された染料の量を、分光光度計マイクロプレートリーダーを使用して560nmで測定した。試料中のコラーゲン濃度を、作成した検量線を使用して計算した。
アルカリホスファターゼ酵素活性アッセイ
アルカリホスファターゼ活性アッセイを、10mM Tris-HCl(pH 7.4)、0.2% IGEBAL(Sigma)及び2mM PMSF中で収集して超音波処理した細胞から測定した(培養6、8、及び16日目)。アルカリホスファターゼ活性は、アルカリホスファターゼの基質であるp-ニトロフェニルホスフェート(Sigma)による比色法を使用し、アルカリホスファターゼ(Sigma)活性の検量線を参照して検出した。
ヒドロキシアパタイトミネラル結合アッセイ
ヒドロキシアパタイト結晶(Berkeley Advanced Biomaterials)の等量を、0.1% Tweenを含むpH 7.4の20mM Tris/HCl、150mM NaCl中で、1D11対照抗体、D10タグ付抗体(デカアスパラギン酸ペプチドとコンジュゲートしたGC1008)、又はウシ血清アルブミン(BSA)のいずれかと共に各々室温で、絶えず振とうさせながら1時間インキュベートした後、10,000gで5分間遠心した。上清中のタンパク質濃度を、Micro BCAタンパク質アッセイ(Pierce)を使用して3回の反復実験で測定した。吸光度をマイクロプレートリーダーにおいて560nmで分光光度法によって読み取った。上清から失われたタンパク質量は、ミネラル結合分画であると考えられた。
参照文献
1. Addison WN, Nelea V, Chicatun F, Chien YC, Tran-Khanh N, Buschmann MD, Nazhat SN, Kaartinen MT, Vali H, Tecklenburg MM, Franceschi RT and McKee MD(2015)Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone 71:244-256.
2. Addison WN, Azari F, Sorensen ES, Kaartinen MT and McKee MD(2007)Pyrophosphate inhibits mineralization of osteoblast cultures by binding to mineral, upregulating osteopontin and inhibiting alkaline phosphatase activity. J. Biol. Chem., 282:15872-83.
3. Addison WN, Nakano Y, Loisel T, P. Crine and McKee MD(2008)MEPE-ASARM peptides control extracellular matrix mineralization by binding to hydroxyapatite: An inhibition regulated by PHEX cleavage of ASARM. J. Bone Miner. Res. 23:1638-1649.
4. McKee MD, Nakano Y, Masica DL, Gray JJ, Lemire I, Heft R, Whyte MP, Crine P and Millan JL(2011)Enzyme replacement therapy prevents dental defects in a mouse model of hypophosphatasia. J. Dent. Res. 90:470-476.
[実施例3]
デカアスパラギン酸骨標的化ペプチドにコンジュゲートした抗TGF-β抗体のヒドロキシアパタイトに対する親和性
骨標的化抗TGF-β抗体GC1008及び対照の非標的化1D11抗体の結合を、BIACORE(商標)T200機器を使用して表面プラズモン共鳴によって調べた。実験は、PBS-Tween-20(PBST)緩衝液中、CM5センサーチップ上、25℃で実施した。凍結乾燥TGF-βを、4mM HClに懸濁(100μg/mL)した後、BIACORE(商標)アミンカップリングキットを使用して固定するためにpH 4.0の10mM酢酸ナトリウム中で1μg/mL又は5μg/mLに希釈した。高密度(約3600 RU TGF-β1)及び低密度(800 RU TGF-β2、460 RU TGF-β3)TGF-β表面は、TGF-β濃度及びインキュベーション時間を調節することによって得た。骨標的化及び非骨標的化抗TGF-β抗体の濃度はいずれも、500 nMであった。
対応する参照表面を、リガンドを含まないPBST中で調製した。注入パラメータは、5μL/分、接触時間は180秒、解離時間は600秒であった。ランニング緩衝液は、10mMグリシンを含み、センサーチップをpH 1.5の10mMグリシン中、10μl/分で60秒間で再生した。これらの実験に使用した表面プラズモン共鳴条件を以下の表10及び11にまとめる。
上記の方法を使用して、抗TGF-β抗体1D11単独の親和性、及びデカアスパラギン酸にコンジュゲートしたそのヒト化対応物GC1008(「GC1008-D10」)の親和性を、TGF-βアイソフォームTGF-β1、TGF-β2、及びTGF-β3の各々について決定した。図7A〜7Cにて実証されるように、GC1008-D10コンジュゲートは、TGF-β1、TGF-β2、及びTGF-β3アイソフォームの各々に関して高い親和性を示す。特に、GC1008-D10は、非コンジュゲート1D11抗体より高い親和性でTGF-β1及びTGF-β2に結合し、GC1008-D10は、非コンジュゲート1D11抗体より低いkoffでTGF-β1及びTGF-β2から解離する。
他の実施形態
本明細書において言及した全ての刊行物、特許、及び特許出願はその各々の独立した刊行物又は特許出願が、具体的に及び個々に参照により本明細書に組み入れられるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載してきたが、さらなる改変が可能であり、本出願は、一般的に本発明の原理に従い、本発明が属する技術分野において公知であるか、又は通常の実践の範囲内である本発明からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変化形、使用、又は適合を含むことが意図され、及び本明細書に上記で記載し、特許請求の範囲で述べる本質的な特徴に適用され得ることを理解されたい。
他の実施形態は特許請求の範囲にある。

Claims (95)

  1. 標的化部分に結合したTGF-βアンタゴニストを含むコンジュゲートであって、前記標的化部分が、ヒト骨組織に存在するタンパク質又はミネラルに結合する、コンジュゲート。
  2. 前記TGF-βアンタゴニストが、TGF-βに結合する抗体、その抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、又は低分子である、請求項1に記載のコンジュゲート。
  3. 前記TGF-βアンタゴニストがTGF-βに結合するペプチドである、請求項2に記載のコンジュゲート。
  4. 前記ペプチドが、アミノ酸配列IDGVYDNAEYAERFMEENEGHIVDIHDFSLGSS(配列番号5)を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  5. 前記ペプチドが、アミノ酸配列WIWLDTNMGYRIYQEFEVT(配列番号1)を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  6. 前記ペプチドが、配列番号2の残基21〜1404のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  7. 前記ペプチドが、配列番号2の残基21〜1428のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  8. 前記ペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  9. 前記ペプチドが、アミノ酸配列WIWLDTNMGSRIYQEFEVT(配列番号3)を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  10. 前記ペプチドが、配列番号4の残基21〜1404のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  11. 前記ペプチドが、配列番号4の残基21〜1428のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  12. 前記ペプチドが、配列番号4のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  13. 前記ペプチドが、配列番号6のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  14. 前記ペプチドが、アミノ酸配列RKHFPETWIWLDTNMGYRIYQEFEV(配列番号7)を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  15. 前記ペプチドが、ANFCLGPCPYIWSLDT(配列番号8)、ANFCSGPCPYLRSADT(配列番号9)、PYIWSLDTQY(配列番号10)、PYLWSSDTQH(配列番号11)、PYLRSADTTH(配列番号12)、WSXD(配列番号13)、及びRSXD(配列番号14)からなる群から選択されるアミノ酸配列であって、Xが任意の天然に存在するアミノ酸を表す、アミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  16. 前記ペプチドが、TSLDATMIWTMM(配列番号15)、SNPYSAFQVDIIVDI(配列番号16)、TSLMIWTMM(配列番号17)、TSLDASIIWAMMQN(配列番号18)、SNPYSAFQVDITID(配列番号19)、EAVLILQGPPYVSWL(配列番号20)、及びLDSLSFQLGLYLSPH(配列番号21)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  17. 前記ペプチドが、TSLDASIIWAMMQN(配列番号22)、KRIWFIPRSSWYERA(配列番号23)、KRIWFIPRSSW(配列番号24)、KRIWFIPRSSW(配列番号25)、及びKRIWFIPRSSW(配列番号26)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  18. 前記ペプチドが、配列番号27〜49のいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  19. 前記ペプチドが、配列番号50のアミノ酸配列を有する、請求項3に記載のコンジュゲート。
  20. 前記TGF-βアンタゴニストが、TGF-βに結合する抗体又はその抗原結合断片である、請求項2に記載のコンジュゲート。
  21. 前記抗体又はその抗原結合断片が、以下の相補性決定領域(CDR):
    a.アミノ酸配列SNVIS(配列番号327)を有するCDR-H1;
    b.アミノ酸配列GVIPIVDIANYAQRFKG(配列番号328)を有するCDR-H2;
    c.アミノ酸配列TLGLVLDAMDY(配列番号329)を有するCDR-H3;
    d.アミノ酸配列RASQSLGSSYLA(配列番号330)を有するCDR-L1;
    e.アミノ酸配列GASSRAP(配列番号331)を有するCDR-L2;及び
    f.アミノ酸配列QQYADSPIT(配列番号332)を有するCDR-L3
    を含む、請求項20に記載のコンジュゲート。
  22. 前記抗体又はその抗原結合断片が、第2の抗体又はその抗原結合断片に対するTGF-βの結合を競合的に阻害し、前記第2の抗体又はその抗原結合断片が、以下のCDR:
    a.アミノ酸配列SNVIS(配列番号327)を有するCDR-H1;
    b.アミノ酸配列GVIPIVDIANYAQRFKG(配列番号328)を有するCDR-H2;
    c.アミノ酸配列TLGLVLDAMDY(配列番号329)を有するCDR-H3;
    d.アミノ酸配列RASQSLGSSYLA(配列番号330)を有するCDR-L1;
    e.アミノ酸配列GASSRAP(配列番号331)を有するCDR-L2;及び
    f.アミノ酸配列QQYADSPIT(配列番号332)を有するCDR-L3
    を含む、請求項20に記載のコンジュゲート。
  23. 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号333のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項20〜22のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  24. 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列番号334のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項20〜23のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  25. 前記抗体又はその抗原結合断片が、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片、ポリクローナル抗体又はその抗原結合断片、ヒト化抗体又はその抗原結合断片、二重特異性抗体又はその抗原結合断片、最適化抗体又はその抗原結合断片、二重可変免疫グロブリンドメイン、一本鎖Fv分子(scFv)、ダイアボディ、トリアボディ、ナノボディ、抗体様タンパク質スキャフォールド、Fv断片、Fab断片、F(ab')2分子、及びタンデムdi-scFVからなる群から選択される、請求項20〜24のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  26. 前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項25に記載の方法。
  27. 前記抗体が、最適化抗体である、請求項25に記載の方法。
  28. 前記最適化抗体が、親和性成熟抗体である、請求項27に記載の方法。
  29. 前記抗体が、IgG、IgA、IgM、IgD、及びIgEからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記TGF-βアンタゴニストが、TGF-β受容体に結合するペプチドである、請求項1に記載のコンジュゲート。
  31. 前記ペプチドが、HANFCLGPCPYIWSL(配列番号51)、FCLGPCPYIWSLDT(配列番号52)、及びHEPKGYHANFCLGPCP(配列番号53)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項30に記載のコンジュゲート。
  32. 前記標的化部分がペプチドである、請求項1〜31のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  33. 前記標的化部分が、ヒト骨組織に存在するタンパク質に結合するペプチドである、請求項32に記載のコンジュゲート。
  34. 前記のヒト骨組織に存在するタンパク質が、コラーゲンである、請求項33に記載のコンジュゲート。
  35. 前記タンパク質に結合する前記ペプチドが、配列番号54〜56のいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項34に記載のコンジュゲート。
  36. 前記タンパク質に結合する前記ペプチドが、配列番号57〜59のいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項34に記載のコンジュゲート。
  37. 前記タンパク質に結合する前記ペプチドが、配列番号56のアミノ酸配列を有する、請求項34に記載のコンジュゲート。
  38. 前記標的化部分が、ヒト骨組織に存在するミネラルに結合するペプチドである、請求項33に記載のコンジュゲート。
  39. 前記のヒト骨組織に存在するミネラルが、ヒドロキシアパタイトである、請求項38に記載のコンジュゲート。
  40. 前記標的化部分がポリアニオン性ペプチドである、請求項39に記載のコンジュゲート。
  41. 前記ポリアニオン性ペプチドが、カルボキシレート、スルホネート、ホスホネート、及びホスフェートからなる群から選択される側鎖置換基を有する1つ以上のアミノ酸を含む、請求項40に記載のコンジュゲート。
  42. 前記ポリアニオン性ペプチドが、1つ以上のグルタメート残基を含む、請求項40又は41に記載のコンジュゲート。
  43. 前記ポリアニオン性ペプチドが、1〜25個のグルタメート残基を含む、請求項42に記載のコンジュゲート。
  44. 前記ポリアニオン性ペプチドが、3〜20個のグルタメート残基を含む、請求項43に記載のコンジュゲート。
  45. 前記ポリアニオン性ペプチドが、5〜15個のグルタメート残基を含む、請求項44に記載のコンジュゲート。
  46. 前記ポリアニオン性ペプチドが、8〜12個のグルタメート残基を含む、請求項45に記載のコンジュゲート。
  47. 前記ポリアニオン性ペプチドが、10個のグルタメート残基を含む、請求項46に記載のコンジュゲート。
  48. 前記ポリアニオン性ペプチドが、式Enのペプチドであって、Eがグルタメート残基を示し、nが1〜25の整数であるペプチドである、請求項42に記載のコンジュゲート。
  49. nが3〜20の整数である、請求項48に記載のコンジュゲート。
  50. nが5〜15の整数である、請求項48に記載のコンジュゲート。
  51. nが8〜12の整数である、請求項48に記載のコンジュゲート。
  52. nが10である、請求項48に記載のコンジュゲート。
  53. 前記グルタメート残基が連続している、請求項42〜47のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  54. 前記グルタメート残基が不連続である、請求項42〜47のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  55. 前記ポリアニオン性ペプチドが、1つ以上のアスパルテート残基を含む、請求項40〜54のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  56. 前記ポリアニオン性ペプチドが、1〜25個のアスパルテート残基を含む、請求項55に記載のコンジュゲート。
  57. 前記ポリアニオン性ペプチドが、3〜20個のアスパルテート残基を含む、請求項56に記載のコンジュゲート。
  58. 前記ポリアニオン性ペプチドが、5〜15個のアスパルテート残基を含む、請求項57に記載のコンジュゲート。
  59. 前記ポリアニオン性ペプチドが、8〜12個のアスパルテート残基を含む、請求項58に記載のコンジュゲート。
  60. 前記ポリアニオン性ペプチドが、10個のアスパルテート残基を含む、請求項59に記載のコンジュゲート。
  61. 前記ポリアニオン性ペプチドが、式Dnのペプチドであって、Dがアスパルテート残基を示し、nが1〜25の整数であるペプチドである、請求項55に記載のコンジュゲート。
  62. nが3〜20の整数である、請求項61に記載のコンジュゲート。
  63. nが5〜15の整数である、請求項61に記載のコンジュゲート。
  64. nが8〜12の整数である、請求項61に記載のコンジュゲート。
  65. nが10である、請求項61に記載のコンジュゲート。
  66. 前記アスパルテート残基が連続している、請求項55〜60のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  67. 前記アスパルテート残基が不連続である、請求項55〜60のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  68. 前記ポリアニオン性ペプチド中の、生理的pHで負に荷電している側鎖を有するアミノ酸の、アミノ酸の全量に対する比率が、約0.5〜約2.0である、請求項40〜68のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  69. 前記ミネラルに結合する前記ペプチドが、配列番号60〜326のいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項38に記載のコンジュゲート。
  70. 前記TGF-βアンタゴニストが、免疫グロブリンFcドメインによって前記標的化部分に結合している、請求項1〜69のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  71. 前記TGF-βアンタゴニストが、前記免疫グロブリンFcドメインのN末端に結合し、前記標的化部分が、前記免疫グロブリンFcドメインのC末端に結合している、請求項70に記載のコンジュゲート。
  72. 前記TGF-βアンタゴニストが、前記免疫グロブリンFcドメインのC末端に結合し、前記標的化部分が、前記免疫グロブリンFcドメインのN末端に結合している、請求項70に記載のコンジュゲート。
  73. 前記免疫グロブリンが、ヒトIgG、ヒトIgA、ヒトIgM、ヒトIgE、及びヒトIgDからなる群から選択される、請求項70〜72のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  74. 請求項1〜73のいずれか一項に記載のコンジュゲート及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
  75. 前記コンジュゲートが、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、鼻腔内、硬膜外、又は経口投与のために製剤化されている、請求項74に記載の医薬組成物。
  76. 前記コンジュゲートが、筋肉内投与のために製剤化されている、請求項75に記載の医薬組成物。
  77. 前記コンジュゲートが、静脈内投与のために製剤化されている、請求項75に記載の医薬組成物。
  78. 前記コンジュゲートが、皮下投与のために製剤化されている、請求項75に記載の医薬組成物。
  79. TGF-βシグナリングの上昇と関連する疾患に罹患しているヒト患者を処置する方法であって、請求項1〜73のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項74〜78のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を、前記患者に投与するステップを含む方法。
  80. 前記疾患が、骨疾患である、請求項79に記載の方法。
  81. 前記疾患が、骨形成不全症、腎性骨ジストロフィー、副甲状腺機能亢進症誘発性骨疾患、糖尿病性骨疾患、変形性関節炎、ステロイド誘発性骨疾患、廃用性骨粗鬆症、及び脳性麻痺からなる群から選択される、請求項79又は80に記載の方法。
  82. 骨代謝回転の上昇と関連する疾患に罹患しているヒト患者を処置する方法であって、請求項1〜73のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項74〜78のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を、前記患者に投与するステップを含む、方法。
  83. 前記疾患が、骨形成不全症、マッキューン・オルブライト症候群、ゴーシェ病、高シュウ酸尿症、骨ページェット病、及び若年性ページェット病からなる群から選択される、請求項79又は82に記載の方法。
  84. 前記疾患が、骨形成不全症である、請求項81又は83に記載の方法。
  85. 前記骨形成不全症が、I型骨形成不全症、II型骨形成不全症、III型骨形成不全症、IV型骨形成不全症、V型骨形成不全症、VI型骨形成不全症、VII型骨形成不全症、VIII型骨形成不全症、IX型骨形成不全症、X型骨形成不全症、又はXI型骨形成不全症である、請求項84に記載の方法。
  86. 前記疾患が、転移性骨がんである、請求項79又は82に記載の方法。
  87. 前記患者が、乳がん又は前立腺がんに罹患している、請求項86に記載の方法。
  88. 前記疾患が、骨粗鬆症、線維性骨異形成、カムラチ・エンゲルマン病、マルファン症候群、骨空洞性骨異形成症、常染色体優性大理石骨病、骨粗鬆症、骨粗鬆症・偽グリオーマ症候群、若年性老人様皮膚萎縮骨形成異常症、先天性骨形成不全症、小頭症、及び白内障からなる群から選択される、請求項79又は82に記載の方法。
  89. 前記疾患が、偽性副甲状腺機能低下症、鎖骨頭蓋異形成症、先天性角化不全症、滲出性硝子体網膜症1、シンメルペニング・フォイアスタイン・ミムス(Schimmelpenning-Feuerstein-Mims)症候群、プラダー・ウィリ症候群、軟骨無発生症、アントレー・ビクスラー症候群、アスパルチルグルコサミン尿症、セリアック病、脳・眼・顔・骨格症候群1、リシン尿性タンパク質不耐症、ニューロパシー、先天性角化不全症、エーラス・ダンロス症候群、骨端異形成症、ヒアリン線維腫症候群、ペロー(Perrault)症候群1、ヘモクロマトーシス、ホモシスチン尿症(例えば、シスタチオニンβシンターゼ欠損による)、高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病、デスブクオイス(desbuquois)異形成症、多発性翼状片症候群、致死性先天性拘縮症候群1、ミトコンドリアDNA枯渇症候群6(肝脳型)、ニーマンピック病、大理石骨病、ポルフィリン症、ロスモンド・トムソン症候群、ウィルソン病、デント病1、オクシピタル・ホーン症候群、高グリセロール血症、低リン血症性くる病、ロウ眼脳腎症候群、腎尿細管症、糖尿病、小脳失調、ビタミンDヒドロキシル化欠損性くる病、ワールブルグ・ミクロ症候群1、スタブ・ヴィーデマン(Stuve-Wiedemann)症候群、青色ゴムまり様母斑症候群、シングルトン・マーテン症候群、小頭骨異形成原発性小人症、異骨硬化症、ハラーマン・ストライフ症候群、ブルック症候群1、多発性翼状片症候群(例えば、X連鎖性)、象牙質形成不全症を伴う脊椎骨幹端異形成症、ホール・リグス(Hall-Riggs)精神遅滞症候群、骨脆弱性を伴う乳児多臓器神経疾患、III型尖頭多合指症、先端骨溶解症、ACTH非依存性副腎皮質大結節性過形成、知的障害を伴うアミノ酸尿症、関節症、骨脆弱性(例えば、頭蓋骨縫合早期癒合症、眼球突出、水頭症、及び独特の顔面特徴を伴う)、脆弱角膜症候群、脳腱黄色腫症、ネコなき症候群、半身性骨端異形成症、常染色体優性エーラス・ダンロス症候群、家族性骨異形成症、フリン・エアード症候群、老人様皮膚萎縮骨形成異常症、Ia型糖原病、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群、乳児全身性ヒアリン症、多毛性骨軟骨異形成症、機能的亜鉛欠乏を伴う高亜鉛血症、低ホスファターゼ症、常染色体優性低リン血症性くる病、X連鎖性劣性低リン血症性くる病、リヒテンスタイン症候群、巨大骨端異形成症(例えば、骨粗鬆症、しわの多い皮膚及び老人様外観を伴う)、メンケス病、精神遅滞(例えば、X連鎖性シュナイダー・ロビンソン型)、ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症、小球状水晶体-骨幹端異形成症、モルキオ症候群a型、モルキオ症候群B型、耳軟骨骨化(例えば、知的障害、筋委縮、及び骨頭蓋骨狭窄症を伴う)、骨粗鬆症及び眼皮膚低色素症候群、骨粗鬆症・偽グリオーマ症候群、若年性骨粗鬆症、魚鱗癬及び骨折を伴う骨硬化症、卵巣形成不全1、卵巣形成不全2、卵巣形成不全3、卵巣形成不全4、下垂体腺腫、硬化性白質脳症を伴う脂肪膜性多膿疱性骨異形成、プラダー・ウィリ体型、骨減少症、オカモト型早期老化症候群、プリエト(Prieto)X連鎖精神遅滞症候群、濃化異骨症候群、パイル病、ライフェンスタイン症候群、常染色体優性遠位尿細管性アシドーシス、1型シュワルツ・ヤンペル症候群、2型シュワルツ・ヤンペル症候群、3型シュワルツ・ヤンペル症候群、4型シュワルツ・ヤンペル症候群、X連鎖性遅発性脊椎骨端異形成、及びトルグ(Torg)・ウィンチェスター症候群からなる群から選択される、請求項79又は82に記載の方法。
  90. 前記コンジュゲート又は医薬組成物を、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は経口、又は鼻腔内若しくは硬膜外投与によって、前記患者に投与するステップを含む、請求項79〜89のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記コンジュゲート又は医薬組成物を、前記患者に筋肉内投与するステップを含む、請求項90に記載の方法。
  92. 前記コンジュゲート又は医薬組成物を、前記患者に静脈内投与するステップを含む、請求項90に記載の方法。
  93. 前記コンジュゲート又は医薬組成物を、前記患者に皮下投与するステップを含む、請求項90に記載の方法。
  94. 請求項1〜73のいずれか一項に記載のコンジュゲート、及び添付文書を含むキットであって、前記添付文書が、前記コンジュゲートの治療有効量を、TGF-βシグナリングの上昇と関連する疾患に罹患しているヒト患者に投与することによって、前記患者を処置するように前記キットのユーザーに指示するものである、キット。
  95. 請求項74〜78のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び添付文書を含むキットであって、前記添付文書が、前記コンジュゲートの治療有効量を、骨代謝回転の上昇と関連する疾患に罹患しているヒト患者に投与することによって、前記患者を処置するように前記キットのユーザーに指示するものである、キット。
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