WO2000031135A1 - PEPTIDOS INHIBIDORES DE TGFβ1 - Google Patents

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WO2000031135A1
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Ignacio José EZQUERRO SAENZ
Juan José LASARTE SAGASTIBELZA
Jesús PRIETO VALTUEÑA
Francisco Borras Cuesta
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Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra, S.A.
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    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Definitions

  • TGF transforming growth factors
  • TGF ⁇ TGF ⁇
  • TGF ⁇ TGF ⁇
  • TGF ⁇ TGF ⁇
  • the TGF ⁇ family consists of 5 isoforms (Brand T. and Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27: 5-18) of dimeric structure (Schlunneger MP and Grutter MG (1992) Nature 358: 430 -434; Brand T. and Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27: 5-18).
  • Studies of mature proteins, purified from the same species, have demonstrated a high degree of identity among their sequences (Table 1).
  • TGF ⁇ l is synthesized as a 390 amino acid precursor called Pre-Pro-TGF ⁇ l.
  • a 29-amino acid hydrophobic fragment is released, which gives rise to Pro-TGF ⁇ l.
  • the mature TGF ⁇ 1 is released by another cut in a region that precedes the amino end of the TGF ⁇ l and consists of two arginines, giving rise to a 112 amino acid protein with a molecular weight of 12 kDa.
  • two of these monomers are joined together by means of disulfide bridges, obtaining a 25 kDa dimer. Modifications of this structure cause the loss of biological function (Barnard JA et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032: 79-87).
  • TGF ⁇ 1 The existence of several domains within the structure of TGF ⁇ 1 is known, one of these domains is located between amino acids 40 and 82 and is involved in the binding of TGF ⁇ 1 to its cellular receptors (Quian S et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. 89: 6290-6294; Burmester JK et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. 90: 8628-8632).
  • TGF ⁇ 1 Five types of specific receptors for TGF ⁇ 1 have been characterized (Cheifetz S et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 17225-17228 and López Casillas F. et al. (1991) Cell 67: 785-795). These receptors have different affinities for different types of TGF ⁇ 1. Type I, II and III receptors are the best known so far (reviewed in Attisano L et al (1994) Biochim. Biophys. Acta 1222: 71-80; Derynck R. (1994) Trends Biochem. Sci. 19: 548 -553; Yingling et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1242: 115-136).
  • Type IV receptors (MacKay K. and Danielpour D. (1991) J. Biol. Chem. 266: 9907-9911) and type V (Ichijo H. et al. (1991) J. Biol have also been described. Chem. 266: 22459-22464). It has also been described that the transmembrane and cytoplasmic domains of endoglin (Cheifetz S et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 19027-19030; Bellón T. et al. (1993) Eur. J. Immunol 23: 2340-2345; Yamashita et al. (1995) J. Biol. Chem. 269: 1995-2001; Zhang H. et al. (1996) J. Immunol. 156: 564-573)) has about one 70% analogy with both human and rat type III receptors.
  • the RUI would be responsible for linking TGF ⁇ 1 and presenting it to RII, which in turn would form a complex with RI (Yamashita et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20172-20178) or complexes in which several RI molecules are associated with RII (eiss G. and Massagué J. (1996) EMBO J 15: 276-289).
  • the RII-RI interaction would cause the phosphorylation of RI and the subsequent activation of its serine / threonine kinase which would phosphorylate second messengers such as MADR2 proteins (Maclas-Silva M et al. (1996) Cell 87: 1215-1224).
  • the effects produced are different depending on the moment of development and the cell type.
  • TGF ⁇ 1 has been associated with hepatic fibrosis processes (Czaja MJ et al. (1989) J. Cell Biol. 108: 2477-2482; Annoni G. et al. (1992) J. Hepatol 14: 259-264) causing an increase in the production of extracellular matrix proteins, by hepatic stellar cells (lipocytes or Ito cells), of their receptors and inhibiting the synthesis of proteolytic enzymes that degrade the matrix (Ignotz RA and Massagué J . (1986) J. Biol. Chem. 261: 4337-4345).
  • TGF ⁇ 1 induces the synthesis of collagen and fibronectin in hepatic stellar cells (einer FR (1990) Hepatology 11: 111-117). There is also a self-regulation increasing its own synthesis, by inducing its mRNA.
  • TGF ⁇ l is also implicated in the increased synthesis of ⁇ 2-Macroglobulin synthesized by hepatocytes and activated hepatic stellar cells. By binding to TGF ⁇ 1 and causing its inactivation (Bachem MG (1994) Ann NY Acad. Sci. 737: 421-424) ⁇ 2- Macroglobulin will eliminate TGF ⁇ 1 from extracellular compartments.
  • liver cirrhosis Patients with liver cirrhosis have a shorter than normal life expectancy due to complications that appear in the course of the disease, such as portal hypertension or liver failure.
  • TGF ⁇ 1 The interaction of TGF ⁇ 1 with cellular receptors causes:
  • the choice of the peptides to be synthesized was made differently depending on whether they came from TGF ⁇ 1 or its receptors.
  • TGF ⁇ 1 sequence 15 amino acid peptides were synthesized that covered the entire TGF ⁇ l sequence. Each peptide had 10 amino acids in common with its two immediate neighbors.
  • the peptides were chosen based on computer programs designed in our laboratory. One of these programs allows two amino acid sequences to be compared with each other, in order to predict partially complementary areas. Other programs capable of predicting the areas of the most exposed proteins were also used, based on the hydrophobicity and hydrophilicity of the amino acids that make up its sequence.
  • the synthesized peptides were analyzed and purified by high pressure liquid chromatography (HPLC), using a Waters 600E-900 system (Millipore Corp., Bedford, United States).
  • a Waters Delta-Pak TM C 18 300 column at 15 ⁇ m, 25xl00mm (Millipore Corp., Bedford, United States) was used.
  • the peptide was dissolved and injected (2 ml) under the same conditions as in the previous case, the same gradient being used at a flow rate of 5 ml / min.
  • the fraction containing the pure peptide was collected in a flask.
  • the Mv-l-Lu cells grown as indicated above were detached from the bottom of the culture flasks using 5 ml of trypsin-EDTA (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), were resuspended in complete medium and were centrifuged at 1500 rpm for 8 minutes. After centrifugation the cells were resuspended in complete medium at a concentration of 50,000 cells / ml.
  • trypsin-EDTA Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel
  • the cells were detached from the bottom of the wells with trypsin-EDTA and collected using a manual collector ⁇ Ti tertek cell harves ter, Ska tron Instruments Inc. , Sterling, United States) that lyse cells by collecting DNA in nitrocellulose filters ⁇ Fil ter MAT 11 731, Ska tron Instruments Inc. , Sterling, United States) where it is fixed.
  • the filters were placed individually in 5 ml polypropylene tubes to which 4 ml of scintillation liquid was added (Bogogreen-11, Scharlau S. A. Reagents, Barcelona, Spain). The activity of each tube was quantified for 90 seconds in a ⁇ LKB scintillation counter (Beta p ⁇ a te system, LKB, Upssala, Switzerland).
  • MV-l-Lu cells were detached from the culture flasks by incubating them at 37 ° C for 10 minutes, with 10 ml of solution 1 (128 mM NaCl, 5 mM KC1, 4- (2-h ⁇ drox ⁇ et ⁇ l) - 1-p ⁇ perazmethanesulfonate 25 mM at pH 7.5, 5 mM glucose and 1 mM EDTA).
  • the cells thus detached were resuspended in solution 2 (128 mM NaCl, 5 mM KC1, 4- (2-h ⁇ drox ⁇ et ⁇ l) -1- 50 mM piperazmethanesulfonate at pH 7.5, 1.2 mM CaCl 2 , MgS0 4 1.2 mM and 5 mg / ml BSA) and were collected by centrifugation at 1000 x g. for 5 minutes. After centrifugation the cells cells were resuspended in solution 2 at a concentration
  • the cells were transferred to a centrifuge tube where they were centrifuged in the cold at 12000 x g. for 1 minute They were subsequently washed twice in cold solution 2 and resuspended in 0.5 ml of cold 2 solution, 5 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO 99.5%, Sigma Chemi lime Co., St. Louis, United States) and disuccimidyl suberate (DSS, Pierce Chemi Lime Co., Rockford, United States) giving a final concentration of 0.25 mM of DSS. The reaction was stopped at 15 minutes by dilution, centrifugation and washing with a solution containing 0.25M sucrose, 10mM Tris and 1mM EDTA at pH 7.4.
  • DMSO 99.5% dimethyl sulfoxide
  • DSS disuccimidyl suberate
  • the cell precipitate was resuspended in 0.5 ml of Triton x-100 (Bio-Rad Labora tories, Hercules, United States) 1% v / v, 10 mM Tris at pH 7.0, 1 mM EDTA, Phenylmethylsulfonyl 0, lmM fluoride, Pepsatin l ⁇ g / ml and Leupeptin l ⁇ g / ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, United States) and incubated for 40 minutes at 4 ° C.
  • the detergent insoluble fraction is separated by centrifugation at 12000 x g. during 15 minutes.
  • the detergent soluble (supernatant) and insoluble (precipitated) fractions were frozen at -20 ° C (Massagué J. and Li e B. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2636-2645).
  • Protein electrophoresis in sodium polyacrylamide dodecyl sulfide gel The soluble and insoluble detergent fractions were used for electrophoretic analysis in 7.5% acrylamide / bisacrylamide gels for 5-6 hours at 220 volts.
  • Protein staining was carried out with a solution of comassie brillan t bl ue Q R250 ⁇ Serva Feinbiochemi ca GmbH, Heidelberg, Al emania) in 50% methanol, 10% acetic acid and distilled water, for 30 minutes. The subsequent washings were performed with a solution of 50% methanol, 10% acetic acid and distilled water for 15 minutes, in a first wash and 2.5% methanol, 0.5% acetic acid and distilled water, in the following washings, until the removal of the background color.
  • Inhibition of peptide-mediated TGF ⁇ 1 binding to cell receptors was measured by the direct immunofluorescence method.
  • An immunofluorescence kit was used for this purpose ⁇ Fl uorokine rh TGF ⁇ -biotin, R&D Systems Europe Ltd. , Abingdon United Kingdom).
  • This assay is based on the ability to bind biotinylated TGF ⁇ 1 to cell receptors, specifically and the subsequent interaction of biotin with fluoresceinated avidin; such that the intensity of the signal will depend on the amount of TGF ⁇ 1 bound to the cellular receptors.
  • MV-l-Lu cells grown in 162 cm 2 bottles were detached using solution 1 (described above) and resuspended in physiological serum for centrifugation at 500 x g. for 5 minutes. After centrifugation the cells were resuspended again in physiological serum at a concentration of 4 x 10 6 cells / ml. 25 ⁇ l of the cell suspension was added to 12x75 mm boro-silicate tubes to which the peptide was added to test in 40 ⁇ l of RPMI 1640 medium, giving a final concentration of 0.42 ⁇ g / ⁇ l and 10 ⁇ l of biotinyladc TGF ⁇ l.
  • the cell precipitate was resuspended in 0.2 ml of cold PBS for cytometric analysis ⁇ FACScan, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, California, United States). This procedure makes it possible to measure the fluorescence emitted by each cell when a laser beam strikes it using a software ⁇ Lisys " ll, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, California, United States) .A typical image of the analysis is shown in Figure 16 by flow cytometry.
  • the positive control of the assay was used to delimit the fields corresponding to the labeled cells, which have bound the TGF ⁇ 1-biotin, (M2) and to the cells not marked (MI).
  • M2 the TGF ⁇ 1-biotin
  • MI the cells not marked
  • the percentage of cells within each one was calculated. The same was done with the data obtained when the peptide was incubated with TGF ⁇ -biotin or with the cells, depending on whether they were from the receptors or TGF ⁇ 1 respectively. With this data, the percentage inhibition of each peptide was calculated using the following formula: 100 - ((M2 Peptide-M2 Negative) xl00 / (M2 Positive-M2 Negative)).
  • White male rats (Wistar albino breed), from simultaneous baits (5 weeks ⁇ 1.5 weeks), were used in order to obtain a homogeneous group in age, and initial weight. Throughout the experimental period, the animals were kept in conditions of constant temperature (22 ° C) and with a light / dark cycle of 12 hours. They had free access to water and food.
  • Hepatic cirrhosis was induced by inhalation of carbon tetrachloride, for 11 weeks, twice a week (López Novoa JM et al (1976) Pathology IX: 223-240; Camps J. et al. (1987) Gastroenterology 93: 498-505).
  • Exposure to CC1 4 was effected by bubbling compressed air, at a flow of 3 liters / minute, through a gas scrubber bottle. It began with a minute of exposure, increasing by one minute per week to reach 4 minutes in the fourth week.
  • CC1 was not administered during the fifth week, starting again at the sixth week with a 5 minute exposure. This exposure time was maintained until week 11.
  • Cirrhotic trolleys 1 Animals undergoing the process of induction of cirrhosis by inhalation of CC1 4 twice a week. These animals were separated into 2 groups upon reaching the fifth week:
  • Cirrhotic controls 1 (Ci ⁇ ): Animals that continued to undergo the fibrosis induction process until week 11, without administering the P144 peptide. They were given saline serum on alternate days, throughout the induction process (weeks 5 to 11).
  • Treated Cirrhotics 1 Animals to which the P144 peptide was administered from the type III receptor sequence, on alternate days, during the fibrosis induction process, from week 5 to week 11.
  • Cirrhotic trolleys 2 (Ci 2 ): Animals that continued to undergo the fibrosis induction process without receiving the P144 peptide or saline. This group was subdivided into two others upon reaching week 11.
  • Cirrhotic Controls 2 (Ci ? ): Cirrhotic animals that were not subjected to any type of treatment, being kept as controls. These animals received saline injections for 3 weeks (weeks 13 to 15). Treated Cirrhotic 2 (Tto-Q: Cirrhotic animals that were treated with the peptide from the type III receptor sequence (P144), for 3 weeks (weeks 13 to 15).
  • Group Tto 1 These animals were subjected to treatment during the fibrosis process. The peptide treatment was started in the fifth week, (before exposure to CC1 4 for 5 minutes) and continued until the end of eleven weeks of the cirrhosis induction process. .
  • Group Tto 2 These animals underwent treatment after the end of the cirrhosis induction process (11 weeks). The treatment was started one week after the last inhalation of CC1 4 and continued for 21 days. Before starting the treatment and at the end of it, blood was taken from all the animals undergoing treatment with the peptide. The peptide was administered by subcutaneous injection, in the abdominal area at a dose of 70 ⁇ g / animal in 500 ⁇ l of physiological serum.
  • a light microscope (Olympus BH-2, Tokyo, Japan) connected to a video camera (Sony DXP-950P, Sony Co., Tokyo, Japan) was used, with which They captured the different fields of each preparation. 6 fields were taken randomly from each preparation stained with red Sirius. The different images captured were analyzed by means of a computer program (Visilog 4, 1, 5, Noesis, Orsay, France) capable of calculating the area of fibrosis and the total area of the preparation. With these data a fibrosis index (area of fibrosis / total area) of each field was calculated.
  • the 14 ⁇ m cuts that were used for this technique were obtained in the same manner as the 3 ⁇ m cuts mentioned above. These cuts were subjected to a deparaffinization process for 12 hours in xylol. Once the paraffin was removed, the samples were hydrated by passing them through different grades of alcohol 96%, 80%, 50%, ending the process in distilled water.
  • Non-collagenic proteins absorbance at 630 nm
  • TGF ⁇ 1 is a cytokine capable of inhibiting in vitro growth of the MV-l-Lu cell line (Grubeck-Loebenstein B. et al. (1989) J. Clin. Invest. 83: 764-770; Brennan FM et al. . (1990) Clin. Exp. Immunol. 81: 278-285), so this line was used to test the blocking effect of peptides on TGF ⁇ 1.
  • the effect of different concentrations of TGF ⁇ 1 on the incorporation of [methyl-3H] thymidine was studied by the MV-l-Lu cells in culture, until the most appropriate conditions were determined for the rehearsal These conditions are shown in Figure 3.
  • Synthetic peptides potentially inhibitory of TGF ⁇ l activity chosen as indicated above in the section: choice of peptides to be synthesized (both those derived from proteins that bind to TGF ⁇ l and TGF ⁇ l itself) were tested using the cell line MV-l-Lu. The peptides were dissolved in buffered RPMI medium, free of fetal calf serum and proceeded as follows:
  • Peptides belonging to the receptor sequence, or complementary to the hydrophilicity peaks of TGF ⁇ were incubated for 30 minutes in the presence of this cytokine and then added to the cell culture. Peptides from the TGF ⁇ 1 sequence were added to the cell culture prior to the addition of TGF ⁇ 1, so that they interact with the cell surface receptors. These incubations were performed in 100 ⁇ l of the same medium as that used to add the cells. The active peptides allowed cell growth to a greater or lesser extent depending on their ability to inhibit TGF ⁇ 1.
  • TGF ⁇ 1 inhibits the growth of MV-l-Lu cells
  • inhibition of this cytokine by peptides results in the restoration of growth of MV-l-Lu cells.
  • the P12 peptide from the TGF ⁇ 1 sequence, has the highest inhibitory activity of TGF ⁇ 1.
  • a study of the effect of the concentration of the peptide on cytokine inhibition was performed, which is indicated below.
  • LeuAlaLeuTyr P29 (313 _ 335) HisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyr IleTrpSerLeuAspThr
  • Figure 6 shows that peptide P29 is active. This peptide encompasses the previously tested P12 peptide and has 9 more amino acids towards the N-terminal end ( Figure 4). Studies conducted by Quian SW et al. (1992)
  • P29 peptide from the TGF ⁇ 1 sequence was used in affinity mapping assays to verify its ability to inhibit the binding of TGF ⁇ 1 to its cellular receptors (Material and Methods).
  • peptides were synthesized from the rat type III receptor. Some peptides were chosen based on areas of their sequence that were predicted as complementary to amino acid blocks of the TGF ⁇ 1 sequence. It was expected that these peptides would be able to bind free TGF ⁇ 1, sequestering it and preventing its binding to cell receptors.
  • peptides were synthesized by overlapping 10 amino acids and covering part of the extracellular zone of the type III receptor (amino acids 45 to 410). It has been described that there is a soluble type III receptor that corresponds to the extracellular area of the receptor, this area is cut from the membrane and acts as a sequestrant of the circulating TGF ⁇ 1 (López Casillas F. et al. (1991) Cell 67: 785-795). Subsequent studies have described two possible areas of TGF ⁇ 1 binding, one of which is at the N-terminal end of the receptor (López-Casillas et al. (1994) J. Cell Biol.
  • Table 4 shows the synthesized peptides.
  • the peptides in Table 4 were tested for their ability to block TGF ⁇ 1 in the MV-l-Lu cell line inhibition model. Since TGF ⁇ 1 is able to inhibit the growth of this line, inhibition of TGF ⁇ 1 by peptides would be able to restore cell growth. These tests are shown in Figures 9 to 12.
  • a dose response assay was performed with the P144 peptide from the human type III receptor sequence, in order to check if its activity was concentration dependent ( Figure 15). It can be seen how the activity of the peptide declines as the concentration of peptide used in the assays decreases.
  • the P144 peptide from the human type III receptor sequence was used in labeling assays.
  • TGF ⁇ 1 Inhibition of TGF ⁇ 1 by peptides from other proteins capable of binding TGF ⁇ l and predicted as complementary to TGF ⁇ l
  • P170, 876-887) Ala euGluSerGlnGlu euCysGlyThrGluVal 2 macroglobulin P171 (1001 1012 ysSerLysIleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyr 2 -macroglobulin.
  • Figures 17 and 18 indicate the inhibitory activity of the peptides from Table 10.
  • Peptides derived from the above synthesis both those synthesized from the sequence of TGF ⁇ l and the type III receptor, were used to measure, by flow cytometry, their inhibitory capacity of TGF ⁇ 1 binding to cell receptors.
  • the cells are incubated with the peptide before adding the TGF ⁇ -biotin that will be revealed using avidma-FITC (Material and Methods).
  • the fluorescence emitted by the avidma-FITC is subsequently measured, which will be directly proportional to the amount of TGF ⁇ 1 bound to the cells and inversely proportional to the activity of the peptide.
  • avidma-FITC Magnetic and Methods
  • Table 7 Comparison of the inhibitory activity of TGF ⁇ 1, of some peptides, measured by the bioassay of growth inhibition of MV-l-Lu 1 cells (peptide concentration 200 ⁇ g / ml) with inhibition of TGF ⁇ 1 binding to its cellular receptors measured by flow cytometry 2 (peptide concentration 420 ⁇ g / ml).
  • the P144 peptide from the human type III receptor sequence which is active in bio-assays of inhibition of the growth of the MV-l-Lu cell line, was used in in vivo assays to study its inhibitory effect on induction of experimental cirrhosis with CC1 4 , in a rat model.
  • liver cirrhosis is induced by inhalation of carbon tetrachloride, for 11 weeks, twice a week (López Novoa JM et al. (1976) Pathology IX: 223-240; Camps J. et al. (1987) Gastroenterology 93: 498-505) as indicated in Material and Methods.
  • P144 peptide was administered according to two protocols:
  • Protocol 1 The peptide was administered on alternate days intraperitoneally during the process of inducing cirrhosis (11 weeks). Figures 20 and 21. 2. Protocol 2: The peptide was administered on alternate days intraperitoneally for 3 weeks, once cirrhosis was established, that is, 12 weeks after the onset of cirrhosis induction. Figures 22 and 23.
  • ISA / ES Figures 36 and 38 indicate the production of total collagen measured by staining of liver sections (two per animal) stained with Fas t Green and Direct Red, color elution and spectrophotometer reading (Material and Methods) (López de León A. and Roj ind, (1985) Histochem. Cytochem. 33: 737-743; Gaudio E. et al. (1993) Int. J. Exp. Path. 74: 463-469).
  • Figures 21 and 23 reflect the production of collagen measured by image analysis from liver sections stained with Syrian red, using light microscopy (Material and Methods).
  • Figures 26 and 27 show the images obtained by light microscopy from liver preparations stained with Syrian red at an increase of 10X obtained from livers of the rats treated during the cirrhosis induction process (C ⁇ and tto.
  • Figure 26 The images in Figure 26 were obtained without applying any type of filter.
  • Figure 27 shows the images once modified for study using specific software. These modifications consist of the application of two filters, one of polarized light and the other of green light, in order to increase the quality of the images and facilitate their study in an automated way.
  • FIG. 1 Inhibition of TGF ⁇ 1 binding to MV-l-Lu cells by peptide P144, measured by flow cytometry.
  • A image obtained by analyzing cells incubated with biotinylated TGF ⁇ 1 and revealed with avidin-FITC.
  • B image obtained by analyzing the cells incubated with avidin-FITC without prior addition of TGF ⁇ 1.
  • C image obtained by analyzing the cells incubated with TGF ⁇ l previously incubated with the P144 peptide at a concentration of 0.42 ⁇ g / ⁇ l, the development was performed with avidin-FITC.
  • In Abeisas the emitted fluorescence is indicated and in ordinates the number of cells for each fluorescence value.
  • FIG. 2 Representative scheme of the process of cirrhosis due to CC1 4 . With black arrows it is indicated when two weekly doses of CC1 4 were administered to the rats and with black dashed arrows when it was a weekly dose. Gray arrows indicate administration of the P144 peptide.
  • FIG. 3 Effect of TGF ⁇ l on the growth of MV-l-Lu cells.
  • the cells were grown at a density of 5000 cells / well at the TGF ⁇ 1 concentrations, in pg / ml indicated.
  • Abscissa TGF ⁇ 1 concentration (pg / ml); Ordered: c .p .m.
  • FIG. 4 Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 (200 pg / ml) by TGF ⁇ 1 peptides. All peptides were tested at the concentration of 200 ⁇ g / ml. A 100% TGF ⁇ 1 inhibition corresponds to the growth of MV-l-Lu cells that is obtained in the absence of TGF ⁇ 1.
  • ISA / ES 100% corresponds to the growth of MV-l-Lu cells obtained in the absence of TGF ⁇ 1.
  • FIG. 7 Autoradiography of a spinal assay] and by affinity of TGF ⁇ 1 receptors.
  • Cl lane effect of the incubation of cells with a concentration of 0.16 ⁇ M of 125 TGF ⁇ l that corresponds to an activity of 0.3 ⁇ C ⁇ (positive control)
  • C2 lane effect of pre-incubation of cells with a concentration of TGF ⁇ l not radioactive 10 times higher than 1 5 I -TGF ⁇ 1 (negative control).
  • C3 lane premubation was performed with the P29 peptide at a concentration 10 6 times higher than the molar concentration of 125 I -TGF ⁇ 1. The inhibition of the binding of 125 I -TGF ⁇ 1 to cell receptors type I, II and III can be observed both by the P29 peptide and by the non-radioactive TGF ⁇ l.
  • FIG. 8 Autoradiography of an affinity labeling assay of TGF ⁇ 1 receptors.
  • Cl to C6 streets effect of the premubation of MV-l-Lu cells, with different concentrations of the P29 peptide (10 6 , 8xl0 5 , 6xl0 5 , 4xl0 5 , 2xl0 5 , 10 s times the molar concentration of 1 5 I -TGF ⁇ 1 respectively), prior to the addition of 125 I-TGF ⁇ l.
  • C7 lane premcubation effect of MV-l-Lu cells with unlabeled TGF ⁇ l (10 2 times the molar concentration of 125 I-TGF ⁇ l) prior to the addition of 125 I -TGF ⁇ l (negative control).
  • C8 lane effect of the incubation of MV-l-Lu cells with a 0.42 ⁇ M concentration of 125 I -TGF ⁇ 1 that corresponds to an activity of 0.4 ⁇ Ci, without pre-incubations (positive control).
  • FIG. 9 Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 (200 pg / ml) by receptor peptides predicted as complementary to TGF ⁇ l zones. All peptides were tested at the concentration of 200 ⁇ g / ml. A 100% TGF ⁇ 1 inhibition corresponds to the growth of MV-1- Lu cells that is obtained in the absence of TGF ⁇ 1.
  • FIG. 10 Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 (200 pg / ml) by overlapping peptides from the extracellular region of type III receptor. All peptides were tested at the concentration of 200 ⁇ g / ml. A 100% TGF ⁇ 1 inhibition corresponds to the growth of MV-l-Lu cells that is obtained in the absence of TGF ⁇ 1.
  • FIG. 11 Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 (200 pg / ml) by overlapping peptides from the extracellular region of type III receptor. All peptides were tested at the concentration of 200 ⁇ g / ml. A 100% TGF ⁇ 1 inhibition corresponds to the growth of MV-l-Lu cells that is obtained in the absence of TGF ⁇ 1.
  • FIG. 12 Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 (200 pg / ml) by overlapping peptides from the extracellular region of type III receptor. All peptides were tested at the concentration of 200 ⁇ g / ml. A 100% TGF ⁇ 1 inhibition corresponds to the growth of MV-l-Lu cells that is obtained in the absence of TGF ⁇ 1.
  • FIG. 14 Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 (200 pg / ml) by receptor peptides from the modification of peptide P54 (P139 to P143) and peptides from of the human type III receptor (P144 and P145). All peptides were tested at the concentration of 200 ⁇ g / ml. A 100% TGF ⁇ 1 inhibition corresponds to the growth of MV-l-Lu cells that is obtained in the absence of TGF ⁇ 1.
  • Figure 15 Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 activity (200 pg / ml) in the presence of different nominal concentrations of unfiltered P144 peptide.
  • Lane C4 and C5 effect of the incubation of the cells with a concentration of 0.1 ⁇ M of 125 TGF ⁇ l that corresponds to an activity of 0.2 ⁇ Ci (positive control) It is possible to observe the inhibition of the union of 125 I -TGF ⁇ l a cellular receptors both by the P144 peptide and by the non-radioactive TGF ⁇ 1.
  • FIG. 17 Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 (200 pg / ml) by peptides from the human type II receptor (P146), fetuine (P147 to P149) and endoglin (P150 to P154). All peptides were tested at the concentration of 200 ⁇ g / ml. A 100% TGF ⁇ 1 inhibition corresponds to the growth of MV-l-Lu cells that is obtained in the absence of TGF ⁇ 1.
  • Figure 18. Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 (200 pg / ml) by peptides from ⁇ 2-Macroglobulin. All peptides were tested at the concentration of 200 ⁇ g / ml. A 100% TGF ⁇ 1 inhibition corresponds to the growth of MV-l-Lu cells that is obtained in the absence of TGF ⁇ 1.
  • Figure 19 Percentage of inhibition of TGF ⁇ 1 binding to MV-l-Lu cells by different synthetic peptides. Inhibition was studied by measuring the percentage of labeled cells (emit fluorescence) and unlabeled (do not emit fluorescence) for each peptide (Material and Methods).
  • FIG. 20 Effect of administration of P144 peptide on collagen synthesis during induction of experimental cirrhosis with CC1 4 .
  • FIG 21 Effect of administration of P144 peptide on collagen synthesis during induction of experimental cirrhosis with CC1 4 .
  • the ratio between the area of fibrosis and the total area in tissue preparations stained with Syrian red is indicated in ordinates.
  • Figure 22 Effect of administration of P144 peptide on collagen synthesis during induction of experimental cirrhosis with CC1 4 .
  • the different groups of rats are indicated in abscissa: Co
  • FIG. 23 Effect of administration of the P144 peptide on collagen synthesis after cirrhosis induced with CC1 4 .
  • the ratio between the area of fibrosis and the total area in tissue preparations is indicated in ordinates.
  • Figure 24 Comparison between the data on the amount of collagen and area of fibrosis, obtained using the two techniques used. The ratio of the ratio between the area of fibrosis and the total area, obtained by image analysis, is indicated on the axis of the abscissa. The values of the quotient between the ⁇ g of collagen and the mg of total protein, obtained by spectrophotometry analysis of liver sections stained with "Direct Red and Fast Green" are indicated. R 2 is indicated. (F ⁇ 0.001).
  • Figure 25 Comparison between the data on the amount of collagen and the area of fibrosis, obtained by means of the two techniques used for the study of the samples at the end of protocol 2. The ratio of the ratio between the area of fibrosis is indicated on the abcissa axis.

Abstract

Péptidos sintéticos antagonistas, obtenidos de TGFβ1 o de sus receptores en el organismo, que pueden ser utilizados en la fabricación, tanto por si solos, como las secuencias génicas que los codifican y los sistemas recombinantes que los expresen, en la fabricación de composiciones útiles para el tratamiento de enfermedades hepáticas y más concretamente en casos de fibrosis. Dichas composiciones pueden incluir opcionalmente mimotopos de dichos péptidos activos.

Description

"PEPTIDOS INHIBIDORES DE TGFβl"
DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DE LA TÉCNICA
El control del crecimiento celular está regulado por diferentes proteínas del grupo de los factores de crecimiento (Schalch DS y col (1979) Endocrinoiogy 104:1143- 1151). Entre los factores de crecimiento más importantes implicados en el desarrollo celular, capaces de actuar de forma autocrina y paracrina, se encuentran los factores transformantes del crecimiento (TGF, del inglés Trans- forming Growth Fa ctor) (Braun L. y col. (1988) Cell Biol 85:1539-1543; Lyons RM y Moses HL (1990) Eur . J. Biochem. 187:467-473) . El término TGF se utilizó, por primera vez, para describir la actividad producida por una linea celular transformada con el virus del sarcoma murino (deLarco JE y Todaro GJ (1978) Proc. Nati. Acad. Sci. 75:4001-4005; Mizel SB y col. (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. 77:2205-2208). El sobrenadante de estas células fue capaz de inducir el normal crecimiento, en agar blando, de células que necesitan un soporte sólido para crecer. Estudios más específicos pusieron en evidencia dos clases de TGF, que se denominaron TGFα y TGFβ, que a su vez abarcan a familias de proteínas relacionadas. La familia del TGFβ está formada por 5 iso- formas (Brand T. y Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27:5-18) de estructura dimérica (Schlunneger MP y Grutter MG (1992) Nature 358:430-434; Brand T. y Schneider MD (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27:5-18). Estudios de las proteínas maduras, purificadas a partir de una misma especie, han demostrado un alto grado de identidad entre sus secuencias (Tabla 1).
Tabla 1. Homología entre los diferentes tipos de TGFβs .
TGFβl, TGFβ2 y TGFβ3 procedente de humanos, TGFβ4 procedente de pollo y TGFβ5 procedente de rana. (Roberts AB y Sporn MB, 1990) .
% de| TGFβl TGFβ2 TGFβ3 TGFβ4 TGFβ5
TGFfil 1 100
TGFβ2 71 100
TGFβ3 72 76 100
TGFβ4 82 64 71 100
TGFβ5 76 66 69 72 100
El TGFβl se sintetiza como un precursor de 390 aminoácidos denominado Pre-Pro-TGFβl En una primera hidrólisis se produce la liberación de un fragmento hidrófobo de 29 aminoácidos, que da lugar al Pro-TGFβl. Posteriormente se libera el TGFβl maduro mediante otro corte en una región que precede al extremo amino del TGFβl y que consta de dos argininas, dando lugar a una proteina de 112 aminoácidos con un peso molecular de 12 kDa. Para dar lugar a la forma biológicamente activa, dos de estos monómeros se unen entre si por medio de puentes disulfuro, obteniéndose un dimero de 25 kDa. Las modificaciones de esta estructura provocan la pérdida de la función biológica (Barnard JA y col. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032:79-87).
Se conoce la existencia de varios dominios dentro de la estructura del TGFβl, uno de estos dominios se encuentra localizado entre los aminoácidos 40 y 82 y está implicado en la unión del TGFβl a sus receptores celulares (Quian S y col. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. 89:6290-6294; Bur- mester JK y col. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. 90:8628- 8632) .
Receptores del TGFβl y otras proteínas de unión
• Se han caracterizado cinco tipos de receptores específicos para el TGFβl (Cheifetz S y col. (1988) J. Biol. Chem. 263:17225-17228 y López Casillas F. y col. (1991) Cell 67:785-795). Estos receptores tienen distintas afinidades para los diferentes tipos de TGFβl. Los receptores tipo I, II y III son los más conocidos hasta el momento (revisado en Attisano L y col (1994) Biochim. Biophys. Acta 1222:71- 80; Derynck R. (1994) Trends Biochem. Sci. 19:548-553; Yingling y col. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1242:115- 136) . También se han descrito los receptores de tipo IV (MacKay K. y Danielpour D. (1991) J. Biol . Chem. 266:9907- 9911) y de tipo V (Ichijo H. y col. (1991) J. Biol. Chem. 266:22459-22464). Se ha descrito también que los dominios transmembrana y citoplas-máticos de la endoglina (Cheifetz S y col. (1992) J. Biol. Chem. 267:19027-19030; Bellón T. y col. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2340-2345; Yamashita y col. (1995) J. Biol. Chem. 269:1995-2001; Zhang H. y col. (1996) J. Immunol. 156:564-573)) tiene alrededor de un 70% de analogía con los receptores de tipo III tanto humano como de rata.
El RUI seria el encargado de unir el TGFβl y presen- tarlo a RII que a su vez formarla un complejo con RI (Yamashita y col. (1994) J. Biol. Chem. 269:20172-20178) o a complejos en los que varias moléculas de RI se asocian con el RII ( eiss G. y Massagué J. (1996) EMBO J 15:276-289). La interacción RII-RI provocarla la fosforilación de RI y la posterior activación de su serin/treonin quinasa la que fosforilaria a segundos mensajeros como las proteínas MADR2 (Maclas-Silva M y col., (1996) Cell 87:1215-1224).
Papel del TGFβl en la diferenciación y regeneración hepá- tica
Los efectos producidos son distintos dependiendo del momento del desarrollo y del tipo celular.
. Aumento de la matriz extracelular, al actuar sobre las células estelares hepáticas (células de Ito) , principal fuente de proteínas de la matriz (Mustoe TA y col. (1987) Science 237:1333-1336).
. Diferenciación de las células epiteliales a hepatocitos (Florini JR y col. (1986) J. Biol. Chem. 261:16509-16513). . Inhibición del crecimiento celular durante el proceso de regeneración hepática. Este efecto es de gran importancia en el mantenimiento del reposo celular in vivo (Kato Y y col (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:9552-9556). . Inhibición de la endocitosis del receptor del factor de crecimiento epitelial (EGF) como se ha podido observar en cultivos de hepatocitos fetales de rata (Noda M. y Rodan GA (1987) J. Cell Physiol. 133:426-437).
Papel del TGFβl en la fibrosis hepática
El TGFβl se ha visto asociado a los procesos de fibrosis hepática (Czaja MJ y col. (1989) J. Cell Biol. 108:2477-2482; Annoni G. y col. (1992) J. Hepatol 14:259- 264) provocando un aumento de la producción de las protei- ñas de la matriz extracelular , por las células estelares hepáticas (lipocitos o células de Ito) , de sus receptores e inhibiendo la síntesis de las enzimas proteoliticas que degradan la matriz (Ignotz RA y Massagué J. (1986) J. Biol. Chem. 261:4337-4345). En el hígado el TGFβl induce la sin- tesis de colágeno y fibronectina en las células estelares hepáticas ( einer FR (1990) Hepatology 11:111-117). También existe una autorregulación aumentando su propia síntesis, mediante la inducción de su ARNm.
El TGFβl también se ve implicado en el aumento de la síntesis de la α2-Macroglobulina sintetizada por los hepatocitos y las células estelares hepáticas activadas. Mediante la unión al TGFβl y provocando su inactivación (Bachem MG (1994) Ann NY Acad. Sci. 737:421-424) la α2- Macroglobulina eliminarla el TGFβl de los compartimentos extracelulares .
El estudio de pacientes afectados por un daño hepático crónico ha mostrado que existe una correlación entre la expresión del TGFβl y la expresión del ARNm para el procolágeno tipo I y los niveles séricos de péptido tipo III del procolágeno (Castilla A. y col. (1991) N. Engl . J. Med. 324:933-940) .
Los pacientes con cirrosis hepática tienen una expec- tativa de vida mas corta de lo normal debido a las complicaciones que aparecen en el curso de la enfermedad, como la hipertensión portal o la insuficiencia hepática.
Efecto del TGFβl sobre la matriz extracelular
La interacción del TGFβl con los receptores celulares provoca :
. Activación de la síntesis de procolágeno, fibronectina (Ignotz RA y col. (1987) J. Biol. Chem. 262:6443-6446) y proteínas relacionadas, entre las que encontramos proteínas de membrana capaces de interactuar con los componentes de la matriz extracelular (Cárter G (1982) J. Biol. Chem. 257:13805-13815) . . Inhibición de la síntesis de enzimas proteoliticas capa- ees de degradar la matriz (Fukamizu H. y Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282).
. Estimulación de la síntesis de inhibidores de enzimas proteoliticas (Fukamizu H. y Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282) . Todo esto induce un aumento de las interacciones de la célula con la matriz extracelular, que junto a la mayor reorganización de las proteínas que la componen, da lugar a un aumento en la cantidad total de matriz extracelular (Roberts CJ y col. (1988) J. Biol. Chem. 263:4586-4592). Estas evidencias confirman la implicación del TGFβl en procesos de cicatrización (Fukamizu H. y Gnnnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282; Barnard JA y col. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032:79-87).
Péptidos como inhibidores de la interacción ligando receptor
Existe la posibilidad de utilizar pequeñas moléculas, péptidos sintéticos, como análogos de moléculas existentes en el organismo, con el fin de emular su función. Estudios realizados por LeSateur y col demuestran la posibilidad de usar análogos ciclados del factor de crecimiento nervioso (NGF, del inglés Nerve Growth Fa ctor) , emulando la región de giro β, permitiendo su unión al receptor (LeSateur L. y col. (1996) Nature Biotechnology 14:1120-1122). También es posible utilizar péptidos como antagonistas de estas moléculas, evitando que el factor nativo interaccione con su receptor por un bloqueo mediado por el péptido (Lasarte JJ y col. (1994) J. Acquired Immune Deficiency Syndromes 7:129-134; LeSateur y col. (1995) J. Biol . Chem. 270:6564- 6569) . Estudios anteriores han demostrado la utilidad de los péptidos sintéticos como inhibidores de la interacción ligando-receptor incluso en el caso de que el epitopo de reconocimiento no sea continuo (Daniels AJ y col. (1995) Mol. Pharmacol. 48:425-432). Otros estudios realizados con el receptor tipo II del TGFβl y con la fetuina, una glico- proteina del grupo de receptores tipo II, han demostrado la posibilidad de usar péptidos ciclados como inhibidores de la interacción del TGFβl con el RII (Demetriou M. y col. (1996) J. Biol. Chem. 271:12755-12761). Con esta ciclación se consigue obtener péptidos con una estructura similar a la que se podría dar m vivo . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Por las razones indicadas más arriba, pensamos que péptidos procedentes tanto del TGFβl como de sus recepto- res, o de proteínas con capacidad de unión al TGFβl, podrían ser inhibidores de la acción del TGFβl. Por lo que decidimos explorar esta posibilidad.
Elección de los péptidos a sintetizar
La elección de los péptidos a sintetizar se realizó de diferente manera según provinieran del TGFβl o de sus receptores .
En el caso de la secuencia del TGFβl se sintetizaron péptidos de 15 aminoácidos que abarcaron toda la secuencia del TGFβl. Cada péptido tenia 10 aminoácidos en común con sus dos vecinos inmediatos.
En el caso de las secuencias de sus receptores, los péptidos se eligieron en base a programas informáticos diseñados en nuestro laboratorio. Uno de estos programas permite comparar dos secuencias aminoacidicas entre si, con el fin de predecir zonas parcialmente complementarias. También se utilizaron otros programas capaces de predecir las zonas de las proteínas que se encontrarían más expuestas, en base a la hidrofobicidad e hidrofilicidad de los aminoácidos que componen su secuencia.
Síntesis de Péptidos
Los péptidos se sintetizaron mediante el método de fase sólida (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-
54), utilizando fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) como grupo protector temporal del grupo alfa-amino (Atherton et al.
(1989) Journal of Chemical Society Perkins Transactions 1: 538-546.). Para la síntesis de pequeñas cantidades de un gran número de péptidos se utilizó un sintetizador múltiple que permite la síntesis simultánea de 96 péptidos (Borras- Cuesta et al. (1991) Biologicals 19: 187-190) . Los péptidos se conservaron a -80°C al estado sólido hasta su utilización.
Purificación de los péptidos por HPLC
Los péptidos sintetizados se analizaron y purificaron mediante cromatografía liquida de alta presión (HPLC) , utilizando un sistema Waters 600E-900 (Millipore Corp . , Bed- ford, Estados Unidos) .
Para el análisis de los péptidos, por HPLC analítico, se utilizó una columna Waters Radial-Pak™ C18 300 A 15 μm, 8xl00mm {Millipore Corp . , Bedford, Estados Unidos) . El péptido se disolvió en una solución de TFA 0,1% en agua destilada, a una concentración máxima de 1 mg/ml. La solución de péptido se inyectó (lOOμl) en la columna y se eluyó en un gradiente de agua/acetonitrilo (Figura 15) { Romil Ltd. , Cambridge , Estados Unidos) ambos con 0,1% TFA a un flujo de 1 ml/minuto. Las fracciones que contenían el péptido se detectaron por su absorbancia a 220 nm y 280 nm {photo diode array detector, wa ters 991 , Millipore Corp . , Bedford, Esta - dos Unidos ) .
Para su purificación se utilizó una columna Waters Delta-Pak™ C18 300 A 15 μm, 25xl00mm (Millipore Corp . , Bedford, Estados Unidos) . El péptido se disolvió y se inyectó (2 mi) en las mismas condiciones que en el caso ante- rior, utilizándose el mismo gradiente a un flujo de 5 ml/min. La fracción que contenia el péptido puro se recogió en un matraz.
EXPERIMENTACIÓN IN VITRO. ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE LOS PÉPTIDOS Líneas celulares
Se utilizó una linea procedente de epitelio de pulmón de visón, MV-l-Lu {CCL-64, American Type Celi Culture, Vir- ginia, Estados Unidos) . Las células se cultivaron en frascos de cultivo de 162 cm: {Costar Corporation, Cambridge, Estados Unidos) en una estufa a 37°C y 5% de C02, hasta alcanzar la subconfluencia . Se utilizó un medio completo: RPMI 1640 con L-glutamina {GibcoBRL, Life Technologies Ltd., Paísley, Escocia) suplementado con un 5% de suero de ternera fetal {FCS, Biological Industries , Kibbutz Beit Haemek, Israel) , HEPES 10 mM {HEPES Buffer 1M, Bio- Whittaker, Verviers , Bélgica) y antibióticos (penicilina lOOU/ml y estreptomicina 100 μg/ml) .
Ensayo de inhibición del crecimiento de la línea celular MV-l-Lu
Las células Mv-l-Lu crecidas tal y como se indica más arriba, se despegaron del fondo de los frascos de cultivo utilizando 5 mi de tripsina-EDTA (Biological Industries , Kibbutz Beit Haemek, Israel) , se resuspendieron en medio completo y se centrifugaron a 1500 r.p.m. durante 8 minutos. Tras la centrifugación las células se resuspendieron en medio completo a una concentración de 50000 células/ml. Para la realización del ensayo se tomaron 10 mi de la suspensión de células y se dispensaron a placas de 96 pocilios de fondo plano {Costar Corporation, Cambridge, Estados Unidos) añadiendo 100 μl/pocillo, y se incubaron durante toda la noche a 37°C y 5% de C02, lo que permite la adhesión de las células al fondo de los pocilios. Una vez transcurrido este tiempo se añadieron los péptidos a ensayar en RPMI, a una concentración final de 200 μg/ml en presencia de una concentración de 200 pg/ml de TGFβl en RPMI (R&D Systems Europe Ltd. , Abingdon, Reino Unido) . La concentra- cιon final de FCS en el pocilio fue del 2,5%. Tras 24 horas de incubación se añadió 1 μCi de timidma tritiaαa por pocilio ( [metil - H] - timidyne 25 Ci/mmol , Amersham Life Science , Buckmghamshire , Remo Unido) y se incubo durante 12 horas adicionales (Grubeck-Loebenstem B. y col. (1989) J. Clin. Invest. 83:764-770; Brennan FM y col. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:278-285).
Una vez terminados los periodos de incubación las células se despegaron del fondo de los pocilios con tripsina-EDTA y se recogieron utilizando un recolector manual { Ti tertek cell harves ter, Ska tron Instruments Inc . , Sterling, Estados Unidos ) que lisa las células recogiendo el ADN en filtros de nitrocelulosa { Fil ter MAT 11 731 , Ska tron Instruments Inc . , Sterling, Estados Unidos) donde queda fijado. Los filtros se colocaron individualmente en tubos de polipropileno de 5 mi a los que se añadió 4 mi de liquido de centelleo ( Bιogreen-11 , Reactivos Scharlau S . A. , Barcelona , España ) . La actividad de cada tubo se cuantif có durante 90 segundos en un contador de centelleo β LKB ( Beta pía te system , LKB, Upssala , Suiza ) .
Estudio de la inhibición de la unión del TGFβl a los receptores celulares
Mareaje selectivo de los receptores celulares (Affinity labeling)
Las células MV-l-Lu se despegaron de los frascos de cultivo incubándolas a 37°C durante 10 minutos, con 10 mi de la solución 1 (NaCl 128 mM, KC1 5 mM, 4- (2-hιdroxιetιl) - 1-pιperazmetanosulfonato 25 mM a pH 7,5, glucosa 5 mM y EDTA 1 mM) . Las células asi despegadas se resuspendieron en la solución 2 (NaCl 128 mM, KC1 5 mM, 4- (2-hιdroxιetιl) -1- piperazmetanosulfonato 50 mM a pH 7,5, CaCl2 1,2 mM, MgS04 1,2 mM y 5 mg/ml BSA) y se recogieron por centrifugación a 1000 x g. durante 5 minutos. Tras la centrifugación las ce- lulas se resuspendieron en la solución 2 a una concentra-
6 ción de 10 células/ml.
A partir de esta suspensión celular se hicieron alícuotas de 0,5 mi en placas de 24 pocilios { Greiner GmbH, Frickenha usen , Alemania ) donde se añadieron los péptidos, en 50 μl de una solución 0,8 mg/ml, se incubaron durante 2 horas a 4°C en agitación. Posteriormente se añadió 125I-TGFβl
(2μCi) a una concentración final de 277,2 pM { 125I-TGFβl human recombinant 800-2200Ci/mmol , Amersham Life Science , Buckinghamshire , Reino Unido) y se incubó durante otras dos horas a 4°C en agitación.
Tras la incubación, las células se transfirieron a un tubo de centrifuga donde se centrifugaron en frió a 12000 x g. durante 1 minuto. Posteriormente se lavaron 2 veces en solución 2 fría y se resuspendieron en 0,5 mi de solución 2 fria, 5 μl de dimetil sulfóxido ( DMSO 99 , 5 %, Sigma Chemi cal Co . , St . Louis , Estados Unidos) y disuccimidil suberato ( DSS, Pierce Chemi cal Co . , Rockford, Estados Unidos) dando una concentración final 0,25 mM de DSS. La reacción se de- tuvo a los 15 minutos por dilución, centrifugación y lavado con una solución que contiene sacarosa 0,25M, Tris 10 mM y EDTA 1 mM a pH 7,4. El precipitado de células se resus- pendió en 0,5 mi de Tritón x-100 ( Bio-Rad Labora tories , Hercules , Estados Unidos) 1% v/v, Tris 10 mM a pH 7,0, EDTA 1 mM, Fenilmetilsulfonil fluoruro 0,lmM, Pepsatin lμg/ml y Leupeptin lμg/ml (Sigma Chemical Co . , St . Louis , Estados Unidos) y se incubó durante 40 minutos a 4°C. La fracción insoluble en detergente se separa por centrifugación a 12000 x g. durante 15 minutos. Las fracciones solubles en detergente (sobrenadante) e insoluble (precipitado) se congelaron a -20°C (Massagué J. y Li e B. (1985) J. Biol. Chem. 260:2636-2645) .
Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida- dodecilsulf to- sódico Las fracciones soluble e insoluble en detergente se utilizaron para análisis electroforéticos en geles de acrilamida/bisacrilamida al 7,5% durante 5-6 horas a 220 voltios.
La tinción de las proteínas se realizó con una solución de comassie brillan t bl ueQ R250 { Serva Feinbiochemi ca GmbH, Heidelberg, Al emania ) en metanol 50%, ácido acético 10% y agua destilada, durante 30 minutos. Los lavados posteriores se realizaron con una solución de metanol 50%, ácido acético 10% y agua destilada durante 15 minutos, en un primer lavado y metanol 2,5%, ácido acético 0,5% y agua destilada, en los siguientes lavados, hasta la eliminación del color de fondo.
Citometría de flujo
La inhibición de la unión del TGFβl, mediada por los péptidos, a los receptores celulares se midió mediante el método de inmunofluorescencia directa. Para ello se utilizó un Kit de inmunofluorescencia { Fl uorokine rh TGFβ -biotin , R&D Systems Europe Ltd . , Abingdon Reino Unido) . Este ensayo está basado en la capacidad de unión del TGFβl biotinilado a los receptores celulares, de forma especifica y la poste- rior interacción de la biotina con avidina fluoresceinada; de tal forma que la intensidad de la señal dependerá de la cantidad de TGFβl unido a los receptores celulares.
Las células MV-l-Lu crecidas en frascos de 162 cm2 se despegaron utilizando la solución 1 (descrita anteriormen- te) y se resuspendieron en suero fisiológico para su centrifugación a 500 x g. durante 5 minutos. Tras la centrifugación las células se resuspendieron de nuevo en suero fisiológico a una concentración de 4xl06 células/ml. Se añadieron 25 μl de la suspensión celular a tubos de boro- silicato de 12x75 mm a los que se añadió el péptido a ensayar en 40 μl de medio RPMI 1640, dando una concentración final de 0,42 μg/μl y 10 μl de TGFβl biotiniladc. Como control de la especificidad se añadió 10 μl de un reactivo biotinilado suministrado por el Kit, como control positivo se añadió 10 μl de TGFβl biotinilado y como control negativo se añadió 20 μl de un anticuerpo bloqueante anti-TGFβl. En todos los controles se añadió suero fisiológico hasta alcanzar un volumen total de 75 μl. Todos los tubos se incubaron durante una hora a 4°C en oscuridad. Transcurrido el periodo de incubación se añadió 10 μl de avidina fluoresceinada y se incubó durante 30 minutos a 4°C en oscuridad, tras los que se añadió 2 mi de una solución de lavado (RDF1) y se centrifugó a 500 x g durante 6 minutos. El precipitado celular se resuspendió en 0,2 mi de PBS frío para el análisis citométrico { FACScan, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, California , Estados Uni dos) . Este procedimiento permite medir la fluorescencia emitida por cada célula al incidir sobre ella un haz de láser mediante un programa informático {Lisys "ll , Becton Dickinson Immunocytometry Systems, California , Estados Uni dos) . En la Figura 16 se muestra una imagen típica del análisis por citometría de flujo.
Para la obtención de los datos de inhibición de la unión del TGFβl a los receptores se utilizó el control po- sitivo del ensayo para delimitar los campos correspondientes a las células marcadas, que han unido al TGFβl -biotina, (M2) y a las células no marcadas (MI) . Una vez delimitados los campos se calculó el porcentaje de células que se encontraba dentro de cada uno. Se hizo lo mismo con los datos obtenidos cuando se incubaba el péptido con TGFβl -biotina o con las células, según fueran procedentes de los receptores o del TGFβl respectivamente. Con estos datos se calculó el porcentaje de inhibición de cada péptido utilizando la siguiente fórmula: 100 - ( (M2 Péptido-M2 Negativo) xl00/ (M2 Positivo-M2 Negativo) ) .
EXPERIMENTACIÓN IN VIVO. MODELO DE FIBROSIS EXPERIMENTAL
Se utilizaron ratas blancas macho (raza Wistar albina) , procedentes de carnadas simultáneas (5 semanas ± 1,5 semanas), con el fin de obtener un grupo homogéneo en edad, y peso inicial. A lo largo del periodo de experimentación, los animales fueron mantenidos en condiciones de températura constante (22°C) y con un ciclo luz/oscuridad de 12 horas. Tuvieron libre acceso al agua y a la comida.
Se indujo cirrosis hepática (CH) mediante inhalación de tetracloruro de carbono, durante 11 semanas, dos veces por semana (López Novoa JM y col (1976) Patología IX: 223- 240; Camps J. y col. (1987) Gastroenterology 93:498-505). La exposición al CC14 se efectuó haciendo burbujear aire comprimido, a un flujo de 3 litros/minuto, a través de un frasco lavador de gases. Se comenzó con un minuto de exposición, aumentando en un minuto por semana hasta llegar a 4 minutos en la cuarta semana. Durante la quinta semana no se administró CC1„, comenzando de nuevo a la sexta semana con una exposición de 5 minutos. Este tiempo de exposición se mantuvo hasta la semana 11. En el agua de bebida se añadió 400 mg/1 de fenobarbital ( Luminals , Bayer, Leverkusen , Ale- mania ) , desde una semana antes de iniciar la exposición al CC14 y hasta el final del periodo de experimentación. Antes de iniciar el tratamiento se dejó una semana, en la que no se les administró CC14. Durante el tratamiento se les administró una dosis semanal de CC14, como recuerdo (Figura 2) .
Distribución de los animales
Los animales se distribuyeron en 4 grupos antes de iniciarse el proceso de inducción de la cirrosis hepática. Con troles Sanos (Co) : Animales que no fueron sometidos al proceso de fibrosis.
Con troles Sanos tra tados (Co+P144) : Animales que no fueron sometidos al proceso de fibrosis y se les administró el péptido P144 durante las 3 últimas semanas (coincidiendo en el tiempo con el tratamiento del grupo de ratas Tto2) .
Con troles Cirróticos 1 (CiJ : Animales sometidos al proceso de inducción de cirrosis por inhalación de CC14 dos veces por semana. Estos animales se separaron en 2 grupos al llegar a la quinta semana:
Controles cirróticos 1 (Ciη ) : Animales que siguieron sometidos al proceso de inducción de la fibrosis hasta la semana 11, sin administrarles el péptido P144. Se les administró suero salino en días alternos, durante todo el proceso de inducción (semanas 5 a 11) .
Cirróticos Tratados 1 (Tto : Animales a los que se le administró el péptido P144 procedente de la secuencia del receptor tipo III, en días alternos, durante el proceso de inducción de la fibrosis, desde la semana 5 hasta la semana 11.
Con troles Cirróticos 2 (Ci2) : Animales que siguieron sometidos al proceso de inducción de la fibrosis sin recibir el péptido P144 ni suero salino. Este grupo se subdividió en otros dos al llegar a la semana 11.
Controles Cirróticos 2 (Ci?) : Animales cirróticos que no fueron sometidos a ningún tipo de tratamiento, manteniéndose como controles. Estos animales recibieron inyecciones de suero salino durante 3 semanas (semanas 13 a 15) . Cirróticos Tratados 2 (Tto-Q : Animales cirróticos que fueron tratados con el péptido procedente de la secuencia del receptor tipo III (P144), durante 3 sema- ñas (semanas 13 a 15) .
Tratamiento de los animales
. Grupo Tto1 : Estos animales fueron sometidos a tratamiento durante el proceso de fibrosis. El tratamiento con el péptido se inició en la quinta semana, (antes de la exposición al CC14 durante 5 minutos) y se continuó hasta finalizar las once semanas del proceso de inducción de cirrosis . . Grupo Tto2 : Estos animales fueron sometidos a tratamiento después de finalizado el proceso de inducción de cirrosis (11 semanas) . El tratamiento se inició una semana después de la última inhalación de CC14 y se continuó durante 21 días . Antes de iniciar el tratamiento y al finalizarlo se extrajo sangre a todos los animales sometidos al tratamiento con el péptido. El péptido fue administrado por inyección subcutánea, en la zona abdominal a una dosis de 70 μg/animal en 500 μl de suero fisiológico.
Sacrificio de los animales y disección del hígado
Finalizado el tratamiento de los animales con el péptido, tanto en el modelo con ratas como en el de rato- nes, se sacrificaron por decapitación, después de haberles extraído sangre del plexo retrorbital con un capilar.
Inmediatamente después se procedió a la disección del hígado y la recogida de muestras.
Se cortaron las muestras y se introdujeron en formol como solución fijadora, para su posterior análisis histoló- gico. Otros fragmentos se introdujeron en criotubos, que tras la inmersión en nitrógeno liquido se conservaron a -80°C.
Evaluación anatomopatológica del hígado
El estudio histológico se realizó en fragmentos de hígado previamente fijados en formol durante al menos 24 horas, transcurridas las cuales se introdujeron en etanol (70%) .
Tras la deshidratación se procedió a la inclusión en bloques de parafina. De los bloques obtenidos se realizaron cortes seriados de 3 μm de espesor, empleando un microtomo de rotación Leitz y cuchillas de acero. Previamente a la tinción los cortes se desparafinaron en xilol (AnalaR, BDH, Poole, Reino Unido) durante 15 minutos, después de calentarlos a 60°C en una estufa, durante 15 minutos, y se hidrataron mediante pasos sucesivos por alcoholes de concentración decreciente 100%, 96%, 80% y 70% finalizando en agua. Se realizaron las siguientes tinciones: Hematoxilina-Eosina .
Tricrómico de Masson (Locquin M, y Langeron, (1985) en Manual de Microscopía Ed. Labor S.A Barcelona) : Utiliza un colorante especifico para proteínas colagénicas (verde luz) .
Rojo Sirio: Tinción específica para colágeno.
Confirmación de la fibrosis hepática : análisis de imagen
Para el análisis de imagen de las muestras obtenidas se utilizó un microscopio de luz ( Olympus BH-2 , Tokio, Japón ) conectado a una cámara de video ( Sony DXP-950P, Sony Co . , Tokio , Japón ) , con la que se captaron los diferentes campos de cada preparación. Se tomaron 6 campos de manera aleatoria a partir de cada preparación teñida con rojo sirio. Las diferentes imágenes captadas se analizaron por medio de un programa informático ( Visilog 4 . 1 . 5 , Noesis , Orsay, Francia ) capaz de calcular el área de fibrosis y el área total de la preparación. Con estos datos se calculó un Índice de fibrosis (área de fibrosis/área total) de cada campo. Para poder utilizar este programa se necesitó modificar la adquisición de las imágenes mediante la utilización de filtros de luz polarizada ( Olympus U-POT, Tokio, Japón ) y de luz verde { Olympus IF550 , Tokio , Japón ) lo que permitió la automatización del proceso de análisis de las muestras .
Detección de colágeno en cortes de 14 μm de tejido parafinado
Los cortes de 14 μm que se utilizaron para esta técnica se obtuvieron de la misma manera que los cortes de 3 μm anteriormente mencionados. Estos cortes fueron sometidos a un proceso de desparafinización durante 12 horas en xilol. Una vez eliminada la parafina, las muestras fueron hidratadas pasándolas por diferentes grados de alcohol 96%, 80%, 50%, finalizando el proceso en agua destilada.
Una vez hidratadas se sometieron a un proceso de pre- tinción en una solución de 160 mg de Fast Green FCF ( Fluka chemika -BioChemika , Buchs , Suiza ) en 160 mi de ácido picri- co (Merk, Darmstadt , Alemania ) saturado durante 15 minutos en oscuridad. Las muestras se lavaron por inmersión en agua hasta que dejaron de colorear el agua de lavado. Una vez eliminado el colorante sobrante, las muestras se tiñeron durante 30 minutos en oscuridad en una solución de 160 mg de Direct Red 80, { Fl uka Chemika -BioChemika Buchs , Suiza ) y 64 mg de Fast Green , ambos colorantes en 160 mi de ácido pícrico saturado. Se lavaron de nuevo hasta eliminar el colorante sobrante y se procedió a despegar las muestras de los portas mediante el raspado de la muestra con una espátula pequeña. Los cortes asi despegados se introdujeron en diferentes tubos que contenían 3 mi de una solución de NaOH 0,1 N { Quimón , Montpl et &Es teban S . A . , Barcelona , Espa ña ) y Metanol (1:1). Se tomaron alícuotas de los diferentes tubos para su lectura en el espectrofotómetro ( Lambda 2 UV/VIS spectrophotometer , Perkin -Elmer , Norwalk , Estados Unidos) a longitudes de onda de 540 nm y 630 nm utilizándose como blanco una alícuota de la solución de NaOH 0,1 N y Metanol (López de León A. y Roj kind (1985) Histochem Cytochem 33:737-743; Gaudio E. y col. (1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469) .
De acuerdo a los trabajos de Gaudio E. y col. (1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469) se utilizaron las siguientes fórmulas para la obtención de las cantidades de colágeno y de proteina total:
mg Colágeno = absorbancia a 540 nm - absorbancia a 630 nm
37 mg Colágeno/mg proteina total = mg Colágeno mg Colágeno + mg proteínas no colagénicas
Proteínas no colagénicas = absorbancia a 630 nm
3
Tratamiento estadístico de los resultados
Los datos obtenidos en la experimentación in vivo se sometieron a análisis estadístico. La normalidad de las variables cuantitativas se comprobó mediante el ensayo de Shapiro-Wilks.
Debido a que los datos no se ajustaban a una distribución normal se realizó estadística no paramétrica. La comparación entre grupos se hizo mediante la H de Kruskal- Wallis seguida de la comparación de U de Mann-Whitney. Los datos se graficaron mediante cajas representándose la mediana de los datos, linea gruesa dentro de cada caja, junto con el rango intercuartilico, altura de la caja, mientras que los bigotes de cada caja representan las observaciones más altas y más bajas dentro de un determinado rango inter- cuartílico .
La asociación entre variables se estudió mediante la prueba exacta de Fisher. Se realizó una regresión logística para estudiar la independencia de la asociación de estas variables.
Se consideró significativo el valor de P igual o menor de 0,05.
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa SPSS para Windows V 6.1.3.
INHIBICIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD DEL TGFβl
Ensayo de inhibición del crecimiento celular de la línea MV-l-Lu
El TGFβl es una citoquina capaz de inhibir el crecimiento in vi tro de la linea celular MV-l-Lu (Grubeck- Loebenstein B. y col. (1989) J. Clin. Invest. 83:764-770; Brennan FM y col. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:278-285), por lo que esta línea se utilizó para ensayar el efecto bloqueante de los péptidos sobre el TGFβl. Tras diferentes combinaciones de medios, células y timidina se estudió el efecto de distintas concentraciones de TGFβl sobre la incorporación de [metil-3H] timidina, por parte de las célu- las MV-l-Lu en cultivo, hasta determinar las condiciones más adecuadas para el ensayo. Estas condiciones se muestran en la Figura 3.
Una vez determinadas tanto la concentración óptima de células MV-l-Lu (5000 células/pocilio) como la menor con- centración de TGFβl capaz de producir una inhibición de alrededor del 90% (200 pg/ml, Figura 18) se ensayó el efecto inhibitorio de los péptidos sintéticos a la concentración de 200 μg/ml.
Inhibición in vitro de la actividad del TGFβl mediante péptidos sintéticos
Los péptidos sintéticos potencialmente inhibidores de la actividad del TGFβl, elegidos tal como se indica más arriba en la sección: elección de los péptidos a sintetizar (tanto los procedentes de proteínas que se unen al TGFβl como del propio TGFβl) se ensayaron utilizando la linea celular MV-l-Lu. Los péptidos se disolvieron en medio RPMI tamponado, libre de suero de ternera fetal y se procedió como sigue:
Los péptidos pertenecientes a la secuencia del receptor, o complementarios a los picos de hidrofilicidad del TGFβl, se incubaron durante 30 minutos en presencia de esta citoquina y luego se agregaron al cultivo celular. Los péptidos procedentes de la secuencia del TGFβl se añadieron al cultivo celular antes de la adición del TGFβl, para que interaccionaran con los receptores de la superficie celular. Estas incubaciones se realizaron en 100 μl del mismo medio que el utilizado para añadir las células. Los péptidos activos permitieron el crecimiento celular en mayor o menor grado según fuera su capacidad de inhibir al TGFβl.
Inhibición del TGFβl mediante péptidos procedentes del TGFβl
En una primera etapa se sintetizaron péptidos solapados procedentes del TGFβl. Estos péptidos (Tabla 2) se sintetizaron pensando que alguno de ellos podría unirse a los receptores celulares, impidiendo de esta manera la unión del TGFβl natural a estos receptores.
Tabla 2. Péptidos procedentes del TGFβl. Se indica el número del péptido junto a su posición en la secuencia completa, asi como su secuencia de aminoácidos. Por comodidad de síntesis todos los péptidos se sintetizaron con una alanina añadida en el extremo C-terminal que no se indica en la tabla .
Péptido Secuencia
Pl (280-293) AlaLeuAspThrAsnTyrCysPheSerSerThrGluLysAsn 2 (284-297) AsnTyrCysSerSerThrGluLysAsnCysCysValArg
"3 (288-301) SerSerThrGluLysAsnCysCysValArgGlnLeuTyrlle
"^ (294-307) CysCysValArgGlnLeuTyrlleAspPheArgLysAspLeu (298-311) GlnLeuTyrlleAspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrp
°° (302-315) AspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluPro
P ' (306-319) AspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHis
°° (308-321) GlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsn
P" (312-325) IleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGly
PÍO 316-329) LysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyr
Pll 319-333) HisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrlleTrpSerLeu
P12 322-335) PheCysLeuGlyProCysProTyrlleTrpSerLeuAspThr
P13 326-339) ProCysProTyrlleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLys
P14 330-343) IleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeu
P15 335-349) ThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnPro
P16 336-349) GlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnPro
P17 340-353) ValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAla
P18 343-358) LeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCys
P19 344-358) TyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCys
P20 348-360) AsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGln
P21 350-363) GlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGlnAlaLeuGlu
P22 354-367) AlaProCysCysValProGlnAlaLeuGluProLeuProIle
P23 358-371) ValProGlnAlaLeuGluProLeuProIleValTyrTyrVal
P24 364-377) ProLeuProIleValTyrTyrValGlyArgLysProLysVal
HOJA RECTIFICADA (REGLA 91)
ISA/ES p25 ¡368-38i> ValTyrTyrValGlyArgLysProLysValGluGlnLeuSer p26 (3--385) GlyArgLysProLysValGluGlnLeuSerAsnMe lleVal p27 (378_391) GluGlnLeuSerAsnMetlleValArgSerCysLysCysSer
En la Figura 4 se muestra el efecto inhibitorio de los péptidos de la Tabla 6 sobre la actividad del TGFβl. Puesto que el TGFβl inhibe el crecimiento de las células MV-l-Lu, la inhibición de esta citoquina mediante los péptidos conlleva el restablecimiento del crecimiento de las células MV-l-Lu.
Como se puede observar en la Figura 4 el péptido P12, procedente de la secuencia del TGFβl, es el que presenta una mayor actividad inhibitoria del TGFβl. Con el fin de estudiar con más detalle el efecto inhibitorio del péptido P12 se realizó un estudio del efecto de la concentración del péptido sobre la inhibición de la citoquina, el cual se indica a continuación.
Ensayo dosis-respuesta de la inhibición del TGFβl por el péptido P12
Se estudió el efecto de la concentración del péptido P12 sobre la inhibición de la actividad del TGFβl. Debido a que este péptido no fue fácilmente soluble en el medio de ensayo, se prepararon soluciones o suspensiones madre de concentración nominal de péptido (aquella que se hubiera logrado si el péptido se hubiera disuelto completamente) y a partir de ellas se tomaron alícuotas que se filtraron o bien se usaron directamente para los ensayos de inhibición.
En la Figura 5 se estudia el efecto inhibidor de concentraciones nominales de péptido, antes y después de filtrar. Se observa que el péptido P12 filtrado y sin filtrar tiene prácticamente la misma actividad. Una vez obtenidos los resultados con el péptido P12 se decidió alargar el péptido tanto, en el sentido N-terminal como C-terminal y estudiar el efecto sobre su actividad. Además se hicieron modificaciones en su secuencia para me- jorar su solubilidad y estudiar la importancia de las dos Cisteinas de su secuencia sobre la actividad inhibitoria del TGFβl. Los péptidos sintetizados se indican en la Tabla 3.
Tabla 3. Péptidos procedentes de la modificación del péptido P12.
Péptido Secuencia
12(322_335) PheCysLeuGlyProCysProTyrlleTrpSerLeuAspThr
P28,322-3.4) PheCysLeuGlyProCysProTyrlleTrpSerLeuAspThrGlnLysVal
LeuAlaLeuTyr P29(313_335) HisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyr IleTrpSerLeuAspThr
P30 PheSerLeuGlyProCysProTyrlleTrpSerLeuAspThr P31 PheCysLeuGlyProSerProTyrlleTrpSerLeuAspThr P32 PheSerLeuGlyProSerProTyrlleTrpSerLeuAspThr P33 PheCysLeuGlyProCysProTyrlleTrpSerAspAspAsp P34 AspAspAspGlyProCysProTyrlleTrpSerLeuAspThr P35 AspAspAspGlyProCysProTyrlleTrpSerAspAspAsp P36 GlyProCysProTyrlleTrpSerAspAspAsp P37 AspAspAspGlyProCysProTyrlleTrpSer P38 AspGlyProCysProTyrlleTrpSerAsp
En la Figura 6 se muestran los resultados de la inhibición del TGFβl por parte de los péptidos de la Tabla 3.
En la Figura 6 se observa que el péptido P29 es activo. Este péptido engloba al péptido P12 probado anterior- mente y tiene 9 aminoácidos mas hacia el extremo N-terminal (Figura 4). Estudios realizados por Quian SW y col. (1992)
HOJARECTIFICADA (REGLA91)
ISA/ES Proc. Nati. Acad. Sci . 89:6290-6294) y por Burmester JK y col. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci . 90:8628-8632) mediante la utilización de proteínas quiméricas recombmantes identificaron una región del TGFβl necesaria para la actividad de esta citoquina (aminoácidos 40 a 82, en la secuencia del TGFβl maduro) . Se especulo que el peptido P29 (aminoácidos 34 a 56, en la secuencia del TGFβl maduro) al abarcar una zona mayor que el peptiαo P12 (aminoácidos 43 a 56), podría adquirir una estructura tridimensional mas semejante a la estructura del TGFβl en circulación. Por este motivo se utilizó el peptido P29 para ensayos de unión a los receptores celulares, basados en el mareaje por afinidad.
Ensayos de inhibición de la unión del TGFβl a sus receptores por el péptido P29 (mareaje por afinidad)
El péptido P29 procedente de la secuencia del TGFβl, se utilizó en los ensayos de mareaje por afinidad para comprobar su capacidad de inhibición de la unión del TGFβl a sus receptores celulares (Material y Métodos) .
Debido a la diferente actividad de los lotes de 125I-
TGFβl empleados, las concentraciones de péptido utilizadas en los ensayos se ajustaron en función de la concentración del lote 125I-TGFβl utilizado en cada caso. Los resultados de estos ensayos se muestran en las Figuras 7 y 8.
Se realizaron ensayos posteriores para buscar la concentración mínima necesaria para bloquear la unión del 125i- TGFβl a los receptores celulares.
Inhibición del TGFβl mediante péptidos procedentes de la secuencia del receptor de tipo III de rata
Con el propósito de encontrar nuevos péptidos inhibidores de la actividad del TGFβl se sintetizaron peptidos procedentes del receptor tipo III de rata. Algunos péptidos se eligieron en base a zonas de su secuencia que fueron predichas como complementarias a bloques de aminoácidos de la secuencia del TGFβl. Se esperaba que estos péptidos fue- ran capaces de unirse al TGFβl libre, secuestrándolo e impidiendo su unión a los receptores celulares.
Otros péptidos se sintetizaron solapando 10 aminoácidos y cubriendo parte de la zona extracelular del receptor de tipo III (aminoácidos 45 a 410) . Se ha descrito que existe un receptor tipo III soluble que se corresponde con la zona extracelular del receptor, esta zona se corta de la membrana y actúa como un secuestrador del TGFβl en circulación (López Casillas F. y col. (1991) Cell 67:785-795). Estudios posteriores han descrito dos posibles zonas de unión al TGFβl, una de ellas se encuentra en el extremo N- terminal del receptor (López-Casillas y col. (1994) J. Cell Biol. 124:557-568) y la otra se encuentra en la zona más próxima a la membrana, hacia el extremo C-terminal (Fuku- shima D. y col. (1993) J. Biol. Chem. 268:22710-22715; Pepin MC y col. (1995) FEBS Lett 377:368-372). Por estos motivos se sintetizaron péptidos de la zona extracelular de este receptor suponiendo que estos péptidos podrían ser capaces de secuestrar el TGFβl circulante.
En la Tabla 4 se muestran los péptidos sintetizados.
Tabla 4. Péptidos procedentes del receptor tipo III de rata. Se indica el número del péptido y su secuencia. P39 a P65 son péptidos predichos como complementarios al TGFβl y P66 a P138 son péptidos solapados que cubren la región ex- tracelular del receptor. Por comodidad de síntesis todos los péptidos se sintetizaron con una alanina añadida en el extremo C-terminal que no se indica en la tabla. Péptido Secuencia
P39 91-102) AsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysPro
P40 104- 115, ValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrp
P41 109- 120) SerProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGlu
P42 110- 121 ) ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArg
P43 333- 344) TrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSer
P44 428- 435) ProIleValProSerValGlnLeuLeuProAspHis
P45 555- 566) GlyAspGluGlyGluThrAlaProLeuSerArgAla
P46 563 5^ ) LeuSerArgAlaGlyValValValPheAsnCysSer
P47 603 614, LeuPheLeuValProSerProGlyValPheSerVal
P48 605 61c) LeuValProSerProGlyValPheSerValAlaGlu
P49 707 -716) GluLeuThrLeuCysSer rgLysLysGlySerLeu
P50 712 723) Ser rgLysLysGlySerLeuLysLeuProArgCys
P51 717 -726) SerLeuLysLeuProArgCysValThrProAspAsp
P52 722 -733) ArgCysValThrProAspAspAlaCysThrSerLeu
P53 727 -736) AspAspAlaCysThrSerLeuAspAlaThrMetlle
P54 731 -742) ThrSerLeuAspAlaThrMetlleTrpThrMetMet
P55 732 -743) SerLeuAspAlaThrMetlleTrpThrMetMetGln
P56 737 -746; MetlleTrpThrMetMetGlnAsnLysLysThrPhe
P57 742 -752) MetGlnAsnLysLysThrPheThrLysProLeuAla
P58 747 -758) ThrPheThrLysProLeuAlaValValLeuGlnVal
P59 761 -775) LysGluAsnValProSerThrLysAspSerSerProIleProPro
P60 766 -780) SerThrLysAspSerSerProIleProProProProProGlnlle
P61 771 -785) SerProIleProProProProProGlnllePheHisGlyLeuAsp
P62 776 -75C) ProProProGlnllePheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMet
P63 781 -795) PheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMetGlylleAlaPheAla
P64 786 -8CC) ThrLeuThrValMetGlylleAlaPheAlaAlaPheValIleGly
P65 797 -80.) LeuLeuThrGlyAlaLeuTrpTyrlleTyrSerHis
P66 (45- 59) LeuMetGluSerPheThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGly
P67 (50- 64) ThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuPro
P68 (55- 69, CysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuProArgGluValHisVal
P69 (60- 74) ThrThrGlyLeuProArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSer
P70 (65- 79 ArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyPro
P71 (70- 84) LeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArg
P72 (75- 89! ThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHis
P73 (80-94, GlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHisLeuAsnProIleAla
HOJA RECTIFICADA (REGLA 91) ISA/ES P74{85_ 99) GluValThrLeuHisLeuAsnProIleAlaSerValHisThrHis
P75,90_ 104) LeuAsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysProIleVal
P76(95_ 109) SerValHisThrHisHisLysProIleValPheLeuLeuAsnSer
P77(100 -114) HisLysProIleValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuVal
P78(105 -119) PheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThr
P79(110 -124) ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAla
P80(115 -129) TrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeu
P81(120 -134) ArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGly
P82(125. 139) GlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGlySerValValGln
P83(130. 144) PheLeuValSerGluGlySerValValGlnPheProSerGlyAsn
P84(135 149) GlySerValValGlnPheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAla
P85(140 -154) PheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArg
P86(145 -159) PheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArgAsnPheProGlnGlu
P87(150 -164) GluThrGluGluArgAsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuVal
P88(155 -169) AsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLys
P89(160 -174) AsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaVal
P90(165 -179) ArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGlu
P91(170 -184) GluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArg
P92(175 -189) ThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArgAsnlleTyrlleLys
P9o (180 -194) LeuLysIleAlaArgAsnlleTyrlleLysValGlyGluAspGln
P94(185 -199) AsnlleTyrlleLysValGlyGluAspGlnValPheProProThr
P" 3 (190 -201) ValGlyGluAspGlnValPheProProThrCysAsnlleGlyLys
P96(195 -209) ValPheProProThrCysAsnlleGlyLysAsnPheLeuSerLeu " ' (200 -214) CysAsnlleGlyLysAsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGlu
P98(205 -219) AsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLys
P99,21o -224) AsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLysAlaAlaGluGlyCys
P100 ¡215-229) TyrLeuGlnProLysAlaAlaGluGlyCysValLeuProSerGln
P1U1 (22o-234) AlaAlaGluGlyCysValLeuProSerGlnProHisGluLysGlu
P102(2: 5-239) ValLeuProSerGlnProHisGluLysGluValHisIlelleGlu Ó O (230-244) ProHisGluLysGluValHisIlelleGluLeulleThrProSer
P104.235-249, ValHisIlelleGluLeulleThrProSerSerAsnProTyrSer rlUO (240-254) LeuIleThrProSerSerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAsp 110 (265-279) AspProGluValValLysAsnLeuValLeulleLeuLysCysLys
Pll i (270-284) LysAsnLeuValLeulleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrp
P r1 ± 1 ±¿ v. (275-289) IleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrpValIleLysSerPhe
P113,2 0-294) LysSerValAsnTrpValIleLysSerPheAspValLysGlyAsn l ^ (285-299) VallleLysSerPheAspValLysGlyAsnLeuLysValIleAla
Pl ID (290-304) AspValLysGlyAsnLeuLysValIleAlaProAsnSerlleGly
HOJA RECTIFICADA (REGLA 91)
ISA/ES PÍO6 (245-25 ) SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIlelleValAspIle
P107 (250-264) AlaPheGlnValAspIlelleValAspIleArgProAlaGlnGlu
P108 (255_26S! IlelleValAspIleArgProAlaGlnGluAspProGluValVal
P109(260_274¡ ArgProAlaGlnGluAspProGluValValLysAsnLeuValLeu
P116,295_309¡ LeuLysValIleAlaProAsnSerlleGlyPheGlyLysGluSer
P117 (300-31 ) ProAsnSerlleGlyPheGlyLysGluSerGluArgSerMetThr
P118 (305-31s, PheGlyLysGluSerGluArgSerMetThrMetThrLysLeuVal
P119(310_324) GluArgSerMetThrMetThrLysLeuValArgAspAspIlePro
P120,315_329) MetThrLysLeuValArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsn
P121 (320-334) ArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAla
P122 ,325-339) SerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyr
PPl23(33o_344i LeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSer
P124 ,335-349) LeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerTyrThrMetAlaPro
P125,340_354) ArgProValThrSerTyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPhe
P126,345_359) TyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPheHisLeuArgLeuGlu
P127 ,350-36 ) ValAlaAsnArgPheHisLeuArgLeuGluAsnAsnGluGluMet
P128 (355-369) HisLeuArgLeuGluAsnAsnGluGluMetArgAspGluGluVal
P129,360.374) AsnAsnGluGluMetArgAspGluGluValHisThrlleProPro
P130,365_379) ArgAspGluGluValHisThrlleProProGluLeuArglleLeu
P131 (370-38 ) HisThrlleProProGluLeuArglleLeuLeuAspProAspHis
P132(375_389) GluLeuArglleLeuLeuAspProAspHisProProAlaLeuAsp
P133(380_394) LeuAspProAspHisProProAlaLeuAspAsnProLeuPhePro
P134 (385_399) ProProAlaLeuAspAsnProLeuPheProGlyGluGlySerPro
Pl35,39o_4o4) AsnProLeuPheProGlyGluGlySerProAsnGlyGlyLeuPro
P136,395_409) GlyGluGlySerProAsnGlyGlyLeuProPheProPheProAsp
P137 ,400-14) AsnGlyGlyLeuProPheProPheProAspIleProArgArgGly
P138 ,405-19) PheProPheProAspIleProArgArgGlyTrpLysGluGlyGlu
Los péptidos de la Tabla 4 se ensayaron en cuanto a su capacidad de bloquear el TGFβl en el modelo de inhibición de la línea celular MV-l-Lu. Puesto que el TGFβl es capaz de inhibir el crecimiento de esta línea, la inhibición del TGFβl por parte de los péptidos sería capaz de restablecer el crecimiento celular. Estos ensayos se muestran en las Figuras 9 a 12.
Como se puede ver en las Figuras 9 a 12 existen varios péptidos capaces de inhibir en mayor o menor grado el cre-
H0JARECTIFICADA (REGLA91)
ISA/ES cimiento de la linea celular MV-l-Lu, aunque sólo el péptido P54 es capaz de inhibir casi por completo la actividad del TGFβl. Con el fin de realizar un estudio más a fondo de este péptido se realizaron ensayos utilizando diferentes concentraciones de péptido frente a una concentración fija de TGFβl de 200 pg/ml.
Ensayo dosis-respuesta de la inhibición del TGFβl por el péptido P54
Se estudió el efecto de la concentración del péptido P54 sobre la inhibición de la actividad del TGFβl. Debido a la poca solubilidad de este péptido se prepararon soluciones madre de concentración nominal de péptido, tal y como se hizo en el caso del péptido P12, a partir de ellas se tomaron alícuotas que se filtraron o bien se usaron directamente para los ensayos de inhibición.
En la Figura 13 se estudia el efecto inhibidor de concentraciones nominales de péptido, antes y después de filtrar. Se observa que en el filtrado del péptido P54 no hay actividad inhibitoria medible.
Una vez comprobada la capacidad del péptido P54 de inhibir la actividad del TGFβl de una manera dependiente de la dosis utilizada se procedió a sintetizar nuevos pépti- dos, tomando como base la secuencia del P54, con el fin de intentar mejorar la solubilidad y con ello su actividad a dosis más bajas. También se sintetizaron dos péptidos procedentes del receptor de tipo III humano. Uno de estos péptidos (P144) es equivalente al péptido P54. El otro péptido (P145) es similar al péptido P106 del receptor de tipo III de rata que también habla mostrado actividad. Estos nuevos péptidos se indican en la Tabla 5. Tabla 5. Péptidos procedentes de la modificación del péptido P54 (péptidos P139 a P143) y del receptor de tipo III humano (péptidos P144 y P145) .
Péptido Secuencia Procedencia
^->4 (731-742) ThrSer euAspAlaThrMetlleTrpThr etMet Receptor Tipo III Rata P139 ThrSerLeuAspAlaThrMetlleTrpAspAspAsp
P140 AspAspAspAlaThrMetlleTrpThr etMet P141 AspAlaThrMe111eTrpAsp
P142 ThrSerLeuMetlleTrpThrMetMet
P143 ThrSerLeuAspAlaThrThrMetMet
P144 ( 29-742) ThrSerLeuAspAlaSerllelleTrpAlaMet et Receptor Tipo GlnAsn III Humano
P145, SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleThr Receptor Tipo IleAsp III Humano
El ensayo de actividad de los péptidos de la Tabla 5 se indica en la Figura 1 .
Ensayo dosis-respuesta de la inhibición del TGFβl por el péptido P144
Se realizó un ensayo dosis respuesta con el péptido P144 procedente de la secuencia del receptor tipo III humano, con el fin de comprobar si su actividad era dependiente de la concentración (Figura 15) . Se puede ver como la actividad del péptido decae conforme se disminuye la concentración de péptido utilizada en los ensayos.
Ensayos de inhibición de la unión del TGFβl a sus receptores por el péptido P144 (mareaje por afinidad)
El péptido P144 procedente de la secuencia del recep- tor de tipo III humano, se utilizó en los ensayos de marca-
MOJARECTIFICADA(REGLA91)
ISA/ES je por afinidad para comprobar su capacidad de inhibición de la unión del TGFβl a sus receptores celulares (Material y Métodos) .
Debido a la diferente actividad de los lotes de 125i- TGFβl empleados, las concentraciones de péptido utilizadas en los ensayos se ajustaron en función de la concentración del lote 125I-TGFβl utilizado en cada caso. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Figura 15.
Una vez comprobada la inhibición de la unión del TGFβl a sus receptores celulares mediante el péptido P144, se realizó un nuevo ensayo con el fin de titular el péptido P144. Se observó que el péptido perdía su actividad a la concentración de 2xl05 veces la concentración molar de 125i- TGFβl.
Inhibición del TGFβl mediante péptidos procedentes de otras proteínas con capacidad de unirse al TGFβl y predichos como complementarios al TGFβl
En esta serie se sintetizaron los péptidos de la Tabla 6 procedentes de proteínas capaces de unirse al TGFβl.
Tabla 6. Péptidos procedentes de distintas proteínas capaces de unirse al TGFβl (receptor tipo II P146, fetuina P147 a P149, endoglina P150 a P154 y α2-Macroglobulina P155 a P179) . Se indica el número del péptido junto a su posición en la secuencia completa, su secuencia de aminoácidos, así como su procedencia. Por comodidad de síntesis todos los péptidos se sintetizaron con una alanina añadida en el extremo C-terminal que no se indica en la tabla. Péptidos Secuencia Procedencia
P146 (84-101) CysValAlaValTrpArgLysAsnAspGluAsnlleThr Receptor Tipo II
LeuGluThrValCys II P147 ( 14- 32) CysAspPheGlnLeuLeu ysLeuAspGly ysPheSer Fetuina
ValValTyrAlaLysCyε P148 (H _ 32) CysAspPheHisIleLeuLysGlnAspGlyGlnPheArg Fetuina
ValCysHisAlaGlnCys P149 (114-132) CysAspIleHisValLeu ysGlnAspGlyPheSerVal Fetuina
LeuPheThrLysCysAsp P150 (247-261) GluAlaValLeuIleLeuGlnGlyProProTyrValSer Endoglina
TrpLeu P151(289-303) ValAsn euProAspThrArgGlnGlyLeu euGluGlu Endoglina
AlaArg P152 ( 45. 59) LeuAspSerLeuSerPheGlnLeuGlyLeuTyr euSer Endoglina
ProHis P153 ( 81-495) ProSerlleProGluLeuMetThrGln euAspSerCys Endoglina
GlnLeu P154 (479-493) MetSerProSerlleProGlu euMetThrGlnLeuAsp Endoglina
SerCys
P155 (13- 4) euLeuLeuLeuValLeuLeuProThrAspAlaSer CC2 -Macroglobulina P156 (20-31) ProThrAspAlaSerValSerGlyLysProGlnTyr 0C2 -Macroglobulina P157 (44-55) ThrGlu ysGlyCysValLeuLeuSerTyr euAsn 0C2 -Macroglobulina
P158 (i66.177) TyrlleGlnAspPro ysGlyAsnArglleAlaGln CC2 -Macroglobulina
P158 (166-177) TyrlleGlnAspProLysGlyAsnArglleAlaGln 0.2 -Macroglobulina P159 (192-203) PhePro euSerSerGluProPheGlnGlySerTyr CC2 -Macroglobulina P160 (247-258) AsnValSerValCysGlyLeuTyrThrTyrGlyLys α2 -Macroglobulina P161(248-259) ValSerValCysGly euTyrThrTyrGly ysPro 0C2 -Macroglobulina F-L 0_¡ ( co-.fil 1 ValCysGlyLeuTyrThrTyrGly ysProValPro 0C2 -Macroglobulina
P163 (<226677--278) SerlleCysArg ysTyrSerAspAlaSerAspCys CC2 -Macroglobulina
P164 (469. ProCysGlyHisThrGlnThrValGlnAlaHisTyr α2 -Macroglobulina
P165 ,554. AspSerAla ysTyrAspValGluAsnCysLeuAla α2 -Macroglobulina
P167 (790. GlnProPhePheValGluLeuThr etProTyrSer (X2 -Macroglobulina
P168 ,827. GlnLeuGluAlaSerProAlaPhe euAlaValPro α2 -Macroglobulina
P169 „,«. 36) SerValGlnLeuGluAlaSerProAlaPheLeuAla 0C2 -Macroglobulina
P170 ,876-887) Ala euGluSerGlnGlu euCysGlyThrGluVal 2 -Macroglobulina P171(1001.1012 ysSerLysIleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyr 2 -Macroglobulina
HOJA RECTIFICADA (REGLA 91)
ISA/ES P1721005-ιoi6i IleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyrGlnArgGlnLeu C.2 -Macroglobulina P1731062 1073, LysArg ysGluVal euLysSerLeuAsnGluGlu α2 -Macroglobulma P1741193 120 ValGlyHisPheTyrGluProGlnAlaProSerAla 0C2 -Macroglobulina P1751209 i2_0) ThrSerTyrValLeuLeuAlaTyrLeuThrGlnAla α2 -Macroglobulma P1761211 1222 TyrVal eu euAlaTyr euThrAlaGlnProAla α2 -Macroglobulma P177 __s6-ι-.7 ValAlaLeuHisAlaLeuSerLysTyrGlyAlaAla α2 -Macroglobulma P178 123 χ2 3 TyrGlyArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAla 2 -Macroglobulma P179123 1245 ArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThr AlaPheVal (X2 -Macroglobulina
En las Figuras 17 y 18 se indica la actividad innibitoria de los péptidos procedentes de la Tabla 10.
Como puede ooservarse en las Figuras 17 y 18 sólo e_ péptido P150 mostró actividad superior al 50%. Sin embargo, los péptidos P146 y P149 que hablan sido descritos como activos por Demetπou M y col (1996) J Biol Chem 271:12755- 12 61 no resultaron activos en las condiciones utilizadas para este ensayo.
Medición por citometría de flujo del efecto inhibitorio de péptidos sintéticos sobre la unión del TGFβl a sus receptores celulares
Péptidos procedentes cte síntesis anteriores, tanto los que se sintetizaron a partir de la secuencia del TGFήl como del receptor tipo III, se utilizaron para medir, por citometria de flujo, su capacidad inhibitoria de la unión del TGFβl a los receptores celulares. En estos ensayos las células se incuban con el peptido antes de añadir el TGFβl- biotina que se revelara utilizando avidma-FITC (Material y Métodos) . Posteriormente se mide la fluorescencia emitida por la avidma-FITC, que será directamente proporcional a la cantidad de TGFβl unido a las células e inversamente proporcional a la actividad del péptido. En la Figura 19 y
HOJA RECTIFICADA (REGLA 91)
ISA/ES en la Tabla7 se indican los resultados obtenidos con los péptidos más relevantes.
Tabla 7. Comparación de la actividad inhibitoria del TGFβl, de algunos péptidos, medida mediante el bioensayo de inhibición del crecimiento de las células MV-l-Lu1 (concentración de péptido 200 μg/ml) con la inhibición de la unión del TGFβl a sus receptores celulares medida mediante cito- metría de flujo2 (concentración de péptido 420 μg/ml).
Péptidos bioensayo Cysito etría Secuencia (%inhibición) 1 (".inhibición) 2
P29 77,6 92,34 HisGluPro ysGlyTyrHis AlaAsnPheCysLeuGlyPro CysProTyrlleTrpSerLeu AspThr
Pll 40 86 HisAlaAsnPheCysLeuGly ProCysProTyrlleTrpSer Leu
P12 96 77 PheCysLeuGlyProCysPro TyrlleTrpSerLeuAspThr
P18 18,2 6,5 LeuTyrAsnGlnHisAsnPro GlyAlaSerAlaAlaProCys Cys
P54 97 82,3 ThrSerLeuAspAlaThrMet IleTrpThrMetMet
P140 -1,7 69,8 AspAspAspAlaThrMetlie TrpThrMetMet
P142 70 72 ThrSerLeuMetlleTrpThr MetMet
P106 40 91 SerAsnProTyrSerAlaPhe GlnValAspIlelleValAsp He
P145 21 74,35 SerAsnProTyrSerAlaPhe GlnValAspIleThrlleAsp
P144 88 80 T rSerLeuAspAlaSerlle IleTrpAlaMetMetGlnAsn
HOJARECTIFICADA(REGLA91)
ISA/ES P150 64 73 GluAlaValLeuIleLeuGln
GlyProProTyrValSerTrp
Leu
P152 45 68 , 4 LeuAspSerLeuSerPheGln
LeuGlyLeuTyrLeuSerPro
His
INHIBICIÓN IN VIVO DE LA ACTIVIDAD DEL TGFβl
El péptido P144 procedente de la secuencia del receptor tipo III humano, que habla resultado activo en los bio- ensayos de inhibición del crecimiento de la linea celular MV-l-Lu, se utilizó en los ensayos in vivo para estudiar su efecto inhibitorio en la inducción de cirrosis experimental con CC14, en un modelo de ratas.
Modelo de cirrosis experimental en ratas Wistar
En este modelo la cirrosis hepática se induce mediante inhalación de tetracloruro de carbono, durante 11 semanas, dos veces por semana (López Novoa JM y col. (1976) Patología IX:223-240; Camps J. y col. (1987) Gastroenterology 93:498-505) tal y como se indica en Material y Métodos. El péptido P144 se administró de acuerdo a dos protocolos :
1. Protocolo 1 : El péptido se administró en días alternos por vía intraperitoneal durante el proceso de inducción de la cirrosis (11 semanas) . Figuras 20 y 21. 2. Protocolo 2 : El péptido se administró en días alternos por vía intraperitoneal durante 3 semanas, una vez establecida la cirrosis, es decir a las 12 semanas del inicio de la inducción de la cirrosis. Figuras 22 y 23.
La producción de colágeno en ambos protocolos se midió mediante dos técnicas:
HOJARECTIFICADA (REGLA91)
ISA/ES En la Figuras 36 y 38 se indica la producción de colágeno total medida por tinción de cortes de hígado (dos por animal) teñidos con Fas t Green y Direct Red, elución del color y lectura en espectrofotómetro (Material y Métodos) (López de León A. y Roj ind, (1985) Histochem. Cytochem. 33:737-743; Gaudio E. y col. (1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469) .
En las Figuras 21 y 23 se refleja la producción de colágeno medida por análisis de imagen a partir de cortes de hígado teñidos con rojo sirio, utilizando microscopía de luz (Material y Métodos) .
Como se puede ver en la Figura 20 se observan diferencias significativas (P<0,05) entre el grupo de ratas tratadas con el péptido P144 (Ttox) y el grupo de ratas cirróti- cas control (Cix) al estudiar el cociente colágeno vs proteína total. En la Figura 37 las diferencias entre el grupo de ratas tratadas con el péptido P144 (Tto- y el grupo de ratas cirróticas control (Cix) también son significativas (P<0,001) al estudiar el área de fibrosis. Como se puede observar en las figuras 22 y 23, en las que se muestran los resultados de las ratas tratadas una vez establecida la cirrosis, las diferencias entre los grupos de ratas tratadas con el péptido P144 (Tto2) y las cirróticas sin tratar (Ci2) no son significativas cuando se utilizan cualquiera de las dos técnicas de medición de fibrosis .
Las dos técnicas utilizadas para la medición de colágeno se compararon entre si mediante una regresión lineal con el fin de comprobar la aleatoriedad en la elección de los campos a estudio en cada preparación y con ello la validez del análisis de imagen, Figuras 24 y 25.
Como se puede observar en las gráficas 24 y 25 existe una correlación entre ambas técnicas con una R>0,85 en ambos casos, siendo altamente significativa (F< 0,001). Esto confirma que la adquisición de las imágenes a estudio se realizó de forma totalmente aleatoria y con ello la validez de los datos obtenidos mediante el análisis de imagen.
En la figuras 26 y 27 se muestran las imágenes obtenidas por microscopía de luz a partir de preparaciones de hígado teñidas con rojo sirio a un aumento de 10X obtenidas a partir de hígados de las ratas tratadas durante el proceso de inducción de la cirrosis (C^ y Tto .
Las imágenes de la Figura 26 fueron obtenidas sin aplicar ningún tipo de filtro. La Figura 27 muestra las imágenes una vez modificadas para su estudio mediante un software específico. Estas modificaciones consisten en la aplicación de dos filtros, uno de luz polarizada y el otro de luz verde, con el fin de aumentar la calidad de las imágenes y facilitar su estudio de forma automatizada.
En las figuras 26 y 27 se observa que existen diferencias entre las imágenes procedentes de las ratas cirróticas (CÍ-L) y las procedentes de las ratas tratadas con el péptido P144 (Tto:) . Las diferencias de efectividad entre los protocolos 1 y 2 podrían ser debidas a que la producción de TGFβl podría ser mucho menor una vez inducida la cirrosis (protocolo 2) que durante el proceso de inducción de cirrosis con CC14 (protocolo 1), e incluso podría estar en niveles normales, por lo que el efecto del tratamiento con el péptido P144 sería menos notorio en el protocolo 2 que en el protocolo 1.
Cuando se comparan los grupos de ratas cirróticas no tratadas, al final del proceso de inducción de la cirrosis (Cix) con las cirróticas no tratadas, a las 4 semanas de finalizada la inducción (Ci2) se observa que existen diferencias significativas (P=0,016) entre ambos grupos (Figura 28), lo que indicaría que existe una regresión parcial de la cirrosis al eliminar el agente cirrotizante, observación que ha sido publicada por diversos autores (Szende-B y col (1992) In Vivo 6:355-361; Columbano A (1996) Carcinogenesis 17:395-400) .
Estas diferencias de efectividad entre los dos protocolos también podrían ser debidas al propio protocolo ya que los animales del protocolo 2 se trataron sólo durante 3 semanas en dias alternos, mientras que les animales del protocolo 1 se trataron por un periodo más amplio de tiempo (7 semanas, también en dias alternos).
Los resultados obtenidos demuestran que es posible inhibir al TGFβl tanto in vi tro como in vivo mediante péptidos sintéticos procedentes de diferentes proteínas. En un futuro sería de gran interés intentar aumentar la actividad biológica de estos péptidos. Ello podría llevarse a cabo remplazando sistemáticamente cada uno de los aminoácidos de sus secuencias por los 19 restantes. Una vez alcanzado el péptido de mayor actividad convendría preparar mimotopos (McConnell-SJ (1994) Gene 151:115-118; Steward-M (1995) J. Virol. 69:7668-7673) del mismo con el fin de aumentar la vida media en el organismo del agente inhibidor.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Inhibición de la unión del TGFβl a las células MV-l-Lu por el péptido P144, medida por citometría de flu- jo. A, imagen obtenida al analizar las células incubadas con TGFβl biotinilado y reveladas con avidina-FITC . B, imagen obtenida al analizar las células incubadas con avidina- FITC sin previa adición de TGFβl. C, imagen obtenida al analizar las células incubadas con TGFβl previamente incu- bado con el péptido P144 a una concentración de 0,42 μg/μl, el revelado se realizó con avidina-FITC. En abeisas se indica la fluorescencia emitida y en ordenadas el número de células para cada valor de fluorescencia. También se indican los campos correspondientes a las células marcadas con el TGFβl-biotina y avidina-FITC (M2) y a las células no marcadas (MI) .
Figura 2. Esquema representativo del proceso de cirrosis por CC14. Con flechas negras se indica cuando se administró a las ratas dos dosis semanales de CC14 y con flechas negras discontinuas cuando fue una dosis semanal. Las flechas grises indican la administración del péptido P144. A: Controles sanos; B: Controles sanos + P144, B- : con -éptido 70 μg/día; C: Cirróticos; z con salino; C2 con péptido 70 μg/día; D: Cirróticos con CC14 + Fenobarbital ; Oλ y salino; D2 y péptido 70 μg/día.
Figura 3. Efecto del TGFβl sobre el crecimiento de células MV-l-Lu. Las células se cultivaron a una densidad de 5000 células/pocilio a las concentraciones de TGFβl, en pg/ml indicadas. Abcisas: Concentración TGFβl (pg/ml); Ordenadas: c .p .m.
Figura 4. Porcentaje de inhibición del TGFβl (200 pg/ml) por péptidos del TGFβl. Todos los péptidos fueron probados a la concentración de 200 μg/ml. Una inhibición del TGFβl del 100% se corresponde con el crecimiento de las células MV-l-Lu que se obtiene en ausencia de TGFβl.
Figura 5. Porcentaje de inhibición de la actividad del TGFβl (200 pg/ml) en presencia de distintas concentraciones
nominales del péptido P12 filtrado (^ ) y sin filtrar (•) .
Figura 6. Porcentaje de inhibición del TGFβl (200 pg/ml) por péptidos del TGFβl. Todos los péptidos fueron probados a la concentración de 200 μg/ml. Una inhibición del TGFβl
HOJARECTIFICADA(REGLA91)
ISA/ES del 100% se corresponde con el crecimiento de las células MV-l-Lu que se obtiene en ausencia de TGFβl.
Figura 7. Autorradiografía de un ensayo de raarca]e por afinidad de los receptores del TGFβl. Calle Cl : efecto de la incubación de las células con una concentración 0,16 μM de 125TGFβl que se corresponde con una actividad de 0,3μCι (control positivo) Calle C2 : efecto de la premcubación de las células con una concentración de TGFβl no radioactivo 10 veces superior a la de 1 5I -TGFβl (control negativo) . Calle C3 : la premcubación se realizó con el péptido P29 a una concentración 106 veces superior a la concentración molar de 125I -TGFβl. Se puede observar la inhibición de la unión del 125I -TGFβl a los receptores celulares tipo I, II y III tanto por parte del péptido P29 como por el TGFβl no radioactivo.
Figura 8. Autorradiografía de un ensayo de marcare por afinidad de los receptores del TGFβl. Calles Cl a C6 : efec- to de la premcubación de las células MV-l-Lu, con distintas concentraciones del péptido P29 (106, 8xl05, 6xl05, 4xl05, 2xl05, 10s veces la concentración molar de 1 5I -TGFβl respectivamente), previas a la adición del 125I-TGFβl. Calle C7 : efecto de la premcubación de las células MV-l-Lu con TGFβl no marcado (102 veces la concentración molar de 125I- TGFβl) previa a la adición del 125I -TGFβl (control negativo) . Calle C8 : efecto de la incubación de las células MV-l-Lu con una concentración 0,42 μM de 125I -TGFβl que se corresponde con una actividad de 0,4 μCi, sin preincubaciones pre- vías (control positivo) .
Figura 9. Porcentaje de inhibición del TGFβl (200 pg/ml) por péptidos del receptor predichos como complementarios a zonas del TGFβl. Todos los péptidos fueron probados a la concentración de 200 μg/ml. Una inhibición del TGFβl del 100% se corresponde con el crecimiento de las células MV-1- Lu que se obtiene en ausencia de TGFβl.
Figura 10. Porcentaje de inhibición del TGFβl (200 pg/ml) por péptidos solapados procedentes de la región extra- celular del receptor tipo III. Todos los péptidos fueron probados a la concentración de 200 μg/ml. Una inhibición del TGFβl del 100% se corresponde con el crecimiento de las células MV-l-Lu que se obtiene en ausencia de TGFβl.
Figura 11. Porcentaje de inhibición del TGFβl (200 pg/ml) por péptidos solapados procedentes de la región extra- celular del receptor tipo III. Todos los péptidos fueron probados a la concentración de 200 μg/ml. Una inhibición del TGFβl del 100% se corresponde con el crecimiento de las células MV-l-Lu que se obtiene en ausencia de TGFβl.
Figura 12. Porcentaje de inhibición del TGFβl (200 pg/ml) por péptidos solapados procedentes de la región extracelular del receptor tipo III. Todos los péptidos fueron probados a la concentración de 200 μg/ml. Una inhibición del TGFβl del 100% se corresponde con el crecimiento de las cé- lulas MV-l-Lu que se obtiene en ausencia de TGFβl.
Figura 13. Porcentaje de inhibición de la actividad del TGFβl (200 pg/ml) en presencia de distintas concentraciones nominales del péptido P54 filtrado ( ) y sin filtrar (•).
Figura 14. Porcentaje de inhibición del TGFβl (200 pg/ml) por péptidos del receptor procedentes de la modificación del péptido P54 (P139 a P143) y de los péptidos procedentes del receptor de tipo III humano (P144 y P145) . Todos los péptidos fueron probados a la concentración de 200 μg/ml. Una inhibición del TGFβl del 100% se corresponde con el crecimiento de las células MV-l-Lu que se obtiene en ausencia de TGFβl.
Figura 15. Porcentaje de inhibición de la actividad del TGFβl (200 pg/ml) en presencia de distintas concentraciones nominales del péptido P144 sin filtrar.
Figura 16. Autorradiografía de un ensayo de mareaje por afinidad de los receptores del TGFβl. Calle Cl : la preincu- bación se realizó con el péptido P144 a una concentración 106 veces superior a la concentración molar de 125I -TGFβl Calles C2 y C3 : efecto de la preincubación de las células con una concentración de TGFβl no radioactivo 10 veces superior a la de 125I-TGFβl (control negativo). Calle C4 y C5 : efecto de la incubación de las células con una concentración 0,1 μM de 125TGFβl que se corresponde con una actividad de 0,2μCi (control positivo) Se puede observar la inhibición de la unión del 125I -TGFβl a los receptores celulares tanto por parte del péptido P144 como por el TGFβl no radioactivo .
Figura 17. Porcentaje de inhibición del TGFβl (200 pg/ml) por péptidos procedentes del receptor tipo II humano (P146) , de la fetuina (P147 a P149) y de la endoglina (P150 a P154) . Todos los péptidos fueron probados a la concentración de 200 μg/ml. Una inhibición del TGFβl del 100% se corresponde con el crecimiento de las células MV-l-Lu que se obtiene en ausencia de TGFβl. Figura 18. Porcentaje de inhibición del TGFβl (200 pg/ml) por péptidos procedentes de la α2 -Macroglobulina . Todos los péptidos fueron probados a la concentración de 200 μg/ml. Una inhibición del TGFβl del 100% se corresponde con el crecimiento de las células MV-l-Lu que se obtiene en ausencia de TGFβl.
Figura 19. Porcentaje de inhibición de la unión del TGFβl a células MV-l-Lu por diferentes péptidos sintéticos. La inhibición se estudió midiendo el porcentaje de células marcadas (emiten fluorescencia) y sin marcar (no emiten fluorescencia) para cada péptido (Material y Métodos) .
Figura 20. Efecto de la administración del péptido P144 so- bre la síntesis de colágeno durante la inducción de cirrosis experimental con CC14. En ordenadas se indica el cociente colágeno vs proteína total. En abcisas se indican los distintos grupos de ratas: Co= ratas sanas; Co+P144= ratas sanas tratadas con el péptido P144; Tto1= ratas sometidas a inducción de cirrosis con CC14 y a las que se les suministra el péptido P144 en días alternos durante este periodo y Cix= ratas sometidas a inducción de cirrosis con CC14 durante 11 semanas y que no son tratados con el péptido P14 .
Figura 21. Efecto de la administración del péptido P144 sobre la síntesis de colágeno durante la inducción de cirrosis experimental con CC14. En ordenadas se indica el cociente entre el área de fibrosis y el área total en preparaciones de tejido teñidas con rojo sirio. En abcisas se indican los distintos grupos de ratas: Co= ratas sanas; Co+P144= ratas sanas tratadas con el péptido; Ttox= ratas sometidas a inducción de cirrosis con CC14 y a las que se les suministra el péptido P144 en días alternos durante este periodo y Cix= ratas sometidas a inducción de cirrosis con CC14 durante 11 semanas y que no son tratados con el péptido P144. Figura 22. Efecto de la administración del péptido P144 sobre la síntesis de colágeno una vez inducida la cirrosis con CC14. En ordenadas se indica el cociente colágeno vs proteína total. En abcisas se indican los distintos grupos de ratas: Co= ratas sanas; Co+P144= ratas sanas tratadas con el péptido; Tto2= ratas sometidas a inducción de cirrosis con CC14 y a las que se les suministra el péptido P144 en días alternos al final de este periodo y Ci2= ratas sometidas a inducción de cirrosis con CC14 durante 11 semanas y que no son tratados con el péptido P144.
Figura 23. Efecto de la administración del péptido P144 sobre la síntesis de colágeno una vez inducida la cirrosis con CC14. En ordenadas se indica el cociente entre el área de fibrosis y el área total en preparaciones de tejido. En abcisas se indican los distintos grupos de ratas: Co= ratas sanas; Co+P144= ratas sanas tratadas con el péptido; Tto2= ratas sometidas a inducción de cirrosis con CC14 y a las que se les suministra el péptido P144 en días alternos al final de este periodo y Ci2= ratas sometidas a inducción de cirrosis con CC14 durante 11 semanas y que no son tratados con el péptido P144.
Figura 24. Comparación entre los datos sobre cantidad de colágeno y área de fibrosis, obtenidos mediante las dos técnicas utilizadas. En el eje de abcisas se indican los valores del cociente entre el área de fibrosis y el área total, obtenidos mediante el análisis de imagen. En ordena- das se indican los valores del cociente entre los μg de colágeno y los mg de proteína total, obtenidos mediante el análisis por espectrofotometría de cortes de hígado teñidos con "Direct Red y Fast Green". Se indica la R2. (F <0,001). Figura 25. Comparación entre los datos sobre cantidad de colágeno y área de fibrosis, obtenidos mediante las dos técnicas utilizadas para el estudio de las muestras al final del protocolo 2. En el eje de abcisas se indican los valores del cociente entre el área de fibrosis y el área total, obtenidos mediante el análisis de imagen. En ordenadas se indican los valores del cociente entre los μg de colágeno y los mg de proteína total, obtenidos mediante el análisis por espectrofotometría de cortes de hígado teñidos con "Direct Red y Fast Green". Se indica la R2. (F <0,001).
Figura 26. Imágenes representativas de los 24 campos obtenidos por microscopía de luz (10X) a partir de preparaciones de hígados de ratas teñidas con rojo sirio. Ratas cirróticas (Cix) al final de la inducción de cirrosis con CC14 y cirróticas tratadas (Ttox) con el péptido P144 durante el proceso de inducción de la cirrosis con CC14. Se tomaron diferentes campos a partir de las preparaciones procedentes de cada animal (R= rata y C= campo) .
Figura 27. Imágenes representativas de los 24 campos obtenidos por microscopía de luz (10X) a partir de preparaciones de hígados de ratas teñidas con rojo sirio. Ratas cirróticas (Cix) al final de la inducción de cirrosis con CC14 y cirróticas tratadas (Tto con el péptido P144 durante el proceso de inducción de la cirrosis con CC14. Se tomaron diferentes campos a partir de las preparaciones procedentes de cada animal (R= rata y C= campo) . Se ha utilizado luz polarizada y filtro verde con el fin de resaltar las fibras de colágeno.
Figura 28. Comparación entre los dos grupos de ratas cirróticas no tratadas. Cix son ratas cirróticas al final de las 12 semanas de inducción de la cirrosis con CC14, Ci2 son ratas cirróticas a las 4 semanas del final del proceso de inducción de la cirrosis. P=0,016. Ordenadas: Área fibrosis/Area total .

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Péptidos antagonistas de la unión de TGFβl a sus receptores en el organismo, caracterizados por presentar secuencias de aminoácidos parciales idénticas o similares a las del propio TGFβl y/o sus receptores.
2.- Péptido activo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:l.
3.- Péptido activo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2.
4. - Péptido activo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoáci- dos SEQ ID NO: 3.
5.- Péptido activo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: .
6.- Péptido activo de acuerdo con la reivindica- ción 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5.
7.- Péptido activo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6.
8.- Péptido activo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.
9.- Péptido activo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoáci- dos SEQ ID NO: 8.
10.- Péptido activo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9.
11.- Peptido activo de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por poseer la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:10.
12.- Mimotopos de cualquiera de los peptidos activos de las reivindicaciones 1 a 11 caracterizados por presentar un efecto antagonista similar a los mismos y una mayor vida media en el organismo que estos.
13.- Procedimiento de utilización de al menos uno de los peptidos activos de las reivindicaciones 1 a 11 y/o al menos uno de sus mimotopos para fabricar una composición de aplicación en enfermedades hepáticas.
14.- Procedimiento de utilización de al menos un ADN que codifique para al menos uno de los peptidos activos de las reivindicaciones 1 a 11 para fabricar una composi- ción de aplicación en enfermedades hepáticas que incluya opcionalmente al menos uno de los mimotopos de dichos pép- tidos activos.
15.- Procedimiento de utilización de al menos un sistema de expresión recombmante que codifique para al menos uno de los peptidos activos de las reivindicaciones 1 a 11 para fabricar una composición de aplicación en enfermedades hepáticas que incluya opcionalmente al menos uno de los mimotopos de dichos peptidos activos.
16.- Procedimiento de acuerdo con la reivindica- cion 15, caracterizado porque el sistema recombinante es un adenovirus defectivo.
17.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizado porque el sistema recombinante es un plásmido .
18.- Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 13 a 17 de aplicación a la fibrosis hepática.
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