WO2010089443A2 - FORMULACIONES FARMACÉUTICAS DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE TGF- β1 - Google Patents

FORMULACIONES FARMACÉUTICAS DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE TGF- β1 Download PDF

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Definitions

  • W02008 / 013928 (Biogen IDEC MA Inc., The Trustees of the University of Pennsylvania) refers to methods for the treatment of cancer, which include administration to a subject in need of treatment of a combination therapy comprising (a) administration of a TGF- ⁇ inhibitor and (b) a vector comprising an isolated polynucleotide encoding an interferon polypeptide.
  • the TGF- ⁇ inhibitor includes soluble human TGFRIII polypeptides.
  • Solubilizing agents such as cyclodextrins or other solubilizing agents known to those skilled in the art, can be used as pharmaceutical excipients for the release of therapeutic compounds.
  • this patent publication does not disclose actual formulations comprising a TGF- ⁇ inhibitor and a cyclodextrin.
  • An objective of the present invention is to provide emulsions of TGF- ⁇ 1 inhibitor peptides with a higher drug loading per composition.
  • the derivatives may include aliphatic esters of the carboxyl groups, amides of the caboxyl groups by reaction with ammonia or with primary or secondary amines, N-acyl derivatives or free amino groups of the amino acid residues formed with acyl groups (by for example, alkanoyl or carboxylic aroyl groups), or 0-acyl derivatives of free hydroxyl group (eg, seryl or threonyl residues) formed with acyl groups.
  • Such derivatives may also include, for example, polyethylene glycol side chains, which can mask antigenic sites and extend the residence of the molecule in body fluids.
  • peptide molecules may include conservative or non-conservative alterations in the amino acid sequence that result in silent changes that preserve the functionality of the molecule including, for example, deletions, additions and substitutions. Such altered molecules may be desirable when they provide certain advantages in their use.
  • conservative substitutions would involve substituting one or more amino acids in the corresponding peptide sequence for another amino acid that has similar polarity and hydropicity / hydrophilicity characteristics that give rise to a functionally equivalent molecule.
  • the preferable cyclodextrins for complexing with TGF- ⁇ 1 inhibitor peptides are ⁇ -cyclodextrins and ⁇ ⁇ cyclodextrins. More preferably they are the hydrophilic derivatives of ⁇ -cyclodextrins and ⁇ -cyclodextrins, such as 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, 2-hydroxyethyl- ⁇ -cyclodextrin, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, or sulfated ⁇ -cyclodextrin and sulfated ⁇ - ⁇ -cyclodextrin.
  • the TGF- ⁇ 1 inhibitor peptide is present in the complex or of the invention in a weight ratio of about 0.004: 1 to about 0.024: 1 relative to the cyclodextrin (0.004- 0.024: 1). In another embodiment, the TGF- ⁇ 1 inhibitor peptide is present in the complex or of the invention in a weight ratio of about 0.002: 1 to about 0.018: 1 relative to cyclodextrin (0.002-0, 018: 1 ).
  • the range of feasible intervals between the TGF- ⁇ 1 inhibitor peptide and the cyclodextrin may depend on other excipients present in the emulsion formulations of any of the realizations described in the present invention.
  • a “therapeutically effective amount” in this context is an amount sufficient to act prophylactically against, stabilize, or treat a disease or pathological condition mediated by TGF- ⁇ 1 in subjects suffering from said disease or pathological condition.
  • said particular diseases or pathological conditions mediated by TGF- ⁇ l include the diseases ibropr ol ife rat i va s.
  • f ibroprolifrative diseases include renal disorders associated with the unregulated activity of TGF- ⁇ 1 and an excess fibrosis that includes glomeruloneph ritis (GN), such as mesangial prolific energetic GN, immune GN and crescent GN.
  • GN glomeruloneph ritis
  • Other renal pathologies include diabetic nephropathy, renal interstitial fibrosis, renal fibrosis in transplant patients who are administered cyclosporins and nephropathy associated with the human immunodeficiency virus (HIV).
  • HAV human immunodeficiency virus
  • Table 3 summarizes the different formulations tested. Table 3: Composition of initial formulations to be tested for silicone emulsion.

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Abstract

La presente invención se refiere a un complejo que comprende un péptido inhibidor de TGF-β1 y una ciclodextrina o un derivado de la misma. También se proporciona una emulsión de un péptido inhibidor de TGF-β1 que comprende cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona. Se describen procedimientos para la preparación de dicho complejo y dicha emulsión, así como su uso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o estado patológico mediado por TGF-β1.

Description

FORMULACIONES FARMACÉUTICAS DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE TGF- βl
Campo de la invención
El campo técnico de la invención es el campo farmacéutico, en particular las formulaciones galénicas.
Antecedentes de la invención
El factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) representa una familia de proteínas, TGF-βl, TGF-β2, y TGF-β3, que son moduladores pleiotrópicos del crecimiento y la diferenciación celular, el desarrollo embrionario y óseo, la formación de matrices extracelulares, hematopoyesis, respuestas inmunitarias e inflamatorias (Roberts y Sporn Handbook of Experimental Pharmacology (1990) 95: 419-58; Massagué et al. Ann Rev CeIl Biol (1990) 6: 597-646) . Otros miembros de esta superfamilia incluyen activina, inhibina, proteína morfogénica ósea, y sustancia inhibidora mulleriana. El TGF-β inicia un mecanismo de señalización intracelular que conduce en última instancia a la expresión de genes que regulan el ciclo celular, las respuestas proliferativas de control, o que están relacionados con proteínas de la matriz extracelular que median en la señalización externa-interna celular, la adhesión celular, la migración, y la comunicación intercelular.
Los miembros de la superfamilia de TGF-β regulan de manera crítica muchos procesos diferentes en los sistemas cardiovascular y reproductor femenino. Los miembros de la superfamilia de TGF-β se expresan de manera abundante en el medio óseo y regulan una serie de importantes procesos óseos. Se ha estudiado ampliamente la contribución de la señalización de TGF-β al cáncer humano y a enfermedades del tejido conectivo. La señalización de la superfamilia de TGF-β también es crítica durante la embriogénesi s desde las etapas iniciales de la formación de la blástula, durante la gastrulación, y a lo largo de las múltiples etapas del desarrollo de órganos. Los miembros de la superfamilia de TGF-β se están continuamente relacionando con otras enfermedades, tales como trastornos neurológicos , otosclerosis, psoriasis, cirrosis biliar, y asma infantil. El rango de enfermedades en las que los miembros de la superfamilia de TGF-β tienen una función probablemente continuará creciendo (Gordon y Blobe Biochimica et Biophysica Acta (2008) 1782:197- 228) .
Debido al papel omnipresente de la superfamilia de TGF-β en varios procesos patológicos, se han ideado diferentes moléculas antagonistas para neutralizar la actividad de TGF-βl, incluyendo moléculas pequeñas, asi como oligonucleótidos antisentido y anticuerpos.
WO2000/31135 (Proyecto de Biomedicina Cima, S. L.) se refiere a antagonistas de péptidos de la unión de TGF-βl al receptor de TGF-βl de tipo III o endoglina.
WO2007/048857 (Proyecto de Biomedicina Cima, S. L) se refiere al uso de un péptido que inhibe TGF-βl seleccionado entre: péptido P144, cuya secuencia corresponde con la SEQ ID NO: 1, péptido pl7 cuya secuencia corresponde con la SEQ ID NO: 2, un péptido que tiene por lo menos un 90% de homología con la misma, o fragmentos de los anteriores, en la preparación de un agente modulador de la respuesta inmune.
Debido al desarrollo clínico de péptidos inhibidores de TGF-βl, existe la creciente necesidad de formulaciones galénicas para la administración de estos antagonistas al cuerpo.
En este aspecto, US2007/0207965 proporciona un método para el tratamiento de la fibrosis de la piel con un péptido que inhibe TGF-βl, y composiciones adecuadas para su administración. El método incluye, en particular, el uso del péptido P144. Para la administración de este péptido, se suministran también emulsiones estables con dimetilsulfóxido como agente solubilizante (la emulsión 965 o E.965) . La fase lipofílica comprende dimeticona 350 y un aceite mineral. Dicha emulsión se puede cargar con hasta 300 μg de péptido por mi, y sus condiciones de almacenamiento requieren temperaturas alrededor de 5°C. Los fármacos de naturaleza peptídica son normalmente difíciles de formular. En particular, el péptido inhibidor de TGF-βl P144 es insoluble en agua, polietilenglicol 400 (PEG400) , etanol, gl i ce ro l , copol ímero en bl oque de p o 1 i o x i e t i 1 e n o- polioxipropileno (Pluronic® F68) , tetra-hidrof urano, hexano, dime t i 1 f o rmami da , di el o r orne taño , polivinil pirrolidona
(Plasdone®) , propilenglicol , Gantrez® S97, deoxicolato sódico, por nombrar algunos disolventes.
Las ciclodextrinas con conocidas en la técnica como un medio plausible para solubilizar compuestos terapéuticos. Las ciclodextrinas son oligosacáridos cíclicos formados por seis o más unidades de α-D-glucopiranósido que forman una estructura molecular rígida cónica con interiores huecos de volúmenes específicos. Son capaces de formar complejos aceptor-huésped con ciertas moléculas hidrofóbicas, que modifican las propiedades físicas y químicas de la molécula huésped, principalmente en cuanto a la solubilidad en agua.
En este aspecto, W02008 / 013928 (Biogen IDEC MA Inc . , The Trustees of the University of Pennsylvania) se refiere a métodos para el tratamiento del cáncer, que comprenden la administración a un sujeto con necesidad del tratamiento de una terapia de combinación que comprende (a) la administración de un inhibidor de TGF-β y (b) un vector que comprende un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido interferón. El inhibidor de TGF-β incluye polipéptidos TGFRIII humanos solubles . Se pueden utilizar agentes solubilizantes, tales como ciclodextrinas u otros agentes solubilizantes conocidos por técnicos del sector, como excipientes farmacéuticos para la liberación de los compuestos terapéuticos . Sin embargo, esta publicación de patente no da a conocer formulaciones reales que comprendan un inhibidor de TGF-β y una ciclodextrina .
WO2003/048323 (Bristol-Myers Squibb Company) se refiere a polipéptidos para el diagnóstico, el tratamiento y la prevención de artritis reumatoide y estados patológicos relacionados, donde dicho polipéptido asociado con la artritis reumatoide tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 95% idéntica con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 48. La SEQ ID NO: 48 corresponde a la secuencia de aminoácidos del Receptor del Factor de Crecimiento Transformante Beta Tipo III Humano (No. de acceso Q03167) . El compuesto o compuestos de la invención se pueden formular con diluyentes de disolución rápida, tales como manitol, lactosa, sacarosa y/o ciclodext riñas . De manera similar, no está demostrada la actividad eficaz de las ciclodextrinas para solubilizar los polipéptidos TGFBRIII.
La formación de complejos de ciclodextrina depende de las afinidades geométricas y estructurales entre la ciclodextrina y las moléculas huésped, asi como del volumen de la cavidad interna de las ciclodextrinas. Por tanto, no todas las moléculas son capaces de formar complejos con ciclodextrinas o con tipos particulares de las mismas. Asi pues, aún queda por demostrar si los péptidos inhibidores de TGF-βl pueden formar complejos con ciclodextrinas, y qué tipos de ciclodextrinas son adecuadas para la formación de estas cápsulas moleculares.
No siendo suficiente la solubilización de péptidos inhibidores de TGF-βl, los formuladores aún necesitan cumplir el objetivo final de proporcionar formulaciones finales que puedan liberar de manera eficaz los compuestos activos al organismo. En este aspecto, las formulaciones basadas en lipidos, como emulsiones, parecen ser un sistema de vehículos prometedores para la liberación de fármacos poco solubles. Las emulsiones son una mezcla íntima de dos líquidos no completamente miscibles, como aceite y agua, donde uno de los líquidos en forma de gotas finas se dispersa en el otro normalmente con la ayuda de un emulsionante o tensioactivo .
La selección de un tensioactivo adecuado para preparar emulsiones suficientemente estables para una aplicación particular no es predecible o un ejercicio de rutina. Además, en el caso particular de preparar mayores dosis de péptidos inhibidores de TGF-βl, deben considerarse otros parámetros, tales como la reducción de la cristalización y precipitación del fármaco .
En un esfuerzo exhaustivo por mej orar las propiedades f i s i coquími ca s de pépt i do s i nhibi do re s de TGF-βl, particularmente en cuanto a la solubilidad, y con la misión de mejorar la formulación de la emulsión 965 (E.965) , los inventores de la presente invención han obtenido de manera satisfactoria complejos de ciclodextrina con los péptidos inhibidores de TGF-βl de interés, y han preparado una emulsión que comprende estos complejos de ciclodextrinas y péptidos inhibidores de TGF-βl y el tensioactivo cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona (Abil® EM90) , que cumple uno o más de los objetivos mencionados a continuación.
Compendio de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación que mejore la solubilidad en agua de péptidos inhibidores de TGF-βl.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación que mejore la solubilidad en agua de péptidos inhibidores de TGF-βl, lo cual evita o disminuye la cantidad de disolventes orgánicos.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación segura de péptidos inhibidores de TGF-βl que utilice excipientes farmacéuticamente aceptables.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar emulsiones de péptidos inhibidores de TGF-βl que sean suficientemente estables con una estabilidad de almacenamiento o química adecuada .
Un objetivo de la presente invención es proporcionar emulsiones de péptidos inhibidores de TGF-βl sin cristales o con un contenido despreciable de cristales. Un objetivo de la presente invención es proporcionar emulsiones de péptidos inhibidores de TGF-βl que sean suficientemente homogéneas .
Un objetivo de la presente invención es proporcionar emulsiones de péptidos inhibidores de TGF-βl con una mayor carga de fármaco por composición.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar emulsiones de péptidos inhibidores de TGF-βl con un grado de partícula fino (de la partícula interna) .
Un objetivo de la presente invención es proporcionar emulsiones de péptidos inhibidores de TGF-βl que se puedan preparar en condiciones suaves, por ejemplo, utilizando menos calor.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar emulsiones de péptidos inhibidores de TGF-βl que sean adecuadas para la producción industrial a gran escala.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación que permita la acción local tópica de péptidos inhibidores de TGF-βl sin ser absorbidos o mínimamente absorbidos .
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una formulación de péptidos inhibidores de TGF-βl que admita diferentes vías de administración al cuerpo, por ejemplo, vía oral, parenteral o tópica.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar emulsiones de péptidos inhibidores de TGF-βl fácilmente extendibles .
Un objetivo de la presente invención es proporcionar emulsiones de péptidos inhibidores de TGF-βl de apariencia agradable sin ser grasientas. En un aspecto, la presente invención se refiere a un complejo que comprende un péptido inhibidor de TGF-βl y una ciclodextrina o un derivado de la misma, donde
• el péptido inhibidor de TGF-βl se selecciona entre un péptido que tiene por lo menos un 70% de identidad en la secuencia con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-23, sus sales, derivados funcionales, variantes, análogos y fragmentos de los mismos con capacidad de inhibir TGF-βl; y
• la ciclodextrina o un derivado de la misma se selecciona entre una β-ciclodextrina y una γ-ciclodextrina .
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende dicho complejo, en la que el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en una cantidad terapéuticamente eficaz, y la ciclodextrina es una ciclodextrina farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, dicha formulación farmacéutica comprende además cetil PEG/PPG- 10/1 dimeticona.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una emulsión de un péptido inhibidor de TGF-βl caracterizada porque dicha emulsión comprende cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende dicha emulsión de un péptido inhibidor de TGF-βl, en la que dicho péptido inhibidor de TGF-βl está presente en una cantidad terapéuticamente eficaz.
En una realización particular de dicha emulsión, dicho péptido inhibidor de TGF-βl forma un complejo con una ciclodextrina o un derivado de la misma, y dicha ciclodextrina es una ciclodextrina farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de dicho complejo que comprende un péptido inhibidor de TGF-βl y una ciclodextrina o un derivado de la misma, comprendiendo dicho procedimiento la mezcla del péptido inhibidor de TGF-βl con una solución acuosa que comprende la ciclodextrina o un derivado de la misma. El producto obtenido por este procedimiento constituye un aspecto adicional de esta invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de dicha emulsión del péptido inhibidor de TGF-βl que comprende cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona, comprendiendo dicho procedimiento: a) la preparación de (i) un complejo mediante la mezcla del péptido inhibidor de TGF-βl con una solución acuosa que comprende la ciclodextrina o un derivado de la misma; y de (ii) una fase lipofilica que comprende cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona; y b) la mezcla de dicho complejo en dicha fase lipofilica.
El producto obtenido por este procedimiento constituye un aspecto adicional de esta invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de dicho complejo, dicha emulsión del péptido inhibidor de TGF-βl, o cualquiera de dichas formulaciones farmacéuticas, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o estado patológico mediados por TGF-βl.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad o estado patológico mediados por TGF-βl en un mamífero, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad eficaz de dicho complejo, o de dicha emulsión del péptido inhibidor de TGF-βl, o de cualquiera de dichas formulaciones farmacéuticas.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 : Imágenes microscópicas de la emulsión silicónica con 100 μg/g, lote A-2, a la izquierda con luz visible y a la derecha con luz ultravioleta y procesada posteriormente para facilitar la vi sualización en blanco y negro (conversión a formato de color CMYK; selección del canal o componente negro; inversión de grises, que es lo que se presenta en la imagen) . Figura 2: Imágenes microscópicas de la emulsión silicónica blanco, lote A-3, a la izquierda con luz visible y a la derecha con luz ultravioleta y procesada tal como se ha mencionado previamente .
Figura 3: Imágenes microscópicas de la emulsión silicónica, lote A-IO, a la izquierda con luz visible y a la derecha con luz ultravioleta y procesada tal como se ha mencionado previamente (concentración de P144: 1000 μg/g) .
Figura 4: Imágenes microscópicas de la emulsión silicónica, lote A-16, a la izquierda con luz visible y a la derecha con luz ultravioleta y procesada tal como se ha mencionado previamente (concentración de P144: 1000 μg/g) .
Figura 5: Imágenes microscópicas de la emulsión silicónica, lote
A-18, a la izquierda con luz visible y a la derecha con luz ultravioleta y procesada tal como se ha mencionado previamente
(concentración de P144: 700 μg/g) . Marcados por flechas están los cristales de P144.
Figura 6: Imágenes microscópicas de la emulsión silicónica con una concentración de P144 de 1100 μg/g, lote A-28, a la izquierda con luz visible y a la derecha con luz ultravioleta. Marcados por flechas están los cristales de P144.
Figura 7: Imágenes microscópicas de la emulsión silicónica con una concentración de P144 de 800 μg/g, lote A-30, a la izquierda con luz visible y a la derecha con luz ultravioleta y procesada.
Figura 8: Fotografía de la emulsión de P144 denominada ESD600.
Figuras 9-16 : Medición de la capacidad de expansión de la emulsión de P144 (ESD600) [Ejemplo 6, apartado 2.2. ] ; para ello, se procedió al trazado del contorno de un portaobjetos en papel milimetrado (Figura 9) y al trazado de las diagonales (Figura 10) ; a continuación, el portaobjetos inferior se coloca coincidiendo con el trazado de su contorno (Figura 11) y se coloca la muestra de emulsión de P144 (ESD600) en el punto de intersección de las diagonales (Figura 12) . Seguidamente, el portaobjetos superior se coloca sobre el portaobjetos inferior que contiene la muestra de emulsión (Figura 13) y se mide el diámetro del circulo formado por la emulsión como resultado del peso del portaobjetos superior colocado (Figura 14); a continuación, se coloca un peso conocido sobre la muestra, en la intersección de las diagonales (Figura 15) y se miden los diámetros siguiendo las diagonales trazadas (Figura 16) .
Figura 17: Representación del incremento de superficie de la emulsión P144 (ESD600) en función del peso aplicado.
Figura 18: Determinación de la fase externa de la emulsión P144 (ESD600) utilizando el método de dilución.
Figura 19: Determinación de la fase externa de la emulsión P144 (ESD600) utilizando el método de dilución.
Figura 20: Determinación de la fase externa de la emulsión P144 (ESD600) utilizando el método de coloración.
Figura 21: Cantidad de P144 en el receptor de la celda de Franz . ES-O: Emulsión Silicónica ESD600[0] control; ES-100: Emulsión Silicónica ESD600 con 100 μg P144/g (ESD600 [I00] ) • Los datos representan la media ± desviación típica (DT) (n = 4 para ES-O y n = 8 para ES-100) .
Figura 22: Comparativa de la cuantificación de la cantidad de P144 en las diferentes regiones de la piel de oreja de cerdo.
Cada columna representa el valor medio de la concentración de
P144 retenido en la sección de piel, expresada como miligramos de P144/cm3 de piel + DT (n = 8) . CD-100: Emulsión E.965 con 100 μg P144/g (E .965 [i00] ) ; ES-100: Emulsión silicónica ESD600[i00] con 100 μg P144/g.
Figura 23: Cuantificación de la cantidad de P144 en las diferentes regiones de la piel de oreja de cerdo. Cada columna representa el valor medio de la concentración de P144 retenido en la sección de piel, expresada como miligramos de P144/cm3 de piel + DT (n = 8) . CD-IOO: Emulsión 965 con 100 μg P144/g
(E.965[ioo]) ; ES-100: Emulsión silicónica ESD600[i00] con 100 μg P144/g.
Figura 24: Representación de la cantidad teórica de P144 en los distintos cortes realizados. El 100% se alcanzaría cuando todo el fármaco hubiera pasado de la preparación semisólida a la piel (piel de cerdo: 176 mm2 x 1 mm de profundidad) . CD-100: Emulsión E.965 con 100 μg P144/g (E .965[i00] ) ; ES-100: Emulsión silicónica ESD6OO[ioo] con 100 μg P144/g.
Descripción detallada de la invención En un aspecto, la presente invención se refiere a un complejo, en adelante "complejo de la invención", que comprende un péptido inhibidor de TGF-βl y una ciclodextrina o un derivado de la misma, en el que
• el péptido inhibidor de TGF-βl se selecciona entre un péptido que tiene por lo menos un 70% de identidad en la secuencia con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-23, sus sales, derivados funcionales, variantes, análogos y fragmentos de los mismos con capacidad de inhibir TGF-βl; y
• la ciclodextrina o un derivado de la misma se selecciona entre una β-ciclodextrina y una γ-ciclodextrina .
El término "complejo" se refiere a una estructura en la que una o más moléculas de ciclodextrina (el "aceptor") forman una cavidad en la que se sitúan una o más moléculas de un segundo compuesto (el "huésped") . Tal como se utiliza en la presente invención, el segundo compuesto de refiere a un péptido inhibidor de TGF-βl. Los términos complejo y encapsulación molecular se pueden utilizar indistintamente.
El término "péptido inhibidor de TGF-βl" se refiere a una molécula que tiene la capacidad de inhibir una función biológica de TGF-βl mediante la interacción con la forma activa de TGF-βl, particularmente la isoforma 1 de TGF-beta con el número de acceso AAAL2764 o NP000651. Aunque los inhibidores de la presente invención se caracterizan por su capacidad de interaccionar con TGF-βl, podrían interaccionar adicionalmente con las otras isoformas en mamíferos (TGF-β2 y β3) . Esta actividad inhibe la interacción T G F-beta con los correspondientes receptores de la superfamilia, como los receptores de tipo I, tales como quinasas de tipo activina ALKl, ALK2 , ALK5; receptores tipo II, tales como receptor de TGF-β de tipo II (TβRII) ; co-receptores , tales como endoglina y cripto . Adicionalmente, los inhibidores pueden también interaccionar con los receptores del tipo I como ALK3, ALK4 , ALK6, ALK7; receptores del tipo II como ActRII, ActRIIb, BMPRII, MISRII, y TβRII; co-receptores como RGMa, RGMb, y hemo juvelina; pseudo- receptores como BAMBI; componentes de señalización, tales como cordina, folistatina, leftyl, nogina, esclerostina; y otros miembros de la ruta de transducción de la señal de TGF-β o miembros compartidos por la ruta de transducción de la señal de TGF-β y otra ruta.
Estas moléculas son de naturaleza peptídica, lo que significa que comprenden α-aminoácidos unidos por un enlace amida, es decir, el enlace peptídico. El término "péptido" no debe limitarse a cadenas de aminoácidos cortas, puede incluir cadenas de más de 50 aminoácidos de longitud. Por tanto, el término péptido, tal como se utiliza en la presente invención, abarca también polipéptidos y proteínas.
En la presente invención, el péptido inhibidor de TGF-βl se selecciona preferiblemente de un péptido que tiene por lo menos un 70%, ventajosamente al menos un 80%, o, preferentemente, al menos un 90% de identidad en la secuencia con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-23 tal como se representan en la siguiente Tabla 1. Tabla 1
Figure imgf000014_0001
Los péptidos inhibidores de TGF-βl se pueden obtener de una serie de fuentes celulares que sintetizan estos péptidos incluyendo, por ejemplo, células transfectadas con moléculas de ADN recombinantes capaces de dirigir la síntesis o secreción de los péptidos. Alternativamente, los péptidos inhibidores de TGF- βl se pueden sintetizar mediante métodos sintéticos químicos, incluyendo, pero sin limitación, la síntesis de péptidos en fase sólida. Los péptidos están también disponibles comercialmente, por ejemplo, P144 es suministrado por Sigma-Genosys, Ltd. (Cambridge, Reino Unido) .
Tal como se conoce en la técnica, "identidad en la secuencia" entre dos (poli) péptidos o proteínas se determina comparando la secuencia de aminoácidos de un (poli) péptido con la secuencia de un segundo (poli ) péptido . Tal como se describe en la presente invención, para saber si un (poli ) péptido concreto es por lo menos aproximadamente un 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% idéntico a otro (poli) péptido se puede determinar utilizando métodos y programas o software informático conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitación, el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group) o el paquete GCG (GAP versión 8, Genetics Computer Group, Estados Unidos) . BESTFIT utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981) ) , para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. El paquete GCG utiliza penalizaciones estándar para proteínas: valoración de un espacio 3,00, valoración de la longitud 0,100 y la Matriz descrita en Gribskov y Brugess, Nucí. Acids Res. (1986) 14(16), 6745-6763.
En una realización particular, el péptido inhibidor de TGF-βl es un péptido seleccionado del grupo de péptidos cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 1-23, o una sal, derivado funcional, variante, análogo o fragmento del mismo con capacidad de inhibir TGF-βl. Así, en una realización particular, el péptido inhibidor de TGF-βl es el péptido cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 1, o en la SEQ ID NO: 2, o en la SEQ ID NO: 3, o en la SEQ ID NO: 4, o en la SEQ ID NO: 5, o en la SEQ ID NO: 6, o en la SEQ ID NO: 7, o en la SEQ ID NO: 8, o en la SEQ ID NO: 9, o en la SEQ ID NO: 10, o en la SEQ ID NO: 11, o en la SEQ ID NO: 12, o en la SEQ ID NO: 13, o en la SEQ ID NO: 14, o en la SEQ ID NO: 15, o en la SEQ ID NO: 16, o en la SEQ ID NO: 17, o en la SEQ ID NO: 18, o en la SEQ ID NO: 19, o en la SEQ ID NO: 20, o en la SEQ ID NO: 21, o en la SEQ ID NO: 22, o en la SEQ ID NO: 23, o una sal, derivado funcional, variante, análogo o fragmento del mismo con capacidad de inhibir TGF- βl .
En otra realización particular, el péptido inhibidor de TGF-βl se selecciona entre un péptido que tiene por lo menos un 70%, ventajosamente al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, de identidad en la secuencia con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-23, o una sal, derivado funcional, variante, análogo o fragmento del mismo con capacidad de inhibir TGF-βl. Asi, en una realización particular, el péptido inhibidor de TGF-βl es un péptido cuya secuencia de aminoácidos tiene por lo menos un 70%, ventajosamente al menos un 80%, preferentemente al menos un 90%, de identidad en la secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1, o en la SEQ ID NO: 2, o en la SEQ ID NO: 3, o en la SEQ ID NO: 4, o en la SEQ ID NO: 5, o en la SEQ ID NO: 6, o en la SEQ ID NO: 7, o en la SEQ ID NO: 8, o en la SEQ ID NO: 9, o en la SEQ ID NO: 10, o en la SEQ ID NO: 11, o en la SEQ ID NO: 12, o en la SEQ ID NO: 13, o en la SEQ ID NO: 14, o en la SEQ ID NO: 15, o en la SEQ ID NO: 16, o en la SEQ ID NO: 17, o en la SEQ ID NO: 18, o en la SEQ ID NO: 19, o en la SEQ ID NO: 20, o en la SEQ ID NO: 21, o en la SEQ ID NO: 22, o en la SEQ ID NO: 23, o una sal, derivado funcional, variante, análogo o fragmento del mismo con capacidad de inhibir TGF-βl.
El término "sales" se refiere en la presente invención a sales de grupos carboxilo y a sales de adición de ácido de grupos amino de los péptidos inhibidores de TGF-βl. Las sales de un grupo carboxilo se pueden formar mediante medios conocidos en la técnica e incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, amonio, hierro o zinc, y similares, y sales con bases orgánicas como las formadas, por ejemplo, con aminas, tales como t rietanol amina , arginina, lisina, piperidina, procaina, y similares. Las sales de adición de ácido incluyen, por ejemplo, sales con ácidos minerales, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo, ácido acético o ácido oxálico. Naturalmente, cualquiera de dichas sales debe mantener la actividad biológica del péptido inhibidor de TGF-βl. Para uso terapéutico, las sales de péptidos inhibidores de TGF-βl son aquellas en las que el contra-ión es farmacéuticamente aceptable. Las sales no farmacéuticamente aceptables también están comprendidas en el ámbito de la presente invención, ya que se pueden utilizar en la producción de productos finales farmacéuticamente aceptables.
"Derivados funcionales", tal como se utiliza en la presente invención, cubre derivados que se pueden preparar a partir de los grupos funcionales que aparecen como cadenas laterales en los residuos o los grupos N o C-terminal, mediante medios conocidos en la técnica, y se incluyen en la presente invención, siempre y cuando permanezcan farmacéuticamente estables, es decir, no destruyan la actividad biológica de los péptidos tal como se ha descrito anteriormente, es decir, la capacidad de unirse al correspondiente receptor e iniciar la señalización del receptor, y no confieran propiedades tóxicas a las composiciones que los contienen. Los derivados pueden tener grupos químicos, tales como residuos carbohidrato o fosfato, siempre y cuando dicho derivado mantenga la actividad biológica del péptido y permanezca farmacéuticamente aceptable.
Por ejemplo, los derivados pueden incluir esteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos caboxilo mediante la reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados N-acílicos o grupos amino libres de los residuos de aminoácidos formados con grupos acilo (por ejemplo, grupos alcanoílo o carbocílico aroílo) , o derivados 0-acílicos de grupo hidroxilo libre (por ejemplo, de residuos serilo o treonilo) formados con grupos acilo. Dichos derivados también pueden incluir, por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar sitios antigénicos y extienden la residencia de la molécula en fluidos del organismo.
Una "variante" según la presente invención se refiere a una molécula que es sustancialmente similar a cualquiera de los péptidos completos definidos anteriormente o un fragmento de los mismos . Los péptidos variantes se pueden preparar convenientemente mediante síntesis química directa del péptido variante utilizando métodos conocidos en la técnica. Naturalmente, dicha variante tendría una actividad de unión al receptor y de iniciación de señal similar a los correspondientes péptidos inhibidores de TGF-βl.
Las variaciones en la estructura primaria del péptido, así como las variaciones en niveles más elevados de organización estructural, por ejemplo, variación en el tipo de enlaces covalentes que unen los residuos de aminoácidos o la adición de grupos a los residuos terminales del péptido, se encuentran dentro del ámbito de la invención. Además, las moléculas peptídicas pueden incluir alteraciones conservativas o no conservativas en la secuencia de aminoácidos que dan lugar a cambios silenciosos que conservan la funcionalidad de la molécula incluyendo, por ejemplo, eliminaciones, adiciones y sustituciones. Dichas moléculas alteradas pueden ser deseables cuando proporcionan ciertas ventajas en su uso. Tal como se utiliza en la presente invención, las sustituciones conservativas implicarían la sustitución de uno o más aminoácidos en la secuencia del correspondiente péptido por otro aminoácido que tiene una polaridad y características de hidrof obicidad/hidrof ilicidad similares que dan lugar a una molécula funcionalmente equivalente. Dichas sustituciones conservativas incluyen, pero sin limitación, sustituciones en los siguientes grupos de aminoácidos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; usina, arginina; f enilalanina, tirosina; y metionina, norleucina.
Las variantes de las secuencias de aminoácidos del péptido definido anteriormente se pueden preparar mediante mutaciones en los ADN que codifican los derivados sintetizados . Dichas variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones, inserciones o sustituciones de residuos en la secuencia de aminoácidos. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución también puede conducir a la construcción final, con la condición de que la construcción final posea la actividad deseada . Obviamente, las mutaciones que se realizarán en el ADN que codifica el péptido variante no deben alterar el marco de lectura y, preferiblemente, no crearán regiones complementarias que podrían producir una estructura de ARNm secundario.
A nivel genético, estas variantes se preparan normalmente mediante mutagénesis dirigida de sitio ( " s i t e-directed mutagénesis" ) de nucleótidos en el ADN que codifica la molécula peptídica, produciendo de este modo el ADN que codifica la variante y, a continuación, expresando el ADN en un cultivo de células recombinantes . Las variantes mostrarán habitualmente la misma actividad biológica cualitativa que el péptido no variante .
Un "análogo" de los péptidos definidos anteriormente, según la presente invención, se refiere a una molécula no natural, que es sustancialmente similar a las moléculas completas o un fragmento activo de las mismas. Dicho análogo mostraría la misma actividad que los correspondientes péptidos inhibidores de TGF-βl.
Un "fragmento" según la presente invención se refiere a cualquier subgrupo de las moléculas, es decir, un péptido más corto, que mantiene la actividad biológica deseada, por ejemplo, la capacidad de inhibir TGF-βl. Los fragmentos se pueden preparar fácilmente mediante la eliminación de aminoácidos de cualquier extremo de la molécula y ensayar el resultado por sus propiedades como antagonista receptor. Las proteasas para eliminar un aminoácido cada vez del extremo N-terminal o C- terminal de un polipéptido son conocidas en la técnica.
La actividad biológica deseada del péptido inhibidor de TGF-βl
(e.g. la capacidad de inhibir TGF-βl) se puede determinar mediante cualquier bioensayo convencional adecuado para medir la actividad de TGF-βl, por ejemplo mediante los ensayos descritos por Meager Journal of Immunological Methods (1991) 141: 1-14. Entre estos métodos, el ensayo de inhibición del crecimiento de células Mv-I-Lu es particularmente adecuado. También se proporciona una descripción del ensayo de células Mv-I-Lu en WO2005/019244. Preferiblemente, el péptido inhibidor de TGF-βl de la presente invención tiene una actividad inhibidora del 20% o superior en el ensayo de inhibición del crecimiento de células Mv-I-Lu. Más preferiblemente, el péptido inhibidor de TGF-βl de la presente invención tiene una actividad inhibidora de por lo menos el 50% en el ensayo de inhibición del crecimiento de células Mv-I-Lu.
El término "ciclodextrina", tal como se utiliza en la presente invención, incluye cualquiera de las ciclodextrinas conocidas, tales como ciclodextrinas no sustituidas que contienen de seis a doce unidades de glucosa, especialmente, α-ciclodextrina, β- ciclodextrina, γ-ciclodextrina, sus derivados, y mezclas de las mismas. La α-ciclodextrina consiste en seis unidades de glucosa, la β-ciclodextrina consiste en siete unidades de glucosa, y la γ-ciclodextrina consiste en ocho unidades de glucosa, dispuestas en anillos con forma de rosquilla.
El término "derivado de ciclodextrina", tal como se utiliza en esta descripción, incluye cualquier ciclodextrina que presenta, al menos, un grupo hidroxilo terminal modificado. La modificación química de las ciclodextrinas puede alterar sus propiedades físico-químicas, mejorando la solubilidad, estabilidad y controlando la actividad química de las moléculas con las que están unidas (moléculas huésped) . Se ha descrito la incorporación, mediante reacción de los grupos hidroxilo (OH) de las ciclodextrinas, de grupos alquilo, arilo, carboxialquilo, cianoalquilo, hidroxialquilo, sulfo-alquilo , amino, azido, heterociclilo, acetilo, benzoílo, succinilo, y otros grupos que contienen fósforo, azufre, etc. [Robyt (1998) "Essentials of carbohidrate chemistry", Ed. Charles R. Cantor, Springer Advanced Text in Chemistry] .
Las ciclodextrinas preferibles para formar complejos con los péptidos inhibidores de TGF-βl son β-ciclodextrinas y γ~ ciclodextrinas. Más preferiblemente son los derivados hidrofílicos de β-ciclodextrinas y γ-ciclodextrinas, tales como 2 -hidroxipropil- β-ciclodextrina, 2 -hidroxietil-γ- ciclodextrina, 2-hidroxipropil-γ-ciclodextrina, o β-ciclodextrina sulfatada y β-γ-ciclodextrina sulfatada. Ejemplos ilustrativos de derivados de β-ciclodextrinas incluyen, sin limitación, β-ciclodextrina mono- o poli- (Ci-C6) alquiladas, tal como dimetil-β-ciclodextrina o heptakis (2 , 6-di-0-metil) -β-ciclodextrina (DIMEB) , trimetil-β- ciclodextrina o heptakis (2, 3, 6-tri-0-metil) -β-ciclodextrina
(TRIMEB) , β-ciclodextrina metilada aleatoria (RM-β-CD) ; β- ciclodextrina mono- o poli- (Ci-C6) hidroxi alquiladas, tal como hidroxietil-β-c iclodextrina , 2 -hidroxipropil- β-ciclodextrina (HP-β-CD) , h i dr ox ibu t i 1-β-ciclodextrina; β-ciclodextrinas carboxi (Ci-C6) al qui l ada s , tal e s como c a r b o x i m e t i 1-β- ciclodextrina, carboxietil-β-ciclodextrina; β-ciclodextrinas (Ci- C6) alquilcarboniladas , tales como acetil-β-ciclodextrina; β- ciclodextrina mono-, tetra-, o hepta-sustituida; sulfoalquil éter ci clodext riñas (SAE-CD) , tales como sulf obutiléter ciclodextrina (SBECD) ; maltosil-β-c i c 1 o de x t r i n a ; ( 2- carboximetoxi) propil- β-ciclodextrina, etc .
Las ciclodextrinas y derivados de las mismas para su uso en la presente invención están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Sigma-Aldrich . También se pueden sintetizar según los métodos conocidos por el experto en la materia.
La cantidad de péptido inhibidor de TGF-βl presente en el complejo de la invención puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realización particular de la presente invención, el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en el complejo de la invención en una proporción en peso de aproximadamente 0, 002:1 hasta aproximadamente 0, 024 : 1 en relación a la ciclodextrina (0,002-0, 024:1) . En otra realización particular, el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en el complej o de la invención en una proporción en peso de aproximadamente 0, 004:1 hasta aproximadamente 0, 018: 1 en relación a la ciclodextrina (0,004-0,018:1) . En otra realización particular, el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en el complej o de la invención en una proporción en peso de aproximadamente 0, 004 : 1 hasta aproximadamente 0, 024 : 1 en relación a la ciclodextrina (0, 004-0,024:1) . En otra realización particular, el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en el complej o de la invención en una proporción en peso de aproximadamente 0, 002 : 1 hasta aproximadamente 0, 018 : 1 en relación a la ciclodextrina (0,002-0, 018 : 1 ) . El rango de intervalos factibles entre el péptido inhibidor de TGF-βl y la ciclodextrina puede depender de otros excipientes presentes en las formulaciones de la emulsión de cualquiera de las real i zacione s de s cri tas en l a pre s ente i nvención. Preferiblemente, el complejo de la invención comprende el péptido inhibidor de TGF-βl de SEQ ID NO: 6 e hidroxipropil- beta-ciclodextrina (HP-β-CD) . Más preferiblemente, el complejo de la invención comprende el péptido inhibidor de TGF-βl de SEQ ID NO: 6 y HP-β-CD en una proporción en peso de aproximadamente 0,004:1 a aproximadamente 0,018:1 en relación a la ciclodextrina (0, 004-0,018:1) . Incluso más preferiblemente, el complejo de la invención comprende el péptido inhibidor de TGF-βl de SEQ ID NO: 6 y H P-β-CD en una proporción en peso de aproximadamente 0, 018:1.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una formulación farmacéutica, en adelante "formulación farmacéutica [1] de la invención", que comprende un complejo de la invención, en el que el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en una cantidad terapéuticamente eficaz y la ciclodextrina es una ciclodextrina farmacéuticamente aceptable.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" en este contexto es una cantidad suficiente para actuar profilácticamente contra, estabilizar, o tratar una enfermedad o estado patológico mediados por TGF-βl en sujetos que padecen dicha enfermedad o estado patológico.
La cantidad terapéuticamente eficaz de péptido inhibidor de TGF- βl puede estar comprendida en el intervalo de desde 0,01 mg a 50 g por día, desde 0,02 mg a 40 g por día, desde 0,05 mg a 30 g por día, desde 0, 1 mg a 20 g por día, desde 0, 2 mg a 10 g por día, desde 0,5 mg a 5 g por día, desde 1 mg a 3 g por día, desde 2 mg a 2 g por día, desde 5 mg a 1,5 g por día, desde 10 mg a 1 g por día, desde 10 mg a 500 mg por día.
El término "farmacéuticamente aceptable" aplicado a una ciclodextrina en el contexto de la presente invención significa que no tiene un efecto perjudicial persistente en la salud del sujeto en tratamiento. La aceptabilidad farmacéutica de una ciclodextrina depende, entre otros factores, del compuesto de ciclodextrina específico en cuestión, de su concentración en la composición administrada, y de la vía de administración. Por ejemplo, el uso de β-ciclodextrina como un excipiente en composiciones intravenosas o parenterales está limitado por efectos hemolíticos y nefrotóxicos, pero es generalmente no tóxico cuando se administra oralmente.
En una realización particular, la formulación farmacéutica [1] de la invención, que comprende un complejo de la invención, comprende además cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una emulsión, en adelante "emulsión de la invención", de un péptido inhibidor de TGF-βl caracterizada porque dicha emulsión comprende cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona.
Cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona, ABIL® EM 90, es un emulsionante o tensioactivo no iónico con base de silicona con un valor aproximado de HLB (equilibrio hidrof í lico-lipof í lico ) de 5. Cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona está disponible comercialmente en Degussa.
Por tanto, la emulsión de la invención es una emulsión de agua en aceite (w/o) que comprende gotas sustancialmente uniformes y esféricas - la fase hidrofílica - dispersadas en un medio continuo - la fase lipofílica. La fase hidrofílica comprende el péptido inhibidor de TGF-βl complejado con una β-ciclodextrina o con una γ-ciclodextrina. La fase lipofílica comprende cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona entre otros excipientes.
La emulsión de la invención se caracteriza, en general, por su estabilidad termodinámica y por un tamaño de partícula promedio comprendido en el intervalo de las mieras, es decir, un diámetro comprendido entre aproximadamente 0,5 y 20 μm, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 μm y 10 μm, más preferiblemente entre 1 y 10 μm. El tamaño de partícula promedio depende, entre otros factores, de la velocidad de mezcla con el medio acuoso.
La fase lipofílica de la emulsión de la invención puede comprender otros tensioactivos además del cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona, con la condición de que el sistema de tensioactivos utilizado posea un valor HLB global comprendido entre 0 y 8 en base al sistema HLB. No obstante, las composiciones de tensioactivos que comprenden PEG/PPG-10/1 dimeticona y uno o más tensioactivos adicionales con cualquier valor de HLB y capaces de dispersar emulsiones w/o también son adecuadas para las emulsiones de la invención. La composición de tensioactivos puede incluir por tanto uno o más tensioactivos que tienen un valor de HLB superior a 8, o de naturaleza más hidrofílica, siempre y cuando la combinación final de tensioactivos con PEG/PPG-10/1 dimeticona sea capaz de dispersar una emulsión w/o; o el valor de HLB global del sistema de tensioactivos sea por lo menos inferior a 8. Para calcular el valor final de HLB de la composición de tensioactivos, se puede utilizar el método de Griffin que permite además el cálculo de las cantidades relativas de los tensioactivos necesarios para producir formulaciones físicamente estables para combinaciones agua/aceite particulares.
En una realización particular, la presente invención se refiere a una emulsión de la invención, en la que el péptido inhibidor de TGF-βl se selecciona entre un péptido que tiene por lo menos un 70%, ventajosamente al menos un 80%, o preferentemente al menos un 90% de identidad en la secuencia con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-23. Ejemplos ilustrativos de emulsiones de la invención incluyen aquéllas en las que el péptido inhibidor de TGF-βl forma un complejo con una ciclodextrina o un derivado de la misma. Realizaciones particulares se refieren a emulsiones de la invención, en la que el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en una proporción en peso de aproximadamente 0, 002 : 1 hasta aproximadamente 0, 024 : 1 en relación a la ciclodextrina (0, 002-0,024:1) , o en una proporción en peso de aproximadamente 0, 004:1 hasta aproximadamente 0,024:1 (0, 004-0, 024 :1) , o en una proporción en peso de aproximadamente 0, 002:1 hasta aproximadamente 0, 018:1 (0,002-0, 018 :1) , o en una proporción en peso de aproximadamente 0, 004 : 1 hasta aproximadamente 0, 018 : 1 (0, 004-0,018:1) . El rango de intervalos factibles entre el péptido inhibidor de TGF-βl y la ciclodextrina puede depender de otros excipientes presentes en las formulaciones de la emulsión de la invención.
Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a una formulación farmacéutica, en adelante "formulación farmacéutica [2] de la invención", que comprende una emulsión de la invención, en la que el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en una cantidad terapéuticamente eficaz , y la ciclodextrina es una ciclodextrina farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un complejo de la invención, comprendiendo dicho procedimiento la mezcla del péptido inhibidor de TGF-βl con una solución acuosa que comprende la ciclodextrina o un derivado de la misma . El producto (complejo de la invención) obtenido mediante dicho procedimiento constituye un aspecto adicional de la presente invención .
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una emulsión de la invención, en adelante "procedimiento para la preparación de una emulsión de la invención", comprendiendo dicho procedimiento:
a) la preparación de: (i) un complejo mediante la mezcla de un péptido inhibidor de TGF-βl con una solución acuosa que comprende la ciclodextrina o un derivado de la misma; y de (ii) una fase lipofílica que comprende cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona; y
b) la mezcla del complejo sobre la fase lipofílica.
En una realización particular, en el procedimiento para la preparación de una emulsión de la invención, antes de la etapa b) , el complejo y la fase lipofílica se calientan a una temperatura comprendida entre 15°C y 700C, preferiblemente a una temperatura entre 200C y 500C, más preferiblemente a una temperatura entre 25°C y 35°C.
El producto (emulsión de la invención) obtenido mediante dicho procedimiento para la preparación de una emulsión de la invención, constituye un aspecto adicional de la presente invención .
Las diversas emulsiones de la invención se preparan en general pesando por separado los componentes de cada fase de la emulsión (fases acuosa y oleosa) en recipientes de acero inoxidable de capacidad adecuada. A continuación, cada fase se calienta en un baño adecuado con control termostático a una temperatura comprendida entre 15°C y 700C, preferiblemente a una temperatura entre 200C y 500C, más preferiblemente a una temperatura entre 25°C y 35°C. El recipiente que comprende la fase acuosa se puede recubrir para evitar pérdidas por evaporación. La fase oleosa se calienta hasta obtener una fusión homogénea. Preferiblemente, ambas fases muestran una apariencia homogénea clara a temperaturas entre 25°C y 700C. Posteriormente, se agita la fase oleosa y la fase acuosa se vierte poco a poco sobre la fase oleosa. La emulsión se mantiene en agitación durante 30-40 minutos. Al final del proceso, la emulsión se encuentra a temperatura ambiente. La etapa final es la maduración de la emulsión. Esta etapa es de duración variable, generalmente entre 48 y 72 horas, es decir, un tiempo suficiente para verificar su estabilidad.
A las emulsiones de la invención se las pueden añadir una serie de excipientes utilizados normalmente en el sector farmacéutico. Estos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser agentes conservantes, emolientes, agentes antiespumantes, antioxidantes, tampones, pigmentos, agentes colorantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de recubrimiento, agentes granulantes, desintegrantes, deslizantes, lubricantes, materiales de matriz convencionales, agentes complej antes , absorbentes, sustancias de carga. Se pueden utilizar para los fines habituales y en cantidades típicas sin afectar de forma adversa a las propiedades de las composiciones. Las formas de dosificación de los productos proporcionados por la presente invención pueden contener también otras sustancias terapéuticamente valiosas.
En la Tabla 2 se recogen las formulaciones más preferidas para su uso en la invención, incluyendo las descripciones genéricas de los compuestos utilizados en la formulación, las funciones de los mismos , los intervalos preferidos y las cantidades utilizadas para un ejemplo ilustrativo de estos compuestos.
Tabla 2
Figure imgf000027_0001
^proporción peso/peso (p/p) ; c.s.p.: cantidad suficiente para Por tanto, en una realización particular, la presente invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende un péptido inhibidor de TGF-βl en una cantidad de 0,01% a 1% p/p, una β-ciclodextrina o una γ-ciclodextrina en una cantidad de 1% a 10% p/p, cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona en una cantidad de 0,5% a 6% p/p, un conservante (e.g., un paraben, tal como metilparaben, propilparaben, etc.) en una cantidad de 0,005% a 0,6% p/p, una silicona en una cantidad de 3% a 20% p/p, un aceite mineral en una cantidad de 10% a 40% p/p, y agua en cantidad suficiente hasta 100%.
Las emulsiones de la presente invención se pueden administrar a un sujeto por cualquier vía de administración adecuada, por ejemplo, de forma tópica, o como un pulverizador bucal o nasal, de forma oftálmica, etc.
El complejo de la invención que comprende un péptido inhibidor de TGF-βl y una ciclodextrina o un derivado de la misma, en el que • el péptido inhibidor de TGF-βl se selecciona entre un péptido que tiene por lo menos un 70% de identidad en la secuencia con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-23, sus sales, derivados funcionales, variantes, análogos y fragmentos de los mismos con actividad inhibidora de TGF-βl; y
• la ciclodextrina o un derivado de la misma se selecciona entre una β-ciclodextrina y una γ-ciclodextrina; se puede administrar a un sujeto por cualquier vía de administración adecuada, por ejemplo, por vía oral, rectal, parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, o subcutánea, etc. , por vía int r aci s t ernal , int r avagi nal , intraperitoneal , intravesical, por vía tópica, por vía oronasal o pulmonar, por ejemplo, como un pulverizador bucal o nasal, por vía oftálmica, etc.
Las formas de dosificación unitaria adecuadas que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, por ejemplo, cápsulas duras de gelatina, cápsulas blandas de gelatina, comprimidos, comprimidos oblongos, comprimidos con recubrimiento entérico, cápsulas duras de gelatina con recubrimiento entérico, cápsulas blandas de gelatina con recubrimiento entérico, pastillas azucaradas, líquidos orales, jarabes, pulverizadores, supositorios, etc.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un complejo de la invención, o de una emulsión de la invención, o de una formulación farmacéutica [1] de la invención, o de una formulación farmacéutica [2] de la invención, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o estado patológico mediado por TGF-βl.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un complejo de la invención, o una emulsión de la invención, o una formulación farmacéutica [1] de la invención, o una formulación farmacéutica [2] de la invención, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o estado patológico mediado por TGF-βl.
Adicionalmente, la presente invención proporciona un método de tratamiento de una enfermedad o estado patológico mediado por TGF-βl en un mamífero en necesidad de tratamiento, comprendiendo dicho método la administración a dicho mamífero en necesidad de tratamiento de una cantidad eficaz de un complejo de la invención, o de una emulsión de la invención, o de una formulación farmacéutica [1] de la invención o de una formulación farmacéutica [2] de la invención.
El término "una enfermedad o estado patológico mediados por TGF- βl" incluye enfermedades cardiovasculares, tales como telangiectasia hemorrágica hereditaria (síndrome de Rendu-Osler- Weber) , enfermedades de la aorta, tales como el síndrome de Loeys-Di e t z , síndrome de aneurismas aórticos torácicos familiares, y síndrome de tortuosidad arterial, hipertensión pulmonar primaria e hipertensión pulmonar familiar, pre- eclampsia, a t e r o s c 1 e r o s i s , restenosis, hipertensión, cardiomiopatía hipertrófica/insuficiencia cardiaca congestiva; enfermedades del tejido conectivo, tales como síndrome de Marfan y trastornos del tipo Marfan, enfermedades fibróticas; trastornos esqueléticos y musculares, tales como enfermedad de Camurati-Engelmann , f ibrodi splasia osificante progresiva, condrodisplasias de tipo Hunter-Thompson y Grebe, osteoporosis, esclerosteosis y enfermedad de Van Buchem, braquidactilia y sinf alangismo , y distrofia muscular de Duchenne; trastornos reproductivos, tales como insuficiencia ovárica prematura, y síndrome del conducto mülleriano persistente; síndromes de cáncer hereditario, tales como síndrome de poliposis juvenil, cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, y síndromes de Bannayan-Riley-Ruvalcaba y Cowden; cáncer esporádico, tal como cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, y cáncer de próstata; trastornos del desarrollo, tales como paladar hendido y situs inversus y situs ambigús, etc.
En una realización particular, dichas enfermedades o estados patológicos particulares mediados por TGF-βl incluyen las enfermedades f ibropr ol i f e rat i va s . Específicamente, las enfermedades f ibroprolif erativas incluyen trastornos renales asociados con la actividad no regulada de TGF-βl y una fibrosis en exceso que incluye glomerulonef ritis (GN) , tales como GN prolif erativa mesangial, GN inmune y GN crescéntica. Otras patologías renales incluyen la nefropatía diabética, la fibrosis intersticial renal, la fibrosis renal en pacientes con transplante a los que se administran ciclosporinas y nefropatía asociada con el virus de la inmunodef iciencia humana (VIH) . Los trastornos vasculares del colágeno incluyen la esclerosis sistémica progresiva, polimiositis, esclerodermia, dermatomiositis, fascitis eosinof ílica, morfea o los asociados con la aparición del síndrome de Raynaud. Las fibrosis pulmonares resultantes de la excesiva actividad de TGF-βl incluyen el síndrome de dificultad respiratoria adulta, la fibrosis pulmonar idiopática y la fibrosis pulmonar intersticial frecuentemente asociada con trastornos autoinmunes, tales como el lupus eritematoso sistémico y la esclerodermia, el contacto químico o alergias . Otro trastorno autoinmune asociado con características f ibroprolif erativas es la artritis reumatoide. En una realización particular, dicha enfermedad o estado patológico mediado por TGF-βl se selecciona entre fibrosis hepática, fibrosis pulmonar, fibrosis corneal y fibrosis del daño peritoneal (e.g. , fibrosis del daño peritoneal inducido por diálisis) .
Los miembros de la superfamilia de TGF-β se están relacionando continuamente con otras enfermedades . Por ejemplo, se han observado alteraciones en la expresión de TGF-βl en varios trastornos neurológicos que incluyen autismo, esquizofrenia, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple y enfermedad de Alzheimer, mientras que se altera la expresión de activina en la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson. Los polimorfismos TGFBl también se asocian con otosclerosis, una pérdida progresiva de audición que resulta de un aumento en la remodelación de la cápsula ótica, asi como en la psoriasis, la cirrosis biliar y el asma infantil.
Algunas enfermedades o estados patológicos mediados por TGF-βl incluyen queloides, cicatrices hipertróficas, tales como aquellas resultantes de una intervención quirúrgica o lesión, quemaduras químicas o térmicas causadas por calor o frío, fibrosis de la piel asociada con el transplante de médula ósea, morfea, esclerodermia y enfermedades similares, tales como acroqueratoelas toido s i s ; atrofoderma de Pasini y Pierini; síndrome CREST; dermatitis artefacta; esclerodermia difusa; fascitis eosinof í lica ; enfermedad injerto contra huésped; esclerodermia por queloide; lichen esclerosus; esclerodermia lineal; esclerodermia sistémica limitada; displasia mandibuloacral ; cambios en la piel asociados con mieloma; dermopatía fibrosante nefrogénica; síndrome del solapamiento; síndrome de Parry-Romberg; porfiria cutánea tarda; progeria; cambios en la piel del síndrome de polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, proteínas monoclonales y cambios en la piel o POEMS; pseudoesclerodermia ; esclerodermia de Buschke; escleromixedema; vitíligo; síndrome de Werner, acné, celulitis, síndrome de Dupuytren, enfermedad de Peyronie, arrugas y, en general, cualquier lesión o patología de la piel que pasa a través de una etapa con fibrosis o un aumento en la producción y/o activación de TGF-βl, así como cualquier enfermedad con fibrosis de la piel como complicación.
Los mamíferos seleccionables para la administración del complejo de la invención, la emulsión de la invención o la formulación farmacéutica [1] ó [2] de la invención incluyen perros, gatos, caballos, cerdos, ratones, ratas, primates y, especialmente, humanos .
Los siguientes ejemplos no limitantes ayudan a ilustrar los principios de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Estudio de la composición de la formulación
La finalidad era obtener una formulación que tuviera un cierto carácter oclusivo, que fluyera correctamente para facilitar su manejo industrial en grandes cantidades y que como en el caso de la emulsión 965 (E.965) no permitiese la absorción del P144 y su distribución sistémica.
Para la obtención de la emulsión silicónica se buscaron diversos tensioactivos con la finalidad de conseguir una emulsión lo más fina posible. Tras una metódica búsqueda entre diferentes proveedores se seleccionaron Abil® Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG16/16) y Abil® EM90 (cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona) .
Se realizaron varios ensayos de formulación hasta obtener una emulsión estable, fluida y con buenas características organolépticas. En la Tabla 3 se resumen las diferentes formulaciones ensayadas. Tabla 3 : Composición de formulaciones iniciales a ensayar para la emulsión silicónica.
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[CD : Hidroxipropil-beta-ciclodextrina]
Los resultados obtenidos con las formulaciones mostradas en la Tabla 3 fueron los siguientes:
• Fórmula F.l: nada más terminar la agitación de la mezcla de fases éstas se separaban. No hubo formación de una emulsión. • Fórmula F.2: la emulsión se formó y se mantuvo durante unas horas pero se cortó tras un periodo de reposo.
• Fórmula F.3: ocurrió como en el caso anterior pero terminó por cortarse tras un periodo de reposo algo más prolongado que en la fórmula F.2. • Fórmula F.4: no se apreciaron grandes diferencias con respecto a la formulación F.2.
• Fórmula F.5: no llegó a formarse la emulsión.
• Fórmula F.6: se formó una emulsión estable, con buena fluidez y características organolépticas aceptables. Se conservó parte a temperatura ambiente y parte a 40C.
• Fórmula F.7: formulación definitiva, se ajustó a los parámetros definidos en los objetivos. Se decidió por tanto seleccionar la formulación F.7 como punto de partida para los ensayos de capacidad de transporte o carga del péptido (P144) .
Ejemplo 2: Procedimiento de elaboración de la emulsión silicónica cargada con P144 (100 μg/g)
El método para la elaboración de la emulsión silicónica, según la Fórmula F.7, fue el siguiente:
1. Se pesó el agua. 2. Se pesaron el propilparaben y el metilparaben y se disolvieron en el agua aplicando un ligero calor (inferior a 35°C) para favorecer la disolución de los conservantes.
3. Una vez disueltos los parabenes se dejó enfriar la solución y entonces se añadió la CD (hidroxipropil-beta-ciclodextrina) poco a poco y bajo agitación hasta total disolución.
4. A continuación se añadió el P144 lentamente y bajo agitación, el tiempo necesario para la disolución de P144 fue bastante prolongado (una noche) .
5. En un recipiente aparte se pesó la parafina y la dimeticona 350 sobre las que se añadió el Abil® EM 90. Se mezclaron los tres componentes mediante agitación magnética.
6. Se añadió la fase acuosa con el P144 disuelto sobre la fase oleosa hasta la formación de la emulsión. Una vez terminado el periodo de maduración de la emulsión se sometieron tres alícuotas de aproximadamente 6 g a una prueba para comprobar la estabilidad de la emulsión. Dicha prueba consistió en:
- Centrifugar a 2.000 r.p.m. durante 5 minutos
- Centrifugar a 4.000 r.p.m. durante 10 minutos
- Centrifugar a 8.000 r.p.m. durante 10 minutos - Centrifugar a 13.000 r.p.m. durante 10 minutos
- Calentar a 900C
En los dos primeros casos no se observó ninguna alteración en el aspecto de la emulsión. En el tercer caso pudo verse que se liberaba una mínima cantidad de agua en la superficie de la emulsión. Sin embargo, al centrifugar a 13000 r.p.m. o al calentar la emulsión no se apreció ninguna alteración. Se ensayó otro método alternativo para la incorporación de P144 en la formulación: la mezcla física. Consistió en mezclar en seco, con la ayuda de un mortero el P144 y la ciclodextrina . A continuación se añadió esta mezcla sobre el agua de la formulación dando lugar a una suspensión que no acabó de disolverse. Por este motivo se descartó esta forma de incorporar P144.
Se seleccionó como procedimiento de fabricación aquel en que se preparaba una solución de ciclodextrina sobre la que se incorporaba el péptido, si bien se añadió una modificación, se calentaron ligeramente (inferior a 35°C) las dos fases de la emulsión .
Ejemplo 3: Verificación de la disolución de P144 en la emulsión silicónica
Se buscó un método rápido y sencillo que permitiera saber si P144 estaba disuelto en la formulación o por el contrario se encontraba en forma de cristales dispersos en la emulsión. Dadas las características de P144 se decidió que tal método fuese la observación al microscopio mediante luz visible y luz ultravioleta de muestras representativas de las diferentes formulaciones ensayadas.
Las condiciones experimentales ensayadas fueron las siguientes: microscopio Nikon ECLIPSE E800, cámara Nikon DIGITAL CAMERA DXM 1200, programa de análisis de imagen ACT-I. Las diversas muestras se observaron bajo luz visible y radiación UV (EX 330- 380, DM 400, BA 420) y aumentos 4x. En las Figuras 1-7 se muestran imágenes de una parte de los lotes elaborados con la formulación descrita más arriba. En las Figuras 1 y 2 se muestran fotografías de la emulsión silicónica con 100 μg/g de P144 y emulsión silicónica blanco, sin P144 respectivamente.
Ejemplo 4: Comparación de la capacidad de transporte de P144 entre la emulsión E.965 y la nueva emulsión silicónica
Se comparó la capacidad de transporte de P144 entre la emulsión E.965 y la nueva emulsión silicónica según la fórmula F.7 inicialmente seleccionada. Igualmente se incorporaron nuevas formulaciones F.8 y F.9 en las que se aumentaba la cantidad de ciclodext riña con la intención de aumentar en paralelo la capacidad de carga de P144. Estas nuevas formulaciones se recogen en la Tabla 4.
Tabla 4: Composición de la nueva emulsión silicónica, según la fórmula F.7 inicialmente seleccionada, y las fórmulas modificadas F .8 y F .9. Se ensayó la capacidad de transporte de las 3 fórmulas, variando las concentraciones de carga del péptido P144 (ver Tabla 5)
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Inicialmente se preparó una emulsión en la cual se duplicó la cantidad de péptido llegando a los 200 μg/g (fórmula F.7) . Este aumento de masa se compensó reduciendo el contenido en agua, si bien es una variación insignif icativa en el conjunto de la formulación.
El procedimiento para la obtención de la emulsión se mantuvo igual que en el ejemplo anterior.
En la evaluación microscópica con luz visible y ultravioleta de esta formulación (lote A-4) no se encontraron cristales de P144, lo cual es indicativo de una solubilización adecuada de P144. A continuación se ensayó la misma formulación F.7 y método pero con una concentración de 300 μg/g; esta concentración es similar a la concentración más elevada que se consiguió alcanzar con la emulsión E.965. En el estudio microscópico con luz visible y ultravioleta de esta formulación (lote A-5) no se detectaron cristales .
Por tanto, se puede concluir que se ha conseguido una formulación con una capacidad de carga de P144 similar a la de la emulsión E.965, con mejores propiedades galénicas, y en la que su proceso de fabricación requiere un aporte de calor considerablemente inferior.
A partir de este punto cualquier incremento de la concentración de P144 en la formulación, sin detección de cristales de péptido, seria considerado como una mejora en la capacidad de carga con respecto a la emulsión E.965 y supondría el cumplimiento de los objetivos marcados.
Manteniendo la misma formulación F.7 que en los casos anteriores se prepararon nuevas emulsiones silicónicas en las que se fue incrementando paulatinamente la concentración de P144: con 400 μg, 600 μg, 800 μg y 1.000 μg de P144 por gramo de formulación. Con ninguna de las cuatro nuevas emulsiones se apreciaron cristales de P144 cuando se analizaron con luz visible o con luz ultravioleta (Figura 3) .
Sin embargo, posteriormente se volvieron a elaborar nuevos lotes (A-12, A-14 y A-15) de la emulsión con unas concentraciones de P144 de 1.000 μg/g, 1.200 μg/g y de 800 μg/g, respectivamente. En esta ocasión sí se vieron claramente cristales de P144 cuando se inspeccionaron con luz ultravioleta.
La causa de estas discrepancias en los resultados entre lotes semejantes podría ser que la preparación de los lotes A- 9 (800 μg/g) y A-10 (1.000 μg/g) se realizó con unas diluciones de una solución de P144 preparada previamente a una concentración diferente a la necesaria para cualquiera de estos dos lotes. Una posible causa es que se estuviera ya muy próximo al limite de solubilidad de P144 en la presente formulación y por ello en unas ocasiones aparezcan unos pocos cristales y en otras ocasiones no se observe ningún cristal de P144.
Para confirmar esta posibilidad se ensayó una nueva fórmula F.8, con ligeras modificaciones realizadas sobre la formulación inicial F.7. Se aumentó el contenido en hidroxipropil-beta- ciclodextrina (CD) desde el 2,5% p/p hasta un 4,2% p/p y se duplicó el contenido en parabenes de modo que la nueva formulación quedó como se muestra en la Tabla 4.
Con esta nueva fórmula alternativa se preparó un lote (A-16) con una carga de 1.000 μg/g de P144. En ninguno de los campos observados al microscopio aparecieron cristales de P144 (Figura
4 ) , lo que hizo suponer que la segunda hipótesis era la acertada. Aumentando la cantidad de hidroxipropil-beta- ciclodext riña (CD) se consiguió la disolución de todo el péptido.
Este cambio en la formulación provocó que fuera necesario, de acuerdo con la bibliografía, un aumento de los conservantes en la formulación pues es sabido que la presencia de ciclodextrinas reduce la eficacia de los parabenes. Por este motivo se duplicó la concentración del metil y del propilparaben .
Posteriormente, vista la causa de aparición de cristales de P144, se decidió mantener la formulación F.7 inicialmente ensayada e ir ajustando la cantidad de péptido que esta pudiera captar. Asi se prepararon unos nuevos lotes (A-17 y A-18) de la emulsión con una concentración de péptido que se consideró próxima al limite de solubilidad: 750 μg/g y 700 μg/g. En ambos casos se detectaron cristales (Figura 5) .
En vista de estos resultados se decidió establecer como concentración máxima de P144 para esta formulación F.7 los 600 μg/g, que fue denominada ESD600. La Tabla 5 presenta un resumen de los resultados obtenidos para los diferentes lotes ensayados en los estudios de carga de P144 para las distintas formulaciones.
Tabla 5 : Resumen comparativo de los resultados obtenidos (formación de cristales) para los distintos lotes de emulsiones preparados , según las fórmulas F .7 , F.8 y F.9, variando las concentraciones de carga del péptido P144 (Ejemplos 2, 4 y 5)
Formula P144 Lote Resultado μg/g p/p Cristales Figura
F.7
0 0 A-3
100 0,01 A-2
200 0,02 A- 4
300 0,03 A-5
400 0,04 A- 6
600 0,06 A- 7
800 0,08 A- 9
1000 0,1 A-10
800 0,08 A-15
1000 0,11 A-12
1200 0,12 A- 14
700 0,07 A-18
750 0,075 A- 17
F.
1000 0,1 A- 16
F.9
0 0 A-21
700 0,07 A-29
800 0,08 A-30 7
1100 0,11 A-28 6
1200 0,12 A-26
1400 0,14 A-23
900 0,09 A-31 Conclusiones para la nueva emulsión silicónica de P144, formulación ESD600
Se considera que los objetivos establecidos al principio de este proyecto fueron alcanzados. Los requerimientos descritos inicialmente para ambas formulaciones fueron:
- permitir la acción local de P144 sin que éste sea absorbido significativamente,
- presentar una buena extensibilidad, y - presentar aspecto agradable sin ser grasiento.
Con la nueva formulación ESD600 se pretendió alcanzar los siguientes objetivos: facilitar la solubilización del principio activo empleando algún sistema que permitiese la eliminación/disminución de disolventes orgánicos,
- obtener una emulsión más homogénea y más estable, y disminuir el calentamiento de las fases para obtener la emulsión, sin poner en riesgo la estabilidad de la sustancia activa.
El primero de los objetivos se alcanzó al haber eliminado el dimetilsulfóxido (DMSO) como disolvente, sustituyéndolo por una solución de hidroxipropil-beta-ciclodextrina que además permitió duplicar la concentración más alta de péptido alcanzada con la emulsión E.965.
El segundo objetivo también se consiguió. Por último también se logró el tercer objetivo, reducir la temperatura del calentamiento de las fases para la formación de la emulsión. Mientras que para la preparación de la emulsión E.965 se alcanzaban temperaturas de trabajo entre 50-560C, para la preparación de la emulsión ESD600 la temperatura de trabajo se mantiene siempre por debajo de 35°C.
Ejemplo 5: Modificación de la emulsión silicónica de P144, formulación ESD600 Se estableció como un nuevo objetivo conseguir una formulación que fuese capaz de transportar una concentración de péptido aun mayor.
Se modificó la formulación F.7 (ESD600) lo mínimo posible con la intención de aumentar al máximo posible la capacidad de carga de P144. Para ello se aumentó la concentración de hidroxipropil- beta-ciclodextrina hasta un 5% p/p y también se duplicó la concentración de los parabenes, rebajándose proporcionalmente el porcentaje de parafina. Así la formulación quedaría como se muestra en la Tabla 4, fórmula F.9 (ESD900) . Esta emulsión sería el vehículo para transportar cantidades considerablemente mayores de principio activo. De acuerdo con esta nueva fórmula, se prepararon diferentes lotes de emulsiones cargados con concentraciones crecientes de P144: 0 μg/g (formulación blanco), 700 μg/g, 800 μg/g, 1.100 μg/g, 1.200 μg/g y 1.400 μg/g.
La formulación blanco (ESD900 sin P144) correspondiente al lote A-21, permitió controlar que no existía ninguna señal ni con luz visible ni con luz ultravioleta.
Tabla 6. Composición de las emulsiones silicónicas para P144,
ESD600 y ESD900
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La observación al microscopio de las correspondientes muestras puso de manifiesto la formación de cristales de P144 en las formulaciones cuya concentración de P144 era igual o superior a 1.000 μg/g (Figuras 5 y 6) . Posteriormente se preparó el lote A-31, con una concentración de péptido de 900 μg/g. En este caso no se observaron cristales de P144.
Por tanto, se pudo concluir que con la nueva formulación F.9 que contenia un 5% p/p de hidroxipropi 1-beta-ciclodextrina, la concentración de P144 máxima era de 900 μg/g. A esta formulación se la denominó ESD900.
Conclusiones
La emulsión silicónica de P144 (ESD600 o ESD900) permite la acción local de P144 sin que este sea absorbido; presenta una buena extensibilidad y aspecto agradable sin ser grasiento, siendo una emulsión más homogénea y más estable; facilita la solubilización del principio activo empleando una solución acuosa de hidroxipropil-beta-ciclodextrina (2,5% p/p en ESD600 ó 5,0 p/p en ESD900) eliminando la necesidad de disolventes orgánicos .
Se ha aumentado la capacidad de transporte de P144, duplicando (ESD600) o triplicando (ESD900) la capacidad de carga de la emulsión E.965.
Con la nueva emulsión silicónica se consigue disminuir el calentamiento de las fases para obtener la emulsión, sin poner en riesgo la estabilidad de la sustancia activa.
Ejemplo 6: Caracterización galénica de la formulación ESD600
1. Características macroscópicas Apariencia: La emulsión silicónica ESD600 tenía una apariencia uniforme y lechosa con una consistencia de fluido y una homogeneidad excelente.
Olor: Inodoro
Tacto: La emulsión silicónica ESD600 presentaba propiedades oclusivas, sin efecto de secado, y dejaba un residuo oleoso absorbente ligeramente lento después de la aplicación. El tacto era suave con apariencia brillante. 2. Características microscópicas 2.1. Tamaño de gota:
Procedimiento: Se colocó una alícuota de emulsión silicónica ESD600 en un portaobjetos. La visualización se llevó a cabo con un microscopio Olympus CH40 (xlOO x 1.25 = xl25) .
Resultado: Tamaño de gota bastante homogénea, en el intervalo de 2-3 μm, aproximadamente un 10% de las gotas medían 10 μm de tamaño. Véase la Figura 8.
2.2. Determinación de la consistencia
- Medición de la capacidad de expansión (Figuras 9-16) : Procedimiento :
Después de marcar el contorno de un portaobjeto sobre papel milimetrado y trazar las correspondientes diagonales para obtener su intersección como punto central de referencia, el portaobjetos se colocó asegurando que coincidía con el trazado mencionado anteriormente, y se colocaron aproximadamente 25 mg de emulsión en el punto central. A continuación, se colocó suavemente un segundo portaobjetos de peso conocido sobre el primer portaobjetos y, después de esperar un minuto, se realizó la medición de los dos diámetros del círculo formado con respecto al punto de intersección de las diagonales trazadas, calculando el valor promedio y dividiendo por dos. Se calculó el radio promedio del círculo. A continuación, se repitió el mismo procedimiento con tres pesos diferentes y siempre en intervalos de un minuto. Los radios obtenidos de esta manera se utilizaron para calcular las correspondientes superficies, en base a la fórmula S = π*r2. La capacidad de expansión se determinó a temperatura ambiente. Véanse las Figuras 9-16.
Resultados :
La Tabla 7 da a conocer los pesos utilizados para determinar la capacidad de expansión de la formulación, junto con los correspondientes incrementos de diámetro, radio promedio y superficie de la muestra de la emulsión silicónica de P144 ESD600. Tabla 7 : Resultados de las pruebas de capacidad de expansión de la muestra P144de la emulsión silicónica de P144 ESD600
Figure imgf000044_0001
Véase la Figura 17.
El incremento de superficie calculada fue de 1.884,955 mm2. La emulsión silicónica de P144 ESD600 mostraba una mejor capacidad de expansión que la emulsión E.965, ya que el incremento de superficie fue de aproximadamente dos veces como mucho .
3. Determinación del tipo de emulsión La determinación del tipo de emulsión se llevó a cabo mediante dos métodos:
3.1. Método de dilución: A un tubo que contiene agua (3 mi) , se añade una pequeña cantidad de emulsión silicónica de P144 ESD600, sin agitación. Si la fase externa es acuosa, el agua se vuelve turbia. Si la fase externa es oleosa, el agua permanece inalterada y no se vuelve turbia.
Después de realizar la prueba tal como se ha descrito, el agua no se volvió turbia e incluso se observaron gotas oleosas; por lo tanto, se podría afirmar que la emulsión silicónica presentaba una fase externa oleosa (w/o) . Las Figuras 18 y 19 muestran los resultados obtenidos con este método. 3.2. Método de colorante: Se utilizó un colorante soluble en agua, específicamente, una solución de azul de metileno (0,4% p/v) . Si la emulsión es del tipo o/w (aceite en agua) , el colorante se dispersará. Sin embargo, si la emulsión es del tipo w/o, se repele y no se dispersará.
Se colocó sobre un portaobjetos una pequeña cantidad de la emulsión de estudio. A continuación, se añadió una gota de azul de metileno, sin mezclar. Después de realizar la prueba tal como se ha descrito, se observó que la emulsión repelía el colorante; por lo tanto, se concluyó que era del tipo w/o. Véase la Figura 20.
4. Determinación del pH
La determinación del pH se llevó a cabo diluyendo 500 mg de emulsión en 10 mi de agua, seguido de filtración. Se realizaron tres mediciones con un pHmetro GLP 21 Crison, con los siguientes resultados : • Muestra no. 1: 5,78
• Muestra no. 2: 5,79
• Muestra no. 3: 5,70
• pH promedio = 5,76 ± 0,049
Ejemplo 7 : Estudio de la absorción percutánea de P144 formulado en la emulsión ESD600
Planificación y objetivo
Este estudio tuvo como objetivo el valorar la absorción y penetración percutánea en muestras de piel de oreja de cerdo del péptido P144 formulado en la formulación denominada "ESD600" a una concentración de 100 μg/g (ESD600 tioo] ) • Se utilizó como producto de referencia la formulación "ESD600 control" sin péptido (ESD600[0]) .
Materiales y métodos
La piel de oreja de cerdo proviene de cerdos híbridos para consumo humano. Las orejas se trataron tal y como se describe más adelante en "Procedimiento 1. Etapa 1: Dermatomización" . El producto de ensayo fue la emulsión ESD600 con 100 μg P144/g (ESD600 [íoo], N° lote : X-6) . Esta preparación semisólida se realizó según el procedimiento descrito anteriormente. Su composición está recogida en la Tabla 8.
Tabla 8
Figure imgf000046_0001
CD: Hidroxipropil-beta-ciclodextrina
El producto de referencia fue la emulsión silicónica ESD600[0] control sin P144 (ESD600[0], N° lote : X-5) . Esta preparación semi-sólida se real i zó según procedimiento de scrito anteriormente, pero sin añadir el principio activo. Su composición está recogida en la Tabla 9.
Tabla 9
Figure imgf000046_0002
CD: Hidroxipropil-beta-ciclodextrina
Equipos utilizados:
- Balanza Mettler AT261 Delta Range - pHmetro Crison, pH meter GLP 21
- Celdas de difusión de Franz Variomag Telesystem. El aparato de celdas de Franz consta de 6 celdas de vidrio borosilicatado y teflón con un compartimento receptor (volumen 7 mL) y un compartimento dador (diámetro 15 mm) . - Dermatomo (Aesculap-Wagner dermatome C. GA 630; B. Braun Surgical S. A., Barcelona, España)
- Arcón de -800C (Forma Scientific, 938)
- Congelador de -200C
Todos los reactivos, sales y productos químicos fueron de calidad analítica. Solución reguladora de fosfatos (PBS) (Sigma, ref: P4417- 100 TAB) , hidroxipropil-beta-ciclodextrina (OH-CD)
(Sigma, ref . 332607) , Tissue Tek® OCT Compound (Sakura, ref :
4583) . Agua tipo II, obtenida en un sistema Wasserlab (Modelo
Automático N° AU 050503 ) se utilizó para preparar las soluciones .
Viales de recogida de muestra de las celdas (Watters. Ref:
7176) .
Criotubos para conservación de las muestras.
El equipo de "Celdas de difusión de Franz" consta de 6 celdas, distribuidas en 2 filas. Cada celda tiene 2 compartimentos: dador y receptor. En el primero se coloca el producto a ensayar o su control y en el segundo se coloca la solución que recogerá la cantidad de fármaco que atraviese el sistema experimental (la piel de cerdo o humana) . Este sistema experimental se encuentra en la interfase entre el compartimento dador y el receptor. La distribución de los productos a ensayar en el aparato "Celdas de Franz" se realizó de la siguiente manera: ESD6OOtioo] (Celdas 5 y 6), ESD600[0] Control (Celda 2) . El experimento con piel de oreja de cerdo se repitió 4 veces.
Procedimiento
1. Etapa 1: Dermatomización El mismo día de su obtención las orejas de cerdo se lavaron, manipularon y cortaron con ayuda de un dermatomo para obtener membranas de 1 mm de espesor y una superficie mínima de 4 era2. Las membranas se almacenaron de forma separada en congelador a - 200C.
2. Etapa 2: Ensayo de difusión percutánea. 2.1. Ensayo de difusión percutánea
Se realizó un estudio de difusión de 24 horas en el que se ensayó la emulsión silicónica ESD6OO[iOo] con 100 μg/g de péptido. Como membrana de difusión se empleó piel de oreja de cerdo dermatomizada a 1,0 mm. Previo al inicio del ensayo, las pieles se hidrataron por inmersión durante 30 minutos con PBS (solución tampón de fosfato, pH 7,4+0,2) . Por otra parte, el receptor de cada una de las celdas se llenó con 7 mi de una solución tampón de fosfato conteniendo un 5% p/p de OH-CD ajustada a pH 7,4 ± 0,2. Sobre el compartimento receptor se colocó la porción de piel dermatomizada e hidratada. Sobre ella, se fijó el compartimento receptor (diámetro 15 mm) , donde se colocaron, aproximadamente, 0,9 g de preparación semisólida (volumen de 1 mi) , producto a ensayar (ESD600 tioo] ) o su producto de referencia
(Emulsión Silicónica ESD600 control; ESD600[0]) . El receptor se mantuvo a una temperatura de 32,5 ± 0,50C y bajo una agitación de 400 r.p.m. A intervalos predeterminados de tiempo (Oh, Ih, 2h, 6h, 12h y 24h) se recogieron muestras de 1 mi manualmente desde el compartimento receptor, reemplazando seguidamente este volumen por 1 mi de solución original para mantener constante el volumen receptor. Las muestras recogidas se almacenaron en criotubos a -800C en un congelador -800C para su posterior análisis cromatográfico .
3. Estudio de la presencia de P144 en las distintas capas de la piel
Una vez finalizado el ensayo, se procedió a la realización de los cortes de las membranas. Para ello, previamente, se quitó la piel de las celdas y se eliminaron los restos de producto a ensayar o control lavándolas con agua tipo II. Las muestras se colocaron sobre una superficie dura y se les añadió una cantidad suficiente de OCT para obtener un bloque congelado homogéneo que permitiera realizar los sucesivos cortes. Sobre cada muestra se realizaron seis cortes sucesivos con ayuda de un criostato, en profundidad, de 50 μm para piel de oreja de cerdo. Estos cortes se recogieron individualmente en criotubos, se identificaron con un código y finalmente se almacenaron a -800C hasta su posterior análisis por cromatografía. Las Tablas 10-13 recogen las características de las muestras de piel. En dichas tablas se recoge el porcentaje de superficie de la piel (necesario para la cuantificación del P144 en la misma) analizado tras la realización del corte en el criostato.
Tabla 10. Cuantificación en cortes de piel de oreja de cerdo. Superficie de corte (S= 176 mm2; grosor = 50 mm) . Experimento 1
Figure imgf000050_0001
Tabla 11. Cuantificación en cortes de piel de oreja de cerdo. Superficie de corte (S= 176 mm2; grosor = 50 mm) . Experimento 2
Figure imgf000051_0001
Tabla 12. Cuantificación en cortes de piel de oreja de cerdo. Superficie de corte (S= 176 mm2; grosor = 50 mm) . Experimento 3
Figure imgf000052_0001
Tabla 13. Cuantificación en cortes de piel de oreja de cerdo. Superficie de corte (S= 176 mm2; grosor = 50 mm) . Experimento 4
Figure imgf000053_0001
Tratamiento, evaluación e interpretación de resultados La cuantif icación del péptido P144, tanto en las muestras de piel como en los reservorios se realizó por cromatografía líquida de alta resolución con detección de masas (HPLC/MS/MS) .
Muestras provenientes de receptores:
El límite de cuantif icación (LOQ) de la técnica HPLC-Masas para muestras proveniente de receptores es de 10 ng/ml, y se ha utilizado para hacer una de las siguientes afirmaciones: • Cuando no se detectan cantidades de péptido P144, en las soluciones recogidas del compartimento receptor (muestras negativas o en todo caso por debaj o del límite de cuantif icación de la técnica analítica) : "El P144, formulado en la preparación semisólida ESD600, no es capaz de atravesar la barrera cutánea".
• Cuando se detectan cantidades de péptido P144 , en las soluciones recogidas del compartimento receptor, superiores al límite de cuantif icación de la técnica analítica: "El
P144, formulado en la preparación semi-sólida ESD600, es capaz de atravesar la barrera cutánea".
Si se hubieran detectado cantidades de péptido P144 en el compartimento receptor , se habrían l levado a cabo representaciones X-Y de las cantidades acumuladas frente al tiempo . Igualmente, en el caso de presencia de cantidad significativa de fármaco, se habría calculado el flujo transdérmico (J) desde la pendiente de la curva que represente el estado estacionario.
Muestras provenientes de cortes horizontales de piel:
En el estudio de presencia del P144 en las distintas capas (profundidades) de la piel, se representó la cantidad de P144 cuantificada por HPLC-MS en función de la profundidad. Todos los datos se representaron como media aritmética y desviación típica, indicándose el número de repeticiones (n) . La existencia de diferencias significativas y comparaciones estadísticas se analizó mediante ANOVA. Para comparaciones entre diferentes tratamientos, se aplicó el test de Tukey y el test de Dunnett. En cualquier caso, se consideró significativa una p< 0,05. El análisis estadístico se realizó mediante el programa SPSS versión 11.
Resultados y discusión sobre el estudio de absorción y penetración cutánea en piel de oreja de cerdo
La Figura 21 muestra la cantidad de P144, formulada en ESD600 con 100 μg P144/g (ESD600 tioo] ) , capaz de alcanzar el receptor en el estudio de absorción transdérmica . Como se puede observar, la cantidad de P144 detectada en receptor fue siempre inferior a 2 ng en todos los casos analizados (límite de cuantificación de la técnica HPLC/MS/MS; ver Tabla 14) . En ningún caso, se pudo observar una señal que permitiera aventurar el paso de una mínima fracción de péptido. Por ello es posible afirmar que, en las condiciones de este estudio, no existe flujo transdérmico de P144 a través de la piel de oreja de cerdo hacia la circulación general .
Tabla 14 : Resultados de cuantificación de receptores
Nombre muestra CONC. (ng/ml)
1.2 t=0h < LOQ
1.2 t=lh < LOQ
1.2 t=2h < LOQ
1.2 t=6h < LOQ
1.2 t=12h < LOQ
1.2 t=24 h < LOQ
1.5 t=0h < LOQ
1.5 t=lh < LOQ
1.5 t=2h < LOQ
1.5 t=6h < LOQ
1.5 t=12h < LOQ
1.5 t=24 h < LOQ
1.6 t=0h < LOQ
1.6 t=lh < LOQ
1.6 t=2h < LOQ
1.6 t=6h < LOQ
1.6 t=12h < LOQ
1.6 t=24 h < LOQ
2.2 t=0h < LOQ
2.2 t=lh < LOQ
2.2 t=2h < LOQ
2.2 t=6h < LOQ
2.2 t=12h < LOQ
2.2 t=24 h < LOQ
2.5 t=0h < LOQ
2.5 t=lh < LOQ
2.5 t=2h < LOQ
2.5 t=6h < LOQ
2.5 t=12h < LOQ
2.5 t=24 h < LOQ
2.6 t=0h < LOQ
2.6 t=lh < LOQ
2.6 t=2h < LOQ 2.6 t=6h < LOQ
2.6 t=12h < LOQ
2.6 t=24 h < LOQ
3.2 t=0h < LOQ
3.2 t=lh < LOQ
3.2 t=2h < LOQ
3.2 t=6h < LOQ
3.2 t=12h < LOQ
3.2 t=24 h < LOQ
3.5 t=0h < LOQ
3.5 t=lh < LOQ
3.5 t=2h < LOQ
3.5 t=6h < LOQ
3.5 t=12h < LOQ
3.5 t=24 h < LOQ
3.6 t=0h < LOQ
3.6 t=lh < LOQ
3.6 t=2h < LOQ
3.6 t=6h < LOQ
3.6 t=12h < LOQ
3.6 t=24 h < LOQ
4.2 t=0h < LOQ
4.2 t=lh < LOQ
4.2 t=2h < LOQ
4.2 t=6h < LOQ
4.2 t=12h < LOQ
4.2 t=24 h < LOQ
4.5 t=0h < LOQ
4.5 t=lh < LOQ
4.5 t=2h < LOQ
4.5 t=6h < LOQ
4.5 t=12h < LOQ
4.5 t=24 h < LOQ
4.6 t=0h < LOQ
4.6 t=lh < LOQ
4.6 t=2h < LOQ
4.6 t=6h < LOQ
Figure imgf000058_0001
En las Tablas 10-13 se recogen los resultados de la determinación de P144 en las distintas capas de piel de cerdo analizadas. La Figura 22 muestra la distribución de P144 en la piel de oreja de cerdo, tras la aplicación tópica de ESD6OOtioo] durante 24 h y comparándola con los resultados obtenidos con la emulsión 965 (E.965) conteniendo la misma cantidad de péptido (E.965[ioo]) • Esta distribución se estimó mediante el corte horizontal de porciones de piel de 50 mm. Como controles se utilizaron los cortes de piel tratada con ESD600[0], sin P144. En cualquier caso, no se han encontrado diferencias significativas en el contenido de fármaco en los 6 cortes realizados (p<0,05) . En el caso de la emulsión control ESD600[0] no se encontraron cantidades de P144 (LOQ: 100 ng) .
Desde un punto de vista estructural, la piel de cerdo parece ser la más semejante a la piel humana (Touitou et al. J. Controlled Reléase, 1998, 56, 7-21; Simón and Maibach. Skin Pharmacol . Appl. Skin Physiol. 2000, 13, 229-234) . Además, está descrita su idoneidad para el estudio de la permeabilidad de numerosos fármacos a través de la piel (Neubert and Wohlrab. Acta Pharm. Technol., 1990, 36, 197-206) . Jenning y colaboradores (Jenning et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. , 2000, 49, 211-218) han establecido, por medidas de microscopía óptica, que en la piel de cerdo se puede diferenciar una capa de estrato córneo de aproximadamente 100 mm, seguido de una capa de epidermis viable de 100-200 mm. La dermis estaría localizada entre los 200 a 500 mm, considerando la parte restante como dermis y pequeñas porciones de tejido graso subcutáneo (Jenning et al. Eur. J. Pharm. Biopharm., 2000, 49, 211-218) .
Los resultados de distribución de P144 en la piel de oreja de cerdo (Figura 23) muestran claramente la afinidad de P144 por las distintas regiones de la misma. Aunque, en el caso de la ESD600 y en contraposición a los resultados obtenidos con E.965, esta afinidad es mayor por el estrato córneo (EC) de la piel. En realidad se puede observar un gradiente de concentración de P144 desde el estrato córneo hasta la última capa de la dermis.
Con los datos de penetración cutánea, se ha calculado la cantidad teórica de la fracción de dosis que existe en las distintas capas de la piel. La Figura 24 muestra estos resultados para ESD600 y comparados con los obtenidos para
E.965. Como se puede observar, la emulsión silicónica ESD600 tiene un efecto sensiblemente menor que la emulsión E.965 para potenciar la penetración de P144 en las diferentes capas de la piel .
Ejemplo 8: Estudio de solubilidad de P144
Preparación del producto peptidico optimizado 1. Muestras liofilizadas de péptido-albúmina humano: 2 viales, cada uno contenia producto liofilizado de 500 μg del péptido y 400 mg de albúmina humana.
2. Muestras liofilizadas de péptido-albúmina humano: 2 viales, cada uno contenia producto liofilizado de 500 μg del péptido y 200 mg de albúmina humana.
3. Muestras liofilizadas de péptido de hidroxi-propil-β- ciclodextrinas : 2 viales, cada uno contenia producto liofilizado de 500 μg del péptido y 100 mg de h i d r o x i-propil-β- ciclodextrinas . 4. Muestras liofilizadas de péptido de urea: 2 viales, cada uno contenia producto liofilizado de 500 μg del péptido y 200 mg de urea .
El volumen original antes de la liofilización fue de 2 mi. Se recomienda dispersar cada vial con 2 mi de agua destilada. Tabla 15
Figure imgf000060_0001

Claims

Reivindicaciones
1. Un complejo que comprende un péptido inhibidor de TGF-βl y una ciclodextrina o un derivado de la misma, en el que • el péptido inhibidor de TGF-βl se selecciona entre un péptido que tiene por lo menos un 70% de identidad en la secuencia con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-23, sus sales, derivados funcionales, variantes, análogos y fragmentos de los mismos con capacidad de inhibir TGF-βl; y • la ciclodextrina o un derivado de la misma se selecciona entre una β-ciclodextrina y una γ-ciclodextrina .
2. Complejo según la reivindicación 1, en el que la β-ciclodextrina es una β-ciclodextrina mono- o poli- (Ci-C6) hidroxi alquilada.
3. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 02, en el que el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en una proporción en peso de aproximadamente 0 , 002 : 1 hasta aproximadamente 0,024:1 en relación a la ciclodextrina.
4.- Una formulación farmacéutica que comprende el complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el péptido inhibidor de TGF-βl e s tá p re s e nte e n una cant i dad terapéuticamente eficaz, y la ciclodextrina es una ciclodextrina farmacéuticamente aceptable.
5.- Formulación farmacéutica según la reivindicación 4, que comprende además cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona.
6.- Una emulsión de un péptido inhibidor de TGF-βl que comprende cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona.
7.- Emulsión según la reivindicación 6, en la que el péptido inhibidor de TGF-βl se selecciona entre un péptido que tiene por lo menos un 70% de identidad en la secuencia con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-23
8.- Emulsión según la reivindicación 7, en la que el péptido inhibidor de TGF-βl forma un complejo con una ciclodextrina o un derivado de la misma.
9.- Emulsión según la reivindicación 8, en la que el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en una proporción en peso de aproximadamente 0, 002 : 1 hasta aproximadamente 0, 024 : 1 en relación a la ciclodextrina.
10.- Una formulación farmacéutica que comprende una emulsión de un péptido inhibidor de TGF-βl según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en la que el péptido inhibidor de TGF-βl está presente en una cantidad terapéuticamente eficaz, y la ciclodextrina de la emulsión según la reivindicación 8 es una ciclodextrina f armacéuticamnte aceptable.
11. Formulación farmacéutica según la reivindicación 10, que comprende un péptido inhibidor de TGF-βl en una cantidad de 0, 01% a 1% p/p, una β-ciclodextrina o una γ-ciclodextrina en una cantidad de 1% a 10% p/p, cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona en una cantidad de 0,5% a 6% p/p, un conservante paraben en una cantidad de 0, 005% a 0, 6% p/p, una silicona en una cantidad de 3% a 20% p/p, un aceite mineral en una cantidad de 10% a 40% p/p, y agua en una c.s.p. 100%.
12. Un procedimiento para la preparación de un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende la mezcla del péptido inhibidor de TGF-βl con una solución acuosa que comprende la ciclodextrina o un derivado de la misma.
13. Un procedimiento para la preparación de una emulsión de un péptido inhibidor de TGF-βl según la reivindicación 8, que comprende a) la preparación de (i) un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y de (ii) una fase lipofilica que comprende cetil PEG/PPG-10/1 dimeticona; y b) la mezcla de dicho complejo sobre dicha fase lipofilica.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que antes de la etapa b) , el complejo y la fase lipofilica se calientan a una temperatura comprendida entre 25°C y 700C.
15. Producto obtenible mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
16. Uso de un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , o de una emul s ión s egún cual qui era de l as reivindicaciones 6 a 9, o de una formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 4, 5, 10 ú 11, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o estado patológico mediado por TGF-βl.
17. Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o f o rmul aci ón f armacéut i ca s egún cual qui era de l as reivindicaciones 4, 5, 10 ú 11, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o estado patológico mediado por TGF-βl.
18. Un método de tratamiento de una enfermedad o estado patológico mediado por TGF-βl en un mamífero en necesidad de tratamiento, comprendiendo dicho método la administración a dicho mamífero de una cantidad eficaz de un complejo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o de una emulsión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, o de una formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 4, 5, 10 ú 11.
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