WO2007048857A1 - USO DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE TGF- βl EN LA PREPARACIÓN DE UN AGENTE MODULADOR DE LA RESPUESTA INMUNE - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de un péptido inhibidor de TGF-βl seleccionado entre: el péptido pl44 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 1, el péptido pl7 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores, en la preparación de un agente modulador de la respuesta inmune.

Description

USO DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE TGF-βl EN LA PREPARACIÓN DE UN AGENTE MODULADOR DE LA RESPUESTA INMUNE

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se engloba en el campo de la preparación de agentes moduladores de la respuesta inmune.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El TGF-βl (factor transformante del crecimiento β-l)es un potente inmunomodulador que está presente en todas las fases de la respuesta inmunitaria generando distintos efectos. Actualmente se reconoce como un potente regulador de células del sistema inmunitario, incluyendo linfocitos, macrófagos y células dendríticas (Letterio J. J., 1998) . La actividad biológica del TGF-βl varía mucho en función del tipo y el estado de diferenciación celular, así como de la presencia de otras citoquinas, sugiriendo que una alteración en el balance de este conjunto de citoquinas puede también afectar al TGF-βl y contribuir al desarrollo de patologías asociadas a disfunción del sistema inmunitario. El TGF-βl regula la respuesta inmunitaria de manera compleja y dependiente del contexto, lo que se ha puesto en evidencia utilizando modelos experimentales de diferentes enfermedades, así como por la evaluación de ratones genéticamente modificados en cuanto a la expresión de TGF-βl, sus receptores, o proteínas reguladoras. El TGF-βl regula la función e interacción de células del sistema inmunitario en el desarrollo de respuestas humorales, cítotóxícas, de inmunotolerancia y en el origen patológico de muchas enfermedades infecciosas y autoinmunes . Los linfocitos T están claramente regulados por el

TGF-βl en todas las fases de su desarrollo (Fontana A. et al., 1992). El efecto del TGF-βl varía según el estado de diferenciación del linfocito, y el tipo de señal de activación que haya recibido éste. Los primeros estudios sobre el efecto del TGF-βl en linfocitos humanos, revelaron la capacidad de éstos para producir y secretar TGF-βl como inhibidor de la proliferación dependiente de IL-2 y la función citolítica (Pardoux C. et al., 1997).

Las células dendríticas son una población leucocitaria claramente diferenciada por su función como células presentadoras de antígeno en la activación de respuestas de linfocitos T. Son una población celular muy especializada, que incluye las células de Langerhans de la epidermis y las células dendríticas foliculares de los nodulos linfáticos, y en las que el TGF-βl regula tanto su diferenciación como su actividad (Strobl H. Knapp W., 1999).

Se ha identificado que el TGF-βl potencia la diferenciación funcional in vítro de células dendríticas, a partir de precursores CD34⁺, inducida por la presencia de otras citoquinas (TNF-α, SCF, y GM-CSF) . El TGF-βl también actúa aumentando la viabilidad de las células dendríticas en cultivo. Por otra parte, el papel del TGF-βl en este tipo celular también parece estar relacionado con un mecanismo de regulación que inhibe respuestas de baja especificidad para evitar procesos autoinmunes.

En la diferenciación, proliferación y producción de Ig (inmunoglobulinas) de células B, el TGF-βl tiene un papel regulador mediante la inhibición de los niveles de ciertas moléculas de superficie, incluyendo el complejo mayor de histocompatibilidad tipo n (MCH-II) tanto en pre- linfocitos B como en células B maduras. Por otro lado, el TGF-βl inhibe la secreción de Ig en general pero induce claramente la producción de IgA por lo que desarrolla un importante papel en la respuesta inmunitaria asociada a mucosas. La mayoría de los estudios sobre el efecto del TGF-βl como inhibidor de la producción de todo tipo de Ig, se han realizado in vitro. Aunque, también se ha descrito en cultivos de linfocitos la necesidad de ciertos niveles de TGF-βl, que actúan a nivel autocrino, para la producción efectiva de IgG e IgE. Así, la función del TGF-βl en la inducción de anticuerpos se muestra, como en otros muchos procesos, dual y opuesta según el contexto de la respuesta inmunitaria (Lebman D.A., Edmiston J. S., 1999).

En el caso de los macrófagos, el efecto del TGF-βl a nivel tisular es generalmente supresor y contribuye a finalizar la respuesta inflamatoria.

Posiblemente, el efecto más relevante del TGF-βl sobre la inactivación de los macrófagos, se deba a su capacidad de limitar la producción de especies reactivas de oxígeno e intermediarios metabólicos del nitrógeno por células activadas por IFN-γ o LPS. La enzima responsable de la producción de NO (óxido nítrico) por los macrófagos activados, es la forma inducible de la enzima óxido nítrico sintasa (iNOS) . La regulación de la actividad de esta enzima por diferentes citoquinas, incluida el TGF-βl, permite regular la respuesta inmunitaria en general y en concreto, la respuesta de los macrófagos frente a microorganismos y células tumorales . El TGF-βl inhibe la enzima iNOS tanto a nivel transcripcional, disminuyendo los niveles de ARNm, como suprimiendo la actividad de la proteína. El TGF-βl también inhibe la producción de especies reactivas de oxígeno intermediarias y la citotoxicidad oxidativa, mediante la inactivación de los macrófagos y el control de los monocitos de sangre periférica (Ashcroft G. S., 1999).

Adicionalmente, la activación o producción del TGF-βl, así como la alteración de su vía de señalización, está descrita en muchas enfermedades producidas por la infección de diferentes microorganismos, entre ellos Leishmania, Trypanosoma cruzi, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C...

Los documentos del estado de la técnica más próximos a la presente invención son la Patente ES 2 146 552 y la solicitud de patente ES200302020. El primer documento se refiere al uso de péptidos antagonistas de la unión de TGF-βl a sus receptores en el organismo, caracterizados por presentar secuencias de aminoácidos parciales similares o idénticas a las del propio TGF-βl y/o sus receptores; así como a su uso para fabricar una composición de aplicación en enfermedades hepáticas, en concreto para la fibrosis hepática. En este documento se protege al péptido pl44 (SEQ

ID NO: 1) así como su uso anteriormente indicado, si bien no se menciona su uso en la preparación de un agente modulador de la respuesta inmune que constituye el objeto de la presente invención. En la solicitud de patente ES200302020 se protegen péptidos inhibidores de la actividad biológica de TGF-βl los cuales han sido obtenidos a partir de una librería de fagos, y su uso para el tratamiento de enfermedades que cursan con una expresión desregulada de TGF-βl, en especial las alteraciones fibróticas. En este documento se protege al péptido pl7 (SEQ ID NO: 2) y al uso descrito, pero de nuevo no se refiere a su uso en la preparación de un agente inmunomodulador . — ET _

Este efecto modulador del sistema inmune resulta muy importante puesto que permite estimular o inhibir diferentes aspectos de la respuesta inmune en función de las necesidades, e incluso puede poseer aplicaciones como adyuvante de vacunación.

Otro documento relevante es la solicitud de patente WO 2005/059133A2, que se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un estimulador de la función de las células inmunes y al menos una sustancia que inhibe la proliferación celular y/o induce la muerte celular. Como estimulador de la función del sistema inmune se emplean un antagonista de TGP-βl seleccionado entre: oligonucleótidos que hibridan con el ARNm o con el ADN codificante para TGF-βl, proteínas inhibidoras de TGF-βl, y péptidos que posean un peso molecular inferior a 100 JcDa inhibidores de TGF-βl. Adicionalmente, este documento se refiere al uso de dicha composición farmacéutica en el tratamiento de neoplasias. Sin embargo, en este documento no se utiliza ningún péptido como inhibidor de TGF-βl, sino un oligonucleótido, aunque puede deducirse que un péptido de estas características tendría, en principio, un efecto similar. Esto no puede afirmarse sin una experimentación considerable.

A continuación se presenta una relación de la bibliografía citada en la presente solicitud:

Ashcroft GS. (1999). Bidirectional regulation of macrophage function by TGF-beta. Microbes Infect . Dec; 1 (15) .- 1275- 82.

Fontana A, Constam DB, Frei K, Malipiero U, Pfister HW.Modulation of the immune respσnse by transformíng growth factor beta. (1992) Int Aren Allergy Immunol . ; 99 (1) -.1-7.

Lai, M. Z., Ross, D. T., Guillet, J. G., Briner, T. J., Gefter, M. L., Smith, J.A. (1987). T lymphocyte response to bacteriophage lambda repressor el protein. Recognition of the same peptide presented by Ia molecules of different haplotypes. J Immunol 139, 3973-80.

Letterio, J. J., Roberts, A. B. (1998). Regulation of immune responses by TGF-beta. Annu Rev Immunol 16, 137-61.

Lebman DA, Edmiston JS. (1999) . The role of TGF-beta in growth, differentiation, and maturation of B lymphocytes. Microbes Infect . Dec ; 1 (15) : 1297-304.

Pardoux, C, Ma, X., Gobert, S., Pellegrini, S., Mayeux,

P., Gay, F., Trinchieri, G., Chouaib, S. (1999).

Downregulation of interleukin-12 (IL-12) responsiveness in human T cells by transforming growth factor-beta: relationship with IL-12 signaling. Blood 93, 1448-55.

Schini, V. B., Durante, W., Elizondo, E., Scott-Burden, T.,

Junguero, D. C, Schafer, A. I., Vanhoutte, P. M. (1992). The induction of nitric oxide synthase activity is inhibited by TGF-beta 1, PDGFAB and PDGFBB in vascular smooth muscle cells. Eur J Pharmacol 216, 379-83.

Strobl H, Knapp W. (1999) . TGF-betal regulation of dendritic cells. Microbes Infect . Dec; 1 (15) : 1283-90.

Teicher B.A. (2001) . Malignant cells, directors of the malignant process: Role of transforming growth factor- beta. Cáncer and Metástasis Reviews 20, 133-143. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Para facilitar la comprensión del presente texto se indica que el término "péptido ρl44" se refiere a un péptido inhibidor de TGF-βl caracterizado porque su secuencia de aminoácidos corresponde a la definida en SEQ ID NO: 1. Asimismo el término "péptido pi7" se refiere a un péptido inhibidor de la actividad de TGF-βl, caracterizado porque su secuencia de aminoácidos corresponde a la definida en SEQ ID NO: 2. El "adyuvante incompleto de Freund" se refiere a una composición de sobra conocida por un experto en la materia, caracterizada porque está compuesta por una emulsión de aceite en agua, que actúa como adyuvante retrasando la liberación de antígeno. La presente invención se refiere a un agente modulador de la respuesta inmune caracterizado porque comprende un péptido inhibidor de TGF-βl seleccionado entre: el péptido pl44 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 1, el péptido pl7 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores. En una realización concreta de la invención, dicho fragmento de un péptido inhibidor de

TGF-βl está seleccionado entre: el fragmento pl7(l-il) definido en la secuencia SEQ ID NO: 3, el fragmento pl7(l- 11) am que corresponde a SEQ ID NO-. 4, y el fragmento Acpl7 (l-li) am definido por la secuencia SEQ ID NO: 5.

Por otro lado, la invención también se refiere al uso de dicho agente modulador en la regulación de respuestas inmunes humorales, celulares o ambas. En una realización preferente, la invención se refiere al uso del agente modulador como adyuvante de vacunación. En una realización concreta de la invención el agente modulador de la respuesta inmune se caracteriza porque además comprende el adyuvante incompleto de Freund.

En una realización preferente, la invención se refiere al uso de dicho agente modulador en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de patologías seleccionadas entre: patologías relacionadas con microorganismos que inducen una inmunosupresión mediada por

TGF-βl y cáncer. Preferentemente, dichos microorganismos están seleccionados entre.- Leishmania, Trypanosoma cruzii, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C, el virus de la gripe, y el virus del herpes simple. Asimismo, en una realización concreta de la invención, la composición anteriormente descrita es para el tratamiento de un cáncer seleccionado entre: cáncer de mama, cáncer de próstata, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de piel, hepatocarcinoma, mieloma múltiple y cáncer de estómago.

La presente invención se refiere al uso de un péptido inhibidor de TGF-βl seleccionado entre: el péptido pl44 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 1, el péptido pl7 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores, en la preparación de un agente modulador de la respuesta inmune.

Por otro lado, la invención se refiere a un método de uso de un péptido inhibidor de TGF-βl seleccionado entre: el péptido pl44 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 1, el péptido pl7 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores, para preparar un agente modulador de la respuesta inmune. Adicionalmente, la invención se refiere al uso de un fragmento de un péptido inhibidor de TGF-βl obtenido a partir del péptido pl7 seleccionado entre: el fragmento pl7(l-ll) definido en la secuencia SEQ ID NO: 3, el fragmento pl7 (1-11) am que corresponde a SEQ ID NO: 4, y el fragmento Acpl7 (1-11) am definido por la secuencia SEQ ID NO; 5. Para facilitar la comprensión del texto, se indica que pl7 (l-ll) am, corresponde a un fragmento que corresponde a los aminoácidos 1 a 11 del péptido pl7, en el que el aminoácido en posición 11 (triptófano) se encuentra amidado; Acpl7 (1-11) am corresponde al fragmento anterior que posee además el aminoácido en posición 1 (lisina) acetilado.

La presente invención también se refiere a péptidos que poseen al menos un 70% de homología con dichos péptidos, y preferentemente que posean al menos un 80% de homología con ellos, siempre y cuando mantengan la capacidad de inhibir la actividad biológica de TGF-βl. Así como a cualquier fragmento de los anteriores que mantenga la capacidad de inhibir la actividad biológica de TGF-βl.

En una realización preferente, la presente invención se refiere al uso de un péptido inhibidor de TGF-βl anteriormente descrito, caracterizado porque el agente modulador anteriormente indicado regula las respuestas inmunes humorales, celulares, o ambas. En una realización concreta de la presente invención dicho agente modulador posee un efecto estimulador de la respuesta inmune, preferentemente como adyuvante de vacunación.

Por otro lado, una realización preferente de la presente invención se caracteriza porque dicho agente modulador posee un efecto inhibidor de la respuesta inmune. Adicionalraente, la invención se refiere al uso de una secuencia de KDlSS que codifique para un péptido inhibidor de TGF-βl seleccionado entre: el péptido pl44 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 1, el péptido pl7 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores, para fabricar un agente modulador de la respuesta inmune. Asimismo, la invención también se refiere al uso de un sistema de expresión recombinante que codifique para el péptido pl44, el péptido pl7, un péptido que posea al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores, para fabricar un agente modulador de la respuesta inmune. En una realización preferente de la invención, dicho agente modulador de la respuesta inmune posee un efecto seleccionado entre: estimulador e inhibidor de la respuesta inmune.

Por otra parte, la invención se refiere al uso de un péptido inhibidor de TGF-βl cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 1, un péptido que posee al menos un 90% de homología con el mismo, o fragmentos de uno de los anteriores en la preparación de una composición para el tratamiento de patologías seleccionadas entre: patologías relacionadas con microorganismos que inducen una inmunosupresión mediada por TGF-βl y cáncer. En una realización concreta de la presente invención, dichos microorganismos están seleccionados entre: Leishmania, Trypanosoma cruzíi, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C, el virus de la gripe, y el virus del herpes simple.

Una realización concreta de la presente invención se caracteriza porque dicha composición tendría efecto sobre la inducción de respuestas inmunes frente a tumores establecidos, inhibiendo el efecto intnunosupresor asociado a la producción y/o activación de TGF-βl en diversos tipos de tumores (Teicher B.A., 2001): cáncer de mama, cáncer de próstata, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de piel, hepatocarcinoma, mieloma múltiple y cáncer de estómago.

El agente modulador objeto de la presente invención, puede emplearse en toda clase de mamíferos, entre ellos roedores y primates. Y en una realización preferente en seres humanos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Inhibición de la expresión de distintos marcadores de maduración de células dendríticas tras incubación con pl44 (barras llenas) o con anticuerpos neutralizantes de TGF-βl (barras vacías) . La expresión de marcadores fue medida mediante citometría de flujo.

Figura 2. Efecto de la administración de pl44 y/o RAd- IL12 a ratones BALB/c sobre los niveles séricos de iFN-γ a los días 0, 3 y 6. Se administró intraperitonealmente 10⁸ pfu de RAd-ILl2 de ratón (barras vacías) o de RAdIL-12 y pl44 (barras llenas) .

Figura 3. Niveles de NO (μM) en suero a días 0 y 6 después de la administración de 10⁸ pfu de RAd IL-12 de ratón, por vía intraperitoneal conjuntamente con pl44 (barras llenas) o sin pl44 (barras vacías) .

Figura 4. Respuesta humoral frente a RAd LacZ inducida al día 15 en ratones BALB/c tras una inmunización subcutánea (en IFA) con RAd LacZinact en presencia o en ausencia de pl44.

Figura 5. Respuesta humoral frente a RAd LacZ inducida en ratones BALB/c tras una segunda inmunización subcutánea (en IFA) con RAd LacZinact, en presencia o en ausencia de pi44. Figura 6. Respuesta humoral inducida en los ratones de la Figura 5 el día 7 tras la infección por vía intravenosa con 4 x 10⁸ pfu de RAd LacZact . El grupo control corresponde a ratones administrados una sola vez por vía intravenosa con 4 x 10⁸ pfu de RAd LacZact.

Figura 7. Tinciones X-gal de cortes histológicos de muestras de hígado de los ratones de la Figura 6, 7 días después de la administración de 4 x 10⁸ pfu de RAd LacZact por vía intravenosa. Figura 8. Efecto de la inclusión de pl44 en las mezclas de inmunización con FIS sobre los niveles de IL-2 (A) y de IFN-γ (B) en sobrenadantes de cultivos de linfocitos, derivados de nodulos obtenidos de ratones inmunizados sólo con FIS o con FIS+pl44. La producción de citoquinas se midió in vi tro tras reestimulación de los cultivos con 6 μM (barras vacías) o bien 30 μM (barras llenas) de FIS o de pl44.

Figura 9. Supervivencia de ratones BALB/c a los que se les administró 5 x 10⁵ células CT26 por vía intravenosa y que recibieron diferentes tratamientos (i)-(iv). A excepción del grupo control (i) que recibió sólo 5 x 10⁵ células CT26 el día 10, los tres grupos restantes fueron además inmunizados con 50 μg de AHl en IFA por vía subcutánea el día 0. Los grupos (iii) y (iv) recibieron además, 50 μg de pl44 por vía intraperitoneal a días alternos entre los días 4-20 y 10-20, respectivamente.

Figura 10. La adición del péptido bloqueante de TGF-βl pl7 al medio de cultivo de células NK de ratón inhibe su proliferación en respuesta a altas concentraciones de IL-2. En todos los casos se comparan cultivos de linfocitos

"Natural Killer" establecidos exactamente de la misma manera con y sin péptido pl7. A) Recuento de células a los tiempos señalados a partir de un cultivo de esplenocitos totales de ratón RAGl^"7'. El valor presentado corresponde a Ia media de los recuentos de 2 pocilios de 3,5 cm de diámetro en cada caso en número absoluto. B) Recuento a los tiempos señalados de un cultivo de células DX5+ purificadas magnéticamente a partir de esplenocitos de ratón RAGl^"^^', que carece de linfocitos T y B, representado como media de los recuentos de 2 pocilios de 0,4 cm de diámetro en cada caso. C) Proliferación, de células de microcultivos similares al representado en B y a esos mismos tiempos, medida como incorporación de timidina tritiada en un ensayo de 6 horas.

Figura 11. El péptido pl7 reduce los niveles de expresión en membrana de los marcadores de activación CD25 y CD69 en células NK de ratón. Los histogramas muestran los niveles de expresión por citometría de flujo de estos marcadores en células cultivadas con y sin péptido y activadas con IL-2. En el interior de cada histograma se indica la intensidad de fluorescencia media (IFM) de cada marcador. Figura 12. El péptido pl7 aumenta la citotoxicidad de células NK de ratón, activadas con IL-2 frente a diversas líneas tumorales. En las gráficas se muestran los porcentajes de lisis de líneas celulares con distinta sensibilidad a la citotoxicidad por NK. Las células efectoras se mantuvieron con y sin péptido durante 6 días en cultivo y durante el tiempo del ensayo de liberación de cromo sobre las células diana indicadas a las correspondientes proporciones entre linfocitos efectores y células dianas.

Figura 13. Las gráficas muestran la proliferación celular medida, como incorporación de timidina tritiada, en función de la cantidad de células dendríticas presentes por pocilio, en ausencia o presencia de diferentes estímulos previos y en presencia y ausencia de péptido pl7 (150 μg/ml) . El péptido pl7 incrementa la proliferación linfocitaria en ensayos de respuesta mixta leucocitaria (MLR) con CD no estimuladas o estimuladas con LPS o pie. Figura 14. La población CD25+ genera un efecto supresor de la proliferación de esplenocitos activados mediante anticuerpos Anti-CD3 (0.5 μl/poc.) (rombos), las células CD25- (cuadrado) son incapaces de generar este efecto permitiendo la proliferación celular comparada con la proliferación basal de esplenocitos en ausencia de estímulos proliferativos (triángulos) .

Figura 15. Los péptidos inhibidores de TGF-β (truncados y modificados de pl7) en un cocultivo de células T reguladoras y esplenocitos activados de ratón inhiben la acción supresora de la proliferación celular ejercida por los linfocitos T reguladores. Se puede observar el efecto dosis dependiente de los péptidos pl7(l-ll)am y Acpl7(l- 11) am sobre la acción inhibidora de linfocitos T reguladores. La inhibición ejercida es dosis-dependiente, a una concentración de 50 μM el pl7(l-ll) es capaz de inhibir el efecto supresor en un 20%, el pl7(l-ll)am en un 128% y el Acpl7 (l-ll) am en un 148% a una concentración de 25 μM. Figura 16. Los péptidos inhibidores de TGF-βl, pl44 y p 17 (l-ll) am administrados por vía intraperitoneal entre día 6 y 10 (50 μg/ratón/48h) retrasan el crecimiento tumoral a partir de la inoculación subcutánea de 50.000 células CT26 a día 0, en animales inmunizados 10 días antes con AHl.

MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

A continuación se exponen unos ejemplos del funcionamiento de la invención con carácter ilustrativo y en modo alguno limitativo del alcance de la misma.

EJEMPLO 1

En este ejemplo se estudia el efecto del péptido pl44 en un sistema en el que se utiliza TGF-βl exógeno como inductor de la diferenciación de una población de esplenocitos hacia células dendríticas.

Aislamiento y cultivo de las células dendríticas Tras sacrificar un ratón C57 macho, de 8 semanas, se le extrajo el bazo en condiciones estériles y se homogeneizó en una placa con medio limpio para obtener una suspensión celular. Las células se centrifugaron 5 minutos a 1.000 rpm y el sedimento celular obtenido se resuspendió con 1 ml/bazo de solución de lisis ACK (NH₄Cl 0,15 M, KHCO₃ 1 mM, sal sódica-EDTA 0,1 mM, pH 7,2-7,4) durante 1 minuto a 37 °C. A continuación, se centrifugó y se lavaron las células con 10 mi de medio RIO frío (RPMI-1640, 10% FBS, Glutamina, 2xlO^"5 M 2-Mercaptoetanol) para centrifugar y lavar una vez más. Finalmente, se resuspendieron las células en 50 mi de medio RIO. Se prepararon placas de 6 pocilios (Costar #3471) tratándolas con 1 mi por pocilio de medio para diferenciación de esplenocitos a dendríticas

[RIO + 10 ng/ml de GM-CSF de ratón (Peprotech, EC LTD, London, UK) + lng/ml de TGF-βl (RD Systems, Minneapolis, USA)], durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 2 mi de la suspensión celular a cada pocilio y se incubaron a 37 ⁰C y 5% CO₂. Durante las primeras semanas se cambió el medio dos veces, mediante la eliminación de 1 mi de sobrenadante y la adición de 1 mi de medio fresco (RlO + GM-CSF + TGF-βl) para dendríticas. Tras estas dos semanas se separó el medio. Se añadieron a las placas 1 mi por pocilio de medio de disociación en PBS libre de enzimas (GIBCO BRL) que se incubó 10 minutos a 37 ⁰C, seguidamente se retiró y se añadieron 2 mi de medio (RIO + GM-CSF + TGF-βl) templado. A continuación se despegaron las células mediante un pipeteo lento, y las células despegadas se centrifugaron a 1.000 rpm y fueron resuspendidas en medio fresco (Rio + GM-CSF + TGF-βl) . Las células así obtenidas, pueden ser reamplificadas por siembra en placa, repitiendo el proceso inicial.

Tratamientos de las células dendríticas A partir de un cultivo de 18 días de células dendríticas derivadas de esplenocitos, se realizaron los siguientes tratamientos durante 72 horas:

-Grupo control : células tratadas con medio para dendríticas (GM-CSF+TGF-βl) , con 0,25% de DMSO.

-Anticuerpo anti- (TGF-βl) : células tratadas con medio para dendríticas (GM-CSF+TGF-βl), con 0,25% de DMSO, al que se le añadió un anticuerpo neutralizante anti- (TGF- βl) (Pharmingen) a una concentración de 20 μg/ml. -Péptido pl44 : células tratadas con medio para dendríticas (GM-CSF + TGF-βl) , al que se le añade péptido pl44 en solución con DMSO, quedando una concentración final de péptido de 50 μg/ml al 0,25% de DMSO. A las 48 horas se renovaron los medios correspondientes a cada tratamiento y al final del tratamiento se recogieron las células por pipeteo, previo tratamiento con medio de disociación (GIBCO BRL) .

Análisis de marcadores de superficie por citometría de flujo

La determinación de marcadores de superficie, de los esplenocitos cultivados con los diferentes tratamientos, se realizó mediante citometría de flujo (FACScalibur, Becton- Dickinson, San José, CA, USA) . Las células se lavaron con 2 mi de solución salina por pocilio y a continuación se añadió 1 mi de medio de disociación en PBS libre de enzimas (GIBCO BRL) , y se incubó 10 minutos a 37 ⁰C. Seguidamente se retiró el medio y se añadió 2 mi de PBS. Se despegaron las células mediante un pipeteo lento y las células despegadas se centrifugaron a 1.000 rpm y se resuspendieron a una concentración de 2 x 10^s cel/ml en PBS. Se incubó 100 μl/pocillo de la suspensión celular obtenida, con 1 μl de los viales de anticuerpos monoclonales (Becton-Dickinson, Pharmingen) , anti-CD80, anti-CDllc y anti-MHC I de ratón conjugados con FITC (1 mg/ml) , en placas de 96 pocilios durante 30 minutos a 4 °C y en la oscuridad. Seguidamente, se lavaron las células 3 veces con PBS mediante centrifugación de la placa a 1.500 rpm (Centrifuge 5810R, eppendorf) durante 5 minutos, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo las células en 100 μl de PBS. Como control negativo, se utilizó un anticuerpo monoclonal no reactivo, conjugado con FITC (Becton-Dickinson, Pharmingen) . Durante la maduración de esplenocitos in vitro, la presencia de ciertos factores y citoquinas en el medio, pueden diferenciar las células hacia diferentes fenotipos leucocitarios. En este caso el TGF-βl está descrito como un factor necesario in vitro para que ciertos tipos celulares expresen, en superficie, marcadores asociados a las células dendríticas. Cuando estudiamos el efecto de la incubación de células dendríticas durante 72 horas en presencia de pl44 sobre los marcadores de estas células, se observó que pl44 tenía un efecto negativo sobre la expresión de MHC I, CDlIc, CD80. Este efecto va en el mismo sentido y con similar magnitud, que el producido cuando se incuban las células en presencia de anticuerpos anti- (TGF-βl) . En efecto, como se puede observar en la Figura 1, los niveles de fluorescencia asociados a cada marcador se reducen de manera similar por el tratamiento con péptido pl44 o anticuerpo anti-TGFβl. Este resultado, pone en evidencia la importancia del TGF-βl en la maduración de las células dendríticas, y sugiere que el empleo de inhibidores de esta citoquina en protocolos de inmunización, podría tener efectos importantes tanto en la inducción de respuestas humorales como celulares.

EJEMPLO 2 Actividad in vivo de un adβnovirus rβcombinante para la IL- 12 de ratón

En este ejemplo se estudia el efecto del péptido pl44 en un sistema in vivo en el que el TGF-βl actúa como supuesto antagonista de las citoquinas inducidas en este modelo. La producción de IL- 12 de ratón mediante la expresión de un transgen, incluido en el adenovirus recombinante, induce un estado inflamatorio a través de la inducción de una cascada de factores, entre los que destacan el IFN-γ y el óxido nítrico. El TGF-βl ha sido descrito como un inhibidor de la producción y acción biológica de la IL-12, IFN-γ y NO (Pardoux C. et al., 1999? Schini V. B. et al., 1992). En este modelo se administraron por vía intraperitoneal IxIO⁸ pfu de RAd IL-12 de ratón en 500 μl de suero salino a grupos de 3 ratones BALB/c de 4 a 8 semanas de edad (Harían) , distribuyendo los animales en los siguientes grupos:

- RAd IL-12: estos animales recibieron IxIO⁸ pfu de RAd IL- 12 de ratón el día 0. - RAd IL-12 + pl44 : estos animales recibieron el mismo tratamiento que el grupo anterior pero se les administró durante 5 días, tras la administración del adenovirus, el péptido pi44 a una dosis diaria de 100 μg en 500 μl de SF que contenía 0,66% de DMSO.

A ambos grupos se les extrajeron muestras de sangre los días 6 y 9 tras la inmunización para la posterior cuantificación de los niveles de IFN-γ y NO en suero. Medición de los niveles de IFN-γ

La cantidad de IFN-γ se midió mediante un ELISA comercial (Mouse IFN-γ Duoset ELISA Development System,

Genzyme, Cambridge y OPTEIA Mouse IFN-γ Set, Pharmingen, San Diego, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como pg/ml de IFN- γ utilizando una curva estándar de cantidades conocidas de

IFN-γ.

Medición de los niveles de óxido nítrico

Los niveles de producción de NO, se toman como medida indirecta de niveles de nitritos y nitratos en suero. La medición se lleva a cabo mediante un ensayo de quimioluminiscencia utilizando el detector de óxido nítrico Sievers NOA 280, siguiendo el método recomendado por el fabricante (Sievers Instruments Inc. 1996) .

La técnica utilizada permite medir nitratos o nitratos + nitritos dependiendo del procedimiento de reducción de NO utilizado. Los nitritos presentes en las muestras fueron reducidos a NO por incubación con 350 mM de Nal en ácido acético glacial según la siguiente reacción:

I^' + NO₂ ^" + 2 H⁺ > NO + ^x/₂ I₂ + H₂O

En la medición de nitritos y nitratos, éstos fueron reducidos a NO por incubación con 50 mM de VCl₃ en HCl IN a 90 ⁰C según la siguiente reacción:

2 NO₃ ^" + 3 V⁺³ + 2 H₂O > 2 NO + 3 VO₂ ⁺ + 4 H⁺

La reducción a NO ocurre en la cubeta del detector. El NO resultante de cualquiera de las dos reacciones anteriores, es transportado al detector por una bomba de vacío. En el detector se produce la reacción de quimioluminiscencia entre el NO y el ozono.-

NO + O₃ > O₂ + NO₂ ^* > NO₂ + h

La emisión del NO₂ ^* está en la región roja e infrarroja del espectro de luz y es detectada por un tubo fotomultiplicador sensible al rojo. Esta señal es cuantificada y los datos obtenidos son recogidos y procesados por un ordenador.

La administración a ratones de un adenovirus recombinante (RAd) que expresa IL-12 de ratón, genera una cascada de respuestas entre las que destacan un incremento importante de los niveles en suero de IFN-γ y de NO. Ya que los procesos de inducción de IFN-γ y de NO son afectados por los niveles de TGF-βl (Schini V. B. et al., 1992), estudiamos también el efecto de la administración del péptido pl44 sobre dichos niveles. En la Figura 2 y la

Figura 3 se indican respectivamente los niveles de IFN-γ y NO en el suero de ratones a los que se les administró una dosis de lxlO⁸ pfu de adenovirus recombinante para la IL- 12 de ratón (RAd IL-12) con o sin pl44. En la Figura 2 se muestra que la administración del péptido pl44 conjuntamente con RAd IL-12, aumenta los niveles de iFN-γ inducidos respecto a aquellos alcanzados tras la administración de sólo RAd IL-12.

En la Figura 3 se muestra el efecto de la administración de RAd IL- 12 con o sin pl44, sobre los niveles séricos de NO. La administración conjunta de RAd IL- 12 y pl44 genera un mayor nivel del NO al día 6, respecto al generado sólo con la administración de RAd IL- 12.

El efecto de pl44 en este modelo de inducción de citoquinas proinflamatorias, se puede explicar basándonos en la acción que el TGF-βl ejerce sobre la regulación, expresión y actividad de la IL-12 y de los procesos que esta citoquina activa. En efecto, está descrito que el TGF-βl ejerce una acción antagonista sobre la expresión y actividad de la IL-12 y del IFN-γ . Por lo tanto, si el pl44 neutraliza al TGF-βl, se elimina el efecto antagonista de esta citoquina sobre la expresión y actividad de la IL-12 y del IFN-γ y consecuentemente aumentan los niveles séricos de IFN-γ (Fig. 2) . En resumen, en este modelo el TGF-βl actúa frenando tanto la expresión de IL- 12, como (en forma concomitante) la expresión de IFN-γ. En consecuencia, la inhibición del TGF-βl mediante pl44 tiene el efecto de aumentar la expresión de IFN-γ.

Con respecto al efecto que el pl44 tiene sobre el aumento del NO, creemos que puede también explicarse basándose en la inhibición del TGF-βl por parte de pl44. En efecto, puesto que el TGF-βl inhibe la expresión y activación de la enzima iNOS, responsable de la producción de NO es lógico concluir que si se inhibe la citoquina, los niveles de NO tenderán a aumentar, tal como se observa en la Figura 3 al día 6.

Puesto que el IFN-γ induce la expresión y actividad de la iNOS, los resultados de las Figuras 2 y 3 son coherentes, ya que al día 6 se observa que la administración de pl44 redunda respectivamente en un aumento de los niveles de IFN-γ y de NO.

EJEMPLO 3

Inducción de anticuerpos Para analizar el efecto inmunomodulador del péptido pl44 en la respuesta humoral, se utilizaron ratones BALB/c hembras (Harían, Barcelona) de entre 6 y 8 semanas. Para la inducción de anticuerpos específicos se inoculó un adenovirus recombinante (RAd-LacZ) inactivado con calor en baño a 100 °C durante 10 minutos.

Grupos de animales y tratamientos

Se inmunizaron tres ratones por grupo, mediante la inyección por vía intraperitoneal de una mezcla de 200 μl que contenía 1 x 10⁸ pfu del adenovirus RAd-LacZ inactivado, suero fisiológico (SF) o con 50 μg de péptido pl44, todo ello emulsionado en adyuvante completo de Freund

(CFA) en relación volumétrica 1:1 como se indica en la Tabla M4. Treinta días tras la primera inmunización los animales fueron reinmunizados con las mismas mezclas, pero emulsionados en adyuvante incompleto de Freund (IFA) . Se sacaron muestras de sangre del plexo retrorbital los días 15 y 45 para cuantificar los anticuerpos anti-adenovirus generados en cada animal.

Con el fin de estudiar la posible inducción de tolerancia antigénica en los ratones tratados con pl44, el día 50 tras la I^a inyección, los ratones fueron inoculados por vía intravenosa con 4 x lθ⁸ pfu de RAd-LacZ activos en 100 μl de RPMI-1640, incluyendo un nuevo grupo de ratones control (cont iv) que sólo habían recibido la dosis intravenosa de los adenovirus LacZ activos. Se sacaron muestras de sangre a los 7 días en todos los grupos. Seguidamente se sacrificaron los animales para incluir muestras hepáticas en OCT^Θ (Tissue-Tek®, SAKURA, The Netherlands) para la posterior evaluación de la expresión de LacZ en el hígado. Tabla 1. Composición de las mezclas de inmunización de los distintos grupos con adenovirus inactivados por calor.

Grupos RAd-LacZ p144 CFA/IFA SF

RAd-LacZ 50μl (1x10⁸ pfu) - 100μl 50μl

RAd-LacZ + p144 50μl (1x10⁸ pfu) 50μl (50μg) 100μl

Cuantificación de anticuerpos anti-RAd LacZ en el suero

La detección de anticuerpos en suero frente a RAd-LacZ se realizó mediante ensayos ELISA utilizando placas de 96 pocilios de fondo plano Maxisorp^β (Nunc, Roskilde, Denmark) , basándose en el sistema estreptavidina-biotina usando como revelador el ácido 2, 2' -azino-bis-3- etilbenzotiazolin-6-sulfónico (ABTS) . Las placas se incubaron durante toda la noche a 4 ⁰C con 50 μl por pocilio de una solución de 75 μl de RAd-LacZ 10¹⁰ pfu/ml en 10 mi Na₂CO₃ 0,1 M (pH=10,5). Posteriormente se realizaron 3 lavados con 200 μl por pocilio de tampón de lavado PBST

(tampón fosfato salino pH=6 con 0,1% de Tween 20) . Las uniones inespecíficas se bloquearon por incubación de las placas durante una hora a temperatura ambiente con 400 μl por pocilio de PBST con 1% de leche en polvo (PLT) . Las placas se vaciaron y se realizaron tres lavados con PBST.

Se añadieron 4 μl de suero en 100 μl de PLT haciendo 8 diluciones dobles seriadas y se incubaron las placas 1 hora en estufa a 37 ⁰C. Se lavó tres veces con PBST y se incubó durante una hora a 37 ⁰C con 50 μl por pocilio, de una dilución ¹ZiOOo en PBST de anticuerpo biotinilado anti-IgG de ratón obtenido en cabra (Amersham) . Se lavó tres veces con PBST y se añadieron 50 μl por pocilio de una solución ¹Z₅₀₀ de estreptavidina-peroxidasa (Amersham) . Después de 1 hora de incubación se realizaron tres lavados con PBST y se procedió al revelado de la placa. Como substrato de la reacción de revelado se utilizó el ABTS, que da coloración verde en presencia de peróxido de hidrógeno y la enzima peroxidasa. Se preparó una solución con 10 tnl de ácido acético 0,6% (pH=4,6), 7,5 μl de H₂O₂ al 33% (v/v) y 100 μl de ABTS 40 mM. Se añadieron 100 μl por pocilio y al cabo de una hora se leyó la placa a 405 nm en un lector Multiskan Plus MKII (Labsystem, Helsinki, Finland) .

Tinción in situ de la expresión del transgen (Tinción X-gal)

Los cortes de criostato (6 μm) a partir de las preparaciones de muestras hepáticas incluidas en un compuesto para corte óptimo en criostato ("optimal cutting temperature compound" , OCT) , se secaron a temperatura ambiente. A continuación, se fijaron con glutaraldehido al 0,5% durante 10 minutos, añadiendo 200 μl por preparación. Seguidamente se realizaron 3 lavados en PBS, para añadir a continuación 200 μl de la mezcla de tinción: K₃Fe(CN)₆ 30 mM, K₄Fe(CN)₆ 30 mM, X-GaI 20 ng/ml y MgCl₂ en PBS. Las preparaciones se incubaron durante 12 horas a 37 ⁰C, tras lo cual se realizaron 3 lavados en PBS y una vez secas, se procedió a montar las preparaciones.

La utilización de ciertos virus recombinantes como herramientas de terapia génica, tiene el inconveniente de que pueden utilizarse pocas veces debido a la inducción de respuestas de anticuerpos frente al virus. En efecto, si el virus es administrado más de una vez, su efecto se ve notablemente (o completamente) mermado debido a que los anticuerpos inducidos en las primeras administraciones son capaces de neutralizar al virus administrado en posteriores tratamientos. Por este motivo, decidimos estudiar el papel de pl44 en un proceso de inducción de anticuerpos frente a un adenovirus recombinante . La idea básica detrás de este experimento fue estudiar si la neutralización del TGF-βl por parte de pl44, podría o no inhibir la producción de anticuerpos, o incluso inducir tolerancia inmunológica frente al adenovirus en administraciones sucesivas. Así, en un primer experimento inmunizamos ratones con adenovirus recombinante para Lac Z inactivado por el calor (RAd LacZinact) . Esta inmunización se llevó a cabo en presencia o ausencia de pl44. Tal como se muestra en la Figura 4, la primera inmunización no tuvo un efecto cuantificable mediante ELISA sobre la producción de anticuerpos anti-RAd Lac Z.

Sin embargo, tras una segunda inmunización se observó un efecto muy distinto (Fig. 5) . Así, la segunda inmunización con RAd LacZ inactivado en ausencia de pl44, indujo títulos altos de anticuerpos frente a RAd LacZ. Sin embargo, al incluir pl44 en la mezcla de inmunización, el título de anticuerpos frente a RAd LacZ fue claramente inferior al obtenido sólo con RAd LacZ inactivado.

Tras estos resultados, se decidió estudiar si los ratones tratados con pl44 habían podido desarrollar algún grado de tolerancia frente a los antígenos presentados en forma de adenovirus inactivado. Para ello, los grupos de ratones mencionados anteriormente, fueron inoculados por vía intravenosa el día 20 (tras la segunda inmunización) con adenovirus LacZ activo (RAd LacZact) , en ausencia del péptido pl44. Siete días después se σuantificó la expresión del transgen in vivo, y se analizó tanto la presencia de anticuerpos en los sueros como la expresión de LacZ en los hígados. Como se puede observar en la Figura 6, el título de anticuerpos se igualó aproximadamente en los dos grupos de ratones, indicando que no se había inducido tolerancia y que pl44 es capaz de inhibir la respuesta humoral, sólo cuando se incluye en la mezcla de inmunización con el antígeno, en el presente caso el adenovirus inactivado por el calor.

El análisis histológico el día 7 de los hígados de los ratones de la Figura 6, mostró que sólo el grupo control infectado por vía intravenosa con RAd LacZact, fue positivo a la tinción LacZ, lo que sugiere que en los otros grupos, la presencia de anticuerpos anti-adenovirus en suero fue suficiente para neutralizar la administración de virus RAd LacZact, impidiendo la infección en el hígado y la consiguiente expresión del gen LacZ (Fig. 7) .

EJEMPLO 4

En este ejemplo se estudia como afecta la presencia del péptido pl44 en una mezcla de inmunización junto con un péptido (FIS), que actúa como un determinante "T helper" .

Este péptido induce un perfil de citoquina que favorece la producción de anticuerpos frente a diferentes antígenos.

Inducción de respuestas ¹¹T helper" El péptido FIS está caracterizado como un determinante

"T helper" derivado de la mioglobina de cachalote, aminoácidos (106-118) . Este péptido ha sido ampliamente utilizado para la inducción de anticuerpos frente a péptidos hapténicos . Quisimos analizar el efecto del péptido pl44 en la inducción de un perfil de citoquinas caracterizado entre otros por el incremento de IFN-γ e IL-

2. En este modelo se administraron por vía subcutánea a grupos de 3 ratones hembra BALB/c de 4 a 8 semanas de edad

(Harían, Barcelona) , distribuyendo los animales en los siguientes tratamientos:

-FIS: ratones que recibieron por vía subcutánea una emulsión 1:1 de adyuvante incompleto de Freund y suero salino que contenía 50 μg de FIS. -PIS+pl44: ratones que recibieron por vía subcutánea una emulsión 1:1 de adyuvante incompleto de Freund y suero salino que contenía 50 μg de FIS y 50 μg de pl44.

A los diez días de la inmunización se sacrificaron los animales y se extrajeron los nodulos linfáticos popliteales, inguinales y periaórticos. Los nodulos se homogeneizaron con una jeringa y se lavaron tres veces a 4 ⁰C con medio de lavado (medio RPMI 1640 limpio) . A continuación se resuspendieron las células en medio completo (RPMI 1640 con 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 5x10-5 M de β-mercaptoetanol, 25 mM de Hepes y piruvato sódico, a una concentración de 5,3 x 10⁶ células /mi añadiéndose 150 μl en cada pocilio de una placa de 96 pocilios de fondo plano. Las diferentes concentraciones de péptido (6 y 30 μM) se añadieron por triplicado y en un volumen de 100 μl por pocilio. Se cultivaron las células en una estufa a 37 ⁰C y con 5% de CO2 durante dos días. A las 24 horas se recogieron 50 μl del sobrenadante en placa de 96 para medir la IL-2 producida por las células, y a las 48 horas se recogieron 50 μl del sobrenadante para medir IFN-γ. Estos sobrenadantes se congelaron a -20 ⁰C hasta la cuantificación de la concentración de las citoquinas.

Medición de los niveles de IPN-γ

La cantidad de IFN-γ se midió mediante un ELISA comercial (Mouse IFN-γ Duoset ELISA Development System, Genzyme, Cambridge y OPTEIA Mouse IFN-γ Set, Pharmingen, San Diego, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron como pg/ml de IFN- γ utilizando una curva estándar de cantidades conocidas de IFN-γ. Medición de los niveles de IL-2

La cantidad de IL-2 en cada sobrenadante se midió estudiando la proliferación de la línea celular CTL. L, cuyo crecimiento es dependiente de IL-2 (Lai M. et al., 1987)

Esta línea se mantuvo en cultivo con medio completo suplementado con IL-2 a una concentración de 10 U/ml .

Para realizar el ensayo se cultivaron los sobrenadantes con 3000-5000 células CTL. L por pocilio, diluidos hasta un volumen final de 100 μl . Tras 24 horas de cultivo se añadieron 0,5 μCi (25 Ci/mmol) de timidina tritiada (Amersham) por pocilio y se recogieron las células 20 horas después a placas con filtro (UniFilter-96 GF/c^'5, Perkin Elmer) con un recolector (Piltermate 196 Harvester, Packard) . La radioactividad se cuantificó, en un contador de centelleo (Top Count, Microplate Scintillation Counter,

Packard) tras adición de 25 μl de líquido de centelleo

(MICROSCINT ^@, Packard, Bioscience Company) por pocilio.

Los resultados de las cuentas se expresaron como mU/ml de IL-2 interpolando las cuentas de cada pocilio en una curva estándar.

El péptido FIS es un determinante "T helper" que abarca los residuos 106 a 118 de la secuencia de la mioglobina de cachalote. La inmunización de ratones BALB/c con FlS induce la activación de linfocitos T productores de IFN-γ y de IL-2 en respuesta al péptido. Puesto que el TGF- β juega un papel en la inducción de respuestas inmunitarias, se estudió el efecto de pl44 sobre la producción de citoquinas tras la inmunización de ratones con FIS, en presencia y ausencia de pl44. Para ello se inmunizaron ratones BALB/c con 50 μg de FIS sólo, o bien con 50 μg de FIS en presencia de 50 μg de pl44. Como se puede observar en la Figura 8, la presencia de péptido pl44 en las mezclas de inmunización disminuye la producción de IL-2 y de IFN-γ frente a FIS. Es importante indicar, que pl44 también es probablemente presentado por las moléculas MHC de clase II del ratón BALB/c como un DTh, puesto que al reestimular in vitro frente a pl44 se observa producción de IL-2 y también algo de IFN-γ. Los resultados sugieren que la inclusión de pl44 en la mezcla de inmunización tiene un efecto negativo sobre la capacidad "helper" de los DTh, lo que probablemente es debido a la neutralización del TGF-βl que sería necesario en el momento de la inducción de respuestas inmunitarias.

EJEMPLO 5 A. Efecto del péptido pl44 en una mezcla de inmunización con un DTc (AHl) y un DTh (LVQ) del antígeno tumoral.

Un DTc es un péptido que es presentado por el MHC-II en la superficie de la célula presentadora, y un DTc un péptido que es presentado por el MHC-I en la superficie de la célula presentadora y en células tumorales. Se sabía que la inmunización conjunta con un DTc (péptido AHl) y un DTh (péptido LVQ) , ambos péptidos provenientes de la proteína gp70 del antígeno tumoral expresado por las células CT26, era capaz de proteger frente al crecimiento subcutáneo de

500.000 células tumorales CT26. Dado que el TGF-β es importante en el proceso de inducción de la respuesta inmunitaria, se quiso estudiar el efecto del péptido pl44 sobre la inducción de la respuesta responsable de la protección frente al crecimiento con células CT26. Como se indica en la Tabla 1 se inmunizaron tres grupos de ratones BALB/c con las siguientes mezclas en adyuvante incompleto de Freund: (i) con AHl + LVQ, (ü) con. AHl + LVQ + pl44 y (iii) sólo con adyuvante incompleto de Freund. Se observó, que sólo la inmunización con AHl + LVQ logró proteger a los ratones y que por lo tanto la incorporación de pl44 en la mezcla de inmunización, tuvo un efecto negativo sobre la protección frente al crecimiento con células CT26.

Tabla 2. La administración de pl44 junto con AHl + LVQ tiene un efecto negativo sobre la protección frente al crecimiento de células CT26 alcanzada tras inmunización de ratones BALB/c con AHl + LVQ.

. . . . . , Grado de

Mezcla de inmunización . protección

(AHl + LVQ) en EFA 3 /3

(AHl + LVQ + p 144) en IFA 0 /3

IFA 0 /3

Puesto que el péptido pl44 es capaz de bloquear la actividad del TGF-βl, los resultados obtenidos sugieren que la citoquina juega un papel crucial en la inducción de una respuesta antitumoral eficaz y que su bloqueo en esta etapa tiene un efecto negativo en la inducción de respuestas antitumorales protectoras. Este resultado está en consonancia con otro anterior (Fig. 8) en el que se muestra como la administración de pl44 junto al DTh FIS bloquea la activación de la respuesta Th frente al FIS.

B. Efecto del péptido pl44 tras la inmunización con un DTc (AHl) en un modelo de metástasis pulmonar.

Se especuló que la neutralización del TGF-βl, una vez inducida la respuesta inmunitaria, podría tener un efecto beneficioso sobre la evolución de la misma. Para probar este concepto, se estudió el efecto de administrar pi44 a diferentes tiempos y diferentes protocolos de inmunización, sobre la supervivencia de ratones en un modelo de metástasis pulmonar inducido mediante la administración de 5 x 10⁵ células CT26 por vía intravenosa.

Se sabía por experiencia previa, que la inmunización sólo con el DTc AHl, producía cierto retraso en la aparición de tumores tras la administración por vía intravenosa de células CT26. Por este motivo, se comparó en un experimento de supervivencia, la inclusión de pl44 a diferentes tiempos tras la inmunización con AHl. Así, los animales del grupo (i) recibieron sólo la administración de células CT26, los grupos de animales (ii) , (iii) y (iv) fueron inmunizados el día 0 por vía subcutánea con 50 μg de AHl en IFA (adyuvante incompleto de Freund) y posteriormente se les administró 5 x 10⁵ células CT26 por vía intravenosa el día 10. El grupo (iii) recibió además 50 μg de pl44 en 500 μl de SF (suero fisiológico) por vía íntraperitoneal a días alternos entre los días 4 y 20. El grupo (iv) , al igual que el grupo (iii) , recibió 50 μg de pl44 en 500 μl de SF por vía Íntraperitoneal a días alternos, sólo entre los días 10 y 20. Como se puede observar en la Figura 9, la inmunización con AHl (ii) sólo media un ligero retraso en la mortalidad respecto al grupo control (i) no inmunizado. En los animales inmunizados con

AHl, el tratamiento con pl44 refuerza el efecto de supervivencia, sobre todo en el grupo (iv) en que se administró pl44 entre los días 10 y 20.

C. Efecto de los péptidos pl44 tras la inmunización con un DTc (AHl) en un modelo tumoral subcutáneo.

A continuación, se estudió el efecto de pl44 en un modelo de progresión tumoral menos agresivo que la administración de CT26 por vía intravenosa. En este nuevo modelo se inmunizaron ratones con 50 μg de AHl el día 0 y diez días más tarde se les administró 5 x 10⁵ células CT26 por vía subcutánea. Además, con el fin de probar el efecto de bloquear el TGF-βl sobre la protección frente a las células tumorales CT26, otros dos grupos de ratones (grupos 2 y 3) se trataron a días alternos por vía intraperitoneal entre los días 10-30 con 50 μg de pl44.

Tabla 3 La administración de pl44 tras una inmunización con AHl tiene un efecto positivo sobre la protección frente al crecimiento de células CT26 en ratones BALB/c con AHl.

Animales protegidos

Grupos Día O Día 10 Día 10-30 el día 50

1 50 μg AHl 5 x lO⁵ CT26 SF 0 /10

2 50 μg AHl 5 x 10⁵ CT26 50 μg pl44 cada 48 h 4 /10

Como se puede observar en la Tabla 3, el bloqueo de TGF-βl diez días después de la inmunización con AHl, genera una protección frente al crecimiento tumoral medida el día

50 tras la administración subcutánea de las células tumorales. Esta protección alcanzó al 40% de los animales.

Dado el aumento de la eficacia de protección frente al crecimiento de células tumorales, debido a la neutralización de TGF-βl, es de gran interés y podrá ser una estrategia a adoptar a fin de obtener mejores respuestas antitumorales . EJEMPLO 6

Modulación de los células NK

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivos de células NK

Se realizaron a partir de células de bazo de ratones RAGl^"/^"

, carentes de linfocitos T y B. En algunos casos, el total de esplenocitos se puso en cultivo en placas de 6 pocilios a 4xlO⁶ de células por mi en medio RPMI enriquecido con 10%

SBF, L-glutamina, antibióticos, aminoácidos no esenciales, β-mercaptoetanol e interleuquina-2 recombinante humana

(Chiron) a 6000 Ul/ml. En la mitad de los pocilios se añadió péptido pl7 a una concentración de 150 μg/ml . A las 48 h se retiró el medio y se lavaron los pocilios con medio RPMI para desechar las células no adherentes . A continuación se añadió medio fresco con/sin péptido. A día +5 se volvió a cambiar el medio reponiendo esta vez todas las células y el péptido pl7 en los cultivos correspondientes. Los recuentos celulares con azul tripán se llevaron a cabo a días +5 y +6 de este cultivo. En otros casos , se purificaron células NK a partir de esplenocitos de ratón mediante selección inmunomagnética utilizando el sistema MiniMACS, bolitas anti-DX5 y columnas MS (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. Las células así obtenidas se cultivaron en placas de 48 pocilios a l,5xlθ^s/ml en el medio anteriormente descrito con/sin péptido pl7 a 150 μg/ml . A las 48h se añadió péptido nuevo a los pocilios que llevaban pl7, y los recuentos se realizaron a días +2 y +4.

Citometría de flujo

Se emplearon los siguientes anticuerpos monoclonales de rata anti-ratón marcados con PE: anti-CD25, anti-CD69 y un anticuerpo control de isotipo, todos de Pharmingen (BD) . La adquisición y análisis de las muestras se realizaron mediante un FACScalibur y el programa CellQuest.

Ensayo de proliferación con timidina tritiada

Para este ensayo se emplearon células DX5+ a días 2 y 4 de cultivo. Brevemente, se plaquearon triplicados de 10000 células por pocilio con y sin péptido, midiéndose su incorporación de timidina tritiada en el medio de cultivo habitual con IL-2 6000 Ul/ml a las 6 h de la adición de la timidita.

Ensayo de liberación de cromo

La citotoxicidad de las NK se comprobó mediante ensayos estándar de liberación de ⁵¹Cr de 4,5 h. Brevemente, se incubaron las dianas con 50 μCi de ⁵¹Cr durante 2 h, se lavaron (3 veces) y a continuación se añadieron las células efectoras a distintas proporciones, siendo la máxima 40:1 (efectoras rdianas) . Por último se midió la liberación de ⁵¹Cr debida a la lisis por células NK tras 4,5 h en un contador de centelleo TopCount (Perkin-Elmer) . La citotoxicidad se midió como el porcentaje de Cr liberado con respecto al total adquirido por las células.

Lineas celulares

Se emplearon como dianas del ensayo de citotoxicidad por NK las siguientes líneas tumorales: MC38 (carcinoma de colon) y LLC (carcinoma de pulmón) , originadas en ratones C57BL/6, y CT26 (carcinoma de colon) y RENCA (carcinoma renal) procedentes de ratones BALB/c. LLC y RENCA se cultivaron en RPMI suplementado con suero bovino fetal, antibióticos y L- glutamina y MC38 y RENCA en DMEM suplementado de la misma manera .

RESULTADOS

El péptido pl7 ejerce un claro efecto antiproliferativo sobre la población de células NK obtenidas de ratones RAGl^"''^" y cultivados ín vitro (Fig.10), en ensayos de cuantificación de proliferación mediante recuento celular directo o de síntesis de ADN (incorporación de timidina tritiada) . Al analizar el efecto de pl7 en la expresión en superficie celular de diferentes marcadores, se encontró que pl7 reduce los niveles de CD25 y CD69 (Fig.ll) medido como intensidad de florescencia media. Los marcadores CD25 y CD69 median inmunosupresión, y ambos son inducidos por el

TGF-βl. Así el péptido pl7 actúa bloqueando el efecto de

TGF-βl, sobre la inducción de estos dos marcadores (CD25 y CD69) , en esta población celular del sistema inmunitario. Por otro lado, en ensayos de citotoxicidad enfrentando esta población celular a diferentes líneas tumorales de ratón

(Fig.12), la presencia del péptido pl7 mejora la actividad citotóxica de esta población de células "Natural Killer" en mayor o menor medida. De todos estos modelos experimentales se concluye que el péptido pl7 ejerce una clara actividad biológica sobre la proliferación, diferenciación y fase efectora de las células NK.

EJEMPLO 7

Modulación de células dendríticas

MATERIAL Y MÉTODOS

Obtención de células dendríticas (CD) a partir de médula ósea de ratón:

En primer lugar las patas fueron separadas y colocadas en una placa con RPMI 10% FBS en hielo. Para obtener las médulas es necesario cortar las cabezas de los fémures y pasar medio por el interior del hueso para arrastrar las médulas a una placa con RPMI 10% FBS. A continuación se deshicieron las médulas con la ayuda de una jeringa y se recogió el contenido en un tubo Falcon que se centrifugó a

2000 rpm durante 5 minutos, tras la centrifugación se retiró el sobrenadante y se procedió al lisado de los eritrocitos, el cual se realizó con el buffer de lisis ACK. Una vez Usadas las células se procedió a realizar la depleción de aquellas poblaciones celulares que no interesan, para ello se utilizaron tanto anticuerpos comerciales como anticuerpos obtenidos a partir de ascites combinados con complemento de conejo. La depleción se realizó a una concentración celular de 2x10 células/ml a la que se añadió la siguiente mezcla: -Ascites antiCD4 a lOOμg/ml. -Ascites antiCDδ a lOOμg/ml

-Sobrenadante B220 en dilución 1/20 (antilinfocitos B) -lOμl/ml de GRl (antigranulocitos) -Complemento en dilución 1/20.

Esta mezcla fue incubada durante 50 minutos a 37 °C agitando cada 15-20 minutos aproximadamente. Transcurrido este tiempo se realizó un lavado con medio limpio RPMI y se cuantificó el número de células obtenido. Finalmente se sembraron las células en placas de 12 pocilios a una concentración final de un millón de células por mililitro (3ml/pocillo) y 20 μg/ml de las citoquinas IL-4 y GM-CSF. A día 3 y 5 desde la siembra se retiraron 2 mi de cada uno de los pocilios que se repusieron con medio fresco junto con la concentración de citoquinas correspondientes a ese volumen . El día seis se recogieron las CD, se cuantificaron y se pusieron en placas de 12 pocilios a una concentración de 1 millón/ml (3ml/pocillo) y 20μg/ml de las citoquinas IL-4 y GM-CSF y se realizó el siguiente tratamiento: - sin estímulo - sin pl7

- con pl7 (l50ug/ml) - LPS (lOug/ml) - sin pl7

- con pl7 (l50ug/ml)

- p(I:C) (lOOug/ml) - sin pl7

- con pl7 (150ug/ml)

- 1668 (IuM) - sin pl7 - con pl7 (150ug/ml)

- 3T3-CD40L - sin pl7

- con pl7 (i50ug/ml)

LPS: Lipopolisacarido; PoIi (I :C) : ARN bicatenario sintético (ácido poli inosininicopolicitidílico) . 1668: oligodeoxinucleótido (ODN).

3T3-CD40L: línea celular que produce ligando de CD40.

Las células se dejaron en presencia de los distintos estímulos durante 48 horas, transcurrido este tiempo se recogieron y cuantificaron a fin de realizar el ensayo de respuesta mixta leucocitaria, que consiste en una reacción alogénica donde células no adherentes de bazo de un ratón perteneciente a una determinada cepa se enfrentan a células dendríticas de otra cepa de ratón diferente. El objetivo de este ensayo es estudiar la capacidad presentadora de las CD, que al pertenecer a una cepa distinta de ratón presentan una restricción HLA diferente que es reconocida por los linfocitos del otro ratón haciendo que proliferen. El grado de proliferación se determina a través de la incorporación de timidina tritiada. Este parámetro indica la eficacia con la que presentan antígeno las CD. En este caso las células no adherentes se obtuvieron a partir de un ratón Balb/c y las células dendrítiσas derivan de un ratón C57.

Además las células se incubaron con diferentes estímulos para ver el efecto de pl7 en este contexto.

RESULTADOS

El péptido pl7 es capaz de incrementar la proliferación linfocitaria en ensayos de respuesta mixta leucocitaria

(MLR) como consecuencia de un incremento en la eficacia con que las células dendríticas presentan antígeno. Este efecto del péptido pl7 se produce con células dendríticas no estimuladas o estimuladas con LPS o pIC (Pig.13). Sin embargo otros estímulos (1668 y 3T-CD40L) no permiten al péptido p17 mediar una diferencia en la eficacia de la presentación antigénica y por consiguiente en la respuesta proliferativa linfocitaria. Estos resultados ponen de manifiesto el potencial de un péptido inhibidor de TGP-βl en la estimulación de células presentadoras de antígeno (CD) y la eficacia de la presentación antigénica.

EJEMPLO 8 Modulación de los linfocitos T reguladores

MATERIAL Y MÉTODOS

1. OBTENCIÓN DE ESPLENOCITOS TOTALES: Para la obtención de esplenocitos de ratones Balb-c hembras de 6 semanas, se sacrificaron 4 animales y tras la extracción del bazo se trasladaron a medio limpio para su disgregación con cristales, el homogeneizado obtenido fue filtrado (filtro de 70 Mieras) y transferido a tubos de 50 mi, para su posterior lavado y centrifugado. Las células obtenidas se incubaron durante 1 minuto en Buffer de lisis, para la eliminación de eritrocitos y posteriormente se lavó con medio de cultivo limpio. Finalmente las células obtenidas se resuspendieron en 1 mi de medio-AUTOMACS y se procedió a su recuento. 2. PURIFICACIÓN DE LINFOCITOS CD25+: la purificación de linfocitos CD25+ se realizó mediante el uso de columnas magnéticas marcando con CD25PE y tras una incubación se añadieron microesferas magnéticas anti-PE (Phycoerithrin) . Tras incubación, lavado y filtrado (filto de 30 Mieras) se pasaron las muestras por la columna magnética, obteniendo por gravedad el eluido que contiene la población CD25-. Una vez extraída la columna del campo magnético se lava por presión obteniéndose las células CD25+.

3. ENSAYO DE ACTIVIDAD SUPRESORA: Para comprobar el carácter regulador de la población CD25+ se sembraron un total de 100.000 esplenocitos por pocilio en placa de fondo en U de 96 pocilios, en un volumen de 200 μl . por pocilio, y anticuerpo Anti-CD3 (0.5 μl/poc.) solos o enfrentados con CD25+ o CD25- colocando 25.000 células por pocilio (CD25+) o 50.000 células por pocilio (CD25-) realizando diluciones dobles de la concentración de estas células.

4. ENSAYO DE INHIBICIÓN DE LA ACTIVIDAD SUPRESORA POR LOS PÉPTIDOS: En placa de 96 pocilios de fondo en U, con 200 μl vol./poc, se sembraron 100.000 esplenocitos por pocilio y anticuerpo Anti-CD3 (0.5 μl/poc.) más 25.000 linfocitos CD25+ por pocilio. A estas mezclas se añadieron péptidos (3 columnas/Péptido, 50 MicroM en I^a fila y en las tres siguientes diluciones dobles. Se ensayaron 3 Péptidos: P17(l-ll) SEQ ID NO: 3, P17(l-ll)am SEQ ID NO: 4 y AcP17(l- 11) am SEQ ID NO : 5. Tanto este ensayo como el de actividad supresora se incuban a 37⁰C durante 48 h, se les añade timidina tritiada a 0,5 μCi/poc. y se cosecha a las 8h, contando posteriormente las CPM que emiten las células de cada pocilio. 5. COMPROBACIÓN DE LA SEPARACIÓN EFECTIVA DE LOS TREG: Mareaje con anticuerpo anti-CD4 y anti-CD25 fluorescentes y análisis por citometría de flujo (89% de la población separada magnéticamente es CD4+CD25+) .

RESULTADOS

LOS CD25+ SELECCIONADOS SON LINFOCITOS T CON ACTIVIDAD REGULADORA: En la Fig.14 se evidencia como la población de esplenocitos prolifera en presencia del estimulo adecuado (AntiCD3) y en ausencia de células reguladoras. La presencia de linfocitos CD25+ produce una inhibición completa de la proliferación de los esplenocitos totales. LOS PÉPTIDOS INHIBIDORES DEL TGFB SON CAPACES DE BLOQUEAR ESA ACTIVIDAD SUPRESORA DE LOS Linfocitos T reguladores (CD25+) : Sobre la base del modelo establecido en la figura 14, los péptidos derivados del péptido pl7 son capaces de bloquear de manera dosis-dependiente el efecto antiproliferativo de la población linfocitaria CD25+. A una concentración de 50 μM el péptido AcP17 (1-11) Am y P17(l- 11) am son capaces de inhibir totalmente el efecto de los linfocitos T reguladores (Fig.15).

EJEMPLO 8 Efecto sobre el crecimiento tumoral

MATERIAL Y MÉTODOS

GRUPOS: 4 grupos de 7 ratones hembras balb-c de 6 semanas/grupo . Control

AHl + IFA s. c.

AHl + IFA s. c. + P144 (50μg i .p . /dosis/ratón)

AHl + IFA s. c. + P17(l-ll)am (50μg i .p. /dosis/ratón) DISEÑO: AHl + IFA: día -10; Péptidos: desde día -6 a días alternos hasta día 10. Medición volumen tumoral: Cada 3 días desde día 10 hasta día 41. Desafío a día 0 con CT26 (500000 células/ratón s.c. en el lomo)

RESULTADOS

DISMINUCIÓN DEL VOLUMEN TUMORAL MEDIO POR GRUPOS EN LOS TRATADOS CON PÉPTIDOS: Se estudió el efecto de los péptidos pl44 y P17(l-ll)Am en un modelo de progresión tumoral. En este modelo se inmunizaron ratones con 50 μg de AHl 10 día ante de la administración de 5 x 10⁵ células CT26. Con el fin de comprobar el efecto de bloquear el TGF-βl sobre la protección frente a las células tumorales CT26, otros dos grupos de ratones se trataron a días alternos por vía intraperitoneal entre los días 6 y 10 (50 μg/ratón/48h) con los péptidos pl44 y P17 (l-ll) Am. Estos péptidos son capaces de generar una protección frente al crecimiento tumoral medida el día 42 tras la administración subcutánea de las células tumorales. Esta protección alcanzó al 100% de los animales en el caso de pl44 (Fig.16) .

Dado el aumento de la eficacia de protección frente al crecimiento de células tumorales, debido a la neutralización de TGF-βl, se reitera el gran interés y posible desarrollo de estos péptidos en estrategias a adoptar con el fin de mejorar terapias antitumorales .

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un agente modulador de la respuesta inmune caracterizado porque comprende un péptido inhibidor de TGF- βl seleccionado entre: el péptido pl44 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 1, el péptido pl7 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO-. 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores.

2. - Un agente modulador de la respuesta inmune según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un fragmento de un péptido inhibidor de TGF-βl seleccionado entre: el fragmento pl7(l-ll) definido en la secuencia SEQ ID NO: 3, el fragmento pl7(l-ll)am que corresponde a SEQ ID NO: 4, y el fragmento Acpi7 (1-11) atn definido por la secuencia SEQ ID NO: 5.

3. - Uso de un agente modulador definido en una de las reivindicaciones 1 o 2, en la regulación de respuestas inmunes humorales, celulares o ambas.

4.- Uso de un agente modulador según la reivindicación 3 como adyuvante de vacunación.

5. - Uso de un agente modulador según la reivindicación 3 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de patologías seleccionadas entre: patologías relacionadas con microorganismos que inducen una inmunosupresión mediada por TGF-βl y cáncer.

6. - Uso de una gente modulador de la respuesta inmune según la reivindicación 5, caracterizado porque dichos microorganismos están seleccionados entre: Leíshmanía, Txypanosoma cruzii, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C, el virus de la gripe, y el virus del herpes simple.

7.- Uso de un agente modulador según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha composición es para el tratamiento de un cáncer seleccionado entre: cáncer de mama, cáncer de próstata, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de piel, hepatocarcinoma, mieloma múltiple y cáncer de estómago.

8.- Uso de un péptido inhibidor de TGF-βl seleccionado entre: el péptido pl44 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 1, el péptido pl7 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores, en la preparación de un agente modulador de la respuesta inmune.

9.- Uso de un fragmento de un péptido inhibidor de TGF-βl según la reivindicación 8, seleccionado entre-, el fragmento pl7 (1-11) definido en la secuencia SEQ ID NO: 3, el fragmento pl7(l-ll)am que corresponde a SEQ ID NO: 4, y el fragmento Acpl7 (1-11) am definido por la secuencia SEQ ID NO: 5.

10.- Uso de un péptido inhibidor de TGF-βl inhibidor de TGF-βl según una de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado porque dicho agente modulador regula las respuestas inmunes humorales, celulares, o ambas.

11.- Uso de un péptido inhibidor de TGF-βl según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque dicho agente modulador posee un efecto estimulador de la respuesta inmune.

12.- Uso de un péptido inhibidor de TGF-βl según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, como adyuvante de vacunación.

13. - Uso de un péptido inhibidor de TGF-βl según una de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque dicho agente modulador posee un efecto inhibidor de la respuesta inmune.

14.- Uso de una secuencia de ADN que codifique para un péptido inhibidor de TGF-βl seleccionado entre: el péptido pl44 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO-. 1, el péptido pl7 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores, para fabricar un agente modulador de la respuesta inmune.

15. - Uso de un sistema de expresión recombinante que codifique para un péptido inhibidor de TGF-βl seleccionado entre: el péptido pl44 cuya secuencia corresponde a SEQ ID

NO: 1, el péptido pl7 cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de los anteriores, para fabricar un agente modulador de la respuesta inmune.

16.- Uso de una secuencia de ADN según la reivindicación 14 o de un sistema de expresión recombinante según la reivindicación 15, caracterizado porque dicho agente modulador de la respuesta inmune posee un efecto seleccionado entre: estimulador e inhibidor de la respuesta inmune .

17. - Uso de un péptido inhibidor de TGF-βl cuya secuencia corresponde a SEQ ID NO: l, SEQ ID NO: 2, un péptido que posee al menos un 90% de homología con los mismos, o fragmentos de uno de los anteriores, en la preparación de una composición para el tratamiento de patologías seleccionadas entre : patologías relacionadas con microorganismos que inducen una inmunosupresión mediada por TGF-βl y cáncer.

18. - Uso de un péptido inhibidor de TGF-βl según la reivindicación 17, caracterizado porgue dichos microorganismos están seleccionados entre: Leishmania, Trypanosoma cruzii, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis C, el virus de la gripe, y el virus del herpes simple.

19.- Uso de un péptido inhibidor de TGF-βl según la reivindicación 17, caracterizado porque dicha composición es para el tratamiento de un cáncer seleccionado entre: cáncer de mama, cáncer de próstata, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de piel, hepatocarcinoma, mieloma múltiple y cáncer de estómago.