WO2005019244A1 - Péptidos con capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento beta 1 (tgf-beta1) - Google Patents

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Javier DOTOR HERRERÍAS
Ana Belén LÓPEZ VÁZQUEZ
Juan José LASARTE SAGASTIBELZA
Jesús PRIETO VALTUEÑA
Francisco BORRÁS CUESTA
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    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki

Definitions

  • the invention relates, in general, to peptides that have the ability to bind to the transforming growth factor ⁇ 1 (TGF- ⁇ 1) and its applications.
  • TGF- ⁇ 1 transforming growth factor ⁇ 1
  • the invention relates to peptides inhibiting the biological activity of TGF- ⁇ 1 through its direct binding to TGF- ⁇ 1, and its use in the treatment of diseases or pathological alterations based on an excessive or deregulated expression of TGF- ⁇ 1.
  • TGF- ⁇ 1 is a glycoprotein belonging to a superfamily of structurally related regulatory proteins (cytokines), included within one of the three isoforms described in mammals (TGF-beta 1, 2 and 3).
  • the most abundant isoform is TGF- ⁇ 1, which consists of a 25 kDa homodimer composed of 2 subunits linked by a disulfide bridge.
  • the amino acid sequence of human TGF- ⁇ 1 has been described by, for example, Derynck K et al., "Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequence and expression in normal and transformed cells”. Nature 316 (6030), 701-705 (1985).
  • TGF- ⁇ 1 is a molecule whose sequence is highly conserved in evolutionary terms. Although originally defined by its ability to induce adhesion-independent proliferation and morphological changes in rat fibroblasts, subsequent investigations have revealed that TGF- ⁇ 1 is a general inhibitor of proliferation in a large number of cell types. It is produced by a wide variety of cell types and in different tissues during all phases of cell differentiation. It produces a great variety of biological effects, generates powerful and very often opposite effects in the development, physiology and immune response. Information on the role of TGF- ⁇ 1 in hepatic differentiation and regeneration, and in hepatic fibrosis, as well as the effects of TGF- ⁇ 1 on the extracellular matrix, can be found in Spanish patent application ES 2146552 Al.
  • TGF- ⁇ 1 fibrosis associated with loss of function of an organ or tissue, or surgical or aesthetic complications
  • TGF- ⁇ 1 Strategies commonly used to inhibit the biological activity of TGF- ⁇ 1 include, among others, the use of (i) specific neutralizing antibodies, (ii) antisense oligos of the gene encoding TGF- ⁇ 1 that block its expression, or (iii) receptors soluble of TGF- ⁇ 1 that act in a similar way to antibodies.
  • the use of antibodies allows a total and specific blockade of this cytokine (TGF- ⁇ 1) although certain side effects are potentiated both by the presence of exogenous immunoglobulins in blood and by the effects derived from the systemic blockade of TGF- ⁇ 1.
  • the stability over time of immunoglobulins does not allow a control at short times of blockade in the activity of this cytokine.
  • the antisense oligo inhibit the production of TGF- ⁇ 1 at the level of gene expression, which can generate important deregulations in all the processes in which this cytokine intervenes.
  • the Spanish patent application ES 2146552 Al describes synthetic peptides derived from both TGF- ⁇ 1 and its receptors, or proteins with TGF- ⁇ 1 binding capacity, which can be used as inhibitors of the biological activity of the TGF- ⁇ l.
  • the invention generally faces the problem of searching for new compounds capable of inhibiting the biological activity of TGF- ⁇ 1.
  • the solution provided by the present invention is based on the fact that the inventors have identified peptides capable not only of binding to TGF- ⁇ 1, but also capable of inhibiting the biological activity of TGF- ⁇ 1 through its direct binding to TGF- ⁇ 1 itself.
  • Some of these peptides have been identified through the use of the technology associated with phage libraries that allows the determination of peptides, typically between 6 and 15 amino acids in size, which have a high affinity binding with TGF- ⁇ 1, quantifying, subsequently, by means of in vitro and in vivo tests, the capacity of inhibition of the biological activity of the TGF- ⁇ 1 of the different peptides.
  • Other peptides have been obtained by truncation of peptides previously identified by said technology associated with phage libraries.
  • Peptides capable of binding to TGF- ⁇ 1 in particular, those capable of inhibiting the biological activity of TGF- ⁇ 1 by direct binding to TGF- ⁇ 1 are potentially useful for the treatment of diseases and pathological disorders associated with over expression or deregulated of TGF- ⁇ 1.
  • peptides capable of binding to TGF- ⁇ 1 provide a tool for studying the biological role of TGF- ⁇ 1 (still to be elucidated in many fields of regulation of different biological processes).
  • one aspect of this invention relates to peptides possessing the ability to bind to TGF- ⁇ 1.
  • said peptides have, in addition, the ability to inhibit the biological activity of TGF- ⁇ 1.
  • the invention in another aspect, relates to a pharmaceutical composition comprising at least one of said peptides.
  • the invention relates to the use of said peptides in the preparation of a medicament for the treatment of diseases and pathological alterations associated with an excessive or deregulated expression of TGF- ⁇ 1.
  • diseases or pathological alterations associated with an excess or deregulated expression of TGF- ⁇ 1 include fibrosis associated with loss of function of an organ or tissue as well as surgical and / or aesthetic complications.
  • the invention relates to DNA sequences encoding said peptides.
  • the invention in another aspect, relates to a DNA construct comprising a DNA sequence encoding a peptide provided by this invention.
  • the invention in another aspect, relates to a vector comprising said DNA sequence or said DNA construct.
  • the invention relates to a host cell, such as a transformed host cell, comprising said DNA construct or said vector.
  • the invention relates to a method for producing a peptide provided by this invention which comprises culturing said host cells under conditions that allow the expression of said peptide and, if desired, recovering the obtained peptide.
  • the invention relates to the use of said sequences of
  • Figure 1 shows schematically the position of a 15 amino acid (aa) peptide, genetically fused to the pIII protein, on the surface of the filamentous bacteriophage M13.
  • Figure 2 schematically shows the gene position of the insert, which codes for a 15 aa peptide, in the bacteriophage MI 3 genome and the position of the peptide in the pIII protein sequence.
  • FIG. 3 shows schematically the selection of peptides by the "Biopanning" technique.
  • the biotinylated TGF- ⁇ 1 is immobilized on streptavidin-containing plates (through the biotin-streptavidin linkage).
  • the phage library is selected on the basis of the interaction between TGF- ⁇ 1 and the peptides presented by the phages. Phages with low affinity for TGF- ⁇ 1 are eliminated by washed. The phages retained in the plate are eluted by decreasing the pH.
  • Figure 4 is a representation of a tree of sequence analogies between the peptides of 15 amino acids identified by a phage library.
  • Figure 5 is a diagram showing the effect of the concentration of TGF- ⁇ 1 on the growth of the cell line Mv-1-Lu, expressed as tritiated thymidine uptake in counts per minute (c.p.m.).
  • Figure 6 is a diagram illustrating the protocol for induction of acute liver damage (see Example 3).
  • the invention relates to a peptide, hereinafter, peptide of the invention, whose amino acid sequence comprises between 3 and 15 consecutive amino acid residues of an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO. : 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 and
  • the peptides of the invention have the ability to bind to TGF- ⁇ 1. Some of said peptides also have the ability to inhibit, in vitro and / or in vivo, the biological activity of TGF- ⁇ 1.
  • the ability of the peptides of the invention to bind to TGF- ⁇ 1 can be determined by any appropriate method that allows determining the binding between two molecules, for example, by an affinity assay, comprising contacting the TGF- ⁇ 1 with the peptide to be tested under conditions that allow the binding of said peptide to TGF- ⁇ 1 and evaluating the binding between the peptide and TGF- ⁇ l.
  • said affinity assay can be performed using radiolabeled TGF- ⁇ 1, for example, human I-TGF- ⁇ 1, as described in
  • the compound that may be labeled is the peptide to be tested.
  • this type of affinity assays comprises contacting TGF- ⁇ 1, for example, immobilized on a plate blocked with streptavidin, with the peptide whose binding capacity to TGF- ⁇ 1 is desired, and, after incubation for a period of time. of appropriate time, analyze the binding of the peptide to TGF- ⁇ 1. Peptides with low affinity for TGF- ⁇ 1 are eliminated by washing while peptides with higher affinity remain bound to TGF- ⁇ 1 and can be released by breaking the molecular interactions between both molecules, which can be done, for example, by lowering the pH .
  • TGF- ⁇ 1 By assaying the peptide against different concentrations of TGF- ⁇ 1, or vice versa, an idea of the affinity of the peptide in question against TGF- ⁇ 1 can be obtained.
  • the ability of the peptides of the invention to inhibit the biological activity of TGF- ⁇ 1 in vitro can be evaluated and, if desired, quantified, using a growth inhibition assay of the Mv-l-Lu cell line, a cell line derived from mink lung epithelium whose proliferation is inhibited by TGF- ⁇ 1 (see Example 2).
  • the ability of the peptides of the invention to inhibit the biological activity of TGF- ⁇ 1 in vivo can be evaluated and, if desired, quantified by an animal model assay of acute liver injury induced, for example, by administration of tetrachloride of carbon (CCL;) (see Example 3).
  • acute liver damage generates a cascade of effects and physiological responses that include the elevation of TGF- ⁇ 1 levels, responsible, among other effects, for the expression of the type I collagen gene, among others.
  • pharmaceutically acceptable salts of the peptide of the invention include the salts usually used to form metal salts or acid addition salts. The nature of salt is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • pharmaceutically acceptable salts of the peptide of the invention can be obtained from acids or bases, organic or inorganic. Said salts can be obtained by conventional methods well known to those skilled in the art.
  • the invention provides a peptide comprising 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 consecutive amino acid residues of an amino acid sequence selected from SEQ. ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22, and their pharmaceutically acceptable salts.
  • the invention provides a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22, and its pharmaceutically acceptable salts.
  • the invention provides a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO.
  • These peptides comprise between 9 and 14 consecutive amino acid residues of the amino acid sequence of the peptide identified by SEQ ID NO: 17 and have been obtained by truncation of said peptide (Example 4).
  • the invention provides a peptide selected from the group consisting of the peptides identified by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 and their pharmaceutically acceptable salts.
  • the technology associated with phage libraries has been used to determine peptides that have a high affinity binding with TGF- ⁇ 1, and subsequently quantify them by means of assays in vitro. In vitro and in vivo, the capacity of inhibition of the biological activity of the TGF- ⁇ 1 of the different peptides.
  • the invention provides a method for the identification of peptides that have the ability to bind to TGF- ⁇ 1 comprising:
  • a phage library comprising a plurality of filamentous phages, the genome of each of said phages containing a nucleotide sequence encoding a different peptide linked to the protein gene of the phage coat, thereby each phage contains a different peptide genetically fused to a phage coat protein; (ii) selecting, by affinity assay, the phage containing the peptides that bind with the highest affinity to TGF- ⁇ 1; and (iii) determining the sequence of the peptides that bind to TGF- ⁇ 1, from the corresponding DNA sequences inserted in the phages selected in step (ii) and coding for said peptides that bind to TGF- ⁇ 1.
  • a phage library composed of a plurality of filamentous bacteriophages was used (MI 3) each containing a different peptide, 15 amino acids, genetically fused to a phage coat protein, in this case bound to the N-terminal end of the pIII coat protein.
  • MI 3 filamentous bacteriophages
  • the phage presents on its surface a peptide of 15 amino acids, in each of the five molecules of the surface protein, while in its interior it contains the DNA that codes for said peptide sequence.
  • the coding sequence for the peptide comes from a degenerate sequence in each of the 15 positions with the 20 natural amino acids, which allows the
  • said affinity assay consists of an in vitro selection protocol termed "biopanning". Briefly, said technique consists of the incubation of a set of phages representing, for practical purposes, all the variants of peptides of 15 amino acids (in this case), in a plate blocked with streptavidin to which biotinylated TGF- ⁇ l is added. . The biotinylated TGF- ⁇ 1 is anchored to the plate through the biotin-streptavidin interaction, which is correctly presented for its interaction with the peptides carried by the phages.
  • the unbound phages are removed by washing and then the phages bound specifically are eluted by a pH decrease that breaks the molecular interactions between the TGF- ⁇ 1 and the peptides presented by the phages.
  • the eluted phages are then amplified by infection in a bacterial strain. The process is repeated a total of 3 rounds, so that the content of phages that bind specifically and with high affinity to TGF- ⁇ l is enriched.
  • the concentration of Biotinylated TGF- ⁇ l used to block the plates is progressively reduced in each round, for example, from 2.5 to 0.01 and finally 0.001 ⁇ g / ml.
  • the phages selected in each round have an increasing degree of affinity for TGF- ⁇ 1.
  • the phages that have been selected for their affinity with TGF- ⁇ 1 are sequenced with primers. This allows to obtain the sequences of the peptides presented in the phages.
  • Example 1 illustrates the selection of peptides that bind to TGF- ⁇ 1 by phage library, selection by "biopanning” and sequencing of peptides with high affinity binding to TGF- ⁇ 1.
  • the invention also provides a method for the identification of peptides having the ability to bind to TGF- ⁇ 1 which comprises truncating peptides possessing the ability to bind to TGF- ⁇ 1 and testing the ability of such truncated peptides to bind to TGF- ⁇ 1.
  • the truncated peptides can be obtained by any conventional method, for example, by chemical synthesis (given their size) of the truncated versions of the peptide by their N-terminal, C-terminal or both ends.
  • the ability of said truncated peptides to bind TGF- ⁇ 1 can be determined by any appropriate method that allows determining the binding between two molecules, for example, by an affinity assay, which comprises contacting the TGF- ⁇ 1 with the peptide to be tested. under conditions that allow the binding of said peptide to TGF- ⁇ 1 and evaluate the binding between the peptide and TGF- ⁇ 1, as previously mentioned. Also, the ability of said truncated peptides to inhibit, in vitro and / or in vivo, the biological activity of TGF- ⁇ 1 can be assayed by any of the assays mentioned in this disclosure.
  • TGF- ⁇ 1 Due to the role of TGF- ⁇ 1 in numerous biological processes, a consequence of the inhibitory activity of TGF- ⁇ 1 of the peptides of the invention has to do with the potential development of a new family of drugs useful for the treatment of diseases and diseases. pathological alterations associated with an excessive or deregulated expression of TGF- ⁇ 1, since such peptides allow to block the excess or deregulation of said cytokine that causes damage.
  • the peptides of the invention can be used in the treatment of diseases or pathological alterations associated with an excess expression or dysregulated of TGF- ⁇ 1, such as (i) fibrosis associated with loss of function of an organ or a tissue, for example, pulmonary fibrosis, liver fibrosis (cirrhosis), renal fibrosis, corneal fibrosis, etc., as well as ( ii) surgical and / or aesthetic complications, for example, fibrosis associated with skin and peritoneal surgery, fibrosis associated with burns, osteoarticular fibrosis, keloids, etc.
  • diseases or pathological alterations associated with an excess expression or dysregulated of TGF- ⁇ 1 such as (i) fibrosis associated with loss of function of an organ or a tissue, for example, pulmonary fibrosis, liver fibrosis (cirrhosis), renal fibrosis, corneal fibrosis, etc., as well as ( ii) surgical and / or aesthetic complications, for example, fibrosis
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of a peptide of the invention together with at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition provided by this invention may contain one or more peptides of the invention, together with, optionally, one or more, alternative TGF- ⁇ l inhibitory compounds.
  • Said pharmaceutical composition is useful for its administration and / or application in the human or animal body, preferably in the human body.
  • peptides such as the peptides of the invention, instead of using antibodies or antisense oligos, has numerous advantages, since they are small molecules, with a higher diffusion capacity and a shorter half-life.
  • the peptides may have a high affinity for TGF- ⁇ 1, but they degrade more rapidly than the antibodies, and the adverse side effects can be controlled by dosing.
  • the vehiculization of the peptides to target organs or tissues in comparison with other types of compounds is also more accessible.
  • the peptides of the invention can be administered to treat the diseases and pathological alterations associated with an excessive or deregulated expression of TGF- ⁇ 1 by any means that produces the contact of the peptide of the invention with the site of action thereof in the human body. or animal
  • the amount of peptide, derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof that may be present in the pharmaceutical composition provided by this invention may vary within a wide range.
  • the dosage for treating a disease or pathological disorder associated with an excessive or deregulated expression of TGF- ⁇ 1 with the peptides and / or pharmaceutical compositions of the invention will depend on numerous factors, including age, condition of the patient, severity of the disease or pathological alteration, the route and frequency of administration and of the peptide of the invention to be administered.
  • compositions containing the peptides of the invention can be presented in any form of administration, for example, solid or liquid, and can be administered by any appropriate route, for example, orally, parenterally, rectally or topically, for which they will include the pharmaceutically acceptable excipients necessary for the formulation of the desired administration form, for example, ointments (lipogels, hydrogels, etc.), eye drops, aerosols by nebulization, injectable solutions, osmotic pumps, etc.
  • ointments lipogels, hydrogels, etc.
  • eye drops eye drops
  • aerosols by nebulization injectable solutions
  • osmotic pumps etc.
  • the invention relates to the use of a peptide of the invention in the preparation of a medicament for the treatment of diseases or pathological alterations associated with an excess or deregulated expression of TGF- ⁇ 1, such as fibrosis associated with loss of function of an organ or tissue, for example, pulmonary fibrosis, hepatic fibrosis (cirrhosis), renal fibrosis, corneal fibrosis, etc .; or surgical and / or aesthetic complications, for example, fibrosis associated with skin and peritoneal surgery, fibrosis associated with burns, osteoarticular fibrosis, keloids, etc.
  • diseases or pathological alterations associated with an excess or deregulated expression of TGF- ⁇ 1 such as fibrosis associated with loss of function of an organ or tissue, for example, pulmonary fibrosis, hepatic fibrosis (cirrhosis), renal fibrosis, corneal fibrosis, etc .
  • surgical and / or aesthetic complications for example, fibrosis associated with skin and
  • the peptides of the invention can be obtained by conventional methods, for example, by chemical synthesis techniques on solid phase; purify by high performance liquid chromatography (HPLC); and, if desired, they can be analyzed by conventional techniques, for example, by sequencing and mass spectrometry, amino acid analysis, nuclear magnetic resonance, etc.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the peptides of the invention can be obtained by recombinant DNA technology. Therefore, in another aspect, the invention provides a DNA sequence encoding a peptide of the invention. Said DNA sequence can be easily deduced from the sequence of the peptide. Said DNA sequence can be contained in a DNA construct.
  • the invention provides a DNA construct comprising a DNA sequence encoding a peptide of the invention.
  • Said DNA construct may incorporate, operably linked, a regulatory sequence for the expression of the DNA sequence encoding the peptide of the invention.
  • the control sequences are sequences that control and regulate the transcription and, where appropriate, the translation of the peptide of the invention, and include promoter, terminator, etc. sequences, functional in transformed host cells comprising said DNA sequence or construction.
  • said expression control sequence is functional in bacteria.
  • said DNA construct comprises, in addition, a marker or gene coding for a motif or for a phenotype that allows the selection of the host cell transformed with said DNA construct.
  • the DNA construct provided by this invention can be obtained by employing techniques well known in the state of the art [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2 nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY , 1989 Vol 1-3].
  • the DNA sequence or the DNA construct provided by this invention can be inserted into an appropriate vector. Therefore, in another aspect, the invention relates to a vector, such as an expression vector, comprising said DNA sequence or construct.
  • the choice of vector will depend on the host cell in which it is to be introduced later.
  • the vector where said DNA sequence is introduced may be a plasmid or a vector which, when introduced into a host cell, is integrated or not in the genome of said cell.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al., 1989, cited supra].
  • the invention relates to a host cell, such as a transformed host cell, comprising a DNA sequence or a DNA construct provided by this invention.
  • the invention in another aspect, relates to a method for producing a peptide of the invention comprising growing a host cell comprising the DNA sequence or construction provided by this invention under conditions that allow the production of said peptide of the invention and, if desired, recover said peptide of the invention.
  • the conditions to optimize the cultivation of said host cell will depend on the host cell used.
  • the method for producing the peptide of the invention further includes the isolation and purification of said peptide.
  • the invention relates to the use of said DNA sequences and DNA constructs in the manufacture of vectors and cells for the treatment of diseases and pathological alterations associated with an excessive or deregulated expression of TGF- ⁇ 1 by gene therapy.
  • said DNA sequence or construct is contacted with a gene transfer vector, such as a viral or non-viral vector.
  • a gene transfer vector such as a viral or non-viral vector.
  • viral vectors suitable for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to the following, adenoviral vectors, adeno-associated vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, alphaviral vectors, herpesviral vectors, vectors derived from coronaviruses, etc.
  • Non-viral type vectors suitable for practicing this embodiment of the invention include, but are not limited to the following: naked DNA, liposomes, polyamines, dendrimers, cationic glycopolymers, liposome-polycation complexes, proteins, gene transfer systems mediated by receiver, etc.
  • the coding sequence for the peptide comes from a degenerate sequence in each of the 15 positions with the 20 natural amino acids. This allows the presentation of l, lxl0 12 possible sequences of 15 amino acids in different phages.
  • the physical relationship, 1 to 1, between the peptide sequence and the DNA encoding it in the bacteriophage makes it possible to select, from a large number of variants, those sequences that specifically bind to TGF- ⁇ 1. This process is carried out through an in vitro selection protocol called "biopanning".
  • the phage library used for the realization of this example comes from a second amplification of the primary library described by T. Nishi, H. Tsuri and H. Saya
  • This technique consists in the incubation of a set of phages, representatives (for practical purposes) of all 15 amino acid variants, in a plate blocked with streptavidin (10 ⁇ g / ml in 0.1 M NaHCO 3 , 2 h at room temperature) to which biotinylated TGF- ⁇ l is added.
  • streptavidin (10 ⁇ g / ml in 0.1 M NaHCO 3 , 2 h at room temperature
  • the biotinylated TGF- ⁇ 1 is anchored to the plate through the biotin-streptavidin interaction, with what is correctly presented for its interaction with the peptides carried by the phages.
  • the TGF- ⁇ 1 is contacted with the peptides carried by the phage at a concentration of 3 ⁇ 10 4 virus / ml and allowed to incubate for approximately 12 hours.
  • the unbound phages are removed by means of 5 washes with PBS / Tween (phosphate-buffered saline / polyoxyalkylene derivatives of sorbitan fatty acid esters) and subsequently the phages are specifically bound by a decrease in pH (elution buffer). ) that breaks down the molecular interactions between TGF- ⁇ 1 and the peptides presented by phages.
  • the eluted phages are then amplified by infection in a bacterial strain (E. coli). The process is repeated a total of 3 rounds, so that the content of phages that bind specifically and with high affinity to TGF- ⁇ 1 is enriched (Figure 3).
  • the concentration of biotinylated TGF- ⁇ l used to block the plates is progressively reduced in each round from 2.5 to 0.01 and finally 0.001 ⁇ g / ml.
  • the phages selected in each round have an increasing degree of affinity for TGF- ⁇ 1.
  • the phages that have been selected for their affinity with TGF- ⁇ 1 are sequenced with primers, after being isolated by resistance to tetracycline conferred by genetically modified phages after infecting E. coli cells. This makes it possible to obtain the sequences of the peptides presented in the phage of a number of clones obtained from isolated colonies.
  • the number of times a sequence repeated, corresponding to a peptide of 15 amino acids carried by each clone, of the total of sequenced clones gives an idea of the degree of relative affinity that said sequence of 15 amino acids has for TGF- ⁇ 1.
  • the number of clones (colonies) of each sequence gives a relative idea of the degree of affinity between the peptides and TGF- ⁇ 1, that is, the greater the number of clones, the higher the binding affinity.
  • the degree of affinity does not correspond to the ability to block the activity of TGF- ⁇ 1 since the most active peptide, the peptide identified with SEQ ID NO: 17 (see Tables 2 and 3) gives 3 clones, while the peptide identified with SEQ ID NO: 3, which gives 41 clones, is much less active in the acute liver damage assay (Table 3).
  • the Mv-l-Lu cell line (CCL-64, American Type Cell Culture, Virginia, United States) derives from mink lung epithelium, grows in monolayer and responds to exogenous TGF- ⁇ 1 with a decrease in its proliferation ( Figure 5) .
  • the inhibition by peptides of this cytokine is capable of restoring its growth and reflects the ability of the various peptides as inhibitors of the in vitro biological activity of TGF- ⁇ 1.
  • the peptides tested were obtained by peptide synthesis following conventional procedures (Merrifield RB J Am Chem Soc 1963; 85: 2149-2154; Atherton E et al., J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1: 538-546).
  • Mv-l-Lu cells are grown to subconfluence in complete medium [RPMI-1640 supplemented with L-glutamine, sodium pyruvate, antibiotics and 10% fetal calf serum (FBS)] at 37 ° C and 5% C0 2 in 162 cm 2 bottles (Costar Corporation, CA, USA).
  • the cells after trypsinization, are cultured in 200 ⁇ l of complete medium in 96-well plates at an initial density of 5,000 cells / well, at 37 ° C and 5% C 0 2 ⁇ for 6 hours to allow their adhesion.
  • TGF- ⁇ l Human Transforming Growth Factor- ⁇ l, Roche
  • 1 ⁇ Ci of methyl- 3 H-thymidine is added per well in 25 ⁇ l 5 of clean medium (RPMI-1640) and the plate is incubated for 12 hours same conditions.
  • the negative control represents the incorporation of tritiated thymidine in the presence of TGF- ⁇ 1, but in the absence of peptide, while the positive control refers to the same parameter in the absence of TGF- ⁇ 1 and peptide.
  • the percentage inhibition of the peptides on the biological activity of TGF- ⁇ 1 can be measured, due to its ability to reverse the repressing effect of this cytokine on the proliferation of the Mv-l-Lu cell line (Table 2).
  • the peptides identified as SEQ ID NO: 3, 11, 17 and 18 inhibit the in vitro biological activity of TGF- ⁇ 1 with a percentage of inhibition of more than 20%.
  • Acute liver damage generates a cascade of effects and physiological responses that includes the elevation of TGF- ⁇ l levels. This elevation is responsible for inducing the expression, among others, of the type I collagen gene.
  • This model of acute liver damage in female Balb / C mice weighing 25 to 30 g, 2 ⁇ l of CC1 4 per gram of mouse in volumetric ratio of 1: 1 with corn oil.
  • the control group receives an equivalent volume of corn oil, and the treated groups receive, after the initial dose of CCLi, 50 ⁇ g of peptide in 500 ⁇ l of physiological saline solution.
  • liver tissue was frozen in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C until used.
  • Other samples of liver tissue were preserved in OCT® or Tissue-Tek® (Sakura Finetek BV) processed in the same way as samples destined for mRNA extraction, and samples were also preserved in 10% buffered formalin, for later inclusion in paraffin and histological evaluation. Subsequently, the type I collagen mRNA level of all the groups was quantified by quantitative PCR.
  • Figure 6 shows a flow diagram corresponding to the induction, sampling and quantification of the results in the acute liver injury assay.
  • the peptides identified as SEQ ID NO: 2, 4, 6, 11, 14 and 17 inhibit the biological activity in vivo of TGF- ⁇ 1 with a percentage of inhibition greater than 35%. Additionally, the activity of the peptide identified as
  • EXAMPLE 4 Inhibition of in vitro biological activity of TGF- ⁇ 1 by truncated peptides of the peptide sequence SEQ ID NO: 17, in proliferation assays with Mv-l-Lu cells
  • truncated peptides derived from the peptide sequence SEQ ID NO: 17
  • the activity of truncated peptides with respect to the complete sequence, in terms of its ability to reverse the repressor effect of TGF- ⁇ 1, on the proliferation of the Mv cell line has been compared -l-Lu
  • truncated versions of this peptide were synthesized, by the N-terminal, C-terminal end or on both ends.
  • the peptides tested were obtained by peptide synthesis following conventional procedures (Merrifield RB J Am Chem Soc 1963; 85: 2149-2154; Atherton E et al., J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1: 538-546). Following the same methodology described in Example 2, the activity of the truncated peptides was quantified in the proliferation assay with Mv-1-Lu cells, compared to the activity of the complete sequence of peptide SEQ ID NO: 17. Table 4

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Abstract

Los péptidos tienen la capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento TGF-β1 (TGF-β1) y son potenciales inhibidores de la actividad biológica del TGF-β1 mediante su unión directa a dicha citoquina. Estos péptidos pueden ser utilizados en el tratamiento de enfermedades o alteraciones patológicas basadas en una expresión excesiva o desregulada del TGF-β1.

Description

PEPTIDOS CON CAPACIDAD DE UNIRSE AL FACTOR TRANSFORMANTE
DE CRECIMIENTO βl (TGF-βl)
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere, en general, a péptidos que tienen la capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento βl (TGF-βl) y a sus aplicaciones. En particular, la invención se refiere a péptidos inhibidores de la actividad biológica del TGF-βl mediante su unión directa al TGF-βl, y a su empleo en el tratamiento de enfermedades o alteraciones patológicas basadas en una expresión excesiva o desregulada del TGF-β 1.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El TGF-βl es una glicoproteína perteneciente a una superfamilia de proteínas reguladoras (citoquinas) estructuralmente relacionadas entre sí, incluida dentro de una de las tres isoformas descritas en mamíferos (TGF-beta 1, 2 y 3). La isoforma más abundante es TGF-βl, que consiste en un homodímero de 25 kDa compuesto por 2 subunidades unidas por un puente disulfuro. La secuencia de aminoácidos del TGF-βl humano ha sido descrita por, por ejemplo, Derynck K et al., "Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequence and expression in normal and transformed cells". Nature 316 (6030), 701-705 (1985).
El TGF-βl es una molécula cuya secuencia está altamente conservada en términos evolutivos. Aunque originalmente se definió por su capacidad para inducir proliferación independiente de adhesión y cambios morfológicos en fibroblastos de rata, investigaciones posteriores han revelado que el TGF-βl es un inhibidor general dé la proliferación en un gran número de tipos celulares. Es producido por una gran variedad de tipos celulares y en diferentes tejidos durante todas las fases de la diferenciación celular. Produce una gran variedad de efectos biológicos, genera potentes y muy a menudo opuestos efectos en el desarrollo, fisiología y respuesta inmune. Información sobre el papel del TGF-βl en la diferenciación y regeneración hepática, y en la fibrosis hepática, así como los efectos del TGF-βl sobre la matriz extracelular, puede encontrarse en la solicitud de patente española ES 2146552 Al.
EE Re ia 28 Teniendo como objetivo el estudio de los mecanismos de acción del TGF-βl, se han descrito una decena de proteínas (receptores de membrana y proteínas de matriz extracelular) que interaccionan con esta citoquina.
Por otra parte, debido a que numerosas enfermedades o alteraciones patológicas están asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl, por ejemplo, las fibrosis asociadas con la pérdida de función de un órgano o tejido, o complicaciones quirúrgicas o estéticas, resulta interesante buscar productos capaces de inhibir la actividad biológica del TGF-βl, dado que tales productos podrían ser potencialmente utilizados en terapia humana o animal como bloqueantes de las consecuencias patológicas de una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl .
Las estrategias habitualmente utilizadas para inhibir la actividad biológica del TGF-βl incluyen, entre otras, el empleo de (i) anticuerpos específicos neutralizantes, (ii) oligos antisentido del gen codificante del TGF-βl que bloquean su expresión, o (iii) receptores solubles del TGF-βl que actúan de forma similar a los anticuerpos. El empleo de anticuerpos permite un bloqueo total y específico de esta citoquina (TGF-βl) aunque se potencian ciertos efectos secundarios tanto por la presencia de inmunoglobulinas exógenas en sangre como por los efectos derivados del bloqueo sistémico del TGF-βl. Además, la estabilidad en el tiempo de las inmunoglobulinas no permite un control a tiempos cortos del bloqueo en la actividad de esta citoquina. Los oligo antisentido inhiben la producción del TGF-βl a nivel de expresión génica, lo que puede generar desregulaciones importantes en todos los procesos en lo que interviene esta citoquina.
Recientemente se ha desarrollado otra estrategia basada en el empleo de péptidos inhibidores de la actividad biológica del TGF-βl. En este sentido, la solicitud de patente española ES 2146552 Al describe unos péptidos sintéticos procedentes tanto del TGF- βl como de sus receptores, o de proteínas con capacidad de unión al TGF-βl, que pueden ser utilizados como inhibidores de la actividad biológica del TGF-βl.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se enfrenta, en general, con el problema de buscar nuevos compuestos capaces de inhibir la actividad biológica del TGF-βl. La solución proporcionada por la presente invención se basa en que los inventores han identificado unos péptidos capaces no solo de unirse al TGF-βl sino, además, capaces de inhibir la actividad biológica del TGF-βl mediante su unión directa al propio TGF-βl. Algunos de estos péptidos han sido identificados mediante el empleo de la tecnología asociada con las librerías de fagos que permite determinar péptidos, con un tamaño típicamente comprendido entre 6 y 15 aminoácidos, que presentan una unión de alta afinidad con el TGF-βl, cuantificando, posteriormente, mediante ensayos in vitro e in vivo, la capacidad de inhibición de la actividad biológica del TGF-βl de los distintos péptidos. Otros péptidos han sido obtenidos mediante truncamiento de péptidos previamente identificados mediante dicha tecnología asociada con las librerías de fagos.
Los péptidos capaces de unirse al TGF-βl, en particular, aquéllos capaces de inhibir la actividad biológica del TGF-βl mediante su unión directa al TGF-βl son potencialmente útiles para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl. Asimismo, los péptidos capaces de unirse al TGF-βl proporcionan una herramienta para el estudio del papel biológico del TGF-βl (aún por dilucidar en muchos campos de la regulación de distintos procesos biológicos).
Por tanto, un aspecto de esta invención se relaciona con unos péptidos que poseen la capacidad de unirse al TGF-βl. En una realización particular y preferida, dichos péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir la actividad biológica del TGF- βl.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende, al menos, uno de dichos péptidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichos péptidos en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl. Ejemplos ilustrativos de dichas enfermedades o alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl incluyen la fibrosis asociada con la pérdida de función de un órgano o un tejido así como complicaciones quirúrgicas y/o estéticas. En otro aspecto, la invención se relaciona con secuencias de ADN que codifican para dichos péptidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para un péptido proporcionado por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicha secuencia de ADN o dicha construcción de ADN.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende dicha construcción de ADN o dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido proporcionado por esta invención que comprende cultivar dichas células hospedadoras bajo condiciones que permiten la expresión de dicho péptido y, si se desea, recuperar el péptido obtenido. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichas secuencias de
ADN y construcciones de ADN en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl mediante terapia génica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra esquemáticamente la posición de un péptido de 15 aminoácidos (aa), genéticamente fusionado a la proteína pIII, en la superficie del bacteriófago filamentoso M13.
La Figura 2 muestra esquemáticamente la posición génica del inserto, que codifica para un péptido de 15 aa, en el genoma del bacteriófago MI 3 y la posición del péptido en la secuencia de la proteína pIII.
La Figura 3 muestra esquemáticamente la selección de péptidos mediante la técnica de "Biopanning". El TGF-βl biotinilado se inmoviliza en placas que contienen estreptavidina (a través de la unión biotina-estreptavidina). La librería de fagos es seleccionada sobre la base de la interacción entre el TGF-βl y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos con baja afinidad por el TGF-βl son eliminados mediante lavados. Los fagos retenidos en la placa son eluidos mediante descenso de pH. Tras tres ciclos de enriquecimiento de fagos con alta afinidad por el TGF-βl, los fagos se aislan y secuencian (véase el Ejemplo 1) [Leyendas de la Figura 3: "a": Libería de fagos presentando péptidos de 15 aa; "b": Infección en E. coli (K91Kan)(amplificación); "c": Purificación de los fagos; "d": Incubación de los fagos con concentraciones decrecientes de TGF-βl; "e": Lavados; "f": Elución de los fagos unidos (ipH); "g": Infección en cepa de E. coli; "h": Selección de colonias infectadas (tetraclina); "i": Amplificación de los fagos seleccionados; y "j": Secuenciación del ADN (correspondiente al péptido) al cabo de tres ciclos de "biopanning"]. La Figura 4 es una representación de un árbol de analogías de secuencia entre los péptidos de 15 aminoácidos identificados mediante una librería de fagos.
La Figura 5 es un diagrama que muestra el efecto de la concentración de TGF- βl sobre el crecimiento de la línea celular Mv-l-Lu, expresada en forma de captación de timidina tritiada en cuentas por minuto (c.p.m.). La Figura 6 es un diagrama ilustrativo del protocolo de inducción de daño hepático agudo (véase el Ejemplo 3).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un aspecto, la invención se relaciona con un péptido, en adelante, péptido de la invención, cuya secuencia de aminoácidos comprende entre 3 y 15 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y
SEQ ID NO: 22, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
Los péptidos de la invención tienen la capacidad de unirse al TGF-βl. Algunos de dichos péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir, in vitro y/o in vivo, la actividad biológica del TGF-βl. La capacidad de los péptidos de la invención de unirse al TGF-βl se puede determinar mediante cualquier método apropiado que permita determinar la unión entre dos moléculas, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, que comprende poner en contacto el TGF-βl con el péptido a ensayar bajo condiciones que permiten la unión de dicho péptido al TGF-βl y evaluar la unión entre el péptido y el TGF-βl. En una realización particular, dicho ensayo de afinidad puede realizarse utilizando TGF- βl marcado radiactivamente, por ejemplo, I-TGF-βl humano, tal como se describe en
ES 2146552 Al. Alternativamente, el compuesto que puede estar marcado es el péptido a ensayar. En general, este tipo de ensayos de afinidad comprende poner en contacto TGF-βl, por ejemplo, inmovilizado en una placa bloqueada con estreptavidina, con el péptido cuya capacidad de unión al TGF-βl se desea conocer, y, tras incubar durante un periodo de tiempo apropiado, analizar la unión del péptido al TGF-βl . Los péptidos con baja afinidad por el TGF-βl son eliminados mediante lavados mientras que los péptidos con mayor afinidad permanecen unidos al TGF-βl y pueden ser liberados rompiendo las interacciones moleculares entre ambas moléculas, lo que puede realizarse, por ejemplo, bajando el pH. Ensayando el péptido frente a distintas concentraciones de TGF-βl, o viceversa, se puede obtener una idea de la afinidad del péptido en cuestión frente al TGF-βl. La capacidad de los péptidos de la invención de inhibir la actividad biológica del TGF-βl in vitro se puede evaluar y, si se desea, cuantificar, mediante un ensayo de inhibición del crecimiento de la línea celular Mv-l-Lu, una línea celular derivada de epitelio pulmonar de visón cuya proliferación es inhibida por el TGF- βl (véase el Ejemplo 2).
La capacidad de los péptidos de la invención de inhibir la actividad biológica del TGF-βl in vivo se puede evaluar y, si se desea, cuantificar mediante un ensayo en un modelo animal de daño hepático agudo inducido, por ejemplo, por administración de tetracloruro de carbono (CCL;) (véase el Ejemplo 3). Como es conocido, el daño hepático agudo genera una cascada de efectos y respuestas fisiológicas que incluye la elevación de los niveles del TGF-βl, responsable, entre otros efectos, de la expresión del gen de colágeno de tipo I, entre otros.
Dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención. El término "sales farmacéuticamente aceptables" incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza de la sal no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención pueden obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o inorgánicos. Dichas sales pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia.
En una realización particular, la invención proporciona un péptido que comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
En una realización concreta, la invención proporciona un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:
13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
En otra realización concreta, la invención proporciona un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO
25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO 35 y SEQ ID NO: 36, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Estos péptidos comprenden entre 9 y 14 restos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos del péptido identificado por la SEQ ID NO: 17 y han sido obtenidos por truncamiento de dicho péptido (Ejemplo 4).
En otra realización concreta, la invención proporciona un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 17, presentan actividad inhibidora de la actividad biológica de TGF-βl, tanto in vitro como in vivo; el péptido identificado por la SEQ ID NO: 2 presenta únicamente actividad inhibidora de la actividad biológica de TGF-βl in vivo; y los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 18, presentan únicamente actividad inhibidora de la actividad biológica de TGF-βl in vitro. Los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 presentan actividad inhibidora de la actividad biológica de TGF-βl in vitro.
Para la identificación inicial de péptidos con capacidad de unirse al TGF-βl se ha utilizado la tecnología asociada con las librerías de fagos que permite determinar péptidos que presentan una unión de alta afinidad con el TGF-βl, y cuantificar, posterioπnente, mediante ensayos in vitro e in vivo, la capacidad de inhibición de la actividad biológica del TGF-βl de los distintos péptidos. La secuencia de los péptidos que se unen al TGF-βl, inhibiendo in vitro o in vivo la actividad biológica del TGF-βl, se puede deducir a partir de la secuencia del ADN correspondiente al cabo de varios ciclos de "biopanning", generalmente 3. El empleo de librerías de fagos para identificar inhibidores de ciertos productos ha sido descrita, por ejemplo, por Chirinos-Rojas C.L. et al., en Immunology, 1999, Jan. 96(1): 109-113; McConnell S.J., et al., en Gene 1994, Dec. 30, 151(1-2):115-118; o Smith G.P., Science, 1985, Jun. 14, 228(4705): 1315- 1317.
Por tanto, la invención proporciona un método para la identificación de péptidos que tienen la capacidad de unirse al TGF-βl que comprende:
(i) utilizar una librería de fagos que comprende una pluralidad de fagos filamentosos, conteniendo el genoma de cada uno de dichos fagos una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido diferente ligada al gen de una proteína de la cubierta del fago, con lo que cada fago contiene un péptido diferente genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago; (ii) seleccionar, mediante un ensayo de afinidad, los fagos que contienen los péptidos que se unen con mayor afinidad al TGF-βl; y (iii) determinar la secuencia de los péptidos que se unen al TGF-βl, a partir de las secuencias de ADN correspondientes insertadas en los fagos seleccionados en la etapa (ii) y que codifican para dichos péptidos que se unen al TGF-βl.
En una realización particular, con el fin de obtener péptidos de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad al TGF-βl y con posible actividad inhibitoria de la actividad biológica de dicha citoquina, se utilizó una librería de fagos compuesta por una pluralidad de bacteriófagos filamentosos (MI 3) conteniendo cada uno de ellos un péptido diferente, de 15 aminoácidos, genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago, en este caso unido al extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII. De esta forma, el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos, en cada una de las cinco moléculas de la proteína de superficie, mientras en su interior contiene el ADN que codifica para dicha secuencia peptídica. En las librerías de fagos la secuencia codificante para el péptido proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales, lo que permite la
19 presentación de 1,1x10 secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física, 1 a 1, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran número de variantes, aquellas secuencias que se unen específicamente al TGF-βl. Este proceso se realiza mediante un ensayo de afinidad.
En una realización particular, dicho ensayo de afinidad consiste en un protocolo de selección in vitro denominado "biopanning". Brevemente, dicha técnica consiste en la incubación de un conjunto de fagos representantes, a efectos prácticos, de todas las variantes de péptidos de 15 aminoácidos (en este caso), en una placa bloqueada con estreptavidina a la que se le añade TGF-βl biotinilado. El TGF-βl biotinilado queda anclado a la placa a través de la interacción biotina-estreptavidina, con lo que queda correctamente presentado para su interacción con los péptidos portados por los fagos.
Tras una incubación se eliminan los fagos no unidos mediante lavados y posteriormente se eluyen los fagos unidos específicamente, mediante un descenso de pH que rompe las interacciones moleculares entre el TGF-βl y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana. El proceso se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad al TGF-βl se va enriqueciendo. La concentración de TGF-βl biotinilado utilizado para bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda, por ejemplo, de 2,5 a 0,01 y finalmente 0,001 μg/ml. De este modo, los fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor grado de afinidad por el TGF-βl. Al final del proceso los fagos que han sido seleccionados por su afinidad con el TGF-βl son secuenciados con cebadores. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos.
El Ejemplo 1 ilustra la selección de péptidos que se unen al TGF-βl mediante librería de fagos, selección por "biopanning" y secuenciación de los péptidos con unión de alta afinidad al TGF-βl. La invención también proporciona un método para la identificación de péptidos que tienen la capacidad de unirse al TGF-βl que comprende truncar péptidos que poseen la capacidad de unirse al TGF-βl y ensayar la capacidad de dichos péptidos truncados para unirse al TGF-βl. Los péptidos truncados pueden obtenerse por cualquier método convencional, por ejemplo, por síntesis química (dado su tamaño) de las versiones truncadas del péptido por su extremo N-terminal, C-terminal o por ambos extremos. La capacidad de dichos péptidos truncados para unirse al TGF-βl puede determinarse mediante cualquier método apropiado que permita determinar la unión entre dos moléculas, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, que comprende poner en contacto el TGF-βl con el péptido a ensayar bajo condiciones que permiten la unión de dicho péptido al TGF-βl y evaluar la unión entre el péptido y el TGF-βl, tal como se ha mencionado previamente. Asimismo, la capacidad de dichos péptidos truncados de inhibir, in vitro y/o in vivo, la actividad biológica del TGF-βl puede ensayarse por cualquiera de los ensayos mencionados en esta descripción.
Debido al papel que desempeña el TGF-βl en numerosos procesos biológicos, una consecuencia de la actividad inhibidora del TGF-βl de los péptidos de la invención tiene que ver con el desarrollo potencial de una nueva familia de fármacos útiles para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl, ya que tales péptidos permiten bloquear el exceso o desregulación de dicha citoquina que origina daño. Los péptidos de la invención, por tanto, pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades o alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl, tales como (i) la fibrosis asociada con la pérdida de función de un órgano o un tejido, por ejemplo, fibrosis pulmonar, fibrosis hepática (cirrosis), fibrosis renal, fibrosis corneal, etc., así como (ii) las complicaciones quirúrgicas y/o estéticas, por ejemplo, fibrosis asociada con la cirugía cutánea y peritoneal, fibrosis asociada con quemaduras, fibrosis osteo-articular, queloides, etc.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de la invención junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede contener uno o más péptidos de la invención, junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos inhibidores del TGF-βl alternativos. Dicha composición farmacéutica es útil para su administración y/o aplicación en el cuerpo humano o animal, preferentemente en el cuerpo humano.
El empleo de péptidos, tales como los péptidos de la invención, en lugar de utilizar anticuerpos u oligos antisentido, presenta numerosas ventajas, ya que son moléculas pequeñas, con mayor capacidad de difusión y de vida media más corta. Los péptidos pueden llegar a tener una elevada afinidad por el TGF-βl, pero se degradan más rápidamente que los anticuerpos pudiéndose controlar mediante dosificación los efectos secundarios adversos. También es más accesible la vehiculización de los péptidos a órganos o tejidos diana en comparación con otro tipo de compuestos. Los péptidos de la invención pueden administrarse para tratar las enfermedades y las alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl por cualquier medio que produzca el contacto del péptido de la invención con el sitio de acción del mismo en el cuerpo humano o animal. La cantidad de péptido, derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que puede estar presente en la composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede variar dentro de un amplio intervalo.
La dosificación para tratar una enfermedad o alteración patológica asociada con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl con los péptidos y/o composiciones farmacéuticas de la invención dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la enfermedad o alteración patológica, la ruta y frecuencia de administración y del péptido de la invención a administrar. Las composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos de la invención pueden presentarse en cualquier forma de administración, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, rectal o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada, por ejemplo, pomadas (lipogeles, hidrogeles, etc.), colirios, aerosoles por nebulización, soluciones inyectables, bombas osmóticas, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
El empleo de los péptidos de la invención en la elaboración de dicha composición farmacéutica constituye un aspecto adicional de esta invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada de TGF-βl, tales como la fibrosis asociada con la pérdida de función de un órgano o un tejido, por ejemplo, fibrosis pulmonar, fibrosis hepática (cirrosis), fibrosis renal, fibrosis corneal, etc.; o las complicaciones quirúrgicas y/o estéticas, por ejemplo, fibrosis asociada con la cirugía cutánea y peritoneal, fibrosis asociada con quemaduras, fibrosis osteo-articular, queloides, etc.
Los péptidos de la invención pueden obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de síntesis química sobre fase sólida; purificarse mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); y, si se desea, se pueden analizar mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante secuenciación y espectrometría de masas, análisis de aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc.
Alternativamente, los péptidos de la invención pueden obtenerse mediante la tecnología del ADN recombinante. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de ADN que codifica para un péptido de la invención. Dicha secuencia de ADN puede ser deducida fácilmente a partir de la secuencia del péptido. Dicha secuencia de ADN puede estar contenida en una construcción de ADN.
Por tanto, la invención proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para un péptido de la invención. Dicha construcción de ADN puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de ADN que codifica para el péptido de la invención. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción del péptido de la invención, e incluyen secuencias promotoras, terminadoras, etc., funcionales en células hospedadoras transformadas que comprenden dicha secuencia o construcción de ADN. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en bacterias. Ventajosamente, dicha construcción de ADN comprende, además, un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicha construcción de ADN. La construcción de ADN proporcionada por esta invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3]. La secuencia de ADN o la construcción de ADN proporcionadas por esta invención, pueden ser insertadas en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende dicha secuencia o construcción de ADN. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra].
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende una secuencia de ADN o una construcción de ADN proporcionadas por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido de la invención que comprende crecer una célula hospedadora que comprende la secuencia o construcción de ADN proporcionada por esta invención bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido de la invención y, si se desea, recuperar dicho péptido de la invención. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula hospedadora dependerán de la célula hospedadora utilizada. Si se desea, el procedimiento para producir el péptido de la invención incluye, además, el aislamiento y purificación de dicho péptido.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl mediante terapia génica. De acuerdo con este aspecto de la invención, dichas secuencia o construcción de ADN se ponen en contacto con un vector de transferencia génica, tal como un vector viral o no viral. Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes, vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales, vectores herpesvirales, vectores derivados de coronavirus, etc. Vectores de tipo no viral apropiados para poner en práctica esta realización de la invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes: ADN desnudo, liposomas, poliaminas, dendrímeros, glicopolímeros catiónicos, complejos liposoma-policatión, proteínas, sistemas de transferencia génica mediados por receptor, etc.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Selección de péptidos que se unen al TGF-βl mediante librería de fagos
Para la obtención de secuencias de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad al TGF-βl y con posible actividad inhibitoria de la actividad biológica de esta citoquina, se utilizó una técnica de selección in vitro basada en la tecnología desarrollada a partir de las librerías de fagos. Estas librerías constan de bacteriófagos filamentosos (MI 3) que contienen un péptido genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del virus, en este caso unido al extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII (Figura 1). De esta forma el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos, en cada una de las 5 moléculas de esta proteína que presenta el fago en su superficie, mientras en su interior contiene el ADN que codifica para dicha secuencia peptídica. En las librerías de fagos la secuencia codificante para el péptido proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales. Esto permite la presentación de l,lxl012 secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física, 1 a 1, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran número de variantes, aquellas secuencias que se unen específicamente al TGF-βl. Este proceso se realiza mediante un protocolo de selección in vitro denominado "biopanning".
La librería de fagos utilizada para la realización de este ejemplo procede de una segunda amplificación de la librería primaria descrita por T. Nishi, H. Tsuri y H. Saya
[Exp. Med. (Japan) 11, 1759 (1993)], cedida por el laboratorio de George P. Smith. Información adicional sobre esta tecnología puede encontrarse en la siguiente página web: http://www.biosci.inissouri.edu/simthgp/PhageDisplavWebsite/PhageDisplavWebsiteIn dex.html
Técnica de selección (Biopanning
Esta técnica consiste en la incubación de un conjunto de fagos, representantes (a efectos prácticos) de todas las variantes de 15 aminoácidos, en una placa bloqueada con estreptavidina (10 μg/ml en NaHC03 0,1 M, 2h a temperatura ambiente) a la que se le añade TGF-βl biotinilado. El TGF-βl biotinilado queda anclado a la placa a través de la interacción biotina-estreptavidina, con lo que queda correctamente presentado para su interacción con los péptidos portados por los fagos. El TGF-βl se pone en contacto con los péptidos portado por los fagos a una concentración de 3xl04 virus/ml y se deja incubar durante 12 horas aproximadamente. Tras la incubación, se eliminan los fagos no unidos mediante 5 lavados con PBS/Tween (tampón fosfato salino/polioxialquilen derivados de esteres de ácidos grasos de sorbitano) y posteriormente se eluyen los fagos unidos específicamente, mediante un descenso de pH (buffer de elución) que rompe las interacciones moleculares entre el TGF-βl y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana (E. coli). El proceso se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad al TGF-βl se va enriqueciendo (Figura 3). La concentración de TGF-βl biotinilado utilizado para bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda de 2,5 a 0,01 y finalmente 0,001 μg/ml. De este modo, los fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor grado de afinidad por el TGF-βl. Al final del proceso los fagos que han sido seleccionados por su afinidad con el TGF-βl, son secuenciados con cebadores, tras ser aislados mediante resistencia a tetraciclina que confieren los fagos modificados genéticamente tras infectar células de E. coli. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos de un número de clones obtenido de colonias aisladas. El número de veces que se repite una secuencia, correspondiente a un péptido de 15 aminoácidos portado por cada clon, del total de clones secuenciados da una idea del grado de afinidad relativa que tiene dicha secuencia de 15 aminoácidos por el TGF-βl.
Secuencia de los péptidos Para la obtención de clones de los fagos, obtenidos a partir del "biopanning", se realiza una selección en presencia de un antibiótico de colonias bacterianas infectadas por estos fagos, cuya resistencia viene dada por un gen de resistencia a tetraciclina presente en el genoma de los fagos. Con este método únicamente crecen colonias infectadas por bacteriófagos. Así cada colonia contiene el genoma de un único fago al que le corresponde la secuencia de un solo péptido presentado en su superficie. De las 108 colonias de bacterias infectadas por fagos, derivados de la última ronda de selección por "biopanning, se secuenció la porción del genoma que engloba la región correspondiente a los péptidos presentados en la proteína pIII utilizando el cebador identificado mediante la SEQ ID NO: 23. De este modo se obtuvieron las secuencias que se muestran en la Tabla 1 donde se indican además el número de colonias (clones) que portaban dichas secuencias.
Tabla 1 Secuencias de aminoácidos procedentes de los fagos que interactúan con el
TGF-βl
Figure imgf000018_0001
El número de clones (colonias) de cada secuencia da una idea relativa del grado de afinidad entre los péptidos y el TGF-βl, o sea, a mayor número de clones mayor afinidad de unión. Sin embargo, el grado de afinidad no se corresponde con la capacidad de bloquear la actividad del TGF-βl puesto que el péptido más activo, el péptido identificado con la SEQ ID NO: 17 (véanse las Tablas 2 y 3) da 3 clones, mientras que el péptido identificado con la SEQ ID NO: 3, que da 41 clones, es mucho menos activo en el ensayo de daño hepático agudo (Tabla 3). Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, esta cuestión podría ser explicada sobre la base de que el péptido más activo bloquearía probablemente la unión del TGF-βl a su receptor.
Comparación de las secuencias peptídicas Las secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa CLUSTAL W (1.81). Este programa genera un agrupamiento múltiple de secuencias en función de sus analogías de secuencia aminoacídica. Los péptidos quedan así agrupados por familias estructurales (Figura 4). En base a las analogías que presentan estos péptidos se pueden sugerir motivos menores de unión al TGF-βl o grupos de péptidos que se unen a diferentes regiones del TGF-βl.
EJEMPLO 2
Inhibición de la actividad biológica in vitro del TGF-βl mediante péptidos en ensayos de proliferación con células Mv-l-Lu
La línea celular Mv-l-Lu (CCL-64, American Type Cell Culture, Virginia, Estados Unidos) deriva de epitelio pulmonar de visón, crece en monocapa y responde al TGF-βl exógeno con una disminución de su proliferación (Figura 5). La inhibición mediante péptidos de esta citoquina es capaz de restablecer su crecimiento y refleja la capacidad de los distintos péptidos como inhibidores de la actividad biológica in vitro del TGF-βl. Los péptidos ensayados fueron obtenidos mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al. J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546).
Las células Mv-l-Lu se cultivan hasta la subconfluencia en medio completo [RPMI-1640 suplementado con L-glutamina, piruvato sódico, antibióticos y 10% de suero de ternera fetal (FBS)] a 37°C y 5% de C02 en botellas de 162 cm2 (Costar Corporation, CA, USA). Las células, tras tripsinizado, se cultivan en 200 μl de medio completo en placas de 96 pocilios a una densidad inicial de 5.000 células/pocilio, a 37°C y 5% C02ι durante 6 horas para permitir su adhesión. Posteriormente se añaden los tratamientos de los diferentes péptidos a distintas concentraciones, comenzando con 200 μg/ml y se añade TGF-βl (Human Transforming Growth Factor-βl, Roche) a una concentración de 200 pg/ml. Tras 12 horas de incubación se añade 1 μCi de metil-3H- timidina (Amersham Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) por pocilio en 25 μl 5 de medio limpio (RPMI-1640) y se incuba la placa 12 horas más en las mismas condiciones. Finalmente, se cosechan las células (Filtermate 196 Harvester, Packard) transfiriéndose la ti idina tritiada, incorporada en la síntesis de ADN, a placas (UniFilter-96 GF/C®, Perkin Elmer)y la radiactividad se cuantifica, tras adición de líquido de centelleo, en un contador de centelleo (Top Count, Microplate Scintillation 10 Counter, Packard). Como control positivo y negativo se utilizó la incorporación de timidina tritiada en ausencia y presencia de TGF-βl, respectivamente. La inhibición de la actividad del TGF-βl en este ensayo se calculó mediante la siguiente fórmula:
lOOx (cpm con péptido - cpm control negativo) %Inhibición
, r (cpm control positivo - cpm control negativo)
El control negativo representa la incorporación de timidina tritiada en presencia de TGF-βl, pero en ausencia de péptido, mientras que el control positivo se refiere al mismo parámetro en ausencia de TGF-βl y péptido. Así se puede medir el porcentaje de 20 inhibición de los péptidos sobre la actividad biológica del TGF-βl, por su capacidad de revertir el efecto represor de esta citoquina sobre la proliferación de la línea celular Mv-l-Lu (Tabla 2).
Tabla 2
Efecto de los péptidos obtenidos mediante la selección por "biopanning" sobre la inhibición de la actividad biológica in vitro del TGF-βl, calculado a partir del restablecimiento del crecimiento de la línea Mv-l-Lu
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Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 3, 11, 17 y 18 inhiben la actividad biológica in vitro del TGF-βl con un porcentaje de inhibición superior al 20%.
Adicionalmente, se ha comparado la actividad del péptido identificado como P144 en la solicitud de patente española ES 2146552 Al con la actividad del péptido identificado mediante la SEQ ID NO: 17 en cuanto a su capacidad para revertir el efecto represor del TGF-βl sobre la proliferación de la línea celular Mv-l-Lu previamente descrito, observándose una mejor actividad del péptido identificado como SEQ ID NO: 17. EJEMPLO 3
Inhibición de la actividad biológica in vivo del TGF-βl mediante péptidos en un modelo de daño hepático agudo, inducido por CC14
El daño hepático agudo genera una cascada de efectos y respuestas fisiológicas que incluye la elevación de los niveles de TGF-βl. Esta elevación es la responsable de inducir la expresión, entre otros, del gen de colágeno de tipo I. En este modelo de daño hepático agudo en ratones hembras Balb/C de 25 a 30 g de peso, se administran por vía oral 2 μl de CC14 por gramo de ratón en relación volumétrica de 1 : 1 con aceite de maíz. El grupo control recibe un volumen equivalente de aceite de maíz, y los grupos tratados reciben, tras la dosis inicial de CCLi, 50 μg de péptido en 500 μl de suero fisiológico al
1% en DMSO (dimetilsulfóxido) cada 24 h. Tras 72 horas todos los animales son sacrificados y se realiza el procesamiento de las muestras hepáticas; para evaluar la expresión de ARNm se congeló tejido hepático en nitrógeno líquido almacenándose seguidamente a -80°C hasta su utilización. Otras muestras de tejido hepático fueron conservadas en OCT® o Tissue-Tek® (Sakura Finetek B.V.) procesándose de la misma manera que las muestras destinadas a extracción de ARNm, y también se conservaron muestras en formol tamponado al 10%, para su posterior inclusión en parafina y evaluación histológica. Posteriormente se cuantifica el nivel de ARNm de colágeno tipo I de todos los grupos mediante PCR cuantitativa. En la Figura 6 se muestra un diagrama de flujo correspondiente a la inducción, toma de muestras y cuantificación de los resultados en el ensayo de daño hepático agudo. La capacidad de los péptidos estudiados de bloquear el daño agudo, medido según los niveles de ARNm de colágeno de tipo I inducido se determinó cuantificando este ARN por PCR en tiempo real. En la Tabla 3 se muestra el grado de inhibición de la expresión de colágeno correspondiente a cada uno de los péptidos. Los péptidos ensayados fueron obtenidos mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al. J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546). Tabla 3
Efecto de los péptidos obtenidos mediante la selección por "biopanning" sobre la inhibición de la actividad biológica in vivo del TGF-βl, calculado sobre la inhibición de la inducción de ARNm de colágeno tipo I en un modelo de daño hepático agudo
Figure imgf000023_0001
(Neg: negativo)
Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 2, 4, 6, 11, 14 y 17 inhiben la actividad biológica in vivo del TGF-βl con un porcentaje de inhibición superior al 35%. Adicionalmente, se ha comparado la actividad del péptido identificado como
P144 en la solicitud de patente española ES 2146552 Al con la del péptido identificado mediante SEQ ID NO: 17 en cuanto a su capacidad para inhibir la expresión del ARNm del colágeno de tipo I en el ensayo de daño agudo hepático en ratones previamente definido. En este ensayo comparativo, se observa que el péptido identificado como SEQ ID NO: 17 inhibe la expresión del ARNm del colágeno de tipo I mucho más que el péptido identificado como P144 en la solicitud de patente española ES 2146552 Al que no tiene actividad. Los resultados obtenidos con los ensayos comparativos (Ejemplos 2 y 3) ponen de manifiesto que un péptido ilustrativo de los péptidos de esta invención (el péptido identificado mediante la SEQ ID NO: 17) es más activo que un péptido ilustrativo de la solicitud de patente española ES 2146552 Al (el péptido identificado como P144) en los ensayos de proliferación con células Mv-l-Lu y en un modelo de daño hepático agudo.
EJEMPLO 4 Inhibición de la actividad biológica in vitro del TGF-βl mediante péptidos truncados de la secuencia del péptido SEQ ID NO: 17, en ensayos de proliferación con células Mv-l-Lu
En este ejemplo se muestra la actividad inhibidora de algunos péptidos cuya secuencia de aminoácidos comprende entre 3 y 15 restos de aminoácidos consecutivos de una de las secuencias de aminoácidos de la invención.
Se ha comparado la actividad de péptidos truncados (derivados de la secuencia del péptido SEQ ID NO: 17) respecto a la secuencia completa, en cuanto a su capacidad para revertir el efecto represor del TGF-βl, sobre la proliferación de la línea celular Mv-l-Lu. Para ello, y con la intención de identificar la secuencia mínima del péptido SEQ ID NO: 17 capaz de inhibir la actividad biológica del TGF-βl in vitro, se sintetizaron versiones truncadas de este péptido, por el extremo N- terminal, C- terminal o por ambos extremos. Los péptidos ensayados fueron obtenidos mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al. J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546). Siguiendo la misma metodología descrita en el Ejemplo 2, se cuantificó la actividad de los péptidos truncados en el ensayo de proliferación con células Mv-l-Lu, en comparación con la actividad de la secuencia completa de péptido SEQ ID NO: 17. Tabla 4
Efecto de los péptidos truncados obtenidos de la secuencia del péptido SEQ ID NO:
17 sobre la inhibición de la actividad biológica in vitro del TGF-βl, calculado a partir del restablecimiento del crecimiento de la línea Mv-l-Lu
Figure imgf000025_0001
Como se muestra en la Tabla 4, en este ensayo comparativo, la eliminación de la lisina (K) del extremo N-terminal, conlleva una pérdida de actividad del péptido SEQ ID NO: 17, del 28,5% al 9,4%. Por el contrario, la eliminación de hasta 3 aminoácidos del extremo C-terminal no afecta a la actividad del péptido. Por otro lado, la eliminación de los aminoácidos aromáticos, tirosina (Y) y triptófano (W), elimina la actividad del péptido. Esto permite reducir la secuencia original del péptido SEQ ID NO: 17 a una secuencia de 12 aminoácidos (KRIWFIPRSSWY) [SEQ ID NO: 34] sin afectar a su actividad inhibitoria del TGF-βl in vitro.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un péptido cuya secuencia de aminoácidos comprende entre 3 y 15 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y
SEQ ID NO: 22, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Péptido según la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
3. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, que posee, además, la capacidad de unirse al factor transformante del crecimiento βl (TGF-βl).
4. Péptido según la reivindicación 3, seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9
SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO: 30: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 36, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
5. Péptido según la reivindicación 3, que posee, además, la capacidad de inhibir, in vitro y/o in vivo, la actividad biológica del TGF-βl .
6. Péptido según la reivindicación 5, seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID
NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
7. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, que comprende, al menos un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos inhibidores del TGF-βl diferentes.
9. Empleo de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada de TGF-βl .
10. Empleo según la reivindicación 9, en el que dichas enfermedades o alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada de TGF-βl comprenden la fibrosis asociada con la pérdida de función de un órgano o un tejido, y las complicaciones quirúrgicas y/o estéticas.
11. Empleo según la reivindicación 10, en el que dichas enfermedades o alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada de TGF- βl comprenden fibrosis pulmonar, fibrosis hepática (cirrosis), fibrosis renal, fibrosis corneal, fibrosis asociada con la cirugía cutánea y peritoneal, fibrosis asociada con quemaduras, fibrosis osteo-articular o queloides.
12. Una secuencia de ADN que codifica para un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
13. Una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 12.
14. Construcción de ADN según la reivindicación 13 que comprende, además, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de dicha secuencia de ADN.
15. Un vector que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 12, o una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14.
16. Una célula hospedadora que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 12, o una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, o un vector según la reivindicación 15.
17. Un procedimiento para producir un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende crecer una célula hospedadora según la reivindicación 16 bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido, y, si se desea, recuperar dicho péptido.
18. Empleo de una secuencia de ADN según la reivindicación 12, o de una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en la elaboración de vectores y células para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-βl mediante terapia génica.
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Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007048857A1 (es) * 2005-10-24 2007-05-03 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. USO DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE TGF- βl EN LA PREPARACIÓN DE UN AGENTE MODULADOR DE LA RESPUESTA INMUNE
ES2327088A1 (es) * 2007-08-20 2009-10-23 Proyecto De Biomedicina Cima S.L. Combinaciones terapeuticas para el tratamiento de las metastasis.
WO2009138544A1 (es) 2008-05-16 2009-11-19 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Adenovirus auxiliares auto-inactivantes para la produccion de adenovirus recombinantes de alta capacidad
WO2009147271A2 (es) 2008-06-04 2009-12-10 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad
WO2009150284A2 (es) 2008-06-13 2009-12-17 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Conjugados de apo-a para la administración de compuestos biológicamente activos
WO2010089443A2 (es) 2009-02-05 2010-08-12 Digna Biotech,S.L. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE TGF- β1
WO2011054994A1 (es) 2009-11-05 2011-05-12 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Sistemas de expresión regulada
WO2011101478A1 (en) 2010-02-22 2011-08-25 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. USE OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR - BETA 1 (TGF-β1) INHIBITOR PEPTIDES FOR THE TREATMENT OF CORNEAL FIBROSIS AND/OR HAZE
WO2012001196A2 (es) 2010-06-28 2012-01-05 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Vectores alfavirales y usos de los mismos para la expresión de genes heterólogos
EP2407534A1 (en) 2010-07-14 2012-01-18 Neo Virnatech, S.L. Methods and reagents for obtaining transcriptionally active virus-like particles and recombinant virions
WO2013079309A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Fundació Privada Institució Catalana De Recerca I Estudis Avançats Methods and kits for the prognosis of colorectal cancer
WO2013113755A1 (en) 2012-01-30 2013-08-08 Fundació Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge (Idibell) Reagents and methods for the treatment of diseases based on the inhibition of calcineurin - nfat signalling pathway
WO2014072517A1 (en) 2012-11-12 2014-05-15 Institució Catalana De Recerca I Estudis Avançats Methods and kits for the prognosis of colorectal cancer
WO2014188042A1 (es) 2013-05-20 2014-11-27 3P Biopharmaceuticals Vectores alfavirales y líneas celulares para la producción de proteínas recombinantes
EP2878674A1 (en) 2013-11-28 2015-06-03 Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) Stable episomes based on non-integrative lentiviral vectors
WO2015101666A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 Fundación Biofísica Bizkaia VLPs, METHODS FOR THEIR OBTENTION AND APPLICATIONS THEREOF
WO2017076924A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Tigenix, S.A.U. Mesenchymal stem cell-derived exosomes and their uses
US11576914B2 (en) 2017-07-26 2023-02-14 The Doshisha Drug for treating or preventing disorder caused by TGF-β signaling, and application thereof

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101029705B1 (ko) * 2010-06-30 2011-04-18 (주)엔솔테크 신규 펩타이드 및 그 용도
US20140170158A1 (en) * 2012-12-17 2014-06-19 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating or preventing lung diseases
JP6730701B2 (ja) 2013-11-14 2020-07-29 学校法人同志社 細胞増殖促進または細胞障害抑制による角膜内皮治療薬
WO2017110093A1 (ja) 2015-12-24 2017-06-29 学校法人同志社 ＴＧＦ－βシグナルに起因する障害を治療または予防するための医薬およびその応用
GB201707561D0 (en) * 2017-05-11 2017-06-28 Argenx Bvba GARP-TGF-beta antibodies

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08151396A (ja) * 1994-11-28 1996-06-11 Teijin Ltd Ｈｌａ結合性オリゴペプチド及びそれを含有する免疫調節剤
WO2000024782A2 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
ES2146552A1 (es) * 1998-11-24 2000-08-01 Inst Cientifico Tecnol Navarra Peptidos inhibidores de tgf/31

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6509318B1 (en) * 2000-09-29 2003-01-21 The Regents Of The University Of California TGF-B inhibitors and methods
KR20050084921A (ko) * 2002-11-01 2005-08-29 보이스 타운 내셔널 리서치 호스피탈 α１β1 인테그린에 대한 유도성 리간드 및 이의 용도

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08151396A (ja) * 1994-11-28 1996-06-11 Teijin Ltd Ｈｌａ結合性オリゴペプチド及びそれを含有する免疫調節剤
WO2000024782A2 (en) * 1998-10-23 2000-05-04 Amgen Inc. Modified peptides, comprising an fc domain, as therapeutic agents
ES2146552A1 (es) * 1998-11-24 2000-08-01 Inst Cientifico Tecnol Navarra Peptidos inhibidores de tgf/31

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISHIKAWA, D. ET AL.: "GDlalpha-replica peptides functionally mimic GDlalpha, an adhesion molecule of metastatatic tumor cells, and suppress the tumor metastasis", FEBS LETTERS, vol. 441, no. 1, 11 December 1998 (1998-12-11), pages 20 - 24, XP002276425 *

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007048857A1 (es) * 2005-10-24 2007-05-03 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. USO DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE TGF- βl EN LA PREPARACIÓN DE UN AGENTE MODULADOR DE LA RESPUESTA INMUNE
JP2009512727A (ja) * 2005-10-24 2009-03-26 プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダ 免疫応答調節剤の製造におけるＴＧＦ−β１インヒビターペプチドの使用
ES2327088A1 (es) * 2007-08-20 2009-10-23 Proyecto De Biomedicina Cima S.L. Combinaciones terapeuticas para el tratamiento de las metastasis.
WO2009138544A1 (es) 2008-05-16 2009-11-19 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Adenovirus auxiliares auto-inactivantes para la produccion de adenovirus recombinantes de alta capacidad
WO2009147271A2 (es) 2008-06-04 2009-12-10 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Sistema para empaquetamiento de adenovirus de alta capacidad
WO2009150284A2 (es) 2008-06-13 2009-12-17 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Conjugados de apo-a para la administración de compuestos biológicamente activos
WO2010089443A2 (es) 2009-02-05 2010-08-12 Digna Biotech,S.L. FORMULACIONES FARMACÉUTICAS DE PÉPTIDOS INHIBIDORES DE TGF- β1
WO2011054994A1 (es) 2009-11-05 2011-05-12 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Sistemas de expresión regulada
WO2011101478A1 (en) 2010-02-22 2011-08-25 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. USE OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR - BETA 1 (TGF-β1) INHIBITOR PEPTIDES FOR THE TREATMENT OF CORNEAL FIBROSIS AND/OR HAZE
WO2012001196A2 (es) 2010-06-28 2012-01-05 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Vectores alfavirales y usos de los mismos para la expresión de genes heterólogos
EP2407534A1 (en) 2010-07-14 2012-01-18 Neo Virnatech, S.L. Methods and reagents for obtaining transcriptionally active virus-like particles and recombinant virions
WO2012007557A1 (en) 2010-07-14 2012-01-19 Neo Virnatech, S.L. Methods and reagents for obtaining transcriptionally active virus-like particles and recombinant virions
WO2013079309A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Fundació Privada Institució Catalana De Recerca I Estudis Avançats Methods and kits for the prognosis of colorectal cancer
WO2013113755A1 (en) 2012-01-30 2013-08-08 Fundació Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge (Idibell) Reagents and methods for the treatment of diseases based on the inhibition of calcineurin - nfat signalling pathway
WO2014072517A1 (en) 2012-11-12 2014-05-15 Institució Catalana De Recerca I Estudis Avançats Methods and kits for the prognosis of colorectal cancer
WO2014188042A1 (es) 2013-05-20 2014-11-27 3P Biopharmaceuticals Vectores alfavirales y líneas celulares para la producción de proteínas recombinantes
US10011847B2 (en) 2013-05-20 2018-07-03 3P Biopharmaceuticals, S.L. Alphaviral vectors and cell lines for producing recombinant proteins
EP2878674A1 (en) 2013-11-28 2015-06-03 Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) Stable episomes based on non-integrative lentiviral vectors
WO2015101666A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 Fundación Biofísica Bizkaia VLPs, METHODS FOR THEIR OBTENTION AND APPLICATIONS THEREOF
WO2017076924A1 (en) 2015-11-02 2017-05-11 Tigenix, S.A.U. Mesenchymal stem cell-derived exosomes and their uses
US11576914B2 (en) 2017-07-26 2023-02-14 The Doshisha Drug for treating or preventing disorder caused by TGF-β signaling, and application thereof

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