PT1669367E

PT1669367E - Peptídeos com capacidade de se ligarem a um factor de crescimento transformador beta 1 (tgf-1)

Info

Publication number: PT1669367E
Application number: PT04742049T
Authority: PT
Inventors: Juan Jose Lasarte Sagastibelza; Javier Dotor De Las Herrerias; Ana Belen Lopez Vazquez; Jesus Prieto Valtuena; Francisco Borras Cuesta
Original assignee: Proyecto Biomedicina Cima Sl
Priority date: 2003-08-22
Filing date: 2004-07-05
Publication date: 2010-12-07
Also published as: ATE479702T1; US20070142275A1; RU2455358C2; DK1669367T3; WO2005019244A1; EP1669367B1; HRP20100637T1; CN1839149A; DE602004028949D1; US7666841B2; RU2008115678A; JP2007525204A; AU2010212466B2; ES2304069B1; CA2535807A1; EP1669367A1; RU2333917C2; PL1669367T3; ES2304069A1; JP4902352B2

Description

ΕΡ1669367Β1

DESCRIÇÃO PEPTÍDEOS COM CAPACIDADE DE SE LIGAREM A DM FACTOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMADOR BETA 1 (TGF-B1) A invenção refere-se, genericamente, a peptídeos com capacidade de se ligarem a um factor de crescimento transformador βΐ (TGF-βΙ), e suas aplicações. Particularmente a invenção refere-se a peptídeos que inibem a actividade biológica de TGF-βΙ como um resultado de ligação directa a TGF-βΙ, e ao seu uso no tratamento de doenças ou alterações patológicas baseadas na expressão de TGF-βΙ excessiva ou desregulada.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A TGF-βΙ é uma glicoproteína que pertence à superfamília das proteínas (citoquinas) regulatórias relatadas estruturalmente incluídas numa das três isomorfas descritas em mamíferos (TGF-β 1, 2 e 3). A mais abundante isomorfa é a TGF-βΙ, que consiste em 25 kDa de um homodímero composto de duas subunidades conectadas por uma ligação de dissulfeto. A sequência de aminoácidos de TGF humana foi descrita por diversos autores como K. Derynck et al., em "Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequence and expression in normal and transformed sells", Nature 316 (6030), 701-705 (1985). A TGF-βΙ é uma molécula com uma sequência altamente preservada em termos evolutivos. Embora tenha sido originalmente definida pela sua capacidade para induzir adesão independente de proliferação e mudanças morfológicas em fibroblastos de ratos, posteriores pesquisas mostram que a TGF-βΙ é um inibidor geral da proliferação de grande intervalo de tipos celulares. A molécula é produzida por uma grande variedade de tipos de células e em diferentes tecidos durante todas as fases da diferenciação celular. Apresenta uma grande série de efeitos biológicos, com a geração de potentes e frequentemente 1 ΕΡ1669367Β1 opostos efeitos em relação ao desenvolvimento, fisiologia e resposta imune. Informações relativas à função do TGF-βΙ na regeneração do figado e diferenciação, e na fibrose do fígado, bem como nos efeitos da molécula sobre a matriz extracelular podem ser encontradas no pedido de Patente Espanhola ES 2146552 AI.

Com o propósito de explorar o mecanismo de acção de TGF-βΙ, relacionaram-se 10 proteínas para interagir com esta citoquina (membranas receptoras e proteínas matriz extracelular).

Por outro lado, como muitas doenças ou alterações patológicas estão associadas à expressão de TGF-βΙ desregulada ou excessiva, e.g., fibrose associada a órgão ou perda de função do tecido, ou complicações estéticas ou cirúrgicas, é interessante pesquisar produtos capazes de inibir a actividade biológica de TGF-βΙ, na medida em que tais produtos podem ser potencialmente usados na terapia humana ou animal para bloquear as consequências patológicas da expressão de TGF-βΙ excessiva ou desregulada. Várias estratégias têm sido usadas para inibir a actividade biológica de TGF-βΙ incluindo o uso de: (i) anticorpos de neutralização específicos; (ii) sequência de oligonucleótideos anti-sentido do gene de codificação TGF-βΙ que bloqueiam a sua expressão; ou (iii) receptores solúveis para TGF-βΙ que actuam de modo semelhante aos anticorpos. O uso de anticorpos fornece bloqueio total e específico desta citoquina (TGF-βΙ), embora certos efeitos colaterais sejam aumentados pela presença simultânea de imunoglobulinas exógenas no sangue e efeitos derivados do bloqueio sistémico de TGF-βΙ. Além disso, a estabilidade da imunoglobulina no tempo não permite controlo de curto prazo da actividade de bloqueio desta citoquina. As sequências de oligonucleotídeos anti-sentido inibem a produção de TGF-βΙ ao nível de expressão do gene, um facto 2 ΕΡ1669367Β1 que pode gerar importante desregulação de todos processos nos quais esta citoquina participa.

Outra estratégia foi recentemente desenvolvida, baseada no uso de peptideos que inibem a actividade biológica de TGF-βΙ. Neste sentido, o pedido de Patente Espanhola ES 2146552 AI descreve alguns peptideos sintéticos originados de TGF-βΙ e seus receptores, ou de proteínas capazes de se ligarem a TGF-βΙ, e que podem ser usadas como inibidores da actividade biológica de TGF-βΙ.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção em geral refere-se ao problema de procurar novos compostos capazes de inibir a actividade biológica de TGF-βΙ. A solução fornecida pela presente invenção é baseada no facto de os inventores terem identificado uma série de peptideos capazes, não só de se ligarem a TGF-βΙ, mas também de inibir a actividade biológica de TGF-βΙ através de ligação directa ao último. Alguns destes peptideos foram identificados usando uma tecnologia associada à bibliotecas de peptideos fago-exibidas, que permite a identificação de peptideos, com um tamanho típico na faixa de 6 a 15 aminoácidos, capazes de se ligarem com elevada afinidade a TGF-βΙ, quantificando, subsequentemente, por ensaios ín vitro e in vivo a sua capacidade para inibir a actividade biológica de TGF-βΙ. Outros peptideos foram obtidos através da truncagem de peptideos previamente identificados com esta tecnologia associada à biblioteca de fagos.

Os peptideos capazes de se ligarem a TGF-βΙ, e em particular aqueles capazes de inibir a actividade biológica de TGF-βΙ, pela sua ligação directa a TGF-βΙ, são potencialmente úteis para o tratamento de doenças e alterações patológicas associadas a expressão desregulada ou excessiva de TGF-βΙ. Do mesmo modo, peptideos capazes 3 ΕΡ1669367Β1 de se ligarem a TGF-βΙ oferecem uma ferramenta para estudar o papel biológico de TGF-βΙ (um aspecto que deve ser clarificado em muitas áreas da regulação de diferentes processos biológicos) .

Assim, um aspecto desta invenção refere-se a peptideos capazes de se ligarem a TGF-βΙ, tal como definido na reivindicação 1. Numa forma de realização particular e preferida, estes peptideos são também capazes de inibir a actividade biológica de TGF-βΙ.

Noutro aspecto a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um dos mencionados peptideos.

Noutro aspecto a invenção refere-se ao uso dos referidos peptideos para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de doenças e alterações patológicas associadas à expressão de TGF-βΙ desregulada ou excessiva, tal como definido na reivindicação 7. Exemplos representativos de tais doenças ou alterações patológicas associadas à expressão de TGF-βΙ desregulada ou excessiva incluem fibrose associada à perda de função do órgão ou tecido, bem como complicações estéticas e/ou cirúrgicas.

Noutro aspecto, a invenção relata a sequência de DNA que codifica os referidos peptideos.

Noutro aspecto a invenção refere-se a uma construção de DNA que compreende uma sequência de DNA que codifica um peptideo fornecido por esta invenção.

Noutro aspecto a invenção refere-se a um vector que compreende a referida sequência de DNA ou construção de DNA. 4 ΕΡ1669367Β1

Noutro aspecto a invenção refere-se a uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira transformada que compreende a referida construção de DNA ou vector.

Noutro aspecto a invenção refere-se a um processo para produzir um peptideo fornecido por esta invenção que compreende cultivar as referidas células hospedeiras sobre condições que permitem a expressão dos referidos peptideos e, se desejado, recuperando o peptideo obtido.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra esquematicamente a posição de um peptideo 15-aminoácido (aa), geneticamente fundido à proteína pIII, na superfície do filamento bacteriófago M13. A Figura 2 mostra esquematicamente a posição genética do inserto, que codifica um 15-aa peptideo, no genoma do bacteriófago M13 e a posição do peptideo na sequência da proteína pIII. A Figura 3, mostra esquematicamente a selecção dos peptideos baseada na técnica "biopanning". 0 biotinilado TGF-βΙ é imobilizado nas placas contendo estreptavidina (através da ligação biotina-estreptavidina). Os fagos da biblioteca são seleccionados na base da interacção entre TGF-βΙ e os peptideos apresentados pelos fagos. Os fagos com baixa afinidade para TGF-βΙ são eliminados através de lavagens. Os fagos retidos na placa são eluídos pela diminuição do pH. Após 3 ciclos de enriquecimento de fagos com alta afinidade para TGF-βΙ, os fagos são isolados e sequenciados (ver exemplo 1) [Legendas para a Figura 3: "a": Biblioteca de fagos apresentando 15-aa peptideos; "b": Infecção em E. coli (K91Kan) (amplificação); 5 ΕΡ1669367Β1 "c": Purificação dos fagos; "d": Incubação dos fagos com diminuição das concentrações de TGF- βΐ; "e": Lavagens; "f": Eluição dos fagos ligados (ipH); "g": Infecção em estirpes de E. colí; "h": Selecção de colónias infectadas (tetraciclina); "i": Amplificação dos fagos seleccionados; e "j": Sequenciamento de DNA (correspondente ao peptideo) após 3 ciclos de "biopanning"]. A Figura 4 fornece uma representação de uma sequência de árvore analógica entre os peptídeos 15-aa identificados por meio de uma biblioteca de peptídeos fago-exibidos. A Figura 5 fornece uma representação diagramática do efeito da concentração de TGF-βΙ no crescimento de linhagens de células Mv-l-Lu, expressas pela titulação de timidina em contagens por minuto (c.p.m.). A Figura 6 fornece uma representação diagramática do protocolo de indução de lesão aguda no fígado (ver exemplo 3).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Segundo um determinado aspecto, a invenção refere-se a um peptideo caracterizado pela sua capacidade de ligação a TGF-βΙ, daqui em diante denominado peptideo da invenção, cuja sequência de aminoácido é SEQ ID NO: 17, ou um seu fragmento com a capacidade de ligação a TGF-βΙ, que compreende entre 9 e 14 resíduos de aminoácidos consecutivos da SEQ ID NO: 17, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Os peptídeos da invenção são capazes de se ligar a TGF-βΙ. Alguns destes peptídeos são capazes de inibir a actividade biológica de TGF-βΙ, in vitro e/ou in vivo. 6 ΕΡ1669367Β1 A capacidade de os peptídeos da invenção se ligarem a TGF-βΙ pode ser comprovada por qualquer método apropriado que permita a determinação da ligação entre duas moléculas, por exemplo, através de um ensaio de afinidade que compreende a colocação de TGF-βΙ em contacto com o peptideo testado sob condições que permitem a ligação do peptideo a TGF-βΙ; e avaliando a ligação entre o peptideo e TGF-βΙ. Numa forma de realização particular, este ensaio de afinidade pode ser executado usando radioactividade marcada TGF-βΙ, e. g., I125-TGF-βΙ humano, tal como descrito em ES 2146552 Al. Alternativamente, o peptideo pode ser o componente marcado. Em geral, este tipo de ensaio de afinidade envolve a colocação de TGF-βΙ (por exemplo, imobilizada em placa bloqueada com estreptavidina) em contacto com o peptideo testado cuja afinidade deve ser determinada e, após incubação durante um período de tempo de incubação apropriado, analisar a ligação do peptideo a TGF-βΙ. Os peptídeos com baixa afinidade a TGF-βΙ são eliminados por lavagens, enquanto os peptídeos com uma elevada afinidade permanecem ligados a TGF-βΙ e podem ser liberados pela ruptura das interacções moleculares entre duas moléculas (e.g., diminuindo o pH) . Através do teste de peptideo contra concentrações diferentes de TGF-βΙ, ou vice-versa, pode obter-se uma ideia da afinidade do peptideo testado para TGF-βΙ. A capacidade dos peptídeos da invenção para inibir a actividade biológica de TGF-βΙ in vitro pode ser avaliada e, se desejado, quantificada por um teste de inibição ao crescimento de linhagens celulares Mv-l-Lu, uma linhagem celular derivada de epitélio pulmonar de "mink", cuja proliferação é inibida por TGF-βΙ (ver Exemplo 2). A capacidade dos peptídeos da invenção para inibir a actividade biológica de TGF-βΙ in vivo pode ser avaliada e, se desejado, quantificada pelo teste num modelo animal de lesão aguda no fígado, induzidos, por exemplo pela administração de CC14 (ver Exemplo 3) . Como é sabido, a lesão aguda no fígado gera uma cascata de efeitos e respostas fisiológicas incluindo um aumento nos níveis de TGF-βΙ, 7 ΕΡ1669367Β1 que, por seu turno, é responsável (entre outros efeitos) pela expressão do tipo 1 gene colágeno.

No escopo desta invenção estão os sais farmaceuticamente aceitáveis dos peptideos da invenção. 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" incluem os habitualmente usados para formar sais metálicos ou sais de adição ácidos. A natureza do sal não é um factor critico, desde que seja farmaceuticamente aceitável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos peptideos da invenção podem ser obtidos de ácidos ou bases (orgânicas ou inorgânicas), com base em métodos convencionais que são bem conhecidos pelos técnicos na área.

Numa forma de realização particular, a invenção fornece um peptideo compreendendo 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 resíduos de aminoácidos consecutivos de uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17 e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Noutra forma de realização particular, a invenção fornece um peptideo identificado por SEQ ID NO: 17 e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Noutra forma de realização particular, a invenção fornece um

peptideo selecionado do grupo formado pelos peptideos identificados como SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Estes peptideos compreendem entre 9 e 14 resíduos de aminoácidos consecutivos de sequência de aminoácidos de peptideos identificados por SEQ ID NO: 17, e foram obtidos pela truncagem do referido peptideo (Exemplo 4).

Noutra forma de realização particular, a invenção fornece um peptideo selecionado do grupo formado pelos peptideos identificados 8 ΕΡ1669367Β1 por SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Os peptideos identificados por SEQ ID NO: 17, mostram uma capacidade inibitória da actividade biológica de TGF-βΙ, tanto in vitro como in vivo. Os peptideos identificados pela SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34 mostram actividade inibitória da actividade biológica de TGF-βΙ in vitro.

Para a identificação inicial dos peptideos com a capacidade de se ligarem a TGF-βΙ usou-se uma tecnologia que envolve bibliotecas de peptideos fago-observados que permitem determinar os peptideos com elevada afinidade à ligação TGF-βΙ e, subsequentemente, quantificam in vitro e in vivo a sua capacidade de inibir a actividade biológica de TGF-βΙ. A sequência dos referidos peptideos que se ligam a TGF-βΙ, inibindo a actividade biológica de TGF-βΙ in vitro e in vivo, pode ser deduzida da correspondente sequência de DNA após vários ciclos de "biopanning" (geralmente 3) . Foi descrito o uso da biblioteca de peptideos fago-observados para identificar os inibidores de certos produtos, por exemplo, por Chirinos-rojas C.L. et al., in Immunology, 1999, Jan. 96 (1): 109-113; McConnell S.J., et al., in Gene 1994, Dec. 30, 151 (1-2) : 115-118; ou Smith G.P., Science, 1985, Jun. 14, 228 (4705): 1315-1317.

Assim, descreve-se ainda um método para identificar peptideos capazes de se ligarem a TGF-βΙ, que compreende: (i) usar uma biblioteca de peptideos fago-observados compreendendo uma pluralidade de fagos filamentosos, em que o genoma de cada um contem uma sequência de nucleotideo que codifica um peptideo diferente ligado a um gene que codifica uma proteína envelopada (pelo que cada fago contem um peptideo diferente geneticamente fundido a uma proteína do fago envelope); 9 ΕΡ1669367Β1 (ii) seleccionar, via ensaio de afinidade, os fagos contendo os peptideos que ligam com afinidade aumentada a um TGF-βΙ; e (iii) determinar a sequência dos peptideos que se ligam a TGF-βΐ, baseado na correspondente sequência de DNA colocada nos fagos seleccionados na etapa (ii) e que codificam os referidos peptideos que ligam a TGF-βΙ.

Numa forma de realização particular, para obter peptideos 15-aa capazes de se ligarem com elevada afinidade a TGF-βΙ, e também com uma eventual actividade inibitória sobre a actividade biológica da mencionada citoquina, usou-se uma biblioteca de peptideos fago-observados compreendendo uma pluralidade de bacteriófagos filamentosos (M13), cada um contendo um diferente peptideo 15-aa geneticamente fundido a uma proteína do fago envelope, neste caso a ligação à extremidade N-terminal do envelope proteico pIII. Deste modo o fago apresenta uma superfície com um peptideo 15-aa em cada uma das 5 superfícies das moléculas proteicas, enquanto o DNA codificando a sequência de peptideo mencionada está contida no interior do fago. Nas bibliotecas de fagos a sequência que codifica o peptideo origina-se a partir da sequência degenerada em cada uma das 15 posições com os 20 aminoácidos naturais, permitindo assim a apresentação de 1,1 x 1012 possíveis sequências de 15 aminoácidos em diferentes fagos. A razão física 1:1, entre a sequência de peptideos e o DNA codificado dentro do bacteriófago permite a selecção (entre um largo intervalo de variantes) das sequências que se ligam especificamente a TGF-βΙ. Este processo é executado via ensaio de afinidade.

Numa forma de realização particular, o mencionado ensaio de afinidade consiste num protocolo de selecção ín vítro conhecido por "biopanning". Resumidamente esta técnica consiste na incubação de uma colecção de fagos representativos em termos práticos de todas as 10 ΕΡ1669367Β1 variantes de peptídeos (neste caso) numa placa bloqueada com estreptavidina e à qual se adiciona TGF-βΙ biotinilado. 0 TGF-βΙ biotinilado é assim ancorado na placa através da ligação estreptavidina-biotina, sendo assim correctamente observado para a sua interacção de TGF-βΙ com os peptideos transportados pelos fagos. Seguindo a incubação, os fagos que não se ligaram são eliminados através de lavagens e os fagos ligados especificamente são então especificamente eluidos pela diminuição do pH, um procedimento que rompe as interacções moleculares entre TGF-βΙ e os peptideos representados pelos fagos. Os fagos eluidos são então amplificados via infecção numa estirpe bacteriana. 0 procedimento é repetido por 3 ciclos, até concluir o enriquecimento no conteúdo dos fagos, os quais se ligam especificamente e com elevada afinidade, a TGF-βΙ. A concentração de TGF-βΙ biotinilado usado para bloquear as placas é gradualmente reduzida em cada ciclo, e.g., de 2,5 a 0,01, e finalmente até 0,001 ug/ml. Assim ao final do processo, os fagos que foram seleccionados pela afinidade ao TGF-βΙ são sequenciados usando primers. Tal operação permite obter a sequência dos peptideos apresentada pelos fagos. O exemplo 1 mostra a selecção dos peptídeos que se ligam ao TGF-βΙ via bibliotecas de fagos, selecção "biopanning", e sequenciamento dos peptídeos que se ligam com elevada afinidade a TGF-βΙ.

Descreve-se ainda um método para a identificação de peptídeos capazes de se ligarem a TGF-βΙ, que compreende a truncagem dos peptídeos que são capazes de se ligarem a TGF-βΙ, seguido por testar a capacidade destes peptídeos truncados de se ligarem a TGF-βΙ. Os peptídeos truncados podem ser obtidos por qualquer método convencional, tal como por exemplo síntese química (em face do seu tamanho) das versões do peptídeo truncado nas extremidades N-terminal ou C-terminal. A capacidade destes peptídeos truncados de se ligarem a TGF-βΙ pode ser determinada usando qualquer método apropriado para 11 ΕΡ1669367Β1 caracterizar a ligação entre as duas moléculas, e.g., um ensaio de afinidade, que envolve a colocação de TGF-βΙ em contacto com o peptideo testado sobre condições permitindo a ligação dos mencionados peptideos ao TGF-βΙ e avaliando o ligante do peptideo ao TGF-βΙ, como mencionado acima. Do mesmo modo, a capacidade destes peptideos truncados para inibir a actividade biológica de TGF-βΙ in vitro e/ou in vivo pode ser testada por qualquer dos métodos mencionados nesta descrição.

Devido ao papel desempenhado pelo TGF-βΙ em muitos processos biológicos, uma consequência da actividade inibitória de TGF-βΙ dos peptideos da invenção relaciona-se com o desenvolvimento potencial da família de drogas para o tratamento de doenças e alterações patológicas associadas a expressão excessiva ou desregulada de TGF-βΙ, desde que tais peptideos possam bloquear o dano induzido pela expressão excessiva ou desregulada desta citoquina.

Os peptideos da invenção podem ser usados no tratamento de (i) : fibrose associada à perda da função do tecido ou órgão, e.g., fibrose pulmonar, fibrose do fígado (cirrose), fibrose renal, fibrose corneana, etc.; e (ii) complicações cirúrgicas e/ou estéticas, e.g., fibrose associada à cirurgia peritoneal e dérmica, fibrose associada a queimaduras, fibrose osteoarticular, quelóides, etc.

Assim, noutro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptideo da invenção juntamente com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica fornecida por esta invenção pode conter um ou mais peptideos da invenção, opcionalmente em combinação com um ou mais compostos de inibição de TGF-βΙ alternativos. Esta composição farmacêutica é útil para a administração e/ou aplicação a humanos ou animais (preferencialmente na primeira). 12 ΕΡ1669367Β1 0 uso de peptídeos tais como os da presente invenção, em vez de antibióticos ou sequências de oligonucleotideos anti-sentido oferece muitas vantagens, dado que estes são moléculas pequenas com maior potencial de difusão e menor meia-vida. Os peptídeos podem exibir elevada afinidade a TGF-βΙ, embora degradem mais rapidamente do que anticorpos, contudo o efeito colateral pode ser controlado pela dosagem. A veiculação dos peptídeos aos órgãos alvo e tecidos é também mais fácil comparada com outros tipos de compostos.

Os peptídeos da invenção podem ser administrados para tratar doenças e alterações patológicas associadas à expressão TGF-βΙ desregulada ou excessiva via qualquer meio que coloque o peptídeo da invenção em contacto com seu sítio de acção ou alvo no interior do corpo humano ou animal. A quantidade de peptídeo, derivada ou sal farmaceuticamente aceitável que pode estar presente na composição farmacêutica fornecida por esta invenção pode variar num intervalo considerável. A dosagem indicada para tratar uma doença ou alteração patológica associada à expressão de TGF-βΙ desregulada ou excessiva usando o peptídeo e/ou composições farmacêuticas da invenção dependerá de inúmeros factores - incluindo idade do paciente, condição, gravidade dos antecedentes das perturbações ou alterações patológicas, e a via e frequência da administração do peptídeo da invenção envolvido.

As composições farmacêuticas contendo os peptídeos da invenção podem ser formuladas em qualquer forma de administração, e.g., sólida ou líquida, e podem ser administradas via qualquer via apropriada, e.g., oral, parenteral, rectal ou tópica. Para este efeito excipientes farmacêuticos aceitáveis necessários para a formulação da forma de administração desejada devem ser incluídos, tais como por 13 ΕΡ1669367Β1 exemplo pomadas (lipogels, hidrogels, etc.), colírios, aerossóis de nebulização, soluções injectáveis, sistemas de bomba osmótica, etc. Uma revisão das diferentes formas de dosagem das drogas e dos excipientes necessários para o efeito pode ser encontrado, por exemplo, na publicação "Tratado de Farmácia Galênica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S. A. Ediciones, Madrid. 0 uso dos peptídeos da invenção no fabrico da mencionada composição farmacêutica constitui um aspecto adicional desta invenção. Assim, noutro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um peptídeo da invenção no fabrico de composição farmacêutica para o tratamento de fibrose associada a perda da função do tecido ou órgão, e. g., fibrose pulmonar, fibrose do fígado (cirrose), fibrose renal, fibrose corneana, etc.; e complicações estéticas e/ou cirúrgicas, e.g., fibroses associadas à pele e cirurgia peritoneal, fibroses associadas a queimaduras, fibroses osteoarticulares, quelóides.

Os peptídeos desta invenção podem ser obtidos pelos métodos convencionais, tais como por exemplo pela síntese química em fase sólida, purificados com cromatografia de fase líquida de alta performance (HPLC), e, se desejado, analisado por técnicas convencionais tais como por exemplo sequenciamento e espectrometria de massa, análise de aminoácidos, técnicas de ressonância magnética nuclear, etc.

Alternativamente, os peptídeos da invenção podem ser obtidos pela tecnologia do DNA recombinante. Assim, noutro aspecto, a invenção fornece uma sequência de DNA codificando um peptídeo da invenção. A referida sequência de DNA pode facilmente ser deduzida da sequência de aminoácidos do peptídeo. A referida sequência de DNA pode estar contida dentro de uma construção de DNA. Assim a invenção fornece uma construção de DNA que 14 ΕΡ1669367Β1 compreende uma sequência de DNA que codifica um peptideo da invenção. Esta construção de DNA pode incorporar operacionalmente uma sequência regulatória para a expressão sequência de DNA que codifica o peptideo da invenção. Sequências de controlo são sequências que controlam e regulam a transcrição e, onde aplicáveis, a translação do peptideo da invenção; incluem sequências promotoras e terminadoras, etc., que são funcionais nas células hospedeiras transformadas, que compreendem a mencionada sequência de DNA ou construção de DNA. Numa forma de realização particular, a referida sequência de expressão de controlo é funcional na bactéria. Vantajosamente, esta construção de DNA também compreende um marcador ou gene que codifica um motivo ou fenótipo que permite selecção das células hospedeiras transformadas por meio da construção de DNA. A construção de DNA fornecida por esta invenção pode ser obtida por meio de métodos que são bem conhecidos no estado da arte [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.,1989 Vol. 1-3] . A sequência de DNA ou construção de DNA fornecida por esta invenção pode ser inserida num vector apropriado. Assim, noutro aspecto, a invenção refere-se a um vector, tal como um vector de expressão, que compreende a sequência de DNA mencionada ou construção de DNA. A escolha do vector dependerá do resultado na célula hospedeira na qual deve ser inserido subsequentemente. Como um exemplo, o vector no qual a sequência de DNA é inserta pode ser um plasmideo ou vector que, sobre inserção dentro da célula, pode ou não pode integrar o genoma da célula. 0 vector pode ser obtido por métodos convencionais conhecidos pelas pessoas desta arte [Sambook et al., citado anteriormente].

Noutro aspecto a invenção refere-se a uma célula hospedeira, tal como uma célula hospedeira transformada, que compreende uma sequência de DNA ou construção de DNA fornecido por esta invenção. 15 ΕΡ1669367Β1

Noutro aspecto a invenção refere-se a um processo para produzir um peptideo da invenção que compreende crescimento de uma célula hospedeira com a sequência de DNA ou construção de DNA fornecida pela invenção, sob condições que permitem a produção do peptideo mencionado da invenção e, se desejado, recuperando o peptideo da invenção. As condições para optimização de cultura da célula hospedeira dependente do tipo de célula hospedeira empregada. Se desejado, o processo para produzir o peptideo da invenção contempla o isolamento e a purificação do peptideo.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção e não devem ser tomados para reflectir limitações à mesma. EXEMPLO 1

Selecção de peptídeos que se ligam a TGF-βΙ usando uma biblioteca de peptideo fago-observado

Para obter sequências de 15 aminoácidos capazes de afinidade elevada de ligação a TGF-βΙ, e oferecendo a actividade inibitória possível sobre a actividade biológica desta citoquina, usou-se uma selecção técnica in vitro baseada na tecnologia desenvolvida de biblioteca de peptideo fago-observado. Estas bibliotecas compreendem uma pluralidade de bacteriófagos filamentosos (M13), cada uma contendo um peptideo geneticamente enovelado para uma proteína do vírus envelope - neste caso ligado à extremidade N-terminal do envelope de proteína pIII (Figura 1). Desta forma o fago observado um peptideo 15-aa na superfície de cada uma das cópias da proteína superficiais pIII, onde a sequência de DNA que codifica o peptideo está contida dentro do fago. Nas bibliotecas de fago, a sequência que codifica o peptideo originado de uma sequência degenerada em cada uma das 15 posições com os 20 aminoácidos naturais, permitindo assim a 16 ΕΡ1669367Β1 apresentação de 1,1 x 1012 possíveis sequências de 15 aminoácidos em diferentes fagos. A taxa física, 1:1, entre a sequência de peptídeos e o DNA que o codifica dentro do bacteriófago permite a selecção (de uma larga faixa de variantes) das sequências que especificamente se ligam a TGF-βΙ. Este processo é executado via protocolo de selecção in vitro conhecido como "biopanning". A biblioteca fago-observado usada para este exemplo originada de uma segunda amplificação da biblioteca primária descrita por T. Nishi, H. Tsuri e H. Saya [Exp. Med. (Japan) 11, 1759 (1993)] e fornecida pelo laboratório George P. Smith. Informações adicionais desta tecnologia podem ser encontradas no seguinte website: http:/www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDispla yWebsitelndex.html

Selecção Técnica ("biopanning")

Esta técnica envolve a incubação de uma colecção de fagos representativos (para efeitos práticos) de todas as variantes 15-aa, numa placa bloqueada com estreptavidina (10 ug/ml em 0,1 M NaHC03, durante 2 horas à temperatura ambiente) à qual se adiciona TGF-βΙ biotinilado. O TGF-βΙ biotinilado é ancorado à placa através da interacção biotina-estreptavidina, permanecendo assim correctamente observado para sua interacção com os peptídeos transportados pelos fagos. A TGF-βΙ contacta os peptídeos transportados pelos fagos a uma concentração de 3 x 104 virus/ml. Após aproximadamente 12 horas de incubação, os fagos não ligados são eliminados por 5 lavagens com PBS/Tween (fosfato tamponado com derivados salino/polioxialiquileno de ésteres de ácidos gordos de sorbitano). Os fagos ligados são então eluídos pela diminuição do pH (eluição tampão) a qual rompe as interacções entre TGF-βΙ e os peptídeos observados pelos fagos. Os fagos eluídos são então amplificados pela infecção em cepa bacteriana (E. coli) . O processo é repetido por 3 ciclos, até que o 17 ΕΡ1669367Β1 enriquecimento no conteúdo de fagos que especificamente se ligam, e com elevada afinidade, a TGF-βΙ seja concluído (Figura 3). A concentração de TGF-βΙ biotinilado usada para bloquear as placas é gradualmente reduzida em cada ciclo, e. g., de 2.5 a 0,01 ug/ml, e finalmente a 0,001 ug/ml. Assim, os fagos seleccionados em cada ciclo mostram mais e mais afinidade a TGF-βΙ. No final do processo, os fagos que foram seleccionados pela sua afinidade a TGF-βΙ, são sequenciados pelo uso de primers, após o isolamento pela resistência à tetraciclina dos fagos geneticamente modificados depois de infectar células de E.coli. Isto permite obter a sequência de peptídeos observada nos fagos de um número de clones obtidos de colónias isoladas. O número de vezes que uma sequência é repetida corresponde a 15 peptídeos aminoácidos transportados via cada clone, do total de colónias sequenciadas é uma indicação da afinidade relativa da referida sequência de 15 aminoácidos para TGF-βΙ.

Sequência de peptídeos A selecção de clones, obtida de "biopanning", foi executada pela selecção das colónias bacterianas infectadas com os fagos na presença de um antibiótico bacteriano; a resistência bacteriana é adquirida pela resistência ao gene da tetraciclina codificado pelo genoma do fago. Assim, somente essas colónias infectadas com os bacteriófagos são capazes de crescer. Estes meios que cada colónia contem o genoma de apenas um fago codificam para somente um peptídeo apresentado na sua superfície.

Obteve-se um número total de 108 colónias de bactérias fago-infectadas do último ciclo de selecção de "biopanning". A sequência das regiões codificadas para os peptídeos presentes na proteína pIII foi executada usando primers identificados com SEQ ID NO:23. Estas diferentes sequências de peptídeos foram fornecidas como mostrado na 18 ΕΡ1669367Β1

Tabela 1. Esta Tabela também reflecte o número de colónias (clones) transportando as referidas sequências

Tabela 1

Sequências de aminoácidos dos fagos que se ligam a TGF-βΙ SEQ ID NO: Número de colónias 1 6 2 1 3 41 4 18 5 1 6 12 7 2 8 2 9 1 10 1 11 4 12 1 13 6 14 2 15 1 16 1 17 3 18 1 19 1 20 1 21 1 22 1 0 número de clones (colónias) de cada sequência dá uma indicação aproximada do grau de afinidade do peptideo para TGF-βΙ, ou seja, quanto maior o número de colónias, maior a afinidade à ligação. Contudo, o grau de afinidade não se correlaciona com a capacidade do peptideo bloquear a actividade biológica de TGF-βΙ. De facto, o mais activo peptideo, identificado pela SEQ ID NO:17 (ver Tabelas 2 e 3), 19 ΕΡ1669367Β1 é representado pelos 3 clones, enquanto o peptídeo identificado pela SEQ ID NO:3, que é representado pelos 41 clones, é muito menos activo no ensaio de lesão aguda no figado (Tabela 3) . Sem vinculação a qualquer teoria concreta, esta observação pode ser desenvolvida postulando que o mais activo peptideo provavelmente bloqueia a ligação de TGF-βΙ a seu receptor.

Comparação das sequências de peptideos

As sequências obtidas foram analisadas usando o programa CLUSTAL W (1,81). Este programa gera agrupamento de múltiplas sequências baseadas nas analogias de sequência de aminoácidos. Os peptideos são consequentemente agrupados em diferentes famílias estruturais baseadas nas analogias de sequência dos peptideos (Figura 4). Com base nestas analogias, podem ser sugeridos menores motivos de ligação TGF-βΙ ou grupos de peptideos que se ligam a diferentes regiões de TGF-βΙ EXEMPLO 2

Inibição da actividade biológica de TGF-βΙ in vitro através do uso de peptideos em ensaios de proliferação de células Mv-l-Lu A linhagem de célula Mv-l-Lu, (CCL-64, American Type Cell Culture, Virgínia, USA) deriva de epitélio pulmonar de mink, cresce como uma monocamada, e responde à presença de TGF-βΙ pelo decréscimo de sua proliferação (Figura 5). Assim, a inibição do peptídeo-mediado desta citoquina é capaz de restaurar o crescimento celular e reflecte a capacidade dos diferentes peptideos para inibir a actividade biológica de TGF-βΙ in vitro. Os peptideos testados foram obtidos pela síntese de peptideos, de acordo com procedimentos convencionais (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al., J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546). 20 ΕΡ1669367Β1

As células Mv-l-Lu são cultivadas para confluência em meio completo [RPMI-1640 suplementado com L-glutamina, piruvato de sódio, antibióticos e soro bovino fetal 10% (FBS) ] a 37C e em 5% C02 em garrafas de 162 cm2 (Costar Corp., CA, USA). A seguir à tripsinização, as células são cultivadas em 200 μΐ de meio completo em 96 placas "well" a uma densidade inicial de 5000 células/"well" a 37°C e em 5% C02 durante 6 horas para assegurar a adesão. Em seguida, adicionam-se as diferentes concentrações dos peptideos a serem testados, iniciando de 200pg/ml, e seguindo a adição de 200 pg/ml de TGF-βΙ (Roche). Após 12 horas de incubação adiciona-se 1 pCi de metil-H3-timidina (Amersham life Science, Buckinghamshire, United Kingdom) por "well" em 25 μΐ de meio limpo (RPMI-1640) . A placa é incubada por mais 12 horas nas mesmas condições. Finalmente as células são recolhidas (Filtermate 196 Harvester, Packard), transferindo a timidina titulada, incorporada durante a síntese de DNA, para placas (UniFilter-96 GF/C, Perkin Elmer). Posteriormente à adição de fluido de cintilação, a radioactividade foi quantificada usando um contador de cintilação (Top Count, Microplate Scintillation Counter, Packard). Como controlo positivo e negativo foi usada a incorporação de timidina titulada na ausência e presença de TGF-βΙ, respectivamente. A inibição da actividade de TGF-βΙ neste teste foi calculada com base na seguinte fórmula: lOOx (cpm com. peptídeo - cpm controle negativo) iinibiçãc = - (com. controle cosif.ivo — cpra controle negativo) O controlo negativo representa a incorporação de timidina titulada na presença de TGF-βΙ mas na ausência do peptídeo, ao passo que o controle positivo refere-se à incorporação de timidina titulada na ausência de TGF-βΙ e peptídeo. Assim, de acordo com a capacidade dos peptideos reverterem o efeito repressor da citoquina na 21 ΕΡ1669367Β1 proliferação da linhagem de células Mv-l-Lu, pode ser mensurada a percentagem de inibição da actividade biológica TGF-βΙ (Tabela 2).

Tabela 2

Efeito dos peptídeos obtidos pela selecção por "biopanning" na inibição da actividade biológica TGF-βΙ in vitro, como calculado do ensaio de restabelecimento do crescimento da linhagem de células Mv-l-Lu SEQ ID NO: %Inibição 1 3,33 +/- 4,3 2 -0,96 +/- 0,83 3 25,39 +/- 1,7 4 5,53 +/- 7,2 5 15,78 +/- 7,7 6 12,85 +/-4,5 7 -24,96 +/- 0,75 8 15,67 +/- 8,5 9 4,98 +/- 9,5 10 -4,58 +/- 0,9 11 27,36 +/- 0,9 12 10,70 +/- 0,9 13 17,97 +/- 4,3 14 3,62 +/- 5,6 15 13,45 +/- 9,5 16 9,47 +/- 4,2 17 38,92 +/- 2,3 18 21,29 +/- 2,8 19 9,71 +/- 3,2 20 6,16 +/- 9,5 21 13,40 +/- 3,2 22 4,13 +/- 1,4 P144 7,26 +/- 3,53 22 ΕΡ1669367Β1

Os peptídeos identificados como SEQ ID NO: 3, 11, 17 e 18 inibem a actividade biológica de TGF-βΙ in vitro com a percentagem de inibição maior do que 20%.

Adicionalmente, para assegurar a capacidade dos peptideos reverterem o efeito supressor de TGF-βΙ na proliferação de linhagem de células Mv-l-Lu como previamente descrito, a actividade do peptideo identificado como P144 no Pedido de Patente Espanhol ES2146552 Al foi comparado com a actividade do peptideo identificado como SEQ ID NO: 17. O peptideo identificado como SEQ ID NO: 17 exibiu uma capacidade aumentada. EXEMPLO 3

Inibição da actividade biológica de TGF-βΙ in vivo pelos peptideos usando um modelo de lesão aguda no fígado induzido por CC14 A lesão aguda no fígado gera uma cascata de efeitos e respostas fisiológicas, incluindo elevações nas concentrações de TGF-βΙ. Esta elevação é responsável pela expressão do gene do colágeno tipo I, entre ouros. Neste modelo de lesão aguda no fígado, cobaias fêmeas Balb/C pesando 25 a 30 g, receberam uma dose oralmente administrada de 2 μΐ de CC14 (por grama de peso corpóreo) dissolvidos em um volume equivalente de óleo de milho (taxa volumétrica de 1:1). O grupo de controlo recebeu apenas um volume equivalente de óleo de milho, e o grupo tratado recebeu (a seguir à simples administração oral de CC14 em óleo de milho) 50 pg de peptideo em 500 μΐ de solução salina fisiológica a 1% em DMSO (dimetil sulfóxido) cada 24 horas. Após 72 horas todos animais foram sacrificados, e as amostras de fígado foram processadas. Para avaliar a expressão de mRNA, tecido de fígado foram congelados em azoto líquido e armazenados a -80C até uso posterior. Outras amostras de tecido de fígado foram armazenadas em OCT ou Tissue Tek (Sakura Finetek B.V.) e processado da mesma forma que as 23 ΕΡ1669367Β1 amostras usadas nos estudos de mRNA. Outras amostras de fígado foram fixadas em solução de formalina tampão a 10%, embebidas em parafina e processada para sua avaliação histológica. A quantidade de mRNA de codificação do colágeno tipo I foi quantificada em todos os grupos usando uma técnica de reacção de polimerase quantitativa (PCR). A Figura 6 mostra um esquema da indução, obtendo das amostras e resultados quantificação no ensaio de lesão aguda no fígado. A capacidade de testar peptídeos para bloquear o dano agudo, como avaliado pela medição dos níveis de mRNA colágeno do tipo I induzido, foi quantificada pelo tempo real (PCR) . A Tabela 3 mostra o grau de inibição da expressão do mRNA tipo I colágeno pelos peptídeos fago-derivados. Os peptídeos testados foram obtidos pelos procedimentos de síntese de peptídeos sólidos convencionais (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al., J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546).

Tabela 3

Efeito dos peptídeos obtidos pela selecção por "biopanning" na inibição da actividade biológica TGF-βΙ in vivo, como calculado na base da inibição da indução da mRNA colágeno do tipo I no modelo de lesão aguda no fígado SEQ ID NO: %Inibição 1 0, 69 2 36,6 ± 30,7 3 2, 09 4 51,30 ± 15,3 5 Neg 6 74,94 ± 25,3 7 Neg 8 Neg 9 26, 59 10 Neg 11 39,34 ± 21,9 12 Neg 24 ΕΡ1669367Β1 13 32, 70 14 49,84 ± 24 15 14, 26 16 Neg 17 93,09 ± 9,6 18 Neg 19 12, 12 20 1, 41 21 Neg 22 Neg P144 -3,51 +/- 36 (Neg: negativo)

Os peptídeos identificados como SEQ ID NO: 2, 4, 6, 11, 14 e 17 inibem a actividade biológica de TGF-βΙ in vivo, com uma percentagem de inibição maior do que 35%.

Adicionalmente, de modo a assegurar a capacidade dos peptídeos para inibir a indução de mRNA de colágeno do tipo I no modelo de lesão aguda no fígado em cobaia como previamente descrito, a actividade do peptídeo identificado como P144 no Pedido de Patente Espanhol ES 2146552 AI foi comparada com a actividade do peptídeo identificado como SEQ ID NO: 17. Neste ensaio comparativo, observou-se que o peptídeo identificado como SEQ ID NO: 17 inibe a expressão do mRNA colágeno tipo I para uma ainda maior extensão do que o peptídeo identificado como P144 no Pedido de Patente Espanhol ES 2146552 Al, o qual não mostra qualquer actividade neste ensaio. Os resultados obtidos pelos testes comparativos (Exemplos 2 e 3) mostram que um peptídeo representativo dos peptídeos desta invenção (o peptídeo identificado como SEQ ID NO: 17) é mais activo do que um peptídeo representativo do Pedido de Patente Espanhol ES 2146552 Al (o peptídeo identificado como P144) nos testes de proliferação com células Mv-l-Lu e no modelo de lesão aguda no fígado. 25 ΕΡ1669367Β1 EXEMPLO 4

Inibição da actividade biológica de TGF-βΙ in vitro pelos peptídeos truncados do peptídeo de SEQ ID NO: 17 no ensaio de proliferação com células Mv-l-Lu.

Este exemplo mostra a actividade inibitória de alguns peptídeos cuja sequência de aminoácidos compreende entre 3 e 15 resíduos de aminoácidos consecutivos de uma das sequências de aminoácidos da invenção.

Foram feitas comparações da actividade de peptídeos truncados (derivados da sequência de peptídeos SEQ ID NO: 17) versus a sequência completa, em termos da capacidade de reverter o efeito supressor de TGF-βΙ, na proliferação da linhagem de células de Mv-l-Lu. Para este efeito e para determinar a sequência mínima de peptídeos SEQ ID NO: 17 capaz de inibir a actividade biológica de TGF-βΙ in vitro, foram sintetizadas versões truncadas deste peptídeo, com truncagem nas extremidades N-terminal e C-terminal ou em ambas as extremidades da molécula. Os peptídeos testados foram obtidos pela síntese peptídica segundo procedimentos convencionais (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al., J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546). Segundo a mesma metodologia descrita no Exemplo 2, a actividade dos peptídeos truncados versus a sequência completa do peptídeo SEQ ID NO: 17 foi quantificada, em termos do ensaio de proliferação da linhagem celular Mv-l-Lu. 26 ΕΡ1669367Β1

Tabela 4

Efeito dos peptídeos truncados obtidos do peptideo SEQ ID NO: 17 na inibição da actividade biológica de TGF-βΙ in vitro, como calculado de um ensaio de restabelecimento do crescimento de linhagem celular de Mv-l-Lu SEQ ID NO: Sequência de peptídeos % Inibição 17 KRIWFIPRSSWYERA 28,5 + /- 3,9 24 (Tl) RIWFIPRSSWYERA 4^ + 1 o 4^ 25 (T2) RIWFIPRSSWYER 6,2 +/-1,5 26 (T3) IWFIPRSSWYERA 4^ (jn + 1 1—* 00 27 (T4) IWFIPRSSWYE 1,4 +/- 2,5 28 (T5) WFIPRSSWY 3,1 +/- 0,9 29 (T6) WFIPRSSWYERA 2,7 +/- 1,8 30 (T7) FIPRSSWYERA -0,3 +/- 3,0 31 (T8) IPRSSWYERA 3,4 +/- 1,4 32 (T9) PRSSWYERA 3,8 +/- 1,6 33 (TIO) KRIWFIPRSSWYER 31,4 +/- 7,0 34 (Tl1) KRIWFIPRSSWY 34,4 +/- 7,9 35 (T12) KRIWFIPRSS σ> o + 1 o 4^ 36 (T13) KRIWFIPRS 6,2 +/- 2,5

Como mostrado na Tabela 4, neste ensaio comparativo, a remoção de lisina (K) da extremidade N-terminal implica na perda da actividade do peptideo SEQ ID NO: 17 de 28,5% a 9,4%. Em contraste, a remoção de até três aminoácidos da extremidade C-terminal não afecta a actividade do peptideo. Analogamente a remoção dos aminoácidos aromáticos tirosina (Y) e triptófano (W) , exclui a actividade do peptideo. Isto permite reduzir o peptideo original SEQ ID NO: 17 a uma sequência de 12 aminoácidos (KRIWFIPRSSWY) [SEQ ID NO: 34] não afectando sua actividade inibitória TGF-βΙ in vitro

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA, S.L. 27 ΕΡ1669367Β1 <120> PEPTÍDEOS COM CAPACIDADE DE SE LIGAREM A UM FACTOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMADOR BETA 1 (TGF- β!1) <130> FIMA02007 <150> ES 200302020 <151 >2003-08-22 <160> 36 <170> versão Patentln 3.1

<210> SEQ ID NO: 1 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 1

Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Leu Arg Ser Ala Pro Gly Ala 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 2 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400>2

Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Asn Arg Ser Ala Pro Gly Ala 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 3 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400>3

Arg Phe Phe Thr Arg Phe Pro Trp His Tyr His Ala Ser Arg Leu 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 4 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400>4

Arg Leu Ala His Ser His Arg His Arg Ser His Vai Ala Leu Thr 15 10 15 <210> SEQ ID NO: 5 <211 > 15 <212> PRT 28 ΕΡ1669367Β1 <213> Sequência de peptídeo artificial <400>5

Arg Arg Trp Vai Arg Tyr Pro Vai His Leu His Ser Pro Ile Vai 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 6 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400>6

Pro Pro Tyr His Arg Phe Trp Arg Gly His Arg His Ala Vai Gin 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 7 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400>7

His Arg Ile Ser His Phe Ala His Arg Tyr Leu Ala Arg Leu His 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 8 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400>8

Trp His Trp Arg His Arg Ile Pro Leu Gin Leu Ala Ala Gly Arg 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 9 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400>9

Gly Trp His Ser Leu Leu His Ser Arg Tyr His Arg Ile Ala Ala 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 10 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 10 29 ΕΡ1669367Β1

Phe Vai Trp Vai Arg Phe His Arg Leu Pro Arg Gin Ile Tyr Thr 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 11 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 11

Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser Vai Arg Thr Arg 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 12 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 12

Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser Vai Gly Leu Gly 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 13 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 13 qrg Lys Trp Phe Leu Gin His Arg Arg Met Pro Vai Ser Vai Leu 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 14 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 14

Ser Gly Arg Arg His Leu His Arg His His Ile Phe Ser Leu Pro 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 15 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 15

Gly Trp Ile Thr Phe His Arg Arg His His Asp Arg Vai Leu Ser 15 10 15 30 ΕΡ1669367Β1

<210> SEQ ID NO: 16 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 16

Arg Leu His Gly His Arg Ser His Arg Phe Thr His Vai Ala Gin 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 17 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 17

Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 18 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 18

Met Pro Leu Ser Arg Tyr Trp Trp Leu Phe Ser His Arg Pro Arg 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 19 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 19

Arg His Leu Ser His Phe Lys Trp Leu Arg Ser His Gly Leu Asp 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 20 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 20

Arg Arg Phe His Phe His Ser Arg Mct Vai Ala Vai Asp Asn Ser 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 21 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial 31 ΕΡ1669367Β1 <400> 21

His Vai Arg Leu His His Tyr Leu Arg His Arg Ser Leu Pro Asn 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 22 <211 > 15 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial <400> 22

Vai Pro Met Ala Leu Asn His GJy Vai Tyr Vai Met Vai Ser Ser 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 23 <211 > 18 <212> DNA <213> Sequência artificial <223> Oligonucleotídeo iniiador fdtet15-mer <400> 23 TGAATTTTCT GTATGAGG 18

<210> SEQ ID NO: 24 <211 > 14 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 24

Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 25 <211 > 13 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 25

Arg lie Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 26 <211 > 13 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 26

Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10 32 ΕΡ1669367Β1

<210> SEQ ID NO: 27 <211 > 11 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 27

Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 28 <211 > 9 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 28

Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr 1 5

<210> SEQ ID NO: 29 <211 > 12 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 29

Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 30 <211 > 11 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 30

Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 31 <211 > 10 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 31

Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 15 10 <210> SEQ ID NO: 32 <211 > 9 33

ΕΡ1669367Β1 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 32

Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5

<210> SEQ ID NO: 33 <211 > 14 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 33

Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 34 <211 > 12 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo SEQ ID NO: 17 <400> 34

Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 35 <211 > 10 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo peptide SEQ ID NO: 17 <400> 35

Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 36 <211 > 9 <212> PRT <213> Sequência de peptídeo artificial obtida portruncagem de peptídeo peptide SEQ ID NO: 17 <400> 36

Lys Arg Tle Trp Phe Ile Pro Arg Ser 1 5

Lisboa, 25 de Novembro de 2010 34

Claims

ΕΡ1669367Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Peptídeo caracterizado pela sua capacidade de se ligar a um factor de crescimento transformador βΐ (TGF-βΙ), em que a sequência de aminoácido de ácido do referido peptideo é SEQ ID NO: 17, ou um fragmento do referido peptideo com capacidade de se ligar a TGF-βΙ, compreendendo entre 9 e 14 aminoácidos consecutivos, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
2. Peptideo de acordo com a reivindicação 1, seleccionado do grupo de peptideos identificados como SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
3. Peptideo de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 2, em que o referido peptídeo tem a capacidade de inibir a actividade biológica de TGF-βΙ in vitro e/ou in vivo.
4. Peptídeo de acordo com a reivindicação 3, selecionado do grupo de peptideos identificados como SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34 e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
5. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de peptídeo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, com pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, que compreende pelo menos um peptídeo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, opcionalmente em conjunto com um ou mais compostos de inibição de TGF-βΙ alternativos. 1 ΕΡ1669367Β1
7. Uso de um peptídeo cuja sequência aminoácido é SEQ ID NO: 17, ou um fragmento do referido peptídeo com capacidade de se ligar a TGF-βΙ compreendendo entre 9 e 14 aminoácidos consecutivos, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de fibrose pulmonar, fibrose do fígado, cirrose, fibrose renal, fibrose corneana, fibrose associada à cirurgia da pele e pertioneal, fibrose associada queimaduras, fibrose osteoarticular ou quelóides.
8. Uso de acordo com a reivindicação 7, em que o referido peptídeo é seleccionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36, e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
9. Sequência de DNA que codifica um peptídeo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4.
10. Construção de DNA que compreende uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 9.
11. Construção de DNA de acordo com a reivindicação 10, que compreende ainda uma sequência operacionalmente ligada que regula a expressão da referida sequência de DNA.
12. Vector que compreende uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 9, ou uma construção de DNA de acordo com qualquer das reivindicações 10 ou 11.
13. Célula hospedeira que compreende uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 9, ou uma construção de DNA de acordo com 2 ΕΡ1669367Β1 qualquer das reivindicações 10 ou 11, ou um vector de acordo com a reivindicação 12.
14. Processo para produzir um peptideo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, que compreende o crescimento de célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13 sob condições que permitem a produção do referido peptideo e, se desejado, a recuperação do referido peptideo. Lisboa, 25 de Novembro de 2010 3