ES2304069A1 - Peptidos con capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento beta 1 (tgf-b1). - Google Patents
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Abstract
Péptidos con capacidad para unirse al factor transformante del crecimiento beta 1. Los péptidos tienen la capacidad de unirse al Factor Transformante de crecimiento beta 1 (TGF-b1) y son potenciales inhibidores de la actividad biológica del TGF-b1 mediante su unión directa a dicha citoquina. Estos péptidos pueden ser utilizados en el tratamiento de enfermedades o alteraciones patológicas basadas en una expresión excesiva o desregulada del TGF-b1.
Description
Péptidos con capacidad de unirse al factor
transformante de crecimiento \beta1
(TGF-\beta1).
La invención se refiere, en general, a péptidos
que tienen la capacidad de unirse al factor transformante de
crecimiento \beta1 (TGF-\beta1) y a sus
aplicaciones. En particular, la invención se refiere a péptidos
inhibidores de la actividad biológica del
TGF-\beta1 mediante su unión directa al
TGF-\beta1, y a su empleo en el tratamiento de
enfermedades o alteraciones patológicas basadas en una expresión
excesiva o desregulada del TGF-\beta1.
El TGF-\beta1 es una
glicoproteína perteneciente a una superfamilia de proteínas
reguladoras (citoquinas) estructuralmente relacionadas entre sí,
incluida dentro de una de las tres isoformas descritas en mamíferos
(TGF-beta 1, 2 y 3). La isoforma más abundante es
TGF-\beta1, que consiste en un homodímero de 25
kDa compuesto por 2 subunidades unidas por un puente disulfuro. La
secuencia de aminoácidos del TGF-\beta1 humano ha
sido descrita por, por ejemplo, Derynck K et al., "Human
transforming growth factor-beta complementary DNA
sequence and expression in normal and transformed cells". Nature
316 (6030), 701-705 (1985).
El TGF-\beta1 es una molécula
cuya secuencia está altamente conservada en términos evolutivos.
Aunque originalmente se definió por su capacidad para inducir
proliferación independiente de adhesión y cambios morfológicos en
fibroblastos de rata, investigaciones posteriores han revelado que
el TGF-\beta1 es un inhibidor general de la
proliferación en un gran número de tipos celulares. Es producido por
una gran variedad de tipos celulares y en diferentes tejidos
durante todas las fases de la diferenciación celular. Produce una
gran variedad de efectos biológicos, genera potentes y muy a menudo
opuestos efectos en el desarrollo, fisiología y respuesta inmune.
Información sobre el papel del TGF-\beta1 en la
diferenciación y regeneración hepática, y en la fibrosis hepática,
así como los efectos del TGF-\beta1 sobre la
matriz extracelular, puede encontrarse en la solicitud de patente
española ES 2146552 A1.
Teniendo como objetivo el estudio de los
mecanismos de acción del TGF-\beta1, se han
descrito una decena de proteínas (receptores de membrana y proteínas
de matriz extracelular) que interaccionan con esta citoquina.
Por otra parte, debido a que numerosas
enfermedades o alteraciones patológicas están asociadas con una
expresión en exceso o desregulada del TGF-\beta1,
por ejemplo, las fibrosis asociadas con la pérdida de función de un
órgano o tejido, o complicaciones quirúrgicas o estéticas, resulta
interesante buscar productos capaces de inhibir la actividad
biológica del TGF-\beta1, dado que tales productos
podrían ser potencialmente utilizados en terapia humana o animal
como bloqueantes de las consecuencias patológicas de una expresión
en exceso o desregulada del TGF-\beta1.
Las estrategias habitualmente utilizadas para
inhibir la actividad biológica del TGF-\beta1
incluyen, entre otras, el empleo de (i) anticuerpos específicos
neutralizantes, (ii) oligos antisentido del gen codificante del
TGF-\beta1 que bloquean su expresión, o (iii)
receptores solubles del TGF-\beta1 que actúan de
forma similar a los anticuerpos. El empleo de anticuerpos permite
un bloqueo total y específico de esta citoquina
(TGF-\beta1) aunque se potencian ciertos efectos
secundarios tanto por la presencia de inmunoglobulinas exógenas en
sangre como por los efectos derivados del bloqueo sistémico del
TGF-\beta1. Además, la estabilidad en el tiempo de
las inmunoglobulinas no permite un control a tiempos cortos del
bloqueo en la actividad de esta citoquina. Los oligo antisentido
inhiben la producción del TGF-\beta1 a nivel de
expresión génica, lo que puede generar desregulaciones importantes
en todos los procesos en lo que interviene esta citoquina.
Recientemente se ha desarrollado otra estrategia
basada en el empleo de péptidos inhibidores de la actividad
biológica del TGF-\beta1. En este sentido, la
solicitud de patente española ES 2146552 Al describe unos péptidos
sintéticos procedentes tanto del TGF-\beta1 como
de sus receptores, o de proteínas con capacidad de unión al
TGF-\beta1, que pueden ser utilizados como
inhibidores de la actividad biológica del
TGF-\beta1.
La Figura 1 muestra esquemáticamente la posición
de un péptido de 15 aminoácidos (aa), genéticamente fusionado a la
proteína pIII, en la superficie del bacteriófago filamentoso
M13.
La Figura 2 muestra esquemáticamente la posición
génica del inserto, que codifica para un péptido de 15 aa, en el
genoma del bacteriófago M13 y la posición del péptido en la
secuencia de la proteína pIII.
La Figura 3 muestra esquemáticamente la
selección de péptidos mediante la técnica de "Biopanning". El
TGF-\beta1 biotinilado se inmoviliza en placas que
contienen estreptavidina (a través de la unión
biotina-estreptavidina). La librería de fagos es
seleccionada sobre la base de la interacción entre el
TGF-\beta1 y los péptidos presentados por los
fagos. Los fagos con baja afinidad por el
TGF-\beta1 son eliminados mediante lavados. Los
fagos retenidos en la placa son eluidos mediante descenso de pH.
Tras tres ciclos de enriquecimiento de fagos con alta afinidad por
el TGF-\beta1, los fagos se aíslan y secuencian
(véase el Ejemplo 1) [Leyendas de la Figura 3: "a": Librería de
fagos presentando péptidos de 15 aa; "b": Infección en E.
coli (K91Kan)(amplificación); "c": Purificación de los
fagos; "d": Incubación de los fagos con concentraciones
decrecientes de TGF-\beta1; "e": Lavados;
"f": Elución de los fagos unidos (\downarrowpH); "g":
Infección en cepa de E. coli; "h": Selección de
colonias infectadas (tetraclina); "i": Amplificación de los
fagos seleccionados; y "j": Secuenciación del ADN
(correspondiente al péptido) al cabo de tres ciclos de
"biopanning"].
La Figura 4 es una representación de un árbol de
analogías de secuencia entre los péptidos de 15 aminoácidos
identificados mediante una librería de fagos.
La Figura 5 es un diagrama que muestra el efecto
de la concentración de TGF-\beta1 sobre el
crecimiento de la línea celular
Mv-1-Lu, expresada en forma de
captación de timidina tritiada en cuentas por minuto (c.p.m.).
La Figura 6 es un diagrama ilustrativo del
protocolo de inducción de daño hepático agudo (véase el Ejemplo
3).
La invención se enfrenta, en general, con el
problema de buscar nuevos compuestos capaces de inhibir la
actividad biológica del TGF-\beta1.
La solución proporcionada por la presente
invención se basa en que los inventores han identificado unos
péptidos capaces no solo de unirse al TGF-\beta1
sino, además, capaces de inhibir la actividad biológica del
TGF-\beta1 mediante su unión directa al propio
TGF-\beta1. Estos péptidos han sido identificados
mediante el empleo de la tecnología asociada con las librerías de
fagos que permite determinar péptidos, con un tamaño típicamente
comprendido entre 6 y 15 aminoácidos, que presentan una unión de
alta afinidad con el TGF-\beta1, cuantificando,
posteriormente, mediante ensayos in vitro e in vivo,
la capacidad de inhibición de la actividad biológica del
TGF-\beta1 de los distintos péptidos.
Los péptidos capaces de unirse al
TGF-\beta1, en particular, aquéllos capaces de
inhibir la actividad biológica del TGF-\beta1
mediante su unión directa al TGF-\beta1 son
potencialmente útiles para el tratamiento de enfermedades y
alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o
desregulada del TGF-\beta1. Asimismo, los
péptidos capaces de unirse al TGF-\beta1
proporcionan una herramienta para el estudio del papel biológico
del TGF-\beta1 (aún por dilucidar en muchos campos
de la regulación de distintos procesos biológicos).
Por tanto, un aspecto de esta invención se
relaciona con unos péptidos que poseen la capacidad de unirse al
TGF-\beta1. En una realización particular y
preferida, dichos péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir
la actividad biológica del TGF-\beta1.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende, al menos, uno de dichos
péptidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de dichos péptidos en la elaboración de un medicamento
para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas
asociadas con una expresión en exceso o desregulada del
TGF-\beta1. Ejemplos ilustrativos de dichas
enfermedades o alteraciones patológicas asociadas con una expresión
en exceso o desregulada del TGF-\beta1 incluyen la
fibrosis asociada con la pérdida de función de un órgano o un
tejido así como complicaciones quirúrgicas y/o estéticas.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
secuencias de ADN que codifican para dichos péptidos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una construcción de A DN que comprende una secuencia de ADN que
codifica para un péptido proporcionado por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un vector que comprende dicha secuencia de ADN o dicha construcción
de ADN.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora
transformada, que comprende dicha construcción de ADN o dicho
vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para producir un péptido proporcionado por esta
invención que comprende cultivar dichas células hospedadoras bajo
condiciones que permiten la expresión de dicho péptido y, si se
desea, recuperar el péptido obtenido.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la
elaboración de vectores y células para el tratamiento de
enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión
en exceso o desregulada del TGF-\beta1 mediante
terapia génica.
En un aspecto, la invención se relaciona con un
péptido, en adelante, péptido de la invención, cuya secuencia de
aminoácidos comprende entre 3 y 15 restos de aminoácidos
consecutivos de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID
NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14,
SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, y sus sales
farmacéuticamente aceptables.
Los péptidos de la invención tienen la capacidad
de unirse al TGF-\beta1. Algunos de dichos
péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir, in vitro
y/o in vivo, la actividad biológica del
TGF-\beta1.
La capacidad de los péptidos de la invención de
unirse al TGF-\beta1 se puede determinar mediante
cualquier método apropiado que permita determinar la unión entre
dos moléculas, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, que
comprende poner en contacto el TGF-\beta1 con el
péptido a ensayar bajo condiciones que permiten la unión de dicho
péptido al TGF-\beta1 y evaluar la unión entre el
péptido y el TGF-\beta1. En una realización
particular, dicho ensayo de afinidad puede realizarse utilizando
TGF-\beta1 marcado radiactivamente, por ejemplo,
^{125}I-TGF-\beta1 humano, tal
como se describe en ES 2146552 A1. Alternativamente, el compuesto
que puede estar marcado es el péptido a ensayar. En general, este
tipo de ensayos de afinidad comprende poner en contacto
TGF-\beta1, por ejemplo, inmovilizado en una placa
bloqueada con estreptavidina, con el péptido cuya capacidad de
unión al TGF-\beta1 se desea conocer, y, tras
incubar durante un periodo de tiempo apropiado, analizar la unión
del péptido al TGF-\beta1. Los péptidos con baja
afinidad por el TGF-\beta1 son eliminados mediante
lavados mientras que los péptidos con mayor afinidad permanecen
unidos al TGF-\beta1 y pueden ser liberados
rompiendo las interacciones moleculares entre ambas moléculas, lo
que puede realizarse, por ejemplo, bajando el pH. Ensayando el
péptido frente a distintas concentraciones de
TGF-\beta1, o viceversa, se puede obtener una idea
de la afinidad del péptido en cuestión frente al
TGF-\beta1. La capacidad de los péptidos de la
invención de inhibir la actividad biológica del
TGF-\beta1 in vitro se puede evaluar y, si
se desea, cuantificar, mediante un ensayo de inhibición del
crecimiento de la línea celular
Mv-1-Lu, una línea celular derivada
de epitelio pulmonar de visón cuya proliferación es inhibida por el
TGF-\beta1 (véase el Ejemplo 2).
La capacidad de los péptidos de la invención de
inhibir la actividad biológica del TGF-\beta1
in vivo se puede evaluar y, si se desea, cuantificar mediante
un ensayo en un modelo animal de daño hepático agudo inducido, por
ejemplo, por administración de tetracloruro de carbono (CCl_{4})
(véase el Ejemplo 3). Como es conocido, el daño hepático agudo
genera una cascada de efectos y respuestas fisiológicas que incluye
la elevación de los niveles del TGF-\beta1,
responsable, entre otros efectos, de la expresión del gen de
colágeno de tipo I, entre otros.
Dentro del alcance de esta invención se
encuentran las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la
invención. El término "sales farmacéuticamente aceptables"
incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales
metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza de la sal no
es critica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las
sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención
pueden obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o
inorgánicos. Dichas sales pueden obtenerse por métodos
convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia.
En una realización particular, la invención
proporciona un péptido que comprende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 14 ó 15 restos de aminoácidos consecutivos de una secuencia
de aminoácidos seleccionada entre la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:
7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID
NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16,
SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID
NO: 21 y SEQ ID NO: 22, y sus sales farmacéuticamente
aceptables.
En una realización concreta, la invención
proporciona un péptido seleccionado del grupo formado por los
péptidos identificados por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ
ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:
12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ
ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:
21 y SEQ ID NO: 22, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
En otra realización concreta, la invención
proporciona un péptido seleccionado del grupo formado por los
péptidos identificados por la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17,
SEQ ID NO: 18, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los
péptidos identificados por la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 17, presentan actividad
inhibidora de la actividad biológica de
TGF-\beta1, tanto in vitro como in
vivo; el péptido identificado por la SEQ ID NO: 2 presenta
únicamente actividad inhibidora de la actividad biológica de
TGF-\beta1 in vivo; y los péptidos
identificados por la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 18, presentan
únicamente actividad inhibidora de la actividad biológica de
TGF-\beta1
in vitro.
in vitro.
Para la identificación inicial de péptidos con
capacidad de unirse al TGF-\beta1 se ha utilizado
1 a tecnología asociada con las librerías de fagos que permite
determinar péptidos que presentan una unión de alta afinidad con el
TGF-\beta1, y cuantificar, posteriormente,
mediante ensayos in vitro e in vivo, la capacidad de
inhibición de la actividad biológica del
TGF-\beta1 de los distintos péptidos. La secuencia
de los péptidos que se unen al TGF-\beta1,
inhibiendo in vitro o in vivo la actividad biológica
del TGF-\beta1, se puede deducir a partir de la
secuencia del ADN correspondiente al cabo de varios ciclos de
"biopanning", generalmente 3. El empleo de librerías de fagos
para identificar inhibidores de ciertos productos ha sido descrita,
por ejemplo, por Chirinos-Rojas C.L. et al.,
en Immunology, 1999, Jan. 96(1):109-113;
McConnell S.J., et al., en Gene 1994, Dec. 30,
151(1-2):115-118; o Smith
G.P., Science, 1985, Jun. 14,
228(4705):1315-1317.
Por tanto, la invención proporciona un método
para la identificación de péptidos que tienen la capacidad de
unirse al TGF-\beta1 que comprende:
- (i)
- utilizar una librería de fagos que comprende una pluralidad de fagos filamentosos, conteniendo el genoma de cada uno de dichos fagos una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido diferente ligada al gen de una proteína de la cubierta del fago, con lo que cada fago contiene un péptido diferente genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago;
- (ii)
- seleccionar, mediante un ensayo de afinidad, los fagos que contienen los péptidos que se unen con mayor afinidad al TGF-\beta1; y
- (iii)
- determinar la secuencia de los péptidos que se unen al TGF-\beta1, a partir de las secuencias de ADN correspondientes insertadas e n los fagos seleccionados en la etapa (ii) y que codifican para dichos péptidos que se unen al TGF-\beta1.
En una realización particular, con el fin de
obtener péptidos de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta
afinidad al TGF-\beta1 y con posible actividad
inhibitoria de la actividad biológica de dicha citoquina, se
utilizó una librería de fagos compuesta por una pluralidad de
bacteriófagos filamentosos (M13) conteniendo cada uno de ellos un
péptido diferente, de 15 aminoácidos, genéticamente fusionado a una
proteína de la cubierta del fago, en este caso unido al extremo
N-terminal de la proteína de cubierta pIII. De esta
forma, el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15
aminoácidos, en cada una de las cinco moléculas de la proteína de
superficie, mientras en su interior contiene el ADN que codifica
para dicha secuencia peptídica. En las librerías de fagos la
secuencia codificante para el péptido proviene de una secuencia
degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos
naturales, lo que permite la presentación de 1,1x10^{12}
secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La
relación física, 1 a 1, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo
codifica en el bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran
número de variantes, aquellas secuencias que se unen
específicamente al TGF-\beta1. Este proceso se
realiza mediante un ensayo de afinidad.
En una realización particular, dicho ensayo de
afinidad consiste en un protocolo de selección in vitro
denominado "biopanning". Brevemente, dicha técnica consiste en
la incubación de un conjunto de fagos representantes, a efectos
prácticos, de todas las variantes de péptidos de 15 aminoácidos (en
este caso), en una placa bloqueada con estreptavidina a la que se
le añade TGF-\beta1 biotinilado. El
TGF-\beta1 biotinilado queda anclado a la placa a
través de la interacción biotina-estreptavidina, con
lo que queda correctamente presentado para su interacción con los
péptidos portados por los fagos. Tras una incubación se eliminan
los fagos no unidos mediante lavados y posteriormente se eluyen los
fagos unidos específicamente, mediante un descenso de pH que rompe
las interacciones moleculares entre el TGF-\beta1
y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son,
entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana. El
proceso se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido
de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad al
TGF-\beta1 se va enriqueciendo. La concentración
de TGF-\beta1 biotinilado utilizado para bloquear
las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda, por
ejemplo, de 2,5 a 0,01 y finalmente 0,001 \mug/ml. De este modo,
los fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor
grado de afinidad por el TGF-\beta1. Al final del
proceso los fagos que han sido seleccionados por su afinidad con el
TGF-\beta1 son secuenciados con cebadores. Esto
permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los
fagos.
El Ejemplo 1 ilustra la selección de péptidos
que se unen al TGF-\beta1 mediante librería de
fagos, selección por "biopanning" y secuenciación de los
péptidos con unión de alta afinidad al
TGF-\beta1.
Debido al papel que desempeña el
TGF-\beta1 en numerosos procesos biológicos, una
consecuencia de la actividad inhibidora del
TGF-\beta1 de los péptidos de la invención tiene
que ver con el desarrollo potencial de una nueva familia de fármacos
útiles para el tratamiento de enfermedades y alteraciones
patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del
TGF-\beta1, ya que tales péptidos permiten
bloquear el exceso o desregulación de dicha citoquina que origina
daño.
Los péptidos de la invención, por tanto, pueden
utilizarse en el tratamiento de enfermedades o alteraciones
patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del
TGF-\beta1, tales como (i) la fibrosis asociada
con la pérdida de función de un órgano o un tejido, por ejemplo,
fibrosis pulmonar, fibrosis hepática (cirrosis), fibrosis renal,
fibrosis corneal, etc., así como (ii) las complicaciones quirúrgicas
y/o estéticas, por ejemplo, fibrosis asociada con la cirugía
cutánea y peritoneal, fibrosis asociada con quemaduras, fibrosis
osteo-articular, queloides, etc.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con una composición farmacéutica que comprende una
cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de la invención
junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable. La
composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede
contener uno o más péptidos de la invención, junto con,
opcionalmente, uno o más, compuestos inhibidores del
TGF-\beta1 alternativos. Dicha composición
farmacéutica es útil para su administración y/o aplicación en el
cuerpo humano o animal, preferentemente en el cuerpo humano.
El empleo de péptidos, tales como los péptidos
de la invención, en lugar de utilizar anticuerpos u oligos
antisentido, presenta numerosas ventajas, ya que son moléculas
pequeñas, con mayor capacidad de difusión y de vida media más corta.
Los péptidos pueden llegar a tener una elevada afinidad por el
TGF-\beta1, pero se degradan más rápidamente que
los anticuerpos pudiéndose controlar mediante dosificación los
efectos secundarios adversos. También es más accesible la
vehiculización de los péptidos a órganos o tejidos diana en
comparación con otro tipo de compuestos.
Los péptidos de la invención pueden
administrarse para tratar las enfermedades y las alteraciones
patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del
TGF-\beta1 por cualquier medio que produzca el
contacto del péptido de la invención con el sitio de acción del
mismo en el cuerpo humano o animal. La cantidad de péptido,
derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que puede estar
presente en la composición farmacéutica proporcionada por esta
invención puede variar dentro de un amplio intervalo.
La dosificación para tratar una enfermedad o
alteración patológica asociada con una expresión en exceso o
desregulada del TGF-\beta1 con los péptidos y/o
composiciones farmacéuticas de la invención dependerá de numerosos
factores, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de
la enfermedad o alteración patológica, la ruta y frecuencia de
administración y del péptido de la invención a administrar.
Las composiciones farmacéuticas que contienen
los péptidos de la invención pueden presentarse en cualquier forma
de administración, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden
administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía
oral, parenteral, rectal o tópica, para lo cual incluirán los
excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la
formulación de la forma de administración deseada, por ejemplo,
pomadas (lipogeles, hidrogeles, etc.), colirios, aerosoles por
nebulización, soluciones inyectables, bombas osmóticas, etc. Una
revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de
medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de
las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de
Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A.
Ediciones, Madrid.
El empleo de los péptidos de la invención en la
elaboración de dicha composición farmacéutica constituye un aspecto
adicional de esta invención. Por tanto, en otro aspecto, la
invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención
en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de
enfermedades o alteraciones patológicas asociadas con una expresión
en exceso o desregulada de TGF-\beta1, tales como
la fibrosis asociada con la pérdida de función de un órgano o un
tejido, por ejemplo, fibrosis pulmonar, fibrosis hepática
(cirrosis), fibrosis renal, fibrosis corneal, etc.; o las
complicaciones quirúrgicas y/o estéticas, por ejemplo, fibrosis
asociada con la cirugía cutánea y peritoneal, fibrosis asociada con
quemaduras, fibrosis osteo-articular, queloides,
etc.
Los péptidos de la invención pueden obtenerse
por métodos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de
síntesis química sobre fase sólida; purificarse mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); y, si se desea, se
pueden analizar mediante técnicas convencionales, por ejemplo,
mediante secuenciación y espectrometría de masas, análisis de
aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc.
Alternativamente, los péptidos de la invención
pueden obtenerse mediante la tecnología del ADN recombinante. Por
tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una secuencia de
ADN que codifica para un péptido de la invención. Dicha secuencia de
ADN puede ser deducida fácilmente a partir de la secuencia del
péptido.
Dicha secuencia de ADN puede estar contenida en
una construcción de ADN. Por tanto, la invención proporciona una
construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica
para un péptido de la invención. Dicha construcción de ADN puede
incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la
expresión de la secuencia de ADN que codifica para el péptido de la
invención. Las secuencias de control son secuencias que controlan y
regulan la transcripción y, en su caso, la traducción del péptido
de la invención, e incluyen secuencias promotoras, terminadoras,
etc., funcionales en células hospedadoras transformadas que
comprenden dicha secuencia o construcción de ADN. En una
realización particular, dicha secuencia de control de expresión es
funcional en bacterias. Ventajosamente, dicha construcción de ADN
comprende, además, un marcador o gen que codifica para un motivo o
para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora
transformada con dicha construcción de ADN. La construcción de ADN
proporcionada por esta invención puede obtenerse mediante el empleo
de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica
[Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory
Manual", 2^{nd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
N.Y., 1989 Vol 1-3].
La secuencia de ADN o la construcción de ADN
proporcionadas por esta invención, pueden ser insertadas en un
vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que
comprende dicha secuencia o construcción de ADN. La elección del
vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a
introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se
introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector
que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no
en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede
realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en
la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra].
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora
transformada, que comprende una secuencia de ADN o una construcción
de ADN proporcionadas por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para producir un péptido de la invención que
comprende crecer una célula hospedadora que comprende la secuencia
o construcción de ADN proporcionada por esta invención bajo
condiciones que permiten la producción de dicho péptido de la
invención y, si se desea, recuperar dicho péptido de la invención.
Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula
hospedadora dependerán de la célula hospedadora utilizada. Si se
desea, el procedimiento para producir el péptido de la invención
incluye, además, el aislamiento y purificación de dicho
péptido.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
el empleo de dichas secuencias de ADN y construcciones de ADN en la
elaboración de vectores y células para el tratamiento de
enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión
en exceso o desregulada del TGF-\beta1 mediante
terapia génica. De acuerdo con este aspecto de la invención, dichas
secuencia o construcción de ADN se ponen en contacto con un vector
de transferencia génica, tal como un vector viral o no viral.
Vectores virales apropiados para poner en práctica esta realización
de la invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes,
vectores adenovirales, vectores adenoasociados, vectores
retrovirales, vectores lentivirales, vectores alfavirales, vectores
herpesvirales, vectores derivados de coronavirus, etc. Vectores de
tipo no viral apropiados para poner en práctica esta realización de
la invención incluyen, pero no están limitados a los siguientes:
ADN desnudo, liposomas, poliaminas, dendrímeros, glicopolímeros
catiónicos, complejos liposoma-policatión,
proteínas, sistemas de transferencia génica mediados por receptor,
etc.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
Para la obtención de secuencias de 15
aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad al
TGF-\beta1 y con posible actividad inhibitoria de
la actividad biológica de esta citoquina, se utilizó una técnica de
selección in vitro basada en la tecnología desarrollada a
partir de las librerías de fagos. Estas librerías constan de
bacteriófagos filamentosos (M13) que contienen un péptido
genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del virus, en
este caso unido al extremo N-terminal de la proteína
de cubierta pIII (Figura 1). De esta forma el fago presenta sobre
su superficie un péptido de 15 aminoácidos, en cada una de las 5
moléculas de esta proteína que presenta el fago en su superficie,
mientras en su interior contiene el ADN que codifica para dicha
secuencia peptídica. En las librerías de fagos la secuencia
codificante para el péptido proviene de una secuencia degenerada en
cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales.
Esto permite la presentación de 1,1x10^{12} secuencias posibles de
15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física, 1 a 1,
entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el
bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran número de
variantes, aquellas secuencias que se unen específicamente al
TGF-\beta1. Este proceso se realiza mediante un
protocolo de selección in vitro denominado
"biopanning".
La librería de fagos utilizada para la
realización de este ejemplo procede de una segunda amplificación de
la librería primaria descrita por T. Nishi, H. Tsuri y H. Saya
[Exp. Med. (Japan) 11, 1759 (1993)], cedida por el laboratorio de
George P. Smith. Información adicional sobre esta tecnología puede
encontrarse en la siguiente página web:
http://www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebsiteln
dex.html.
Esta técnica consiste en la incubación de un
conjunto de fagos, representantes (a efectos prácticos) de todas
las variantes de 15 aminoácidos, en una placa bloqueada con
estreptavidina (10 \mug/ml en NaHCO_{3} 0,1 M, 2 h a temperatura
ambiente) a la que se le añade TGF-\beta1
biotinilado. El TGF-\beta1 biotinilado queda
anclado a la placa a través de la interacción
biotina-estreptavidina, con lo que queda
correctamente presentado para su interacción con los péptidos
portados por los fagos. El TGF-\beta1 se pone en
contacto con los péptidos portado por los fagos a una concentración
de 3x10^{4} virus/ml y se deja incubar durante 12 horas
aproximadamente. Tras la incubación, se eliminan los fagos no
unidos mediante 5 lavados con PBS/Tween (tampón fosfato
salino/polioxialquilen derivados de ésteres de ácidos grasos de
sorbitano) y posteriormente se eluyen los fagos unidos
específicamente, mediante un descenso de pH (buffer de elución) que
rompe las interacciones moleculares entre el
TGF-\beta1 y los péptidos presentados por los
fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante
infección en una cepa bacteriana (E. coli). El proceso se
repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos que
se unen específicamente y con alta afinidad al
TGF-\beta1 se va enriqueciendo (Figura 3). La
concentración de TGF-\beta1 biotinilado utilizado
para bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada
ronda de 2,5 a 0,01 y finalmente 0,001 \mug/ml. De este modo, los
fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor grado de
afinidad por el TGF-\beta1. Al final del proceso
los fagos que han sido seleccionados por su afinidad con el
TGF-\beta1, son secuenciados con cebadores, tras
ser aislados mediante resistencia a tetraciclina que confieren los
fagos modificados genéticamente tras infectar células de E.
coli. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos
presentados en los fagos de un número de clones obtenido de
colonias aisladas. El número de veces que se repite una secuencia,
correspondiente a un péptido de 15 aminoácidos portado por cada
clon, del total de clones secuenciados da una idea del grado de
afinidad relativa que tiene dicha secuencia de 15 aminoácidos por
el TGF-\beta1.
Para la obtención de clones de los fagos,
obtenidos a partir del "biopanning", se realiza una selección
en presencia de un antibiótico de colonias bacterianas infectadas
por estos fagos, cuya resistencia viene dada por un gen de
resistencia a tetraciclina presente en el genoma de los fagos. Con
este método únicamente crecen colonias infectadas por
bacteriófagos. Así cada colonia contiene el genoma de un único fago
al que le corresponde la secuencia de un solo péptido presentado en
su superficie.
De las 108 colonias de bacterias infectadas por
fagos, derivados de la última ronda de selección por
"biopanning", se secuenció la porción del genoma que engloba la
región correspondiente a los péptidos presentados en la proteína
pIII utilizando el cebador identificado mediante la SEQ ID NO: 23.
De este modo se obtuvieron las secuencias que se muestran en la
Tabla 1 donde se indican además el número de colonias (clones) que
portaban dichas secuencias.
El número de clones (colonias) de cada secuencia
da una idea relativa del grado de afinidad entre los péptidos y el
TGF-\beta1, o sea, a mayor número de clones mayor
afinidad de unión. Sin embargo, el grado de afinidad no se
corresponde con la capacidad de bloquear la actividad del
TGF-\beta1 puesto que el péptido más activo, el
péptido identificado con la SEQ ID NO: 17 (véanse las Tablas 2 y 3)
da 3 clones, mientras que el péptido identificado con la SEQ ID NO:
3, que da 41 clones, es mucho menos activo en el ensayo de daño
hepático agudo (Tabla 3). Aunque no se desea estar vinculado a
ninguna teoría, esta cuestión podría ser explicada sobre la base de
que el péptido más activo bloquearía probablemente la unión del
TGF-\beta1 a su receptor.
Las secuencias obtenidas fueron analizadas con
el programa CLUSTAL W (1.81). Este programa genera un agrupamiento
múltiple de secuencias en función de sus analogías de secuencia
aminoacídica. Los péptidos quedan así agrupados por familias
estructurales (Figura 4). En base a las analogías que presentan
estos péptidos se pueden sugerir motivos menores de unión al
TGF-\beta1 o grupos de péptidos que se unen a
diferentes regiones del TGF-\beta1.
La línea celular
Mv-1-Lu (CCL-64,
American Type Cell Culture, Virginia, Estados Unidos) deriva de
epitelio pulmonar de visón, crece en monocapa y responde al
TGF-\beta1 exógeno con una disminución de su
proliferación (Figura 5). La inhibición mediante péptidos de esta
citoquina es capaz de restablecer su crecimiento y refleja la
capacidad de los distintos péptidos como inhibidores de la actividad
biológica in vitro del TGF-\beta1. Los
péptidos ensayados fueron obtenidos mediante síntesis peptídica
siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem
Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al. J
Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546).
Las células
Mv-1-Lu se cultivan hasta la
subconfluencia en medio completo [RPMI-1640
suplementado con L-glutamina, piruvato sódico,
antibióticos y 10% de suero de ternera fetal (FBS)] a 37°C y 5% de
CO_{2} en botellas de 162 cm^{2} (Costar Corporation, CA, USA).
Las células, tras tripsinizado, se cultivan en 200 \mul de medio
completo en placas de 96 pocillos a una densidad inicial de 5.000
células/pocillo, a 37°C y 5% CO_{2}, durante 6 horas para
permitir su adhesión. Posteriormente se añaden los tratamientos de
los diferentes péptidos a distintas concentraciones, comenzando con
200 \mug/ml y se añade TGF-\beta1 (Human
Transforming Growth Factor-\beta1, Roche) a una
concentración de 200 pg/ml. Tras 12 horas de incubación se añade 1
\muCi de metil-^{3}H-timidina
(Amersham Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) por pocillo en
25 \mul de medio limpio (RPMI-1640) y se incuba
la placa 12 horas más en las mismas condiciones. Finalmente, se
cosechan las células (Filtermate 196 Harvester, Packard)
transfiriéndose la timidina tritiada, incorporada en la síntesis de
ADN, a placas (UniFilter-96 GF/C®, Perkin
Elmer)y la radiactividad se cuantifica, tras adición de
líquido de centelleo, en un contador de centelleo (Top Count,
Microplate Scintillation Counter, Packard). Como control positivo y
negativo se utilizó la incorporación de timidina tritiada en
ausencia y presencia de TGF-\beta1,
respectivamente. La inhibición de la actividad del
TGF-\beta1 en este ensayo se calculó mediante la
siguiente fórmula:
El control negativo representa la incorporación
de timidina tritiada en presencia de TGF-\beta1,
pero en ausencia de péptido, mientras que el control positivo se
refiere al mismo parámetro en ausencia de
TGF-\beta1 y péptido. Así se puede medir el
porcentaje de inhibición de los péptidos sobre la actividad
biológica del TGF-\beta1, por su capacidad de
revertir el efecto represor de esta citoquina sobre la proliferación
de la línea celular Mv-1-Lu (Tabla
2).
Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 3,
11, 17 y 18 inhiben la actividad biológica in vitro del
TGF-\beta1 con un porcentaje de inhibición
superior al 20%.
Adicionalmente, se ha comparado la actividad del
péptido identificado como P144 en la solicitud de patente española
ES 2146552 A1 con la actividad del péptido identificado mediante la
SEQ ID NO: 17 en cuanto a su capacidad para revertir el efecto
represor del TGF-\beta1 sobre la proliferación de
la línea celular Mv-1-Lu previamente
descrito, observándose una mejor actividad del péptido identificado
como SEQ ID NO: 17.
\vskip1.000000\baselineskip
El daño hepático agudo genera una cascada de
efectos y respuestas fisiológicas que incluye la elevación de los
niveles de TGF-\beta1. Esta elevación es la
responsable de inducir la expresión, entre otros, del gen de
colágeno de tipo I. En este modelo de daño hepático agudo en
ratones hembras Balb/C de 25 a 30 g de peso, se administran por vía
oral 2 \mul de CCl_{4} por gramo de ratón en relación
volumétrica de 1:1 con aceite de maíz. El grupo control recibe un
volumen equivalente de aceite de maíz, y los grupos tratados
reciben, tras la dosis inicial de CCl_{4}, 50 \mug de péptido en
500 \mul de suero fisiológico al 1% en DMSO (dimetilsulfóxido)
cada 24 h. Tras 72 horas todos los animales son sacrificados y se
realiza el procesamiento de las muestras hepáticas; para evaluar la
expresión de ARNm se congeló tejido hepático en nitrógeno líquido
almacenándose seguidamente a -80°C hasta su utilización. Otras
muestras de tejido hepático fueron conservadas en OCT® o
Tissue-Tek® (Sakura Finetek B.V.) procesándose de la
misma manera que las muestras destinadas a extracción de ARNm, y
también se conservaron muestras en formol tamponado al 10%, para su
posterior inclusión en parafina y evaluación histológica.
Posteriormente se cuantifica el nivel de ARNm de colágeno tipo I de
todos los grupos mediante PCR cuantitativa. En la Figura 6 se
muestra un diagrama de flujo correspondiente a la inducción, toma
de muestras y cuantificación de los resultados en el ensayo de daño
hepático agudo. La capacidad de los péptidos estudiados de bloquear
el daño agudo, medido según los niveles de ARNm de colágeno de tipo
I inducido se determinó cuantificando este ARN por PCR en tiempo
real. En la Tabla 3 se muestra el grado de inhibición de la
expresión de colágeno correspondiente a cada uno de los péptidos.
Los péptidos ensayados fueron obtenidos mediante síntesis peptídica
siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem
Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al. J
Chem Soc Perkin Trans 1981;
1:538-546).
1:538-546).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 2, 4,
6, 11, 14 y 17 inhiben la actividad biológica in vivo del
TGF-\beta1 con un porcentaje de inhibición
superior al 35%.
Adicionalmente, se ha comparado la actividad del
péptido identificado como P144 en la solicitud de patente española
ES 2146552 A1 con la del péptido identificado mediante SEQ ID NO: 17
en cuanto a su capacidad para inhibir la expresión del ARNm del
colágeno de tipo I en el ensayo de daño agudo hepático en ratones
previamente definido. En este ensayo comparativo, se observa que el
péptido identificado como SEQ ID NO: 17 inhibe la expresión del ARNm
del colágeno de tipo I mucho más que el péptido identificado como
P144 en la solicitud de patente española ES 2146552 A1 que no tiene
actividad. Los resultados obtenidos con los ensayos comparativos
(Ejemplos 2 y 3) ponen de manifiesto que un péptido ilustrativo de
los péptidos de esta invención (el péptido identificado mediante la
SEQ ID NO: 17) es más activo que un péptido ilustrativo de la
solicitud de patente española ES 2146552 A1 (el péptido identificado
como P144) en los ensayos de proliferación con células
Mv-1-Lu y en un modelo de daño
hepático agudo.
<110> Fundación para la Investigación
Médica Aplicada (FIMA)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptidos con capacidad para unirse
al factor transformante del crecimiento \beta1
(TGF-\beta1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Leu Arg Ser
Ala Pro Gly Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Asn Arg Ser
Ala Pro Gly Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Phe Phe Thr Arg Phe Pro Trp His Tyr His
Ala Ser Arg Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu Ala His Ser His Arg His Arg Ser His
Val Ala Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Trp Val Arg Tyr Pro Val His Leu His
Ser Pro Ile Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Pro Tyr His Arg Phe Trp Arg Gly His Arg
His Ala Val Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Arg Ile Ser His Phe Ala His Arg Tyr Leu
Ala Arg Leu His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp His Trp Arg His Arg Ile Pro Leu Gln Leu
Ala Ala Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Trp His Ser Leu Leu His Ser Arg Tyr His
Arg Ile Ala Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Val Trp Val Arg Phe His Arg Leu Pro Arg
Gln Ile Tyr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser
Val Arg Thr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser
Val Gly Leu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Lys Trp Phe Leu Gln His Arg Arg Met Pro
Val Ser Val Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Arg Arg His Leu His Arg His His Ile
Phe Ser Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Trp Ile Thr Phe His Arg Arg His His Asp
Arg Val Leu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Leu His Gly His Arg Ser His Arg Phe Thr
His Val Ala Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp
Tyr Glu Arg Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Pro Leu Ser Arg Tyr Trp Trp Leu Phe Ser
His Arg Pro Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His Leu Ser His Phe Lys Trp Leu Arg Ser
His Gly Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Phe His Phe His Ser Arg Met Val Ala
Val Asp Asn Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His Val Arg Leu His His Tyr Leu Arg His Arg
Ser Leu Pro Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Met Ala Leu Asn His Gly Val Tyr Val
Met Val Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> SEQ ID NO: 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador
fdtet15-mer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAATTTTCT GTATGAGG
\hfill18
Claims (17)
1. Un péptido caracterizado porque posee
la capacidad de unirse al factor transformante del crecimiento
\beta1 (TGF-\beta1) que posee una secuencia de
aminoácidos seleccionada entre: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ
ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:
12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ
ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:
21, SEQ ID NO: 22, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
2. Péptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque posee, además, la capacidad de inhibir,
in vitro y/o in vivo, la actividad biológica del
TGF-\beta1.
3. Péptido según la reivindicación 2,
caracterizado porque está seleccionado del grupo formado por
los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ
ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17,
SEQ ID NO: 18, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
4. Una composición farmacéutica
caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de un péptido descrito en cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3 junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
5. Composición farmacéutica según la
reivindicación 4, caracterizada porque comprende, al menos
un péptido descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Composición farmacéutica según una de las
reivindicaciones 4 o 5, caracterizada porque además
comprende uno o más, compuestos inhibidores del
TGF-\beta1 diferentes.
7. Uso de un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en la elaboración de un medicamento para el
tratamiento de enfermedades o alteraciones patológicas asociadas
con una expresión en exceso o desregulada de
TGF-\beta1.
8. Uso según la reivindicación 7,
caracterizado porque dichas enfermedades o alteraciones
patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada de
TGF-\beta1 comprenden la fibrosis asociada con la
pérdida de función de un órgano o un tejido, y las complicaciones
quirúrgicas y/o estéticas.
9. Uso según la reivindicación 8,
caracterizado porque dichas enfermedades o alteraciones
patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada de
TGF-\beta1 comprenden fibrosis pulmonar, fibrosis
hepática (cirrosis), fibrosis renal, fibrosis corneal, fibrosis
asociada con la cirugía cutánea y peritoneal, fibrosis asociada con
quemaduras, fibrosis osteo-articular o
queloides.
10. Una secuencia de ADN caracterizada
porque codifica para un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
11. Una construcción de ADN caracterizada
porque comprende una secuencia de ADN descrita en la reivindicación
10.
12. Construcción de ADN según la reivindicación
11 caracterizada porque comprende, además, operativamente
unida, una secuencia reguladora de la expresión de dicha secuencia
de ADN.
13. Un vector caracterizado porque
comprende una secuencia de ADN descrito en la reivindicación 10, o
una construcción de ADN descrita en cualquiera de las
reivindicaciones 11 o 12.
14. Una célula hospedadora caracterizada
porque comprende una secuencia de ADN definida en la reivindicación
10, o una construcción de ADN definida en cualquiera de las
reivindicaciones 11 o 12, o un vector definido en la reivindicación
13.
15. Un procedimiento para producir un péptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque comprende crecer una célula hospedadora
descrita en la reivindicación 14 bajo condiciones que permiten la
producción de dicho péptido.
16. Un procedimiento según la reivindicación 15,
caracterizado porque comprende recuperar dicho péptido.
17. Uso de una secuencia de ADN definida en la
reivindicación 10, o de una construcción de ADN definida en
cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, en la elaboración de
vectores y células para el tratamiento de enfermedades y
alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o
desregulada del TGF-\beta1 mediante terapia
génica.
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