ES2351865T3

ES2351865T3 - Péptidos que pueden unirse al factor transformante de crecimiento b1 (tgf-b1).

Info

Publication number: ES2351865T3
Application number: ES04742049T
Authority: ES
Inventors: Jesus Prieto Valtuena; Ana Belen Lopez Vazquez; Juan Jose Lasarte Sagastibelza; Javier Dotor De Las Herrerias; Francisco Borras Cuesta
Original assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Current assignee: Proyecto de Biomedicina CIMA SL
Priority date: 2003-08-22
Filing date: 2004-07-05
Publication date: 2011-02-11
Anticipated expiration: 2024-07-05
Also published as: US7666841B2; CN100424093C; PT1669367E; EP1669367B1; BRPI0413215A; JP4902352B2; HRP20100637T1; RU2333917C2; CA2535807A1; RU2455358C2; SI1669367T1; AU2010212466B2; CN1839149A; CY1110885T1; ATE479702T1; WO2005019244A1; AU2010212466A1; ES2304069A1; ES2304069B1; RU2006109011A

Abstract

Los péptidos tienen la capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento TGF-ß1 (TGF-ß1) y son potenciales inhibidores de la actividad biológica del TGF-ß1 mediante su unión directa a dicha citoquina. Estos péptidos pueden ser utilizados en el tratamiento de enfermedades o alteraciones patológicas basadas en una expresión excesiva o desregulada del TGF-ß1.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere, en general, a péptidos que tienen la capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento (TGF-) y a sus aplicaciones. En particular, la invención se refiere a péptidos inhibidores de la actividad biológica del TGF-como resultado de su unión directa al TGF-, y a su empleo en el tratamiento de enfermedades o alteraciones patológicas basadas en una expresión excesiva o desregulada del TGF-.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El TGF-es una glicoproteína perteneciente a una superfamilia de proteínas reguladoras (citoquinas) estructuralmente relacionadas entre sí, incluida dentro de una de las tres isoformas descritas en mamíferos (TGF-beta 1, 2 y 3). La isoforma más abundante es TGF-, que consiste en un homodímero de 25 kDa compuesto por 2 subunidades unidas por un puente disulfuro. La secuencia de aminoácidos del TGF-1 humano ha sido descrita por, por ejemplo, Derynck K et al., “Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequence and expression in normal and transformed cells”. Nature 316 (6030), 701-705 (1985).

El TGF-es una molécula cuya secuencia está altamente conservada en términos evolutivos. Aunque originalmente se definió por su capacidad para inducir proliferación independiente de adhesión y cambios morfológicos en fibroblastos de rata, investigaciones posteriores han revelado que el TGF-es un inhibidor general de la proliferación en un gran número de tipos celulares. Es producido por una gran variedad de tipos celulares y en diferentes tejidos durante todas las fases de la diferenciación celular. Produce una gran variedad de efectos biológicos, genera potentes y muy a menudo opuestos efectos en el desarrollo, fisiología y respuesta inmune. Información sobre el papel del TGF-en la diferenciación y regeneración hepática, y en la fibrosis hepática, así como los efectos del TGF-sobre la matriz extracelular, puede

encontrarse en la solicitud de patente española ES 2146552 A1.

Teniendo como objetivo el estudio de los mecanismos de acción del TGF-, se han descrito una decena de proteínas (receptores de membrana y proteínas de matriz extracelular) que interaccionan con esta citoquina.

Por otra parte, debido a que numerosas enfermedades o alteraciones patológicas están asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-, por ejemplo, las fibrosis asociadas con la pérdida de función de un órgano o tejido, o complicaciones quirúrgicas o estéticas, resulta interesante buscar productos capaces de inhibir la actividad biológica del TGF-, dado que tales productos podrían ser potencialmente utilizados en terapia humana o animal como bloqueantes de las consecuencias patológicas de una expresión en exceso o desregulada del TGF-.

Las estrategias habitualmente utilizadas para inhibir la actividad biológica del TGF- incluyen, entre otras, el empleo de (i) anticuerpos específicos neutralizantes,

(ii) oligos antisentido del gen codificante del TGF-que bloquean su expresión, o (iii) receptores solubles del TGF-que actúan de forma similar a los anticuerpos. El empleo de anticuerpos permite un bloqueo total y específico de esta citoquina (TGF-) aunque se potencian ciertos efectos secundarios tanto por la presencia de inmunoglobulinas exógenas en sangre como por los efectos derivados del bloqueo sistémico del TGF-. Además, la estabilidad en el tiempo de las inmunoglobulinas no permite un control a tiempos cortos del bloqueo en la actividad de esta citoquina. Los oligo antisentido inhiben la producción del TGF-a nivel de expresión génica, lo que puede generar desregulaciones importantes en todos los procesos en lo que interviene esta citoquina.

Recientemente se ha desarrollado otra estrategia basada en el empleo de péptidos inhibidores de la actividad biológica del TGF-. En este sentido, la solicitud de patente española ES 2146552 A1 describe unos péptidos sintéticos procedentes tanto del TGF como de sus receptores, o de proteínas con capacidad de unión al TGF-, que pueden ser utilizados como inhibidores de la actividad biológica del TGF-.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La invención se enfrenta, en general, con el problema de buscar nuevos

compuestos capaces de inhibir la actividad biológica del TGF-.

La solución proporcionada por la presente invención se basa en que los inventores han identificado una serie de péptidos capaces no solo de unirse al TGFsino, además, capaces de inhibir la actividad biológica del TGF-mediante su unión directa al propio TGF-. Algunos de estos péptidos han sido identificados mediante el empleo de la tecnología asociada con las librerías de fagos que permite determinar péptidos, con un tamaño típicamente comprendido entre 6 y 15 aminoácidos, que presentan una unión de alta afinidad con el TGF-, cuantificando, posteriormente, mediante ensayos in vitro e in vivo, la capacidad de inhibición de la actividad biológica del TGF-de los distintos péptidos. Otros péptidos han sido obtenidos mediante truncamiento de péptidos previamente identificados mediante dicha tecnología asociada con las librerías de fagos.

Los péptidos capaces de unirse al TGF-, en particular, aquéllos capaces de inhibir la actividad biológica del TGF-mediante su unión directa al TGF- son potencialmente útiles para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-. Asimismo, los péptidos capaces de unirse al TGF- proporcionan una herramienta para el estudio del papel biológico del TGF-(aún por dilucidar en muchos campos de la regulación de distintos procesos biológicos).

Por tanto, un aspecto de esta invención se relaciona con unos péptidos capaces de unirse al TGF-tal como se define en la reivindicación 1. En una realización particular y preferida, dichos péptidos tienen, además, la capacidad de inhibir la actividad biológica del TGF-.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende, al menos, uno de dichos péptidos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dichos péptidos en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGFtal como se define en la reivindicación 7. Ejemplos ilustrativos de dichas enfermedades o alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-incluyen la fibrosis asociada con la pérdida de función de un órgano o un tejido así como complicaciones quirúrgicas y/o estéticas.

En otro aspecto, la invención se relaciona con secuencias de ADN que codifican dichos péptidos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido proporcionado por esta invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicha secuencia de ADN o dicha construcción de ADN.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende dicha construcción de ADN o dicho vector.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido proporcionado por esta invención que comprende cultivar dichas células hospedadoras bajo condiciones que permiten la expresión de dicho péptido y, si se desea, recuperar el péptido obtenido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra esquemáticamente la posición de un péptido de 15 aminoácidos (aa), genéticamente fusionado a la proteína pIII, sobre la superficie del bacteriófago filamentoso M13.

La Figura 2 muestra esquemáticamente la posición génica del inserto, que codifica un péptido de 15 aa, en el genoma del bacteriófago M13 y la posición del péptido en la secuencia de la proteína pIII.

La Figura 3 muestra esquemáticamente la selección de péptidos basada en la técnica de “Biopanning”. El TGF-biotinilado se inmoviliza en placas que contienen estreptavidina (a través de la unión biotina-estreptavidina). Los fagos de la librería son seleccionados sobre la base de la interacción entre el TGF- y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos con baja afinidad por el TGF-son eliminados mediante lavados. Los fagos retenidos en la placa son eluidos mediante descenso de pH. Tras tres ciclos de enriquecimiento de fagos con alta afinidad por el TGF-, los fagos se aíslan y secuencian (véase el Ejemplo 1) [Leyendas de la Figura 3: “a”: Libería de fagos presentando péptidos de 15 aa; “b”: Infección en E. coli (K91Kan)(amplificación); “c”: Purificación de los fagos; “d”: Incubación de los fagos con concentraciones decrecientes de TGF-1; “e”: Lavados; “f”: Elución de los fagos unidos (↓pH); “g”: Infección en cepa de E. coli; “h”: Selección de colonias infectadas (tetraciclina); “i”: Amplificación de los fagos seleccionados; y “j”: Secuenciación del ADN (correspondiente al péptido) al cabo de tres ciclos de “biopanning”].

La Figura 4 proporciona una representación de un árbol de analogías de secuencia entre los péptidos de 15 aminoácidos identificados mediante una librería de fagos presentadores de péptido.

La Figura 5 proporciona una representación en diagrama del efecto de la concentración de TGF- sobre el crecimiento de la línea celular Mv-1-Lu, expresada en forma de captación de timidina tritiada en cuentas por minuto (c.p.m.).

La Figura 6 proporciona una representación en diagrama del protocolo de inducción de daño hepático agudo (véase el Ejemplo 3).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la invención se relaciona con un péptido caracterizado por su capacidad de unirse a TGF-1, de aquí en adelante referido como péptido de la invención, en donde la secuencia de aminoácidos de dicho péptido es SEQ ID NO: 17, o un fragmento del mismo con capacidad de unión al TGF-1, que comprende entre 9 y 14 restos de aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 17, y sus sales farmacéuticamente aceptables.

Los péptidos de la invención son capaces de unirse al TGF-. Algunos de dichos péptidos son, además, capaces de inhibir, in vitro y/o in vivo, la actividad biológica del TGF-.

La capacidad de los péptidos de la invención de unirse al TGF- se puede determinar mediante cualquier método apropiado que permita determinar la unión entre dos moléculas, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, que comprende poner en contacto el TGF-con el péptido a ensayar bajo condiciones que permiten la unión de dicho péptido al TGF-y evaluar la unión entre el péptido y el TGF-En una realización particular, dicho ensayo de afinidad puede realizarse utilizando TGFmarcado radiactivamente, por ejemplo, 125I-TGF-humano, tal como se describe en ES 2146552 A1. Alternativamente, el compuesto que puede estar marcado es el péptido a ensayar. En general, este tipo de ensayos de afinidad comprende poner en contacto TGF-, por ejemplo, inmovilizado en una placa bloqueada con estreptavidina, con el péptido cuya capacidad de unión al TGF- se desea conocer, y, tras incubar durante un periodo de tiempo apropiado, analizar la unión del péptido al TGF-Los péptidos con baja afinidad por el TGF-son eliminados mediante lavados mientras que los péptidos con mayor afinidad permanecen unidos al TGF-y pueden ser liberados rompiendo las interacciones moleculares entre ambas moléculas, lo que puede realizarse, por ejemplo, bajando el pH. Ensayando el péptido frente a distintas concentraciones de TGF-o viceversa, se puede obtener una idea de la afinidad del péptido en cuestión frente al TGF-. La capacidad de los péptidos de la invención de inhibir la actividad biológica del TGF- in vitro se puede evaluar y, si se desea, cuantificar, mediante un ensayo de inhibición del crecimiento de la línea celular Mv-1-Lu, una línea celular derivada de epitelio pulmonar de visón cuya proliferación es inhibida por el TGF(véase el Ejemplo 2).

La capacidad de los péptidos de la invención de inhibir la actividad biológica del TGF- in vivo se puede evaluar y, si se desea, cuantificar mediante un ensayo en un modelo animal de daño hepático agudo inducido, por ejemplo, por administración de tetracloruro de carbono (CCl4) (véase el Ejemplo 3). Como es conocido, el daño hepático agudo genera una cascada de efectos y respuestas fisiológicas que incluye la elevación de los niveles del TGF-, responsable, entre otros efectos, de la expresión del gen de colágeno de tipo I, entre otros.

Dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención. El término “sales farmacéuticamente aceptables” incluye aquellas sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos. La naturaleza de la sal no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables del péptido de la invención pueden obtenerse a partir de ácidos o bases (orgánicos o inorgánicos), basadas en métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia.

En una realización particular, la invención proporciona un péptido que comprende 9, 10, 11, 12, 13 ó 14 restos de aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 17 y sus sales farmacéuticamente aceptables.

En una realización concreta, la invención proporciona un péptido identificado por la SEQ ID NO: 17 y sus sales farmacéuticamente aceptables.

En otra realización concreta, la invención proporciona un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Estos péptidos comprenden entre 9 y 14 restos de aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos del péptido identificado por la SEQ ID NO: 17 y han sido obtenidos por truncamiento de dicho péptido (Ejemplo 4).

En otra realización particular, la invención proporciona un péptido seleccionado del grupo formado por los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 y sus sales farmacéuticamente aceptables. El péptido identificado por la SEQ ID NO: 17 presenta actividad inhibidora de la actividad biológica de TGF, tanto in vitro como in vivo. Los péptidos identificados por la SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 presentan actividad inhibidora de la actividad biológica de TGF-in vitro.

Para la identificación inicial de péptidos con capacidad de unirse al TGF-se ha utilizado la tecnología asociada con las librerías de fagos presentadores de péptidos que permite determinar péptidos que presentan una alta afinidad de unión con el TGF, y cuantificar, posteriormente, mediante ensayos in vitro e in vivo, su capacidad de inhibir la actividad biológica del TGF-. La secuencia de dichos péptidos que se unen al TGF-, inhibiendo in vitro o in vivo la actividad biológica del TGF-, se puede deducir a partir de la secuencia del ADN correspondiente al cabo de varios ciclos de “biopanning” (generalmente 3). El empleo de librerías de fagos presentadores de péptidos para identificar inhibidores de ciertos productos ha sido descrita, por ejemplo, por Chirinos-Rojas C.L. et al., en Immunology, 1999, Jan. 96(1):109-113; McConnell S.J., et al., en Gene 1994, Dec. 30, 151(1-2):115-118; o Smith G.P., Science, 1985, Jun. 14, 228(4705):1315-1317.

Por tanto, además se describe un método para la identificación de péptidos que tienen la capacidad de unirse al TGF-que comprende:

(i): utilizar una librería de fagos presentadores de péptidos que comprende una pluralidad de fagos filamentosos, conteniendo el genoma de cada uno de dichos fagos una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido diferente ligada al gen que codifica una proteína de la cubierta del fago (con lo que cada fago contiene un péptido diferente genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago);

(ii): seleccionar, mediante un ensayo de afinidad, los fagos que contienen los péptidos que se unen con mayor afinidad al TGF-; y

(iii) determinar la secuencia de los péptidos que se unen al TGF-, basada en las secuencias de ADN correspondientes insertadas en los fagos seleccionados en la etapa (ii) y que codifican dichos péptidos que se unen al TGF-.

En una realización particular, con el fin de obtener péptidos de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad al TGF-y con posible actividad inhibitoria de la actividad biológica de la mencionada citoquina, se utilizó una librería de fagos presentadores de péptidos que comprende una pluralidad de bacteriófagos filamentosos (M13) conteniendo cada uno de ellos un péptido diferente de 15 aminoácidos genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del fago, en este caso unido al extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII. De esta forma, el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos, en cada una de las cinco moléculas de proteína de superficie, mientras que en su interior contiene el ADN que codifica dicha secuencia peptídica. En las librerías de fagos la secuencia paraqué codifica el péptido proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales, lo que permite la presentación de 1,1x1012 secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física, 1:1, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite seleccionar (de entre un amplio número de variantes), aquellas secuencias que se unen específicamente al TGF. Este proceso se realiza mediante un ensayo de afinidad.

En una realización particular, dicho ensayo de afinidad consiste en un protocolo de selección in vitro conocido como “biopanning”. Brevemente, esta técnica implica la incubación de un conjunto de fagos representantes, a efectos prácticos, de todas las variantes de péptidos de 15 aminoácidos (en este caso), en una placa bloqueada con estreptavidina y a la cual se añade TGF- biotinilado. El TGF-biotinilado es así anclado a la placa a través de la unión biotina-estreptavidina, con lo que queda correctamente presentado para su interacción de TGF-1 con los péptidos portados por los fagos. Tras una incubación, se eliminan los fagos no unidos mediante lavados, y posteriormente se eluyen los fagos unidos específicamente mediante un descenso de pH, un proceso que rompe las interacciones moleculares entre el TGF-y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana. El proceso se repite 3 rondas, de manera se consigue un enriquecimiento en el contenido de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad al TGF-. La concentración de TGF-biotinilado utilizado para bloquear las placas se va reduciendo progresivamente en cada ronda, por ejemplo, de 2,5 a 0,01 y finalmente a 0,001 g/ml. De este modo, al final del proceso, los fagos que han sido seleccionados por su afinidad al TGF- son secuenciados usando cebadores. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos.

El Ejemplo 1 ilustra la selección de péptidos que se unen al TGF-mediante librería de fagos, selección por “biopanning” y secuenciación de los péptidos con unión de alta afinidad al TGF-.

Adicionalmente, se describe un método para la identificación de péptidos capaces de unirse al TGF-que comprende la truncación de péptidos que son capaces de unirse al TGF- seguido por un ensayo de la capacidad de estos péptidos truncados para unirse al TGF-Los péptidos truncados pueden obtenerse por cualquier método convencional, por ejemplo, por síntesis química (dado su tamaño) de las versiones truncadas del péptido por su extremo N-terminal, C-terminal. La capacidad de estos péptidos truncados para unirse al TGF- puede determinarse mediante cualquier método apropiado que permita determinar la unión entre dos moléculas, por ejemplo, mediante un ensayo de afinidad, que implica poner en contacto el TGF-con el péptido a ensayar bajo condiciones que permiten la unión de dicho péptido al TGF-y evaluar la unión del péptido al TGF-tal como se ha mencionado previamenteAsimismo, la capacidad de dichos péptidos truncados de inhibir, in vitro y/o in vivo, la actividad biológica del TGF- puede ensayarse por cualquiera de los ensayos mencionados en esta descripción.

Debido al papel que desempeña el TGF-en numerosos procesos biológicos, una consecuencia de la actividad inhibidora del TGF- de los péptidos de la invención tiene que ver con el desarrollo potencial de una familia de fármacos útiles para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF-, ya que tales péptidos permiten bloquear el exceso o la desregulación de dicha citoquina que origina daño.

Los péptidos de la invención, por tanto, pueden utilizarse en el tratamiento de (i) la fibrosis asociada con la pérdida de función de un órgano o un tejido, por ejemplo, fibrosis pulmonar, fibrosis hepática (cirrosis), fibrosis renal, fibrosis corneal, etc., y de

(ii) las complicaciones quirúrgicas y/o estéticas, por ejemplo, fibrosis asociada con la cirugía cutánea y peritoneal, fibrosis asociada con quemaduras, fibrosis osteo-articular, queloides, etc.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de la invención junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede contener uno o más péptidos de la invención, opcionalmente en combinación con uno o más compuestos inhibidores del TGF- alternativos. Esta composición farmacéutica es útil para su administración y/o aplicación en el cuerpo humano o animal (preferiblemente en el último).

El empleo de péptidos, tales como los péptidos de la invención, en lugar de utilizar anticuerpos u oligonucleótidos antisentido, ofrece numerosas ventajas, ya que son moléculas pequeñas, con mayor capacidad de difusión y de vida media más corta. Los péptidos pueden exhibir una elevada afinidad por el TGF-, aunque se degradan más rápidamente que los anticuerpos, sin embargo, los efectos secundarios pueden controlarse mediante dosis. También es más fácil la vehiculización de los péptidos a órganos o tejidos diana en comparación con otro tipo de compuestos.

Los péptidos de la invención pueden administrarse para tratar las enfermedades y las alteraciones patológicas asociadas con una expresión en exceso o desregulada del TGF- por cualquier medio que produzca el contacto del péptido de la invención con su sitio de acción o diana en el cuerpo humano o animal. La cantidad de péptido, derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que puede estar presente en la composición farmacéutica proporcionada por esta invención puede variar dentro de un amplio intervalo.

La dosificación indicada para tratar una enfermedad o alteración patológica asociada con una expresión en exceso o desregulada del TGF-usando los péptidos y/o composiciones farmacéuticas de la invención dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la enfermedad o alteración patológica, la ruta y frecuencia de administración y del péptido de la invención a administrar.

Las composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos de la invención pueden presentarse en cualquier forma de administración, por ejemplo, sólida o líquida, y pueden administrarse por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, parenteral, rectal o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada, por ejemplo, pomadas (lipogeles, hidrogeles, etc.), colirios, aerosoles por nebulización, soluciones inyectables, bombas osmóticas, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el “Tratado de Farmacia Galénica”, C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.

El empleo de los péptidos de la invención en la elaboración de la composición farmacéutica mencionada constituye un aspecto adicional de esta invención. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de un péptido de la invención en la elaboración de una composición famracéutica para el tratamiento de la fibrosis asociada con la pérdida de función de un órgano o un tejido, por ejemplo, fibrosis pulmonar, fibrosis hepática (cirrosis), fibrosis renal, fibrosis corneal, etc.; o las complicaciones quirúrgicas y/o estéticas, por ejemplo, fibrosis asociada con la cirugía cutánea y peritoneal, fibrosis asociada con quemaduras, fibrosis osteo-articular, queloides.

Los péptidos de la invención pueden obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante técnicas de síntesis química sobre fase sólida; purificarse mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y si se desea, se pueden analizar mediante técnicas convencionales, por ejemplo, mediante secuenciación y espectrometría de masas, análisis de aminoácidos, resonancia magnética nuclear, etc.

Alternativamente, los péptidos de la invención pueden obtenerse mediante la tecnología del ADN recombinante. Por tanto, en otro aspecto, la invención da lugar a una secuencia de ADN que codifica un péptido de la invención. Dicha secuencia de ADN puede ser deducida fácilmente a partir de la secuencia del péptido.

Dicha secuencia de ADN puede estar contenida en una construcción de ADN. Por tanto, la invención proporciona una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica para un péptido de la invención. Dicha construcción de ADN puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de la secuencia de ADN que codifica para el péptido de la invención. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción del péptido de la invención, e incluyen secuencias promotoras, terminadoras, etc., funcionales en células hospedadoras transformadas que comprenden dicha secuencia o construcción de ADN. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en bacterias. Ventajosamente, dicha construcción de ADN comprende, además, un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicha construcción de ADN. La construcción de ADN proporcionada por esta invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica Sambrook et al., “Molecular cloning, a Laboratory Manual”, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3.

La secuencia de ADN o la construcción de ADN proporcionadas por esta invención, pueden ser insertadas en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende la secuencia o construcción de ADN mencionadas. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el genoma de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra].

En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula hospedadora, tal como una célula hospedadora transformada, que comprende una secuencia de ADN o una construcción de ADN proporcionadas por esta invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para producir un péptido de la invención que comprende crecer una célula hospedadora con la secuencia o construcción de ADN proporcionada por esta invención bajo condiciones que permiten la producción del mencionado péptido de la invención y, si se desea, recuperar el péptido de la invención. Las condiciones para optimizar el cultivo de dicha célula hospedadora dependerán de la célula hospedadora utilizada. Si se desea, el procedimiento para producir el péptido de la invención incluye, además, el aislamiento y purificación de dicho péptido.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.

EJEMPLO 1 Selección de péptidos que se unen al TGF- mediante librería de fagos presentadores de péptidos

Para la obtención de secuencias de 15 aminoácidos capaces de unirse con alta afinidad al TGF- y con posible actividad inhibitoria de la actividad biológica de esta citoquina, se utilizó una técnica de selección in vitro basada en la tecnología desarrollada a partir de las librerías de fagos. Estas librerías constan de bacteriófagos filamentosos (M13) que contienen un péptido genéticamente fusionado a una proteína de la cubierta del virus, en este caso unido al extremo N-terminal de la proteína de cubierta pIII (Figura 1). De esta forma el fago presenta sobre su superficie un péptido de 15 aminoácidos, en cada una de las 5 moléculas de esta proteína que presenta el fago en su superficie, mientras en su interior contiene el ADN que codifica para dicha secuencia peptídica. En las librerías de fagos la secuencia codificante para el péptido proviene de una secuencia degenerada en cada una de las 15 posiciones con los 20 aminoácidos naturales. Esto permite la presentación de 1,1x1012 secuencias posibles de 15 aminoácidos en diferentes fagos. La relación física, 1 a 1, entre la secuencia peptídica y el ADN que lo codifica en el bacteriófago permite seleccionar, de entre un gran número de variantes, aquellas secuencias que se unen específicamente al TGF-. Este proceso se realiza mediante un protocolo de selección in vitro denominado “biopanning”.

La librería de fagos utilizada para la realización de este ejemplo procede de una segunda amplificación de la librería primaria descrita por T. Nishi, H. Tsuri y H. Saya [Exp. Med. (Japan) 11, 1759 (1993)], cedida por el laboratorio de George P. Smith. Información adicional sobre esta tecnología puede encontrarse en la siguiente página web:http://www.biosci.missouri.edu/smithgp/PhageDisplayWebsite/PhageDisplayWebs iteIndex.html

Técnica de selección (Biopanning)

Esta técnica consiste en la incubación de un conjunto de fagos, representantes (a efectos prácticos) de todas las variantes de 15 aminoácidos, en una placa bloqueada con estreptavidina (10 g/ml en NaHCO3 0,1 M, 2h a temperatura ambiente) a la que se le añade TGF-biotinilado. El TGF-biotinilado queda anclado a la placa a través de la interacción biotina-estreptavidina, con lo que queda correctamente presentado para su interacción con los péptidos portados por los fagos. El TGF-1 se pone en contacto con los péptidos portado por los fagos a una concentración de 3x104 virus/ml y se deja incubar durante 12 horas aproximadamente. Tras la incubación, se eliminan los fagos no unidos mediante 5 lavados con PBS/Tween (tampón fosfato salino/polioxialquilen derivados de ésteres de ácidos grasos de sorbitano) y posteriormente se eluyen los fagos unidos específicamente, mediante un descenso de pH (buffer de elución) que rompe las interacciones moleculares entre el TGF-y los péptidos presentados por los fagos. Los fagos eluidos son, entonces, amplificados mediante infección en una cepa bacteriana (E. coli). El proceso se repite un total de 3 rondas, de manera que el contenido de fagos que se unen específicamente y con alta afinidad al TGF-se va enriqueciendo (Figura 3). La concentración de TGF-biotinilado utilizado para bloquear las placas se va

reduciendo progresivamente en cada ronda de 2,5 a 0,01 y finalmente 0,00g/ml. De este modo, los fagos seleccionados en cada ronda presentan cada vez mayor grado de afinidad por el TGF-. Al final del proceso los fagos que han sido seleccionados por su afinidad con el TGF-son secuenciados con cebadores, tras ser aislados mediante 5 resistencia a tetraciclina que confieren los fagos modificados genéticamente tras infectar células de E. coli. Esto permite obtener las secuencias de los péptidos presentados en los fagos de un número de clones obtenido de colonias aisladas. El número de veces que se repite una secuencia, correspondiente a un péptido de 15 aminoácidos portado por cada clon, del total de clones secuenciados da una idea del grado de afinidad relativa que

10 tiene dicha secuencia de 15 aminoácidos por el TGF-1.

Secuencia de los péptidos Para la obtención de clones de los fagos, obtenidos a partir del “biopanning”, se realiza una selección en presencia de un antibiótico de colonias bacterianas infectadas

15 por estos fagos, cuya resistencia viene dada por un gen de resistencia a tetraciclina presente en el genoma de los fagos. Con este método únicamente crecen colonias infectadas por bacteriófagos. Así cada colonia contiene el genoma de un único fago al que le corresponde la secuencia de un solo péptido presentado en su superficie. De las 108 colonias de bacterias infectadas por fagos, derivados de la última

20 ronda de selección por “biopanning, se secuenció la porción del genoma que engloba la región correspondiente a los péptidos presentados en la proteína pIII utilizando el cebador identificado mediante la SEQ ID NO: 23. De este modo se obtuvieron las secuencias que se muestran en la Tabla 1 donde se indican además el número de colonias (clones) que portaban dichas secuencias.

25

Tabla 1 Secuencias de aminoácidos procedentes de los fagos que interactúan con el TGF-

SEQ ID NO:: Nº de colonias

1: 6

2: 1

3: 41

4: 18

5: 1

6: 12

7: 2

8: 2

9: 1

10: 1

11: 4

12: 1

13: 6

14: 2

15: 1

16: 1

17: 3

18: 1

19: 1

20: 1

21: 1

22: 1

5

El número de clones (colonias) de cada secuencia da una idea relativa del grado de afinidad entre los péptidos y el TGF-, o sea, a mayor número de clones mayor afinidad de unión. Sin embargo, el grado de afinidad no se corresponde con la capacidad de bloquear la actividad del TGF-puesto que el péptido más activo, el

10 péptido identificado con la SEQ ID NO: 17 (véanse las Tablas 2 y 3) da 3 clones, mientras que el péptido identificado con la SEQ ID NO: 3, que da 41 clones, es mucho menos activo en el ensayo de daño hepático agudo (Tabla 3). Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, esta cuestión podría ser explicada sobre la base de que el péptido más activo bloquearía probablemente la unión del TGF-1 a su receptor.

15

Comparación de las secuencias peptídicas

Las secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa CLUSTAL W (1.81). Este programa genera un agrupamiento múltiple de secuencias en función de sus analogías de secuencia aminoacídica. Los péptidos quedan así agrupados por familias estructurales (Figura 4). En base a las analogías que presentan estos péptidos se pueden sugerir motivos menores de unión al TGF-o grupos de péptidos que se unen a diferentes regiones del TGF-.

EJEMPLO 2 Inhibición de la actividad biológica in vitro del TGF-mediante péptidos en ensayos de proliferación con células Mv-1-Lu

La línea celular Mv-1-Lu (CCL-64, American Type Cell Culture, Virginia, Estados Unidos) deriva de epitelio pulmonar de visón, crece en monocapa y responde al TGF-1 exógeno con una disminución de su proliferación (Figura 5). La inhibición mediante péptidos de esta citoquina es capaz de restablecer su crecimiento y refleja la capacidad de los distintos péptidos como inhibidores de la actividad biológica in vitro del TGF-1. Los péptidos ensayados fueron obtenidos mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al. J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546).

Las células Mv-1-Lu se cultivan hasta la subconfluencia en medio completo [RPMI-1640 suplementado con L-glutamina, piruvato sódico, antibióticos y 10% de suero de ternera fetal (FBS)] a 37ºC y 5% de CO2 en botellas de 162 cm2 (Costar Corporation, CA, USA). Las células, tras tripsinizado, se cultivan en 200 l de medio completo en placas de 96 pocillos a una densidad inicial de 5.000 células/pocillo, a 37ºC y 5% CO2, durante 6 horas para permitir su adhesión. Posteriormente se añaden los tratamientos de los diferentes péptidos a distintas concentraciones, comenzando con 200 g/ml y se añade TGF-1 (Human Transforming Growth Factor-1, Roche) a una concentración de 200 pg/ml. Tras 12 horas de incubación se añade 1 Ci de metil-3Htimidina (Amersham Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) por pocillo en 25 l de medio limpio (RPMI-1640) y se incuba la placa 12 horas más en las mismas condiciones. Finalmente, se cosechan las células (Filtermate 196 Harvester, Packard) transfiriéndose la timidina tritiada, incorporada en la síntesis de ADN, a placas (UniFilter-96 GF/C®, Perkin Elmer)y la radiactividad se cuantifica, tras adición de líquido de centelleo, en un contador de centelleo (Top Count, Microplate Scintillation Counter, Packard). Como control positivo y negativo se utilizó la incorporación de

5 timidina tritiada en ausencia y presencia de TGF-1, respectivamente. La inhibición de la actividad del TGF-1 en este ensayo se calculó mediante la siguiente fórmula:

100x (cpm con péptido – cpm control negativo)

%Inhibición =

(cpm control positivo – cpm control negativo) 10 El control negativo representa la incorporación de timidina tritiada en presencia de TGF-1, pero en ausencia de péptido, mientras que el control positivo se refiere al mismo parámetro en ausencia de TGF-1 y péptido. Así se puede medir el porcentaje de inhibición de los péptidos sobre la actividad biológica del TGF-, por su capacidad de 15 revertir el efecto represor de esta citoquina sobre la proliferación de la línea celular Mv-1-Lu (Tabla 2).

Tabla 2 Efecto de los péptidos obtenidos mediante la selección por “biopanning” sobre la inhibición de la actividad biológica in vitro del TGF-, calculado a partir del restablecimiento del crecimiento de la línea Mv-1-Lu

SEQ ID NO:: % Inhibición

1: 3,33 ± 4,3

2: -0,96 ± 0,83

3: 25,39 ± 1,7

4: 5,53 ± 7,2

5: 15,78 ± 7,7

6: 12,85 ± 4,5

7: -24,96 ± 0,75

8: 15,67 ± 8,5

9: 4,98 ± 9,5

10: -4,58 ± 0,9

11: 27,36 ± 0,9

12: 10,70 ± 0,9

13: 17,97 ± 4,3

14: 3,62 ± 5,6

15: 13,45 ± 9,5

16: 9,47 ± 4,2

17: 38,92 ± 2,3

18: 21,29 ± 2,8

19: 9,71 ± 3,2

20: 6,16 ± 9,5

21: 13,40 ± 3,2

22: 4,13 ± 1,4

P144: 7,26 ± 3,53

5 Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 3, 11, 17 y 18 inhiben la actividad biológica in vitro del TGF-con un porcentaje de inhibición superior al 20%. Adicionalmente, se ha comparado la actividad del péptido identificado como P144 en la solicitud de patente española ES 2146552 A1 con la actividad del péptido

10 identificado mediante la SEQ ID NO: 17 en cuanto a su capacidad para revertir el efecto represor del TGF-sobre la proliferación de la línea celular Mv-1-Lu previamente descrito, observándose una mejor actividad del péptido identificado como SEQ ID NO:

17.

EJEMPLO 3 Inhibición de la actividad biológica in vivo del TGF-mediante péptidos usando un modelo de daño hepático agudo inducido por CCl4

El daño hepático agudo genera una cascada de efectos y respuestas fisiológicas que incluye la elevación de los niveles de TGF-1. Esta elevación es la responsable de inducir la expresión, entre otros, del gen de colágeno de tipo I. En este modelo de daño hepático agudo en ratones hembras Balb/C de 25 a 30 g de peso, se administran por vía oral 2 l de CCl4 por gramo de ratón en relación volumétrica de 1:1 con aceite de maíz. El grupo control recibe un volumen equivalente de aceite de maíz, y los grupos tratados reciben, tras la dosis inicial de CCl4, 50 g de péptido en 500 l de suero fisiológico al 1% en DMSO (dimetilsulfóxido) cada 24 h. Tras 72 horas todos los animales son sacrificados y se realiza el procesamiento de las muestras hepáticas; para evaluar la expresión de ARNm se congeló tejido hepático en nitrógeno líquido almacenándose seguidamente a -80ºC hasta su utilización. Otras muestras de tejido hepático fueron conservadas en OCT o Tissue-Tek (Sakura Finetek B.V.) procesándose de la misma manera que las muestras destinadas a extracción de ARNm, y también se conservaron muestras en formol tamponado al 10%, para su posterior inclusión en parafina y evaluación histológica. Posteriormente se cuantifica el nivel de ARNm de colágeno tipo I de todos los grupos mediante PCR cuantitativa. En la Figura 6 se muestra un diagrama de flujo correspondiente a la inducción, toma de muestras y cuantificación de los resultados en el ensayo de daño hepático agudo. La capacidad de los péptidos estudiados de bloquear el daño agudo, medido según los niveles de ARNm de colágeno de tipo I inducido se determinó cuantificando este ARN por PCR en tiempo real. En la Tabla 3 se muestra el grado de inhibición de la expresión de colágeno correspondiente a cada uno de los péptidos. Los péptidos ensayados fueron obtenidos mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al. J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546).

Tabla 3 Efecto de los péptidos obtenidos mediante la selección por “biopanning” sobre la inhibición de la actividad biológica in vivo del TGF-, calculado sobre la inhibición de la inducción de ARNm de colágeno tipo I en un modelo de daño hepático agudo

SEQ ID NO:: % Inhibición

1: 0,69

2: 36,6 ± 30,7

3: 2,09

4: 51,30 ± 15,3

5: Neg

6: 74,94 ± 25,3

7: Neg

8: Neg

9: 26,59

10: Neg

11: 39,34 ± 21,9

12: Neg

13: 32,70

14: 49,84 ± 24

15: 14,26

16: Neg

17: 93,09 ± 9,6

18: Neg

19: 12,12

20: 1,41

21: Neg

22: Neg

P144: -3,51 ± 36

(Neg: negativo)

Los péptidos identificados como SEQ ID NO: 2, 4, 6, 11, 14 y 17 inhiben la actividad biológica in vivo del TGF-con un porcentaje de inhibición superior al 35%. 10 Adicionalmente, se ha comparado la actividad del péptido identificado como P144 en la solicitud de patente española ES 2146552 A1 con la del péptido identificado mediante SEQ ID NO: 17 en cuanto a su capacidad para inhibir la expresión del ARNm del colágeno de tipo I en el ensayo de daño agudo hepático en ratones previamente definido. En este ensayo comparativo, se observa que el péptido identificado como SEQ

15 ID NO: 17 inhibe la expresión del ARNm del colágeno de tipo I mucho más que el

péptido identificado como P144 en la solicitud de patente española ES 2146552 A1 que no tiene actividad. Los resultados obtenidos con los ensayos comparativos (Ejemplos 2 y 3) ponen de manifiesto que un péptido ilustrativo de los péptidos de esta invención (el péptido identificado mediante la SEQ ID NO: 17) es más activo que un péptido ilustrativo de la solicitud de patente española ES 2146552 A1 (el péptido identificado como P144) en los ensayos de proliferación con células Mv-1-Lu y en un modelo de daño hepático agudo.

EJEMPLO 4 Inhibición de la actividad biológica in vitro del TGF-1 mediante péptidos truncados de la secuencia del péptido SEQ ID NO: 17, en ensayos de proliferación con células Mv-1-Lu

En este ejemplo se muestra la actividad inhibidora de algunos péptidos cuya secuencia de aminoácidos comprende entre 3 y 15 restos de aminoácidos consecutivos de una de las secuencias de aminoácidos de la invención.

Se ha comparado la actividad de péptidos truncados (derivados de la secuencia del péptido SEQ ID NO: 17) respecto a la secuencia completa, en cuanto a su capacidad para revertir el efecto represor del TGF-1

sobre la proliferación de la línea celular Mv-1-Lu. Para ello, y con la intención de identificar la secuencia mínima del péptido SEQ ID NO: 17 capaz de inhibir la actividad biológica del TGF-1 in vitro, se sintetizaron versiones truncadas de este péptido, por el extremo N-terminal, C-terminal

o por ambos extremos. Los péptidos ensayados fueron obtenidos mediante síntesis peptídica siguiendo procedimientos convencionales (Merrifield RB. J Am Chem Soc 1963; 85:2149-2154; Atherton E et al. J Chem Soc Perkin Trans 1981; 1:538-546). Siguiendo la misma metodología descrita en el Ejemplo 2, se cuantificó la actividad de los péptidos truncados en el ensayo de proliferación con células Mv-1-Lu, en comparación con la actividad de la secuencia completa de péptido SEQ ID NO: 17.

Tabla 4 Efecto de los péptidos truncados obtenidos de la secuencia del péptido SEQ ID NO: 17 sobre la inhibición de la actividad biológica in vitro del TGF-, calculado a partir del restablecimiento del crecimiento de la línea Mv-1-Lu

SEQ ID NO:: Secuencia % Inhibición

17: KRIWFIPRSSWYERA 28,5  3,9

24 (T1): RIWFIPRSSWYERA 9,4  0,4

25 (T2): RIWFIPRSSWYER 6,2  1,5

26 (T3): IWFIPRSSWYERA 4,5  1,8

27 (T4): IWFIPRSSWYE 1,4  2,5

28 (T5): WFIPRSSWY 3,1  0,9

29 (T6): WFIPRSSWYERA 2,7  1,8

30 (T7): FIPRSSWYERA -0,3  3,0

31 (T8): IPRSSWYERA 3,4  1,4

32 (T9): PRSSWYERA 3,8  1,6

33 (T10): KRIWFIPRSSWYER 31,4  7,0

34 (T11): KRIWFIPRSSWY 34,4  7,9

35 (T12): KRIWFIPRSS 6,0  0,4

36 (T13): KRIWFIPRS 6,2  2,5

5

Como se muestra en la Tabla 4, en este ensayo comparativo, la eliminación de la lisina (K) del extremo N-terminal, conlleva una pérdida de actividad del péptido SEQ ID NO: 17, del 28,5% al 9,4%. Por el contrario, la eliminacion de hasta 3 aminoácidos del extremo C-terminal no afecta a la actividad del péptido. Por otro lado, la eliminación

10 de los aminoácidos aromáticos, tirosina (Y) y triptófano (W), elimina la actividad del péptido. Esto permite reducir la secuencia original del péptido SEQ ID NO: 17 a una secuencia de 12 aminoácidos (KRIWFIPRSSWY) [SEQ ID NO: 34] sin afectar a su actividad inhibitoria del TGF-1 in vitro.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA, S.L.

<120> PÉPTIDOS CON CAPACIDAD PARA UNIRSE AL FACTOR TRANSFORMANTE DEL CRECIMIENTO b1 (TGF-b1)

<130> FIMA02007

<150> ES 200302020

<151> 2003-08-22

<160> 36

<170> PatentIn version 3.1

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 1 Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Leu Arg Ser Ala Pro Gly Ala 15 10 15

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 2 Asp Arg Arg Ile Phe Trp Trp Ser Asn Arg Ser Ala Pro Gly Ala 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 3

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 3 Arg Phe Phe Thr Arg Phe Pro Trp His Tyr His Ala Ser Arg Leu 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 4

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 4 Arg Leu Ala His Ser His Arg His Arg Ser His Val Ala Leu Thr 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 5

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 5 Arg Arg Trp Val Arg Tyr Pro Val His Leu His Ser Pro Ile Val 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 6

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 6 Pro Pro Tyr His Arg Phe Trp Arg Gly His Arg His Ala Val Gln 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 7

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 7 His Arg Ile Ser His Phe Ala His Arg Tyr Leu Ala Arg Leu His 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 8 Trp His Trp Arg His Arg Ile Pro Leu Gln Leu Ala Ala Gly Arg 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 9

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 9 Gly Trp His Ser Leu Leu His Ser Arg Tyr His Arg Ile Ala Ala 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 10

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 10 Phe Val Trp Val Arg Phe His Arg Leu Pro Arg Gln Ile Tyr Thr 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 11 Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser Val Arg Thr Arg 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 12

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 12 Trp His Lys Tyr Phe Leu Arg Arg Pro Leu Ser Val Gly Leu Gly 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 13

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 13

Arg Lys Trp Phe Leu Gln His Arg Arg Met Pro Val Ser Val Leu 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 14 Ser Gly Arg Arg His Leu His Arg His His Ile Phe Ser Leu Pro 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 15

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 15 Gly Trp Ile Thr Phe His Arg Arg His His Asp Arg Val Leu Ser 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 16

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 16 Arg Leu His Gly His Arg Ser His Arg Phe Thr His Val Ala Gln 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 17

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 17 Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 18

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 18 Met Pro Leu Ser Arg Tyr Trp Trp Leu Phe Ser His Arg Pro Arg 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 19 Arg His Leu Ser His Phe Lys Trp Leu Arg Ser His Gly Leu Asp 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 20

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 20 Arg Arg Phe His Phe His Ser Arg Met Val Ala Val Asp Asn Ser 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 21

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 21 His Val Arg Leu His His Tyr Leu Arg His Arg Ser Leu Pro Asn 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 22

<211> 15

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial

<400> 22 Val Pro Met Ala Leu Asn His Gly Val Tyr Val Met Val Ser Ser 1 5 10 15

<210> SEQ ID NO: 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<223> Oligonucleótido iniciador fdtet15-mer

<400> 23 TGAATTTTCT GTATGAGG 18

<210> SEQ ID NO: 24

<211> 14

<212> PRT

<213> Péptido secuencia artificial obtenido por truncado del péptido SEQ ID NO: 17

<400> 24 Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 25

<211> 13

<212> PRT

<400> 25 Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 26

<211> 13

<212> PRT

<400> 26 Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 27

<211> 11

<212> PRT

<400> 27 Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 28

<211> 9

<212> PRT

<400> 28 Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr 1 5

<210> SEQ ID NO: 29

<211> 12

<212> PRT

<400> 29 Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 30

<211> 11

<212> PRT

<400> 30 Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 31

<211> 10

<212> PRT

<400> 31 Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 32

<211> 9

<212> PRT

<400> 32 Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg Ala 1 5

<210> SEQ ID NO: 33

<211> 14

<212> PRT

<400> 33 Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr Glu Arg 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 34

<211> 12

<212> PRT

<400> 34 Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser Trp Tyr 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 35

<211> 10

<212> PRT

<400> 35 Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser Ser 1 5 10

<210> SEQ ID NO: 36

<211> 9

<212> PRT

<400> 36 Lys Arg Ile Trp Phe Ile Pro Arg Ser 1 5

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un péptido caracterizado por su capacidad de unirse al factor transformante del crecimiento  (TGF-), en donde la secuencia de aminoácidos de dicho péptido es SEQ ID NO: 17, o un fragmento de dicho péptido con capacidad de unirse al TGF-1 que comprende entre 9 y 14 restos de aminoácidos consecutivos, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
2.

Péptido según la reivindicación 1, seleccionado del grupo de péptidos identificados como SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
3.

Péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, dicho péptido teniendo la capacidad de inhibir, in vitro y/o in vivo, la actividad biológica del TGF-.
4.

Péptido según la reivindicación 3, seleccionado del grupo que consiste en los péptidos identificados como SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
5.

Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 junto con, al menos, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
6.

Composición farmacéutica según la reivindicación 5, que comprende, al menos, un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, junto con, opcionalmente, uno o más, compuestos inhibidores del TGF- alternativos.
7.

Uso de un péptido cuya secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 17, o un fragmento de dicho péptido con capacidad de unión al TGF-1 que comprende entre 9 y 14 restos de aminoácidos consecutivos, y sus sales farmacéuticamente aceptables, para

la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, cirrosis, fibrosis renal, fibrosis corneal, fibrosis asociada con la cirugía cutánea y peritoneal, fibrosis asociada con quemaduras, fibrosis osteoarticular o queloides.
8.

Uso según la reivindicación 7, en donde dicho péptido es seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, y sus sales farmacéuticamente aceptables.
9.

Una secuencia de ADN que codifica un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
10.

Una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 9.
11.

Construcción de ADN según la reivindicación 10, que comprende, además, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión de dicha secuencia de ADN.
12. Un vector que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 9,

o una construcción de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11.
13.

Una célula hospedadora que comprende una secuencia de ADN según la reivindicación 9, o una construcción de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, o un vector según la reivindicación 12.
14.

Un procedimiento para producir un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende crecer una célula hospedadora según la reivindicación 13 bajo condiciones que permiten la producción de dicho péptido, y, si se desea, recuperar dicho péptido.