KR20090016671A - 레플리킨 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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사무엘 보고치
엘레노어 에스 보고치
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Abstract

본 발명은 분리된 인플루엔자 펩티드 및 핵산 서열, 및 빠른 복제 및 독성을 예측하는 고도로 보존된 레플리킨 및 레플리킨 스캐폴드 서열에서 아미노산 또는 핵산의 치환 패턴을 갖는 상기 인플루엔자 펩티드 및 핵산 서열을 동정하는 방법을 제공한다. 예측된 치환 패턴을 갖는 펩티드 및 핵산 서열을 동정함을 포함하여 출현한 인플루엔자 스트레인에서 독성을 예측하는 방법이 제공된다.
Figure P1020087028985
레플리킨, 인플루엔자, 펩티드, 핵산, 치환, 패턴, 독성, 예측

Description

레플리킨 펩티드 및 이의 용도{REPLIKIN PEPTIDES AND USES THEREOF}
본 출원은 미국 잠정출원번호 60/808,944(2006년 5월 30일 출원, 본원에 참고문헌으로 통합됨)로 우선권을 주장한다. 하기 출원들은 본원에 참고문헌으로 추가적으로 통합된다: 미국 출원번호 11/355,120(2006년 2월 16일 출원), 미국 가출원번호 60/653,083(2005년 2월 16일 출원), 미국 출원번호 11/116,203(2005년 4월 28일 출원), 미국 잠정출원번호 60/565,847(2004년 4월 28일 출원), 미국 출원번호 10/860,050(2004년 6월 4일 출원), 미국 잠정출원번호 60/531,686(2003년 2월 23일 출원), 60/504,958(2003년 9월 23일 출원), 및 60/476,186(2003년 6월 6일 출원), 미국 출원번호 10/189,437(2002년 7월 8일 출원), 미국 출원번호 10/105,232(2002년 3월 26일 출원), 미국 잠정출원번호 60/303,396(2001년 7월 9일 출원), 및 60/278,761(2001년 3월 27일 출원)으로부터 우선권을 주장한 미국 출원번호 09/984,057(2001년 10월 26일 출원).
발명의 기술분야
본 발명은 일반적으로 레플리킨(replikin)으로서 공지된 펩티드류, 및 이러한 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 레플리킨은 아미노산 서열 및 이러 한 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 규정된 구조적 특징을 공유한다. 레플리킨 펩티드는 바이러스 및 유기체의 빠른 복제와 서로 관련이 있다. 레플리킨 스캐폴드는 레플리킨 펩티드류의 서브-세트(sub-set)이다. 레플리킨 스캐폴드는 전염병과 관련되고 빠른 복제, 독성 및 숙주 사망률과 서로 관련이 있는 인플루엔자 바이러스의 스트레인들에 고도로 보존된다. 본 발명자들은 상당히 고도로 레플리킨 및 인플루엔자 스트레인에서의 레플리킨 스캐폴드에서 아미노산의 치환, 및 상응하는 뉴클레오티드의 패턴을 동정하였다. 치환의 동정된 패턴은 독성의 변화와 관련이 있으며, 인플루엔자 전염병 및 광역 유행병의 예측물로서 유용하다.
빠른 복제는 특정의 박테리아, 바이러스 및 성 종양에서 독성의 특징을 갖는다. 미국특허출원번호 09/984,057(2001년 10월 26일 출원)에서는 먼저 전술된 서열 구조를 공유하고 빠르게 복제하는 악성 종양, 박테리아, 바이러스, 다른 유기체 및 복제-관련 단백질에 걸쳐 널리 발견되고, 빠른 복제 및 독성과 관련이 있는 보존된 아미노산 및 핵산 서열의 패밀리로서의 레플리킨을 기재하고 있다. 레플리킨은 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열이며, 여기서 아미노산 서열은 모티프의 첫 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기, 및 모티프의 두 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기 또는 하나 이상의 히스티딘 잔기로 이루어진 모티프를 포함하는 7 내지 약 50개의 아미노산, 두 번째 라이신 잔 기로부터의 6 내지 10개의 잔기가 위치된 하나 이상의 라이신 잔기, 하나 이상의 히스티딘 잔기 및 저거도 6% 라이신 잔기를 포함한다.
프로테오믹(단백체학) 관점으로부터, 레플리킨 모티프는 뇌 교아세포종 악성 종양에 존재하는 신경교종 펩티드 서열을 기초로 한 알고리즘으로부터 유도된다. 건강한 인간 게놈과 비교하여 신경교종에 대해 독특한 펩티드에서 관찰되는 레플리킨 알고리즘은 복제의 경우에 관련된 보존된 구조 및 특정 기능을 갖는 광범위한 부류의 단백질의 발견을 초래한다. 독성의 증가와 단백질에 존재하거나 게놈에 코딩된 레플리킨 펩티드 농도의 증가의 상관관계는 이후 인플루엔자, HIV, 암 및 토마토 잎말림 바이러스(tomato leaf curl virus)를 포함한 이종 질환에서 성립된다. 레플리킨의 존재는 이후 효모, 조류, 식물, 말라리아, 인플루엔자, 게미니 잎마름 토마토 바이러스, HIV 및 암과 같은 다른 종류의 유기체에서 빠른 복제의 현상과 관련이 있다.
빠르게 복제하는 유기체에서 레플리킨의 존재를 검출하는 것 이외에, 1) 레플리킨 농도(단백질 중의 또는 게놈에 엔코팅된 100개의 아미노산 당 레플리킨의 수), 및 2) 빠른 복제에 의존적인 특이적 작용 상태에서의 레플리킨 조성물은, 레플리킨이 이들이 존재하는 유기체의 복제 속도에 대해 정성적으로 뿐만 아니라 정량적으로 관련이 있다는 발견에 대한 근거를 제공함을 발견하였다. 이러한 기능적 증거의 예는 교아세포종 세포에서 빠른 복제와 독성 간, 인플루엔자 바이러스에서의 레플리킨과 인플루엔자 광역 유행병 및 전염병의 예측 간에 발견된 관련성, 및 HIV에서 레플리킨 농도와 빠른 복제 간의 관련성을 포함한다.
레플리킨 서열, 및 특히 레플리킨 서열의 모티프의 규정하는 구성성분은 빠르게 복제하는 바이러스 및 유기체에서, 및 복제와 관련된 단백질에서 시간에 따라 보존됨을 발견하였다. 레플리킨 서열이 보존되기 때문에, 이들은 감염원의 검출을 위한 일관된 타겟을 제공한다. 이러한 레플리킨의 보존은 또한 레플리킨 구조 자체가 존재하고 보존되는 이러한 바이러스 및 유기체에서의 복제 및 생존에 역할을 한다는 증거를 제공한다. 이와 같이, 감염원 내에 동정된 레플리킨은 이러한 감염원에 대해 치료 및 백신의 개발을 위한 우수한 타겟이다.
레플리킨 스캐폴드는 레플리킨의 서브-세트이다. 레플리킨 스캐폴드 펩티드는 감염원에 고도로 보존되는 것으로 나타나며, 빠른 복제, 독성 및 숙주 사망률과 관련이 있다. 레플리킨 스캐폴드 펩티드는 약 16 내지 약 30개의 아미노산을 포함하고, (1) 임의적으로, 말단 라이신에 접하여 인접한 추가 라이신을 포함한 말단 라이신; (2) 말단 히스티딘, 및 말단 히스티딘에 접하여 인접한 히스티딘; (3) 다른 라이신으로부터의 라이신 6 내지 10개의 아미노산 잔기; 및 (4) 적어도 6% 라이신을 추가로 포함하며, 여기서, 레플리킨 스캐폴드 펩티드는 시간에 따른 바이러스 또는 유기체의 개개의 분리물, 지리적 공간 또는 전염병학적 발생내에 동정되거나 예를 들어 유전적 이동을 통한 유전 정보를 공유하는 상이한 바이러스 또는 유기체에서 동정된 일련의 보존된 레플리킨 펩티드의 구성원이다.
상술된 바와 같이, 발견된 첫 번째 레플리킨은 신경교종 레플리킨이며, 이는 말리그닌(malignin)이라 불리우는 뇌 교아세포종 다형(신경교종) 세포 단백질에서 동정된다[참조, 미국특허번호 7,189,800]. 신경교종 레플리킨은 정상의 건강한 인 간 게놈에 존재하는 것으로 알려지지 않았다. 신경교종 레플리킨의 동족체에 대해 조사하기 위해 고안된 알고리즘은 동족체가 4,000 단백질 서열에서 공통되지 않음을 나타내었다. 그러나, 놀랍게도, 동족체는 모든 종양 바이러스에서 및 조류, 식물, 균류, 바이러스 및 박테리아의 복제하는 단백질에서 발견되었다[참조, 미국특허출원번호 10/189,437(2002년 7월 8일 출원)]. 이와 같이, 바이러스 및 유기체의 너비에 걸쳐 레플리킨의 존재는 복제 기능 및 빠른 복제와 관련이 있다.
빠르게 복제하는 바이러스 및 유기체 및 복제-관련 단백질의 보다 광범위한 검토 하에, 게놈, 단백질 또는 단백질 단편 중의 100개의 아미노산 당 레플리킨의 수가 빠른 복제의 기능적 현상과 관련성이 있음을 발견하였다[참조, 미국특허출원번호 10/189,437].
레플리킨 농도와 빠른 복제 간의 상관관계는 추가로 지난 100년에 걸친 인플루엔자 급증에 대한 전염병학적 데이터와 인플루엔자 바이러스 적혈구 응집소 단백질(hemagglutinin protein)의 아미노산 서열의 비교에서 증명되었다. 이러한 비교는 1902에서 2001년 사이에 인플루엔자의 4개의 주요 스트레인 각각 중 하나에 의해 야기된 인플루엔자 전염병에서 스트레인-특이적 인플루엔자 레플리킨의 농도의 4배 내지 10배 증가를 나타내었다. 인플루엔자의 4개의 주요 스트레인은 인플루엔자 B, (A)HIN1, (A)H2N2 및, (A)H3N2이다. 이후 농도의 증가가 이의 소멸하고 1 내지 64년 후에 하나 이상의 특정 레플리킨 조성물의 재현과, 신규한 스트레인-특이적 레플리킨 조성물의 출현으로 기인함을 증명하였다[참조, 미국특허출원번호 10/860,050].
레플리킨 아미노산 구조는 비-레플리킨 아미노산과 동일한 정도로 돌연변이되거나 변경되지 않는 것으로 관찰되었다. 레플리킨 구조는 바이러스 및 유기체에서, 및 바이러스와 유기체 사이에서 시간에 걸쳐 보존된다. 이러한 보존은 레플리킨 구조가 생존에서 중요함을 나타낸다. 이와 같이, 보존된 레플리킨 구조는 감염증 또는 악성 종양의 동정 및 치료를 위해 유용한, 생존과 관련된 신규한 불변의 타겟을 제공한다.
레플리킨은 박테리아, 바이러스, 식물 및 악성 종양을 포함한 바이러스 및 유기체의 범위에서 보존되는 것으로 나타난다. 생존 기능과 매우 밀접하게 관련된 특정 구조가 명확하게 일정하게 변경할 수 없기 때문에, 박테리아, 바이러스, 식물 및 다른 유기체에 걸친 보존된 레플리킨 구조는 레플리킨이 상세하게는 생존 기능에 포함된다고 제안한다.
레플리킨이 보존되거나 대신에 광범위한 자연 돌연변이를 수행하는지의 여부의 고려사항은 구제역 바이러스(FMDV)의 여러 분리물의 단백질 서열을 스캐닝함으로써 시험되었으며, 여기서 이러한 바이러스의 단백질에서의 돌연변이는 10년 동안 전세계에서 널리 제공되었다. FMDV 분리물의 단백질 서열은 특정 레플리킨에서 관찰된 전체 레플리킨 및 구성성분 레플리킨 아미노산 잔기 각각 모두의 존재에 대해 시각적으로 시험되었다. 이웃 아미노산에서 발생됨에 따라 시간에 따른 광범위한 치환을 수행하는 것보다는 오히려, 레플리킨 구조를 포함한 아미노산은 거의 치환되지 않거나 전혀 치환되지 않는 것으로 관찰되었으며, 즉 레플리킨 구조는 비-레플리킨 서열과 비교하여 보존되었다. 유사한 서열 보존은 식물에서, 예를 들어 밀 우비퀴틴(ubiquitin) 활성 효소 E에서 및 HIV의 분리물에서의 트랜스-활성자 (Tat) 단백질에서 관찰되었다[참조, 미국특허출원번호 10/860,050].
임의의 구조의 보존은 구조가 공격하고 파괴하거나 자극하기 위해 안정한 불변의 타겟을 제공하는 지의 여부에 중요하다. 구조가 몇몇 방식에서 유기체의 기본적 생존 메카니즘와 관련이 있기 때문에, 구조는 보존되는 경향이 있다. 다양한 구조는 변하기 쉬운 타겟을 제공하며, 이는 공격체, 에를 들어 이전 구조에 대해 특이적으로 발생되고 이에 따라 개질된 형태에 대해 효과적이지 않은 항체를 방어하기 위한 양호한 전략이다. 이러한 전략은 인플루엔자 바이러스에 의해 사용되어, 예를 들어, 종래 백신이 현재 치명적인 바이러스에 대해 상당히 효과적이지 않을 수 있도록 한다.
레플리킨 구조의 필수적인 구성성분은 히스티딘(h)이며, 이는 산화환원 효소에서 금속기에 대한 이의 빈번한 결합 및 복제를 위해 필요한 에너지원을 제공함에 있어서 이의 가능한 기능에 대해 알려져 있다. 시간에 따른 레플리킨 서열의 검토는 레플리킨에서의 히스티딘 구조가 일정하게 유지됨을 제시한다. 이와 같이, 레플리킨 구조는 바이러스 또는 유기체의 복제의 파괴를 위한 더욱이 매력적인 타겟을 유지시킨다.
레플리킨-함유 단백질은 또한 종종 산화환원 기능, 및 단백질 합성 또는 신장, 뿐만 아니라 세포 복제와 관련이 있다. 금속-계열 산화환원 기능과의 관련성, 혐깃ㅇ 복제 동안 레플리킨-함유 신경교종 말리그닌 농도의 농축, 및 저농도(피코그램/세포)에서 항말리그닌 항체의 세포독성 모두는 레플리킨이 중추 호흡 생존 기 능과 관련이 있음을 제안하고 있으며, 이는 보다 덜 종종 비-레플리킨 아미노산의 돌열변이 특징으로 수행되는 것으로 밝혀졌다[참조, 미국특허출원번호 10/860,050].
빠르게 복제하는 바이러스 및 유기체에서, 상관관계는 바이러스 또는 유기체에 존재하는 레플리킨 서열의 복제 속도와 농도 간에 성립된다. 100개의 아미노산 내에 레플리킨 서열의 농도는 바이러스 또는 유기체의 레플리킨 카운트라 칭한다. 인플루엔자 바이러스에서, 레플리킨 카운트의 증가는 지난 100년에 걸쳐 인플루엔자 전염병과 관련이 있었다.
예를 들어, 적혈구 응집소 단백질에서 스트레인-특이적 레플리킨 농도와 인플루엔자 전염병 및 광역 유행병의 정량적 상관관계는 성립된다(도 6). 지난 세기의 3회의 인플루엔자 광역 유행병 각각에서, H1N1, H2N2 및 H3N2, 광역 유행병은 레플리킨의 증가에 의해 소급적으로 예측되고 이와 관련이 있다[도 6 내지 8 및 10 내지 11]. 레플리킨 카운트의 증가는 또한 4회의 H5N1 전염병, 즉 1997, 2001, 및 2003-2004(도 11) 및 2006년의 전염병 각각에 예측되었다. 인플루엔자 전염병과 스트레인-특이적 바이러스 단백질 화학과의 상관관계를 이후에 보고되기 전까지 이전에 보고된 바 없다.
스트레인-특이적 전염병의 발생 전 1 내지 3년 전에 인플루엔자 그룹의 스트레인-특이적 레플리킨 카운트의 증가의 발견과 유사하게, 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 중의 레플리킨 카운트의 증가는 2003년의 SARS 광역 유행병을 소급적으로 예측함을 발견하였다. 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 레플리킨 카운트는 하기와 같이 증가하였다: 1999년에 3.1 (±1.8); 2000년에 3.9(±1.2); 2001년에 3.9 (±1.3); 및 2002년에 5.1 (±3.6). 이러한 광역 유행병 이전의 증가는 레플리킨 부유 코로나바이러스가 2003년의 SARS 광역 유행병의 원인이라는 발견을 지지한다[참조, 도 8].
HIV 바이러스에서의 레플리킨 카운트는 또한 빠른 복제 및 독성과 관련이 있다. HIV 분리물에서, HIV의 느린-성장 낮은-역가 스트레인((NSI, “Bru,”이는 초기 단계 HIV 감염증에서 널리 퍼져있다)는 100개의 아미노산 당 1.1개 (+/- 1.6) 레플리킨의 레플리킨 농도를 갖지만, HIV의 빠른-성장 높은-역가 스트레인(S1, “Lai,” 이는 말기 단계 HIV 감염증에서 널리 퍼져있다)는 100개의 아미노산 잔기 당 6.8개 (+/- 2.7) 레플리킨의 레플리킨 농도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 중국 및 세계의 수많은 다른 지역에서 토마토 수확물을 황폐화시키는 토마토 잎마름 게미니 바이러스는 레플리킨의 중첩으로 인해 높은 레플리킨 카운트를 갖는 것으로 나타났다. 토마토 잎마름 게미니 바이러스의 레플리킨 카운트는 100개의 아미노산 당 20.7개의 레플리킨 정도로 높게 도달되는 것으로 관찰되었다.
래플리킨 스캐폴드는 인플루엔자 바이러스의 스트레인에서 초기에 동정된 레플리킨 부류의 서브-세트이다. 레플리킨 스캐폴드는 인플루엔자의 치명적인 스트레인에서 고도로 보존된다. 레플리킨 및 레플리킨 스캐폴드는 빠른 복제 및 독성과 관련이 있으며, 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인에서의 레플리킨의 존재 및 농도는 다가올 인플루엔자 전염병을 예측하기 위해 사용된다. 당해 분야에는 증가된 독성 및 숙주 사망률을 초래하는 레플리킨 또는 레플리킨 스캐폴드 내서의 작은 변화를 식별하는 방법이 필요하다. 부가적으로 당해 분야에는 인플루엔자의 고도로 치명적인 스트레인의 처리를 위한 타겟인 보존된 레플리킨 및 레플리킨 스캐폴드 서열이 필요하다. 더욱이 당해 분야에는 인플루엔자의 출현 스트레인에서의 백신 및 다른 치료법의 제조를 위해 유용한 레플리킨 및 레플리킨 스캐폴드 아미노산 서열이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 16개 내지 30개의 아미노산으로 구성되고, 추가로
(1) 말단 라이신 및 선택적으로 말단 라이신에 인접한 라이신;
(2) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 인접한 히스티딘;
(3) 다른 라이신으로부터 6 내지 10개의 아미노산 잔기 떨어져 위치한 라이신; 및
(4) 적어도 6% 라이신을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인으로부터의 실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드에 있어서,
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드는 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 서열과 비교하여 아미노산의 치환을 함유하고, 상기 아미노산 치환은 히스티딘의 치환이 아니며,
인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 서열은
(1) 16 내지 30개의 아미노산으로 구성되고;
(2) 말단 라이신 및 선택적으로 말단 라이신에 인접한 라이신;
(3) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 인접한 히스티딘;
(4) 다른 라이신으로부터 6 내지 10개의 아미노산 잔기 떨어져 위치한 라이신; 및
(5) 적어도 6% 라이신을 포함하며,
치환은 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인에 추가적으로 존재하며, 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인에서 치환의 존재는 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가와 상관관계를 지니고 있으며,
인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인은
(1) 16 내지 30개의 아미노산으로 구성되고;
(2) 말단 라이신 및 선택적으로 말단 라이신에 인접한 라이신;
(3) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 인접한 히스티딘;
(4) 다른 라이신으로부터 6 내지 10개의 아미노산 잔기 떨어져 위치한 라이신; 및
(5) 적어도 6% 라이신을 포함하는 레플리킨 서열을 함유하는, 레플리킨 펩티드를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 서열에서 상이한 아미노산 잔기로 치환된 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 서열에서의 아미노산 잔기는 말단 히스티딘으로부터의 5개의 아미노산 잔기에 위치된다.
다른 바람직한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 서열에서의 아미노산 잔기는 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 분리된 레플리킨 서열에서 루신 이외의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 바람직한 구체예에서, 아미노산은 임의의 소수성 아미노산, 즉 메티오닌, 이소루신, 트립토판, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 프롤린 또는 발린으로 치환된다. 다른 바람직한 구체예에서, 아미노산은 메티오닌 또는 이소루신으로 치환된다. 다른 바람직한 구체예에서, 분리된 레플리킨 서열은 H5N1 인플루엔자 바이러스로부터 분리된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 인플루엔자 바이러스 레플리킨 스캐폴드 펩티드를 포함하는 백신을 제공한다. 또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 인플루엔자 바이러스 레플리킨 스캐폴드 펩티드에 대한 항체를 제공한다.
본 발명은 추가로 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인으로부터 실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드로서,
상기 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인은 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인 (emerging strain)이며,
실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드는 7개 내지 약 50개의 아미노산을 포함하고,
(1) 상기 레플리킨 펩티드의 첫 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기 및 상기 레플리킨 펩티드의 두 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기 또는 하나 이상의 히스티딘 잔기;
(2) 두 번째 라이신 잔기로부터의 6 내지 10개의 잔기 떨어져 위치된 첫 번째 라이신 잔기;
(3) 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(4) 적어도 6% 라이신 잔기로 이루어진 모티프를 동정하고, 동정된 모티프를 선택하고, 상기 동정된 모티프를 포함하는 레플리킨 펩티드를 분리시킴으로써 분리되며,
동정된 모티프의 말단 잔기들 사이의 레플리킨 펩티드 서열에 위치된 하나의 아미노산에서의 치환은 상기 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인에서의 다른 동일한 서열과 비교하여 발생하며, 라이신 또는 히스티딘은 치환되지 않으며,
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 동정된 모티프의 말단 잔기들 사이의 상기 치환은 두 번째 스트레인과 비교하여 빠른 복제 및 증가된 독성과 서로 관련이 있는 레플리킨 펩티드를 제공한다. 본 발명은 추가로 인플루엔자의 H5N1 스트레인에서 분리된 인플루엔자 레플리킨 펩티드를 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 인플루엔자 레플리킨 펩티드를 포함한 백신을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 분리된 인플루엔자 레플리킨 펩티드에 대한 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 약 29개의 아미노산을 포함하는 본 발명의 분리된 레플리킨 펩티드를 제공한다. 분리된 레플리킨 펩티드는 아미노산 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH (서열번호: 1)을 포함할 수 있으며, 여기서 [S]는 루신 이외의 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직한 구체예에서, [S]는 루신 이외의 다른 아미노산일 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, [S]는 메티오닌, 이소루신, 트립토판, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 프롤린 또는 발린을 포함한 임의의 소수성 아미노산일 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, [S]는 메티오닌 또는 이소루신일 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 분리된 인플루엔자 레플리킨 펩티드는 인플루엔자의 H5N1 스트레인으로부터 분리된다.
본 발명은 또한 상술된 임의의 하나 이상의 분리된 서열, 또는 이의 항원성 서브서열, 또는 임의의 상술된 분리된 서열, 또는 이의 항원성 서브서열에 결합하는 항체를 포함한 백신을 제공한다.
본 발명은
(1) 다수의 레플리킨 스캐폴드 펩티드를 포함하는 인플루엔자 바이러스 레플리킨 스캐폴드를 동정하는 단계로서, 레플리킨 스캐폴드가 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인으로부터 분리된 첫 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드, 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인으로부터 분리된 두 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드, 및 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인으로부터 분리된 세 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드를 포함하는 단계;
(2) 두 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드와 비교하여 치환된 세 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드에서 하나의 아미노산을 동정하는 단계로서, 상기 치환된 아미노산이 히스티딘이 아닌 단계,
(3) 인플루엔자의 세 번째 스트레인이 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 증가된 복제, 독성 또는 숙주 사망률을 나타냄을 결정하는 단계,
(4) 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 세 번째 레플리킨 스캐폴드에 치환된 아미노산 잔기가 또한 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 첫 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드에 치환됨을 결정하는 단계,
(5) 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 카운트를 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 조기-발생 분리물의 레플리킨 카운트와 비교하는 단계,
(6) 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 카운트가 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 조기-발생 분리물의 레플리킨 카운트 보다 큰 것을 결정하는 단계, 및
(7) 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인에서의 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 단계를 포함하여, 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인에서 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 첫 번째 레플리킨 스캐폴드에서 치환된 아미노산 잔기는 두 번째 레플리킨 스캐폴드의 말단 히스티딘으로부터 5개의 아미노산 잔기이다. 다른 바람직한 구체예에서, 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 첫 번째 레플리킨 스캐폴드에서 치환된 아미노산 잔기는 루신 이외의 다른 임의의 아미노산 잔기이다. 다른 바람직한 구체예에서, 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 첫 번째 레플리킨 스캐폴드에서 치환된 아미노산 잔기는 루신 이외의 다른 소수성 아미노산이다. 다른 바람직한 구체예에서, 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 첫 번째 레플리킨 스캐폴드에서 치환된 아미노산 잔기는 메티오닌 또는 이소루신이다. 다른 바람직한 구체예에서, 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 레플리킨 스캐폴드는 29개 아미노산을 포함한다. 또다른 구체예에서, 독성의 증가는 광역 유행병을 지시하는 것이다.
본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스의 출현한 첫 번째 스트레인으로부터 레플리킨 펩티드를 동정하는 단계,
인플루엔자 바이러스에서 동일한 서열의 상기 치환을, 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인에서의 빠른 복제 및 증가된 독성을 갖는 인플루엔자 바이러스와 대비하는 단계, 및
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 독성의 증가를 예측하는 단계를 포함하여, 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인의 독성 증가를 예측하는 방법으로서,
상기 인플루엔자 바이러스 레플리킨 펩티드는 7 내지 약 50개의 아미노산으로 이루어지며,
상기 인플루엔자 바이러스 레플리킨 펩티드는
(1) 상기 분리된 레플리킨 펩티드의 첫 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기 및 상기 분리된 레플리킨 펩티드의 두 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기 또는 하나 이상의 히스티딘 잔기;
(2) 두 번째 라이신 잔기로부터의 6 내지 10개의 잔기가 위치된 첫 번째 라이신 잔기;
(3) 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(4) 적어도 6% 라이신 잔기로 이루어진 모티프를 포함하며,
모티프의 말단 잔기들 사이의 아미노산에서의 치환은 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인에서 동일한 서열과 비교하여 발생하며, 라이신 또는 히스티딘은 치환되지 않는 방법을 제공한다.
또다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인에서 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 방법은 컴퓨터를 이용하여 수행된다.
발명의 상세한 설명
정의
본원에서 사용되는 레플리킨 펩티드 또는 레플리킨 단백질은 (1) 두 번째 라이신 잔기로부터 6 내지 10개의 아미노산 잔기에 위치된 하나 이상의 라이신 잔기; (2) 하나 이상의 히스티딘 잔기; (3) 적어도 6% 라이신 잔기를 포함하는 7 내지 약 50개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열이다. 유사하게는, 레플리킨 서열은 레플리킨 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열이다.
본원에서 사용되는 "레플리킨 스캐폴드"는 일련의 보존된 레플리킨 펩티드를 칭하는 것으로서, 여기서 상기 레플리킨 펩티드 서열 각각은 약 16 내지 약 30개의 아미노산을 포함하며, 추가로 (1) 말단 라이신 및 임의적으로 말단 라이신에 접하여 인접한 라이신; (2) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 접하여 인접한 히스티딘; (3) 다른 라이신 잔기로부터의 6 내지 10개의 아미노산 잔기인 라이신 잔기; (4) 적어도 약 6% 라이신을 포함한다. "레플리킨 스캐폴드"는 또한 일련의 "레플리킨 스캐폴드"의 개개 구성원 또는 다수의 구성원을 칭한다.
본원에서 사용되는 "조기-발생" 바이러스 또는 유기체는 바이러스 또는 유기체의 다른 표본에서 수집된 데이터 이전의 데이터에서 바이러스 또는 유기체의 천연 소스로부터 수집된 바이러스 또는 유기체의 표본이다. "후기-발생" 바이러스 또는 유기체는 바이러스 또는 유기체의 다른 표면에서 수집된 데이터에 후속한 데이터에서 바이러스 또는 유기체의 천연 소스로부터 수집된 바이러스 또는 유기체의 표본이다.
본원에서 사용되는 "출현 스트레인"은 바이러스의 스트레인의 조기-발생 분리물에서 또는 바이러스의 다른 스트레인에서 레플리킨 서열의 증가된 또는 증가하는 농도를 갖는 것으로 식별된 바이러스의 스트레인을 칭한다. 인플루엔자 바이러스에서 증가된 또는 증가하는 농도의 레플리킨은 적어도 약 6개월의 기간에 걸쳐, 및 바람직하게는 적어도 약 1년의 기간에 걸쳐, 가장 바람직하게는 적어도 약 3년 이상의 기간에 걸쳐 일어나지만, 매우 짧은 시간에 일어날 수 있다.
본원에 기술된 레플리킨의 "작용성 유도체"는 레플리킨의 분절, 변형체, 유사체, 또는 화학적 유도체이며, 이는 레플리킨에 대해 특이적인 항체와 적어도 일부의 면전염병학적 교차 반응성을 유지시킨다. 레플리킨 펩티드의 분절은 분자의 임의의 서브세트를 칭한다. 변형체 펩티드는 예를 들어 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 직접 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 레플리킨의 유사체는 전체 단백질 또는 이의 분절과 실질적으로 유사한 비-천연 단백질을 칭한다. 레플리킨의 화학적 유도체는 추가적인 화학적 부분을 함유한다.
본원에서 사용되는 "동족체"는 제공된 레플리킨내에서의 모든 아미노산의 퍼센트로서, 이들의 "정의한" 아미노산에 의해 유지되는 위치에서, 레플리킨 구조, 즉 라이신 및 히스티딘을 규정하는 아미노산에 대해 결정적이고, 이전 적용에서 HIV TAT 단백질에 대해 도시된 바와 같이, 레플리킨 구조내에 다른 아미노산에 대해 모든 위치에서 덜 중요하거나 전혀 중요하지 않으며; 보존은 이러한 비교적 불변의 "정의한" 아미노산의 측면에서 정의되며; "정의한" 아미노산과는 다른 특징적 변형 또는 치환은 본 출원의 대상이며, 여기서 이는 기본 레플리킨 스캐폴드의 서브-세트를 나타내는 제공된 기능으로 반복함으로써, 비-무작위인 것으로 보여지고 본원에서 광역 유행병의 예와 관련 있으며, 이전의 생각과 같이 현저하지 않는다.
본원에서 사용되는 "돌연변이"는 아미노산의 치환에 의해 야기되는 유기체의 구조 및 성질의 변화를 칭한다. 반대로, 본원에서 사용되는 용어 "보존," "보존된" 또는 관련된 단어는 치환의 결여로 인한 특정 아미노산의 보존을 칭하는 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "펩티드" 또는 "단백질"은 하나의 아미노산의 카르복실기가 다른 아미노산의 아미노기와 단일화되어 펩티드 결합을 형성하는 두개 이상의 아미노산의 화합물을 칭하는 것이다. 용어 펩티드는 이러한 화합물을 인코딩하는 아미노산 서열을 나타내기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 "분리된" 또는 "합성된" 펩티드 또는 이의 생물학적 활성 부분은 정제 후 실질적으로 세포 물질이 존재하지 않거나 세포 또는 펩티드가 유래되는 것으로부터의 조직원로부터 다른 오염 단백질 또는 펩티드가 실질적으로 존재하지 않거나, 임의의 방법에 의해 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 실질적으로 존재하지 않거나, 재조합 유전자 기술에 의해 합성되는 경우 오염 펩티드로부터 실질적으로 존재하지 않는 펩티드를 칭한다. 분리는 생체내, 시험관내에서, 및 현재 단백체학 소프트웨어 방법 "인 실리코(in silico)"에 의해 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 "레플리킨 카운트" 또는 "레플리킨 농도"는 단백질 또는 유기체에서 100개의 아미노산 당 레플리킨의 수를 칭하는 것이다. 바이러스 또는 유기체의 첫 번째 스트레인에서의 보다 높은 레플리킨 카운트는 보다 낮은 레플리킨 카운트를 갖는 바이러스 또는 유기체의 두 번째, 조기- 또는 후기-발생 스트레인과 비교하여 첫 번째 바이러스 또는 유기체의 보다 빠른 복제와 관련이 있음을 발견하였다.
I. 인플루엔자 전염병 및 광역 유행병과 관련된 증가된 레플리킨 카운트
지난 100년에 걸친 인플루엔자 바이러스 단백질 서열 및 인플루엔자 전염병학과 관련한 본 연구는 인플루엔자에서 증가된 복제 및 독성을 예측하는 방법을 제공하는 것이다. 인플루엔자 바이러스 적혈구 응집소 단백질 서열로부터의 역사적 및 현재의 데이터의 검토는 1902에서 2001년까지 인플루엔자 전염병과 관련된 스트레인에서 인플루엔자의 4개의 주요 스트레인 중 하나, 즉, 인플루엔자 B, (A)HIN1, (A)H2N2 and (A)H3N2에서의 스트레인-특이적 인플루엔자 레플리킨 농도에 있어서 4배 내지 10배의 증가를 나타낸다. 전염병과 관련된 적혈구 응집소 단백질에서의 레플리킨 농도의 증가는 추가로 이의 소멸 후 1 내지 64년 내에 하나 이상의 특이적 레플리킨 조성물의 재발, 및 신규한 스트레인-특이적 레플리킨 조성물의 출현으로 기인한 것으로 밝혀졌다.
인플루엔자 게놈에서 레플리킨의 발견 이전에, 단지 혈청학적 적혈구 응집소 및 항체 분류는 이전에 인플루엔자에 기재되었다. 스트레인-특이적 보존된 펩티드 서열은 어디에도 기재되어 있지 않았다. 임의의 스트레인-특이적 펩티드 서열의 농도 및 조성의 변화는 전염병학적으로 기록된 전염병 및 빠른 복제와 관련된 것으로 기재하고 있지 않다. 이와 같이, 다가오는 인플루엔자 시즌에 두드러지는 스트레인을 예측하거나 백신에 대한 전체-바이러스 스트레인의 연간 혼합물을 고안하기 위한 스트레인-특이적 화학적 구조물은 알려진 바가 없다.
높은 정도의 레플리킨 구조의 보존이 관찰되었으며, 이에 의해 도일한 구조는 100년 동안 잔존할 수 있거나, 1년에서 64년 까지 부재 후에 재발하지만, 이는 인플루엔자 단백질에서 아미노산의 무작위 치환으로 기인한 변화인 것으로 이전에 생각된 것은 레플리킨의 보존의 유기화된 공정으로 기인한 변화인 것으로 여겨짐을 지시한다.
역사적 데이터의 측면에서, 인플루엔자에서의 레플리킨 농도 증가의 모니터링은 미래의 전염병을 예측하기 위한 도구를 제공한다. 이러한 도구는 여러 최근 인플루엔자 급증을 효과적으로 예측한다. 예를 들어, 최근에는 H3N2’의 히스토리에서 가장 큰, H3N2 레플리킨 농도 (1997년에서 2000년), 및1968년의 높은 사망률 H3N2 광역 유행병에서 보여진 특이적 레플리킨 조성물의 재발, 및 1975년 및 1977년의 두번의 높은 사망률에서 급격하게 증가하였지만, 20-25년 동안 부재되었다가 2002년에 H3N2 전염병을 함께 예측하였다.
인플루엔자 B, H1N1, H2N2 및 H3N3에서의 광역 유행병
특히 고려되는 것 중에, 본 출원인은 100개의 아미노산 당 하나 이상의 레플리킨이 시험되는 인플루엔자 바이러스의 개개 스트레인의 거의 모두의 적혈구 응집소 단백질에 존재함을 관찰하였다. 아미노산 서열 데이터가 이용가능한(1902-2001) 각 해에 대해, 인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 B, H1N1, H2N2, 및 H3N2의 4개의 널리 퍼진 스트레인 각각의 분리물의 적혈구 응집소 단백질에서 발생하는 것으로 관찰된 레플리킨 서열은 도 13, 14, 15 및 16에 나타내었다.
각 인플루엔자 A 스트레인은 1918, 1957, 및 1968년 각각에 하나의 광역 유행병의 원인이 되었다. 도 6 및 7에서의 데이터는 100개 아미노산 당 하나 이상의 레플리킨이 시험된 4개의 공통의 인플루엔자 바이러스의 모든 분리물의 인플루엔자 적혈구 응집소 단백질 각각에 존재함을 나타내었으며, 이는 복제의 생존 수준의 유지에서 레플리킨이 작용함을 제시하는 것이다. 1990년에, H3N2 스트레인의 쇠퇴 동안, H3N2의 수많은 분리물에 레플리킨이 존재하지 않았지만, 고농도의 신규한 레플리킨이 H3N2 분리물에 나타났으며, 이는 H3N2(R)의 출현을 규정하는 것이다[도 16 참조].
레플리킨 농도의 여러 성질은 도 6 및 도 7에서 4개의 모든 인플루엔자 바이러스 스트레인에 대해 공통인 것으로 나타났다. 첫째, 농도는 매년 순환적이고, 상승 및 하강의 단일 사이클은 2 내지 3년의 시기에 걸쳐 일어난다. 이러한 상승 및 하강은 적혈구 응집소 및 뉴라미니다제 분류에 의한 개개의 인플루엔자 바이러스 스트레인 지배의 공지된 증대 및 감쇠와 일치한다.
둘째, 이전에 광역 유행병의 원인인 것으로 보여지는 각 인플루엔자 바이러스 스트레인의 최대 레플리킨 농도는 상세하고 개별적으로 각각의 3년의 광역 유행병과 관련이 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 스트레인, H1N1가 원인이 되는 것으로 보여지는 1918년의 광역 유행병에 대해, H1N1에서의 레플리킨의 최대 농도는 독립적으로 일어났으며(P1); H2N2가 출현하고 이의 원인이 되는 것으로 보여지는 1957년의 광역 유행병에 대해, H2N2에서의 레플리킨의 최대 농도가 일어났으며(P2); H3N2가 출현하고 광역 유행병의 원인인 것으로 보여지는 1968년의 광역 유행병에 대해, H3N2에서의 레플리킨의 최대 농도가 이루어졌다(P3).
셋째, 상기 세가지 광역 유행병 각각 직후에 수년에, 특이적 레플리킨 농도가 현저하게 감소하였으며, 아마도 각 경우에 발생된 넓게 분포된 면역원성을 반영한 것이다. 따라서, 이러한 포스트-광역 유행병 쇠퇴는 원인이 되는 광역 유행병 (P1) 직후에 H1N1에 대해 특이적이며, 이러한 시점에 모든 스트레인의 일반적인 성질을 지니지 않는다. 인플루엔자 B에서의 레플리킨 농도의 증가는 H1N1, 예를 들어 1951년에 EB1 및 1976년에 EB2에서의 레플리킨 농도의 감소와 반복적으로 동시에 일어났으며, 둘 모두는 가장 높은 사망률을 갖는 인플루엔자 B 전염병과 관련이 있다[Stuart-Harris, et al., Edward Arnold Ltd. (1985)].
넷째, 농도의 첫 번째 피크 증가를 초과하는 두 번째 피크 농도는 세가지 광역 유행병 각각 이후 15년 후에 발생하였으며, 이러한 두 번째 피크는 전염병에 의해 수반되었다: H1N1 '전염병' 해에 1918년 전염병 이후 15년 (E1); H2N2 '전염병' 해에 1957년 전염병 이후 8년 (E2); 및 H3N2 '전염병' 해에 1968년 전염병 이후 7년 (E3). 특정 레플리킨의 이러한 두 번째 피크 농도는 스트레인의 재생을 반영할 수 있다.
다섯째, 각 스트레인의 특정 레플리킨 농도의 피크는 종종 다른 하나의 스트레인 또는 둘모두의 스트레인의 레플리킨 농도의 감소와 관련되는 것으로 나타나는데, 이는 숙주 사이트에 대한 스트레인들 간의 경쟁을 제시한다. 여섯째, 각 스트레인의 레플리킨 농도가 35년(H2N2)에서 60년(인플루엔자 B)의 시기에 걸쳐 감소하는 명확한 전체적 경향이 존재한다. 이러한 감소는 백신의 영향에 기인할 수 없는 것인데, 인느 인플루엔자 백신의 공동 사용 이전에 1940에서 1964년까지의 인플루엔자 B의 경우에서 명백하기 때문이다. 인플루엔자 B의 경우에, 감소로부터의 레플리킨 회복은 1965년 후에 일어난 것으로 보여지지만, 레플리킨 농도는 다시 1997과 2000년 사이에 감소된다(도 6). 이는 최근 경우의 분리물에서 인플루엔자 B의 낮은 발생과 관련이 있다. H1N1 레플리킨 농도는 H1N1 스트레인의 재발 및 유행과 함께 1978-1979에 최고였으며(도 6), 이후 H1N1 전염병과 동시에 1996년에 최고였다(도 6). H1N1 레플리킨 농도는 또한 1997년과 2000년 사이에 감소하였고, H1N1 스트레인의 존재는 이러한 해 동안 얻어진 분리물에서 감소되었다. H2N2 레플리킨에 대해, 35년 쇠퇴로부터의 회보근 발생하지 않았으며(도 7), 이는 최근 분리물로부터의 H2N2의 부재와 관련이 있다. H3N2에 대해, 많은 분리물의 레플리킨 농도는 1996년에서 2000년까지의 기간 동안 0으로 떨어졌지만, 다른 H3N2 분리물은 레플리킨 농도의 현저하고 급격한 증가를 나타내었다. 이는 H3N2의 서브스트레인의 출현을 지시하는 것으로서, 이는 본원에서 H3N2(R)로서 나타내었다.
상기에서 논의된 바와 같이, 도 6 및 7은 종종 1 내지 3년 동안의 단계적 증가가 레플리킨 농도가 최대값에 도달하기 전에 관찰됨을 나타내고 있다. 이러한 단계적 증가는 전염병의 발생에 선행하며, 이는 레플리킨 피크와 동시에 일어난다. 따라서, 특정 스트레인의 농도에서의 단계적 증가는 특정 스트레인이 전염병 또는 광역 유행병을 야기시키기 위한 가장 적당한 후보라는 신호이다.
인플루엔자 바이러스의 H3N2(R) 스트레인에서의 레플리킨 농도는 1997과 2000년 사이에 증가한 것으로 관찰되었다(도 7). 2002년에 얻어진 전염병은 전염병 전에 레플리킨 농도의 증가의 예측값을 나타내었다. H3N2 레플리킨 농도에서 3개의 유사한 종래 피크 증가는 1968년의 H3N2-계열 광역 유행병에서(도 7), 스트레인이 먼저 출현할 때, 및 1972년 및 1975년의 H3N2-계열 전염병에서(도 7) 일어난 것으로 보인다. 이러한 광역 유행병 및 전염병 각각은 과도한 사망률과 관련이 있다[Ailing, et al., Am J. Epidemiol.,113(1):30-43 (1981)].
그러므로 1997-2000에서의 H3N2 레플리킨의 H3N2(R) 서브종 농도의 빠른 상승은 접근하는 심각한 전염병 또는 광역 유행병의 조기 경보를 통계적으로 나타낸다. 에측은 H3N2 전염병이 2000년에 러시아에서 발생함을 정확하게 나타내었으며(도 7, E4); 2001년 12월의 CDC 리포트는 2001년에, H3N2가 전세계의 인플루엔자 바이러스의 대부분 종종 분리된 스트레인임을 기술하였다[Morbidity and Mortality Weekly Reports (MMWR), Center for Disease Control; 50(48):1084-68 (Dec.7, 2001].
인플루엔자 바이러스 B의 스트레인에서의 레플리킨의 조성
인플루엔자 바이러스 B 스트레인에서 동정된 전체 26개의 레플리킨 중에서(도 13), 하기 10개의 레플리킨은 1940-2001년에 시험된 모든 인플루엔자 B 분리물에 존재한다. 중첩 레플리킨 서열을 별도로 기술하였다.
KSHFANLK (서열번호: 2)
KSHFANLKGTK (서열번호: 3)
KSHFANLKGTKTRGKLCPK (서열번호: 4)
HEKYGGLNK (서열번호: 5)
HEKYGGLNKSK (서열번호: 6)
HEKYGGLNKSKPYYTGEHAK (서열번호: 7)
HAKAIGNCPIWVK (서열번호: 8)
HAKAIGNCPIWVVKKTPLKLANGTK (서열번호: 9)
HAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAK (서열번호: 10)
HAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLK (서열번호: 11)
도 13 및 14는 H1N1 레플리킨과 비교하여 인플루엔자 B 적혈구 응집소에서 레플리킨 구조의 보다 큰 안정성을 지님을 지시한다. 인플루엔자 B는 임의의 광역 유행병의 원인이 아니며, 동물 또는 조류 저장소를 갖지 않는 것으로 나타난다[Stuart-Harris et al., Edward Arnold Ltd., London (1985)].
인플루엔자의 스트레인에서의 유전적 이동
인플루엔자 광역 유행병 또는 전염병의 각 경우에서, 신규한 레플리킨이 출현한다. 제공된 분리물에서의 제공된 적혈구 응집소에서 두개의 동일한 레플리킨이 관찰되지 않는다. 신규한 레플리킨의 출현 정도는 돌연변이 대 다른 동물 또는 알려지지 않은 조류(avian) 서식지로부터의 이동을 나타낸다. 매년 일부 경우에서, 하나 이상의 본래 레플리킨 구조는 보존되며 동시에, 신규한 레플리킨은 출현한다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 B 적혈구 응집소에서, 5개의 레플리킨은 1919년 및 2001년 사이에 일정하게 보존된 반면, 26개의 레플리킨은 동일한 시간 동안 변천되었다(일부는 여러 해의 부재 후에 재발하였다). 특정 레플리킨 구조의 소멸 및 재출현은 레플리킨이 노보(novo) 돌연변이를 통하는 것 보다 덜 다른 바이러스 숙주 서식지로부터 재발함을 제시한다.
상이한 인플루엔자 스트레인의 활성의 변화는 인플루엔자 적혈구 응집소의 서열 변화와 관련된 것으로 여겨지고 있으며, 이는 두개의 불충분하게 이해되는 공정 중 하나에 의해 달성되는 치환의 생성물이다: i) 적혈구 응집소 분자에서 일련의 포인트 돌연변이의 축적에 기인한 것으로 사료되는 항원성 편류, 또는 ii) 이러한 변화가 너무 커서 유전적 재배열이 인간 및 비-인간 숙주의 바이러스 간에 발생할 것으로 가정되는 항원성 이동. 첫째, 본 데이터는 상이한 인플루엔자 스트레인의 활성의 변화가 비-특이적 서열 변화와 관련된 것이기 보다는 스트레인-특이적 레플리킨의 증가된 농도 및 전염병과 관련된 복제에서의 스트레인-특이적 증가를 기초로 하거나 이와 관련됨을 제시한다.
또한, 본 데이터는 서열 변화가 "편류" 또는 "이동"에 기인하고, 보존, 보균체에 저장, 및 재발에 기인한다는 가능한 생각에 대해 시험되었다. 본 데이터는 레플리킨 농도의 전염병-관련 증가가 적혈구 응집소 당 존재하는 레플리킨의 복제에 기인한 것이 아니라 이의 소멸 후 1 내지 59년 내에 하나 이상의 레플리킨 조성물의 재발, 및 단지 A 스트레인에서, 신규한 스트레인-특이적 레플리킨 조성물의 출현에 기인함을 제시한다[도 13-16]. 따라서, 1951년 및 1977년의 인플루엔자 B 전염병에서 레플리킨 농도의 증가는 전염병 해에서의 신규한 레플리킨 조성물의 출현과 관련된 것이 아니라 단지 이전 해에 나타났다가 소멸한 레플리킨 조성물의 재발과 관련이 있다[도 13].
반대로, 종래 소멸된 바이러스 레플리킨의 재발 이외에 A 스트레인에 대하여, 신규한 조성물이 나타난다(예를 들어, 1996년의 전염병 해에서의 H1N1에서, 6개의 조기 레플리킨의 재발 이외에, 10개의 신규한 조성물이 출현하였다). 인플루엔자 B가 아닌 단지 A 스트레인이 비-인간 동물 및 조류 저장소에서 입수하기 때문에, 전체적으로 신규한 조성물은 아마도 레플리킨 알고리즘의 "3-포인트 인식"의 기본적인 요구사항과는 다른 신규한 조성물의 유사점을 지니지 않는 것으로 나타난 존재하는 인간 레플리킨의 돌연변이 보다는 비-인간 숙주 보균체로부터 유래된다. H1N1의 보다 큰 다산 특성은 B와 비교되며, 및 실제로 광역 유행병은 단지 세개의 A 스트레인에 의해 생산되며, B 스트레인에 의해 생산되지 않으며, 이 둘 모두는 또한 인간 A 스트레인의, 비-인간 바이러스 보균체로부터 신규한 레플리킨 조성물을 수용하는 능력의 기능을 지닐 수 있다.
일부 레플리킨은 단지 한 해에 나타나고, 사라졌으며, 최근에 재발하지 않았다[도 13-16]. 다른 레플리킨은 동일한 레플리킨이 재발할 때 1년에서 81년에 소멸되었다. 중요한 레플리킨 'k' 및 'h' 아미노산, 및 이들 사이의 공간은 하기 스트레인-특이적 레플리킨 및 부재 후 동일한 레플리킨의 재발에 대해 도 13-16에 도시된 바와 같이, 수년에 걸쳐 특정 레플리킨의 일정한 존재 동안 보존된다: 10개의 인플루엔자 B, 1개의 H1N1의 레플리킨, 및 1개의 H3N2의 레플리킨.
나머지 적혈구 응집소 서열에서 내측의 래플리킨 구조 및 이의 외측 모두에 다른 아미노산의 상당한 대체 또는 치환 활성에도 불구하고, 인플루엔자 레플리킨 히스티딘(h)은 전혀 대체되지 않는 것으로 나타나고, 라이신(k)은 드물게 대체된다. 이러한 보존의 예는 1918년에서 2000년 사이에 지속적으로 H1N1 레플리킨 "hp(v/i)tigecpkyv(r/k)(s/t)(t/a)k” (서열번호: 12)에서, 1975년에서 1998년 사이에 지속적으로 H3N2 레플리킨 "hcd(g/q)f(q,r)nekwdlf(v/i)er(s/t)k" (서열번호: 13)에서, 및 1975년에 최초로 나타나고, 25년 동안 사라진 후 2000년에 재발한 H3N2 레플리킨 "hqn(s/e)(e/q)g(t/s)g(q/y)aad(l/q)kstq(a/n)a(i/l)d(q/g)I(n/t)(g/n)k,(l/v)n(r/s) vi(e/c)k” (서열번호: 14)에서 나타난다. 많은 아미노산이 치환되지만, 대략 50개 이하의 아미노산에서 두개의 라이신, 6개 내지 10개의 떨어진 잔기, 1개의 히스티딘, 최소 6% 라이신의 기본 레플리킨 구조가 보존되었다.
전체적으로 무작위적인 치환은 이러한 H1N1 및 H3N2 레플리킨을 지속시키지 않거나 1902년부터 2001년까지 인플루엔자 B에서 10개의 레플리킨 구조를 지속시키지 않거나, 74년의 부재 후에 1919년의 18-머 레플리킨을 재발시키지 않는다. 무작위 타입의 치환 보다는, 항구성은 정렬되게 조절된 공정, 또는 최소한 중요한 레플리킨 잔기의 보호를 제안하여, 이들이 몇몇 방법으로 고정되거나 결합되도록 한다: 라이신은 아마도 핵산에 결합되고, 히스티딘은 아마도 호흡 산화환원 효소에 결합된다. 이러한 보존을 조절하는 메카니즘은 현재 알려지지 않았다.
II. 보존 및 유전적 편류는 백신 개발을 위한 조기 경보 메카니즘을 제공한다.
H1N1 레플리킨의 경우에, 1918 광역 유행병과 관련된 P1 피크에 존재하는 두개의 레플리킨은 1933의 회복 E1 피크에 존재하지 않으며, 이는 12개의 신규한 레플리킨을 함유한다. 그러므로, 단독 또는 조합한 끊임없이 보존되는 레플리킨은 백신을 위한 최고의 선택이다. 그러나, 심지어 최근에 나타나는 한해에 증가하는 레플리킨은 종종 잔존하고 추가적인 일년 이상 동안 추가로 증가하여, 농도 피크 및 전염병에서 최고점을 달하며, 이에 따라 조기 경보 및 합성 레플리킨으로 백신화하기 위한 시간 모두를 제공한다[예를 들어, 1990년 초기의 H1N1, 도 6; H5N1 1995-2002, 도 10 및 도 11].
도 7, 8, 10 및 11에서의 데이터는 인플루엔자 단백질 서열에서의 레플리킨의 존재 및 농도와 인플루엔자의 광역 유행병 및 전염병의 발생 간의 직접 상관관계를 나타낸 것이다. 따라서, 레플리킨의 존재 및 농도에 대한 인플루엔자 바이러스 적혈구 응집소 단백질 서열의 분석은 인플루엔자 광역 유행병 및/또는 전염병의 예측체, 뿐만 아니라 인플루엔자 백신 제형을 위한 타겟을 제공한다. 이전에 이러한 데이터와 관련하여 다가올 인플루엔자 시즌에 우세한 스트레인을 예측하고 백신을 위한 전체-바이러스 스트레인의 연간 혼합물을 고안하기 위한 어떠한 스트레인-특이적 화학 구조물도 알려지지 않음을 다시 참조하는 것은 가치가 있다.
스트레인-특이적 전염병 발생 1년 내지 3년 이전에 인플루엔자 그룹에서의 스트레인-특이적 레플리킨 카운트의 증가의 발견과 유사하게, 코로나바이러스 뉴클레오켑시드 단백질 중 레플리킨 카운트의 증가는 또한 식별된다. 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 중의 레플리킨 카운트는 하기와 같이 증가한다: 1999년에 3.1 (±1.8); 2000년에 3.9(±1.2); 2001년에 3.9 (±1.3); 및 2002년에 5.1 (±3.6). 이러한 사전-광역 유행병 증가는 코로나바이러스가 2003 SARS 광역 유행병의 원인임을 지지한다[참조, 도 8 및 표 3].
따라서, 레플리킨 구조 및 레플리킨 카운트의 모니터는 인플루엔자 및 코로나바이러스 스트레인 모두에서 관찰되는 바와 같이 1917-1918 거위 레플리킨 및 이의 개질되고 수반하는 레플리킨에 대해 합성적 스트레인-특이적 예방적 백신화 및 항체 치료법을 개발하기 위한 수단을 제공한다.
도 9는 단백질 서열이 1962년에서 2003년에 수집된 분리물에서 입수되는 뉴클레오캡시드 코로나바이러스 단백질의 자동화된 레플리킨 분석을 도시한 것이다. 각 개개의 단백질은 수탁번호로 표시되고 레플리킨의 존재에 대해 분석된다. 레플리킨 카운트(100개의 아미노산 당 레플리킨의 수)는 자동화된 레플리킨 분석의 일부로서 자동적으로 계산된다. 각 해에 대해, 한 해당 평균(± 표준편차 (S.D.)) 레플리킨 카운트는 그 해에 모든 레플리킨 카운트에 대해 자동적으로 계산된다. 전염병 전, 특정 바이러스 스트레인(코로나바이러스)에서의 특정 단백질(뉴클레오캡시드 단백질)의 복제 증가의 조기 경보의 예는 인플루엔자 전염병 및 광역 유행병에 선행하는 인플루엔자 바이러스의 스트레인에서 나타나는 증가와 비교가능하다[도 6, 7, 10 및 11]. 1999년에서 2002년까지 증가된 레플리킨 카운트는 2002년의 후반부에 출현하고 2003년까지 지속된 SARS 코로나바이러스 광역 유행병과 일치한다고 볼 수 있다. 도 8은 1917년에서 2002년까지 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 레플리킨을 포함한 여러 바이러스 스트레인에 대한 레플리킨 카운트의 그래프를 제공한다.
III. 인플루엔자에서의 레플리킨
단지 하나의 레플리킨 "hp(v/i)tigecpkyv-(r/k)(s/t)(t/a)k" (서열번호: 12)은 스트레인이 먼저 나타나고 그 해에 광역 유행병을 초래한 1918년에서 2000년에 입수한 모든 H1N1 분리물에 존재한다[도 14]("(v/i)"는아미노산 v 또는 i가 다른 해에 동일한 위치에 존재함을 지시한다). H1N1이 단지 하나의 지속성 레플리킨을 함유하지만, H1N1은 인플루엔자 B 보다 더욱 풍부한 것으로 나타난다. 인플루엔자 B 분리물 중 62년간의 단지 31개의 상이한 레플리킨에 대비하여 H1N1에 82년간의 95개의 상이한 레플리킨 구조가 존재한다[도 13 및 14]. 신규한 레플리킨 구조물의 수 증가는 전염병의 해에 발생하며[도 13-16], 증가된 전체 레플리킨 농도와 관련이 있다[도 6, 7, 10 및 11].
인플루엔자 H2N2 레플리킨: 인플루엔자 H2N2는1957년의 인간 광역 유행병의 원인이다. 1957년에 이러한 스트레인에서 동정된 20개의 레플리킨 중 세개는 1995년까지 PubMed에서 시험하기 위해 입수되는 H2N2 분리물 각각에 보존되었다[도 15].
ha(k/q/m)(d/n)ilekthngk (서열번호: 15)
ha(k/q/m)(d/n)ilekthngklc(k/r) (서열번호: 16)
kgsnyp(v/i)ak(g/r)synntsgeqmliiwq(v/i)h (서열번호: 17)
그러나, H1N1과 대조하여, 단지 13개의 추가 레플리킨은 1961년에 출현한 H2N2에서 발견되었다. 신규한 레플리킨의 발생의 이러한 결핍은 수년에 걸쳐 분리물 중에서의 H2N2 레플리킨의 농도 감소 및 H2N2의 발생과 관련이 있다[도 7].
인플루엔자 H3N2는 1968년의 인간 광역 유행병의 원인이다. 1968년에 나타난 5개의 레플리킨은 1977년 이후 소멸되었지만, 1990년에 재발하였다[도 16]. 22년 동안 지속된 레플리킨 구조는 단지 hcd(g/q)f(q/r)nekwdlf(v/i)er(s/t)k (서열번호: 13)이며, 이는1977년에 최초로 나타나고, 1998년까지 지속되었다. 1990년 중반에 12개의 신규한 H3N2 레플리킨의 출현[도 16]은 동시에 레플리킨 농도의 증가(도 7)와, 이러한 분리물 중 일부로부터의 모든 레플리킨의 동시 소멸과 함께 최근의 분리물에서 H3N2 스트레인의 유행[도 7]과 관련이 있으며, 이는 신규한 서브스트레인 H3N2(R)의 출현을 제시한다. 2003년 11월 12월에 H3N2 (복건성)의 신규한 스트레인의 전염병은 미국 가출원번호 60/303,396(2001년 7월 9일 출원)에서 먼저 이루어진 예측을 확증한다.
도 6, 7, 10 및 11은 인플루엔자 전염병 및 광역 유행병이 인플루엔자 바이러스 중의 레플리킨 농도의 증가와 관련이 있으며, 이는 이의 소멸 후 1 내지 59년까지 하나 이상의 레플리킨의 재발에 기인한 것이다. 또한, 단지 A 스트레인에서, 신규한 스트레인-특이적 레플리킨 조성물의 출현이 존재한다[도 14-16, 참조, 도 6 및 7에서 H5N1에 대한 신규한 레플리킨, 사전-전염병의 수의 증가]. 단일 단백질 내에서 개개 레플리킨의 재발에 의한 레플리킨 농도의 증가는 인플루엔자 바이러스에서 일어나는 것이 아니라 다른 유기체에서 일어나는 것으로 보여진다.
IV. 거위 레플리킨 스캐폴드
본 출원인은 1917년에 거위로부터 분리된 인플루엔자 바이러스의 적혈구 응집소에서의 레플리킨(본 출원인은 거위 레플리킨이라 칭함)이 다음 해인 1918년 광역 유행병의 원인인 인플루엔자의 H1N1 스트레인에서 다음해에 나타남을 발견하였으며, 이는 하기와 같이 단지 두개의 치환을 갖는다: kkg(t/s)sypklsksy(t/v)nnkgkevlvlwgvhh (서열번호: 18). 표 1은 인플루엔자 1917 거위 레플리킨(GR)이 이후 85년 동안 다른 인플루엔자 스트레인에 대한 다중 최소 치환 및 명확한 이동에도 불구하고 필수적으로 보존됨을 나타낸다. 본 출원인은 1917년 인플루엔자 GR이 수개의 인플루엔자 스트레인 간의 명확한 이동성을 나타냄을 발견하였으며, 이는 H1N1 (1918년의 광역 유행병), H2N2 (1957-58년의 광역 유행병), H3N2 (1968년의 광역 유행병, 2000에 중국 및 러시아, 2003년에 복건성 스트레인 전염병 2003) 및 H5N1 (1997년 중국에서의 전염병)에서 나타난다. 1997년에 이의 구조는 H1N2에서 이의 1918 구조 KKGSSYPKLSKSYVNNKGKEVLVLWGVHH (서열번호: 19)로 정확하게 복구되었다.
증가된 독성 및 숙주 사망률과 관련가능한 레플리킨 서열은 인플루엔자 바이러스의 스트레인의 출현을 예측하고, 동정하고, 치료하기 위한 타겟을 제공한다. 표 1은 거위 레플리킨을 나타낸 것이다. 인플루엔자 스트레인에 대한 40년간 데이터에 대한 하기 거위 레플리킨 및 이의 동족체는 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인에서 독성의 유용한 예측체인 것으로 나타났다. 시리즈로서 함께 얻어지는, 거위 레플리킨 및 이의 동족체는 레플리킨 스캐폴드의 알고리즘에 적합하며, 이는 보존된 레플리킨 펩티드의 시리즈를 요구하며, 여기서 상기 레플리킨 펩티드 서열 각각은 약 16 내지 약 30개의 아미노산을 포함하며, 추가로 (1) 말단 라이신 및 임의적으로 말단 라이신에 접하여 인접한 라이신; (2) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 접하여 인접한 히스티딘; (3) 다른 라이신 잔기로부터의 라이신 잔기 6 내지 10개의 아미노산 잔기; 및 (4) 적어도 약 6% 라이신을 포함한다.
V. 레플리킨 스캐폴드 서열은 인플루엔자에서 증가된 독성과 관련이 있다.
증가된 독성 또는 숙주 사망률을 나타내는 인플루엔자 분리물로부터의 하나 이상의 레플리킨 스캐폴드 서열에서의 치환에 대해 동일한 아미노산에서의 치환을 갖는 인플루엔자 분리물에서의 레플리킨 스캐폴드 서열은 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인에서 타겟 및 치료법으로서 유용하다. 그러므로, 본 발명은
(1) 말단 라이신 및 선택적으로 말단 라이신에 인접한 라이신;
(2) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 인접한 히스티딘;
(3) 다른 라이신으로부터 6 내지 10개의 아미노산 떨어진 라이신; 및
(4) 적어도 6% 라이신을 추가로 포함하는 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인으로부터의 실질적으로 분리된 레플리킨 스캐폴드 펩티드로서,
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 실질적으로 분리된 레플리킨 스캐폴드 펩티드는 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 스캐폴드 서열과 비교하여 아미노산 치환을 함유하며, 아미노산 치환은 히스티딘의 치환이 아니며,
인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 스캐폴드 서열은
(1) 16 내지 30개의 아미노산;
(2) 말단 라이신 및 선택적으로 말단 라이신에 인접한 라이신;
(3) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 인접한 히스티딘;
(4) 다른 라이신으로부터 6 내지 10개의 아미노산 떨어진 라이신; 및
(5) 적어도 6% 라이신을 포함하며,
치환은 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인의 레플리킨 스캐폴드 서열에 추가적으로 존재하며,
인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인의 레플리킨 스캐폴드 서열은
(1) 16 내지 30개의 아미노산;
(2) 말단 라이신 및 선택적으로 말단 라이신에 인접한 라이신;
(3) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 인접한 히스티딘;
(4) 다른 라이신으로부터 6 내지 10개의 아미노산 떨어진 라이신; 및
(5) 적어도 6% 라이신을 포함하는 레플리킨 서열을 함유하며,
인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인에의 치환의 존재는 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가과 서로 관련이 있는 레플리킨 스캐폴드 펩티드를 제공한다.
바람직한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 서열에서의 상이한 아미노산 잔기로 치환된 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 서열에서의 아미노산 잔기는 말단 히스티딘으로부터의 5개의 아미노산 잔기를 위치시킨다.
다른 바람직한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 서열에서의 아미노산 잔기는 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 분리된 레플리킨 서열에성의 루신과는 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 다른 바람직한 구체예에서, 아미노산은 루신과는 다른 임의의 소수성 아미노산으로 치환된다. 다른 바람직한 구체예에서, 아미노산은 메티오닌 또는 이소루신으로 치환된다. 다른 바람직한 구체예에서, 분리된 레플리킨 서열은 H5N1 인플루엔자 바이러스로부터 분리된다.
본 발명자들은 100년 간의 전염병학적 데이터를 이용하여 인플루엔자 바이러스의 농도가 바이러스의 독성과 관련이 있음을 성립시켰다. 동일한 전염병학적 데이터를 사용하여, 특정의 고도로 보존된 레플리킨 서열의 구조는 또한 독성 및 전염병과 관련이 있다. 동일한 100년간의 전염병학적 데이터내에서 시간에 따른 고도로 보존된 레플리킨 서열의 개개 서열 변화의 검토는 소급적 및 장래적 예측 능력을 증명하였다.
거위 레플리킨 스캐폴드에서의 레플리킨 스캐폴드는 마찬가지로 거위 레플리킨 동족체를 함유한 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인을 치료하기 위한 타겟을 제공하는 것으로 나타났다. 예를 들어, UTOPE 및 키홀 삿갓조개(Keyhole Limpet) 혈색소 애주번트가 보충된, 베트남에서 H51의 고도 병원성 2004 스트레인의 29개 아미노산 레플리킨 스캐폴드 펩티드(표 1에서 "2004 H5N1 베튼남, 고도 병원성"이라 라벨링됨)는 피하적으로 주입될 때 토끼 및 닭에서 강력한 면역 반응을 제공하였다[참조, 실시예 7].
표 1은 2006년 까지의 거위 레플리킨 및 이의 동족체를 제공한다. 표 1에서의 스캐폴드화는 일정한 길이, 아미노산 말단에서의 일정한 라이신, 및 카르복시 말단에서의 일정한 히스티딘 잔기가 10년 동안 고정된 스캐폴드에서 상이한 스트레인에 보존됨을 증명한다. 거위 레플리킨의 동족체는 1917년에서 2006년에, H1N2, H7N7, H5N2 및 H5N1 사이에 추가 치환을 갖는 H1N1, H2N2 및 H3N2에서 각각이 1918년, 1957년 및 1968년의 3회의 광역 유행병의 원인이 되는 스트레인을 포함하는 스트레인에서 나타났다. 거위 레플리킨에서 발생한 특정 치환은 무작위보다 오히려 선택적이고 수년 동안 유지되는 경향이 있다. 따라서, 아미노산 치환이 무작위로 발생한다는 일반적인 가정에도 불구하고, 인플루엔자에서의 모든 치환이 실재로 무작위적이지 않은 것으로 나타날 것이다. 10년에 걸친 이러한 레플리킨 보존은 빠르고 저렴하게 미리 제조될 수 있고 일년 이상 동안 효과적일 수 있는 합성 인플루엔자 백신을 생산할 수 있게 한다.
그러므로, 합성 인플루엔자 백신에 대한 타겟은 인플루엔자 바이러스에서의 보존된 레플리킨 스캐폴드이다. 레플리킨 스캐폴드는 약 16 내지 약 30개의 아미노산을 포함하고, 추가로
(1) 말단 라이신 및 말단 라이신에 접하여 인접한 잔기 부분에서의 임의적 라이신;
(2) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 접하여 인접한 잔기 부분에서의 다른 히스티딘;
(3) 하나 이상의 다른 라이신으로부터 약 6 내지 약 10개의 아미노산 잔기 내의 하나 이상의 라이신; 및
(4) 16 내지 약 30개의 아미노산 펩티드내의 적어도 약 6% 라이신을 포함하는 일련의 보존된 펩티드를 포함한다. 레플리킨 스캐폴드 펩티드는 또한 일련의 레플리킨 스캐폴드 중 개개의 구성원 또는 다수의 구성원을 칭한다.
합성 인플루엔자 백신에 대한 비제한적이고 바람직한 타겟은 약 29 아미노산의 서열 및 말단 라이신에 접하여 인접한 라이신을 포함한 인풀루엔자 바이러스 레플리킨 스캐폴드이다. 다른 바람직한 타겟에서, 레플리킨 스캐폴드의 말단 히스티딘으로부터의 루신의 5개 아미노산 잔기는 다른 아미노산으로 치환된다. 다른 바람직한 타겟에서, 루신의 치환은 소수성 아미노산으로 이루어진다. 다른 바람직한 타겟에서, 루신의 치환은 메티오닌 또는 이소루신으로 이루어진다.
합성 인플루엔자 백신에 대한 덜 바람직한 타겟은 약 29개 아미노산 및
(1) 말단 라이신 및 말단 라이신에 접하여 인접한 라이신;
(2) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 접하여 인접한 히스티딘을 포하함하며
(3) 임의의 다른 라이신으로부터의 6 내지 10개의 아미노산 잔기내에 라이신을 지니지 않는 첫 번째 펩티드를 포함하는 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인에서의 외스캐폴드 스캐폴드일 수 있으며, 여기서, 바이러스의 첫 번째 스트레인 또는 다른 스트레인의 조기-발생 표본은 약 29개 아미노산의 레플리킨 스캐폴드를 포함한다.
표 1에서, 거위 레플리킨 및 이의 동족체의 히스토리는 1917년부터 현재까지 조류 H5N1 바이러스가 급증하는 것을 추적되었다. 표 1은 인플루엔자의 치명적인 스트레인에서의 거위 레플리킨의 "스캐폴드" 동족체의 보존을 증명한다.
표 1은 연 단위 또는 보다 작은 시간으로, 다른 인플루엔자 레플리킨에성의 거위 레플리킨 및 이의 동족체의 단백질 구조에서의 존재 히스토리를 나타낸 것이다. 표 1은 추가로 이러한 동족체에서 아미노산 치환의 히스토리 및 레플리킨의 정의 및 레플리킨에 의해 공급된 빠른 복제의 기능에 대해 필수적인 레플리킨 구조의 특정 아미노산의 보존을 나타낸다.
표 1: 1917년 거위 인플루엔자 레플리킨 및 1918년 인간 광역 유행병 레플리킨에서 2006 H5N1 “조류 독감” 동족체에서, 빠른 복제와 관련된 인플루엔자 바이러스 레플리킨 페비드의 89년간의 보존에서 정렬된 치환을 나타낸 레플리킨 스캐폴드. 서열번호: 20-82는 각각 표시 순서대로 개시되어 있음.
Figure 112008081742318-PCT00001
Figure 112008081742318-PCT00002
* 거위 레플리킨 아미노산과 동일한 잔기는 음영으로 나타내지 않음; 아미노산 치환은 연도 및 스트레인에 따라 스캐폴드 패턴을 나타내기 위해 밝고 어둡게 음영화됨. 2004 및 2006 H5N1, 1957 H2N2, 1968 H3N2 및 H7N7에서 위치 24에서의 치환은 박스로 나타냄.
표 1의 검토는 아미노산의 무작위 치환이 1917년에서 지금까지 인플루엔자의 치명적인 스트레인에서 발생하는 경우, 거위 레플리킨의 특정 뼈대 아미노산은 전염병을 발생시키는 스트레인에서 해마다 보존되지 않음을 나타낸다. 그러나, 무작위 치환으로 초래되는 것과는 반대로, 인플루엔자의 치명적인 스트레인은 해마다 레플리킨을 정의하는 이러한 위치에서 특정의 보존된 아미노산을 지속적으로 함유한다. 즉, 치환이 레플리킨을 정의하는 아미노산 중 하나, 예를 들어, 라이신 또는 히스티딘에서 발생하는 경우, 레플리킨의 정의는 잃게 된다. 그럼에도 불구하고, 레플리킨 서열은 85년 넘게 보존된다. 따라서, 10년에 걸쳐 특정 아미노산이 보존되기 때문에, 치환은 무작위로 완전하다고 할 수 없다. 치환이 레플리킨의 정의에 필수적이지 않은 아미노산(즉, 라이신 또는 히스티딘과는 다른 아미노산)에 일어난다는 사실은 스트레인의 병원성에서 레플리킨의 중요성을 나타낸다.
표 1 로부터, 치환이 일어날 때, 이들은 레플리킨 스캐폴드의 특정의 명확하게 바람직한 위치에서 발생됨을 추가로 나타낼 수 있다. 표 1은 위치 1, 3-24 및 26-27에서 반복하는 치환을 나타낸다. 또한, 치환이 이러한 위치내내 일어나지만, 라이신은 두 번째 라이신으로부터 위치 6 내지 10 아미노산에 계속 존재한다(이는 이러한 치명적인 스트레인에서 치환되지 않는다).
1957년에 나타낸 바와 같이 29 아미노산 스트레치(stretch)내에서 라이신 위치의 치환이 존재할 때에도, 위치 11에서의 K가 위치 10으로 이동되는 경우, 새로운 위치는 2005년 까지 유지되었으며, 이는 몇몇을 제외하고 레플리킨 스캐폴드의 동족 구조를 보존하기 위해 YP, AY, N (위치 15), 및 LVLWG (서열번호: 83)를 가지기 때문이다.
여분의 K가 중국(안후이)에서 H5N1의 2006 스트레인의 레플리킨 스캐폴드에서 나타나는 것은 중요하다. 여분의 K의 존재는 레플리킨 스캐폴드내에서의 레플리킨 카운트의 증가를 나타낸다. 2006 중국(안후이) 스트레인은 6.6의 레플리킨 카운트를 갖는다(하기에 논의됨). 6.6의 레플리킨 카운트는 H5N1 스트레인에 대해 관찰된 가장 높은 수치이며, 단지 1918 광역 유행병을 야기시킨 인플루엔자 스트레인의 레플리킨 카운트와 인플루엔자의 전체 A 스트레인에서 비교가능하다. 이러한 초기 2006 리포트가 반복되고 유지되는 경우, 2004 및 2005년에서의 각각 4.5 및 4.0의 카운트가 실질적으로 증가될 것을 지시하고, H5N1 “조류 독감"의 연속적이거나 증가된 전염병을 예고한다.
레플리킨 스캐폴드 서열을 함유한 인플루엔자 바이러스의 치명적인 스트레인은 레플리킨 스캐폴드가 비-레플리킨 서열로 퇴화하지만 레플리킨 스캐폴드의 스캐폴드 구조와 동일할 수 있는 동족체를 유지할 때 복제 속도 및 독성에 대한 효과를 결정하기 위해 보다 일찍이 검토된다. 이는 더 이상 예를 들어 29 아미노산 내에 레플리킨이 포함된 2 또는 3 보다 적게 나타나지 않거나 심지어 더 이상 레플리킨이지 않지만, 외부 "쉘"을 스캐폴드의 29 아미노산 KKXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXHH (서열번호: 84)으로(그러나 이에 제한되지 않음) 보존하는 (말단부에서 이로부터 구별되는 바와 같이) 레플리킨 스캐폴드에서 내부 Ks 및 Hs의 손실이 종종 분리물의 바이러스 서열에서 발견되어 이들의 높은 레플리킨 카운트 및 통상적으로 전염병 또는 급증의 말단부에서의 이들의 독성을 감소시킴을 발견하였다. 그러므로, 레플리킨 카운트가 감소함에 따라 함께 이루어지는 레플리킨 스캐폴드의 "파괴" (또는 불완전한 합성)은 내부 Ks 및 Hs를 갖는 단지 전체적으로 나타난 스캐폴드의 외형으로서 급증 또는 전염병의 실패의 다른 지수로서 유용하며, 이는 더욱 레플리킨을 생산하고, 이에 따라 보다 높은 레플리킨 카운트를 형성하며, 이는 레플리킨 카운트가 3을 초과하고 최고가 될 때 대개 이러한 형태가 발생하며, 이는 앞으로의 급중 또는 전염병의 형태의 지수로서 유용하다. 이러한 실제적 용도 이외에, 이러한 쉘 현상은 이전에 인식되지 않는 급증 및 전염병에서 바이러스 "성공"과 직접적으로 관련된 기능을 지닌, 레플리킨 스캐폴드가 바이러스의 중요한 구조적 구성요소라는 다른 "원리의 증거"이다.
예를 들어, 레플리킨 스캐폴드를 갖는 특정 인프루엔자 종의 조기-발생 표본은 이후 하기와 같이 변경된다:
1) 29개 아미노산의 길이는 보존된다;
2) 앞의 두개의 아미노산 위치(1 및 2), 즉 KK는 보존된다;
3) 마지막의 두개의 아미노산 위치(28 및 29), 즉 HH는 보존된다;
4) 그러나, 이는 더이상 KK로부터의 K 6 내지 10 아미노산이 아니다(레플리킨의 정의를 위해 필요함).
이와 같이, 스캐폴드는 더이상 레플리킨 스캐폴드가 아니지만, 외스캐폴드이다. 레플리킨 스캐폴드가 높은 레플리킨 카운트 및 전염병 발생과 관련이 있는 동안, 외스캐폴드는 바이러스 휴지 및 전염병의 감소 또는 종결과 관련이 있다. 따라서, 외스캐폴드는 레플리킨 스캐폴드 및 특정 바이러스 급증이 감소할 때 잔기로서 남겨진 퇴화 구조인 것으로 나타나며, 이에 따라 이러한 목적을 위한 유용한 진단 구조인 것으로 나타난다. 이는 1) 항체 또는 작은 억제 RNA와 같은 항-빠른 복제제에 대한 타겟 및 2) 항-바이러스 백신의 주성분으로서 레플리킨 스캐폴드의 발견 및 용도를 확인한다.
레플리킨 스캐폴드의 보전 및 보존은 바람직하게는 두개의 라이신으로 시작하여 두개의 히스티딘으로 종결되는 고정된 29개 아미노산 서열이라는 사실에 의해 나타날 수 있다. 덜 바람직하게는 이러한 스캐폴드는 길이가 16개 내지 약 30개인 아미노산이다.
아미노산 치환
스캐폴드 구조를 파괴하지 않는 레플리킨 스캐폴드에서의 치환은 특정 아미노산에 제한되지 않는다. 그러나, 특정 아미노산이 펩티드의 구조 및 기능에 유사한 효과를 갖는 일반적인 화학적 특징을 공유하기 때문에, 유사한 아미노산을 갖는 레플리킨 서열에서 유사한 구조적 효과를 공유하는 하나의 아미노산의 치환은 상이한 그룹으로부터 다른 아미노산에 의해 아미노산의 치환 보다 더욱 가능성 있는 것으로 가정된다.
아미노산은 4개의 부류, 산성, 염기성, 친수성 및 소수성의 그룹으로 나눌 수 있다. 특정 그룹에서의 아미노산은 상이한 그룹에서의 아미노산 보다 이의 그룹내에서의 아미노산의 더욱 치환될 것으로 가정된다. 산성 측쇄를 지닌 산성 기는 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 염기성 측쇄를 갖는 염기성 기는 히스티딘, 라이신 및 아르기닌을 포함한다. 극성 중성 측쇄를 갖는 중성 친수성 기는 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 트레오닌, 세린 및 시스테인을 포함한다. 비극성 중성 측쇄를 갖는 소수성 기는 메티오닌, 트립토판, 페닐알라닌, 이소루신, 알라닌, 글리신, 프롤린, 발린 및 루신을 포함한다. 이와 같이, 본 발명내에서 고려되는 바와 같이 레플리킨 스캐폴드 서열에서의 특정 아미노산의 바람직한 치환은 치환된 아미노산과 동일한 아미노산내에서 치환될 것이다. 예를 들어, 루신은 글루탐산 보다는 메티오닌에 의해 더욱 치환될 것이며, 메티오닌의 치환은 펩티드의 특정 부분의 일부 기능을 더욱 파괴하지 않을 것으로 가정된다.
레플리킨 스캐폴드의 H5N1 인플루엔자 보존
여러 국가에서 높은 사망률의 H5N1 “조류 독감”의 급증은 과도한 인플루엔자 광역 유행병의 첫 번째 시기를 나타낼 수 있는 것과 관련이 있다. 리포트[Ungchusak K et al.N Eng J Med 2005 Jan 27; 352(4):323-5]에는 H5N1의 첫 번째의 가능한 개인-대-개인 전달에서, "바이러스 유전자의 서열화는 적혈구 응집소의 수용체-결합 사이트 또는 바이러스의 다른 중요한 특징에서의 변화되지 않음을 식별하였다. 모두 8개의 바이러스 유전자 분절의 서열은 태국에서 최근 조류 분리물로부터의 다른 H5N1 서열과 밀접하게 클러스팅되었다."를 제시하고 있다. 계통 발생적 분석은 "인간 인플루엔자 바이러스와의 재배열"의 증거의 부재로부터 H5N1이 새로운 변형체가 아님을 제시하였다. 그러나, 본 출원인은 특이적 H5N1 단백질 서열에서 적어도 2개의 H5N1 전염병에서 변경되지 않고, 실제로 1959 이후에 보존된 사이트에서의 최근 변화를 보고하였다. 이전에, 어떠한 단백질 화학도 바이러스 전염병 및 휴지와 관련이 없었다. 본 출원인은 마지막 세기의 3개의 인플루엔자, H1N1, H2N2 및 H3N2 광역 유행병 각각이 레플리킨이라 불리는 빠른 복제와 관련된 라이신 및 히스티딘이 풍부한 바이러스에서의 특정 부류의 펩티드의 농도의 증가에 의해 소급적으로 예측되고 이와 관련이 있음을 발견하였다. 본 출원인은 또한 1997, 2001, 및 2003-2004년에 3개의 H5N1 전염병 각각에서 예측되는 레플리킨을 발견하였다[도 11]. 이들이 분리물에 나타나는 각 연도에, 레플리킨은 도 11과 같이 100개의 아미노산 당 산출될 수 있으며, 이들의 서열이 분석되고, 표 1에서와 같이 비교된다. 레플리킨의 분석은 수작업으로 또는 본 발명의 바람직한 양태에서 이용가능한 서열 정보에서 레플리킨 농도를 산출하는 목적을 위한 소프트웨어에 의해 자동적으로 수행될 수 있다.
3가지 "조류 독감" 전염병의 급증 전에 인플루엔자의 H5N1 스트레인의 적혈구 응집소 단백질에서의 레플리킨 패턴의 농도의 빠른 증가를 나타낸 그래프는 도 11에서 볼 수 있다. 도 11의 검토는 H5N1의 적혈구 응집소 단백질에서의 레플리킨 농도('레플리킨 카운트')의 증가가 3가지 '조류 독감' 전염병에 선행됨을 나타내다. 예를 들어, 1995에서 1997년에 레플리킨 카운트(평균 +/- SD)의 증가는 1997년의 홍콩 H5N1 전염병 (E1)에 선행하였다. 1999년에서 2001년까지의 레플리킨 카운트의 증가는 2001년의 전염병(E2)에 선행하였다. 2002년에서 2004년까지의 레플리킨 카운트의 증가는 2004년의 전염병(E3)에 선행하였다. 1999년에서의 쇠퇴는 홍콩에서의 E1 전염병에 응하여 가금류의 대량 도축을 발생시켰다.
바이러스 단백질에서의 레플리킨의 카운트 이외에, 시간에 대한 각 레플리킨의 구조는 정보를 제공하고, 백신, 및 항체 및 작은 RNA와 같은 다른 치료법을 위한 타겟을 제공한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 표 1은 1917년에 인플루엔자에 감염된 거위에서 최초로 발견된 레플리킨(거위 레플리킨)을 나타낸 것이다. 아미노산 말단에서의 일정한 길이의 일정한 라이신 및 카르복시 말단에서의 히스티딘 잔기는 10년 동안 고정된 스캐폴드에서의 상이한 스트레인에서 보존되었다. 거위 레플리킨의 동족체는 1917에서 2006년에, 1918, 1957, 및 19681년의 3회의 광역 유행병에 원인인 것을 포함하고, H1N2, H7N7, H5N2 및 H5N1 사이의 추가 치환을 갖는 스트레인에서 나타났다. 거위 레플리킨에서 발생한 특정 치환은 무작위적이기 보다는 오히려, 선택적이고 수년 동안 유지되는 경향이 있다. 따라서, 아미노산 치환이 무작위로 발생한다는 일반적인 가정에도 불구하고, 인플루엔자에서의 모든 치환은 실제로 무작위로 이루어지지 않는 것으로 나타난다. 이러한 10년 간의 레플리킨 보존은 빠르고 저렴하게 미리 제조될 수 있고 1년 이상 유효할 수 있는 합성 인플루엔자 백신의 생산을 허용한다.
1997 H5N1 홍콩 전염병에서, 인간 사망률은 대략 27%이었다. 2004년에, 아시아에서 52명의 사람이 H5N1에 의해 감염되었음이 보고되었으며, 대략 70%가 사망하였다. 가장 최근에, 2004년 12월 28일부터 2005년 1월 27일까지의 베트남에서의 11 케이스 중 9 케이스가 사망하였다. 바이러스의 독성이 증가하는 것으로 나타나지만, 인간에서 인간으로의 추가 전파를 위해 요구되는 것으로 생각되는 임의의 변화는 아직 발생되지 않은 것으로 사료된다. 그러나, 본 출원인은 2004년에 베트남, 태국 및 중국에서 분리물로부터 거위 레플리킨 스캐폴드의 위치 번호 18, 24 및 28에서 3개의 H5N1 레플리킨 아미노산 잔기에서의 새로운 치환을 관찰하였다[참조 표 1]. 1959년에 H5N1의 출현 이후 사이트 번호 24에서의 치환은 발생하지 않지만, 2백만명의 사망의 원인인, 다른 스트레인, 1957년에 H2N2 및 1968년에 H3N2에 의해 야기된 적어도 두개의 인플루엔자 광역 유행병에, 및 H7N7에 의해 야기된 최근의 치명적인 전염병에 존재하였다[참조, 표 1]. 이들이 단지 가능한 위험의 암시를 지니는 동안, 치환에 대한 이들의 데이터는 도 11에 나타낸 상승하는 레플리킨 총구와 조합하며, 광역 유행병과 이러한 레플리킨 데이터의 과거 상관관계는 바이러스가 인간에서 인간으로 거의 전파되지 않는 계통 발생적 분석으로부터 얻어진 것과 동일한 재보증을 제공하지 않는다.
표 1은 인플루엔자의 치명적인 스트레인에서 레플리킨 스캐폴드의 보전을 나타낸 것이다. 상기에서 논의된 바와 같이, 레플리킨 스캐폴드의 외스캐폴드으로의 퇴화는 병원성을 감소시키는 것으로 보여진다. 그러므로, 레플리킨 스캐폴드의 보전 및 보존은 일반적으로 두개의 라이신으로 개시하고 두개의 히스티딘으로 종결하는 고정된 29개의 아미노산 서열이 존재한다는 사실에 의한 것으로 보여진다.
본 발명의 일 양태는 바이러스, 전염병 또는 광역 유행병의 병원성 및 복제의 속도를 추적하거나, 전염병 또는 광역 유행병의 발생을 예측하기 위한 레플리킨 구조 및 기능의 조합이다. 이러한 조합의 예는 1918년의 스트레인 및 H5N1의 H5N1 스트레인과 같은 인플루엔자 스트레인에서의 레플리킨 카운트의 증가를 산출하기 위해 사용되는 본 발명의 레플리킨 알고리즘의 능력이다. 1918 인플루엔자 광역 유행병의 레플리킨 카운트 및 현존하는 "조류 독감"의 급증은 본 발명에 따르고, 이에 의해 이루어진 대표적인 양태의 예측 능력을 나타낸다.
단일 치환은 종래 H5N1 스트레인에 존재하지 않는 인도네시아 및 베트남에 인간의 H5N1 스트레인에서 발견되었지만, 1957 (H2N2) 및 1968 (H3N2)의 가장 최근의 두개의 인간 사망 광역 유행병에 역사적으로 존재한다.
상기 표 1의 검토는 1957년의 높은 사망률의 인플루엔자 광역 유행병의 원인인 인플루엔자 바이러스의 H2N2 스트레인, 및 1968년의 높은 사망률의 인플루엔자 광역 유행병의 원인인 인플루엔자의 H3N2 스트레인이 거위 레플리킨 스캐폴드에서 아미노산 번호 24에서 단일 아미노산 치환을 함유함을 나타낸다[참조, 표 1]. 본 출원인은 인도네시아 및 베트남에서 인간에게서 발견된 H5N1 바이러스 단백질에서의 최근 단일 아미노산 치환이 또한 거위 레플리킨에서 아미노산 번호 24에서의 치환을 가짐을 새롭게 발견하였으며, 본원에서 보고한다. 인도네시아 및 베트남에서 인간으로부터 최근에 분리된 H5N1 거위 레플리킨 펩티드는 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV(M/I)WGIHH (서열번호: 85)이며, 여기서, H5N1의 인도네시아 스트레인은 위치 24에서 이소루신을 함유하며, H5N1의 베트남 스트레인은 위치 24에서 메티오닌을 함유한다. 상기에서 기술된 바와 같이, 본 출원인은 아미노산 24에서의 치환이 증가된 독성 및 인간 광역 유행병을 예측함을 교시한다.
최근에 인간에서 분리된 H5N1의 인도네시아 스트레인은 중요한데, 이는 H5N1의 거위 레플리킨에서 아미노산 번호 24에서의 치환(여기서 "S" 치환이라고 함)이 모든 보다 빠른 H5N1 스트레인으로부터 부재하지만, 1957년 (H2N2) 및 1968년 (H3N2)에서 최종 두개의 높은 사망률의 인플루엔자 광역 유행병에 존재하기 때문이다. 1957 및 1968년의 광역 유행병은 수백만명의 사망의 원인이다. 위치 24에서의 아미노산 치환은 마찬가지로 한명의 사망과 함께 H7N7의 최근 급증(다행히도 잠시 급증)에서 존재하였다[참조 표 1]. 그럼에도 불고하고, H5N1 거위 레플리킨에서 위치 24에서의 아미노산 치환은 1959년에서 현재(2006년) 까지 H5N1의 모든 분석되고 기록된 분리물로부터 부재하였다.
국립의학도서관 (Pubmed)에서 국제1천2백만명 이상의 검토는 아미노산 서열에서 S 치환을 검출하였고, S가 FluForecast® 소프트웨어 (참조, www.Replikins.com)의 도움으로 수년 동안 발생된 서열을 추적하였다.
S 치환은 닭으로부터 최근의 H5N1 분리물에서 발견되지 않았다. 대신에, S 치환은 높은 사망률을 갖는 경우에서 인간으로부터 H5N1 분리물에서 최근에 관찰되었다. S 치환은 2004년 베트남, 및 2006년 인도네시아에서 인간으로부터의 분리물에서 관찰되었다[참조, 표 1]. 베트남 및 인도네시아에서 인간에게서의 전염병학적 증거는 H5N1 거위 레플리킨에서의 S 치환이 개인-대-개인 "클러스터"와 관련이 있음을 제시하며, 여기서 조류에서 인간으로의 전파는 성립되지 않으며, 인간-대-인간 전파는 배제된다. S 치환은 H5N1의 인간-대-인간 전파가 이미 발생하지만 최근에는 드물게 발생함을 제시한다.
세계보건기구 및 미국질병관리센터 대변인은 최근에 "중요한" 걱정되는 서열 변화는 높은 사망률의 H5N1 인도네시아 인간 경우로부터의 H5N1 분리물에서 발견되지 않았다고 발표하였다. 중요한 서열 변화는 당업자에게 개인-대-개인 전파가 발생하기 전에 요구되는 것으로 여겨진다. 이와 같이, "중요한" 서열 변화는 인간 광역 유행병에 대한 필수적인 필요조건인 것으로 여겨진다. S 치환과 개인-대-개인 "클러스터"의 최근 상관관계는 H5N1의 인간-대-인간 전파 이전에 WHO 및 CDC에 의해 예상되는 "중요한" 서열 변화가 상기에서 예측되는 바와 같이 기대되지 않게 거위 레플리킨 스캐폴드내에서 단일 아미노산 변화에서 발견될 수 있다고 제시한다.
거위 레플리킨 바이러스 펩티드가 88년 동안(1917년에서 현재까지) H1N1, H2N2, H2N3, 및 H5N1에 고도로 보존됨을 발견하였다는 사실에도 불구하고, 놀랄만한 돌연변이, S 돌연변이는 구체적으로 보존된 위치, 위치 24에서 거위 레플리킨내에서 식별되었다. 상기가 성입됨에 따라, 단백질에서의 레플리킨의 농도 증가는 빠른 복제 및 전염병과 관련이 있다[참조, 도 6, 7, 8, 10 및 11]. 상승하는 "레플리킨 카운트" (100개의 아미노산 당 레플리킨의 수)는 각 중요한 인플루엔자 전염병, 마지막 세기의 최종 3개의 인플루엔자 광역 유행병, 및 1997년부터 현재까지의 최종 3회의 H5N1 전염병과 정량적으로 관련이 있으며 종종 미리 예측됨을 발견하였다[참조, 도 6, 7, 8, 10 및 11].
단일 치환, 예를 들어, S-치환은 단독일 수 있지만, 광역 유행병의 단독 원원은 아니다. 그럼에도 불구하고, S 치환의 발생은 1957년 및 1968년에 최종 두개의 높은 사망률의 광역 유행병에서 마커이었다. 또한, 높은 레플리킨 카운트 및 높은 사망률에 의해 수행되는, 닭이 아닌 인간 단독에서 H5N1에서의 S 치환(최근)은 전체적으로 H5N1이 인간 광역 유행병에 대한 통로일 수 있음을 제시한다.
다가오는 인간 광역 유행병의 보다 높은 가능성을 제시하는 증거는 높은 레플리킨 카운트 및 높은 사망률과 조합하여 S 치환의 식별 전에 이루어진 종래 더욱 편리한 평가와 상당히 대조적이다. 이와 같이, S-치환의 상세한 기능이 전부 알려져지 않았지만, 증거는 증가된 레플리킨 카운트와 조합한 S-치환의 전염병학적 기능이 명확함을 제시한다.
최종적으로 H5N1으로부터의 총(full-force) 광역 유행병이 구체화되는 경우, 및 구체화되는 때를 최종적으로 결정하는 것은 아직 알려져 있지 않다. 다음 광역 유행병의 제제일 수 있는 H5N1의 최종 치환된 구조의 종래 부족한 정보는 적절한 백신을 생산을 위한 시도를 지연시킨다. 본원에 기재된 레플리킨 펩티드 구조 및 거위 레플리킨 스캐폴드는 가능한 다가올 광역 전여병에 대한 백신의 생산을 위한 필요한 방향을 제공한다.
타겟으로서 S-치환된 레플리킨 스캐폴드
인플루엔자 바이러스이 출현 스트레인 중의 레플리킨 스캐폴드에서 예측적 치환에 의해 제공된 합성 백신을 위한 타겟의 비제한적 예는 표 1에서 “1957 H2N2 인간 인플루엔자 광역 유행병,” “1968 H3N2 인간 인플루엔자 광역 유행병,” “1979-2003 H7N7 인플루엔자,” “2004 H5N1 (베트남, 고도 병원성), ” 및 “2006 H5N1 인도네시아(고도 병원성)”에 제공된다. 상기에서 논의된 바와 같이, 거위 레플리킨 및 표 1에 기재된 다른 모든 서열과 비교하여, 루신의, 1957 및 1968 광역 유행병 스트레인에서 이소루신의 치환 및 H7N7의 1979-2003 스트레인에서 이소루신으로의 치환은 루신의, 2004년에 베트남에서의 H5N1의 출현 스트레인에서 메티오닌으로 새로운 치환, 및 2006년에 인도네시아에서 H5N1의 출현 스트레인에서 이소루신으로의 새로운 치환이 독성의 계속적 증가를 초래하는 예측적 영향력을 제공한다. 인간-대-인간 전파의 일부 증거와 결합된 베트남 및 인도네시아에서의 높은 사망률은 독성이 실제로 이러한 치환된 스트레인에서 증가함을 제시한다. 그러므로, 이러한 스트레인의 치환된 레플리킨 스캐폴드 펩티드는 합성 백신의 개발에서 유용한 레플리킨 스캐폴드 펩티드의 비제한적인 바람직한 구체예이다. 본 발명의 다른 비제한적 구체예는 루신과는 다른 임의의 아미노산 잔기로 치환된 말단 히스티딘으로부터 제 5 위치를 갖는 2004년에 베트남으로부터 분리된 치환된 H5N1 및 2006년에 인도네시아로부터 분리된 치환된 H5N1의 레플리킨 스캐폴드 펩티드이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 레플리킨 스캐폴드 펩티드는 말단 히스티딘으로부터의 제 5 위치에서 루신과는 다른 임의의 소수성 아미노산으로 치환된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 1957 H2N2 광역 유행병 스트레인, 1968 H3N2 광역 유행병 스트레인 및 1979-2003 H7N7 스트레인의 스캐폴드 펩티드는 또한 이러한 출현 스트레인에 대한 합성 백신을 위한 동족의 타겟을 제공한다.
그러므로, 본 발명은 또한 레플리킨 펩티드가 약 29개 아미노산을 포함한 본 발명의 분리된 레플리킨 펩티드를 제공한다. 분리된 레플리킨 펩티드는 아미노산 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH (서열번호: 1)을 포함하며, 여기서 [S]는 그밖에 대략 동일한 레플리킨 펩티드 서열을 포함한 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 치환된 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직한 구체예에서, [S]는 소수성 아미노산일 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, [S]는 메티오닌 또는 이소루신일 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 나타낸 서열은 인플루엔자의 H5N1 스트레인으로부터 분리된다.
VI. 레플리킨 스캐폴드를 이용하여 인플루엔자 독성의 증가를 예측하는 방법
시간에 따른 레플리킨 스캐폴드의 역사적 데이터는 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인의 독성을 예측하기 위한 도구를 제공한다. 이러한 인플루엔자 바이러스의 스트레인이 시간에 따라 레플리킨 농도를 증가시키는 경우, 이는 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인으로서, 독성의 증가가 예측가능하다. 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인이 독성의 증가 또는 역사적으로 고도로 치명적인 인플루엔자 바이러스의 스트레인에서의 숙주 사망률과 관련이 있는 레플리킨 스캐폴드 펩티드에서의 아미노산 치환을 포함하는 경우, 출현 스트레인은 독성이 증가되는 것으로 예측될 수 있다.
그러므로, 본 발명은
(1) 다수의 레플리킨 스캐폴드 펩티드를 포함하는 인플루엔자 바이러스 레플리킨 스캐폴드를 동정하는 단계로서, 레플리킨 스캐폴드가 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인으로부터 분리된 첫 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드, 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인으로부터 분리된 두 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드, 및 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인으로부터 분리된 세 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드를 포함하는 단계;
(2) 두 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드와 비교하여 치환된 세 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드에서 하나의 아미노산을 동정하는 단계로서, 상기 치환된 아미노산이 히스티딘이 아닌 단계,
(3) 인플루엔자의 세 번째 스트레인이 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 증가된 복제, 독성 또는 숙주 사망률을 나타냄을 결정하는 단계,
(4) 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 세 번째 레플리킨 스캐폴드에 치환된 아미노산 잔기가 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 첫 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드에서의 아미노산 잔기 치환과 동일한 잔기 위치임을 결정하는 단계,
(5) 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 카운트를 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 조기 분리물의 레플리킨 카운트와 비교하는 단계,
(6) 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 카운트가 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 조기-발생 분리물의 레플리킨 카운트 보다 큰 것을 결정하는 단계, 및
(7) 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인에서의 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 단계를 포함하여, 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인에서 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 상기에서 논의되고 표 1에 기재된 바와 같이, 거위 레플리킨 및 기재된 레플리킨 스캐폴드에서의 루신의, H2N2 및 H3N2의 1957 및 1968 광역 유행병 스트레인에서의 이소루신으로, H7N7의 1972-2003 스트레인에서의 이소루신으로의 치환은 루신의, 2004년 베트남에서 H5N1의 출현 스트레인에서의 메티오닌으로, 및 2006년 인도네시아에서 H5N1의 출현 스트레인에서의 이소루신으로의 새로운 치환이 독성이 계속적 증가를 초래하는 예측적 영향력을 제공한다. 높은 사망률과 인간 간의 전파의 커플링의 증거로부터 알 수 있는 바와 같이, 베트남 및 인도네시아 스트레인의 독성은 명확하게 증가하였다.
그러므로, 본 발명의 방법의 비제한적인 바람직한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 스캐폴드 펩티드는 임의의 다른 아미노산에 대한 루신의 치환을 수행한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 치환은 루신 이외의 임의의 소수성 아미노산으로 이루어진다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 치환은 메티오닌 또는 이소루신으로 이루어진다. 또다른 바람직한 구체예에서, 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 스캐폴드 펩티드에서의 치환은 레플리킨 스캐폴드 펩티드의 위치 24이며, 대안적으로는 말단 히스티딘으로부터의 제 5 잔기 위치에서 이루어진다.
본 발명은 또한 바이러스 DNA를 분리시키고 서열화하고, 엔코팅된 아미노산 서열에 대해 얻어진 서열을 스캔하고, 아미노산 서열에 대해 본원에 기술된 예측 방법을 후속함을 포함하는 광역 유행병을 예측하기 위한 방법을 제공한다. 핵산 서열은, 아미노산의 서열을 인코딩하는 경우 아미노산 서열과 동족체이다. 본 발명의 방법의 바람직한 구체예에서, 광역 유행병을 예측하기 위한 방법은 얻어진 핵산 서열을 스캔하고, 거위 레플리킨의 위치 24에서의 변화를 결정하고, H5N1의 거위 레플리킨에서 S 치환의 존재를 기초로 하여 미래 광역 유행병을 예측함을 포함한다.
상기에서 논의된 비제한적인 방법은 발견되거나 이후에 기술될 수 있는 임의의 레플리킨 스캐폴드 시리즈에서 사용될 수 있다.
VII. 레플리킨을 사용하여 증가된 인플루엔자 독성을 예측하는 방법
본 발명은 또한 시간, 지리학 또는 전염병학적 이벤트에 따라 레플리킨 서열의 변화를 모니터함으로써 인플루엔자 바이러스의 스트레인에서의 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 비제한적인 방법을 제공한다. 인플루엔자 바이러스의 스트레인에서 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 방법은
(1) 인플루엔자 바이러스의 스트레인의 레플리킨 카운트가 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 조기 발생 분리물의 레플리킨 카운트 보다 큰 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인을 동정하는 단계;
(2) 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인에서 첫 번째 레플리킨 펩티드를 동정하는 단계;
(3) 히스티딘 잔기에서 이루어지지 않은 아미노산 치환을 제외하고 첫 번째 레플리킨 펩티드와 동족체인 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인에서 두 번째 레플리킨 펩티드를 동정하는 단계;
(4) 첫 번째 레플리킨 펩티드에서 아미노산 치환과 동일한 위치에서 아미노산 치환을 제외하고 두 번째 레플리킨 펩티드와 동족체인 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인에서 세 번째 레플리킨 펩티드를 동정하는 단계;
(5) 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인이 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인에 따른 증가된 복제, 독성 또는 숙주 사망률을 나타냄을 결정하는 단계;
(6) 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인이 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인에 따른 증가된 복제, 독성 또는 숙주 사망률을 증명함을 예측하는 단계를 포함한다.
본 방법의 바람직한 구체예에서, 아미노산 치환은 라이신 잔기 또는 히스티딘 잔기에서 이루어지지 않는다. 레플리킨 알고리즘은 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 레플리킨 펩티드 각각에서 만족되어야 한다.
본 발명은 또한 인플루엔자의 H5N1 스트레인로부터 분리된 인플루엔자 레플리킨 펩티드를 제공한다.
VIII. 쉬림프(shrimp) 백색 스폿 바이러스에서 동족체 스캐폴드 서열
본 발명자들은 추가로 백색 스폿 쉬림프 바이러스가 현재 시간까지 레플리킨에 대해 조사된 모든 다른 바이러스 및 유기체와 비교하여 특별히 높은 레플리킨 카운트를 가짐을 발견하였다(말라리아 제외). 레플리킨이 균류, 효모, 바이러스, 박테리아, 조류, 및 암 세포에서 빠른 복제의 필수적인 부속물인 것으로 보여지는 동안, 본 발명자들은 조류 이외의 해양 유기체에서 레플리킨의 존재의 첫 번째 증명을 제공한다. 그리고, 조류와 같이, 레플리킨의 존재는 다시 빠른 체내 침입과 관련이 있다. 쉬림프에서, 백색 스폿 바이러스는 먼저 동부 국가에서 및 현재 서반구 국가에서 수백 달러의 쉬림프의 수확을 훼손시켰다. 현재, 이에 대한 효과적인 예방 및 치료가 존재하지 않는다. 레플리킨 높은 사망률 해양 바이러스 질환의 다른 예는 어류, 예를 들어 잉어에서 나타났으며, 출혈성 질환은 연어에서 나타났으며, 해양 생태 및 질환에서 널리 퍼져있다.
쉬림프 백색 스폿 증후군 바이러스(WSSV)의 뉴클레오캡시드 단백질의 레플리킨의 반복 서열의 존재는 이상하게 높은 103.8의 레플리킨 카운트를 나타낸다. 이러한 바이러스 레플리킨 카운트는 예를 들어 1 내지 5 또는 7 미만의 범위를 가지는 인플루엔자 바이러스의 레플리킨 카운트 보다 상당히 높으며, 111의 열대열원충(Plasmodium Falciparum)(말라리아)에서 (지금까지) 관찰된 레코드 레플리킨 카운트와 비교가능하다. 흥미롭게도, 쉬림프 백색 스폿 증후군 유기체는 바이러스이며, 열대열원충이 트리파노좀인 한, 둘 모두는 적혈구에서 이의 생산적 사이클의 필수적인 부분을 소비하며, 쉬림프(백색 스폿 바이러스) 또는 수컷(말라리아)이 든지 드문 숙주 세포 모두는 이의 숙주의 높은 사망률을 갖는 빠른 복제 질환을 급격히 진행시키고, 둘모두는 이러한 높은 레코드, 즉 레플리킨 반복 및 레플리킨 중첩으로 이의 높은 레플리킨 카운트를 증가시키는 동일한 방법을 사용하는 것으로 나타난다.
본 발명자들은 치명적인 인플루엔자 바이러스와 바이러스의 레플리킨 스캐폴드 부분에서의 백색 스폿 바이러스 간의 상관관계를 성립시켰다. 두개의 바이러스 간의 상관관계는 종래에 제시되지 않았다. 광범위한 치환이 존재하지만, 쉬림프 스폿 증후군 바이러스의 수개의 짧은 레플리킨의 출원인의 발견은 특히 길이 및 중요한 라이신 (k) 및 히스티딘 (h) 잔기 (고정된 스캐폴드 또는 레플리킨 스캐폴드)과 관련하여 인플루엔자 바이러스 레플리킨 서열에 대해 상당한 상동성을 나타내며, 이는 레플리킨 생산의 유사한 메카니즘이 두개의 바이러스 그룹에서 사용됨을 제시한다.
표 2. 쉬림프 백색 스폿 스캐폴드화 (서열번호: 86-95는 각가 표시 순서대로 개시되어 있음)
Figure 112008081742318-PCT00003
본래 1917 거위 레플리킨 잔기와 동일한 잔기는 중간 회색으로 나타내었다. 아미노산 치환은 엷은 회색 및 진한 회색으로 나타내었다.
또한, 돼지 및 조류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 수많은 종이 인간 인플루엔자 감염증에 대한 동물 "보균체"를 제공하는 것으로 알려져 있기 때문에, 해양 형태, 예를 들어 쉬림프 바이러스는 돼지 인플루엔자 및 조류 독감과 같은 급증에 대해 가능한 조기 경보 진단 이익과 함께 시험될 수 있다. 일부 인플루엔자 바이러스의 유사성이 종들 간에 나타나고 이러한 바이러스 종간 이동이 알려져 있지만, 바이러스 활성을 측정하는 정량적 방법은 이전에 존재하지 않는다. 상이한 종으로 이동하는 증가된 활성에 대한 가능한 보균체를 시험하고, 이에 따라 할 수 있지 않았으며, 따라서 발달된 경고를 제공하는 것이 이전에는 가능하지 않았다. 각 종에서의 레플리킨의 활성은 증가된 바이러스 복제 속도의 증거 및 이후 다른 종으로 이동할 수 있는 종에서의 전염병의 출현의 증가에 대해 일정하게 모니터될 수 있다.
이러한 데이터는 추가로 자체의 히스토리, 및 빠른 복제의 공유된 기능 및 숙주의 질환과 함께 펩티드의 새로운 부류로서 레플리킨을 지지한다. 이의 쉬림프 숙주에 대한 높은 사망률과 관련하여, 백색 스폿 증후군 바이러스는 현재 바이러스 레플리킨의 조기 형태로서, 또는 같은 형태의 형태학적 분기로서 시험된 이의 레플리킨을 가질 수 있으며, 이러한 경우에서 인플루엔자 바이러스의 것과 같은 조류 및 동물 레플리킨에 대한 보균체로서 작용할 수 있다. 쉬림프에서의 이러한 레플리킨 발견의 진단적 및 예방적 용도는 이들이 인플루엔자에서 및 레플리킨을 함유한 다른 유기체에 대해 이루어지는 것으로 후속된다.
IX. SARS 바이러스 및 H3N2-복건성 인플루엔자 바이러스 레플리킨에서의 동족체 서열은 1918 광역 유행병으로 역추적된다.
특정 SARS 바이러스 레플리킨 펩티드는 거위 레플리킨과 동족체인 레플리킨 스캐폴드 서열을 지닌 동족체를 포함한 인플루엔자 바이러스 분리물의 여러 스트레인에서 펩티드를 지닌 동족체를 공유한다. 동족체는 2006년의 치명적인 인플루엔자 스트레인으로부터 2천만명 이상의 사망의 원인인 1918 인플루엔자 광역 유행병의 스트레인에서의 서열로 역으로 연장한다.
SARS 코로나바이러스는 최초로 2002-2003 인플루엔자 시즌에 나타났다. 인플루엔자 GR 및 코로나바이러스 레플리킨 (또는 일부 알려지지 않은 공유된 전구체)로부터 2002년 SARS 레플리킨의 이중 기원은 2002년에 모두 발생된 하기 이벤트에 의해 제안된다: 1) 29에서 28 아미노산으로 GR-H1N2 레플리킨 서열에 나타난 85년간 최초의 축합(표 3)(유사한 축합은 H3N2 복건성에서 현 전염병에서의 29에서 27 아미노산에서 발견됨(표 3)); 2) H1N2로부터 이동하는 GR과 일관된 현저한 쇠퇴를 나타낸 GR-H1N2의 레플리킨 카운트; 3) 현저한 증가를 나타낸 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질의 레플리킨 카운트; 및 4) 하기 모티프를 함유한 레플리킨을 지닌 2002-2003년에 나타난 SARS 코로나바이러스: 종래에 GR 1918 and GR-H1N2 2001에서 나타난 'kkg’ 및 'k-k’; 인플루엔자 GR-H1N2 2001에 나타난 'k-kk’, 'kk’ 및 'kl’; 새 기관지염 코로나바이러스 레플리킨에 나타난 'kk’ ; 및 돼지 전염병 설사 코로나바이러스의 레플리킨에 나타난 'kk-kk-k’(서열번호: 96), 'k-k’, 'kk’, 'kl’ 및 'kt’(표 3).
표 3.
1917년에서 2003년까지의 상이한 인플루엔자 스트레인에서의 거위 레플리킨(GR) 서열; SARS 및 H3N2-후지안 외형 2002-2003.
Figure 112008081742318-PCT00004
1917 레플리킨 카운트에 접근하는, H1N2 (표 3)에서, 1917 거위 레플리킨의 존재를 포함하는, 최근 점차 증가하는 높은 레플리킨 카운트 피크는 이미 개시된 것일 수 있는 다가오는 광역 유행병의 경고일 수 있는데, 이는 SARS 바이러스 및 H3N2-복건성 바이러스가 높은 사망률과 관련된 것으로 보여지는(도 17) 거위 레플리킨의 짧은 레플리킨 유도체의 현존하는 담체이기 때문이다.
거위 레플리킨이 인플루엔자 및 SARS의 A-스트레인의 대부분 또는 모두를 포함하는 적어도 85년 히스토리를 가지기 때문에, 이와 이의 구성성분은 판(pan)-스트레인 보호를 위한 보존된 백신 후보물질이다. 거위 레플리킨과 비교하여 %라이신 및 히스티딘에서 풍부한 길이 7 내지 21개의 아미노산인 축합된 짧은 SARS 레플리킨은 길이가 29개의 아미노산인 거위 레플리킨의 사망률(2.5%)과 비교할 때, SARS의 보다 높은 사망률(10-55%)과 결합하여 발생하였다. 이는 또한 다른 유기체, 예를 들어 에볼라 및 천연두 바이러스 및 탄저병 박테리아의 레플리킨에 대한 경우이다(표 3). 이러한 짧은 SARS 레플리킨은 심지어 보다 큰 미처리된 사망률과 관련된 다른 유기체, 예를 들어 천연두, 탄저병, 및 에볼라의 짧은 레플리킨을 지닌 놀라만한 동족체를 나타내었다(표 3). 인플루엔자 레플리킨을 지닌 SARS 코로나바이러스 동족체에서 레플리킨의 검출은 백신에 대한 작은 SARS 항원의 합성을 허용하였다.
짧은 합성 백신은 보다 적은 값으로 더욱 빠르게 생산될 수 있으며, 일반적으로 현존하는 전체 바이러스 백신에서 수천의 요망되지 않는 단백질의 다중 에피토프에 의해 야기되는 오염 및 면역원적 방해에 대해 수반되는 부작용을 방지할 수 있다. 짧은 신경교종 레플리킨 'kagvaflhkk’(서열번호: 321)은 합성을 위한 성공적인 주성분인 것으로 증명되었다[참조, 미국특허번호 6,242,578]. 이는 항-말리그닌 항체를 생산하였으며, 이는 피코그램/세포에서 암 세포에 대해 독성적이고 암 환자의 생존에 정량적으로 관련이 있다. 본 출원인은 뉴클레오캡시드, 스파이크(spike), 및 엔벨로프 단백질에서 발견된 5개의 SARS 짧은 레플리킨을 합성하였다[참조, 실시예 6]. 본 출원인은 이러한 합성적 짧은 SARS 레플리킨이 토끼에 주입될 때 또한 풍부한 특이적 항체를 생산함을 발견하였다. 예를 들어, 21개의 아미노산 SARS 뉴클레오캡시드 레플리킨 항체는 204,800 중 1 보다 큰 희석으로 결합한다. 다양한 작은 펩티드와 함께 달성하기 위해 다른 것에 의한 종래 성공적이지 못한 시도 때문에, 원치않는 부작용없이 강력한 면역 반응은 전체 단백질 또는 천연두 백신에서와 같은 수천의 단백질 또는 핵산과 함께 얻어지며, 강력한 면역 반응을 달성하기 위한 작은 합성 레플리킨 항원의 능력은 이러한 SARS 백신의 효능에 대해 상당하다.
본 출원인은 증가된 사망률에 대한 인플루엔자 및 SARS 바이러스에서의 레플리킨 구조와 도 17에 도시된 바와 같은 결과와의 상관관계를 시험하였다. 짧은 또는 축합된 레플리킨 서열에 대한 높은 사망률의 관계는 인플루엔자 및 SARS 이외의 바이러스에서, 및 박테리아, 말라리아 및 암에서 도 17의 섹션 B에 나타낸 높은 사망률의 유기체에서 나타난다. 레플리킨 구조의 단일화 개념 및 복제가 증식 및 독성에 대해 결정적인 광범위한 바이러스, 박테리아, 말라리아 및 암 유기체에서 기본적인 레플리킨 구조의 유행 이외에, 임의의 세포 타입 또는 감염성 유기체 보다 오히려 빠른 복제에 대한 레플리킨의 관계의 지지에 있어서, 하기 동족 서열이 관찰되었다: 위치 1 및 2에서 “k” 참조, 도입을 위해 또는 빠른 복제를 자극하기 위한 리간드 또는 DNA, RNA 또는 다른 수용체에 존재하는 것과 같은 "k"의 배열을 참조, "이중 k" 및 "다중 k"의 빈도를 참조, 위치 3에서 "g"의 빈도 참조, 천연두 바이러스, 탄저병 바이러스, 라우스 육종 바이러스 및 교아세포종 다중형태(글리오마), 결장 및 유방암에서의 c-src, 및 흑색종 및 결장암에서의 c-yes 만큼 다양한 가장 높은 사망률의 유기체, 암 세포 및 유전자와 결합된 가장 축합된 짧은 레플리킨에서 삼중자 “kkg”, “hek”, “hdk” 및 “hkk”의 발생 참조. 또한 호주 및 동남아시아에서 높은 사망률로 최근에 발생하는 두개의 바이러스, 니파(Nipah) 및 헨드라(Hendrah) 바이러스에 대해 거의 동일한 레플리킨 구조를 갖는다. 이러한 두개의 바이러스는 이에 대해 형성된 유사하거나 동일한 항체를 갖는 것으로 보고되었지만, 어떠한 구조적 기초도 지금까지 이에 대해 알지 못하였으며, 본 출원인의 발견은 이러한 유사한 항체에 대해 이의 두개의 거의 동일한 레플리킨이다.
표 3은 또한 본 출원인이 1917년의 인플루엔자 거위 레플리킨과 두개의 코로나바이러스, 새 기관지염 코로나바이러스 및 돼지 전염병 설사 바이러스 모두를 발견한 2003년 5개의 SARS 레플리킨의 상관관계를 나타낸 것이다. 표 3 및 도 17에서 첫 번째의 2003 인간 SARS 레플리킨은 2002년 인플루엔자 H1N2의 중간 구조를 통해 인플루엔자 바이러스 거위 1917 및 인간 1918 레플리킨에 대한 특정 서열 동족체를 나타낸다[예를 들어, 위치 1, 18 및 19에서 레플리킨 “k”]. 1917 거위 레플리킨 서열은 표 3 및 도 17에서 1999년 까지 레플리킨의 정의에 대해 중요하지 않은 아미노산에서의 수많은 치환에도 불구하고 크게 보존되었음을 나타내고 있다[치환은 이탤릭체로 나타내었다]. 본래 29 아미노산 1917 레플리킨 서열은 2001 H1N2 레플리킨에서 1917-1918의 이의 구조로 거의 정확하게 복구되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 2002 H1N2 인플루엔자 레플리킨은 29에서 28 아미노산으로 단축되며, 아미노산 kevl(i/v)wg (v/i)hh의 "왼쪽으로의 이동"은 명확하게 증명된다.
2003년에서, 하나의 레플리킨은 먼저 기술된 2003 인간 SARS 바이러스의 21 아미노산 레플리킨으로 추가로 단축된다(또는 압축된다). 2003 SARS 레플리킨의 %k는 거위 레플리킨 및 1918 인간 광역 유행병 레플리킨의 20.7%와 비교하여 38.1% (8/21)이다. 인플루엔자 29 아미노산 레플리킨과 비교하여, 3개의 SARS 레플리킨은 각각 19, 11 및 9 아미노산 길이 서열로 추가로 단축됨(또는 압축됨)을 발견하였다. 나타낸 SARS 9 아미노산 서열에서, % k는 44.4% (4/9)이다. SARS 레플리킨의 단축과 관련하여, 인간에서의 SARS 사망률은 1918 인플루엔자 광역 유행병의 2.5% 사망률과 비교하여, 어린이는 10%, 및 성인은 55.5%로 상승하였다.
아미노산 서열은 표 3에서 인플루엔자 레플리킨의 85년(1917-2002) 동안의 동족체 및 보존의 정도를 강조하는 것으로 나타나며, 이를 위한 증거는 1917 거위 레플리킨에서 최초로 관찰되었다. 이러한 보존은 이전에 관찰되지 않았다. 표 3은 또한 1917 거위 레플리킨 및 1918 인간 광역 유행병 인플루엔자 레플리킨으로서 최초로 나타난 인플루엔자 레플리킨에 대한 동족체를 갖는 것 이외에 2003 인간 SARS 바이러스에서의 레플리킨이 코로나바이러스 새 기관지염 바이러스 레플리킨 (예를 들어, 위치 1 및 2에서의 “k”, “h”에서의 말단) 및 코로나바이러스 급성 설사 바이러스 레플리킨 (예를 들어, 위치 1 및 11에서의 “k”, 레플리킨의 말단에서의 “h”) 모두에 대한 특정 서열 동족체를 나타냄을 기술한 것이다. 인플루엔자 및 코로나바이러스 레플리킨 둘 모두에 관련된 이러한 증거는 SARS가 수개의 최근 인플루엔자 전염병 및 보다 이른 광역 유행병으로서 홍콩에서 상승되었기 때문에 고려되며, SARS 바이러스는 부분적으로 뉴클레오캡시드, 스파이크 및 엔벨로프 단백질을 포함한, 이의 구조로 인해 신규한 코로나바이러스로서 분류된다. 특정 전염병학적 증거는 또한 전염병 폐렴으로서 인간에서 최초로 나타난 SARS에서 관련되며, 이는 배설물 오수가 심각하게 고이는(back-up) 군집화된 홍콩 아파트에서 분출되며, 이는 환기 팬에 의해 공기로 운반된다.
X. 인플루엔자 백신, 치료 및 치료제
본 발명은 또한 상술된 임의의 하나 이상의 분리된 서열, 또는 상술된 임의의 하나 이상의 분리된 서열의 임의의 항원성 서브서열, 또는 상술된 임의의 분리된 서열에 결합한 항체 또는 이의 서브서열을 포함한 백신을 제공한다.
일반적으로, 인플루엔자용 백신 제형은 국제 WHO 및 CDC 회의에서 일년에 2회 변경된다. 백신 제형은 세계의 제공된 지역에서 가장 현존하는 다수의 인플루엔자 바이러스 스트레인의 혈청학적 증거를 기초로 한 것이다. 그러나, 본 발명의 이전에 인플루엔자 바이러스 스트레인 특이적 아미노산 서열 변화와 인플루엔자 전염병 또는 광역 유행병의 발생의 관계를 나타내지 않는다.
인플루엔자 바이러스 단백질 중의 특정 레플리킨 및 이의 농도의 관찰은 인플루엔자 광역 유행병 및 전염병의 최초의 특정 정량적 조기 화학적 상관물을 제공하며, 세계의 특정 지역에서 인플루엔자 바이러스의 널리 퍼진 출현 또는 재출현 스트레인을 치료하기 위해 상세하게 조작된 인플루엔자 백신의 생산 및 시간에 따른 투여를 제공한다. 레플리킨의 존재, 농도 및/또는 보존에 대해, 적혈구 응집소 단백질 서열과 같은 인플루엔자 바이러스의 스트레인의 분리물의 단백질 서열을 분석함으로써, 인플루엔자 바이러스 광역 유행병 및 전염병은 예측될 수 있다. 더욱이, 이러한 인플루엔자의 급증의 중증도는 가장 풍부한 것으로 발견되거나 바이러스 분리물에서 상승되는 것으로 보여지는 레플리킨 서열을 기초로 한 인플루엔자 펩티드 백신을 약 1 내지 약 3년의 제공된 시간에 걸쳐 투여함으로써 현저하게 감소될 수 있다.
본 발명의 인플루엔자 펩티드 백신은 단일 레플리킨 펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 인플루엔자 바이러스 스트레인에서 관찰된 다수의 레플리킨 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 펩티드 백신은 제공된 시간에 걸쳐 농도가 증가되는 것으로 보여지고 적어도 이러한 시간 동안 보존되는 레플리킨 서열(들)을 기초로 한다.
예를 들어, 바람직한 백신은 레플리킨 스캐폴드의 구성원인 레플리킨 서열을 포함할 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 고도로 치명적인 스트레인과 레플리킨 스캐폴드 서열의 상관관계와 조합하여 레플리킨 스캐폴드의 고도로 보존된 성질은 레플리킨 스캐폴드 서열이 합성 백신에 대한 바람직한 서열인 것으로 이루어진다. 거위 레플리킨 스캐폴드의 일원은 토끼 및 닭에 피하로 투여될 때 강력한 면역 반응을 제공하여 유효성을 증명하였다[참조, 실시예 7].
본 발명의 백신은 신규한 레플리킨(들) 펩티드와 조합하여 보존된 레플리킨 펩티드(들)을 포함할 수 있거나, 신규한 레플리킨 펩티드 서열을 기초로 할 수 있다. 레플리킨 펩티드는 화학적 합성 또는 재조합 유전자 기술을 포함한 임의의 방법에 의해 합성될 수 있으며, 비-레플리킨 서열을 포함할 수 있지만, 단지 레플리킨 서열을 함유한 펩티드를 기초로 한 백신이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 백신 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 애주번트를 함유한다.
본 발명의 인플루엔자 백신은 단독으로 또는 항바이러스 약물, 예를 들어 간시클로비르(gancyclovir); 인터페론; 인터루킨; M2 억제제, 예를 들어 아만타딘, 리만타딘; 뉴라미니다제 억제제, 예를 들어 자나미비르(zanamivir) 및 오셀타미비르(oseltamivir) 등 뿐만 아니라, 항바이러스 약물의 조합물과 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 인플루엔자 백신은 면역 반응에서 항체를 생산할 수 있는 임의의 동물에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 인플루엔자 백신은 토끼, 닭, 돼지 또는 인간에 투여될 수 있다. 본 발명의 인플루엔자 백신은 일 범위의 인플루엔자의 스트레인 또는 인플루엔자의 특정 스트레인에 관한 것일 수 있다.
본 발명에 따른 비-제한적인 양태에서, 인플루엔자 백신은 인플루엔자 B, (A)H1N1, (A)H2N2, (A)H3N2, H5N1 또는 이후에 비롯될 수 있는 바이러스의 임의의 인간 변형체를 포함한 인플루엔자의 동물 또는 인간 스트레인, 뿐만 아니라 현존하는 조류 H5N1과 같은 동물에서 지배적인 인플루엔자의 스트레인에 대한 면역 반응에 관한 것일 수 있다. 인플루엔자 백신은 또한 인플루엔자 단백질의 임의의 부분에서의 특정 레플리킨 아미노산 서열에 관한 것일 수 있다. UTOPE KKKKHKKKKH (서열번호: 328)에 공유 결합된 H5N1 바이러스 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHH (서열번호: 327)의 레플리킨 스캐폴드 및 널리 공지된 키홀 삿갓조개 시아닌 애주번트를 포함한 인플루엔자 백신은 닭 및 토끼에서 강력한 면역 반응을 제공하였다[참조, 실시예 7].
본 발명의 비-제한적인 구체예는 레플리킨 스캐폴드 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH (서열번호: 1)를 포함한 인플루엔자 백신을 제공하며, 여기서 [S]는 그밖에 약 동일한 레플리킨 펩티드 서열을 포함한 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 치환된 임의의 아미노산일 수 있다. 바람직한 구체예에서, [S]는 소수성 아미노산일 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, [S]는 메티오닌 또는 이소루신일 수 있다. 또다른 바람직한 구체예에서, 상술된 서열은 인플루엔자의 H5N1 스트레인으로부터 분리된다.
또다른 비-제한적인 양태에서, 인플루엔자 백신은 UTOPE, 예를 들어 KKKKH (서열번호: 329) 또는 KKKKHKKKKKH (서열번호: 330)를 포함할 수 있다. 또다른 대안으로, 백신은 애주번트, 예를 들어 본원에 -KLH로 기재된 키홀 삿갓조개 헤모시아닌의 첨가를 포함할 수 있다. 또다른 바람직한 비-제한적인 양태에서, 인플루엔자 백신은 두개의 UTOPES 및 애주번트 서열, 예를 들어 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVMWGIHH KKKKHKKKKKHK-KLH (서열번호: 331) 또는 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVIWGIHH KKKKHKKKKKHK-KLH (서열번호: 332)를 추가로 포함한 인플루엔자 H5N1의 레플리킨 스캐폴드를 포함할 수 있다. 본 발명의 양태는 이전에 분리되고 “2004 H5N1 베트남, 고도 병원성" 또는 “2006 인도네시아, 고도 병원성"으로 라벨링된 조류 독감 레플리킨 중 하나로서 표 1에 나타낸 레플리킨 스캐폴드 서열을 포함할 수 있다.
토끼 및 닭에 피하로 주입된 100 ㎍의 백신의 펩티드의 투여와 관련하여, 항체 반응은 1:120,000 내지 1:240,000의 희석액의 백신화 후에 3주 내지 4주 후에 피크에 도달시키기 위해 1:50 미만의 비백신화된 희석액으로 예상된다.
레플리킨, 예를 들어, 신경교종 레플리킨 (서열번호: 321) “kagvaflhkk” 또는 간염 C 레플리킨 (서열번호: 333) “hyppkpgcivpak”, 또는 HIV 레플리킨, 예를 들어 (서열번호: 334) “kcfncgkegh” 또는 (서열번호: 335) “kvylawvpahk”를 기초로 한 합성 레플리킨 백신, 또는 바람직하게는 제공된 시간에 따라 보존되고/거나 출현하거나 재출현한 레플리킨(들)을 기초로 한 인플루엔자 백신은 개개의 바이러스 감염된 세포를 용리시키고 화학 치료가 이후 효과적일 수 있는 바이러스를 세포밖으로 방출하기 위해 항체 농도를 증가시키는데 사용될 수 있다.
레플리킨 분절을 인식하고 이에 부착되는 항체를 유도하고 이에 의해 세포의 파괴를 야기시키는 것을 요구할 때 단지 레플리킨 구조를 사용하는 것이 바람직하다. 보다 큰 단백질 서열이 당해 분야에서 "복제 관련 기능"을 갖는 것으로서 알려져 있는데도, 보다 큰 단백질을 이용한 백신은 종종 실패되거나 효과적이지 않은 것으로 증명되었다.
본 발명자들이 단일 이론으로 유지되는 것을 원하지 않는 한, 본원에서의 연구는 종래 백신이 항체 및/또는 세포 면역원성의 형태의 적절한 면역 반응을 생산하지 못하고, 보호되지 않음을 제시하는데, 이는 이들이 보다 큰 단백질 서열의 사용을 기초로 한 것이다. 보다 큰 단백질 서열은 변함없이 하나 이상의 에피토프(특이적 항체 형성을 유도할 수 있는 독립적 항원성 서열)를 가지며; 레플리킨 구조는 일반적으로 이러한 가능한 에피토프 중 하나를 포함한다. 보다 큰 단백질 내에 다른 에피토프의 존재는, 면역 시스템을 레플리킨 항원에 대신할 수 있는 부적절한 항원성 자극을 "범람하게" 함으로써, 레플리킨에 대한 항체의 적합한 형성을 방해할 수 있다[예를 들어, Webster, R.G., J. Immunol., 97(2):177-183 (1966); and Webster et al., J. Infect. Dis., 134:48-58, 1976; Klenerman et al, Nature 394:421-422 (1998) 이는 항원성 탁월성의 널리 공지된 현상에 대해, 이에 의한 첫 번째 펩티드 에피토프는 존재하고 면역 시스템에 의해 인식된 후 보급되며, 항체는 다른 펩티드 에피토프가 동시에 존재시에도 이에 존재한다. 이는 백신 제형에서, 유기체로부터의 다른 에피토프를 존재하게 하기 전에 레플리킨이 선취되지 않고 면역원성 메모리에 로딩되도록 먼저 면역 시스템에 일정한 레플리킨 펩티드를 존재시키는 것이 중요한 다른 이유이다.
레플리킨 백신에 대한 정량적 측정 조기 반응(들)
레플리킨 백신에 대한 일일 또는 수주내에 정량적으로 조기 특이적 항체 반응을 측정하기 위한 능력은 단지 임상적 반응 개월 또는 년도 이후에 측정될 수 있는 다른 백신에 대한 중요한 실제적 장점이다.
애주번트
프로운드(Freund)(완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예를 들어 알루미늄 히드록사이드, 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키 삿갓조개 헤모시아닌, 딘트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 애주번트, 예를 들어 BCG 및 코르리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum.)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 애주번트는 숙주 종에 따라 면역 반응을 향상시키는데 사용될 수 있다. 백신으로서 합성 UTOPE의 사용을 제외하고, UTOPE는 애주번트로서 다른 레플리킨 백신 및 비-레플리킨 백신에 사용될 수 있다.
UTOPE
높은 %k 레플리킨은 토끼에 투여될 때 가장 높은 항체 반응을 발생시키는 것으로 나타난다. 본 발명자에 의해 관된 이러한 합성 펩티드는 보편적 합성 에피토프, 또는 “UTOPE"로서 명시되며, 이러한 UTOPE를 기초로 한 백신은 “UVAX”로 명시된다. UVAX, 추론된 합성 백신은 단독 백신으로서 또는 보다 특이적 레플리킨 백신 또는 다른 백신으로 투여될 때 애주번트로서 사용될 수 있다. 하기는 추론된 UTOPE 및 UVAX의 예이다:
고안된 합성 레플리킨 서열번호:
(UTOPE 또는 UVAX)
KKKKHK 336
KKKHKK 337
KKHKKK 338
KHKKKK 339
KKKKKKH 340
KKKKKHK 341
KKKKHKK 342
KKKHKKK 343
KKHKKKK 344
KHKKKKK 345
HKKKKKK 346
레코그닌 및/또는 레플리킨 펩티드는 피검체의 면역 시스템을 유도하여 항-레플리킨 항체를 생산하기 위해 피검체에 투여될 수 있다. 일반적으로, 0.5 내지 약 2 mg 용량, 바람직하게는 1 mg 용량의 각 펩티드는 피검체에 투여하여 면역 반응을 유도한다. 이후 용량은 요망되는 경우 투여될 수 있다.
치환의 동정은 백신의 조기 개발을 제공한다
인플루엔자 바이러스 백신의 생산을 위한 종래 달걀 및 세포-계열 방법은 요망되지 않는 부작용을 생산하고, 제조하는데 6 내지 8개월 이상 소요되고 시험하기 위해 그 이상의 시간이 소요될 수 있는 수천의 원치않는 단백질을 함유한다. FluForecast®는 전염병 또는 광역 유행병인 1 내지 3년의 이전 스트레인-특이적 경고를 허용하며, 중요한 레플리킨 및 치환된 아미노산 "S"의 발견은 시험을 위해 수일 내에 즉시 제조될 수 있는 더욱 정확하고, 잠재적으로 안정한 합성 백신을 허용한다.
H5N1에서 거위 레플리킨에서의 S-치환을 동정하는 것은 H5N1에서 S-치환으로부터 얻어진 미래 인간 광역 유행병에 대한 백신의 개발을 위한 타겟으로 당업자에게 제공한다. 백신은 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH (서열번호: 1)의 임의의 부분을 포함할 수 있으며, 여기서, 위치 24(말단 히스티딘으로부터의 5개의 잔기)에서의 S-치환은 임의의 아미노산 치환을 나타낼 수 있다. 바람직한 구체예에서, S-치환은 루신 이외의 아미노산을 나타낸다. 더욱 바람직한 구체예에서, S-치환은 루신 이외의 소수성 아미노산을 나타낸다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 치환은 메티오닌 또는 이소루신을 나타낸다. 하나의 비-제한적인 백신 구체예는 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH (서열번호: 1)의 7 내지 29개의 아미노산을 포함한다. 다른 비-제한적인 구체예에서, 백신은 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHH (서열번호: 327)의 7 내지 29개의 아미노산을 포함한다. 백신은 또한 대안적으로는 애주번트, 예를 들어 키조개 헤모시아닌 또는 임의의 다른 애주번트 및/또는 UTOPE, 예를 들어, KKKKHK (서열번호: 336) 또는 임의의 다른 UTOPE를 포함할 수 있다. 다른 비-제한적인 구체예에서, 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHH (서열번호: 327)의 7 내지 29개의 아미노산 항원성 서브서열에 대한 항체가 고려된다. 본 발명의 레플리킨 스캐폴드 또는 레플리킨 서열의 약 7 내지 약 29개의 아미노산을 갖는 임의의 항원성 서브서열은 항체를 생산하기 위한 면역 시스템의 백신 및 자극을 위해 고려된다.
서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[S]WGIHH (서열번호: 1) 모두 또는 임의의 부분에 대한 항체는 당업자에 의해 개발될 수 있다. 위치 24를 포함한 에피토프에 구체적으로 관련된 항체는 마찬가지로 당업자에 의해 개발될 수 있다. 바람직한 구체예에서, S-치환은 루신 이외의 아미노산을 나타낸다. 더욱 바람직한 구체예에서, S-치환은 루신 이외의 임의의 소수성 아미노산을 나타낸다. 또다른 바람직한 구체예에서, S-치환은 메티오닌 또는 이소루신을 나타낸다. 예를 들어, 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV(M/I) (서열번호: 347)을 포함한 서열 모두 또는 임의의 일부에 대한 항체는 당업자에 의해 개발될 수 있다.
S 치환을 갖는 거위 레플리킨 서열에 대한 항체는 H5N1으로부터의 감염증을 서열에 대한 항체로 치료하기 위하거나 조류, 동물 또는 인간에서 H5N1의 치명적인 감염증을 진단하기 하기 위해 사용될 수 있다.
최근에 시험된 모든 레플리킨 서열은 면역원성 성질을 나타낸다. 토끼에 말리그닌으로부터의 16-머 레플리킨의 주입은 16-머 레플리킨에 대한 특이적 항체를 생산한다[U.S. 6,242,578 B1의 실시예 6 및 도 9A 및 9B]. SARS 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드, 스파이크, 및 엔벨로프 단백질에서 발견된 SARS 레플리킨은 합성되고 토끼에서 시험되었다. 면역 반응은 정량화된다[참조, 실시예 6]. 백신 V120304U2로 명시된 41 아미노산 레플리킨 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHKKKKHKKKKKHK-KLH (서열번호: 348)는 본 발명자에 의해 H5N1 스캐폴드의 C-말단 말단 상이 두개의 UTOPE 유닛 (KKKKHK) (서열번호: 336) 및 두개의 UTOPE 유닛의 C-말단 단부 상에 공유 연결된 추가 애주번트 (키홀 조개 헤모시아닌 (-KLH로 기재됨))의 첨가와 함께 표 1에서 “2004 H5N1 베트남, 고도 병원성"으로 라벨링된 H5N1 “조류 독감” 인플루엔자 레플리킨의 29개 아미노산 레플리킨 스캐폴드로부터 디자인된다. 100 ㎍의 백신 V120304U2는 토끼 및 닭에 피하로 주입된다. 항체 반응은 백신화 전에 및 주입하고 일주일 내지 8주 후에 측정되었다. 항체 반응은 일 주일에 확인되었고, 백신화 후 3주 내지 4주에 피크에 도달한다. 피크 항체 반응은 1:120,000의 희석 내지 1:240,000 초과의 희석 범위이다. 당업자는 본원에 논의된 레플리킨 서열 및 레플리킨 스캐폴드 서열 각각에 대한 항체를 개발할 수 있다.
레플리킨 뉴클레오티드 서열
레플리킨 DNA 또는 RNA는 바이러스, 박테리아 또는 다른 레플리킨 인코딩제로의 감염으로부터 얻어진 질환의 진단을 위한 다수의 용도를 가질 수 있다. 예를 들어, 레플리킨 뉴클레오티드 서열은 조직 샘플에서의 특정 유기체 또는 환경 샘플에서의 특정 유기체의 존재를 진단하기 위해 본 장소 혼성 검정을 포함한 생체검사된 조직 또는 혈액의 혼성 검정, 예를 들어 서던 또는 노던 분석에서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 고려되는 특정 병원체에 존재하거나 상세하게는 특정 레플리킨에 혼성화한 핵산 분자(센스 또는 안티센스)를 함유한 특정 레플리킨에 대해 특이적인 항체, 및 임의적으로 진단을 위해 필요한 다양한 완충제 및/또는 제제를 함유한 키트를 고려한다.
또한 본 발명의 범위내에, 레플리킨- 또는 레코그닌-함유 mRNA의 전일르 억제하기 위해 기능하는 안티센스 RNA 및 DNA 분자 및 리보자임을 포함한 올리고리보뉴클레오티드 서열이 존재한다. 두개의 안티센스 RNA 및 DNA 분자 및 리보자임은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 안티센스 분자는 피검체에 전달을 위한 다양한 벡터에 도입될 수 있다. 당해 기술자는 최고의 전달 경로를 용이하게 결정할 수 있지만, 일반적으로, i.v. 또는 i.m. 전달이 일반적이다. 투여량은 또한 용이하게 확정된다.
특히 바람직한 안티센스 핵산 분자는 mRNA 코딩에 함유된 레플리킨 서열에 상보적인 것, 예를 들어, 일플루엔자 바이러스 폴리펩티드이며, 여기서 레플리킨 서열은 (1) 두 번째 라이신 잔기로부터 6 내지 10개 잔기에 위치된 하나 이상의 라이신 잔기; (2) 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 라이신 잔기를 포함한 7 내지 약 50개 아미노산을 포함한다. 더욱 바람직하게는 유전자의 코딩 가닥에 존재하는 레플리킨 또는 인플루엔자 바이러스 적혈구 응집소 단백질을 인코딩하는 mRNA에 상보적인 안티센스 핵산 분자이며, 여기서 안티센스 핵산 분자는 6개월 내지 1년 이상의 기간에 걸쳐 보존되는 것으로 증명되고/거나 다른 인플루엔자 바이러스 스트레인의 레플리킨 농도에 대해 레플리킨의 농도 증가를 갖는 것으로 나타난 인플루엔자 바이러스의 스트레인에 존재된 레플리킨을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보적이다. 레플리킨 농도의 증가는 바람직하게는 적어도 6개월, 바람직하게는 약 1년, 가장 바람직하게는 약 2 또는 3년 이상의 기간에 걸쳐 일어난다.
유사하게는, 레플리킨을 인코딩하는 mRNA에 대해 상보적인 mRNA에 대해 상보적인 안티센스 핵산 분자는 (1) 두 번째 라이신 잔기로부터 6 내지 10개 잔기에 위치된 하나 이상의 라이신 잔기; (2) 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및 (3) 적어도 6% 라이신 잔기를 포함한 7 내지 약 50개 아미노산의 레플리킨 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는 유전자의 코딩 가닥 또는 바이러스의 단백질을 인코딩하는 mRNA에 대해 상보적인 안티센스 핵산 분자이다.
XI. 컴퓨터
본 발명은 또한 컴퓨터를 이용하여 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인에서의 독성 증가를 예측하기 위한 방법을 제공한다. 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 포함한 데이터 뱅크는 또한 레플리킨 및 레플리킨 스캐폴드 펩티드를 함유한 인플루엔자 스트레인의 존재에 대해 컴퓨터에 의해 스캔되어 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인이 독성을 증가시킨다는 예측을 위한 요구사항을 만족시킬 수 있다.
도 2는 본 발명의 이전 구체예를 이용하기 위해 이용가능한 컴퓨터의 블록 다이아그램이다. 컴퓨터는 프로세서, 입력/출력 디바이스 및 이전 구체예의독성 예측 방법을 나타낸 기억저장 실행가능한 프로그램 설명서를 포함할 수 있다. 메모리는 정적 메모리, 휘발성 메모리 및/또는 비휘발성 메모리를 포함할 수 있다. 이러한 정적 메모리는 통상적으로 자기적 또는 전기적 또는 광학적 저장 매체에 제공된 메모리("ROM")을 읽을 수 있다. 휘발성 메모리는 통상적으로 무작위 액세스 메모리("RAM")일 수 있고, 프로세서내에 캐시(cache)로서 통합되거나 별도의 집적 회로로서 프로세서로부터 외부적으로 제공될 수 있다. 비-휘발성 메모리는 전기적, 자기적 또는 광학적 저장 매체일 수 있다.
하기 실시예는 단지 본 발명의 설명하기 위한 것으로서 본원에 제공된 본 발명의 전체 범위를 제한하지 않는다. 본 발명의 개질예 및 변형예는 상기 교시에 의해 및 본 발명의 정신 및 의도된 범위를 벗어나지 않고 첨부된 청구항의 범위내에 포함되는 것으로 인식될 것이다.
도 1은 여러 유기체에서 레플리킨의 발생 횟수를 도시한 막대 그래프이다.
도 2는 인플루엔자 바이러스의 적어도 3개의 스트레인의 레플리킨 스캐폴드를 비교함으로써 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 방법을 수행하기 위해 컴퓨터가 사용된 본 발명의 일 양태를 도시한 박스 다이아그램이다.
도 3은 레코그닌(recognin) 16-머(mer)(서열번호: 350)에 노출에 대한 반응으로 형성된 항말리그닌 항체의 양을 나타낸 막대 그래프이다.
도 4A는 통상적으로 얻어진 혈액 얼룩 및 형광으로 얻어진 혈액 얼룩의 사진이다. 도 4B는 두개의 백혈구의 존재를 나타낸 통상적으로 및 형광으로 얻어진 혈액 얼룩의 사진이다. 도 4C는 항말리그닌 항체의 존재하에 신경교종 세포의 조밀한 층의 사진이다. 도 4D 및 도 4E는 항말리그닌 항체의 첨가 후 30 및 45분에 얻어진 도 4C에서의 세포 층의 사진이다.
도 4F는 항말리그닌 항체에 의해 시험관내에서 소세포 폐 종양 세포의 성장 억제를 나타낸 막대 그래프이다.
도 5는 수술전 및 수술 후의 양성 또는 악성 유방 질환을 갖는 환자의 혈청에 존재하는 항말리그닌 항체의 양의 플롯이다.
도 6은 1918에서 2001년까지 연도기준으로 매년 인플루엔자 B 및 인플루엔자 A 스트레인, H1N1의 적혈구 응집소에서 관찰된 레플리킨의 농도를 도시한 그래프이다.
도 7은 1950에서 2001년까지 연도기준으로 매년인플루엔자 A 스트레인, H2N2 및 H3N2, 뿐만 아니라 이의 구성요소 레플리킨에 의해 규정된 출현하는 스트레인, 지시된 H3N2(R)의 적혈구 응집소에서 관찰된 레플리킨 농도의 그래프이다.
도 8은 1917년에서 2002년까지 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 레플리킨을 포함한, 수개의 바이러스 스트레인에 대해 1년 당 레플리킨 카운트를 도시한 그래 프이다.
도 9는 뉴클레오캡시드 코로나바이러스 분리물에 대해 1년 당 평균 레플리킨 카운트를 도시한 챠트이다.
도 10은 H5N1 적혈구 응집소에 대해 1년 당 레플리킨 카운트를 도시한 챠트이다.
도 11은 3개의 "조류 독감" 전염병의 급증 전에 인플루엔자의 H5N1 스트레인의 적혈구 응집소 단백질에서의 래플리킨 패턴의 농도의 빠른 증가를 도시한 그래프이다. 도 11은 H5N1의 적혈구 응집소 단백질의 레플리킨 농도('레플리킨 카운트')의 증가가 3개의 "조류 독감" 전염병에 선행함을 도시한 것이다. H5N1 인플루엔자에서, 1995 내지 1997년에 스트레인-특이적 레플리킨 농도((레플리킨 카운트, 평균+/-SD)의 증가는 1997년 홍콩 H5N1 전염병에 선행하였으며(E1); 1999에서 2001년에서의 증가는 2001년의 전염병에 선행하였으며(E2); 2002 내지 2004년도의 증가는 2004년에 전염병에 선행하였다(E3). 1999년도의 쇠퇴는 홍콩에서 E1 전염병에 응하여 가금류의 대량 선별과 함께 발생하였다.
도 12는 상이한 단백질에서 실질적으로 고정된 아미노산 위치에서 발생하는 레플리킨 스캐폴드를 도시한 표이다(서열번호: 20-47, 50-51, 48-49 및 52-57은 각각 표기 순서대로 개시되어 있음).
도 13은 아미노산 서열이 입수될 수 있는 동안(1940-2001) 매년 인플엔자 B 바이러스의 적혈구 응집소에 존재하는 레플리킨 서열을 제공하는 표이다.
도 14는 아미노산 서열이 입수될 수 있는 동안(1918-2000) 매년 인플엔자 바 이러스의 H1N1 적혈구 응집소에 존재하는 H1N1 레플리킨 서열을 제공하는 표이다.
도 15는 아미노산 서열이 입수될 수 있는 동안(1957-2001) 매년 인플엔자 H2N2 바이러스의 적혈구 응집소에 존재하는 H2N2 레플리킨 서열을 제공하는 표이다.
도 16은 아미노산 서열이 입수될 수 있는 동안(1968-2000) 매년 인플엔자 H3N2 바이러스의 적혈구 응집소에 존재하는 H3N2 레플리킨 서열을 제공하는 표이다.
도 17(A-E)는 인플루엔자 바이러스, SARS 바이러스 및 다른 빠르게 복제하는 바이러스 및 악성 종양과 증가된 숙주 사망률과의 관계를 제공한 표이다(서열번호: 351-388은 각각 표시 순서대로 개시되어 있음).
실시예 1
레플리킨의 추출, 분리 및 동정하기 위한 공정 및 레플리킨-함유 유기체를 타겟, 라벨링 또는 파괴하기 위한 레플리킨의 용도
a) 조류(alge)
하기 조류를 버뮤다 물 지역으로부터 수집하고, 동일한 날에 추출하거나 -20℃에서 냉동시키고 다음날에 추출하였다. 조류를 냉장실(0 내지 5℃에서)에서 중성 완충제, 예를 들어 100 cc의 0.005M 포스페이트 완충제 용액, pH 7("포스페이트 완충제") 의 1 그램 분취액에서 와닝 배합기(Waring blender)로 15분 동안 균질화 시키고, 3000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 과증발로 농축시키고, 차가운 포스페이트 완충액으로 투석하여 대략 15 ml의 부피를 형성하였다. 이러한 추출 용액의 부피를 확인하고, 분취액을 단백질 분석을 위해 수집하고, 잔류물을 분획하여 1 내지 4의 pK 범위를 갖는 단백질 분획을 수득하였다.
바람직한 분획 방법은 하기와 같은 크로마토그래피이다: 추출 용액을 냉장실(4℃)에서 0.005M 포스페이트 완충액으로 평형화된 DEAE 셀룰로즈(Cellex-D) 컬럼 2.5x11.0 cm 상에서 분획하였다. 단계별 용리 용매를 하기 용액으로 교체하였다:
용액 1- 4.04 g NaH2P04 및 0.5g NaH2P04를 15 리터의 증류수에 용해시켰다(0.005 molar, pH 7);
용액 2 - 8.57 g NaH2P04를 2,480 ml의 증류수에 용해시켰다;
용액 3 - 17.1 g의 NaH2P04를 2480 ml의 증류수에 용해시켰다(0.05 molar, pH 4.7);
용액 4 - 59.65 g의 NaH2P04를 2470 ml 증류수에 용해시켰다(0.175 molar);
용액 5 - 101.6 g의 NaH2P04를 2455 ml 증류수에 용해시켰다(pH 4.3);
용액 6 - 340.2 g의 NaH2P04를 2465의 증류수를 용해시켰다(1.0 molar, pX-i 4.1);
용액 7 - 283.63 g의 80% 인산 (H3P04)을 2460 ml의 증류수에 용해시켰 다(1.0 molar, pH 1.0).
6 내지 10 ml 부피 중의 추출물 용액을 컬럼에 통과시키고, 용액 1로 오버레이하고(overlaid), 300 ml의 용액 1의 저장소를 결합시키고, 중력에 의해 컬럼 상으로 떨어지게 하였다. 3 ml 분취액의 용리물을 수집하고, 용액 1과 함께 제거되는 모든 단백질이 컬럼으로부터 제거될 때까지 OD 280에서 단백질 함유물에 대해 분석하였다. 용액 2를 이후 컬럼에 가하고, 이후 각 용액과 함께 제거될 수 있는 모든 단백질이 컬럼으로부터 제거될 때까지 용액 3, 4, 5, 6 및 7을 컬럼에 가하였다. 용액 7로부터의 용리물을 합치고, 포스페이트 완충액에 대해 투석하고, 투석샌드(dialysand) 및 투석물 모두 중의 단백질 함유물을 결정하고, 모두를 겔 전기영동으로 분석하였다. 분자량 3,000 내지 25,000 달톤의 펩티드 또는 단백질의 하나 또는 두개의 밴드를 용액 7에서 수득하였다. 예를 들어, 조류 카울레르파 멕시카나(Caulerpa mexicana), 라우렌시아 오브튜라(Laurencia obtura), 클라도펙사 프롤리페라(Cladophexa prolifera), 사르가슘 나탄스(Sargassum natans), 카울레르파 베르티실라타(Caulerpa verticillata), 할리메다 튜나(Halimeda tuna), 및 페니실로스 카피타투스(Penicillos capitatus) 모두는 추출 및 상기 처리 후에, 용액 7 용리물에서 오염물이 존재하지 않는 이러한 분자량 영역에서 샤프한 펩티드 밴드를 나타내었다. 이러한 용액 7 단백질 또는 이의 용리된 밴드를 가수분해하고, 아미노산 조성을 결정하였다. 이에 따라 수득된 6% 이상의 라이신 조성을 갖는 펩티드는 레플리킨 전구체이다. 이러한 레플리킨 펩티드 전구체를 이후 아미노산 서열에 대해 결정하고, 레플리킨을 미국특허 6,242,578 B1에 기술된 가수분해 및 질량분석 으로 결정하였다. "3-포인트-인식"에 의해 정의된 기준을 충족하는 것을 레플리킨으로서 동정하였다. 이러한 과정을 또한 적용하여 효모, 박테리아, 및 임의의 식물 레플리킨을 수득할 수 있다.
b) 바이러스
조류에 대한 상기 a)에서와 동일한 추출 및 컬럼 크로마토그래피 분리방법을 이용하여 바이러스-감염 세포에서의 레플리킨을 분리하고 동정하였다.
c) 생체내 및 시험관내 조직 배양에서의 종양 세포
조류에 대한 상기 a)에서와 동일한 추출 및 컬럼 크로마토그래피 분리 방법을 이용하여, 종양 세포에서의 레플리킨을 분리하고 동정하였다. 예를 들어, 상기 a)에서와 같이 각각 처리된 악성 뇌 종양으로부터 분리된 아스트로시틴(Astrocytin)의 레플리킨 전구체, 조직 배양물 중 교아세포종 종양 세포로부터 분리된 말리그닌(Aglyco lOB), 조직 배양물 중의 MCF7 유방 종양 세포, 및 조직 배양물 중의 P3J 림프종에서 각각 9.1%, 6.7%, 6.7%, 및 6.5%의 라이신 함유물을 갖는 레플리킨 전구체를 수득하였다. U.S. 6,242,578 B1의 실시예 10에 기술된 Aglyco lO의 가수분해 및 질량 분석으로 아미노산 서열 ykagvaflhkkndiide 16-머 레플리킨을 생성시켰다.
실시예 2:
레플리킨의 진단 용도의 실시예로서, Aglyco lOB 또는 16-머 레플리킨을 항원으로서 이용하여 U.S. 6,242,578 B1의 도 2, 3, 4 및 7에 도시된 진단 목적을 위한 혈청에 존재하는 이의 상응하는 항체를 포집하고 이의 양을 정량화할 수 있 다.
라벨링, 영양 섭취 또는 파괴 목적을 위해 레플리킨에 결합하는 제제의 생산의 예로서, 16-머 레플리킨에 대한 항체를 생성시키기 위해 16-머 레플리킨의 랫빗으로의 주입은 U.S. 6,242,578 B1의 실시예 6 및 도 9A 및 9B에 도시되어 있다.
레플리킨을 라벨링하기 위한 제제의 사용의 예로서, 이러한 레플리킨을 함유한 특이적 세포를 라벨링하기 위한 16-머 레플리킨에 항체의 사용은 U.S. 6,242,578 B1의 도 8 및 실시예 6에 도시되어 있다.
레플리킨을 파괴하기 위한 제제의 사용의 예로서, 이러한 레플리킨을 함유한 특정 세포를 억제하거나 파괴하기 위한 16-머 레플리킨에 항체의 사용은 U.S. 6,242,578 B1의 도 9에 도시되어 있다.
실시예 3
레플리킨의 존재 및 농도에 대한 인플루엔자 바이러스 적혈구 응집소 단백질 또는 뉴라미니다제(neuraminidase) 단백질의 분리물의 서열 데이터 분석을 서열의 시각적 스캔으로 또는 본원에 기재된 3-포인트 인식 시스템을 기초로 한 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 수행하였다. 인플루엔자 바이러스의 분리물을 수득하고, 인플루엔자 적혈구 응집소 및/또는 뉴라미니다제 단백질의 아미노산 서열을 임의의 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 적혈구 응집소 또는 뉴라미니다제 유전자를 서열화하고, 이로부터의 단백질 서열을 유도하여 수득하였다. 서열을 각 분리물 중의 신규한 레플리킨의 존재, 시간에 따른 레플리킨의 보존 및 레플리킨의 농도에 대해 스캔하였다. 레플리킨 서열과 아미노산 서열에 대한 농도의 비교는 조기에, 예를 들어 약 6개월 내지 약 3년 전에 분리물로부터 얻었으며, 단 데이터는 다가올 인플루엔자 시즌에 인플루엔자의 원인이 되는 스트레인의 출현을 예측하기 위해 사용되고 시즌별 인플루엔자 펩티드 백신 또는 핵산 계열 백신에 대한 주성분을 형성하기 위해 사용된다. 약 6개월 내지 약 3년 이상의 기간 동안 인플루엔자 바이러스의 제공된 스트레인 중의 레플리킨 농도 증가, 특히 단계적 증가의 관찰은 미래에 인플루엔자 전염병 또는 광역 유행병의 원인으로서 스트레인의 출현의 예측체이다.
펩티드 백신 또는 출현 스트레인에서 관찰된 레플리킨을 기초로 한 핵산-계열 백신을 생성시켰다. 출현 스트레인을 일정한 시간 동안에 적혈구 응집소 및/또는 뉴라미니다제 서열내에 레플리킨 서열 농도의 최고의 증가를 갖는 인플루엔자 바이러스의 스트레인으로서 동정하였다. 바람직하게는, 펩티드 또는 핵산 백신은 출현 스트레인에서 보존되는 것으로 관찰된 임의의 레플리킨 서열을 기초로 한 것이거나 이를 포함한다. 보존된 레플리킨은 바람직하게는 약 2년 및 바람직하게는 보다 긴 시간 동안 적혈구 응집소 또는 뉴라미니다제 단백질 서열에 존재하는 레플리킨 서열이다. 백신은 출현 스트레인에서 동정된 레플리킨 서열의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
백신 생산을 위해, 효과적인 백신을 위해 유용한 것으로서 식별되는 레플리킨 펩티드 또는 펩티드를 임의의 방법, 화학적 방법, 및 클로닝, 숙주 세포에서의 발현 및 이로부터의 정제를 포함한 생물학적 기술로 합성하였다. 펩티드를 바람직하게는 치료학적 항체 반응을 유도하기 위해 결정된 양으로 약제학적으로 허용가능 한 담체와 배합하였다. 일반적으로, 투약량은 약 0.1 mg 내지 약 10 mg이다.
인플루엔자 백신을 바람직하게는 "인플루엔자 시즌"의 개시 전에 이를 필요로 하는 환자에게 투여한다. 인플루엔자 flu 시즌은 일반적으로 10월 말 및 4월 말에 일어난다. 그러나, 백신을 한해 동안 임의의 시간에 투여할 수 있다. 바람직하게는, 인플루엔자 백신을 일년에 한번 투여하고, 이는 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인에 존재하고, 바람직하게는 보존되는 것으로 관찰된 레플리킨 서열을 기초로 한다. 인플루엔자 백신에의 포함을 위한 다른 바람직한 레플리킨은 1년 이상의 부재 후에 인플루엔자의 스트레인에 재출현하는 것으로 증명된 레플리킨이다.
실시예 4
레플리킨의 존재 및 농도에 대한 코로나바이러스 뉴클레오캡시드, 또는 스파이크, 또는 엔벨로프, 또는 다른 단백질의 분리물의 서열 데이터의 분석을 서열의 시각적 스캔으로 또는 본원에 기술된 3-포인트 인식 방법을 기초로 한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행하였다.
실시예 5
레플리킨의 존재 및 농도에 대한 플라스모듐 팔시파륨(Plasmodium falciparum)의 항원의 분리물의 서열 데이터 분석을 서열의 시각적 스캔으로 또는 본원에 기술된 3-포인트 인식 방법을 기초로 한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행하였다.
실시예 6
SARS 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드, 스파이크, 및 다른 단백질에서 발견 된 5개의 짧은 SARS 레플리킨의 아미노산 서열을 합성하였으며, SARS 코로나바이러스에서 레플리킨 서열에 대한 면역 반응을 시험하기 위하여 토끼 상에서 시험하였다. 하기 레플리킨 서열을 시험하였다: (1) 2003 인간 SARS 뉴클레오캡시드 (서열번호: 362); (2) 2003 인간 SARS 스파이크 단백질 (서열번호: 363); (3) 2003 인간 SARS 스파이크 단백질 (서열번호: 364); 2003 인간 SARS 스파이크 단백질; (서열번호: 365); (4) 2003 SARS 엔벨로프 단백질 (서열번호: 366); 및 (5) 2003 인간 SARS 뉴클레오캡시드 단백질 (서열번호: 367). 각 합성된 펩티드를 랫에 피하로 주입하였다. 시험된 토끼은 10,000 중 1 초과의 희석에 결합된 5개의 서열 각각에 대해 측정가능한 특정 항체를 생산하였다. 21 아미노산 SARS 뉴클레오캡시드 레플리킨 항체 (서열번호: 362)를 204,800 중 1 초과의 희석에 결합하도록 나타내었다. 다양한 작은 펩티드로 천연두 백신으로서 전체 단백질 또는 수천의 단백질 또는 핵산으로 얻어진 원치않는 부작용 없이 강력한 면역 반응을 달성하기 위한 다른 사람에 의한 이전의 성공적이지 못한 시도로 인해, 강력한 면역 반응을 달성하기 위한 작은 합성 레플리킨 항원의 능력은 SARS 백신의 효능에 대해 상당한 것으로 보여진다.
실시예 7
백신 V120304U2로 명시된 41개 아미노산 레플리킨 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHKKKKHKKKKKHK-KLH (서열번호: 348)는 H5N1 스캐폴드의 C-말단 단부 상에 두개의 UTOPE 유닛 (KKKKHK) (서열번호: 336)의 첨가 및 두개의 UTOPE 유닛의 C-말단 단부에 공유 결합된 추가 애주번트(키홀 조개 헤모시아 닌(-KLH로 칭함))의 첨가를 지닌 표 1에서 “2004 H5N1 베트남, 고도 병원성"으로 라벨링된 H5N1 “조류 독감” 인플루엔자 레플리킨의 29개의 아미노산 레플리킨 스캐폴드로부터 본 발명자에 의해 디자인되었다. 100 ㎍의 백신 V120304U2를 토끼과 닭에 피하로 주입하였다. 항체 반응을 백신화 전 및 주입하고 1주 내지 8주 후에 측정하였다. 항체 반응을 1주일에 확인하고, 백신화 후 3주 내지 4주에 피크에 도달하였다. 피크 항체 반응은 1:120,000의 희석 내지 1:240,000 초과의 희석 범위이다. 항체 역가를 높은 결합 96 웰 플레이트 상에 고체상으로 결합된 펩티드-GGG (염소 감마 글로불린)으로의 효소 연결된 면역흡수 검정(ELISA)으로 결정하였다. 혈청을 먼저 50배로 희석시키고, 이후 추가로 2배의 연속 희석으로 희석하였다. ELISA 역가 결과를 0.2의 405 nm에서의 광학 밀도로부터 얻어지고, 연속 희석 곡선의 비선형 회귀 분석으로부터 유도된 추정된 희석 인자로부터 결정하였다. 검출을 양고추냉이 과산화물 컨주레이트된 2차 항체 및 ABTS 기재(ABTS는 Boehringer Mannheim. GmbH의 상표로 등록됨)를 이용하여 얻었다. 두 마리 닭 및 두 마리 토끼에서의 시험 결과를 표 4에 제공하였다. 토끼 D4500에서의 시험으로부터의 개개의 웰 결과를 표 5에 제공하였다. 실시예 6에 기재된 결과와 비교하여, 토끼 또는 닭에서의 항체 반응에 대한 레플리킨 서열의 전체 6회의 시험에서, 모든 6개 서열은 측정가능한 항체 반응을 제공하고, 항원성을 증명하였다.
표 4
1일째에 닭에 100 μg V120304U2를 주입함
18일째에 항체 생산의 ELISA 역가
Figure 112008081742318-PCT00005
1일째에 토끼에 100 μg V120304U2을 주입
20일째에 항체 생산의 ELISA 역가
Figure 112008081742318-PCT00006
표 5
1일째에 토끼에 100 μg V120304U2을 주입. 개개 웰에 7일, 20일, 및 28일째에 역가에 대한 OD450 결과.
Figure 112008081742318-PCT00007
실시예 8
인플루엔자의 출현한 치명적인 스트레인은 하기 방법을 이용하여 예측될 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 치명적인 스트레인에서 레플리킨 스캐폴드의 존재에 대한 인플루엔자 바이러스의 분리물의 서열 및 전염병학적 데이터의 분석을 전염병학적 데이터와 함께 시각적 스캐닝 서열을 이용하거나 본원에 기술된 레플리킨 스 캐폴드 알고리즘을 기초로 한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행하였다.
분리된 인플루엔자 바이러스 펩티드는 분리된 펩티드가 16 내지 약 30개의 아미노산을 포함하고, 추가로
(1) 말단 라이신, 및 임의적으로 말단 라이신에 접하여 인접한 라이신;
(2) 말단 히스티딘, 및 말단 히스티딘에 접하여 인접한 히스티딘;
(3) 다른 라이신으로부터의 약 6 내지 약 10개의 아미노산내에서의 라이신; 및
(4) 적어도 6% 라이신을 포함하는 경우 레플리킨 스캐폴드 펩티드인 것으로 여겨질 수 있다.
레플리킨 스캐폴드 서열을 함유한 분리된 서열을 레플리킨 스캐폴드 시리즈의 다른 구성원을 지닌 공유되고 치환된 서열에 대해 스캔하고, 전염병학적 독성의 수준으로 비교하였다. 전염병학적 독성을 급증 범위 및/또는 숙주 사망률 또는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 결정할 수 있다.
개개 레플리킨 스캐폴드 펩티드내의 개개 치환을 이후 개개 레플리킨 스캐폴드 펩티드가 분리된 특정 분리물과 고도로 치명적인 급증과의 관련성에 대해 스캔한다. 6 달 내지 3년에 걸쳐 증가하는 레플리킨 카운트를 기초로 한 출현 스트레인인 것으로 보여지고 대표적인 레플리킨 스캐폴드 펩티드를 함유하는 인플루엔자 바이러스의 현존하는 스트레인을 조기-발생 스트레인에서 증가된 독성과 관련된 치환이 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인에 존재하는 지를 결정하기 위해 스캔한다. 증가된 독성과 관련한 개개 치환이 존재는 경우, 인플루엔자 바이러스의 출현 스트레인이 증가된 독성을 가질 것으로 예측될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> BOGOCH, SAMUEL BOGOCH, ELENORE S. BOGOCH, SAMUEL WINSTON BORSANYI, ANNE-ELENORE B. <120> REPLIKIN PEPTIDES AND USES THEREOF <130> 13794/47310 <140> 11/755,597 <141> 2007-05-30 <150> 60/808,944 <151> 2006-05-30 <150> 11/355,120 <151> 2006-02-16 <150> 60/653,083 <151> 2005-02-16 <150> 11/116,203 <151> 2005-04-28 <150> 60/565,847 <151> 2004-04-28 <150> 10/860,050 <151> 2004-06-04 <150> 60/531,686 <151> 2003-02-23 <150> 60/504,958 <151> 2003-09-23 <150> 60/476,186 <151> 2003-06-06 <150> 10/189,437 <151> 2002-07-08 <150> 10/105,232 <151> 2002-03-26 <150> 09/984,057 <151> 2001-10-26 <150> 60/303,396 <151> 2001-07-09 <150> 60/278,761 <151> 2001-03-27 <160> 388 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Variable amino acid; see specification as filed for detailed description of preferred embodiments <400> 1 Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Xaa Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 2 Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 3 Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 4 Lys Ser His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys Leu 1 5 10 15 Cys Pro Lys <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 5 His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 6 His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 7 His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Glu His Ala Lys 20 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 8 His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 9 His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Val Lys Lys Thr 1 5 10 15 Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys 20 25 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 10 His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys 20 25 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 11 His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys 20 25 30 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Arg or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Thr or Ala <400> 12 His Pro Xaa Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Xaa Xaa Xaa Lys 1 5 10 15 <210> 13 <211> 18 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Gly or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gln or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Ser or Thr <400> 13 His Cys Asp Xaa Phe Xaa Asn Glu Lys Trp Asp Leu Phe Xaa Glu Arg 1 5 10 15 Xaa Lys <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ser or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Glu or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Gln or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Leu or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Ala or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Ile or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Gln or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Asn or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Gly or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Arg or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Glu or Cys <400> 14 His Gln Asn Xaa Xaa Gly Xaa Gly Xaa Ala Ala Asp Xaa Lys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Xaa Ala Xaa Asp Xaa Ile Xaa Xaa Lys Xaa Asn Xaa Val Ile Xaa 20 25 30 Lys <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Lys, Gln or Met <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asp or Asn <400> 15 His Ala Xaa Xaa Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys 1 5 10 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Lys, Gln or Met <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Asp or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Lys or Arg <400> 16 His Ala Xaa Xaa Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Xaa 1 5 10 15 <210> 17 <211> 27 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Gly or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Val or Ile <400> 17 Lys Gly Ser Asn Tyr Pro Xaa Ala Lys Xaa Ser Tyr Asn Asn Thr Ser 1 5 10 15 Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gln Xaa His 20 25 <210> 18 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Thr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Thr or Val <400> 18 Lys Lys Gly Xaa Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Xaa Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 19 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 19 Lys Lys Gly Ser Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 20 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 20 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 21 Lys Lys Gly Ser Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 22 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 22 Lys Lys Glu Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 23 Lys Lys Gly Asp Ser Tyr Pro Lys Leu 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Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 29 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 29 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 30 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 30 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 31 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 31 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 32 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 32 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 33 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 33 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 34 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 34 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 35 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 35 Lys Lys Gly Asp Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 36 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 36 Lys Lys Gly Ser Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 37 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 37 Lys Lys Gly Ser Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 38 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 38 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 39 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 39 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 40 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 40 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 41 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 41 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 42 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 42 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Ile Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asn 1 5 10 15 Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 43 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 43 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asn 1 5 10 15 Lys Lys Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 44 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 44 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Lys Val Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 45 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 45 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Lys Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 46 <211> 28 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 46 Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys 1 5 10 15 Glu Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 47 <211> 28 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 47 Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys 1 5 10 15 Glu Lys Glu Val Leu Ile Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 48 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 48 Lys Lys Gly Pro Asn Tyr Pro Val Ala Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 49 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 49 Lys Lys Gly Pro Asn Tyr Pro Val Ala Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 50 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 50 Lys Lys Glu Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Arg Lys Ser Ile Ile Ile Asn 1 5 10 15 Lys Lys Glu Val Lys Leu Val Ile Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 51 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 51 Lys Ser Tyr Lys Asn Thr Arg Lys Asp Pro Ala Leu Ile Ile Trp Gly 1 5 10 15 Ile His His <210> 52 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 52 Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 53 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 53 Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Ser Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 54 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 54 Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Ile Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 55 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 55 Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Met Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 56 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 56 Lys Lys Gly Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 57 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 57 Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 58 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 58 Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 59 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 59 Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 60 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 60 Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 61 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 61 Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 62 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 62 Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 63 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 63 Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 64 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 64 Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 65 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 65 Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 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Val Xaa Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 86 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 86 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 87 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 87 Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 88 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 88 Lys Lys Asn Val Lys Ser Ala Lys Gln Leu Pro His Leu Lys Val Leu 1 5 10 15 Lys Lys Leu Asp Val Arg Gly Ala Lys Gln Leu Pro His 20 25 <210> 89 <211> 28 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 89 Lys Val His Leu Asp Val Lys Gly Val Lys Gln Leu Leu His Leu Lys 1 5 10 15 Val Arg Leu Asp Val Arg Gly Ala Lys Gln Leu His 20 25 <210> 90 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 90 Lys Lys Glu Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Arg Lys Ser Ile Ile Ile Asn 1 5 10 15 Lys Lys Glu Val Lys Leu Val Ile Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 91 <211> 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Synthetic peptide motif <400> 96 Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 97 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 97 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 98 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 98 Lys Lys Gly Ser Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 99 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 99 Lys Lys Gly Ser Asn Tyr Pro Val Ala Lys Gly Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 100 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 100 Lys Lys Gly Pro Asn Tyr Pro Val Ala Lys Gly Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile Ile Trp Gly Val His His 20 25 <210> 101 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 101 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly 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<213> Influenza virus <400> 109 His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Glu His Ala Lys 20 <210> 110 <211> 13 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 110 His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys 1 5 10 <210> 111 <211> 23 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 111 His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys 20 <210> 112 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 112 His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys 20 25 <210> 113 <211> 32 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 113 His Ala Lys Ala Ile Gly Asn Cys Pro Ile Trp Val Lys Thr Pro Leu 1 5 10 15 Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys 20 25 30 <210> 114 <211> 13 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 114 His Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Lys Thr Arg Gly Lys 1 5 10 <210> 115 <211> 17 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 115 His Phe 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<223> Arg or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Thr or Ala <400> 135 His Pro Xaa Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Xaa Xaa Xaa Lys 1 5 10 15 <210> 136 <211> 21 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Glu or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Asn or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Lys or Arg <400> 136 His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Xaa Lys Val Xaa Xaa Gln Leu 1 5 10 15 Xaa Asn Asn Ala Lys 20 <210> 137 <211> 17 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Glu or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Asn or Ser <400> 137 His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Xaa Lys Val Xaa Xaa Gln Leu 1 5 10 15 Lys <210> 138 <211> 36 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> region may encompass Asn 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<222> (16)..(16) <223> Glu or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Lys or not present <400> 206 His Asn Gly Lys Ser Ser Phe Tyr Xaa Xaa Leu Leu Trp Leu Thr Xaa 1 5 10 15 Xaa Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys 20 25 <210> 207 <211> 17 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 207 His Asn Gly Lys Ser Ser Phe Tyr Lys Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu 1 5 10 15 Lys <210> 208 <211> 55 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 208 His Thr Val Thr Lys Gly Val Thr Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ser Phe Tyr Lys Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys Asn Gly Leu 20 25 30 Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val 35 40 45 Leu Val Leu Trp Gly Val His 50 55 <210> 209 <211> 38 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Lys or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Thr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Lys or Met <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Asn or not present <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Glu or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(30) <223> Asn or Lys <400> 209 His Thr Val Thr Xaa Gly Val Xaa Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ser Phe Tyr Xaa Xaa Leu Leu Trp Leu Thr Xaa Lys Xaa Gly Leu 20 25 30 Tyr Pro Asn Leu Ser Lys 35 <210> 210 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 210 His Thr Val Thr Lys Gly Val Thr Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ser Phe Tyr Lys Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys 20 25 <210> 211 <211> 48 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 211 Lys Tyr Val Arg Ser Thr Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 1 5 10 15 Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 20 25 30 Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 35 40 45 <210> 212 <211> 43 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 212 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Glu 20 25 30 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys 35 40 <210> 213 <211> 33 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<210> 225 <211> 35 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> Glu or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Val or Ala <400> 225 His Asn Gln Lys Ser Ser Phe Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Xaa 1 5 10 15 Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Xaa Ala Asn Asn 20 25 30 Lys Glu Lys 35 <210> 226 <211> 16 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 226 His Pro Ile Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys 1 5 10 15 <210> 227 <211> 43 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 227 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 20 25 30 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys 35 40 <210> 228 <211> 33 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 228 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 20 25 30 Lys <210> 229 <211> 34 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 229 His 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<213> Influenza virus <400> 263 His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys 1 5 10 15 Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 20 25 <210> 264 <211> 19 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 264 His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Arg 1 5 10 15 Thr Arg Lys <210> 265 <211> 7 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 265 Lys Phe His Gln Ile Glu Lys 1 5 <210> 266 <211> 11 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Gly or Gln <400> 266 Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Xaa Ile Glu Lys 1 5 10 <210> 267 <211> 14 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Val or Leu <400> 267 Lys Leu Asn Arg Xaa Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His 1 5 10 <210> 268 <211> 25 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 268 His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp 1 5 10 15 Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys 20 25 <210> 269 <211> 8 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 269 Lys Ile Cys Asn Asn Pro His Lys 1 5 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Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 20 25 30 Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg 35 40 45 His <210> 275 <211> 39 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 275 Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr 1 5 10 15 Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu 20 25 30 Val Ala Leu Glu Asn Gln His 35 <210> 276 <211> 33 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ser or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Glu or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Thr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Gly or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Leu or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Ala or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Ile or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Gln or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (24)..(24) <223> Asn or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (25)..(25) <223> Gly or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (27)..(27) <223> Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Arg or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Glu or Cys <400> 276 His Gln Asn Xaa Xaa Gly Xaa Gly Xaa Ala Ala Asp Xaa Lys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Xaa Ala Xaa Asp Xaa Ile Xaa Xaa Lys Xaa Asn Xaa Val Ile Xaa 20 25 30 Lys <210> 277 <211> 18 <212> PRT <213> Influenza virus <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Gly or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Gln or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Ser or Thr <400> 277 His Cys Asp Xaa Phe Xaa Asn Glu Lys Trp Asp Leu Phe Xaa Glu Arg 1 5 10 15 Xaa Lys <210> 278 <211> 20 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 278 His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Lys Leu Phe Glu 1 5 10 15 Arg Thr Arg Lys 20 <210> 279 <211> 28 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 279 Lys Ser Gly Ser Thr Tyr Pro Val Leu Lys Val Thr Met Pro Asn Asn 1 5 10 15 Asp Asn Phe Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val His 20 25 <210> 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Influenza virus <400> 335 Lys Val Tyr Leu Ala Trp Val Pro Ala His Lys 1 5 10 <210> 336 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 336 Lys Lys Lys Lys His Lys 1 5 <210> 337 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 337 Lys Lys Lys His Lys Lys 1 5 <210> 338 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 338 Lys Lys His Lys Lys Lys 1 5 <210> 339 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 339 Lys His Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 340 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 340 Lys Lys Lys Lys Lys Lys His 1 5 <210> 341 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 341 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Xaa Trp Gly Ile Xaa His 20 25 <210> 350 <211> 16 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 350 Tyr Lys Ala Gly Val Ala Phe Leu His Lys Lys Asn Asp Ile Asp Glu 1 5 10 15 <210> 351 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 351 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 352 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 352 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 353 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 353 Leu Lys Glu Asp Leu Tyr Pro Lys Leu Arg Lys Ser Val Val His Asn 1 5 10 15 Lys Lys Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 354 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 354 Leu Lys Glu Asn Ser Tyr Pro Lys Leu Arg Lys Ser Ile Ile Ile Asn 1 5 10 15 Lys Lys Lys Glu Val Leu Val Ile Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 355 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 355 Lys Lys Gly Thr Ser Tyr Pro Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Thr Asn Asn 1 5 10 15 Lys Lys Lys Glu Val Leu Val Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 356 <211> 29 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 356 Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr 1 5 10 15 Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His 20 25 <210> 357 <211> 29 <212> PRT <213> Human coronavirus <400> 357 Lys Lys Ser Ala Lys Thr Gly Thr Pro Lys Pro Ser Arg Asn Gln Ser 1 5 10 15 Pro Ala Ser Ser Gln Thr Ser Ala Lys Ser Leu Ala His 20 25 <210> 358 <211> 29 <212> PRT <213> Cancine coronavirus <400> 358 Lys Lys Leu Gly Val Asp Thr Glu Lys Gln Gln Gln Arg Ser Lys Ser 1 5 10 15 Lys Glu Arg Ser Asn Ser Lys Thr Arg Asp Thr Thr Pro 20 25 <210> 359 <211> 28 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 359 Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys 1 5 10 15 Glu Lys Glu Val Leu Ile Leu Trp Gly Val His His 20 25 <210> 360 <211> 27 <212> PRT <213> Avian bronchitis coronavirus <400> 360 Lys Lys Ile Asn Ser Pro Gln Pro Lys Phe Glu Gly Ser Gly Val Pro 1 5 10 15 Asp Asn Glu Asn Leu Lys Thr Ser Gln Gln His 20 25 <210> 361 <211> 24 <212> PRT <213> Porcine epidemic diarrhea coronavirus <400> 361 Lys Thr Gly Asn Ala Lys Leu Gln Arg Lys Lys Glu Lys Lys Asn Lys 1 5 10 15 Arg Glu Thr Thr Leu Gln Gln His 20 <210> 362 <211> 21 <212> PRT <213> SARS coronavirus <400> 362 Lys His Leu Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys 1 5 10 15 Asp Lys Lys Lys Lys 20 <210> 363 <211> 18 <212> PRT <213> SARS coronavirus <400> 363 Lys His Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val 1 5 10 15 Tyr Lys <210> 364 <211> 11 <212> PRT <213> SARS coronavirus <400> 364 Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His 1 5 10 <210> 365 <211> 9 <212> PRT <213> SARS coronavirus <400> 365 Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys 1 5 <210> 366 <211> 9 <212> PRT <213> SARS coronavirus <400> 366 Lys Lys Gly Ala Lys Leu Leu His Lys 1 5 <210> 367 <211> 7 <212> PRT <213> SARS coronavirus <400> 367 Lys His Leu Asp Ala Tyr Lys 1 5 <210> 368 <211> 16 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 368 His Leu Val Cys Gly Lys Lys Gly Leu Gly Leu Ser Gly Arg Lys Lys 1 5 10 15 <210> 369 <211> 19 <212> PRT <213> Monkeypox virus <400> 369 Lys Lys Ile Thr Asn Ile Thr Thr Lys Phe Glu Gln Leu Glu Lys Cys 1 5 10 15 Cys Lys His <210> 370 <211> 17 <212> PRT <213> African swine fever virus <400> 370 Lys Lys Leu Lys Lys Ser Leu Lys Leu Leu Ser Phe Tyr His Pro Lys 1 5 10 15 Lys <210> 371 <211> 16 <212> PRT <213> West Nile Virus <400> 371 Lys Asn Arg Ile Glu Arg Leu Lys Lys Glu Tyr Ser Ser Thr Trp His 1 5 10 15 <210> 372 <211> 11 <212> PRT <213> Nipah virus <400> 372 Lys Ser Arg Gly Ile Pro Ile Lys Lys Gly His 1 5 10 <210> 373 <211> 11 <212> PRT <213> Hendra virus <400> 373 Lys Ser Arg Ile Met Pro Ile Lys Lys Gly His 1 5 10 <210> 374 <211> 10 <212> PRT <213> Sindbis virus <400> 374 Lys Lys Phe Leu Asn Gln Phe Lys His His 1 5 10 <210> 375 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 375 Lys Lys Lys Ser Lys Lys His Lys Asp Lys 1 5 10 <210> 376 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 376 Lys His His Pro Lys Asp Asn Leu Ile Lys 1 5 10 <210> 377 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 377 Lys His Lys Arg Lys Lys Phe Arg Gln Lys 1 5 10 <210> 378 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 378 Lys Ala Gly Val Ala Phe Leu His Lys Lys 1 5 10 <210> 379 <211> 9 <212> PRT <213> Smallpox virus <400> 379 Lys Ile His Leu Ile Ser Val Lys Lys 1 5 <210> 380 <211> 8 <212> PRT <213> Smallpox virus <400> 380 Lys Leu Ile Ser Ile His Glu Lys 1 5 <210> 381 <211> 8 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 381 Lys Leu Arg Glu Glu His Glu Lys 1 5 <210> 382 <211> 8 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 382 Lys His Lys Lys Gln Ile Val Lys 1 5 <210> 383 <211> 8 <212> PRT <213> Ebola virus <400> 383 Lys Lys His Ala Thr Val Leu Lys 1 5 <210> 384 <211> 8 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 384 Lys Lys Glu Asp Asp Glu Lys His 1 5 <210> 385 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 385 Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys 1 5 <210> 386 <211> 7 <212> PRT <213> Rous sarcoma virus <400> 386 Lys Lys Leu Arg His Glu Lys 1 5 <210> 387 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 387 Lys Lys Leu Arg His Glu Lys 1 5 <210> 388 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 388 Lys Lys Leu Arg His Asp Lys 1 5 - 108/108 -

Claims (50)

16개 내지 30개의 아미노산으로 구성되고,
(1) 말단 라이신 및 선택적으로 말단 라이신에 인접한 라이신;
(2) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 인접한 히스티딘;
(3) 다른 라이신으로부터 6 내지 10개의 아미노산 떨어져 위치한 라이신; 및
(4) 적어도 6% 라이신을 포함하는 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인으로부터의 실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드(Replikin peptide)에 있어서,
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드는 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 서열과 비교하여 아미노산의 치환을 함유하고, 상기 아미노산 치환은 히스티딘의 치환이 아니며,
인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인의 레플리킨 서열은
(1) 16 내지 30개의 아미노산으로 구성되고;
(2) 말단 라이신 및 선택적으로 말단 라이신에 인접한 라이신;
(3) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 인접한 히스티딘;
(4) 다른 라이신으로부터 6 내지 10개의 아미노산 떨어져 위치한 라이신; 및
(5) 적어도 6% 라이신을 포함하며,
인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인은
(1) 16 내지 30개의 아미노산으로 구성되고;
(2) 말단 라이신 및 선택적으로 말단 라이신에 인접한 라이신;
(3) 말단 히스티딘 및 말단 히스티딘에 접하여 인접한 히스티딘;
(4) 다른 라이신으로부터 6 내지 10개의 아미노산 떨어져 위치한 라이신; 및
(5) 적어도 6% 라이신을 포함하는 레플리킨 서열을 함유하며,
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 서열에 존재하는 치환은 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인의 레플리킨 서열에 추가적으로 존재하며, 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인에서의 치환의 존재는 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가와 상관관계를 지님을 특징으로 하는 레플리킨 펩티드.
제 1항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기는 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 펩티드의 말단 히스티딘으로부터의 5번째 아미노산 잔기에 위치하는 레플리킨 펩티드.
제 2항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기는 루신 이외의 임의의 아미노산 잔기인 레플리킨 펩티드.
제 3항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기는 임의의 소수성 아미노산인 레플리킨 펩티드.
제 4항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기는 메티오닌 또는 이소루신인 레플리 킨 펩티드.
제 5항에 있어서, 서열 KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[X]WGIHH (서열번호: 1)를 포함하며, 잔기 [X]는 루신 이외의 임의의 아미노산인 레플리킨 펩티드.
제 6항에 있어서, 잔기 [X]는 메티오닌, 이소루신, 트립토판, 페닐알라닌, 알라닌, 글리신, 프롤린 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된 레플리킨 펩티드.
제 7항에 있어서, 잔기 [X]는 메티오닌 또는 이소루신인 레플리킨 펩티드.
제 1항에 있어서, 분리된 레플리킨은 H5N1 인플루엔자 바이러스 펩티드인 레플리킨 펩티드.
제 1항의 레플리킨 펩티드를 포함한 백신.
제 1항의 레플리킨 펩티드의 항원성 서브서열을 포함하며, 상기 항원성 서브서열은 제 1항의 레플리킨 펩티드의 아미노산 서열의 7 내지 29개의 아미노산 잔기인 백신.
KKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLV[X]WGIHH (서열번호: 1)의 실질적으로 분리된 아미노산 서열을 포함하며, 잔기 [X]는 루신 이외의 임의의 아미노산인 백신.
제 12항에 있어서, 잔기 [X]는 루신 이외의 임의의 소수성 아미노산인 백신.
제 13항에 있어서, 잔기 [X]는 메티오닌 또는 이소루신인 백신.
제 10항에 있어서, 애주번트(adjuvant)를 추가로 포함한 백신.
제 10항에 있어서, UTOPE를 추가로 포함하는 백신.
제 1항의 레플리킨 펩티드에 대한 실질적으로 분리된 항체.
제 1항의 레플리킨 펩티드의 항원성 서브서열에 대한 실질적으로 분리된 항체로서, 항원성 서브서열은 제 1항의 레플리킨 펩티드의 아미노산 서열의 7 내지 29번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체.
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인으로부터 실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드로서,
상기 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인은 인플루엔자 바이러스의 출 현 스트레인(emerging strain)이며,
실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드는 7개 내지 약 50개의 아미노산을 포함하고,
(1) 상기 레플리킨 펩티드의 첫 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기 및 상기 레플리킨 펩티드의 두 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기 또는 하나 이상의 히스티딘 잔기;
(2) 두 번째 라이신 잔기로부터 6 내지 10개 잔기 떨어져 위치된 첫 번째 라이신 잔기;
(3) 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(4) 적어도 6% 라이신 잔기로 이루어진 모티프(motif)를 동정하고, 상기 동정된 모티프를 선택하고, 상기 동정된 모티프를 포함하는 레플리킨 펩티드를 분리시킴으로써 분리되며,
동정된 모티프의 말단 잔기들 사이의 레플리킨 펩티드 서열에 위치된 하나의 아미노산에서의 치환은 상기 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인에서의 다른 동일한 서열과 비교하여 발생하며, 라이신 또는 히스티딘은 치환되지 않으며,
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 동정된 모티프의 말단 잔기들 사이의 상기 치환은 두 번째 스트레인과 비교하여 빠른 복제 및 증가된 독성과 서로 관련이 있는 레플리킨 펩티드.
제 19항에 있어서, 인플루엔자 바이러스의 H5N1 스트레인로부터 분리된 레플 리킨 펩티드.
제 19항의 레플리킨 펩티드를 포함한 백신.
제 19항의 분리된 레플리킨 펩티드의 아미노산 서열의 7 내지 29번째 아미노산 잔기를 포함한 항원성 서브서열을 포함한 백신.
제 19항의 레플리킨 펩티드에 대한 실질적으로 분리된 항체.
제 19항의 레플리킨 펩티드의 항원성 서브서열에 대한 실질적으로 분리된 항체로서, 상기 항원성 서브서열은 제 19 항의 레플리킨 펩티드의 7 내지 29번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체.
(1) 레플리킨 스캐폴드가 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인으로부터 분리된 첫 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드, 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인으로부터 분리된 두 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드, 및 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인으로부터 분리된 세 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드를 포함하는 다수의 레플리킨 스캐폴드 펩티드로부터 인플루엔자 바이러스 레플리킨 스캐폴드를 동정하는 단계,
(2) 두 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드와 비교하여 치환된 세 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드에서 상기 치환된 아미노산이 히스티딘이 아닌 하나의 아미노산을 동정하는 단계,
(3) 인플루엔자의 세 번째 스트레인이 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 증가된 복제, 독성 또는 숙주 사망률을 나타냄을 결정하는 단계,
(4) 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 세 번째 레플리킨 스캐폴드에 치환된 아미노산 잔기가 또한 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 첫 번째 레플리킨 스캐폴드 펩티드에 치환됨을 결정하는 단계,
(5) 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 카운트를 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 조기-발생 분리물의 레플리킨 카운트와 비교하는 단계,
(6) 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 레플리킨 카운트가 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 조기-발생 분리물의 레플리킨 카운트 보다 큰 것을 결정하는 단계, 및
(7) 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인에서의 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 단계로 구성된 인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인에서 복제, 독성 또는 숙주 사망률의 증가를 예측하는 방법.
제 25항에 있어서, 두 번째 레플리킨 스캐폴드와 비교하여 첫 번째 레플리킨 스캐폴드에 치환된 아미노산 잔기는 두 번째 레플리킨 스캐폴드의 말단 히스티딘으 로부터의 5 번째 아미노산 잔기가 위치되는 방법.
제 26항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기는 루신 이외의 아미노산 잔기인 방법.
제 27항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기는 루신 이외의 소수성 아미노산인 방법.
제 28항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기는 메티오닌 또는 이소루신인 방법.
제 25항에 있어서, 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 레플리킨 스캐폴드가 29개의 아미노산 잔기를 포함하는 방법.
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 출현 스트레인으로부터 레플리킨 펩티드를 동정하는 단계,
인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인에서 동일한 서열에서의 상기 치환을, 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인과 비교하여 인플루엔자 바이러스의 세 번째 스트레인에서의 빠른 복제 및 증가된 독성과 대비하는 단계, 및
인플루엔자 바이러스의 첫 번째 스트레인의 독성의 증가를 예측하는 단계를 포함하여, 인플루엔자 바이러스 출현 스트레인 독성 증가를 예측하는 방법에 있어 서,
상기 인플루엔자 바이러스 레플리킨 펩티드는 7 내지 약 50개의 아미노산으로 구성되며,
(1) 상기 분리된 레플리킨 펩티드의 첫 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기 및 상기 분리된 레플리킨 펩티드의 두 번째 말단에 위치한 하나 이상의 라이신 잔기 또는 하나 이상의 히스티딘 잔기;
(2) 두 번째 라이신 잔기로부터의 6 내지 10개의 잔기 떨어져 위치한 첫 번째 라이신 잔기;
(3) 하나 이상의 히스티딘 잔기; 및
(4) 적어도 6% 라이신 잔기로 이루어진 모티프를 포함하며,
모티프의 말단 잔기들 사이의 아미노산에서의 치환은 인플루엔자 바이러스의 두 번째 스트레인에서 동일한 서열과 비교하여 라이신 또는 히스티딘은 치환되지 않게 발생함을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 출현 스트레인 독성 증가를 예측하는 방법.
아미노산 서열 KKX1X2X3YPTIKX4X5X6NNTNX7EDLLVX8WGIX9H(서열번호 349)를 포함하는 실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드로서,
X1은 N 또는 G이며;
X2는 N 또는 S이며;
X3은 A 또는 T이며;
X4는 R 또는 K이며;
X5는 S 또는 T이며;
X6은 임의의 아미노산 잔기이며;
X7은 임의의 아미노산 잔기이며;
X8은 루신 이외의 임의의 아미노산 잔기이며;
X9는 H 또는 Q인 레플리킨 펩티드.
제 32항에 있어서, X6가 Y인 레플리킨 펩티드.
제 32항에 있어서, X7이 Q, I, M, V 또는 H인 레플리킨 펩티드.
제 32항에 있어서, X7이 Q 또는 H인 레플리킨 펩티드.
제 35항에 있어서, X7이 Q인 레플리킨 펩티드.
제 32항에 있어서, X8이 메티오닌, 이소루신, 글리신, 알라닌, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 아스파라긴 또는 글루타민인 레플리킨 펩티드.
제 37항에 있어서, X8이 메티오닌, 이소루신, 글리신, 알라닌, 발린, 프롤린, 페닐알라닌 또는 트립토판인 레플리킨 펩티드.
제 38항에 있어서, X8이 메티오닌 또는 이소루신인 레플리킨 펩티드.
제 39항에 있어서, X8이 메티오닌인 레플리킨 펩티드.
제 39항에 있어서, X8이 이소루신인 레플리킨 펩티드.
제 32항에 있어서, X9가 H인 레플리킨 펩티드.
제 32항에 있어서,
X1이 N이며;
X2가 S이며;
X3가 T이며;
X4가 R이며;
X5가 S인 레플리킨 펩티드.
제 32항의 레플리킨 펩티드의 항원성 서브서열을 포함하는 실질적으로 분리된 펩티드로서, 상기 항원성 서브서열은 제 32항의 레플리킨 펩티드의 아미노산 서열의 7 내지 29번째 아미노산 잔기인 펩티드.
제 32항의 실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드를 포함한 백신.
제 44항의 실질적으로 분리된 펩티드를 포함한 백신.
제 32항의 실질적으로 분리된 레플리킨 펩티드에 대한 실질적으로 분리된 항체.
제 44항의 실질적으로 분리된 펩티드에 대한 실질적으로 분리된 항체.
제 1항의 레플리킨 펩티드를 인코딩하는 실질적으로 분리된 핵산.
제 19항의 레플리킨 펩티드를 인코딩하는 실질적으로 분리된 핵산.
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