CN1328569A - TGFβ1－抑制肽 - Google Patents
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Abstract
从生物体中的TGFβ1或从其受体得到的拮抗性合成肽,它们能够即可以以它们自身,也可以以编码它们的基因序列和表达它们的重组系统,用于生产用于治疗肝脏疾病,更具体地说是纤维化的组合物。所述组合物能够任选地包括所述活性肽的模拟型(mimotope)。
Description
技术背景描述
细胞生长由生长因子家族的各种蛋白质调节(Schalch DS等(1979)内分泌学(Endocrinology)104：1143-1151)。参与细胞发育，并能够由自分泌和旁分泌机制发挥作用的最重要生长因子包括转化生长因子(TGF)(Braun L.等(1988)细胞生物学(Cell Biol.)85：1539-1543；LyonsRM和Moses HL(1990)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)187：467-473)。
术语TGF首次用于描述由鼠肉瘤病毒转化的细胞系产生的活性(deLarco JE和Todaro GJ(1978)国立科学院科学学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)75：4001-4005；Mizel SB等(1980)国立科学院科学学报，77：2205-2208)。这些细胞的悬浮液能够诱导需要固体支持物支持生长的细胞在软琼脂中正常生长。更具体的研究证明存在两类TGF，称之为TGFα和TGFβ，它们又包括相关蛋白质家族。TGFβ家族由五个二聚体结构(Schlunneger MP和Gmutter MG(1992)自然358：430-434；Brand T.和Schneider MD(1995)J.Mol.Cell Cardiol.27：5-18)的同种型构成(Brand T.和Schneider MD(1995)J.Mol.Cell Cardiol.27：5-18)。对从单一物种纯化出来的成熟蛋白质的研究表明它们的序列之间存在高度相同性(表1)。表1.不同型TGFβ之间的同源性。TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3来源于人，TGFβ4来源于鸡，TGFβ5来源于狗。(Roberts AB和Sporn MB，1990)。
| ％ | TGFβ1 | TGFβ2 | TGFβ3 | TGFβ4 | TGFβ5 |
| TGFβ1 | 100 | ||||
| TGFβ2 | 71 | 100 | |||
| TGFβ3 | 72 | 76 | 100 | ||
| TGFβ4 | 82 | 64 | 71 | 100 | |
| TGFβ5 | 76 | 66 | 69 | 72 | 100 |
TGFβ1以一种具有390个氨基酸称之为前-原-TGFβ1的前体合成。在第一次水解中，释放出一种29个氨基酸的疏水片段，得到原-TGFβ1。然后在TGFβ1氨基末端之前的、由两个精氨酸构成的区域中的再次切割得到成熟TGFβ1，其为112个氨基酸的蛋白质，分子量为12KDa。为了形成生物活性形式，这两种单体通过二硫键连接到一起，产生一种25KDa的二聚体。这种结构的改变导致生物功能的丧失(Barnard JA等(1990)生物化学和生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)1032：79-87)。
已知TGFβ1结构中存在多种结构域。发现这些结构域之一定位在氨基酸40-82之间，涉及TGFβ1与其细胞受体的结合(Quian SW等(1992)国家科学院科学学报89：6290-6294；Burmester JK等(1993)国家科学院科学学报90：8628-8632)。TGFβ1和其它结合蛋白质的受体
已经鉴定了五种TGFβ1的特异性受体(Cheifetz S等(1988)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：17225-17228；Lopez Casillas F.等(1991)细胞(Cell)67：785-795)。这些受体对不同型TGFβ1具有不同的亲合性。I、II和III型受体目前了解最为清楚(Attisano L等的综述(1994)生物化学和生物物理学报1222：71-80；Derynck R(1994)生物化学趋势(Trends Biochem.Sci.)19：548-553；Yingling等(1995)生物化学和生物物理学报1242.115-136)。IV型受体(MacKay K.和Danielpour D.(1991)生物化学杂志266：9907-9911)和V型受体(Ichiji H.等(1991)生物化学杂志266：22459-22464)也已有描述。还曾报道endoglin的跨膜区和胞质区(Cheifetz S等(1993)生物化学杂志267：19027-19030；Bellon T.等(1993)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)223：2340-2345；Yamashita等(1995)免疫学杂志(J.Immunol.)156：564-573)与人和大鼠的III型受体具有约70％的相似性。
RIII可能是一种具有下述功能的受体，其结合TGFβ1并将它呈递给RII(其可能又与RI形成复合物)(Yamashita等(1994)生物化学杂志269：20172-20178)或者复合物(其中各种RI分子与RII结合)(Weiss G.和Massague J.(1996)EMBO J 15：276-289)。RII-RI的相互作用将促进RI的磷酸化，随后激活其丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，该激酶将使类似MADR2蛋白的第二信使磷酸化(Macias-Silva M等(1996)细胞87：1215-1224)。TGFβ1在肝分化和再生中的作用
根据发育时段和细胞类型产生的作用是不同的。
·增大胞外基质，作用于肝星状细胞(Ito细胞)——基质蛋白质
的基本来源(Mustoe TA等(1987)科学237：1333-1336)。
·使上皮细胞和肝细胞分化(Florini JR等(1986)生物化学杂志261：
16509-16513)。
·在肝再生过程中抑制细胞生长。该作用对于维持细胞体外休眠十
分重要(Kato Y等(1988)国家科学院科学学报85：9552-9556)。
·抑制上皮生长因子(EGF)受体的胞吞作用，如在胎鼠肝细胞培
养中观察到的那样(Noda M.和Rodan GA(1987)细胞生理学杂志
(J.Cell Physiol.)133：426-437)。TGFβ1在肝纤维化中的作用
发现TGFβ1与肝纤维化进程有关(Czaja MJ等(1989)细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)108：2477-2482；Annoni G.等(1992)J.Hepatol.14：259-264)，其导致通过肝星状细胞(肝细胞或Ito细胞)上它们的受体使胞外基质蛋白质的产生增加，并抑制使基质降解的蛋白水解酶的合成(Ignotz RA和Massague J.(1986)生物化学杂志261：4337-4345)。在肝脏中，TGFβ1诱导肝脏星状细胞中胶原蛋白和粘连蛋白的合成(Weiner FR(1990)肝脏学(Hepatology)11：111-117)。还通过诱导其mRNA，增加其自身合成，实现自动调节。
还发现TGFβ1涉及由肝细胞和激活的肝星状细胞合成的α2-巨球蛋白的合成增加。据称α2-巨球蛋白通过与TGFβ1结合并使其灭活(BachemMG(1994)Ann NY Acad.Sci.737：421-424)，从胞外空间消除TGFβ1。
对慢性肝病患者的研究表明，在TGFβ1表达与I型原胶原蛋白的mRNA表达和原胶原蛋白III型肽的血清水平之间存在相关性(Castilla A.等(1991)N.Engl.J.Med.324：933-940)。
肝硬化患者由于疾病过程产生的并发症，例如门静脉高压或肝功衰竭，使他们的存活期比正常生命期限短。TGFβ1对胞外基质的影响
TGFβ1与细胞受体的相互作用导致：
·激活原胶原蛋白、粘连蛋白(Ignotz RA等(1987)生物化学杂
志262：6443-6446)和相关蛋白质，包括能够与胞外基质成分相
互作用的膜蛋白(Carter WG(1982)生物化学杂志257：13805-
13815)的合成。
·抑制能够降解基质的蛋白水解酶的合成(Fukamizu H.和Grinell
F.(1990)实验细胞研究(Exp.Cell Res.)190：276-282)。
·刺激蛋白水解酶抑制剂的合成(Fukamizu H.和Grinell F.(1990)实
验细胞研究190：276-282)。
这些作用导致细胞与胞外基质相互作用的增强，其与基质的组成蛋白质的较高识别结合，导致胞外基质总量增加(Roberts CJ等(1988)生物化学杂志263：4586-4592)。这些结果证实TGFβ1参与愈合过程(Fukamizu H.和Grinnell F.(1990)实验细胞研究190：276-282；Bamard JA等(1990)生物化学和生物物理学报1032：79-87)。肽作为配体-受体相互作用的抑制剂
存在这样的可能性，即用小分子、合成肽作为体内存在分子的类似物，用于模拟体内分子的功能。LeSateur等进行的研究证实了应用神经生长因子(NGF)的环状类似物模拟β回文区，使其结合受体的可能性(LeSateur L.等(1996)天然生物技术(Nature Biotechnology)14：1120-1122)。还可能应用肽作为这些分子的拮抗剂，通过该肽介导的封闭作用阻止天然因子与其受体的相互作用(Lasate JJ等(1994)获得性免疫缺陷综合症杂志(J.Acquired Immune Deficiency Syndromes)7：129-134；LeSateur等(1995)生物化学杂志270：6564-6569)。早期研究证明了合成肽作为配体-受体相互作用的抑制剂的有用性，甚至当识别表位不连续时同样如此(Daniels AJ等(1995)分子药理学(Mol.Pharmacol.)48：425-432)。其它有关TGFβ1的II型受体和胎球蛋白，一种II型受体家族中的糖蛋白的研究，证明了应用环状肽作为TGFβ1与RII相互作用抑制剂的可能性(Demetriou M.等(1996)生物化学杂志271：12755-12761)。通过这种环化，即可能获得具有类似于体内可能获得肽结构的肽。发明详述
由于前面陈述的原因，我们认为来源于TGFβ1和其受体，或者来源于能够结合TGFβ1的蛋白质的肽，能够作为TGFβ1活性的抑制剂。因此我们决定开发该可能性。待合成肽的选择
根据肽来源于TGFβ1还是来源于其受体，按照不同方式选择用于合成的肽。
对于TGFβ1序列的情况，从包括TGFβ1全序列的15个氨基酸合成肽。每个肽具有与它的两个直接邻居相同的10个氨基酸。
对于TGFβ1受体序列的情况，基于我们实验室设计的软件选择肽。用一种计算机程序比较两个氨基酸序列，旨在于预测部分互补区。也应用了其它程序，它们能够基于构成这些序列的氨基酸的疏水性和亲水性，预测暴露最多的蛋白质区域。肽的合成
通过固相法(Merrifield(1963)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)85：2149-54)，应用芴基甲氧羰基(Fmoc)作为alpha-氨基的临时保护基(Atherton等(1989)Journal of Chemical Society Perkins Transaction1：538-546)合成肽。对于多种肽的少量合成，应用多重合成仪，其允许96个肽的同步合成(Borras-Cuesta等(1991)生物学(Biologicals)19：187-190)。将肽在-80℃以固体状态储藏，直到使用。通过HPLC纯化肽
通过高效液相色谱(HPLC)，应用Waters600E-900系统(MilliporeCorp.，Bedford，USA)分析和纯化合成的肽。
应用Waters Radial-PakTM C18 300 15μm，8×100mm柱(MilliporeCorp.，Bedford，USA)通过分析型HPLC分析肽。将肽溶解于0.1％TFA的蒸馏水溶液，至最大浓度为1mg/ml。将肽溶液(100μl)注射到柱中，在水/乙腈梯度中洗脱(图15)(Romid Ltd.，Cambridge，USA)，均用0.1％TFA，流速为1ml/min。通过220nm和280nm处的肽吸收度检测含肽的组分(光敏二极管阵列检测仪，Waters 991，Millipore Corp.，Bedford，USA)。
应用Waters Delta-PakTM C18 300 15μm，25×100mm柱(MilliporeCorp.，Bedford，USA)进行肽的纯化。溶解肽，并在与前面程序同样的条件下注射(2ml)，应用同样的梯度，流速为5ml/min。将含纯化肽的组分收集到一个烧瓶中。肽活性的体外实验研究细胞系
使用来自貂肺上皮细胞的细胞系MV-1-Lu(CCL-64，美国典型细胞培养中心(American Type Cell Culture)，Virginia，USA)。细胞在162cm2的培养瓶(Coster Corporation，Cambridge，USA)中，在37℃和5％CO2的培养箱中生长，直到获得亚汇合。使用完全培养基：添加5％胎牛血清(FCS，Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，Israel)、10mM HEPES(1M HEPES缓冲液，Bio-Whittaker，Verviers，Belgium)和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的含L-谷氨酰胺(GibcoBRL，LifeTechnologies Ltd.，Paisley，Scotland)的RPMI1640。MV-1-Lu细胞系的生长抑制实验
用5ml胰蛋白酶-EDTA(Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，Israel)从培养瓶的底部除下如上述生长的MV-1-Lu细胞，重悬浮于完全培养基，以1500rev/min离心8分钟。离心后，将细胞以50000个细胞/ml的浓度重悬浮于完全培养基。进行实验时，取10ml细胞悬浮液分散于96孔、平底培养板(Costar Corporation，Cambridge，USA)，每孔加100μl，在37C和5％CO2下培养过夜，使细胞附着到孔的底面。在培养结束时，在存在RPMI(R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon，UK)中浓度为200pg/ml TGFβ1的情况下，将待实验的肽加入RPMI至终浓度为200μg/ml。每孔中FCS的终浓度为2.5％。培养24小时后，向每孔加入1μCi的氚代胸苷(25 Ci/mmol [甲基-3H]-胸苷，Amersham Life Science，Buckinghamshire，UK)再次培养12小时(Grubeck-Loebenstein B.等(1989)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)83：764-770；Brennan FM等(1990)临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)81：278-285)。
在培养结束时，用胰蛋白酶-EDTA从孔底除下细胞，通过人工收获仪(Titertek细胞收获仪，Skatron Instruments Inc.，Sterling，USA)收集细胞，并破碎细胞，在硝酸纤维素滤纸(Filter MAT 11731，Skatron InstrumentsInc.，Sterling，USA)上收集固定于其上的DNA。将滤纸分别置于5ml聚丙烯试管，象其中加入4ml发光液体(Biogreen-11，Reactivos Scharlau S.A.，Barcelona，Spain)。在βLKB发光记录仪上90秒定量检测各管的活性(Betaplate system，LKB，Uppsala，Sweden)。TGFβ1与细胞受体结合的抑制研究细胞受体的选择性标记(亲合性标记)
从培养瓶取出MV-1-Lu细胞，将它们与10ml溶液1(128mM NaCl、25mM 4-(2-羟基)-1-哌嗪乙基磺酸盐pH7.5、5mM葡萄糖和1mMEDTA)在37℃培养10分钟。然后将取出的细胞重悬浮于溶液2(128mMNaCl、5mM KCl、50mM 4-(2-羟基)-1-哌嗪乙基磺酸盐pH7.5、1.2mMMgSO4和5mg/ml BSA)，通过1000×g离心5分钟收集细胞。细胞离心后，以106个细胞/ml的浓度重悬浮于溶液2。
从该细胞悬浮液，取0.5mL置于24-孔平板(Greiner GmbH、Frickenhausen，Germany)，加入50μl 0.8mg/ml的肽溶液，然后在4℃保温2小时同时搅拌。接下来，加入终浓度为277.2pM的125I-TGFβ1(2μCi)(125I-TGFβ1人重组800-2200Ci/mmol，Amersham Lift Science，Buckinghamshire，UK)，再次在4℃搅拌下保温2小时。
保温后，将细胞转移到一个离心管中，然后在12000 xg下冷却离心1分钟。然后在0.5ml冷溶液2、5μl二甲亚砜(DMSO99.5％，SigmaChemical Co.，St.Louis，USA)和DSS终浓度为0.25mM的二琥珀酰辛二酸酯(DSS，Pierce Chemical Co.，Rockford，USA)中重悬浮。通过稀释、离心和用含0.25M蔗糖、10mM Tris和1mM EDTA的溶液(pH7.4)冲洗中止反应。细胞沉淀重悬浮于0.5ml Triton X-100(Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)1％v/v、10mM Tris(pH7.0)、1mM EDTA、0.1mM氟化苯甲基磺酸盐、1μg/ml抑肽素和1μg/ml亮肽素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)，并在4℃保温40分钟。在去污剂中不溶的部分通过在12000×g离心15分钟分离出去。在去污剂中溶解的部分(上清液)和不溶部分(沉淀)在-20℃冷冻(Massague J.和Like B.(1985)生物化学杂志260：2636-2645)。在聚丙烯酰胺十二烷基磺酸钠凝胶中电泳蛋白质
通过在7.5％丙烯酰胺/二丙烯酰胺凝胶中，220伏电压下电泳5-6小时，分析在去污剂中的可溶组分和不溶组分。
用考马斯亮蓝 R250(Serva Feinbiochemica GmbH，Heidelberg，Germany)的甲醇(50％)、乙酸(10％)和蒸馏水溶液染色蛋白质30分钟。然后第一次漂洗用甲醇(50％)、乙酸(10％)和蒸馏水溶液冲洗15分钟，随后用甲醇(2.5％)、乙酸(0.5％)和蒸馏水进行随后的漂洗，直到背景颜色除去。流动细胞记数
通过直接免疫荧光法测定由肽介导的TGFβ1与细胞受体结合的抑制作用。其中应用了一种免疫荧光试剂盒(Fluorokine rh TGFβ-生物素，R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon，UK)。具体地说，该实验基于生物素酰化TGFβ1结合细胞受体的能力，以及随后生物素与荧光标记抗生物素蛋白的相互作用，因此信号强度将依赖于与细胞受体结合的TGFβ1的量。
用溶液1(前面描述的)除下在162cm2培养瓶中生长的MV-1-Lu细胞，重悬浮于生理盐水，在500×g离心5分钟。离心后，细胞再次以4×106个细胞/ml的浓度悬浮于生理盐水。将25μl细胞悬浮液加入12×75mm硼硅酸盐试管，向其中加入在40μl RPMI 1640培养基中的待实验肽，使其终浓度为0.42μg/ml，和10μl生物素酰化的TGFβ1。作为特异性对照，加入10μl试剂盒中提供的生物素酰化试剂，加入10μl生物素酰化的TGFβ1作为阳性对照，加入20μl抗-TGFβ1的阻断抗体作为阴性对照。向所有对照中加入生理盐水，至总体积为75μl。所有试管在4℃黑暗条件下保温1小时。
在保温结束时，加入10μl荧光素标记的抗生物素蛋白，在4℃黑暗条件下保温30分钟，之后加入2ml清洗液(RDF1)，然后在500×g下离心6分钟。细胞沉淀重悬浮于0.2ml冷PBS，用于细胞记数(FACScan，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，California，USA)。当一束激光偶尔照射到孔上时，该方法能够应用一种计算机程序(LisysTM II，BectonDickinson Immunocytometry Systems，California，USA)测定各细胞发射的荧光。图16显示了一副通过流动细胞记数分析得到的典型图像。
为了得到TGFβ1与其受体结合抑制的数据，应用实验的阳性对照，以划出相当于结合TGFβ1-生物素(M2)和结合未标记细胞(M1)的标记细胞的范围。一旦划出该范围，则可计算定位在它们之中每一个上的细胞百分数。对于当肽与TGFβ1-生物素或与细胞(根据肽是否分别来源于受体还是TGFβ1)共同保温时得到的数据，进行同样的操作。利用这些数据，同时应用下列算式计算各肽的抑制百分率：100-((M2肽-M2阴性)×100/(M2阳性-M2阴性))。在纤维症模型中的体内实验
使用来自同一窝(5周±1.5周)的白色雄性大鼠(albino Wistar品系)，为了得到年龄和初始重量均一的一组动物。整个实验过程中，动物保持在恒温(22℃)和12小时光照和黑暗循环条件下。它们可以随意取水和食物。
通过吸入四氯化碳共11周，每周两次，诱导肝硬化(HC)(Lopez NovoaJM等(1976)Patologia IX：223-240；Camps J.等(1987)胃肠病学(Gastroenterology)93：498-505)。通过经一个气体洗瓶，以3升/分钟的流速吹进压缩空气，实现接触CCl4。最初接触1分钟，之后每周增加1分钟，直到第四周达到4分钟。在第五周不给CCl4，第六周重新开始，接触5分钟。5分钟的接触时间维持到11周。从开始接触CCl4前1周到实验结束时，在引用水中加入400mg/l苯巴比妥(Luminal，Bayer，Leverkusen，Germany)。在开始处理之前，留出一周不施用CCl4。在处理过程中，按照记录(图2)给动物施用一周剂量的CCl4。动物的分布
在开始诱导肝硬化之前，将动物分成4组。
健康对照(Co)：没有接受纤维化处理的动物。
处理的健康对照(Co＋P144)：没有接受纤维化处理，但在最后3周施用肽P144的动物(与大鼠Tto2组的处理时间一致)。
硬化对照1(Ci1)：每周吸入CCl4两次，接受硬化诱导处理的动物。到第五周时将这些动物分成2组：
硬化对照1(Ci1)：11周以后，继续接受纤维化诱导处理，而没有接受肽P144的动物。在整个诱导过程中，在不施用CCl4的其它天给它们施用盐水血清(第5到11周)。
处理的硬化1(Tto1)：在诱导纤维化过程的第5到11周中，在不施用CCl4的其它天，施用来自III型受体序列的肽P144的动物。
硬化对照2(Ci2)：连续接受纤维化诱导处理而不接受肽P144或盐水血清的动物。到第11周将这组动物分成另两组。
硬化对照2(Ci2)：不接受任何类型处理的硬化动物，作为对照。这些动物接受3周盐水血清的注射(第13到15周)。
处理的硬化2(Tto2)：用来自III型受体(P144)序列的肽处理3周(第13至15周)的硬化动物。动物的处理·Tto1组：这些动物在纤维化过程中接受处理。在第5周开始用肽的处理(在接触CCl4之前的5分钟)，持续到硬化诱导过程的第11周末。·Tto2组：这些动物在纤维化诱导过程(11周)完成后接受处理。在最后一次吸入后的一周开始处理，持续21天。
在开始处理之前和处理之后，从所有接受肽处理的动物体内取血。在腹部以500μl生理盐水中70μg/只动物的剂量皮下注射施用肽。处死动物并解剖出肝脏
当完成用肽处理动物后，对于大鼠模型和小鼠模型，用毛细管从动物的后-眶血管丛取血后，断头处死动物。
然后立即解剖肝脏并收集样品。切碎样品并置于甲醛中作为固定液，用于以后的组织学检查。其它碎片置于浸在液氮中的冷冻管中，然后-80℃储藏。肝脏的病理解剖学评价
将之前固定在甲醛中至少24小时的肝脏碎片进行组织学检查，之后将它们置于乙醇中(70％)。
脱水后，将它们嵌入石蜡块。用Leitz旋转式显微镜用薄片切片机和钢刀从得到的石蜡块连续制备3μm厚的切片。染色之前将切片置于二甲苯(AnalaR、BDH、Poole，UK)中15分钟脱石蜡，将它们在60℃的烘箱中加热15分钟后，使它们连续通过浓度降低的乙醇100％、96％、80％和70％最后是水，使它们脱水。使用下列染料：苏木素-曙红Masson’s三色(trichromic)(Locquin M.和Langeron，(1985)in Manual deMicroscopia Ed.Labor S.A.Barcelona)：对于胶原蛋白应用一种特定染料(绿光)。天狼红：胶原蛋白的特异性染料。肝纤维化的确定：图像分析
对于得到样品的图像分析，应用一种连接有摄象机(Sony DXP-950P，Sony Co.，Tokyo，Japan)的光学显微镜(Olympus BH-2，Tokyo，Japan)，利用该装置各切片的每个视野均被拍摄下来。对于每个切片随机拍摄六个视野。利用计算机程序(Visilog 4.1.5，Noesis，Orsay，France)分析拍摄的各种图像，该程序能够计算纤维化面积和切片的总面积。从这些数据计算各视野的纤维化指数(纤维化面积/总面积)。为了能够应用该程序，有必要应用偏振光滤光片(Olympus U-POT，Tokyo，Japan)和绿光滤光片(Olympus IF550，Tokyo，Japan)改变图像的物象，其使样品分析过程的自动化成为可能。石蜡-处理组织的14μm切片中的胶原检测
按照前面描述的3μm切片的同样方式制备用于该方法的14μm切片。将这些切片置于二甲苯12小时，使它们脱石蜡。去除石蜡后，将它们通过不同浓度的乙醇96％、80％、50％，使样品脱水，最后在蒸馏水中完成该过程。
脱水后，使它们在160mg Fast Green FCF(Fluka Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)的160ml饱和苦味酸(Merck，Darmstadt，Germany)溶液中黑暗下保持15分钟进行预染色处理。将样品浸入水中漂洗，直到它们不再使漂洗水显色。去除紫色染料后，使样品在160mg Direct Red 80(Fluka Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)和64mg Fast Green的160ml饱和苦味酸溶液中黑暗下保持30分钟染色样品。再次漂洗它们，直到去除紫色染料，然后用小抹刀刮样品，以从薄片上分离样品。以这种方式分离下来的切片分别置于含3ml NaOH 0.1N(Quimon，Montplet&Esteban S.A.，Barcelona，Spain)和甲醇(1∶1)的试管中。从各试管取等量液体，在分光光度计(Lambda 2 UV/VIS spectrophotometer，Perkin-Elmer，Norwalk USA)上，在波长540nm和630nm处读数，以NaOH0.1N和甲醇液的等量液作为空白(Lopez de Leon A.和Rojkind(1985)Histochem，Cytochem.33：737-743；Gaudio E.等(1993)国际实验病理学杂志(Int.J.Exp.Path.)74：463-469)。
按照Gaudio E.等((1993)国际实验病理学杂志74：463-469)的工作，施用下列公式计算胶原蛋白和总蛋白的量： 
结果的统计学分析
对体内实验得到的数据进行统计学分析。通过Shapiro-Wilks实验验证量变的常态。
由于没有将数据调整到正常分布，进行了非-参数统计分析。利用Kruskal-Wallis H方法，然后通过Mann-Whitney U.比较，实现组间比较。数据用直方图表示，并表示了数据的中值(每个框内的粗线)，以及四分位内数的间距(框的高度)，而各框的“胡须”表示一个给定四分位数的间距的最高和最低观察值。
用Fisher’s精确度检验研究变量之间的相关性。应用逻辑回归研究这些变量相关性的独立性。
P值等于或低于0.05被认为具有显著性。
用Windows V 6.1.3.的程序SPSS完成所有统计分析。TGFβ1的体外抑制活性抑制MV-1-Lu细胞系细胞生长的实验
TGFβ1是一种能够抑制MV-1-Lu细胞系体外生长的细胞因子(Grubeck-Loebenstein B.等(1989)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)83：764-770；Brennan FM等(1990)临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)81：278-285)，因此用该细胞系实验肽对TGFβ1的阻断作用。我们应用培养基、细胞和腺苷的不同组合，研究不同浓度的TGFβ1对培养中的MV-1-Lu细胞整合[甲基-3H]胸苷的影响，用于确定实验的最合适条件。这些条件在图3中显示。
确定MV-1-Lu细胞的最佳浓度(5000细胞/孔)和能够产生约90％细胞抑制的最低TGFβ1浓度(200pg/ml，图18)之后，对浓度为200μg/ml的合成肽的抑制作用进行实验。合成肽对TGFβ1活性的体外抑制
用MV-1-Lu细胞系实验作为TGFβ1活性的潜在抑制剂的合成肽，该合成肽是按照“待合成肽的选择(来源于结合TGFβ1的蛋白质和TGFβ1本身的肽)”部分描述的方法选择出来的。将肽溶解于缓冲的RPMI培养基，无胎牛血清，应用下列程序：
将属于受体序列的肽，或互补于TGFβ1亲水性峰的肽，在存在该细胞因子的情况下，保温30分钟，然后与细胞培养物混合。将来源于TGFβ1序列的肽在加入TGFβ1之前加到细胞培养物中，因为它们与细胞表面受体相互作用。在100μl用于加入细胞的同样培养基中进行上述保温。根据活性肽抑制TGFβ1的能力不同，使细胞生长程度较大或较小。利用来源于TGFβ1的肽抑制TGFβ1
首先，合成来源于TGFβ1的重叠肽。合成这些肽(表2)，期望它们中的某些能够结合细胞受体，因此防止天然TGFβ1与这些受体的结合。表2.来源于TGFβ1的肽。显示了肽的数目，在完全序列中的位置，以及其氨基酸序列。为了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加了一个丙氨酸，其未在表中显示。肽 序列Pl(280-293) AlaLeuAspThrAsnTyrCysPheSerSerThrGluLysAsnP2(284-297) AsnTyrCysSerSerThrGluLysAsnCysCysValArgP3(288-301) SerSerThrGluLysAsnCysCysValArgGlnLeuTyrIleP4(294-307) CysCysValArgGlnLeuTyrIleAspPheArgLysAspLeuP5(296-311) GlnLeuTyrIleAspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrpP6(302-315) AspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluProP7(306-319) AspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHisP8(308-321) GlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnP9(312-325) IleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyP10(316-329) LysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrPll(319-333) HisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuP12(322-335) PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP13(326-339) ProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLysP14(330-343) IleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeuP15(335-349) ThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProP16(336-349) GlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProP17(340-353) ValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaP18(343-358) LeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysP19(344-358) TyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysP20(348-360) AsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGlnP21(350-363) GlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGlnAlaLeuGluP22(354-367) AlaProCysCysValProGlnAlaLeuGluProLeuProIleP23(358-371) ValProGlnAlaLeuGluProLeuProIleValTyrTyrValP24(364-377) ProLeuProIleValTyrTyrValGlyArgLysProLysValP25(368-381) ValTyrTyrValGlyArgLysProLysValGluGlnLeuSerP26(372-385) GlyArgLysProLysValGluGlnLeuSerAsnMetIleValP27(378-391) GluGlnLeuSerAsnMetIleValArgSerCysLysCysSer
图4显示了表6中的肽对TGFβ1活性的抑制作用。因为TGFβ1抑制MV-1-Lu细胞的生长，肽对这些细胞因子的抑制作用导致重新实现MV-1-Lu细胞的生长。
从图4中可以看到，来源于TGFβ1序列的肽P12是一种对TGFβ1活性表现较高抑制作用。为了更详细研究肽P12的抑制作用，进行下列关于肽浓度对细胞因子抑制作用影响的研究，其在下面描述。肽P12对TGFβ1的抑制作用的剂量-反应实验
研究了肽P12的浓度对TGFβ1活性的抑制作用的影响。由于该肽不容易溶解于实验培养基，用肽的名义浓度(那将是如果肽完全溶解得到的浓度)制备储备液或悬浮液，然后从中取等分液，过滤，或甚至直接用于抑制实验。
图5考察了过滤前和过滤后，名义浓度的肽的抑制作用。可以看到，过滤或不过滤，肽P12实际上具有相同的活性。
得到肽P12的结果后，决定在N-末端和C-末端双向延长肽，研究对其活性的影响。另外，对其序列进行改变，以改善其溶解性，并研究其序列中两个半胱氨酸对TGFβ1抑制活性的重要性。表3中描述了合成的肽。表3.来源于对肽P12进行修饰的肽肽 序列P12(322-335)PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP28(322-344)PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrGlnLysVal
LeuAlaLeuTyrP29(313-335)HisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyr
IleTrpSerLeuAspThrP30 PheSerLeuGiyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP31 PheCysLeuGlyProSerProTyrIleTrpSerLeuAspThrP32 PheSerLeuGlyProSerProTyrIleTrpSerLeuAspThrP33 PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAspP34 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrP35 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAspP36 GlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAspP37 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerP38 AspGlyProCysProTyrIleTrpSerAsp
图6显示了表3中的肽对TGFβ1的抑制作用的结果。
从图6中可以看到，肽P29是有活性的。该肽包括以前实验的肽P12，并在N-末端方向具有9个额外氨基酸(图4)。按照Quian SW等((1992)国家科学院科学进展89：6290-6294)和Brmester JK等((1993)国家科学院科学进展90：8628-8632)的方法，应用鉴定有上述细胞因子活性必须的TGFβ1区(成熟TGFβ1序列中的氨基酸40到82)的嵌合重组蛋白质进行研究。推测肽P29(成熟TGFβ1序列中的氨基酸34到56)，其比肽P12(氨基酸43到56)延长了一个较长的区域，可能需要一种更类似环状TGFβ1结构的三维结构。由于这个原因，用肽P29基于亲合性标记实验结合细胞受体。肽P29对TGFβ1与其受体结合的抑制实验(亲合性标记)
将来源于TGFβ1序列的肽P29用于亲合性标记实验，用于验证其抑制TGFβ1与其细胞受体结合的能力(材料和方法)。
由于应用的125I-TGFβ1的不同批次的活性不同，该实验中应用的肽的浓度按照各情况下使用的125I-TGFβ1批次的浓度调整。这些实验的结果在图7和8中显示。
进行进一步的实验，以寻找阻断125I-TGFβ1与细胞受体结合所需的最小浓度。来源于大鼠III型受体序列的肽对TGFβ1的抑制
为了寻找抑制TGFβ1活性的新肽，合成了来源于大鼠III型受体的肽。在预测与TGFβ1序列的氨基酸序列模块互补的序列区域基础上选择一些肽。期望这些肽将能够结合游离TGFβ1，遮蔽它并防止它与细胞受体结合。
通过重叠10个氨基酸并覆盖部分III型受体的胞外区(氨基酸45到410)合成另外一些肽。曾报道可溶性III型受体存在对应的受体胞外区，将该区从膜上切下来，作为循环系统中TGFβ1的遮蔽剂(Lopez CasillasF.等(1991)细胞67：785-795)。后来的研究描述了两种结合TGFβ1的可能区域，一种定位在受体的N-末端(Lopez-Casillas等(1994)细胞生物学杂志124：557-568)，另一种定位在C-末端侧最靠近膜的区域(Fukushima D.等(1993)生物化学杂志268：22710-22715；Pepin MC等(1995)FEBS Lett.377：368-372)。由于上述原因，合成了这些受体的胞外区，猜测这些肽可能能够遮蔽循环中的TGFβ1。
表4显示了合成的肽。表4.来源于大鼠III型受体的肽。P39到P65是预测互补于TGFβ1的肽，P66到P138是覆盖受体胞外区的重叠肽。为了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加一个丙氨酸，其在表中没有显示。肽 序列P39(91-102) AsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysProP40(104-115) ValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrpP41(109-120) SerProGlnProLauValTrpHisLeuLysThrGluP42(110-121) ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArgP43(333-344) TrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerP44(428-439) ProIleValProSerValGlnLeuLeuProAspHisP45(555-566) GlyAspGluGlyGluThrAlaProLeuSerArgAlaP46(363-574) LeuSerArgAlaGlyValValValPheAsnCysSerP47(603-614) LeuPheLeuValProSerProGlyValPheSerValP48(605-616) LeuValProSerProGlyValPheSerValAlaGluP49(707-718) GluLeuThrLeuCysSerArgLysLysGlySerLeuP50(712-723) SerArgLysLysGlySerLeuLysLeuProArgCysP51(717-728) SerLeuLysLeuProArgCysValThrProAspAspP52(722-733) ArgCysValThrProAspAspAlaCysThrSerLeuP53(727-738) AspAspAlaCysThrSerLeuAspAlaThrMetIleP54(731-742) ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP55(732-743) SerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetGlnP56(737-748) MetIleTrpThrMetMetGlnAsnLysLysThrPheP57(742-752) MetGlnAsnLysLysThrPheThrLysProLeuAlaP58(747-758) ThrPheThrLysProLeuAlaValValLeuGlnValP59(761-775) LysGluAsnValProSerThrLysAspSerSerProIleProProP60(766-780) SerThrLysAspSerSerProIleProProProProProGlnIleP61(771-785) SerProIleProProProProProGlnIlePheHisGlyLeuAspP62(776-790) ProProProGlnIlePheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMetP63(781-795) PheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMetGlyIleAlaPheAlaP64(786-800) ThrLeuThrValMetGlyIleAlaPheAlaAlaPheValIleGlyP65(797-809) LeuLeuThrGlyAlaLeuTrpTyrIleTyrSerHisP66(45-55) LeuMetGluSerPheThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGlyP67(50-64) ThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuProP68(55-69) CysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuProArgGluValHisValP69(60-74) ThrThrGlyLeuProArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSerP70(65-79) ArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyProP7l(70-84) LeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgP72(75-89) ThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHisP73(80-94) GlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHisLeuAsnProIleAlaP74(85-99) GluValThrLeuHisLeuAsnProIleAlaSerValHisThrHisP75(90-104) LeuAsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysProIleValP76(95-109) SerValHisThrHisHisLysProIleValPheLeuLeuAsnSerP77(100-114) HisLysProIleValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValP78(105-119) PheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrP79(110-124) ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAlaP80(115-129) TrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeuP81(120-134) ArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGlyP82(125-139) GlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGlySerValValGlnP83(130-144) PheLeuValSerGluGlySerValValGlnPheProSerGlyAsnP84(135-149) GlySerValValGlnPheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAlaP85(140-154) PheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArgP86(145-159) PheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArgAsnPheProGlnGluP87(150-164) GluThrGluGluArgAsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuValP88(155-169) AsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLysP89(160-174) AsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaValP90(163-179) ArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGluP91(170-184) GluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArgP92(175-189) ThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArgAsnIleTyrIleLysP93(190-194) LeuLysIleAlaArgAsnIleTyrIleLysValGlyGluAspGlnP94(185-159) AsnIleTyrIleLysValGlyGluAspGlnValPheProProThrP95(190-201) ValGlyGluAspGlnValPheProProThrCysAsnIleGlyLysP96(195-209) ValPheProProThrCysAsnIleGlyLysAsnPheLeuSerLeuP97(200-214) CysAsnIleGlyLysAsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGluP98(205-219) AsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLysP99(210-224) AsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLysAlaAlaGluGlyCysP100(215-229) TyrLeuGlnProLysAlaA1aGluGlyCysValLeuProSerGlnP101(220-234) AlaAlaGluGlyCysValLeuProSerGlnProHisGluLysGluP102(225-239) ValLeuProSerGlnProHisGluLysGluValHisIleIleGluP103(230-244) ProHisGluLysGluValHisIleIleGluLeuIleThrProSerP104(235-249) ValHisIleIleGluLeuIleThrProSerSerAsnProTyrSerP105(240-254) LeuIleThrProSerSerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspP110(265-279) AspProGluValValLysAsnLeuValLeuIleLeuLysCysLysP11l(270-284) LysAsnLeuValLeuIleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrpP112(275-289) IleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrpValIleLysSerPheP113(210-294) LysSerValAsnTrpValIleLysSerPheAspValLysGlyAsnP114(285-299) ValIleLysSerPheAspValLysGlyAsnLeuLysValI1eAlaP115(250-304) AspValLysGlyAsnLeuLysValIleAlaProAsnSerIleGlyP106(245-259) SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleIleValAspIleP107(250-264) AlaPheGlnValAspIleIleValAspIleArgProAlaGlnGluP108(255-269) IleIleValAspIleArgProAlaGlnGluAspProGluValValP109(260-274) ArgProAlaGlnGluAspProGluValValLysAsnIeuValLeuPl16(295-309) LeuLysValIleAlaProAsnSerIleGlyPheGlyLysGluSerP117(300-314) ProAsnSerIleGlyPheGlyLysGluSerGluArgSerMetThrP118(305-319) PheGlyLysGluSerGluArgSerMetThrMetThrLysLeuValP119(310-324) GluArgSerMetThrMetThrLysLeuValArgAspAspIleProP120(315-329) MetThrLysLeuValArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsnP121(320-334) ArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAlaP122(325-339) SerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrP123(330-344) LeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerP124(335-349) LeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerTyrThrMetAlaProP125(340-354) ArgProValThrSerTyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPheP126(345-359) TyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPheHisLeuArgLeuGluP127(350-364) ValAlaAsnArgPheHisLeuArgLauGluAsnAsnGluGluMetP128(355-369) HisLeuArgLeuG1uAsnAsnGluGluMetArgAspGluGluValP129(360-374) AsnAsnGluGluMetArgAspGluGluValHisThrIleProProP130(365-379) ArgAspGluGluValHisThrIleProProGluLeuArgIleLeuP131(370-384) HisThrIleProProGluLeuArgIleLeuLeuAspProAspHisP132(375-389) GluLeuArgIleLeuLeuAspProAspHisProProAlaLeuAspP133(380-394) LeuAspProAspHisProProAlaLeuAspAsnProLeuPheProP134(385-399) ProProAlaLeuAspAsnProLeuPheProGlyGluGlySerProP135(390-404) AsnProLeuPheProGlyGluGlySerProAsnGlyGlyLeuProP136(395-409) G1yGluGlySerProAsnGlyGlyLeuProPheProPheProAspP137(400-414) AsnGlyGlyLeuProPheProPheProAspIleProArgArgGlyP138(405-419) PheProPheProAspIleProArgArgGlyTrpLysGluGlyGlu
实验了表4中的肽在MV-1-Lu细胞系抑制模型中阻断TGFβ1的能力。因为TGFβ1能够抑制该细胞系的生长，肽对TGFβ1的抑制能够使细胞重新开始生长。这些实验在图9到12中显示。
如图9到12所示，存在多种能够较高或较低程度地抑制Mv-1-IU细胞系生长的肽，但仅肽P54能够几乎完全地抑制TGFβ1的活性。为了对该肽进行更完全的研究，对不同浓度的肽抗固定浓度为200pg/ml的TGFβ1，进行了实验。肽P54对TGFβ1抑制的剂量-应答实验
研究了肽P54的浓度对TGFβ1活性抑制作用的影响。由于该肽溶解性较低，制备名义浓度的肽储备液，如同对肽P12进行的同样操作，从中取等分液，过滤，或者甚至直接用于抑制实验。
图13考察了过滤前和过滤后，名义浓度的肽的抑制作用。可以看到在肽P54的滤液中没有可检测到的抑制活性。
验证了肽P54以应用剂量依赖方式抑制TGFβ1活性的能力后，我们接着以P54序列为基础合成了新肽，目的在于试图改善溶解性并由此提高在较低剂量中的活性。还合成了两种来源于人III型受体的肽。一种肽(P144)等价于肽P54。另一种肽(P145)类似于大鼠III型受体的肽P106，该肽也证明具有活性。这些新肽在表5中显示。表5.来源于对肽P54进行修饰的肽(肽P139-P143)，以及来源于人III型受体的肽(肽P144和P145)。肽 序列 来源P54(731-742) ThrSerLuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMet 大鼠III型受体P139 ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpAspAspAspP140 AspAspAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetP141 AspAlaThrMetIleTrpAspP142 ThrSerLeuMetIleTrpThrMetMetP143 ThrSerLeuAspAlaThrThrMetMetP144(729-742)TnrSerLeuAspAlaSerIleIleTrpAlaMetMet 人III型受体
GlnAsnP145(241-254)SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleThr 人III型受体
IleAsp表5中的肽的活性实验在图14中显示。肽P144对TGFβ1抑制作用的剂量-应答实验
用来源于人III型受体序列的肽P144进行剂量-应答实验，目的在于实验其活性是否依赖于浓度(图15)。可以看到，肽的活性随着实验中应用的肽浓度的降低而降低。肽P144对TGFβ1与其受体结合的抑制实验(亲合性标记)
在亲合标记实验中使用来源于人III型受体序列的肽P144，用于验证其抑制TGFβ1与TGFβ1的细胞受体结合的能力(材料和方法)。
由于使用的不同批次的125I-TGFβ1的活性不同，该实验中使用的肽的浓度按照每种情况下使用的125I-TGFβ1批次的浓度调整。这些实验的结果在图15中显示。
当验证了肽P144抑制TGFβ1与其细胞受体结合后，进行新的实验以确定肽P144的浓度。观察到当肽的浓度为125I-TGFβ1的分子浓度的2×105倍时，该肽丧失了其活性。来源于能够结合TGFβ1的其它蛋白质并预测互补于TGFβ1的肽的抑制作用
在该部分中合成了表6中的肽，它们来源于能够结合TGFβ1的蛋白质。表6.来源于各种能够结合TGFβ1的蛋白质(II型受体P146，胎球蛋白P147至P149，endoglin P150至P154和α2-巨球蛋白P155至P179)的肽。显示了肽的数目，其在完整序列中的位置，其氨基酸序列以及其来源。为了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加了一个丙氨酸，其未在表中显示。肽 序列 来源P146(84-102) CysValAlaValTrpArgLysAsnAspGluAsnIleThr II型受体
LeuGluThrValCysP147(114-322) CysAspPheGlnLeuLeuLysLeuAspGlyLysPheSer Fetuin
ValValTyrAlaLysCysP149(114-122) CysAspPheHisIleLeuLysGlnAspGlyGlnPheArg Fetuin
ValCysHisAlaGlnCysP149(114-132) CysAspIleHisValLeuLysGlnAspGlyPheSerVal Fetuin
LeuPheThrLysCysAspP150(247-261) GluAlaValLeuIleLeuGlnGlyProProTyrValSer Endoglin
TrpLeuP151(289-393) ValAsnLeuProAspThrArgGlnGlyLeuLeuGluGlu Endoglin
AlaArgP152(445-459) LeuAspSerLeuSerPheGlnLeuGlyLeuTyrLeuSer Endoglin
ProHisP153(482-495) ProSerIleProGluLeuMetThrGlnLeuAspSerCys Endoglin
GlnLeuP154(479-493) MetSerProSerIleProGluLeuMetThrGlnLeuAsp Endoglin
SerCysP155(22-24) LeuLeuLeuLeuValLeuLeuProThrAspAlaSer α-2-巨球蛋白P156(20-31) ProThrAspAlaSerValSerGlyLysProGlnTyr α-2-巨球蛋白P157(44-53) ThrGluLysGlyCysValLeuLeuSerTyrLeuAsn α-2-巨球蛋白P158(166-177) TyrIleGlnAspProLysGlyAsnArgIleAlaGln α-2-巨球蛋白P158(166-177) TyrIleGlnAspProLysGlyAsnArgIleAlaGln α-2-巨球蛋白P159(193-283) PheProLeuSerSerGluProPheGlnGlySerTyr α-2-巨球蛋白P160(247-258) AsnValserValCy5GlyLeuTyrThrTyrGlyLys α-2-巨球蛋白P161(244-259) ValSerValCysGlyLeuTyrThrTyrGlyLysPro α-2-巨球蛋白P162(250-261) ValCysGlyLeuTyrThrTyrGlyLysProValPro α-2-巨球蛋白P163(267-278) SerIleCysArgLysTyrSerAspAlaSerAspCys α-2-巨球蛋白P164(469-480) ProCysGlyHisThrGlnThrValGlnAlaHisTyr α-2-巨球蛋白P165(554-565) AspSerAlaLysTyrAspValGluAsnCysLeuAla α-2-巨球蛋白P167(730-801) GlnProPhePheValGluLeuThrMetProTyrSer α-2-巨球蛋白P168(827-838) GlnLeuGluAlaSerProAlaPheLeuAlaValPro α-2-巨球蛋白P169(835-816) SerValGlnLeuGluAlaSerProAlaPheLeuAla α-2-巨球蛋白P170(876-887) AlaLeuGluSerGlnGluLeuCysGlyThrGluVal α-2-巨球蛋白P171(1081-1012) LysSerLysIleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyr α-2-巨球蛋白P172(1085-1016) IleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyrGlnArgGlnLeu α-2-巨球蛋白P173(1062-1073) LysArgLysGluValLeuLysSerLeuAsnGluGlu α-2-巨球蛋白P174(1193-1204) ValGlyHisPheTyrGluProGlnAlaProSerAla α-2-巨球蛋白P175(2209-1220) ThrSerTyrValLeuLeuAlaTyrLeuThrGlnAla α-2-巨球蛋白Pl76(1211-1222) TyrValLeuLeuAlaTyrLeuThrAlaGlnProAla α-2-巨球蛋白P177(1256-1167) ValAlaLeuHisAlaLeuSerLysTyrGlyAlaAla α-2-巨球蛋白P178(1232-1243) TyrG1yArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAla α-2-巨球蛋白Pl79(1234-1245) ArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAlaPheVal α-2-巨球蛋白
图17和18显示了来源于表10的肽的抑制活性。
如图17和18所示，仅肽P150显示了高于50％的活性。然而，对于肽P146和P149，Demetriou M等((1996)生物化学杂志271：12755-12761)报道具有活性，但在该实验使用的条件下没有发现活性。合成肽对TGFβ1与其细胞受体结合的抑制作用的流动细胞记数测定
通过流动细胞记数测定来源于前面合成过程的肽，包括从TGFβ1序列和从III型受体序列合成的肽，测定它们抑制TGFβ1与其细胞受体结合的能力。在这些实验中，将细胞与肽保温，然后加入TGFβ1-生物素，其将用抗生物素蛋白-FITC检测到(材料和方法)。然后测定抗生物素蛋白-FITC发散的荧光：它将与结合到细胞上的TGFβ1的量成正比，而与肽的活性成反比。最相关肽得到结果在图19和表7中显示。表7.通过抑制MV-1-Lu细胞生长1的生物分析测定(肽浓度200μg/ml)和应用流动细胞记数2测定抑制TGFβ1与其细胞受体结合(肽浓度420μg/ml)，比较了一些肽的TGFβ1的抑制活性。肽 生物检测 细胞记数 序列
(％抑制率)1 (％抑制率)2P29 77.6 92.34 HisGluProLysGlyTyrHis
AlaAsnPheCysLeuGlyPro
CysProTyrIleTrpSerLeu
AspThrP11 40 86 HisAlaAsnPheCysLeuGly
ProCysProTyrIleTrpSer
LeuP12 96 77 PheCysLeuGlyProCysPro
TyrIleTrpSerLeuAspThrP18 18.2 6.5 LeuTyrAsnGlnHisAsnPro
GlyAlaSerAlaAlaProCys
CysP54 97 82.3 ThrSerLeuAspAlaThrMet
IleTrpThrMetMetP140 -1.7 69.8 AspAspAspAlaThrMetIle
TrpThrMetMetP142 70 72 ThrSerLeuMetIleTrpThr
MetMetP106 40 91 SerAsnProTyrSerAlaPhe
GlnValAspIleIleValAsp
IleP145 21 74.35 SerAsnProTyrSerAlaPhe
GlnValAspIleThrIleAspP144 88 80 ThrSerLeuAspAlaSerIle
IleTrpAlaMetMetGlnAsnP150 64 73 GluAlaValLeuIleLeuGln
GlyProProTyrValSerTrpP152 45 68.4
Leu
LeuAspSerLeuSerPheGln
LeuGlyLeuTyrLeuSerPro
HisTGFβ1活性的体内抑制
已经证明在抑制MV-1-Lu细胞系生长的生物检测中具有活性的、来源于人III型受体的序列的肽P144，应用于体内实验，用于研究其在大鼠模型中对CCl4诱导的实验硬化的抑制作用。Wistar大鼠的硬化实验模型
在该模型中，通过吸入四氯化碳11周，每周两次，诱导肝硬化(LopezNovas JM等(1976) Patologia IX：223-240；Camps J.等(1987)胃肠病学93：498-505)，如材料和方法中描述的那样。
按照两种方案施用肽P144：1.方案1：在硬化诱导过程中(11周)，通过腹膜内途径每隔一天施用肽一次。图20和21。2.方案2：当出现硬化时，即从开始诱导硬化的第12周开始，通过腹膜内途径每隔一天施用肽一次，连续3周。图22和23。
通过两种方法测定两种方案中产生的胶原蛋白。
图36和38显示了产生的总胶原，通过染色的肝切片(每只动物两个切片)，用East Green和Direct Red测定颜色的洗脱，在分光光度计上读数(材料和方法)(Lopez de Leon A.和Rojkind(1985)组织化学和细胞化学(Histochem.Cytochem.)33：737-743；Gaudio E.等(1993)国际实验病理学杂志(Int.J.Exp.Path)74：463-469)。
图21和23显示了产生的胶原，通过对天狼红染色的肝切片用光学显微镜进行的图像分析测定(材料和方法)。
如图20所示，当研究胶原蛋白与总蛋白的比率时，在用肽P144处理的大鼠组(Tto1)和硬化大鼠的对照组(Ci1)之间，观察到显著差异(P＜0.05)。在图37中，当研究纤维化面积时，肽P144处理大鼠组(Tto1)和硬化大鼠的对照组(Ci1)之间的差异也是显著的(P＜0.001)。
如图22和23所示，它们显示了出现硬化后处理大鼠的结果，当用两种测定纤维化方法中的任何一种，肽P144处理的大鼠组(Tto2)和硬化大鼠的对照组(Ci2)之间的差异都是不显著的。
用线性回归比较了这两种测定胶原的方法，目的在于验证各制备过程中选择的研究视野的随机性，由此证明图像分析的有效性，图24和25。
如图24和25所示，两种方法之间存在相关性，两种情况下，均R＞0.85，它们是高度显著的(F≤0.001)。这证明用于研究的图像的精确性完全随机实现，因此证明图像分析得到的数据的有效性。
图26和27显示了从天狼红染色的肝切片(从硬化诱导过程中处理大鼠(Ci1和Tto1)的肝得到)的光学显微镜得到的图像，10X放大倍数。
图26中的图像由没有经过任何类型的滤光片得到。
图27显示了应用特殊软件为研究而修饰后的图像。这些修饰包括应用两种滤光片，一个是偏振光的，另一个是绿光的，目的为了改善图像的质量，有助于它们的自动检查。
图26和27表明，在从硬化大鼠(Ci1)得到的图像和从肽P144处理大鼠(Tto1)得到的图像之间存在差异。
方案1和2之间有效性的差异可能由于CCl4诱导出现硬化后(方案2)比CCl4诱导硬化过程中(方案1)可能产生较少的TGFβ1，甚至可能在正常水平所致，因此在方案2中比在方案1中用肽P144处理产生的效果将不显著。
当我们比较硬化诱导过程结束时的未处理大鼠组(Ci1)和诱导结束后第4周未处理的硬化大鼠组(Ci2)时，我们发现两组之间存在显著差异(P＝0.016)(图28)，这表明当硬化物质除去后，硬化的部分衰退，多位作者公开了这一观察结果(Szende-B等(1992)体外(In Vivo)6：355-361；Columbano A(1996)癌发生(Carcinogenesis)17：395-400)。
两种方案之间上述有效性的差异也可能由于方案自身，因为方案2的动物仅隔天处理一次，处理3周，而方案1的动物处理了较长时间(7周，同样隔天处理一次)。
得到的结果证明，来源于不同蛋白质的合成肽在体外和体内均可能抑制TGFβ1。将来可能更多关注于试图增加这些肽的生物活性。这可以通过将这些序列的各氨基酸由另外19个系统取代而实现。一旦发现具有较高活性的肽，将必须制备模拟型(mimotope)(McConnell-SJ(1994)基因(gene)151：115-118；Steward-MW(1995)病毒学杂志(J.Virol.)69：7668-7673)，其目的在于增加生物体中抑制物质的平均寿命。
附图描述
图1.肽P144对TGFβ1与MV-1-Lu细胞结合的抑制，通过流动细胞记数测定。A：考察与生物素酰化TGFβ1保温然后与抗生物素蛋白-FITC培养的细胞得到的图像。B：考察与抗生物索蛋白-FITC保温，而之前不加TGFβ1的细胞得到的图像。C：考察先与浓度为0.42μg/μl的肽P144保温之后与TGFβ1保温，然后与抗生物素蛋白-FITC培养的细胞得到的图像。横坐标显示发散的荧光，纵坐标显示各荧光值的细胞数。也显示了对应TGFβ1-生物素和抗生物素蛋白-FITC(M2)标记细胞和未标记细胞(M1)的视野。
图2.CCl4诱导硬化过程的示意图。黑箭头显示施用给大鼠的CCl4两周剂量，黑色虚线箭头表示一周剂量。灰色箭头表示施用肽P144。A：健康对照；B：健康对照+P144，B1：肽70μg/天；C：硬化；C1生理盐水；C2为肽70μg/天；D：CCl4+苯巴比妥诱导硬化；D1加盐水；D2加肽70μg/天。
图3.TGFβ1对MV-1-Lu细胞生长的影响。细胞以5000个细胞/孔的密度在指示的TGFβ1浓度(pg/ml)下培养，横坐标：TGFβ1浓度(pg/ml)；纵坐标：c.p.m.。
图4.来自TGFβ1的肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有的肽以200μg/ml的浓度实验。对TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时MV-1-Lu细胞的生长。
图5.在存在各种名义浓度的肽P12时，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率，过滤(◆)和未过滤(●)。
图6.来自TGFβ1的肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有的肽以200μg/ml的浓度实验。对TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时MV-1-Lu细胞的生长。
图7.TGFβ1受体的亲和标记实验的放射能照相。C1道：细胞与浓度为0.16μM相应于0.3μCi活性的125I-TGFβ1(阳性对照)共同培养的效果。C2道：细胞与浓度10倍于125I-TGFβ1的非-放射性TGFβ1(阴性对照)预培养的效果。C3道：与浓度比125I-TGFβ1的分子浓度高106倍浓度的肽P29预培养的效果。可以看到，肽P29和非-放射性TGFβ1均抑制125I-TGFβ1与I、II和II型细胞受体的结合。
图8.TGFβ1受体的亲合标记实验的放射能照相。C1到C6道：MV-1-Lu细胞与不同浓度的肽P29(分别为125I-TGFβ1分子浓度的106、8×105、6×105、4×105、2×105、和105倍)预培养，之后加入125I-TGFβ1的效果。道C7：MV-1-Lu细胞与未标记的TGFβ1(125I-TGFβ1分子浓度的102)预培养，之后加入125I-TGFβ1的效果(阴性对照)。C8道：MV-1-Lu细胞与浓度为0.42μM 125I-TGFβ1，相应于0.4μCi活性共培养，而没有之前的预培养的效果(阳性对照)。
图9.预测与TGFβ1区域互补的受体肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图10.来源于III型受体胞外区的重叠肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图11.来源于III型受体胞外区的重叠肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图12.来源于III型受体胞外区的重叠肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图13.在存在不同名义浓度的肽P54时，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率，过滤(◆)和未过滤(●)。
图14.来源于对肽P54修饰的受体肽(P139-P143)和来源于人III型受体的肽(P144和P145)对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图15.在存在不同名义浓度的肽P144而未过滤时，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率。
图16.TGFβ1受体的亲合标记实验的放射能照相。C1道：与浓度比125I-TGFβ1的分子浓度高106倍的肽P144进行预培养。C2和C3道：细胞与浓度比125I-TGFβ1的分子浓度高10倍浓度的非放射性TGFβ1预培养的效果(阴性对照)。C4和C5道：细胞与浓度为0.1μM，相应于0.2μCi活性的125I-TGFβ1共培养的效果(阳性对照)。可以看到肽P144和非放射性TGFβ1均抑制125I-TGFβ1与细胞受体的结合。
图17.来源于人II型受体的肽(P146)、来源于胎球蛋白的肽(P147-149)和来源于endoglin的肽(P150-P154)对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图18.来源于α2-巨球蛋白的肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图19.各种合成肽对TGFβ1与MV-1-Lu细胞结合的百分抑制率。对于各肽，通过测定标记细胞(发散荧光)和未标记细胞(未发散荧光)的百分率研究抑制。
图20.在用CCl4诱导实验性硬化过程中，施用肽P144对胶原合成的影响。纵坐标显示了胶原蛋白与总蛋白的比率。横坐标显示了大鼠的各不同组：Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144处理的健康大鼠；Tto1＝接受CCl4诱导硬化并在该过程中每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci1＝接受CCl4诱导硬化11周，并且不用肽P144处理的大鼠。
图21.在CCl4诱导实验性硬化过程中，施用肽P144对胶原合成的影响。纵坐标显示了天狼红染色的组织切片中纤维化面积与总面积的比率。横坐标显示了大鼠的各不同组：Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144处理的健康大鼠；Tto1＝接受CCI4诱导硬化并在该过程中每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci1＝接受CCl4诱导硬化11周，并且不用肽P144处理的大鼠。
图22.用CCl4诱导硬化后，施用肽P144对胶原合成的影响。纵坐标显示了胶原蛋白与总蛋白的比率。横坐标显示了大鼠的各不同组：Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144处理的健康大鼠；Tto2＝接受CCl4诱导硬化并在该过程结束时，每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci2＝接受CCl4诱导硬化11周，并且不用肽P144处理的大鼠。
图23.用CCl4诱导硬化后，施用肽P144对胶原合成的影响。纵坐标显示了组织切片中纤维化面积与总面积的比率。横坐标显示了大鼠的各不同组：Co＝健康大鼠；Co＋P144＝用肽P144处理的健康大鼠；Tto2＝接受CCl4诱导硬化并在该过程结束时，每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci2＝接受CCl4诱导硬化11周，并且不用肽P144处理的大鼠。
图24.通过应用的两种方法得到的胶原蛋白量和纤维化面积的数据的比较。横坐标表示通过图像分析得到的纤维化面积与总面积的比值。纵坐标表示通过Direct Red和Fast Green染色的肝脏切片的分光光度计分析得到的胶原量(μg)与总蛋白(mg)的比值。显示了R2(F≤0.001)。
图25.在方案2结束时，使用两种考察样品的方法得到的胶原量和纤维化面积的数据比较。横坐标表示通过图像分析得到的纤维化面积与总面积的比值。纵坐标表示通过Direct Red和Fast Green染色的肝脏切片的分光光度计分析得到的胶原量(μg)与总蛋白(mg)的比值。显示了R2(F≤0.001)。
图26.通过用光学显微镜(10X)对天狼红染色的大鼠肝脏切片观察得到24个代表性视野的图像。CCl4诱导硬化结束时的硬化大鼠(Ci1)和CCl4诱导硬化过程中用肽P144处理的硬化大鼠(Tto1)。不同视野取自从各动物得到的切片(R＝大鼠，C＝视野)。
图27.通过用光学显微镜(10X)对天狼红染色的大鼠肝脏切片观察得到24个代表性视野的图像。CCl4诱导硬化结束时的硬化大鼠(Ci1)和CCl4诱导硬化过程中用肽P144处理的硬化大鼠(Tto1)。不同视野取自从各动物得到的切片(R＝大鼠，C＝视野)。使用了偏振光和绿光滤光片，以便显露出胶原纤维。
图28.两组未处理的硬化大鼠之间的比较。Ci1是在CCl4诱导硬化的12周末的硬化大鼠，Ci2是诱导硬化过程结束后4周的硬化大鼠。P＝0.016。纵坐标：纤维化面积/总面积。序列表<110>纳瓦拉公司科学与技术研究所<120>TGFβ1-抑肽<160>10<210>SEQ IN NO：1<211>15<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>来源于TGFβ1，319-333位<400>His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp
5 10
Ser Leu
15<210>SEQ IN NO：2<211>14<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>来源于TGFβ1，322-335位<400>Phe Cys Leu Gly Pro Cys pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp
5 10
Thr<210>SEQIN NO：3<211>12<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>推测与TGFβ1，731-742位互补<400>Thr Ser Leu Asp Ala Thr Met Ile Trp Thr Met Met
5 10<210>SEQ IN NO：4<211>15<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>与大鼠III型受体的胞外区，245-259位重叠<400>Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Ile Val
5 l0
Asp Ile
15<210>SEQ IN NO：5<211>9<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>推测与TGFβ1，731-742位互补的修饰P54<400>Thr Ser Leu Met Ile Trp Thr Met Met
5<210>SEQ IN NO：6<211>14<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>来源于修饰的人III型受体，729-742位<400>Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile Ile Trp Ala Met Met Gln
5 10
Asn<210>SEQ IN NO：7<211>14<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>来源于修饰的人III型受体，241-254位<400>Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile
5 10
Asp<210>SEQ IN NO：8<211>15<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>endoglin的247-261位<400>Glu Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser
5 10
Trp Leu
15<210>SEQ IN NO：9<211>15<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>endoglin的445-459位<400>Leu Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser
5 10
Pro His
15<210>SEQ IN NO：10<211>23<212>肽<213>人工序列<220>结构域<223>TGFβ1的322-335位的修饰P12<400>His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly
5 10
Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr
15 20
Claims (18)
1.一种作为体内TGFβ1与其受体结合的拮抗剂的肽，其特征在于，它们具有部分等同于或类似于TGFβ1本身和/或其受体的氨基酸序列。
2.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
3.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
4.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
5.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
6.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
7.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
8.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
9.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
10.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
11.按照权利要求1的活性肽，特征在于它具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
12.权利要求1-11之一的活性肽的模拟型(mimotope)，特征在于它们表现类似于权利要求1-11活性肽的拮抗作用，但比后者在体内具有更长的平均寿命。
13.一种应用至少一种权利要求1-11的活性肽和/或至少一种它们的模拟型生产应用于肝脏疾病的组合物的方法。
14.一种应用至少一种编码至少一种权利要求1-11的活性肽的DNA生产应用于肝脏疾病的组合物的方法，任选包括至少一种所述活性肽的模拟型。
15.一种应用至少一种编码至少一种权利要求1-11的活性肽的重组表达系统生产应用于肝脏疾病的组合物的方法，任选包括至少一种所述活性肽的模拟型。
16.按照权利要求15的方法，特征在于所述重组表达系统是一种缺陷型腺病毒。
17.按照权利要求15的方法，特征在于所述重组表达系统是一种质粒。
18.按照权利要求13-17的方法应用于肝纤维化。
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Owner name: TOP BIOLOGICAL MEDICAL ENGINEERING CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: INST OF APPLICATION MEDICINE Effective date: 20050701 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20050701 Address after: Pamplona Patentee after: Inst of Application Medicine Address before: Navarra Spain Patentee before: Inst of Application Medicine |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20050525 Termination date: 20141123 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |