CN1203091C - TGFβ1－抑制肽 - Google Patents
TGFβ1－抑制肽 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1203091C CN1203091C CNB99813614XA CN99813614A CN1203091C CN 1203091 C CN1203091 C CN 1203091C CN B99813614X A CNB99813614X A CN B99813614XA CN 99813614 A CN99813614 A CN 99813614A CN 1203091 C CN1203091 C CN 1203091C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- peptide
- tgf
- cell
- rat
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 262
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 40
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims abstract 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 claims description 16
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 abstract description 151
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 abstract description 151
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 26
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 abstract description 19
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 abstract description 19
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 117
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 53
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 49
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 49
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 description 38
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 34
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 31
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 29
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 29
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 description 21
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 20
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 18
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 16
- 238000011160 research Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 102100027303 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 2 Human genes 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 11
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 11
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 11
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 11
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 11
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000012085 Endoglin Human genes 0.000 description 10
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 7
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 6
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 6
- RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L Fast green FCF Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC(O)=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- LXUJDHOKVUYHRC-KKUMJFAQSA-N Phe-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N LXUJDHOKVUYHRC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- 108010077465 Tropocollagen Proteins 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 3
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 210000004024 hepatic stellate cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 2
- 241000208199 Buxus sempervirens Species 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- QSQXZZCGPXQBPP-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Cys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O QSQXZZCGPXQBPP-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- MJNWEIMBXKKCSF-XVYDVKMFSA-N His-Ala-Asn Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N MJNWEIMBXKKCSF-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 2
- PPHLBTXVBJNKOB-FDARSICLSA-N Met-Ile-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O PPHLBTXVBJNKOB-FDARSICLSA-N 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- MFQXSDWKUXTOPZ-DZKIICNBSA-N Phe-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N MFQXSDWKUXTOPZ-DZKIICNBSA-N 0.000 description 2
- BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N Pro-His Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CN=CN1 BEPSGCXDIVACBU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- BXHRXLMCYSZSIY-STECZYCISA-N Pro-Tyr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O BXHRXLMCYSZSIY-STECZYCISA-N 0.000 description 2
- DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N Ser-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- -1 Streptomycin sulphates Chemical class 0.000 description 2
- UXUAZXWKIGPUCH-RCWTZXSCSA-N Thr-Met-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O UXUAZXWKIGPUCH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 2
- VYQQQIRHIFALGE-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 VYQQQIRHIFALGE-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 210000000208 hepatic perisinusoidal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N phenobarbital Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O DDBREPKUVSBGFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N picric acid Chemical class OC1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O OXNIZHLAWKMVMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001047 purple dye Substances 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 2
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SITWEMZOJNKJCH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VEAPAYQQLSEKEM-GUBZILKMSA-N Ala-Met-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O VEAPAYQQLSEKEM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NJIKKGUVGUBICV-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N Asp-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KVMPVNGOKHTUHZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N Asp-Ile Chemical compound CCC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O BSWHERGFUNMWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHSDEZURHWEZPN-SXTJYALSSA-N Asp-Ile-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N NHSDEZURHWEZPN-SXTJYALSSA-N 0.000 description 1
- SPWXXPFDTMYTRI-IUKAMOBKSA-N Asp-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SPWXXPFDTMYTRI-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N Asp-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O NTQDELBZOMWXRS-IWGUZYHVSA-N 0.000 description 1
- 208000031872 Body Remains Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004214 Fast Green FCF Substances 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- DXJZITDUDUPINW-WHFBIAKZSA-N Gln-Asn Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DXJZITDUDUPINW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ARPVSMCNIDAQBO-YUMQZZPRSA-N Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ARPVSMCNIDAQBO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- CAXXTYYGFYTBPV-IUCAKERBSA-N Gln-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CAXXTYYGFYTBPV-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- OSZUPUINVNPCOE-SDDRHHMPSA-N His-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O OSZUPUINVNPCOE-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 229940124036 Hydrolase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N Ile-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O WKXVAXOSIPTXEC-HAFWLYHUSA-N 0.000 description 1
- GLLAUPMJCGKPFY-BLMTYFJBSA-N Ile-Ile-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(O)=O)=CNC2=C1 GLLAUPMJCGKPFY-BLMTYFJBSA-N 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N L-alanine-L-arginine Natural products CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCNC(N)=N SITWEMZOJNKJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N Leu-Ser-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IWMJFLJQHIDZQW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNKLKUUGESXCBS-KBPBESRZSA-N Lys-Gly-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O NNKLKUUGESXCBS-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N Met-Met Chemical compound CSCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCSC ZYTPOUNUXRBYGW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 241000713862 Moloney murine sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102100025751 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000772415 Neovison vison Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N Pro-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- YIQKLZYTHXTDDT-UHFFFAOYSA-H Sirius red F3B Chemical compound C1=CC(=CC=C1N=NC2=CC(=C(C=C2)N=NC3=C(C=C4C=C(C=CC4=C3[O-])NC(=O)NC5=CC6=CC(=C(C(=C6C=C5)[O-])N=NC7=C(C=C(C=C7)N=NC8=CC=C(C=C8)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)O)S(=O)(=O)[O-])S(=O)(=O)[O-].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+] YIQKLZYTHXTDDT-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108700032504 Smad2 Proteins 0.000 description 1
- 101150102611 Smad2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- BOBZBMOTRORUPT-XIRDDKMYSA-N Trp-Ser-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BOBZBMOTRORUPT-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- LQGDFDYGDQEMGA-PXDAIIFMSA-N Tyr-Ile-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N LQGDFDYGDQEMGA-PXDAIIFMSA-N 0.000 description 1
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 244000144987 brood Species 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000019240 fast green FCF Nutrition 0.000 description 1
- 230000009795 fibrotic process Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004093 hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 description 1
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108010085203 methionylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 208000007232 portal hypertension Diseases 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M sodium;dodecane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCS([O-])(=O)=O DAJSVUQLFFJUSX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2799/00—Uses of viruses
- C12N2799/02—Uses of viruses as vector
- C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
- C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
从生物体中的TGFβ1或从其受体得到的拮抗性合成肽，它们能够即可以以它们自身，也可以以编码它们的基因序列和表达它们的重组系统，用于生产用于治疗肝脏疾病，更具体地说是纤维化的组合物。所述组合物能够任选地包括所述活性肽的模拟型(mimotope)。
Description
技术背景描述
细胞生长由生长因子家族的各种蛋白质调节(Schalch DS等(1979)内分泌学(Endocrinology)104：1143-1151)。参与细胞发育，并能够由自分泌和旁分泌机制发挥作用的最重要生长因子包括转化生长因子(TGF)(Braun L.等(1988)细胞生物学(Cell Biol.)85：1539-1543；LyonsRM和Moses HL(1990)欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)187：467-473)。
术语TGF首次用于描述由鼠肉瘤病毒转化的细胞系产生的活性(deLarco JE和Todaro GJ(1978)国立科学院科学学报(Proc.Natl.Acad.Sci.)75：4001-4005；Mizel SB等(1980)国立科学院科学学报，77：2205-2208)。这些细胞的悬浮液能够诱导需要固体支持物支持生长的细胞在软琼脂中正常生长。更具体的研究证明存在两类TGF，称之为TGFα和TGFβ，它们又包括相关蛋白质家族。TGFβ家族由五个二聚体结构(Schlunneger MP和Grutter MG(1992)自然358：430-434；Brand T.和Schneider MD(1995)J.Mol.Cell Cardiol.27：5-18)的同种型构成(Brand T.和Schneider MD(1995)J.Mol.Cell Cardiol.27：5-18)。对从单一物种纯化出来的成熟蛋白质的研究表明它们的序列之间存在高度相同性(表1)。
表1.不同型TGFβ之间的同源性。TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3来源于人，TGFβ4来源于鸡，TGFβ5来源于狗。(Roberts AB和Sporn MB，1990)。
| ％ | TGFβ1 | TGFβ2 | TGFβ3 | TGFβ4 | TGFβ5 |
| TGFβ1 | 100 | ||||
| TGFβ2 | 71 | 100 | |||
| TGFβ3 | 72 | 76 | 100 | ||
| TGFβ4 | 82 | 64 | 71 | 100 | |
| TGFβ5 | 76 | 66 | 69 | 72 | 100 |
TGFβ1以一种具有390个氨基酸称之为前-原-TGFβ1的前体合成。在第一次水解中，释放出一种29个氨基酸的疏水片段，得到原-TGFβ1。然后在TGFβ1氨基末端之前的、由两个精氨酸构成的区域中的再次切割得到成熟TGFβ1，其为112个氨基酸的蛋白质，分子量为12KDa。为了形成生物活性形式，这两种单体通过二硫键连接到一起，产生一种25KDa的二聚体。这种结构的改变导致生物功能的丧失(Barnard JA等(1990)生物化学和生物物理学报(Biochem.Biophys.Acta)1032：79-87)。
已知TGFβ1结构中存在多种结构域。发现这些结构域之一定位在氨基酸40-82之间，涉及TGFβ1与其细胞受体的结合(Quian SW等(1992)国家科学院科学学报89：6290-6294；Burmester JK等(1993)国家科学院科学学报90：8628-8632)。
TGFβ1和其它结合蛋白质的受体
已经鉴定了五种TGFβ1的特异性受体(Cheifetz S等(1988)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：17225-17228；Lopez Casillas F.等(1991)细胞(Cell)67：785-795)。这些受体对不同型TGFβ1具有不同的亲合性。I、II和III型受体目前了解最为清楚(Attisano L等的综述(1994)生物化学和生物物理学报1222：71-80；Derynck R.(1994)生物化学趋势(Trends Biochem.Sci.)19：548-553；Yingling等(1995)生物化学和生物物理学报1242：115-136)。IV型受体(MacKay K.和Danielpour D.(1991)生物化学杂志266：9907-9911)和V型受体(Ichiii H.等(1991)生物化学杂志266：22459-22464)也已有描述。还曾报道endoglin的跨膜区和胞质区(Cheifetz S等(1993)生物化学杂志267：19027-19030；Bellon T.等(1993)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)223：2340-2345；Yamashita等(1995)免疫学杂志(J.Immunol.)156：564-573)与人和大鼠的III型受体具有约70％的相似性。
RIII可能是一种具有下述功能的受体，其结合TGFβ1并将它呈递给RII(其可能又与RI形成复合物)(Yamashita等(1994)生物化学杂志269：20172-20178)或者复合物(其中各种RI分子与RII结合)(Weiss G.和Massague J.(1996)EMBO J 15：276-289)。RII-RI的相互作用将促进RI的磷酸化，随后激活其丝氨酸/苏氨酸激酶的活性，该激酶将使类似MADR2蛋白的第二信使磷酸化(Macias-Silva M等(1996)细胞87：1215-1224)。
(1)
TGFβ1在肝分化和再生中的作用
根据发育时段和细胞类型产生的作用是不同的。
·增大胞外基质，作用于肝星状细胞(Ito细胞)——基质蛋白质的基本来源(Mustoe TA等(1987)科学237：1333-1336)。
·使上皮细胞和肝细胞分化(Florini JR等(1986)生物化学杂志261：16509-16513)。
·在肝再生过程中抑制细胞生长。该作用对于维持细胞体外休眠十分重要(Kato Y等(1988)国家科学院科学学报85：9552-9556)。
·抑制上皮生长因子(EGF)受体的胞吞作用，如在胎鼠肝细胞培养中观察到的那样(Noda M.和Rodan GA(1987)细胞生理学杂志(J.Cell Physiol.)133：426-437)。
TGFβ1在肝纤维化中的作用
发现TGFβ1与肝纤维化进程有关(Czaia MJ等(1989)细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)108：2477-2482；Annoni G.等(1992)J.Hepatol.14：259-264)，其导致通过肝星状细胞(肝细胞或Ito细胞)上它们的受体使胞外基质蛋白质的产生增加，并抑制使基质降解的蛋白水解酶的合成(Ignotz RA和Massague J.(1986)生物化学杂志261：4337-4345)。在肝脏中，TGFβ1诱导肝脏星状细胞中胶原蛋白和粘连蛋白的合成(Weiner FR(1990)肝脏学(Hepatology)11：111-117)。还通过诱导其mRNA，增加其自身合成，实现自动调节。
还发现TGFβ1涉及由肝细胞和激活的肝星状细胞合成的α2-巨球蛋白的合成增加。据称α2-巨球蛋白通过与TGFβ1结合并使其灭活(BachemMG(1994)Ann NY Acad.Sci.737：421-424)，从胞外空间消除TGFβ1。
对慢性肝病患者的研究表明，在TGFβ1表达与I型原胶原蛋白的mRNA表达和原胶原蛋白III型肽的血清水平之间存在相关性(Castilla A.等(1991)N.Engl.J.Med.324：933-940)。
肝硬化患者由于疾病过程产生的并发症，例如门静脉高压或肝功衰竭，使他们的存活期比正常生命期限短。
TGFβ1对胞外基质的影响
TGFβ1与细胞受体的相互作用导致：
·激活原胶原蛋白、粘连蛋白(Ignotz RA等(1987)生物化学杂志262：6443-6446)和相关蛋白质，包括能够与胞外基质成分相互作用的膜蛋白(Carter WG(1982)生物化学杂志257：13805-13815)的合成。
·抑制能够降解基质的蛋白水解酶的合成(Fukamizu H.和GrinellF.(1990)实验细胞研究(Exp.Cell Res.)190：276-282)。
·刺激蛋白水解酶抑制剂的合成(Fukamizu H.和Grinell F.(1990)实验细胞研究190：276-282)。
这些作用导致细胞与胞外基质相互作用的增强，其与基质的组成蛋白质的较高识别结合，导致胞外基质总量增加(Roberts CJ等(1988)生物化学杂志263：4586-4592)。这些结果证实TGFβ1参与愈合过程(Fukamizu H.和Grinnell F.(1990)实验细胞研究190：276-282；Bamard JA等(1990)生物化学和生物物理学报1032：79-87)。
肽作为配体-受体相互作用的抑制剂
存在这样的可能性，即用小分子、合成肽作为体内存在分子的类似物，用于模拟体内分子的功能。LeSateur等进行的研究证实了应用神经生长因子(NGF)的环状类似物模拟β回文区，使其结合受体的可能性(LeSateur L.等(1996)天然生物技术(Nature Biotechnology)14：1120-1122)。还可能应用肽作为这些分子的拮抗剂，通过该肽介导的封闭作用阻止天然因子与其受体的相互作用(Lasarte JJ等(1994)获得性免疫缺陷综合症杂志(J.Acquired Immune Deficiency Syndromes)7：129-134；LeSateur等(1995)生物化学杂志270：6564-6569)。早期研究证明了合成肽作为配体-受体相互作用的抑制剂的有用性，甚至当识别表位不连续时同样如此(Daniels AJ等(1995)分子药理学(Mol.Pharmacol.)48：425-432)。其它有关TGFβ1的II型受体和胎球蛋白，一种II型受体家族中的糖蛋白的研究，证明了应用环状肽作为TGFβ1与RII相互作用抑制剂的可能性(Demetriou M.等(1996)生物化学杂志271：12755-12761)。通过这种环化，即可能获得具有类似于体内可能获得肽结构的肽。
发明详述
由于前面陈述的原因，我们认为来源于TGFβ1和其受体，或者来源于能够结合TGFβ1的蛋白质的肽，能够作为TGFβ1活性的抑制剂。因此我们决定开发该可能性。
待合成肽的选择
根据肽来源于TGFβ1还是来源于其受体，按照不同方式选择用于合成的肽。
对于TGFβ1序列的情况，从包括TGFβ1全序列的15个氨基酸合成肽。每个肽具有与它的两个直接邻居相同的10个氨基酸。
对于TGFβ1受体序列的情况，基于我们实验室设计的软件选择肽。用一种计算机程序比较两个氨基酸序列，旨在于预测部分互补区。也应用了其它程序，它们能够基于构成这些序列的氨基酸的疏水性和亲水性，预测暴露最多的蛋白质区域。
肽的合成
通过固相法(Merrifield(1963)美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)85：2149-54)，应用芴基甲氧羰基(Fmoc)作为alpha-氨基的临时保护基(Atherton等(1989)Journal of Chemical Society Perkins Transaction1：538-546)合成肽。对于多种肽的少量合成，应用多重合成仪，其允许96个肽的同步合成(Borras-Cuesta等(1991)生物学(Biologicals)19：187-190)。将肽在-80℃以固体状态储藏，直到使用。
通过HPLC纯化肽
通过高效液相色谱(HPLC)，应用Waters 600E-900系统(MilliporeCorp.，Bedford，USA)分析和纯化合成的肽。
应用Waters Radial-PakTM C18 30015μm，8×100mm柱(MilliporeCorp.，Bedford，USA)通过分析型HPLC分析肽。将肽溶解于0.1％TFA的蒸馏水溶液，至最大浓度为1mg/ml。将肽溶液(100μl)注射到柱中，在水/乙腈梯度中洗脱(图15)(Romid Ltd.，Cambridge，USA)，均用0.1％TFA，流速为1ml/min。通过220nm和280nm处的肽吸收度检测含肽的组分(光敏二极管阵列检测仪，Waters 991，Millipore Corp.，Bedford，USA)。
应用Waters Delta-PakTM C18 30015μm，25×100mm柱(MilliporeCorp.，Bedford，USA)进行肽的纯化。溶解肽，并在与前面程序同样的条件下注射(2ml)，应用同样的梯度，流速为5ml/min。将含纯化肽的组分收集到一个烧瓶中。
肽活性的体外实验研究
细胞系
使用来自貂肺上皮细胞的细胞系MV-1-Lu(CCL-64，美国典型细胞培养中心(American Type Cell Culture)，Virginia，USA)。细胞在162cm2的培养瓶(Coster Corporation，Cambridge，USA)中，在37℃和5％CO2的培养箱中生长，直到获得亚汇合。使用完全培养基：添加5％胎牛血清(FCS，Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，Israel)、10mM HEPES(1M HEPES缓冲液，Bio-Whittaker，Verviers，Belgium)和抗生素(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的含L-谷氨酰胺(GibcoBRL，LifeTechnologies Ltd.，Paisley，Scotland)的RPMI 1640。
MV-1-Lu细胞系的生长抑制实验
用5ml胰蛋白酶-EDTA(Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，Israel)从培养瓶的底部除下如上述生长的MV-1-Lu细胞，重悬浮于完全培养基，以1500rev/min离心8分钟。离心后，将细胞以50000个细胞/ml的浓度重悬浮于完全培养基。进行实验时，取10ml细胞悬浮液分散于96孔、平底培养板(Costar Corporation，Cambridge，USA)，每孔加100μl，在37℃和5％CO2下培养过夜，使细胞附着到孔的底面。在培养结束时，在存在RPMI(R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon，UK)中浓度为200pg/ml TGFβ1的情况下，将待实验的肽加入RPMI至终浓度为200μg/ml。每孔中FCS的终浓度为2.5％。培养24小时后，向每孔加入1μCi的氚代胸苷(25Ci/mmol[甲基-3H]-胸苷，Amersham Life Science，Buckinghamshire，UK)再次培养12小时(Grubeck-Loebenstein B.等(1989)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)83：764-770；Brennan FM等(1990)临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)81：278-285)。
在培养结束时，用胰蛋白酶-EDTA从孔底除下细胞，通过人工收获仪(Titertek细胞收获仪，Skatron Instruments Inc.，Sterling，USA)收集细胞，并破碎细胞，在硝酸纤维素滤纸(Filter MAT 11731，Skatron InstrumentsInc.，Sterling，USA)上收集固定于其上的DNA。将滤纸分别置于5ml聚丙烯试管，象其中加入4ml发光液体(Biogreen-11，Reactivos Scharlau S.A.，Barcelona，Spain)。在βLKB发光记录仪上90秒定量检测各管的活性(Betaplate system，LKB，Uppsala，Sweden)。
TGFβ1与细胞受体结合的抑制研究
细胞受体的选择性标记(亲合性标记)
从培养瓶取出MV-1-Lu细胞，将它们与10ml溶液1(128mM NaCl、25mM 4-(2-羟基)-1-哌嗪乙基磺酸盐pH7.5、5mM葡萄糖和1mMEDTA)在37℃培养10分钟。然后将取出的细胞重悬浮于溶液2(128mMNaCl、5mM KCl、50mM 4-(2-羟基)-1-哌嗪乙基磺酸盐pH7.5、1.2mMMgSO4和5mg/ml BSA)，通过1000xg离心5分钟收集细胞。细胞离心后，以106个细胞/ml的浓度重悬浮于溶液2。
从该细胞悬浮液，取0.5mL置于24-孔平板(Greiner GmbH、Frickenhausen，Germany)，加入50μl 0.8mg/ml的肽溶液，然后在4℃保温2小时同时搅拌。接下来，加入终浓度为277.2pM的125I-TGFβ1(2μCi)(125I-TGFβ1人重组800-2200Ci/mmol，Amersham Lift Science，Buckinghamshire，UK)，再次在4℃搅拌下保温2小时。
保温后，将细胞转移到一个离心管中，然后在12000xg下冷却离心1分钟。然后在0.5ml冷溶液2、5μl二甲亚砜(DMSO 99.5％，SigmaChemical Co.，St.Louis，USA)和DSS终浓度为0.25mM的二琥珀酰辛二酸酯(DSS，Pierce Chemical Co.，Rockford，USA)中重悬浮。通过稀释、离心和用含0.25M蔗糖、10mM Tris和1mM EDTA的溶液(pH7.4)冲洗中止反应。细胞沉淀重悬浮于0.5ml Triton X-100(Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)1％v/v、10mM Tris(pH7.0)、1mM EDTA、0.1mM氟化苯甲基磺酸盐、1μg/ml抑肽素和1μg/ml亮肽素(Sigma Chemical Co.，St.Louis，USA)，并在4℃保温40分钟。在去污剂中不溶的部分通过在12000xg离心15分钟分离出去。在去污剂中溶解的部分(上清液)和不溶部分(沉淀)在-20℃冷冻(Massague J.和Like B.(1985)生物化学杂志260：2636-2645)。
在聚丙烯酰胺十二烷基磺酸钠凝胶中电泳蛋白质
通过在7.5％丙烯酰胺/二丙烯酰胺凝胶中，220伏电压下电泳5-6小时，分析在去污剂中的可溶组分和不溶组分。
用考马斯亮蓝R250(Serva Feinbiochemica GmbH，Heidelberg，Germany)的甲醇(50％)、乙酸(10％)和蒸馏水溶液染色蛋白质30分钟。然后第一次漂洗用甲醇(50％)、乙酸(10％)和蒸馏水溶液冲洗15分钟，随后用甲醇(2.5％)、乙酸(0.5％)和蒸馏水进行随后的漂洗，直到背景颜色除去。
流动细胞记数
通过直接免疫荧光法测定由肽介导的TGFβ1与细胞受体结合的抑制作用。其中应用了一种免疫荧光试剂盒(Fluorokine rh TGFβ-生物素，R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon，UK)。具体地说，该实验基于生物素酰化TGFβ1结合细胞受体的能力，以及随后生物素与荧光标记抗生物素蛋白的相互作用，因此信号强度将依赖于与细胞受体结合的TGFβ1的量。
用溶液1(前面描述的)除下在162cm2培养瓶中生长的MV-1-Lu细胞，重悬浮于生理盐水，在500xg离心5分钟。离心后，细胞再次以4×106个细胞/ml的浓度悬浮于生理盐水。将25μl细胞悬浮液加入12×75mm硼硅酸盐试管，向其中加入在40μl RPMI 1640培养基中的待实验肽，使其终浓度为0.42μg/ml，和10μl生物素酰化的TGFβ1。作为特异性对照，加入10μl试剂盒中提供的生物素酰化试剂，加入10μl生物素酰化的TGFβ1作为阳性对照，加入20μl抗-TGFβ1的阻断抗体作为阴性对照。向所有对照中加入生理盐水，至总体积为75μl。所有试管在4℃黑暗条件下保温1小时。
在保温结束时，加入10μl荧光素标记的抗生物素蛋白，在4℃黑暗条件下保温30分钟，之后加入2ml清洗液(RDF1)，然后在500xg下离心6分钟。细胞沉淀重悬浮于0.2ml冷PBS，用于细胞记数(FACScan，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，California，USA)。当一束激光偶尔照射到孔上时，该方法能够应用一种计算机程序(LisysTM II，BectonDickinson Immunocytometry Systems，California，USA)测定各细胞发射的荧光。图16显示了一副通过流动细胞记数分析得到的典型图像。
为了得到TGFβ1与其受体结合抑制的数据，应用实验的阳性对照，以划出相当于结合TGFβ1-生物素(M2)和结合未标记细胞(M1)的标记细胞的范围。一旦划出该范围，则可计算定位在它们之中每一个上的细胞百分数。对于当肽与TGFβ1-生物素或与细胞(根据肽是否分别来源于受体还是TGFβ1)共同保温时得到的数据，进行同样的操作。利用这些数据，同时应用下列算式计算各肽的抑制百分率：100-((M2肽-M2阴性)×100/(M2阳性-M2阴性))。
在纤维症模型中的体内实验
使用来自同一窝(5周±1.5周)的白色雄性大鼠(albino Wistar品系)，为了得到年龄和初始重量均一的一组动物。整个实验过程中，动物保持在恒温(22℃)和12小时光照和黑暗循环条件下。它们可以随意取水和食物。
通过吸入四氯化碳共11周，每周两次，诱导肝硬化(HC)(Lopez NovoaJM等(1976)Patologia IX：223-240；Camps J.等(1987)胃肠病学(Gastroenterology)93：498-505)。通过经一个气体洗瓶，以3升/分钟的流速吹进压缩空气，实现接触CCl4。最初接触1分钟，之后每周增加1分钟，直到第四周达到4分钟。在第五周不给CCl4，第六周重新开始，接触5分钟。5分钟的接触时间维持到11周。从开始接触CCl4前1周到实验结束时，在引用水中加入400mg/l苯巴比妥(Luminal，Bayer，Leverkusen，Germany)。在开始处理之前，留出一周不施用CCl4。在处理过程中，按照记录(图2)给动物施用一周剂量的CCl4。
动物的分布
在开始诱导肝硬化之前，将动物分成4组。
健康对照(Co)：没有接受纤维化处理的动物。
处理的健康对照(Co+P144)：没有接受纤维化处理，但在最后3周施用肽P144的动物(与大鼠Tto2组的处理时间一致)。
硬化对照1(Ci1)：每周吸入CCl4两次，接受硬化诱导处理的动物。到第五周时将这些动物分成2组：
硬化对照1(Ci1)：11周以后，继续接受纤维化诱导处理，而没有接受肽P144的动物。在整个诱导过程中，在不施用CCl4的其它天给它们施用盐水血清(第5到11周)。
处理的硬化1(Tto1)：在诱导纤维化过程的第5到11周中，在不施用CCl4的其它天，施用来自III型受体序列的肽P144的动物。
硬化对照2(Ci2)：连续接受纤维化诱导处理而不接受肽P144或盐水血清的动物。到第11周将这组动物分成另两组。
硬化对照2(Ci2)：不接受任何类型处理的硬化动物，作为对照。这些动物接受3周盐水血清的注射(第13到15周)。
处理的硬化2(Tto2)：用来自III型受体(P144)序列的肽处理3周(第13至15周)的硬化动物。
动物的处理
·Tto1组：这些动物在纤维化过程中接受处理。在第5周开始用肽的处理(在接触CCl4之前的5分钟)，持续到硬化诱导过程的第11周末。
·Tto2组：这些动物在纤维化诱导过程(11周)完成后接受处理。在最后一次吸入后的一周开始处理，持续21天。
在开始处理之前和处理之后，从所有接受肽处理的动物体内取血。在腹部以500μl生理盐水中70μg/只动物的剂量皮下注射施用肽。
处死动物并解剖出肝脏
当完成用肽处理动物后，对于大鼠模型和小鼠模型，用毛细管从动物的后-眶血管丛取血后，断头处死动物。
然后立即解剖肝脏并收集样品。切碎样品并置于甲醛中作为固定液，用于以后的组织学检查。其它碎片置于浸在液氮中的冷冻管中，然后-80℃储藏。
肝脏的病理解剖学评价
将之前固定在甲醛中至少24小时的肝脏碎片进行组织学检查，之后将它们置于乙醇中(70％)。
脱水后，将它们嵌入石蜡块。用Leitz旋转式显微镜用薄片切片机和钢刀从得到的石蜡块连续制备3μm厚的切片。染色之前将切片置于二甲苯(AnalaR、BDH、Poole，UK)中15分钟脱石蜡，将它们在60℃的烘箱中加热15分钟后，使它们连续通过浓度降低的乙醇100％、96％、80％和70％最后是水，使它们脱水。使用下列染料：苏木素-曙红Masson’s三色(trichromic)(Locquin M.和Langeron，(1985)in Manual deMicroscopia Ed.Labor S.A.Barcelona)：对于胶原蛋白应用一种特定染料(绿光)。
天狼红：胶原蛋白的特异性染料。
肝纤维化的确定：图像分析
对于得到样品的图像分析，应用一种连接有摄象机(Sony DXP-950P，Sony Co.，Tokyo，Japan)的光学显微镜(Olympus BH-2，Tokyo，Japan)，利用该装置各切片的每个视野均被拍摄下来。对于每个切片随机拍摄六个视野。利用计算机程序(Visilog 4.1.5，Noesis，Orsay，France)分析拍摄的各种图像，该程序能够计算纤维化面积和切片的总面积。从这些数据计算各视野的纤维化指数(纤维化面积/总面积)。为了能够应用该程序，有必要应用偏振光滤光片(Olympus U-POT，Tokyo，Japan)和绿光滤光片(Olympus IF550，Tokyo，Japan)改变图像的物象，其使样品分析过程的自动化成为可能。
石蜡-处理组织的14μm切片中的胶原检测
按照前面描述的3μm切片的同样方式制备用于该方法的14μm切片。将这些切片置于二甲苯12小时，使它们脱石蜡。去除石蜡后，将它们通过不同浓度的乙醇96％、80％、50％，使样品脱水，最后在蒸馏水中完成该过程。
脱水后，使它们在160mg Fast Green FCF(Fluka Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)的160ml饱和苦味酸(Merck，Darmstadt，Germany)溶液中黑暗下保持15分钟进行预染色处理。将样品浸入水中漂洗，直到它们不再使漂洗水显色。去除紫色染料后，使样品在160mg Direct Red 80(Fluka Chemika-Biochemika，Buchs，Switzerland)和64mg Fast Green的160ml饱和苦味酸溶液中黑暗下保持30分钟染色样品。再次漂洗它们，直到去除紫色染料，然后用小抹刀刮样品，以从薄片上分离样品。以这种方式分离下来的切片分别置于含3ml NaOH 0.1N(Quimon，Montplet&Esteban S.A.，Barcelona，Spain)和甲醇(1∶1)的试管中。从各试管取等量液体，在分光光度计(Lambda 2 UV/VIS spectrophotometer，Perkin-Elmer，Norwalk USA)上，在波长540nm和630nm处读数，以NaOH0.1N和甲醇液的等量液作为空白(Lopez de Leon A.和Rojkind(1985)Histochem，Cytochem.33：737-743；Gaudio E.等(1993)国际实验病理学杂志(Int.J.Exp.Path.)74：463-469)。
按照Gaudio E.等((1993)国际实验病理学杂志74：463-469)的工作，施用下列公式计算胶原蛋白和总蛋白的量：
结果的统计学分析
对体内实验得到的数据进行统计学分析。通过Shapiro-Wilks实验验证量变的常态。
由于没有将数据调整到正常分布，进行了非-参数统计分析。利用Kruskal-Wallis H方法，然后通过Mann-Whitney U.比较，实现组间比较。数据用直方图表示，并表示了数据的中值(每个框内的粗线)，以及四分位内数的间距(框的高度)，而各框的“胡须”表示一个给定四分位数的间距的最高和最低观察值。
用Fisher’s精确度检验研究变量之间的相关性。应用逻辑回归研究这些变量相关性的独立性。
P值等于或低于0.05被认为具有显著性。
用Windows V 6.1.3.的程序SPSS完成所有统计分析。
TGFβ1的体外抑制活性
抑制MV-1-Lu细胞系细胞生长的实验
TGFβ1是一种能够抑制MV-1-Lu细胞系体外生长的细胞因子(Grubeck-Loebenstein B.等(1989)临床研究杂志(J.Clin.Invest.)83：764-770；Brennan FM等(1990)临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)81：278-285)，因此用该细胞系实验肽对TGFβ1的阻断作用。我们应用培养基、细胞和腺苷的不同组合，研究不同浓度的TGFβ1对培养中的MV-1-Lu细胞整合[甲基-3H]胸苷的影响，用于确定实验的最合适条件。这些条件在图3中显示。
确定MV-1-Lu细胞的最佳浓度(5000细胞/孔)和能够产生约90％细胞抑制的最低TGFβ1浓度(200pg/ml，图18)之后，对浓度为200μg/ml的合成肽的抑制作用进行实验。
合成肽对TGFβ1活性的体外抑制
用MV-1-Lu细胞系实验作为TGFβ1活性的潜在抑制剂的合成肽，该合成肽是按照“待合成肽的选择(来源于结合TGFβ1的蛋白质和TGFβ1本身的肽)”部分描述的方法选择出来的。将肽溶解于缓冲的RPMI培养基，无胎牛血清，应用下列程序：
将属于受体序列的肽，或互补于TGFβ1亲水性峰的肽，在存在该细胞因子的情况下，保温30分钟，然后与细胞培养物混合。将来源于TGFβ1序列的肽在加入TGFβ1之前加到细胞培养物中，因为它们与细胞表面受体相互作用。在100μl用于加入细胞的同样培养基中进行上述保温。根据活性肽抑制TGFβ1的能力不同，使细胞生长程度较大或较小。利用来源于TGFβ1的肽抑制TGFβ1
首先，合成来源于TGFβ1的重叠肽。合成这些肽(表2)，期望它们中的某些能够结合细胞受体，因此防止天然TGFβ1与这些受体的结合。
表2.来源于TGFβ1的肽。显示了肽的数目，在完全序列中的位置，以及其氨基酸序列。为了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加了一个丙氨酸，其未在表中显示。
肽 序列
P1(280-293) AlaLeuAspThrAsnTyrCysPheSerSerThrGluLysAsn
P2(284-297) AsnTyrCysSerSerThrGluLysAsnCysCysValArg
P3(288-301) SerSerThrGluLysAsnCysCysValArgGlnLeuTyrIle
P4(294-307) CysCysValArgGlnLeuTyrIleAspPheArgLysAspLeu
P5(296-311) GlnLeuTyrIleAspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrp
P6(302-315) AspPheArgLysAspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluPro
P7(306-319) AspLeuGlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHis
P8(308-321) GlyTrpLysTrpIleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsn
P9(312-325) IleHisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGly
P10(316-329) LysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyr
Pll(319-333) HisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeu
P12(322-335) PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThr
P13(326-339) ProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLys
P14(330-343) IleTrpSerLeuAspThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeu
P15(335-349) ThrGlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnPro
P16(336-349) GlnTyrSerLysValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnPro
P17(340-353) ValLeuAlaLeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAla
P18(343-358) LeuTyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCys
P19(344-358) TyrAsnGlnHisAsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCys
P20(348-360) AsnProGlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGln
P21(350-363) GlyAlaSerAlaAlaProCysCysValProGlnAlaLeuGlu
P22(354-367) AlaProCysCysValProGlnAlaLeuGluProLeuProIle
P23(358-371) ValProGlnAlaLeuGluProLeuProIleValTyrTyrVal
P24(364-377) ProLeuProIleValTyrTyrValGlyArgLysProLysVal
P25(368-381) ValTyrTyrValGlyArgLysProLysValGluGlnLeuSer
P26(372-385) GlyArgLysProLysValGluGlnLeuSerAsnMetIleVal
P27(378-391) GluGlnLeuSerAsnMetIleValArgSerCysLysCysSer
图4显示了表6中的肽对TGFβ1活性的抑制作用。因为TGFβ1抑制MV-1-Lu细胞的生长，肽对这些细胞因子的抑制作用导致重新实现MV-1-Lu细胞的生长。
从图4中可以看到，来源于TGFβ1序列的肽P12是一种对TGFβ1活性表现较高抑制作用。为了更详细研究肽P12的抑制作用，进行下列关于肽浓度对细胞因子抑制作用影响的研究，其在下面描述。
肽P12对TGFβ1的抑制作用的剂量-反应实验
研究了肽P12的浓度对TGFβ1活性的抑制作用的影响。由于该肽不容易溶解于实验培养基，用肽的名义浓度(那将是如果肽完全溶解得到的浓度)制备储备液或悬浮液，然后从中取等分液，过滤，或甚至直接用于抑制实验。
图5考察了过滤前和过滤后，名义浓度的肽的抑制作用。可以看到，过滤或不过滤，肽P12实际上具有相同的活性。
得到肽P12的结果后，决定在N-末端和C-末端双向延长肽，研究对其活性的影响。另外，对其序列进行改变，以改善其溶解性，并研究其序列中两个半胱氨酸对TGFβ1抑制活性的重要性。表3中描述了合成的肽。
表3.来源于对肽P12进行修饰的肽
肽 序列
P12(322-335) PneCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThr
P28(322-344) PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThrGlnLysVal
LeuAlaLeuTyr
P29(313-335) HisGluProLysGlyTyrHisAlaAsnPheCysLeuGlyProCysProTyr
IleTrpSerLeuAspThr
P30 PheSerLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThr
P31 pheCysLeuGlyProSerProTyrIleTrpSerLeuAspThr
P32 PheSerLeuGlyProSerProTyrIleTrpSerLeuAspThr
P33 PheCysLeuGlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAsp
P34 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerLeuAspThr
P35 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAsp
P36 GlyProCysProTyrIleTrpSerAspAspAsp
P37 AspAspAspGlyProCysProTyrIleTrpSer
P38 AspGlyProCysProTyrIleTrpSerAsp
图6显示了表3中的肽对TGFβ1的抑制作用的结果。
从图6中可以看到，肽P29是有活性的。该肽包括以前实验的肽P12，并在N-末端方向具有9个额外氨基酸(图4)。按照Quian SW等((1992)国家科学院科学进展89：6290-6294)和Brmester JK等((1993)国家科学院科学进展90：8628-8632)的方法，应用鉴定有上述细胞因子活性必须的TGFβ1区(成熟TGFβ1序列中的氨基酸40到82)的嵌合重组蛋白质进行研究。推测肽P29(成熟TGFβ1序列中的氨基酸34到56)，其比肽P12(氨基酸43到56)延长了一个较长的区域，可能需要一种更类似环状TGFβ1结构的三维结构。由于这个原因，用肽P29基于亲合性标记实验结合细胞受体。
肽P29对TGFβ1与其受体结合的抑制实验(亲合性标记)
将来源于TGFβ1序列的肽P29用于亲合性标记实验，用于验证其抑制TGFβ1与其细胞受体结合的能力(材料和方法)。
由于应用的125I-TGFβ1的不同批次的活性不同，该实验中应用的肽的浓度按照各情况下使用的125I-TGFβ1批次的浓度调整。这些实验的结果在图8中显示。
进行进一步的实验，以寻找阻断125I-TGFβ1与细胞受体结合所需的最小浓度。
来源于大鼠III型受体序列的肽对TGFβ1的抑制
为了寻找抑制TGFβ1活性的新肽，合成了来源于大鼠III型受体的肽。在预测与TGFβ1序列的氨基酸序列模块互补的序列区域基础上选择一些肽。期望这些肽将能够结合游离TGFβ1，遮蔽它并防止它与细胞受体结合。
通过重叠10个氨基酸并覆盖部分III型受体的胞外区(氨基酸45到410)合成另外一些肽。曾报道可溶性III型受体存在对应的受体胞外区，将该区从膜上切下来，作为循环系统中TGFβ1的遮蔽剂(Lopez CasillasF.等(1991)细胞67：785-795)。后来的研究描述了两种结合TGFβ1的可能区域，一种定位在受体的N-末端(Lopez-Casillas等(1994)细胞生物学杂志124：557-568)，另一种定位在C-末端侧最靠近膜的区域(Fukushima D.等(1993)生物化学杂志268：22710-22715；Pepin MC等(1995)FEBS Lett.377：368-372)。由于上述原因，合成了这些受体的胞外区，猜测这些肽可能能够遮蔽循环中的TGFβ1。
表4显示了合成的肽。
表4.来源于大鼠III型受体的肽。P39到P65是预测互补于TGFβ1的肽，P66到P138是覆盖受体胞外区的重叠肽。为了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加一个丙氨酸，其在表中没有显示。
肽 序列
P39(91-102) AsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysPro
P40(104-115) ValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrp
P41(109-120) SerProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGlu
P42(110-121) ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArg
P43(333-344) TrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSer
P44(428-439) ProIleValProSerValGlnLeuLeuProAspHis
P45(555-566) GlyAspGluGlyGluThrAlaProLeuSerArgAla
P46(563-574) LeuSerArgAlaGlyValValValPheAsnCysSer
P47(603-614) LeuPheLeuValProSerProGlyValPheSerVal
P48(605-616) LeuValProSerProGlyValPheSerValAlaGlu
P49(707-718) GluLeuThrLeuCysSerArgLysLysGlySerLeu
P50(712-723) SerArgLysLysGlySerLeuLysLeuProArgCys
P51(717-728) SerLeuLysLeuProArgCysValThrProAspAsp
P52(722-733) ArgCysValThrProAspAspAlaCysThrSerLeu
P53(727-738) AspAspAlaCysThrSerLeuAspAlaThrMetIle
P54(731-742) ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMet
P55(732-743) SerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetGln
P56(737-748) MetIleTrpThrMetMetGlnAsnLysLysThrPhe
P57(742-752) MetGlnAsnLysLysThrPheThrLysProLeuAla
P58(747-758) ThrPheThrLysProLeuAlaValValLeuGlnVal
P59(761-775) LysGluAsnValProSerThrLysAspSerSerProIleProPro
P60(766-780) SerThrLysAspSerSerProIleProProProProProGlnIle
P61(771-785) SerProIleProProProProProGlnIlePheHisGlyLeuAsp
P62(776-790) ProProProGlnIlePheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMet
P63(781-795) PheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMetGlyIleAlaPheAla
P64(786-800) ThrLeuThrValMetGlyIleAlaPheAlaAlaPheValIleGly
P65(797-809) LeuLeuThrGlyAlaLeuTrpTyrIleTyrSerHis
P66(45-59) LeuMetGluSerPheThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGly
P67(50-64) ThrValLeuSerGlyCysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuPro
P68(55-69) CysAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuProArgGluValHisVal
P69(60-74) ThrThrGlyLeuProArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSer
P70(65-79) ArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyPro
P71(70-84) LeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArg
P72(75-89) ThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHis
P73(80-94) GlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHisLeuAsnProIleAla
P74(85-99) GluValThrLeuHisLeuAsnProIleAlaSerValHisThrHis
P75(90-104) LeuAsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysProIleVal
P76(95-109) SerValHisThrHisHisLysProIleValPheLeuLeuAsnSer
P77(100-114) HisLysProIleValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuVal
P78(105-119) PheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThr
P79(110-124) ProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAla
P80(115-129) TrpHisLeuLysThrGluArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeu
P81(120-134) ArgLeuAlaAlaGlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGly
P82(125-139) GlyValProArgLeuPheLeuValSerGluGlySerValValGln
P83(130-144) PheLeuValSerGluGlySerValValGlnPheProSerGlyAsn
P84(135-149) GlySerValValGlnPheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAla
P85(140-154) PheProSerGlyAsnPheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArg
P86(145-159) PheSerLeuThrAlaGluThrGluGluArgAsnPheProGlnGlu
P87(150-164) GluThrGluGluArgAsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuVal
P88(155-169) AsnPheProGlnGluAsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLys
P89(160-174) AsnGluHisLeuValArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaVal
P90(165-179) ArgTrpAlaGlnLysGluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGlu
P91(170-184) GluTyrGlyAlaValThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArg
P92(175-189) ThrSerPheThrGluLeuLysIleAlaArgAsnIleTyrIleLys
P93(180-194) LeuLysIleAlaArgAsnIleTyrIleLysValGlyGluAspGln
P94(185-199) AsnIleTyrIleLysValGlyGluAspGlnValPheProProThr
P95(190-201) ValGlyGluAspGlnValPheProProThrCysAsnIleGlyLys
P96(195-209) ValPheProProThrCysAsnIleGlyLysAsnPheLeuSerLeu
P97(200-214) CysAsnIleGlyLysAsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGlu
P98(205-219) AsnPheLeuSerLeuAsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLys
P99(210-224) AsnTyrLeuAlaGluTyrLeuGlnProLysAlaAlaGluGlyCys
P100(215-229) TyrLeuGlnProLysAlaAlaGluGlyCysValLeuProSerGln
P101(220-234) AlaAlaGluGlyCysValLeuProSerGlnProHisGluLysGlu
P102(225-239) ValLeuProSerGlnProHisGluLysGluValHisIleIleGlu
P103(230-244) ProHisGluLysGluValHisIleIleGluLeuIleThrProSer
P104(235-249) ValHisIleIleGluLeuIleThrProSerSerAsnProTyrSer
P105(240-254) LeuIleThrProSerSerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAsp
P110(265-279) AspProGluValValLysAsnLeuValLeuIleLeuLysCysLys
P111(270-284) LysAsnLeuValLeuIleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrp
P112(275-289) IleLeuLysCysLysLysSerValAsnTrpValIleLysSerPhe
P113(280-294) LysSerValAsnTrpValIleLysSerPheAspValLysGlyAsn
P114(285-299) ValIleLysSerPheAspValLysGlyAsnLeuLysValIleAla
P115(290-304) AspValLysGlyAsnLeuLysValIleAlaProAsnSerIleGly
P106(245-259) SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleIleValAspIle
P107(250-264) AlaPheGlnValAspIleIleValAspIleArgProAlaGlnGlu
P108(255-269) IleIleValAspIleArgProAlaGlnGluAspProGluValVal
P109(260-274) ArgProAlaGlnGluAspProGluValValLysAsnLeuValLeu
P116(295-309) LeuLysValIleAlaProAsnSerIleGlyPheGlyLysGluSer
P117(300-314) ProAsnSerIleGlyPheGlyLysGluSerGluArgSerMetThr
P118(305-319) PheGlyLysGluSerGluArgSerMetThrMetThrLysLeuVal
P119(310-324) GluArgSerMetThrMetThrLysLeuValArgAspAspIlePro
P120(315-329) MetThrLysLeuValArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsn
Pl21(320-334) ArgAspAspIleProSerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrPAla
P122(325-339) SerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyr
P123(330-344) LeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSer
P124(335-349) LeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerTyrThrMetAlaPro
P125(340-354) ArgProValThrSerTyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPhe
P126(345-359) TyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPheHisLeuArgLeuGlu
P127(350-364) ValAlaAsnArgPheHisLeuArgLeuGluAsnAsnGluGluMet
P128(355-369) HisLeuArgLeuGluAsnAsnGluGluMetArgAspGluGluVal
P129(360-374) AsnAsnGluGluMetArgAspGluGluValHisThrIleProPro
P130(365-379) ArgAspGluGluValHisThrIleProProGluLeuArgIleLeu
P131(370-384) HisThrIleProProGluLeuArgIleLeuLeuAspProAspHis
P132(375-389) GluLeuArgIleLeuLeuAspProAspHisProProAlaLeuAsp
P133(380-394) LeuAspProAspHisProProAlaLeuAspAsnProLeuPhePro
P134(385-399) ProProAlaLeuAspAsnProLeuPheProGlyGluGlySerPro
P135(390-404) AsnProLeuPheProGlyGluGlySerProAsnGlyGlyLeuPro
P136(395-409) GlyGluGlySerProAsnGlyGlyLeuProPheProPheProAsp
P137(400-414) AsnGlyGlyLeuProPheProPheProAspIleProArgArgGly
P138(405-419) PheProPheProAspIleProArgArgGlyTrpLysGluGlyGlu
实验了表4中的肽在MV-1-Lu细胞系抑制模型中阻断TGFβ1的能力。因为TGFβ1能够抑制该细胞系的生长，肽对TGFβ1的抑制能够使细胞重新开始生长。这些实验在图9到12中显示。
如图9到12所示，存在多种能够较高或较低程度地抑制Mv-1-1U细胞系生长的肽，但仅肽P54能够几乎完全地抑制TGFβ1的活性。为了对该肽进行更完全的研究，对不同浓度的肽抗固定浓度为200pg/ml的TGFβ1，进行了实验。
肽P54对TGFβ1抑制的剂量-应答实验
研究了肽P54的浓度对TGFβ1活性抑制作用的影响。由于该肽溶解性较低，制备名义浓度的肽储备液，如同对肽P12进行的同样操作，从中取等分液，过滤，或者甚至直接用于抑制实验。
图13考察了过滤前和过滤后，名义浓度的肽的抑制作用。可以看到在肽P54的滤液中没有可检测到的抑制活性。
验证了肽P54以应用剂量依赖方式抑制TGFβ1活性的能力后，我们接着以P54序列为基础合成了新肽，目的在于试图改善溶解性并由此提高在较低剂量中的活性。还合成了两种来源于人III型受体的肽。一种肽(P144)等价于肽P54。另一种肽(P145)类似于大鼠III型受体的肽P106，该肽也证明具有活性。这些新肽在表5中显示。
表5.来源于对肽P54进行修饰的肽(肽P139-P143)，以及来源于人III型受体的肽(肽P144和P145)。
肽 序列 来源
P54(731-742) ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMet 大鼠III型受体
P139 ThrSerLeuAspAlaThrMetIleTrpAspAspAsp
P140 AspAspAspAlaThrMetIleTrpThrMetMet
P141 AspAlaThrMetIleTrpAsp
P142 ThrSerLeuMetIleTrpThrMetMet
P143 ThrSerLeuAspAlaThrThrMetMet
P144(729-742) ThrSerLeuAspAlaSerIleIleTrpAlaMetMet 人III型受体
GlnAsn
P145(241-254) SerAsnProTyrSerAlaPheGlnValAspIleThr 人III型受体
IleAsp
表5中的肽的活性实验在图14中显示。
肽P144对TGFβ1抑制作用的剂量-应答实验
用来源于人III型受体序列的肽P144进行剂量-应答实验，目的在于实验其活性是否依赖于浓度(图15)。可以看到，肽的活性随着实验中应用的肽浓度的降低而降低。
肽P144对TGFβ1与其受体结合的抑制实验(亲合性标记)
在亲合标记实验中使用来源于人III型受体序列的肽P144，用于验证其抑制TGFβ1与TGFβ1的细胞受体结合的能力(材料和方法)。
由于使用的不同批次的125I-TGFβ1的活性不同，该实验中使用的肽的浓度按照每种情况下使用的125I-TGFβ1批次的浓度调整。这些实验的结果在图15中显示。
当验证了肽P144抑制TGFβ1与其细胞受体结合后，进行新的实验以确定肽P144的浓度。观察到当肽的浓度为125I-TGFβ1的分子浓度的2×105倍时，该肽丧失了其活性。
来源于能够结合TGFβ1的其它蛋白质并预测互补于TGFβ1的肽的抑制作用
在该部分中合成了表6中的肽，它们来源于能够结合TGFβ1的蛋白质。
表6.来源于各种能够结合TGFβ1的蛋白质(II型受体P146，胎球蛋白P147至P149，endoglin P150至P154和α2-巨球蛋白P155至P179)的肽。显示了肽的数目，其在完整序列中的位置，其氨基酸序列以及其来源。为了方便合成，合成的所有肽在C-末端添加了一个丙氨酸，其未在表中显示。
肽 序列 来源
CysValAlaValTrpArgLysAsnAspGluAsnIleThr II型受体
LeuGluThrValCys
ValValTyrAlaLysCys
ValCysHinAlaGlnCys
LeuPheThrLysCysAsp
P150(247-261) GluAlaValLeuIleLeuGlnGlyProProTyrValSer Endoglin
TrpLeu
ValAsnLeuProAspThrArgGlnGlyLeuLeuGluGlu Endoglin
AlaArg
P152(445-459) LeuAspSerLeuSerPheGlnLeuGlyLeuTyrLeuSer Endoglin
ProHis
ProSerIleProGluLeuMetThrGlnLeuAspSerCys Endoglin
GlnLeu
P154(479-493) MetSerProSerIleProGluLeuMetThrGlnLeuAsp Endoglin
SerCys
ProThrAspAlaSerValSerGlyLysProGlnTyr α-2-巨球蛋白
ThrGluLysGlyCysValLeuLeuSerTyrLeuAsn α-2-巨球蛋白
P158(166-177) TyrIleGlnAspProLysGlyAsnArgIlaAlaGln α-2-巨球蛋白
PheProLeuSerSerGluProPheGlnGlySerTyr α-2-巨球蛋白
AsnValSerValCysGlyLeuTyrThrTyrGlyLys α-2-巨球蛋白
SerIleCysArgLysTyrSerAspAlaSerAspCys α-2-巨球蛋白
ProCysGlyHisThrGlnThrValGlnAlaHisTyr α-2-巨球蛋白
SerValGlnLeuGluAlaSerProAlaPheLeuAla α-2-巨球蛋白
AlaLeuGluSerGlnGluLeuCysGlyThrGluVal α-2-巨球蛋白
P172(1005-1014) IleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyrGlnArgGlnLeu α-2-巨球蛋白
P173(1063-1073) LysArgLysGluValLeuLysSerLeuAsnGluGlu α-2-巨球蛋白
P174(1193-1204) ValGlyHisPheTyrGluProGlnAlaProSerAla α-2-巨球蛋白
P175(1209-1220) ThrSerTyrValLeuLeuAlaTyrLeuThrGlnAla α-2-巨球蛋白
P176(1212-1222) TyrValLeuLeuAlaTyrLeuThrAlaGlnProAla α-2-巨球蛋白
P177(1234-1267) ValAlaLeuHisAlaLeuSerLysTyrGlyAlaAla α-2-巨球蛋白
P178(1232-1243) TyrGlyArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAla α-2-巨球蛋白
P179(1224-1245) ArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAlaPheVal α-2-巨球蛋白
图17和18显示了来源于表10的肽的抑制活性。
如图17和18所示，仅肽P150显示了高于50％的活性。然而，对于肽P146和P149，Demetriou M等((1996)生物化学杂志271：12755-12761)报道具有活性，但在该实验使用的条件下没有发现活性。
合成肽对TGFβ1与其细胞受体结合的抑制作用的流动细胞记数测定
通过流动细胞记数测定来源于前面合成过程的肽，包括从TGFβ1序列和从III型受体序列合成的肽，测定它们抑制TGFβ1与其细胞受体结合的能力。在这些实验中，将细胞与肽保温，然后加入TGFβ1-生物素，其将用抗生物素蛋白-FITC检测到(材料和方法)。然后测定抗生物素蛋白-FITC发散的荧光：它将与结合到细胞上的TGFβ1的量成正比，而与肽的活性成反比。最相关肽得到结果在图19和表7中显示。
表7.通过抑制MV-1-Lu细胞生长1的生物分析测定(肽浓度200μg/ml)和应用流动细胞记数2测定抑制TGFβ1与其细胞受体结合(肽浓度420μg/ml)，比较了一些肽的TGFβ1的抑制活性。
肽 生物检测 细胞记数 序列
(％抑制率)1 (％抑制率)2
P29 77,6 92,34 HisGluProLysGlyTyrHis
AlaAsnPheCysLeuGlyPro
CysProTyrIleTrpSerLeu
AspThr
P11 40 86 HisAlaAsnPheCysLeuGly
ProCysProTyrIleTrpSer
Leu
P12 96 77 PheCysLeuGlyProCysPro
TyrIleTrpSerLeuAspThr
P18 18,2 6,5 LeuTyrAsnGlnHisAsnPro
GlyAlaSerAlaAlaProCys
Cys
P54 97 82,3 ThrSerLeuAspAlaThrMet
IleTrpThrMetMet
P140 -1,7 69,8 AspAspAspAlaThrMetIle
TrpThrMetMet
P142 70 72 ThrSerLeuMetIleTrpThr
MetMet
P106 40 91 SerAsnProTyrSerAlaPhe
GlnValAspIleIleValAap
Ile
P145 21 74,35 SerAsnProTyrSerAlaPhe
GlnValAspIleThrIleAsp
P144 88 80 ThrSerLeuAspAlaSerIle
IleTrpAlaMetMetGlnAsn
P150 64 73 GluAlaValLeuIleLeuGln
GlyProProTyrValSerTrp
Leu
P152 45 68,4 LeuAspSerLeuSerPheGln
LeuGlyLeuTyrLeuSerPro
His
TGFβ1活性的体内抑制
已经证明在抑制MV-1-Lu细胞系生长的生物检测中具有活性的、来源于人III型受体的序列的肽P144，应用于体内实验，用于研究其在大鼠模型中对CCl4诱导的实验硬化的抑制作用。
Wistar大鼠的硬化实验模型
在该模型中，通过吸入四氯化碳11周，每周两次，诱导肝硬化(LopezNovas JM等(1976)Patologia IX：223-240；Camps J.等(1987)胃肠病学93：498-505)，如材料和方法中描述的那样。
按照两种方案施用肽P144：
1.方案1：在硬化诱导过程中(11周)，通过腹膜内途径每隔一天施用肽一次。图20和21。
2.方案2：当出现硬化时，即从开始诱导硬化的第12周开始，通过腹膜内途径每隔一天施用肽一次，连续3周。图22和23。
通过两种方法测定两种方案中产生的胶原蛋白。
图36和38显示了产生的总胶原，通过染色的肝切片(每只动物两个切片)，用Fast Green和Direct Red测定颜色的洗脱，在分光光度计上读数(材料和方法)(Lopez de Leon A.和Rojkind(1985)组织化学和细胞化学(Histochem.Cytochem.)33：737-743；Gaudio E.等(1993)国际实验病理学杂志(Int.J.Exp.Path)74：463-469)。
图21和23显示了产生的胶原，通过对天狼红染色的肝切片用光学显微镜进行的图像分析测定(材料和方法)。
如图20所示，当研究胶原蛋白与总蛋白的比率时，在用肽P144处理的大鼠组(Tto1)和硬化大鼠的对照组(Ci1)之间，观察到显著差异(P＜0.05)。在图37中，当研究纤维化面积时，肽P144处理大鼠组(Tto1)和硬化大鼠的对照组(Ci1)之间的差异也是显著的(P＜0.001)。
如图22和23所示，它们显示了出现硬化后处理大鼠的结果，当用两种测定纤维化方法中的任何一种，肽P144处理的大鼠组(TIo2)和硬化大鼠的对照组(Ci2)之间的差异都是不显著的。
用线性回归比较了这两种测定胶原的方法，目的在于验证各制备过程中选择的研究视野的随机性，由此证明图像分析的有效性，图24和25。
如图24和25所示，两种方法之间存在相关性，两种情况下，均R＞0.85，它们是高度显著的(F≤0.001)。这证明用于研究的图像的精确性完全随机实现，因此证明图像分析得到的数据的有效性。
图26和27显示了从天狼红染色的肝切片(从硬化诱导过程中处理大鼠(Ci1和Tto1)的肝得到)的光学显微镜得到的图像，10X放大倍数。
图26中的图像由没有经过任何类型的滤光片得到。
图27显示了应用特殊软件为研究而修饰后的图像。这些修饰包括应用两种滤光片，一个是偏振光的，另一个是绿光的，目的为了改善图像的质量，有助于它们的自动检查。
图26和27表明，在从硬化大鼠(Ci1)得到的图像和从肽P144处理大鼠(Tto1)得到的图像之间存在差异。
方案1和2之间有效性的差异可能由于CCl4诱导出现硬化后(方案2)比CCl4诱导硬化过程中(方案1)可能产生较少的TGFβ1，甚至可能在正常水平所致，因此在方案2中比在方案1中用肽P144处理产生的效果将不显著。
当我们比较硬化诱导过程结束时的未处理大鼠组(Ci1)和诱导结束后第4周未处理的硬化大鼠组(Ci2)时，我们发现两组之间存在显著差异(P＝0.016)(图28)，这表明当硬化物质除去后，硬化的部分衰退，多位作者公开了这一观察结果(Szende-B等(1992)体外(In Vivo)6：355-361；Columbano A(1996)癌发生(Carcinogenesis)17：395-400)。
两种方案之间上述有效性的差异也可能由于方案自身，因为方案2的动物仅隔天处理一次，处理3周，而方案1的动物处理了较长时间(7周，同样隔天处理一次)。
得到的结果证明，来源于不同蛋白质的合成肽在体外和体内均可能抑制TGFβ1。将来可能更多关注于试图增加这些肽的生物活性。这可以通过将这些序列的各氨基酸由另外19个系统取代而实现。一旦发现具有较高活性的肽，将必须制备模拟型(mimotope)(McConnell-SJ(1994)基因(gene)151：115-118；Steward-MW(1995)病毒学杂志(J.Virol.)69：7668-7673)，其目的在于增加生物体中抑制物质的平均寿命。
附图描述
图1.肽P144对TGFβ1与MV-1-Lu细胞结合的抑制，通过流动细胞记数测定。A：考察与生物素酰化TGFβ1保温然后与抗生物素蛋白-FITC培养的细胞得到的图像。B：考察与抗生物素蛋白-FITC保温，而之前不加TGFβ1的细胞得到的图像。C：考察先与浓度为0.42μg/μl的肽P144保温之后与TGFβ1保温，然后与抗生物素蛋白-FITC培养的细胞得到的图像。横坐标显示发散的荧光，纵坐标显示各荧光值的细胞数。也显示了对应TGFβ1-生物素和抗生物素蛋白-FITC(M2)标记细胞和未标记细胞(M1)的视野。
图2.CCl4诱导硬化过程的示意图。黑箭头显示施用给大鼠的CCl4两周剂量，黑色虚线箭头表示一周剂量。灰色箭头表示施用肽P144。A：健康对照；B：健康对照+P144，B1：肽70μg/天；C：硬化；C1生理盐水；C2为肽70μg/天；D：CCl4+苯巴比妥诱导硬化；D1加盐水；D2加肽70μg/天。
图3.TGFβ1对MV-1-Lu细胞生长的影响。细胞以5000个细胞/孔的密度在指示的TGFβ1浓度(pg/ml)下培养，横坐标：TGFβ1浓度(pg/ml)；纵坐标：c.p.m.。
图4.来自TGFβ1的肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有的肽以200μg/ml的浓度实验。对TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时MV-1-Lu细胞的生长。
图5.在存在各种名义浓度的肽P12时，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率，过滤(◆)和未过滤(●)。
图6.来自TGFβ1的肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有的肽以200μg/ml的浓度实验。对TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时MV-1-Lu细胞的生长。
图7.TGFβ1受体的亲和标记实验的放射能照相。C1道：细胞与浓度为0.16μM相应于0.3μCi活性的125I-TGFβ1(阳性对照)共同培养的效果。C2道：细胞与浓度10倍于125I-TGFβ1的非-放射性TGFβ1(阴性对照)预培养的效果。C3道：与浓度比125I-TGFβ1的分子浓度高106倍浓度的肽P29预培养的效果。可以看到，肽P29和非-放射性TGFβ1均抑制125I-TGFβ1与I、II和II型细胞受体的结合。
图8.TGFβ1受体的亲合标记实验的放射能照相。C1到C6道：MV-1-Lu细胞与不同浓度的肽P29(分别为125I-TGFβ1分子浓度的106、8×105、6×105、4×105、2×105、和105倍)预培养，之后加入125I-TGFβ1的效果。道C7：MV-1-Lu细胞与未标记的TGFβ1(125I-TGFβ1分子浓度的102)预培养，之后加入125I-TGFβ1的效果(阴性对照)。C8道：MV-1-Lu细胞与浓度为0.42μM125I-TGFβ1，相应于0.4μCi活性共培养，而没有之前的预培养的效果(阳性对照)。
图9.预测与TGFβ1区域互补的受体肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图10.来源于III型受体胞外区的重叠肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图11.来源于III型受体胞外区的重叠肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图12.来源于III型受体胞外区的重叠肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图13.在存在不同名义浓度的肽P54时，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率，过滤(◆)和未过滤(●)。
图14.来源于对肽P54修饰的受体肽(P139-P143)和来源于人III型受体的肽(P144和P145)对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图15.在存在不同名义浓度的肽P144而未过滤时，TGFβ1(200pg/ml)活性的百分抑制率。
图16.TGFβ1受体的亲合标记实验的放射能照相。C1道：与浓度比125I-TGFβ1的分子浓度高106倍的肽P144进行预培养。C2和C3道：细胞与浓度比125I-TGFβ1的分子浓度高10倍浓度的非放射性TGFβ1预培养的效果(阴性对照)。C4和C5道：细胞与浓度为0.1μM，相应于0.2μCi活性的125I-TGFβ1共培养的效果(阳性对照)。可以看到肽P144和非放射性TGFβ1均抑制125I-TGFβ1与细胞受体的结合。
图17.来源于人II型受体的肽(P146)、来源于胎球蛋白的肽(P147-149)和来源于endoglin的肽(P150-P154)对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图18.来源于α2-巨球蛋白的肽对TGFβ1(200pg/ml)的百分抑制率。所有肽均以200μg/ml的浓度实验。TGFβ1的100％抑制对应无TGFβ1时获得的MV-1-Lu细胞生长。
图19.各种合成肽对TGFβ1与MV-1-Lu细胞结合的百分抑制率。对于各肽，通过测定标记细胞(发散荧光)和未标记细胞(未发散荧光)的百分率研究抑制。
图20.在用CCl4诱导实验性硬化过程中，施用肽P144对胶原合成的影响。纵坐标显示了胶原蛋白与总蛋白的比率。横坐标显示了大鼠的各不同组：Co＝健康大鼠；Co+P144＝用肽P144处理的健康大鼠；Tto1＝接受CCl4诱导硬化并在该过程中每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci1＝接受CCl4诱导硬化11周，并且不用肽P144处理的大鼠。
图21.在CCl4诱导实验性硬化过程中，施用肽P144对胶原合成的影响。纵坐标显示了天狼红染色的组织切片中纤维化面积与总面积的比率。横坐标显示了大鼠的各不同组：Co＝健康大鼠；Co+P144＝用肽P144处理的健康大鼠；Tto1＝接受CCl4诱导硬化并在该过程中每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci1＝接受CCl4诱导硬化11周，并且不用肽P144处理的大鼠。
图22.用CCl4诱导硬化后，施用肽P144对胶原合成的影响。纵坐标显示了胶原蛋白与总蛋白的比率。横坐标显示了大鼠的各不同组：Co＝健康大鼠；Co+P144＝用肽P144处理的健康大鼠；Tto2＝接受CCl4诱导硬化并在该过程结束时，每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci2＝接受CCl4诱导硬化11周，并且不用肽P144处理的大鼠。
图23.用CCl4诱导硬化后，施用肽P144对胶原合成的影响。纵坐标显示了组织切片中纤维化面积与总面积的比率。横坐标显示了大鼠的各不同组：Co＝健康大鼠；Co+P144＝用肽P144处理的健康大鼠；Tto2＝接受CCl4诱导硬化并在该过程结束时，每隔一天施用肽P144的大鼠；Ci2＝接受CCl4诱导硬化11周，并且不用肽P144处理的大鼠。
图24.通过应用的两种方法得到的胶原蛋白量和纤维化面积的数据的比较。横坐标表示通过图像分析得到的纤维化面积与总面积的比值。纵坐标表示通过Direct Red和Fast Green染色的肝脏切片的分光光度计分析得到的胶原量(μg)与总蛋白(mg)的比值。显示了R2(F≤0.001)。
图25.在方案2结束时，使用两种考察样品的方法得到的胶原量和纤维化面积的数据比较。横坐标表示通过图像分析得到的纤维化面积与总面积的比值。纵坐标表示通过Direct Red和Fast Green染色的肝脏切片的分光光度计分析得到的胶原量(μg)与总蛋白(mg)的比值。显示了R2(F≤0.001)。
图26.通过用光学显微镜(10X)对天狼红染色的大鼠肝脏切片观察得到24个代表性视野的图像。CCl4诱导硬化结束时的硬化大鼠(Ci1)和CCl4诱导硬化过程中用肽P144处理的硬化大鼠(Tto1)。不同视野取自从各动物得到的切片(R＝大鼠，C＝视野)。
图27.通过用光学显微镜(10X)对天狼红染色的大鼠肝脏切片观察得到24个代表性视野的图像。CCl4诱导硬化结束时的硬化大鼠(Ci1)和CCl4诱导硬化过程中用肽P144处理的硬化大鼠(Tto1)。不同视野取自从各动物得到的切片(R＝大鼠，C＝视野)。使用了偏振光和绿光滤光片，以便显露出胶原纤维。
图28.两组未处理的硬化大鼠之间的比较。Ci1是在CCl4诱导硬化的12周末的硬化大鼠，Ci2是诱导硬化过程结束后4周的硬化大鼠。P＝0.016。纵坐标：纤维化面积/总面积。
序列表
<110>纳瓦拉公司科学与技术研究所
<120>TGFβ1-抑制肽
<160>10
<210>SEQ IN NO：1
<211>15
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>来源于TGFβ1，319-333位
<400>His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp
5 10
Ser Leu
15
<210>SEQ IN NO：2
<211>14
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>来源于TGFβ1，322-335位
<400>Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp
5 10
Thr
<210>SEQ IN NO：3
<211>12
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>推测与TGFβ1，731-742位互补
<400>Thr Ser Leu Asp Ala Thr Met Ile Trp Thr Met Met
5 10
<210>SEQ IN NO：4
<211>15
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>与大鼠III型受体的胞外区，245-259位重叠
<400>Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Ile Val
5 10
Asp Ile
15
<210>SEQ IN NO：5
<211>9
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>推测与TGFβ1，731-742位互补的修饰P54
<400>Thr Ser Leu Met Ile Trp Thr Met Met
5
<210>SEQ IN NO：6
<211>14
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>来源于修饰的人III型受体，729-742位
<400>Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile Ile Trp Ala Met Met Gln
5 10
Asn
<210>SEQ IN NO：7
<211>14
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>来源于修饰的人III型受体，241-254位
<400>Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile
5 10
Asp
<210>SEQ IN NO：8
<211>15
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>endoglin的247-261位
<400>Glu Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser
5 10
Trp Leu
15
<210>SEQ IN NO：9
<211>15
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>endoglin的445-459位
<400>Leu Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser
5 10
Pro His
15
<210>SEQ IN NO：10
<211>23
<212>肽
<213>人工序列
<220>结构域
<223>TGFβ1的322-335位的修饰P12
<400>His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly
5 10
Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr
15 20
Claims (11)
1.一种作为体内TGFβ1与其受体结合的拮抗剂的肽，特征在于它是一种合成肽，其氨基酸序列选自SEQ ID NO：3-9及其具有同样的活性的变体。
2.按照权利要求1的肽，特征在于它具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
3.按照权利要求1的肽，特征在于它具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
4.按照权利要求1的肽，特征在于它具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
5.按照权利要求1的肽，特征在于它具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
6.按照权利要求1的肽，特征在于它具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
7.按照权利要求1的肽，特征在于它具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
8.按照权利要求1的肽，特征在于它具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
9.一种应用至少一种权利要求1-8之一的肽生产应用于肝脏疾病的组合物的方法。
10.一种应用编码至少一种权利要求1-8之一的肽的DNA生产应用于肝脏疾病的组合物的方法。
11.按照权利要求10的方法，其中的肝脏疾病是肝纤维化。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES009802465A ES2146552B1 (es) | 1998-11-24 | 1998-11-24 | Peptidos inhibidores de tgf/31 |
| ESP9802465 | 1998-11-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1328569A CN1328569A (zh) | 2001-12-26 |
| CN1203091C true CN1203091C (zh) | 2005-05-25 |
Family
ID=8305903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB99813614XA Expired - Fee Related CN1203091C (zh) | 1998-11-24 | 1999-11-23 | TGFβ1－抑制肽 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7057013B1 (zh) |
| EP (1) | EP1132403B1 (zh) |
| JP (5) | JP3836677B2 (zh) |
| CN (1) | CN1203091C (zh) |
| AT (1) | ATE322505T1 (zh) |
| AU (1) | AU767498B2 (zh) |
| BR (1) | BR9915604B1 (zh) |
| CA (1) | CA2352537C (zh) |
| CY (1) | CY1105616T1 (zh) |
| DE (1) | DE69930763T2 (zh) |
| DK (1) | DK1132403T3 (zh) |
| ES (2) | ES2146552B1 (zh) |
| PT (1) | PT1132403E (zh) |
| RU (1) | RU2232771C2 (zh) |
| SI (1) | SI1132403T1 (zh) |
| WO (1) | WO2000031135A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020119424A1 (zh) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | 中国药科大学 | 一种含有sumo抑制剂的组合物及应用 |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7723473B2 (en) | 1997-06-19 | 2010-05-25 | St. Louis University | Peptide antagonists of TGF-beta family members and therapeutic uses thereof |
| JP2002087938A (ja) * | 2000-09-11 | 2002-03-27 | Shiseido Co Ltd | 養毛剤及びそのスクリーニング方法 |
| CA2484994C (en) * | 2002-04-29 | 2016-06-14 | St. Louis University | Peptide antagonists of tgf-beta family members and therapeutic uses thereof |
| ES2304069B1 (es) * | 2003-08-22 | 2009-08-12 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Peptidos con capacidad de unirse al factor transformante de crecimiento beta 1 (tgf-b1). |
| US8158589B2 (en) * | 2003-08-22 | 2012-04-17 | Proyecto Biomedicine Cima, S.L. | Peptides with the capacity to bind to transforming growth factor β1 (TGF-β1) |
| US20090263410A1 (en) * | 2005-10-24 | 2009-10-22 | Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. | Use of tgf-b1 inhibitor peptides in the preparation of an immune response modulating agent |
| US7582609B2 (en) | 2006-03-01 | 2009-09-01 | Digna Biotech, S.L. | Method for the treatment of skin fibrosis and suitable compositions for such treatment |
| KR100879239B1 (ko) * | 2007-04-19 | 2009-01-16 | (주)케어젠 | Ｔｇｆｐ－ｃａｐ 펩타이드 및 그의 용도 |
| ES2327088B1 (es) * | 2007-08-20 | 2010-07-26 | Proyecto De Biomedicina Cima S.L. | Combinaciones terapeuticas para el tratamiento de las metastasis. |
| WO2009029656A1 (en) * | 2007-08-27 | 2009-03-05 | Auxagen, Inc. | METHODS FOR INHIBITING TGF-β |
| JP4630914B2 (ja) | 2008-04-14 | 2011-02-09 | 株式会社日本ハイポックス | 肝線維化抑制剤 |
| JP5685529B2 (ja) | 2008-06-13 | 2015-03-18 | プロイェクト、デ、ビオメディシナ、シーマ、ソシエダッド、リミターダＰｒｏｙｅｃｔｏ Ｄｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎａ Ｃｉｍａ， Ｓ．Ｌ． | 生物学的活性を有する化合物の投与のための複合体 |
| EP2341913B1 (en) * | 2008-09-16 | 2014-11-19 | Saint Louis University | Method of enhancing tgf-beta signalling |
| CN102307598A (zh) | 2009-02-05 | 2012-01-04 | 迪格纳生物技术公司 | TGF-β1抑制肽的药物制剂 |
| ES2347627B1 (es) | 2009-03-06 | 2011-10-10 | Isdin, S.A. | Peptido para el tratamiento profilactico o terapeutico de tumores de la piel en estadios iniciales. |
| KR100983182B1 (ko) * | 2009-08-14 | 2010-09-20 | (주)엔솔테크 | 신규 펩타이드 및 그 용도 |
| US20120225933A1 (en) | 2009-11-05 | 2012-09-06 | Gonzalez Aseguinolaza Gloria | Regulated expression systems |
| CN105315370A (zh) * | 2010-02-18 | 2016-02-10 | 加利福尼亚大学董事会 | 整合素αVβ8中和抗体 |
| CN102898508B (zh) * | 2011-08-12 | 2014-04-30 | 北京大学第一医院 | 封闭TGF-β受体或IL-10受体的多肽、其药物组合物及其用途 |
| EP2754719B1 (en) | 2011-09-05 | 2018-08-29 | Pola Pharma Inc. | Method of using etfb as biomarker for identifying the growth state of fibroblasts |
| CU24181B1 (es) * | 2012-11-09 | 2016-04-25 | Ct De Inmunología Molecular | POLIPÉPTIDOS DERIVADOS DEL TGFß |
| HUE049377T2 (hu) | 2013-03-14 | 2020-09-28 | Brigham & Womens Hospital Inc | Készítmények és eljárások epiteliális õssejtek expanziójára és tenyésztésére |
| US11730722B2 (en) | 2013-07-30 | 2023-08-22 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Corneal endothelium ECM therapeutic medicaments |
| EP3705498A1 (en) | 2013-08-22 | 2020-09-09 | Acceleron Pharma Inc. | Tgf-beta receptor type ii variants and uses thereof |
| JPWO2015064768A1 (ja) | 2013-10-31 | 2017-03-09 | 京都府公立大学法人 | 角膜内皮の小胞体細胞死関連疾患治療薬 |
| CA2931309C (en) | 2013-11-21 | 2022-06-21 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Compositions and methods for treating pulmonary hypertension |
| CN106794233B (zh) * | 2014-08-01 | 2021-11-12 | 布里格姆及妇女医院股份有限公司 | 与肺动脉高压的治疗有关的组合物和方法 |
| WO2016037016A1 (en) | 2014-09-03 | 2016-03-10 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Compositions, systems, and methods for generating inner ear hair cells for treatment of hearing loss |
| CN105821029A (zh) * | 2015-01-04 | 2016-08-03 | 彭霞 | 异源融合基因修饰的癌细胞/树突状细胞融合肿瘤疫苗及其制备方法 |
| TWI726870B (zh) * | 2015-03-04 | 2021-05-11 | 美商健臻公司 | 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β１的ｓｃＦｖ-Ｆｃ二聚體 |
| US10669528B2 (en) | 2015-06-25 | 2020-06-02 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance |
| US9884900B2 (en) | 2015-08-04 | 2018-02-06 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for treating Janus kinase-associated disorders by administering soluble transforming growth factor beta type II receptor |
| CN108779437A (zh) | 2016-01-08 | 2018-11-09 | 麻省理工学院 | 分化的肠内分泌细胞和胰岛素产生细胞的制备 |
| KR101791526B1 (ko) | 2016-02-18 | 2017-11-01 | (주)케어젠 | 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도 |
| KR101841748B1 (ko) * | 2016-02-18 | 2018-05-08 | (주)케어젠 | 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도 |
| US10213511B2 (en) | 2016-03-02 | 2019-02-26 | Frequency Therapeutics, Inc. | Thermoreversible compositions for administration of therapeutic agents |
| US11260130B2 (en) | 2016-03-02 | 2022-03-01 | Frequency Therapeutics, Inc. | Solubilized compositions for controlled proliferation of stem cells / generating inner ear hair cells using a GSK3 inhibitor: IV |
| US10201540B2 (en) | 2016-03-02 | 2019-02-12 | Frequency Therapeutics, Inc. | Solubilized compositions for controlled proliferation of stem cells / generating inner ear hair cells using GSK3 inhibitors: I |
| WO2017161001A1 (en) | 2016-03-15 | 2017-09-21 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion |
| WO2018125746A1 (en) | 2016-12-30 | 2018-07-05 | Frequency Therapeutics, Inc. | 1h-pyrrole-2,5-dione compounds and methods of using them to induce self-renewal of stem/progenitor supporting cells |
| DK3628049T3 (da) | 2017-05-04 | 2023-08-14 | Acceleron Pharma Inc | Tgf-beta-receptortype-ii-fusionsproteiner og anvendelser deraf |
| KR101954214B1 (ko) * | 2017-05-23 | 2019-03-06 | (주)케어젠 | 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도 |
| CN112135613A (zh) | 2018-03-20 | 2020-12-25 | 西奈山伊坎医学院 | 激酶抑制剂化合物和组合物及使用方法 |
| WO2019236766A1 (en) | 2018-06-06 | 2019-12-12 | Ideaya Biosciences, Inc. | Methods of culturing and/or expanding stem cells and/or lineage committed progenitor cells using lactam compounds |
| WO2019234221A1 (en) | 2018-06-08 | 2019-12-12 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for stratification and treatment of a patient suffering from chronic lymphocytic leukemia |
| US11617745B2 (en) | 2018-08-17 | 2023-04-04 | Frequency Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for generating hair cells by downregulating FOXO |
| JP2021533788A (ja) | 2018-08-17 | 2021-12-09 | フリークエンシー セラピューティクス インコーポレイテッド | Ｊａｇ−１を上方制御することにより有毛細胞を生成するための組成物及び方法 |
| JP2022515652A (ja) | 2018-12-31 | 2022-02-21 | アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ | キナーゼ阻害剤化合物及び組成物ならびに使用方法 |
| KR102265432B1 (ko) | 2019-08-20 | 2021-06-15 | 주식회사 케어젠 | 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 |
| CN110483648A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-22 | 南京安吉生物科技有限公司 | 一种融合多肽及其应用 |
| CN110511285B (zh) * | 2019-08-27 | 2023-01-24 | 南京安吉生物科技有限公司 | 一种重组融合多肽及其应用 |
| AU2021409832A1 (en) * | 2020-12-23 | 2023-08-10 | Korea Institute Of Science And Technology | NOVEL PEPTIDE CAPABLE OF INHIBITING TGF-β SIGNALING AND USE THEREOF |
| KR20240000395A (ko) * | 2022-06-22 | 2024-01-02 | 주식회사 유씨아이테라퓨틱스 | TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8927546D0 (en) * | 1989-12-06 | 1990-02-07 | Ciba Geigy | Process for the production of biologically active tgf-beta |
| EP0542971A1 (en) * | 1991-05-10 | 1993-05-26 | The Salk Institute For Biological Studies | CLONING AND RECOMBINANT PRODUCTION OF RECEPTOR(S) OF THE ACTIVIN/TGF-$g(b) SUPERFAMILY |
| FR2720069A1 (fr) * | 1994-05-19 | 1995-11-24 | Inst Nat Sante Rech Med | Dérivés de facteurs de croissance et d'hormones de la superfamille des TGFB, procédé pour leur obtention et leurs applications biologiques. |
| US5824655A (en) * | 1995-02-15 | 1998-10-20 | The University Of Utah | Anti-transforming growth factor-β gene therapy |
-
1998
- 1998-11-24 ES ES009802465A patent/ES2146552B1/es not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-11-23 PT PT99957342T patent/PT1132403E/pt unknown
- 1999-11-23 BR BRPI9915604-0A patent/BR9915604B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-11-23 DE DE69930763T patent/DE69930763T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-23 WO PCT/ES1999/000375 patent/WO2000031135A1/es active IP Right Grant
- 1999-11-23 AT AT99957342T patent/ATE322505T1/de active
- 1999-11-23 JP JP2000583961A patent/JP3836677B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-23 SI SI9930897T patent/SI1132403T1/sl unknown
- 1999-11-23 CA CA2352537A patent/CA2352537C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-23 DK DK99957342T patent/DK1132403T3/da active
- 1999-11-23 EP EP99957342A patent/EP1132403B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-23 US US09/831,253 patent/US7057013B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-11-23 RU RU2001117230/04A patent/RU2232771C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-11-23 ES ES99957342T patent/ES2262349T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-11-23 AU AU15077/00A patent/AU767498B2/en not_active Ceased
- 1999-11-23 CN CNB99813614XA patent/CN1203091C/zh not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-04-10 JP JP2006107967A patent/JP4002287B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-04-11 US US11/401,744 patent/US7528226B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-06-16 CY CY20061100805T patent/CY1105616T1/el unknown
-
2007
- 2007-02-19 JP JP2007037713A patent/JP4068654B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-02 JP JP2007259167A patent/JP4237807B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-10-20 JP JP2008269650A patent/JP4272255B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020119424A1 (zh) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | 中国药科大学 | 一种含有sumo抑制剂的组合物及应用 |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1203091C (zh) | TGFβ1－抑制肽 | |
| CN1305897C (zh) | 新肽化合物和其制备方法及含有它们的药物组合物 | |
| CN1238367C (zh) | 分离的编码t细胞诱导因子(tif)的核酸分子,其编码蛋白及其应用 | |
| CN1304581C (zh) | 用于治疗神经退行性疾病的组合物和方法 | |
| CN101044162A (zh) | Glp－1类似物融合蛋白质制剂 | |
| CN1789411A (zh) | 分离的编码t细胞诱导因子(tif)的核酸分子,其编码蛋白及其应用 | |
| CN1671423A (zh) | 新型嵌合cd154 | |
| CN1839149A (zh) | 能够结合转化生长因子β1(TGF－β1)的肽 | |
| CN1357042A (zh) | 白介素－17相关哺乳动物细胞因子、编码其的多核苷酸、应用 | |
| CN1738900A (zh) | 特异于胰腺胰岛β细胞的蛋白质及其应用 | |
| CN1231676A (zh) | 用于治疗骨质疏松症的甲状旁腺激素类似物 | |
| CN1230120A (zh) | 一种抑制信号-传导蛋白和glgf(pdz/dhr)区域之间相互作用的化合物及其应用 | |
| CN1049166A (zh) | Magainin肽的取代类似物 | |
| CN1961073A (zh) | 切割型dance、dance复合体及其使用方法 | |
| CN1246333C (zh) | EDb－纤粘连蛋白结构域(II)的受体 | |
| CN1835969A (zh) | 冯希普尔－林道肿瘤抑制蛋白对低氧诱导因子－1的条件调节机制 | |
| CN1323716C (zh) | Sarp－1在治疗和/或预防硬皮病中的应用 | |
| CN1835763A (zh) | Ccn1组合物和方法 | |
| CN1118573C (zh) | gp350/220的非剪接变异体 | |
| CN1639343A (zh) | 检测瘦素受体配体的方法 | |
| CN1765929A (zh) | 含有肽载体和表皮生长因子的融合蛋白和核酸及其用途 | |
| CN1277616A (zh) | 能抑制早老素和β-淀粉样肽或其前体间相互作用的肽 | |
| CN1195374A (zh) | 整合素调节/信号传递的细胞质调节剂 | |
| CN1212397C (zh) | 筛选抗SARS冠状病毒药物用非感染性病毒重组基因SARS－CoV－EGFP | |
| CN1241941C (zh) | 一种促进神经分化和抗细胞凋亡的蛋白质及其编码基因 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: INST OF APPLICATION MEDICINE Free format text: FORMER OWNER: INSTITUTO CIENTIFICO Y TECNOLOGICO DE NAVARRA S A Effective date: 20030228 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20030228 Address after: Navarra Spain Applicant after: Inst of Application Medicine Address before: Pamplona Applicant before: Instituto Cientifico Y Tecnologico De Navarra S A |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: TOP BIOLOGICAL MEDICAL ENGINEERING CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: INST OF APPLICATION MEDICINE Effective date: 20050701 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20050701 Address after: Pamplona Patentee after: Inst of Application Medicine Address before: Navarra Spain Patentee before: Inst of Application Medicine |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20050525 Termination date: 20141123 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |