JP2002530431A - TGFβ1−インヒビターペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
h DS など. (1979) Endocrinology 104: 1143-1151)。細胞成長に関与し、そし
てオートクライン及びパラクライン機構により作用することができる最も重要な
成長因子は、形質転換成長因子(TGF)を包含する(Braun L. など. (1988) Cel
l Bid. 85: 1539-1543; Lyons RM and Moses HL (1990) Eur. J. Biochem. 187:
467-473)。
る活性を記載するために最初に使用された(delarco JE and Todaro GJ (1978)
Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4001-4005; Mizel SB など. (1980) Proc. Natl.
Acad. Sci. 77: 2205-2208)。それらの細胞の上清液は、増殖のために固体支持
体を必要とする細胞の軟質寒天における正常な増殖を誘発することができた。よ
り特別な研究は、関連するタンパク質のファミリーを含んで成る、TGFα及びTGF
βと呼ばれる2種のTGF種類を示した。
92) Nature 358: 430-434; Brand T. and Schneider MD (1995) J. Mol. Cell C
ardiol. 27: 5-18)の5種のイソフォーム(Brand T. and Schneider MD (1995)
J. Mol. Cell Cardiol. 27: 5-18)から成る。単一の種から精製された成熟タ
ンパク質の調査は、それらの配列間で高い程度の同一性を示した(表1)。
される。最少の加水分解において、Pro−TGFβ1を生成する29個のアミノ酸の疎
水性フラグメントの開放が存在する。次に、成熟TGFβ1が、TGFβ1の末端アミノ
を先行し、そして2個のアルギニンから成る領域におけるもう1つの切断により
開放され、12kDaの分子量を有する112個のアミノ酸のタンパク質が生成される。
生物学的活性形を生成するためには、それらのモノマーの2つがジスルフィド架
橋により一緒に連結し、25kDaのダイマーを生成する。この構造の変更は、生物
学的機能の損失を引き起こす(Barnard JA など. (1990) Brochim. Biophys. Ac
ta 1032: 79-87)。
メインの1つは、アミノ酸40〜82間に位置することが見出されており、そしてTG
Fβ1のその細胞受容体への結合に関与する(Quian SW など. (1992) Proc. Natl
. Acad. Sci. 89: 6290-6294; Burmester JK など.(1993)Proc. Natl. Acad.
Sci. 90: 8628-8632)。
ts S. など. (1988) J. Biol. Chem. 163: 17225-17228及びLopez Casillas F.
(1991) Cell 67: 785-795)。それらの受容体は、異なったタイプのTGFβ1に対
して異なった親和性を有する。タイプI, II及びIIIの受容体は、これまでの最良
の理解である(Attisano L. など. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1222: 71-8
0; Derynck R. (1994) Trends Biochem. Sci. 19: 548-553; Yingling など. (1
995) Biochim. Biophys. Acta 1242: 115-136)。
9907-9911)及びタイプV受容体(Ichijo H. など. (1991) J. Biol. Chem. 266
: 22459-22464)もまた記載されている。エンドグリンのトランスメンブラン及
び細胞質ドメインが、ヒト及びラットの両者においてタイプIII受容体と約70%
の類似性を有することがまた報告されている(Cheifetz S. など. (1993) J. Bi
ol. Chem 267: 19027-19030; Bellon T. など. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2
340-2345; Yamashita など. (1995) J. Biol. Chem. 269: 1995-2001; Zhang H.
など. (1996) J. Immunol. 156: 564-573)。
など. (1994) J. Biol. Chem. 269: 20172-20178)、又はRIの種々の分子がRII
と組み合わされている複合体(Weiss G. and Massague J. (1996) EMBO J. 15:
276-289)に、それを提供する作用を有するものである。RII−RI相互作用は、RI
のリン酸化、及びMADR2タンパク質のような第2メッセンジャーにリン酸化する
そのセリン/トレオニンキナーゼの続く活性化を生ぜしめる(Macias-Silva M.
など., (1996) Cell 87: 1215-1224)。
して作用する細胞外マトリックスの拡大(Mustoe TA など. (1987) Science 237
: 1333-1336)。 ・上皮細胞及び肝細胞の分化(Florini JRなど. (1986) J. Biol. Chem. 261:
16509-16513)。
持において非常に重要なものである(Kato Y. など. (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. 85: 9552-9556)。 ・ラット胎児肝臓細胞の培養物において観察されるような上皮増殖因子(EGF
)の受容体のエンドサイトーシスの阻害(Noda M. and Rodan GA (1987) J. Cel
l Physiol. 133: 426-437)。
脂肪細胞又はIto細胞)によりそれらの受容体の上昇を引き起こし、そしてマト
リックスを分解するタンパク質分解酵素の合成を阻害する(Ignot RA and Massa
gue J. (1986) J. Biol. Chem. 261: 4337-4345)、肝線維症の工程に関連する
ことが見出された(Czaja MJ. など. (1989) J. Cell Biol. 108: 2477-2482; A
nnoni G. など. (1992) J. Hepatol. 14: 259-164)。肝臓においては、TGFβ1
は、肝臓星状細胞におけるコラーゲン及びフィブロネクチンの合成を誘発する(
Weiner FR (1990) Hepatology 11: 111-117)。そのmRNAの誘発によるそれ自体
の合成を高めることによっての自己−調節が存在する。
マクログロブリンの高められた合成に関与することも見出されている。TGFβ1に
結合し、そしてその不活性化を引き起こすことによって(Bachem MG (1994) Ann
NY Acad. Sci. 737: 421-424)、α2−マクログロブリンは、細胞外区画からT
GFβ1を排除すると言われる。 慢性肝臓損傷を有する患者の調査は、TGFβ1の発現と、タイプIプロコラーゲ
ンについてのmRNAの発現及びプロコラーゲンのタイプIIIペプチドの血清レベル
との間に相互関係が存在することを示した(Castilla A. など. (1991) N. Engl
. J. Med. 324: 933-940)。 肝硬変を有する患者は、疾病、例えば門脈圧亢進症又は肝疾患の間に生じる合
併症のために正常な生命の予測よりも短い生命の予測を有する。
em. 262: 6443-6446)、及び関連するタンパク質、例えば細胞外マトリックスの
成分と相互作用することができる膜タンパク質(Carter WG (1982) J. Biol. Ch
em. 257: 13805: 12805-12815)の合成の活性化; ・マトリックスを分解することができるタンパク質分解酵素の合成の阻害(Fu
kamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190: 276-282); ・タンパク質分解酵素のインヒビターの合成の刺激(Fukamizu H. and Grinne
ll F. (1990) Exp. Cell Res. 190: 276-282)。
合、細胞外マトリックスの合計量の上昇を生ぜしめる、細胞外マトリックスとの
細胞の相互作用の上昇を導く(Roberts CJ など. (1988) J. Biol. Chem. 263:
4586-4592)。それらの発現は、TGFβ1が瘢痕工程に関与されていることを確か
める(Fukamizu H. and Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190: 276-282; Ba
rnard JA など. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1032: 79-87)。
子、すなわち合成ペプチドを使用することの可能性が存在する。LeSateur など
により行われた研究は、受容体へのその結合を可能にする、β回転領域を模倣す
る神経成長因子(NGF)の環状化された類似体の使用の可能性を示す(LeSateur
L. など. (1996) Nature Biotechnology 14: 1120-1122)。ペプチドにより介在
されるブロッキングによりその受容体と相互作用する生来の因子を妨げる、ペプ
チド分子のアンタゴニストとしてそれらのペプチドを使用することも可能である
(Lasarte JJ など. (1994) J. Acquired Immue Deficiency Syndromes 7: 129-
134; Le Sateur など. (1995) J. Biol. Chem. 270: 6564-6569)。
互作用のインヒビターとしての合成ペプチドの有用性を示している(Daniels AJ
など. (1995) Mol. Pharmacol. 48: 425-432)。TGFβ1のタイプII受容体及び
フェチュイン、すなわちタイプII受容体のグループにおける糖タンパク質に関し
て行われた他の研究は、TGFβ1とRIIとの相互作用のインヒビターとしての環化
されたペプチドの使用可能性を示している(Demetrion M. など. (1996) J. Bio
l. Chem. 271: 12755-12761)。この環化により、インビボで得られる構造に類
似する構造を有するペプチドを得ることが可能になる。
する能力を有するタンパク質に由来するペプチドが、TGFβ1の作用のインヒビタ
ーであると思われる。従って、本発明者は、この可能性を調査することを決定し
た。
するかどうかに依存して、異なった手段で選択した。 TGFβ1の配列の場合、ペプチドは、TGFβ1の完全な配列を含む15個のアミノ酸
から合成された。個々のペプチドは、その2種の中間隣接物と同じような10個の
アミノ酸を有した。
ソフトウェアに基づいて選択された。コンピュータープログラムの1つは、2種
のアミノ酸を、部分的に相補的な領域を予測するために比較する。アミノ酸配列
を補足するアミノ酸の疎水性及び親水性に基づいて、最も暴露されるタンパク質
の領域を予測することができる他のプログラムも使用した。
ルボニル(Fmoc)を用いて、固相法(Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85
: 2149-34)により合成された(Atherton など. (1989) Journal of Chemical S
ociety Perkins Transactions 1: 538-546)。少量の多数のペプチドの合成のた
めに、96個のペプチドの同時合成を可能にする多合成機が使用された(Barras-C
uestaなど. (1991) Biologicals 19: 187-190)。ペプチドは、使用まで、固体
状態で−80℃で貯蔵された。
, USA)を用いて、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)により分析し、そし
て精製した。
p., Bedford, USA)を、分析用HPLCによるペプチドの分析のために使用した。ペ
プチドを、蒸留水中、TFAの0.1%溶液において、1mg/ml の最大濃度まで溶解した
。前記ペプチドの溶液(100μl)をカラムに注入し、そして1ml/分の流速で、0.
1%TFAにより、水/アセトニトリルグラジエント(図15)(Romil Ltd., Cambrid
ge, USA)において溶出した。ペプチドを含んだ画分を、220nm及び280nmでのそ
の吸光度により検出した(Photodiode Array Detector, Waters 991, Millopore
Corp., Fedford, USA)。
rp., Bedford, USA)を、その精製のために使用した。ペプチドを溶解し、5ml/
分の流速で同じグラジエントを用いて、前記の場合におけるのと同じ条件下で注
入した(2ml)。純粋なペプチドを含む画分をフラスコに集めた。
can Type Cell Culture, Virginia, USA)。細胞を、集密性以下に達するまで、
37℃及び5%CO2で、ストーブにおいて、162cm2の培養フラスコ(Costar Corpor
ation, Cambridge, USA)において増殖した。次の完全培地を使用した:5%の
ウシ胎児血清(FCS, Biological Industries, Kibbuts Beit Haemek, Israel),
10mMのHEPES(1MのHEPES緩衝液、Bio−Whittaker, Verviers, Belgium)及び
抗生物質(100U/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン)により補
充された、L−グルタミンを有するRPMI 1640 (GibcoBRL, Life Technologies Lt
d., Paisley, Scotland)。
logical Industries, Kibbutz Baemek, Israel)を用いて、培養フラスコの底か
ら除去し、完全培地に再懸濁し、そして1500回転/分で8分間、遠心分離した。
遠心分離の後、細胞を完全培地において、50,000個の細胞/mlの濃度に再懸濁し
た。試験を行うために、10mlの細胞懸濁液を採取し、そして96−ウェルの平底培
養プレート(Costar Corporation, Cambridge, USA)において、100μl/ウェル
で分散し、そして37℃及び5%のCO2で一晩、インキュベートし、ウェルの底への
細胞の付着を可能にした。
mlの濃度のTGFβ1の存在下で200μg/mlの濃度にした(R & D Systems Europe Lt
d., Abingdon, UK)。ウェルにおけるFCSの最終濃度は2.5%であった。24時間の
インキュベーションの後、1μCiのトリチウム化されたチミジンをウェル当たり
添加し(25Ci/mモルの[メチル−3H]−チミジン、Amersham Life Science, Bucki
nghamshire, UK)、そしてさらに12時間インキュベートした(Grukeck−Loebens
tein B. など. (1989) J. Clin. Invest. 83: 764-770; Brennan FM など. (199
0) Clin. Exp. Immunol 81: 278-285)。
から除去し、そして細胞を破壊する手動収穫機(Titertek cell harvester, Ska
tron Instruments Inc., Sterling, USA)を用いて集め、ニトロセルロースフィ
ルター(Filter MAT 11731, Skatron Instruments Inc., Sterling, USA)にDNA
を集め、ここでそれを固定した。フィルターをそれぞれ、5mlのポリプロピレン
に配置し、これに、4mlのシンチレーション液体を添加した(Biogreen-11, Reac
tivos Scharlau S.A., Barcelona, Spain)。個々の管の活性を、βLKBシンチレ
ーションカウンター(Beta plate system, LKB, Uppsala, Sweden)により90秒
間、定量化した。細胞受容体へのTGFβ1の結合の阻害の調査 細胞受容体の選択的ラベリング(親和性ラベリング) MV−1−Lu細胞を、培養フラスコから除去し、それらを37℃で10分間、10mlの
溶液1(128mMのNaCl、5mMのKCl、25mMの4−(2−ヒドロキシエチル)−1−
ピペラジンエタンスルホネート、pH7.5, 5mMのグルコース及び1mMのEDTA) と共
にインキュベートした。このようにして除去された細胞を、溶液2(128mMのNaC
l, 5mMのKCl, 50mM の4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンス
ルホネート、pH7.5, 1.2mMのCaCl2, 1.2mMのMgSO4及び5mg/mlのBSA)に再懸濁し
、そして1000×gでの5分間の遠心分離により集めた。遠心分離の後、細胞を106
個の細胞/mlの濃度で溶液2に再懸濁した。
(Greiner GmbH, Frickenhausen, Germany)、ペプチドを、0.8mg/mlの溶液50μ
lで添加し、次にこれを撹拌しながら、4℃で2時間インキュベートした。次に
、125I−TGFβ1(2μCi)を添加し、277.2pMの最終濃度にし(125I−TGFβ1ヒ
ト組換え800−2200Ci/mモル、Amersham Life Science, Buckinghamshire, UK)
、そしてこれを撹拌しながら、4℃でさらに2時間インキュベートした。
間、冷却下で遠心分離した。次に、それらを冷溶液2により2度洗浄し、そして
0.5mlの冷溶液2、5μlのジメチルスルホキシド(DMSO 99% Sigma Chemical Co.
, St. Louis, USA)及びジスクシミジルスルベレート(DSS, Pierce Chemical C
o., Rockford, USA)に再懸濁し、最終濃度0.25mMのDSSを付与した。反応を、0.
25Mのサッカロース、10mMのトリム及び1mMのEDTA(pH7.4)を含む溶液により希
釈し、遠心分離及び洗浄により停止した。
(v/v), 10mMのトリス(pH7.0)、1mMのEDTA, 0.1mM のフェニルメチルスルホニ
ルフルオリド、1μg/mlのペプスタチン及び1μg/mlのロイペプチン(Sigma Ch
emical Co., St. Louis, USA)の溶液0.5mlに再懸濁し、そして4℃で40分間イ
ンキュベートした。界面活性剤において不溶性である画分を、12,000×gでの15
分間の遠心分離により分離した。海面活性剤において可溶性である画分(上清液
)及び不溶性である画分(沈殿物)を、−20℃で凍結した(Massague J. and Li
ke B. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2636-2645)。
時間のアクリルアミド/ビスアクリルアミドゲルにおける電気泳動による分析の
ために使用した。 タンパク質を、メタノール(50%)、酢酸(10%)及び蒸留水におけるクーマ
シーブリリアントブルー(商標)R250 (Serra Feinbiochemi ca gmbH, Heidelbe
rg, Germany) の溶液により30分間、染色した。続く洗浄を、第1の洗浄におい
ては、メタノール(50%)、酢酸(10%)及び蒸留水の溶液により15分間もたら
し、そして続く洗浄においては、メタノール(2.5%)、酢酸(0.5%)及び蒸留
水の溶液により、バックグラウンドの色が除去されるまで、もたらした。
免疫蛍光方法により測定した。免疫蛍光キットをこのために使用した(Fluoroki
ne rh TGFβ−ビオチン、R & D Systems Europe Ltd., Abingdon, UK)。子の試
験は、シグナル強度が細胞受容体に結合されるTGFβ1の量に依存するよう、特定
の態様での細胞受容体に結合するビオチニル化されたTGFβ1の能力、及びフルオ
レセインによりラベルされたアビジンとビオチンとの続く相互作用に基づかれて
いる。
載される)を用いて除去し、そして500×gで5分間の遠心分離のために生理食塩
水に再懸濁した。遠心分離の後、細胞を、4×106個の細胞/mlの濃度で生理食塩
水に再び再懸濁した。その細胞懸濁液25μlを、12×75mmの硼珪酸塩管に添加し
、これに、40μlのRPMI 1640培地における試験されるペプチド(0.42μg/μlの
最終濃度)及び10μlのビオチニルされたTGFβ1を添加した。
を添加し、10μlのビオチニル化されたTGFβ1を陽性の対照として添加し、そし
て20μlの抗−TGFβ1阻止抗体を負の対照として添加した。生理食塩水を、75μl
の合計体積が達成されるまで、すべての対照に添加した。すべての管を、暗室に
おいて、4℃で1時間インキュベートした。
ビジンを添加し、暗室において4℃で30分間インキュベートし、その後、2mlの
洗浄溶液(RDF1)を添加し、続いて500×gで6分間、遠心分離した。細胞沈殿物を
、細胞計測のために冷PBS0.2ml に再懸濁した(FACScan, Becoton Dickinson Im
munocytometry Systems, California, USA)。この方法は、レザー線がそれに対
して入射する場合、個々の細胞により発せられる蛍光のコンピュータープログラ
ム(Lisys(商標)II, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Californi
a USA)による測定を可能にする。図16は、流動細胞計測法による分析からの典
型的な像を示す。
を、TGFβ1−ビオチン(M2)及びラベルされていない細胞(M1)に結合している
、ラベルされた細胞に対応する領域の範囲を定めるために使用した。その領域の
範囲が定められると、それらの個々に位置する細胞の百分率を計算した。同じこ
とを、ペプチドがTGFβ1−ビオチン又は細胞と共にインキュベートされた場合に
得られるデータにより、それらがそれぞれ受容体又は又はTGFβ1のいずれかに由
来するかに依存して、行った。それらのデータにより、個々のペプチドの%阻害
率を次の式を用いて計算した:100−((M2ペプチド−M2陰性)×100/(M2陽性
−M2陰性))。
齢及び初期体重において均等であるグループを得るために使用した。実験を通し
て、動物は、明及び暗の12時間サイクルを伴って、一定温度(22℃)の条件下
に保持された。それらは、水及び食物を自由に得ることができた。
(Lopez Novoa JM など. (1976) Patologia IX: 223-240; Camps J. など. (198
7) Gastroenterology 93: 498-505)。CCl4への暴露は、ガス洗浄−ボトルを通
して、3l/分の流速で、圧縮された空気を泡立てることによってもたらされる。
1分間の暴露を、まず用い、4週目で4分に達するまで、週当たり1分づつ高め
た。
。この暴露時間を、11週目で維持した。400mg/lのフェノバルビタール(Lumina
l(商標), Bayer, Leverkusen, Germany)を、CCl4への暴露の開始の1週前か
ら、実験期間の最後まで、飲料水に添加した。処理の開始の前、1週間放置し、
ここでそれらはCCl4を投与されなかった。処理の間、それらは記録されるように
(図2)、毎週の用量のCCl4を投与された。
て最後の3週間、ペプチドp144を投与された動物(ラットTto2のグループの処理
と同時に起こる)。 硬変対照1(Ci1):週2度、CCl4の吸入により硬変の誘発工程にゆだねられ
た動物。それらの動物は、5週目に達すると、次の2つのグループに分離された
:
の誘発工程にゆだね続けられた動物。それらは、誘発工程(5週〜11週)を通し
て、塩溶液血清を1日おきに投与された。 治療された硬変1(Tto1):5週から11週まで、線維症の誘発工程の間、1日
おきに、タイプIII受容体の配列に由来するペプチドP144を投与された動物。 硬度対照2(Ci2):ペプチドP144又は塩溶液血清を受けないで、線維症の誘
発工程にゆだね続けた動物。このグループは、11週に達すると、さらに2つのグ
ループに細分割された。
ねられていない硬変動物。それらの動物は、3週間(13週〜15週まで)塩溶液血
清の注入を受けた。 治療された硬変2(Tto2):3週間(13週〜15週まで)、タイプIII受容体の
配列に由来するペプチドにより処理された硬変動物。
変誘発工程の11週目の最後まで続けた。 グループTto2:それらの動物は、硬変の誘発工程の完結の後(11週目)、処理
を受けた。処理は、CCl4の最後の吸入の1週間後、開始し、そして21日間続けた
。 処理の開始の前、及びその完結に基づいて、ペプチドにより処理されたすべて
の動物から血液を採取した。ペプチドを、生理食塩水500μl中、70μgの用量(
動物当たり)で、腹部領域における皮下注射により投与した。
理の完結に基づいて、毛細管を有する眼窩後方叢から採血した後、断頭により、
動物を、殺害した。 すぐにこれに続いて、肝臓を切開し、そしてサンプルを採取した。 サンプルを切断し、そして後での組織学的試験のために、固定溶液としてのホ
ルモルに配置した。他のフラグメントを、凍結管に配置し、これを液体窒素に含
浸し、そして次に、−80℃で貯蔵した。
ラグメントに対して行い、この後、それらをエタノール(70%)に配置した。 脱水の後、それらをパラフィンブロックに埋封した。3μmの厚さの連続的切
片を、Leitz回転ミクロトーム及び鋼製羽を用いて、得られたブロックから調製
した。染色の前、断片を、60℃でストーブにおいて15分間、それらを加熱した後
、15分間、キシレンにおいてパラフィン除去し(AnalaR, BDH, Poole UK)、そ
してそれらを、100%、96%、80%、及び70%の低下する濃度のアルコールに連
続的に通すことにより、そして最終的に水において水和化した。次の染料を使用
した: ヘマトキシリン−エオシン; Masson’s 三原色(Locquin M. and Langeron, (1985) Manual de Microscopi
a Ed. Labor S.A. Burcelona):コラーゲンタンパク質のための特定の染料の使
用(緑色光); Sirius Red: コラーゲンに対して特異的な染料。
ビデオカメラ(Sony DXP-950P, Sony Co., Tokyo, Japan)に連結された光顕微
鏡を使用した(Olympus BH-2, Tokyo, Japan)。6個の視野を、Sirius Red に
より染色された個々の調製物からランダムに採取した。獲得された種々の像を、
線維症の領域及び調製物の合計領域を計算するコンピュータープログラム(Visi
log 4.1.5, Noesis, Orsay, France)により分析した。
について計算した。このプログラムを使用できるためには、サンプル分析の工程
の自動化を可能にする、偏光された光フィルター(Olympus U-POT, Tokyo, Japa
n)及び緑光フィルター(Olympus IF550, Tokyo, Japan)を用いることによって
、像獲得を改良する必要がある。
。それらの切片を、キシレンにおいて12時間、パラフィン除去の工程にゆだねた
。パラフィンが除去されるとすぐに、サンプルを、それらを、96%、80%、50%
の異なった濃度のアルコールに通し、その工程を蒸留水において完結することに
より水和化した。
, Darmstadt, Germany)中、160mgのFast Green FCF (Fluka Chemika-BioChemik
a, Buchs, Switzerland) の溶液における予備染色の工程にゆだねた。サンプル
を、それらがもはや洗浄水を着色しなくなるまで、水への含浸により洗浄した。
過剰の染色が除去された後、サンプルを、160mlの飽和ピクリン酸中、160mgのDi
rect Red 80 (Fluka Chemika-BioChemika Buchs, Switzerland) 及び64mgのFast
Green の溶液において、暗室において30分間、染色した。それらを、過剰染色
を除去するまで、再び洗浄し、そして次に、サンプルを、小さなヘラによりサン
プルをこすることによってスライドから除去した。
Quimon, Montplet & Esteban S.A., Barcelona, Spain)3ml を含む別々の管に
配置した。0.1NのNaOH及びメタノールの溶液にアリコートをブランクとして用い
て、540nm及び630nmの波長で、分光計(Lambda 2 UV/VIS 分光計、Perkin-Elmer
, Norwalk, USA)による読み取りのために、種々の管からアリコートを採取した
(Lopez de Leon A. and RojKind (1985) Histochem. Cytochem. 33: 737-743;
Gaudio E. など. (1993) Int. J. Exp. Path. 74: 463-469)。
次の式を、コラーゲン及び合計タンパク質の量を見出すために使用した:
の正規性は、Shapiro−Wilks試験により確かめられた。 データは正常な分布に調節されていないので、非パラメーター統計学的分析を
採用した。グループ間の比較は、Kruskal-Wallis H, 続いてMann-Whitney Uの比
較によりもたらされた。データは、四分位数間領域(ボックスの高さ)と共に、
データのメジアン(個々のボックス内の濃い線)の表示を伴って、ボックスによ
りグラフ的に示され、そして個々のボックスの“ホイスカー(whiskers)”は、与
えられる四分位数間領域内の最高及び最低の観察を表す。
は、それらの変数の会合の独立性を調べるために使用された。 0.05に等しいか又はそれ以下のPの値は、有意として見なされた。 すべての統計学的分析は、Window V6.1.3のためのプログラムSPSSを用いて行
われた。
り(Grubeck−Loebenstein B. など. (1989) J. Clin. Invest. 83: 764-770; B
rennan FNなど. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81: 278-285)、従って、この系
はTGFβ1に対するペプチドのブロッキング効果を試験するために使用された。培
地、細胞及びチミジンの種々の組み合わせの後、本発明者は、試験のための最も
適切な条件を決定するために、培養におけるNV−1−Lu細胞による[メチル−3H]
は図3に示される。 最適濃度のMV−1−Lu細胞(5000個の細胞/ウェル)及び約90%の阻害率を生
成できる最小濃度のTGFβ1(200pg/ml;図18)の両者が決定されると、200μg/m
lの濃度での合成ペプチドの阻害効果が試験された。
れた、TGFβ1活性の実質的なインヒビターである合成ペプチド(TGFβ1に結合す
るタンパク質及びTGFβ1自体に由来するそれら)を、MV−1−Lu細胞系を用いて
試験した。ペプチドを、ウシ胎児血清を有さない緩衝されたRPMI培地に溶解し、
そして次の方法を使用した:
チドを、このサイトカインの存在下で30分間インキュベートし、そして次に、細
胞培養物と組合した。TGFβ1の配列に由来するペプチドを、それらは細胞表面の
受容体と相互作用するので、TGFβ1の添加の前、細胞培養物に添加した。それら
のインキュベーションは、細胞を添加するために使用されるのと同じ培地100μl
においてもたらされた。活性ペプチドは、TGFβ1を阻害するその能力に依存して
、高いか又は低い程度、細胞増殖を可能にした。
。それらのペプチド(表2)を、それらのいくつかが細胞受容体に結合し、従っ
てそれらの受容体への天然のTGFβ1の結合を妨げることを期待して合成した。 表2.TGFβ1由来のペプチド。ペプチドの番号が、その完全な配列におけるその
位置及びそのアミノ配列と共に示されている。合成を便利にするために、すべて
のペプチドは、表に示されないC−末端で付加されたアラニンにより合成された
。
TGFβ1はMV−1−Lu細胞の増殖を阻害するので、ペプチドによるこのサイトカイ
ンの阻害は、MV−1−Lu細胞の増殖の再確立を導く。 図4から見出され得るように、TGFβ1の配列に由来するペプチドP12は、TGFβ
1のより高い阻害活性を示すペプチドである。ペプチドP12の阻害効果のより詳細
な研究のためには、下記に記載される、サイトカインの阻害に対するペプチドの
濃度の効果についての研究が行われた。
ドは試験培地において容易に溶解できないので、原溶液又は懸濁液は公称濃度の
ペプチド(ペプチドが完全に溶解している場合に達成されている)により調製さ
れ、そしてアリコートがそれらから取られ、そして濾過され、又はさらに、阻害
試験のために直接的に使用された。
伴って及びそれを伴わないでのペプチドP12は実際的に同じ活性を有することが
見出され得る。 結果がペプチドP12により得られると、ペプチドを、N−末端及びC−末端方向
に延長し、そしてその活性に対する効果を調べることが決定された。さらに、そ
の溶解性を改良し、そしてTGFβ1の阻害活性に対するその配列における2個のシ
ステインの重要性を研究するために、その配列の変更が行われた。合成されるペ
プチドが表3に示される。
前に試験されたペプチドP12を包含し、そしてN−末端の方に9個の特別なアミノ
酸を有する(図4)。キメラ組換えタンパク質を用いて、Quian SWなど. (1992)
Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 6290-6294及びBurmester JK など. (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. 90: 8628-8632) により行われた調査は、このサイトカイン
の活性のために必要であるTGFβ1の領域(成熟TGFβ1の配列におけるアミノ酸40
〜82)を同定した。
ドP29(成熟TGFβ1の配列におけるアミノ酸34〜56)が、循環におけるTGFβ1の
構造のような立体構造を獲得できることが推測された。この理由のために、ペプ
チドP29は、親和性ラベリングに基づいて、細胞受容体への結合の試験のために
使用された。
グ) TGFβ1の配列に由来するペプチドP29を、その細胞受容体へのTGFβ1の結合の
阻害についてのその能力を確証するために親和性ラベリング試験に使用した(材
料及び方法)。 使用される一連の125I− TGFβ1の異なった活性のために、試験において使用
されるペプチドの濃度を、個々の場合に使用される一連の125I−TGFβ1の濃度に
従って調節した。それらの試験の結果は、図7及び8に示される。 さらなる試験を、細胞受容体への125I−TGFβ1の結合を阻止するために必要と
される最少濃度を見出すために行った。
イプIII受容体に由来するペプチドを合成した。TGFβ1の配列のアミノ酸阻止に
対する相補的であるものとして予測されるそれらの配列の領域に基づいて、いく
つかのペプチドを選択した。それらのペプチドが遊離TGFβ1に結合することが
でき、それを隔離し、そして細胞受容体へのその結合を妨げることが所望される
。
体の細胞外領域の一部(アミノ酸45〜410)をカバーすることによって合成した
。受容体の細胞外領域に対応する可溶性タイプIII受容体が存在することは、記
載されており、ここで前記領域は膜から切断され、そして循環におけるTGFβ1の
隔離体として作用する(Lopez Casillas F. など.(1991)Cell67:785−795)
。
1つは受容体のN−末端に位置し(Lopez-Casillasなど. (1994) J. Cell Biol.
124: 557-568)、そして他の1つはC−末端側の膜に最も隣接する領域に位置す
る(Fukushima D. など. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22710−22715;Pepin MC
など. (1995) FEBS Lett 377: 368-372)。それらの理由のために、この受容体
の細胞外領域のペプチドを、それらのペプチドが循環TGFβ1を隔離することがで
きる仮定に基づいて合成した。合成されるペプチドは表4〜6に示される。
びその配列が示される。P39〜P65はTGFβ1に対して相補的であるものとして測定
されるペプチドであり、そしてP66〜P138は受容体の細胞外領域をカバーするオ
ーバーラップするペプチドである。合成を便利にするために、すべてのペプチド
は、表に示されていないC−末端で付加されるアラニンにより合成した。
阻害するそれらの能力について試験した。TGFβ1はこの系の増殖を阻害すること
ができるので、ペプチドによるTGFβ1の阻害は、細胞増殖を再確立することがで
きた。それらの試験は、図9〜12に示される。 図9〜12に見出され得るように、MV−1−Lu細胞系の増殖を、高いか又は低い
程度に阻害することができる種々のペプチドが存在するが、しかしペプチドP54
のみがTGFβ1の活性をほとんど完全に阻害することができる。このペプチドのよ
り十分な調査を行うために、試験を、200pg/mlの固定された濃度のTGFβ1に対し
て異なった濃度のペプチドを用いて行った。
い溶解性の観点から、呼称濃度のペプチドを有する原液を、ペプチドP12の場合
に行われたようにして、調製し、そしてアリコートをそれらから取り、そして濾
過し、又はさらに、阻害試験について直接的に使用した。 図13は、濾過の前及び後、呼称濃度のペプチドの阻害効果を試験する。ペプチ
ドP54の濾液において測定できる阻害活性が存在しないことが見出され得る。
を確証した後、本発明者は、低い用量での溶解性及び従って、その活性を改良す
るために、P54の配列を基礎として取り、新規ペプチドを合成した。ヒトタイプI
II受容体に由来する2種のペプチドをまた合成した。それらのペプチドの1つ(
P144)は、ペプチドP54と同様である。他の1つのペプチド(P145)は、活性を
また示した、ラットのタイプIII受容体のペプチドP106に類似する。それらの新
規ペプチドは表7に示される。 表7.ペプチドP54(ペプチドP139〜P143)及びヒトタイプIII受容体(ペプチド
P144及びP145)の修飾に由来するペプチド。
り、その活性が濃度に依存するかどうかを試験するために行った(図15)。ペプ
チドの活性が試験に使用されるペプチドの濃度の低下と共に低下することが見出
され得る。
グ) ヒトタイプIII受容体の配列に由来するペプチドP144を、その細胞受容体へのT
GFβ1の結合の阻害についてのその能力を確証するために親和性ラベリング試験
に使用した(材料及び方法)。 使用される一連の125I− TGFβ1の異なった活性のために、試験において使用
されるペプチドの濃度を、個々の場合に使用される一連の125I−TGFβ1の濃度に
従って調節した。それらの試験の結果は、図15に示される。
、新規試験を、ペプチドP144を滴定するために行った。ペプチドは、125I− TGF
β1のモル濃度の2×105倍の濃度でその活性を失うことが観察された。 TGFβ1に結合する能力を有し、そしてTGFβ1に対して相補的であるとして予測さ
れる他のタンパク質に由来するペプチドによるTGFβ1の阻害:
を、この系列において合成した。 表8及び9.TGFβ1に結合することができる種々のタンパク質(タイプII受容体
P146、P149に対するフェチュインP147, P154に対するエンドグリンP150及びP179
に対するα2−マクログロブリンP155)に由来するペプチド。ペプチドの番号が
、完全な配列におけるその位置、そのアミノ酸配列及びその起源と共に示されて
いる。合成を便利にするために、すべてのペプチドは、表に示されないC−末端
で付加されるアラニンにより合成された。
した。しかしながら、Demetriou M. など. (1996) J. Biol. Chem. 271: 12755-
12761により活性的であるものとして記載されたペプチドP146及びP149は、この
試験のために使用される条件下で活性的であることが見出されなかった。 TGFβ1のその細胞受容体への結合に対する合成ペプチドの阻害効果の流動細胞計
測法による測定:
のペプチド及びタイプIII受容体からのそれらのペプチドを、細胞計測法により
、TGFβ1の細胞受容体への結合を阻害するそれらの能力を測定するために使用し
た。それらの試験においては、細胞を、アビジン−FITCを用いて検出されるであ
ろう、TGFβ1−ビオチンの添加の前、ペプチドと共にインキュベートする(材料
及び方法)。次に、アビジン−FITCにより放される蛍光を測定した:これは、細
胞に結合されるTGFβ1の量に直接的に比例し、そしてペプチドの活性に反比例す
るであろう。最も適切なペプチドにより得られる結果が図19及び表7に示される
。
つかのペプチドのTGFβ1の阻害活性(ペプチド濃度200μ/ml)と、流動細胞計測
法2を用いて測定されるその細胞受容体へのTGFβ1の結合の阻害(ペプチド濃度4
20μg/ml)との比較。
わかっているヒトタイプIII受容体の配列に由来するペプチドP144を、CCl4によ
る試験的硬変の誘発におけるその阻害効果を研究するためにラットにおけるイン
ビボ試験に使用した。
たり2度、11週間、四塩化炭素の注入により誘発する(Lopez Novoa JM など. (1
976) Patologia IX: 223-240: Camps J. など. (1987) Gastroenterology93: 49
8-505)。
により1日おきに投与した。図20及び21。 2.プロトコール2:ペプチドを、硬変が確立されると、すなわち硬変の誘発
の開始から12週目で、3週間、腹腔内経路により1日おきに投与した。図22及び2
3。
: 図36及び38は、Fast Green 及びDirect Redによる肝臓切片(動物当たり2個
)の染色、色彩の溶出及び分光計による読み取りにより測定される全コラーゲン
生成を示す(材料及び方法)(Lopez de Leon A. and Rojkind (1985) Histoche
m. Cytochem. 33: 737-743; Gaudio E. など。(1993)Int. J. Exp. Path. 74:
463-469)。
の像分析により測定されるコラーゲン生成を示す(材料及び方法)。 図20に見出され得るように、ペプチドP144により処理されたラットグループ(
Tto1)と硬変ラットの対照グループ(Ci1)との間の、合計タンパク質に対する
コラーゲンの割合の研究に基づく有意な差異が観察される(P<0.05)。図37にお
いては、ペプチドP144により処理されたラットのグループ(Tto1)と硬変ラット
の対照グループ(Ci1)との間の差異はまた、線維症の領域が調べられる場合、
有意である(P<0.001)。
変が確立されると、ペプチドP144により処理されたラットのグループ(Tto2)
と処理されていない硬変ラット(Ci2)との間の差異は、線維症を測定するため
の2種の技法のいずれかを用いる場合、有意ではない。 コラーゲンを測定するために使用される2種の技法を、個々の調製における調
査のための視野の選択のランダム性、及び従って、像分析の有効性を確かめるた
めに、線状回帰を用いて比較した(図24及び25)。
場合、R>0.85を有する2種の技法間の相互関係が存在する。これは、調査のため
の像の獲得が完全にランダムにもたらされたことを確証し、そして像分析により
得られたデータの有効性を確立する。 図26及び27は、硬変誘発工程の間に処理されたラット(Ci1及びTto1)の肝臓
から得られた、Sirius Red により染色された肝臓調製物からの10倍の倍率での
光顕微鏡により得られる像を示す。
後の像を示す。それらの改良は、像の品質を改良し、そしてそれらの自動試験を
促進するために、2種のフィルター、すなわち偏光された光及び緑色光の2種の
フィルターの適用から成る。 図26及び27は、硬変ラット(Ci1)から得られた像と、ペプチドP144により処
理されたラット(Tto1)から得られた像との間に差異が存在することを示す。
ると(プロトコール1)、CCl4による硬変の誘発工程の間(プロトコール1)よ
りも低い事実によるものであり、その結果、ペプチドP144による処理の効果がプ
ロトコール1においてよりもプロトコール2において明白に低い。 硬変の誘発の工程の最後での処理されていない硬変ラットのグループ(Ci1)
と、誘発の最後から4週目での処理されていない硬変ラット(Ci2)とを比較す
る場合、2種のグループ間に有意な差異(P=0.016)が存在(図28)することが
見出され、これは、硬変剤が除去される場合、硬変の部分的緩衝が存在すること
を示し、この観察は種々の業者により公開されている(Szende-Zなど. (1992) i
n Viro 6: 355-361: Columbano A (1996) Carcinogenesis 17: 395-400)。
るものであり得る。なぜならば、プロトコール2の動物は1日おきに3週間、単
に処理され、そしてプロトコール1の動物はそれよりも長い期間(1日おきに、
7週間)、処理されるからである。
インビトロ及びインビボで阻害することが可能であることを示す。将来、それら
のペプチドの生物学的活性を高めることは、非常に興味あるものであろう。これ
は、それらの配列の個々のアミノ酸を他の19個の個々のアミノ酸により組織的に
置換することによって達成され得る。より高い活性を有するペプチドが達成され
ると、生物における阻害剤の平均寿命を高めるために、そのミモトープ(McConn
ell-SJ (1994) Gene 151: 115-118; Steward-MW (1995) J. Viro. 69: 7668-767
3)を調製する必要がある。
胞へのTGFβ1の結合の阻害性を示す。A:ビオチニル化されたTGFβ1と共にイン
キュベートされ、そしてアビジン−FITCにより増殖せしめられた細胞の試験にも
とづいて得られた像;B:TGFβ1の添加を伴わないで、アビジン−FITCと共にイ
ンキュベートされた細胞に基づいて得られた像;C:0.42μg/mlの濃度で、ペプ
チドP144と共にインキュベートされる前、TGFβ1と共にインキュベートされ、そ
してアビジン−FITCにより増殖された細胞の試験に基づいて得られた像。発せら
れる蛍光は横軸上に示され、そして縦軸は蛍光の個々の値に対する細胞の数を示
す。TGFβ1−ビオチン及びアビジン−FITCによりラベルされた細胞(M1)及びラ
ベルされていない細胞(M1)に対応する領域がまた示されている。
の用量がラットに投与される場合を示し、そして黒の点線の矢印は、1回の毎週
の用量が存在する場合を示す。灰色の矢印は、ペプチドP144の投与を示す。A:
健康な対照;B:健康な対照+P144;B1:ペプチド70μg/日による;C:硬変;C1 :塩溶液による;C2:ペプチド70μg/日による;D:CCl4+フェノバルビタール
による硬変;D1+塩溶液;D2:+ペプチド70μg/日。
β1の濃度(pg/ml)で5000個の細胞/ウェルの密度で培養した。横軸:TGFβ1濃
度(pg/ml); 縦軸:c.p.m.
のペプチドは、200μg/mlの濃度で試験された。100%のTGFβ1の阻害率は、TGF
β1の不在下で得られるMV−1−Lu細胞の増殖に対応する。
プチドP12の存在下でのTGFβ1(200pg/ml)の活性の%阻害率を示す。
すべてのペプチドは、200μg/mlの濃度で試験された。100%のTGFβ1の阻害率は
、TGFβ1の不在下で得られるMV−1−Lu細胞の増殖に対応する。
。レーンC1:0.3μCiの活性に対応する0.16μMの濃度の125I− TGFβ1による細
胞のインキュベーションの効果(正の対照)。レーンC2:125I− TGFβ1の濃度
よりも10倍、高い濃度の非放射性TGFβ1による細胞のプレインキュベーションの
効果(負の対照)。レーンC3:プレインキュベーション125I− TGFβ1のモル濃
度よりも106倍、高い濃度でのペプチドP29によりもたらされた。ペプチドP29及
び非放射性TGFβ1の両者によるタイプI, II及び細胞受容体への125I− TGFβ1の
結合の阻害性が存在することが見出され得る。
。レーンC1〜C6:125I− TGFβ1の添加の前、異なった濃度(それぞれ、125I−
TGFβ1のモル濃度の106, 8×105, 6×105, 4×105, 2×105培)のペプチドP29に
よるMV−1−Lu細胞のプレインキュベーションの効果。レーンC7:125I−TGFβ1
の添加の前、ラベルされていないTGFβ1(125I− TGFβ1のモル濃度の102倍)に
よるMV−1−Lu細胞のプレインキュベーションの効果(負の対照)。レーンC8:
従来のプレインキュベーションを伴わないで、0.4μCiの活性に対応する0.42μM
の濃度の125I− TGFβ1によるMV−1−Lu細胞のインキュベーションの効果(正
の対照)。
TGFβ1(200pg/ml)の%阻害率を表す。すべてのペプチドは、200μg/mlの濃度
で試験された。100%のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−1−L
u細胞の増殖に対応する。
ドによるTGFβ1(200pg/ml)の%阻害率を示す。すべてのペプチドは、200pg/ml
の濃度で試験された。100%のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV
−1−Lu細胞の増殖に対応する。
ドによるTGFβ1(200pg/ml)の%阻害率を示す。すべてのペプチドは、200pg/ml
の濃度で試験された。100%のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV
−1−Lu細胞の増殖に対応する。
ドによるTGFβ1(200pg/ml)の%阻害率を示す。すべてのペプチドは、200pg/ml
の濃度で試験された。100%のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV
−1−Lu細胞の増殖に対応する。
ペプチドP54の存在下でのTGFβ1(200pg/ml)の活性の%阻害率を示す。
プチド(P144及び145)の修飾に由来する受容体ペプチドによるTGFβ1(200pg/m
l)の%阻害率を示す。すべてのペプチドは、200pg/mlの濃度で試験された。100
%のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−1−Lu細胞の増殖に対応
する。
β1(200pg/ml)の活性の%阻害率を示す。
。レーンC1:プレインキュベーションが125I− TGFβ1のモル濃度よりも106倍高
い濃度でのペプチドP144によりもたらされた。レーンC2及びC3:125I− TGFβ1
の濃度よりも10倍高い濃度の非放射性TGFβ1による細胞のプレインキュベーシ
ョンの効果(負の対照)。レーンC4及びC5:0.2μCiの活性に対応する0.1μMの
濃度の125I− TGFβ1による細胞のインキュベーションの効果(正の対照)。ペ
プチドP144及び非放射性TGFβ1の両者による細胞受容体への125I− TGFβ1の結
合の阻害が存在することが見出され得る。
ドグリン(P150〜P154)に由来するペプチドによるTGFβ1(200pg/ml)の%阻害
率を示す。すべてのペプチドは、200μg/mlの濃度で試験された。100%のTGFβ1
の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−1−Lu細胞の増殖に対応する。
)の%阻害率を示す。すべてのペプチドは、200μg/mlの濃度で試験された。100
%のTGFβ1の阻害率は、TGFβ1の不在下で得られるMV−1−Lu細胞の増殖に対応
する。
害率を示す。阻害は、個々のペプチドについてラベルされた細胞(蛍光を放す)
及びラベルされていない細胞(蛍光を放していない)の%を測定することによっ
て調べられた。
の投与の効果を示す。合計タンパク質の対するコラーゲンの割合は、縦軸上に示
される。横軸は、次の種々のラットグループを示す:Co=健康なラット;Co+P1
44=ペプチドP144により処理された健康なラット:Tto1=CCl4による硬度の誘発
にゆだねられ、そしてこの期間、1日おきにペプチドP144を投与されたラット;
及びCi1=11週間CCl4による硬変の誘発にゆだねられ、そしてペプチドP144によ
り処理されていないラット。
の投与の効果を示す。縦軸は、Sirius Redにより処理された組織調製物における
合計領域に対する線維症の領域の割合を示す。横軸は、次の種々のラットグルー
プを示す:Co=健康なラット;Co+P144=ペプチドにより処理された健康なラッ
ト:Tto1=CCl4による硬変の誘発にゆだねられ、そしてこの期間、1日おきにペ
プチドP144を投与されたラット;及びCi1=11週間CCl4による硬変の誘発にゆだ
ねられ、そしてペプチドP144により処理されていないラット。
44の投与の効果を示す。縦軸は、合計タンパク質に対するコラーゲンの割合を示
す。横軸は、次の種々のラットグループを示す:Co=健康なラット;Co+P144=
ペプチドP144により処理された健康なラット:Tto1=CCl4による硬度の誘発にゆ
だねられ、そしてこの期間、1日おきにペプチドP144を投与されたラット;及び
Ci1=11週間CCl4による硬変の誘発にゆだねられ、そしてペプチドP144により処
理されていないラット。
44の投与の効果を示す。縦軸は、組織調製物における合計領域に対する線維症の
領域の割合を示す。横軸は、次の種々のラットグループを示す:Co=健康なラッ
ト;Co+P144=ペプチドP144により処理された健康なラット:Tto1=CCl4による
硬度の誘発にゆだねられ、そしてこの期間、1日おきにペプチドP144を投与され
たラット;及びCi1=11週間CCl4による硬変の誘発にゆだねられ、そしてペプチ
ドP144により処理されていないラット。
領域に基づくデータの比較を示す。横軸は、像分析により得られる、合計領域に
対する線維症の領域の割合の値を示す。縦軸は、Direct Red 及びFast Green に
より染色された肝臓切片の分光分析により得られる、mg合計タンパク質に対する
μgコラーゲンの割合の値を示す。R2が示される。(F≦0.001)。
技法により得られた、コラーゲンの量及び線維症の領域に基づくデータの比較を
示す。横軸は、像分析により得られる、合計領域に対する線維症の領域の割合の
値を示す。縦軸は、Direct Red 及びFast Green により染色された肝臓切片の分
光分析により得られる、mg合計タンパク質に対するμgコラーゲンの割合の値を
示す。R2が示される。(F≦0.001)。
)により得られた24の視野の代表である像を示す。CCl4による硬変の誘発の最後
での硬変ラット(Ci1)及びCCl4による硬変の誘発の間、ペプチドP144により処
理された硬変ラット(Tio1)。異なった視野が個々の動物から得られた調製物か
ら取られた(R=ラット及びC=視野)。
)により得られた24の視野の代表である像を示す。CCl4による硬変の誘発の最後
での硬変ラット(Ci1)及びCCl4による硬変の誘発の間、ペプチドP144により処
理された硬変ラット(Tio1)。異なった視野が個々の動物から得られた調製物か
ら取られた(R=ラット及びC=視野)。偏光された光及び緑色フィルターが、コ
ラーゲン繊維を示すために使用された。
は、CCl4による硬変の誘発の12週間の最終での硬変ラットであり、そしてCi2は
、硬変の誘発の工程の最後から4週目での硬変ラットである。P=0.016。縦軸:
繊維症の領域/合計領域。
Claims (18)
- 【請求項1】 身体中での形質転換成長因子β1(TGFβ1)のその受容体へ
の結合のアンタゴニストであるペプチドであって、それらがTGFβ自体及び/又は
その受容体のアミノ酸配列に対して同一であるか又は類似する部分アミノ酸配列
を有することを特徴とするペプチド。 - 【請求項2】 配列番号1のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
1記載の活性ペプチド。 - 【請求項3】 配列番号2のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
1記載の活性ペプチド。 - 【請求項4】 配列番号3のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
1記載の活性ペプチド。 - 【請求項5】 配列番号4のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
1記載の活性ペプチド。 - 【請求項6】 配列番号5のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
1記載の活性ペプチド。 - 【請求項7】 配列番号6のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
1記載の活性ペプチド。 - 【請求項8】 配列番号7のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
1記載の活性ペプチド。 - 【請求項9】 配列番号8のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
1記載の活性ペプチド。 - 【請求項10】 配列番号9のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求
項1記載の活性ペプチド。 - 【請求項11】 配列番号10のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求
項1記載の活性ペプチド。 - 【請求項12】 請求項1〜11のいずれか1項に記載の活性ペプチドのミ
モトープ(mimotope)であって、それらがそれらに類似するアンタゴニスト効果
を示すが、しかし後者よりも身体中で長い平均寿命を示すことを特徴とするミモ
トープ。 - 【請求項13】 肝臓疾患への適用のための組成物の製造のための、請求項
1〜11のいずれか1項に記載の活性ペプチドの少なくとも1つのペプチド及び/
又はそれらのミモトープの少なくとも1つのミモトープの使用方法。 - 【請求項14】 請求項1〜11記載の活性ペプチドの少なくとも1つのペ
プチドをコードする少なくとも1つのDNAの、前記活性ペプチドのミモトープの
少なくとも1つを任意には含んで成る、肝臓疾患への適用のための組成物の製造
のためへの使用方法。 - 【請求項15】 請求項1〜11記載の活性ペプチドの少なくとも1つのペ
プチドをコードする少なくとも1つの組換え発現システムの、前記活性ペプチド
のミモトープの少なくとも1つを任意には含んで成る、肝臓疾患への適用のため
の組成物の製造のためへの使用方法。 - 【請求項16】 前記組換えシステムが欠陥アデノウィルスであることを特
徴とする請求項1記載の方法。 - 【請求項17】 前記組換えシステムがプラスミドであることを特徴とする
請求項15記載の方法。 - 【請求項18】 肝線維症への適用のための請求項13〜17のいずれか1
項記載の方法。
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