BR9915604B1 - peptÍdios antagonistas de inibidores de tgf-beta1 e seu uso. - Google Patents
peptÍdios antagonistas de inibidores de tgf-beta1 e seu uso. Download PDFInfo
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDIOSANTAGONISTAS DE INIBIDORES DE TGF-BETA1 E SEU USO".
Descrição do Estado da Técnica
O controle do crescimento celular é regulado por diferentesproteínas do grupo dos fatores de crescimento (Schlach D. S. et al. (1979)Endocrinology 104:1143-1151). Entre os fatores de crescimento mais im-portantes envolvidos no desenvolvimento celular, capazes de atuar de formaautócrina e parácrina, encontram-se os fatores de transformação do cresci-mento (TGF, do inglês "Transforming Growth Factor) (Braun L. et al., (1988)Cell Biol. 85:1539-1543; Lyons R. M. e Moses H. L. (1990) Eur. J. Biochem.187:467-473).
O termo TGF foi usado pela primeira vez para descrever a ativi-dade produzida por uma linha celular transformada com o vírus do sarcomamurino (deLarco J. E. e Todaro G. J. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. 75:4001-4005; Mizel S. B. et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. 77:2205-2208). O so-brenadante dessas células foi capaz de induzir o crescimento normal, emágar brando, de células que precisam de um suporte sólido para crescer.Estudos mais específicos evidenciaram duas classes de TGF, que foramdenominadas TGFa e TGFp, que por sua vez abrangem as famílias de pro-teínas relacionadas. A família do TGFp é formada por 5 isoformas (Brand T.e Schneider M. D. (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27:5-18) de estrutura dimérica(Schlunneger Μ. P. e Grutter M. G. (1992) Nature 358:430-434; Brand T. eSchneider M. D. (1995) J. Mol. Cell Cardiol. 27:5-18). Estudos das proteínasmaduras, purificadas a partir de uma mesma espécie, mostraram um alto grau de identidade entre suas seqüências (Tabela 1).
Tabela 1. Homologia entre os diferentes tipos de TGFps. TGFpI, TGFP2 eTGFp3 de humanos, TGFP4 de frango e TGFP5 de rã. (Roberts A. B. eSporn M. B., 1990).<table>table see original document page 3</column></row><table>
O TGFpi é sintetizado por um precursor de 390 aminoácidosdenominado Pre-Pro-TGFpi. Em uma primeira hidrólise é produzida a libe-ração de um fragmento hidrófobo de 29 aminoácidos, que dá lugar ao Pro-TGFpi. Em seguida o TGFpi maduro é liberado mediante outro corte emuma região que precede a extremidade amino do TGFpi e que é constituídade duas argininas, dando lugar a uma proteína de 112 aminoácidos de pesomolecular 12 kDa. Para dar origem à forma biologicamente ativa, dois des-tes monômeros se unem entre si por meio de pontes dissulfeto, obtendo-seum dímero de 25 kDa. As modificações desta estrutura provocam a perda dafunção biológica (Barnard J. A. et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032:79-87).
Conhece-se a existência de vários domínios dentro da estruturado TGFpi, um desses domínios está localizado entre os aminoácidos 40 e82 e está envolvido na união do TGFpi aos seus receptores celulares (Qui- an S. W. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 89:6290-6294; Burmester J. K.et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. 90:8628-9632).Receptores de TGFB1 e outras proteínas de união
Foram caraterizados cinco tipos de receptores específicos parao TGFpI (Cheifetz S. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:17225-17228 e López Casillas F. et al. (1991) Cell 67:785-795). Esses receptores têm afinidadesdistintas para os diferentes tipos de TGFpi Os receptores tipo I, Il e Ill sãoos mais conhecidos até o momento (revisado em Attisano L. et al. (1994)Biochim. Biophys. Acta 1222:71-80; Derynck R. (1994) Trends Biochem. Sei.19:548-553; Yingling et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1242:115-136). Também foram descritos receptores do tipo IV (MacKay K. e Danielpour D.(1991) J. Biol. Chem. 266:9907-9911) e do tipo V (Ichijo H. et al. (1991) J.Biol. Chem. 266:22459-22464). Também foi descrito que os domíniostransmembranosos e citoplasmáticos da endoglina (Cheifetz S. et al. (1992)J. Biol. Chem. 267:19027-19030; Bellón T. et al. (1993) Eur. J. Immunol.
23:2340-2345; Yamashita et al. (1995) J. Biol. Chem. 269:1995-2001; ZhangH. et al. (1996) J. Immunol. 156:564-573) têm em torno de 70% de analogiacom os receptores tipo Ill tanto humanos como de camundongo.
O Rlll seria o encarregado de unir o TGFpi e apresentá-lo aoRll que, por sua vez, formaria um complexo com Rl (Yamashita et al. (1994)J. Biol. Chem. 269:20172-20178) ou complexos nos quais várias moléculasde Rl se associam com o Rll (Weiss G. e Massagué J. (1996) EMBO J15:276-289). A interação Rll-Rl provocaria a fosforilação de Rl e a subse-qüente ativação de sua serina/treonina cinase que fosforilaria segundosmensageiros como as proteínas MADR2 (Macías-Silva M. et al. (1996) Cell87:1215-1224).
Papel do TGFB1 na diferenciação e regeneração hepática
Os efeitos produzidos são distintos e dependem da fase do des-envolvimento e do tipo celular.
Aumento da matriz extracelular, ao atuar sobre as células es-telares hepáticas (células de Ito), principal fonte de proteínas da matriz(Mustoe T. A. et al. (1987) Science 237:1333-1336).
Diferenciação das células epiteliais e hepatócitos (Florini J. R.et al. (1986) J. Biol. Chem. 261-16509-16513).
Inibição do crescimento celular durante o processo de regene-ração hepática. Este efeito é de grande importância na manutenção do re-pouso celular in vivo (Kato Y. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:9552-9556).
Inibição da endocitose do receptor do fator de crescimentoepitelial (EGF) como se pôde observar em culturas de hepatócitos fetais decamundongo (Noda M. e Rodan G. A. (1987) J. Cell Physiol. 133:426-437).Papel do TGFB1 na fibrose hepática
Foi observado que o TGFpi está associado aos processos defibrose hepática (Czaja M. J. et al. (1989) J. Cell Biol. 108:2477-2482; An-noni G. et al. (1992) J. Hepatol. 14:259-264) provocando um aumento daprodução das proteínas da matriz extracelular, pelas células estelares he-páticas (lipócitos ou células de Ito), de seus receptores e inibindo a síntesedas enzimas proteolíticas que degradam a matriz (Ignotz R. A. e MassaguéJ. (1986) J. Biol. Chem. 261:4337-4345). No fígado o TGFpI induz a síntesede colágeno e fibronectina nas células estelares hepáticas (Weiner F. R. (1990) Hepatology 11:111-117). Existe também uma auto-regulação aumen-tando sua própria síntese, mediante a indução de seu mRNA.
O TGFpi também está envolvido no aumento da síntese da a2-macroglobulina sintetizada pelos hepatócitos e células estelares hepáticasativadas. Mediante a união ao TGFpi e provocando sua inativação (Bachem M. G. (1994) Ann. NY Acad. Sei. 737:421-424) a cc2-macroglobulina elimina-ria o TGFpi dos compartimentos extracelulares.
Um estudo de pacientes com alguma lesão hepática crônicamostrou que existe uma correlação entre a expressão do TGFpi e a expres-são do mRNA para o procolágeno tipo I e os níveis séricos de peptídio tipoIll do procolágeno (Castilla A. et al. (1991) N. Engl. J. Med. 324:933-940).
Os pacientes com cirrose hepática têm uma expectativa de vidamais curta que o normal devido às complicações que aparecem durante aenfermidade, como hipertensão porta ou insuficiência hepática.Efeito do TGFB1 na matriz extracelular
A interação do TGFpi com os receptores celulares provoca:
Ativação da síntese de procolágeno, fibronectina (Ignotz R. A.et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:6443-6446) e proteínas relacionadas, entreas quais encontramos proteínas de membrana capazes de interagir com oscomponentes da matriz extracelular (Carter W. G. (1982) J. Biol. Chem.257:13805-13815).
Inibição da síntese de enzimas proteolíticas capazes de de-gradar a matriz (Fukamizu H. e Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282).
Estimulação da síntese de inibidores de enzimas proteolíticas(Fukamizu H. e Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282).
Tudo isso leva a um aumento das interações da célula com amatriz extracelular que, junto com a maior reorganização das proteínas quea compõem, dá lugar a um aumento da quantidade total de matriz extrace-lular (Roberts C. J. et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:4586-4592).
Essas evidências confirmam a implicação do TGFpI em proces-sos de cicatrização (Fukamizu H. e Grinnell F. (1990) Exp. Cell Res. 190:276-282; Barnard J. A. et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032:79-87).Peptídios como inibidores da interação ligando receptor
Existe a possibilidade de utilizar pequenas moléculas, peptídiossintéticos, como análogos de moléculas existentes no organismo, com a fi-nalidade de imitar sua função. Estudos realizados por LeSateur et al. de-monstram a possibilidade de usar análogos ciclados do fator do crescimentonervoso (NGF, do inglês "Nerve Growth Factor"), imitando a região da do-bradiça β, permitindo sua união ao receptor (LeSateur L. et al. (1996) NatureBiotechnology 14:1120-1122). Também é possível usar peptídios como an-tagonistas dessas moléculas, evitando que o fator nativo interaja com seureceptor por um bloqueio mediado pelo peptídio (Lasarte J. J. et al. (1994) J.Acquired Immune Deficiency Syndromes 7:129-134; LeSateur et al. (1995)J. Biol. Chem. 270:6564-6569). Estudos anteriores demonstraram a utilidadedos peptídios sintéticos como inibidores da interação ligando-receptor nocaso de o epítopo de reconhecimento não ser contínuo (Daniels A. J. et al.(1995) Mol. Pharmacol. 48:425-432). Outros estudos realizados com o re-ceptor tipo Il do TGFpi e com a fetuína, uma glicoproteína do grupo de re-ceptores tipo II, demonstraram a possibilidade de uso de peptídios cicladoscomo inibidores da interação do TGFpi com o Rll (Demetriou M. et al.(1996) J. Biol. Chem. 271:12755-12761). Com esta ciclagem pode-se obterpeptídios com estrutura similar àquela que se obteria in vivo.Descrição Detalhada da Invenção
Pelos motivos mencionados acima, acreditamos que peptídiosprovenientes tanto do TGFpi como de seus receptores, ou de proteínascom capacidade de união ao TGFpi, poderiam ser inibidores da ação doTGFpi. Por isso decidimos explorar esta possibilidade.
Escolha dos peptídios a serem sintetizados
A escolha dos peptídios a serem sintetizados foi feita de manei-ra diferente segundo a proveniência do TGFpi ou de seus receptores.
No caso da seqüência do TGFpi, foram sintetizados peptídiosde 15 aminoácidos que continham toda a seqüência do TGFpl Cada peptí-dio tinha 10 aminoácidos em comum com seus dois vizinhos imediatos.
No caso das seqüências de seus receptores, os peptídios foramescolhidos com base em programas de informática criados em nosso labo-ratório. Um desses programas permite comparar duas seqüências de ami-noácidos entre si, com a finalidade de prever zonas parcialmente comple-mentares. Também foram utilizados outros programas capazes de prever aszonas das proteínas que estariam mais expostas, com base na hidrofobici-dade e hidrofiIicidade dos aminoácidos que compõem sua seqüência.
Síntese de peptídios
Os peptídios foram sintetizados pelo método de fase sólida(Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soe. 85:2149-54), utilizando fluorenilmetilo-xicarbonila (Fmoc) como grupo protetor temporal do grupo alfa-amino(Atherton et al. (1989) Journal of Chemical Society Perkins Transactions1:538-546). Para a síntese de pequenas quantidades de um grande númerode peptídios foi utilizado um sintetizador múltiplo que permite a síntese si-multânea de 96 peptídios (Borrás-Cuesta et al. (1991) Biologicals 19: 187-190). Os peptídios foram conservados a -80°C no estado sólido até sua uti-lização.
Purificação dos peptídios por HPLC
Os peptídios sintetizados foram analisados e purificados porcromatografia líquida de alta pressão (HPLC), utilizando um sistema Waters600E-900 (Millipore Corp., Bedford, Estados Unidos).Para análise dos peptídios, por HPLC analítica, foi utilizada umacoluna Waters Radial-Pak™ Ci8 300 A 15 μm, 8 χ 100 mm (Millipore Corp.,Bedford, Estados Unidos). O peptídio foi dissolvido em uma solução de TFA0,1% em água destilada, a uma concentração máxima de 1 mg/ml. A solu-ção de peptídio foi injetada (100 μΙ) na coluna e eluída com um gradiente deágua/acetonitrila (figura 15) (Romil Ltd., Cambridge, Estados Unidos) ambascom 0,1% TFA a um fluxo de 1 ml/minuto. As frações que continham opeptídio foram detectadas por sua absorvência a 220 nm e 280 nm (photodiode array detector, waters 991, Millipore Corp., Bedford, Estados Unidos).
Para sua purificação foi utilizada uma coluna Waters Delta-Pak™ C18 300 A 15 μm, 25 χ 100 mm (Millipore Corp., Bedford, EstadosUnidos). O peptídio foi dissolvido e injetado nas mesmas condições que nocaso anterior, utilizando-se o mesmo gradiente a um fluxo de 5 ml/minuto. Afração que continha o peptídio puro foi recolhida em um matraz.
EXPERIMENTAÇÃO IN VITRO. ESTUDO DA ATIVIDADE DQS PEPTÍDIOS
Linhas celulares
Utilizou-se uma linha proveniente do epitélio do pulmão demarta, MV-1-Lu (CCL-64, American Type Cell Culture, Virgínia, Estados Uni-dos). As células foram cultivadas em frascos de cultura de 162 cm2 (CostarCorporation, Cambridge, Estados Unidos) em uma estufa a 37°C e 5% CO2,até atingir a subconfluência. Foi usado um meio completo: RPMI 1640 comL-glutamina (GibcoBRL, Life Technologies Ltd., Paisley, Escócia) suple-mentado com 5% de soro de bezerro fetal (FCS, Biological Industries, Ki-bbutz Beit Haemek, Israel), HEPES 10 mM (tampão HEPES 1 M, BioWhi-ttaker, Verviers, Bélgica) e antibióticos (penicilina 100 U/ml e estreptomicina100 μg/ml).
Ensaio de inibição do crescimento da linha celular MV-1-Lu
As células Μν-1-Lu desenvolvidas da maneira indicada acimaforam liberadas do fundo dos frascos de cultura utilizando-se 5 ml de tripsi-na-EDTA (Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel), foram ressus-pendidas em meio completo e centrifugadas a 1500 rpm durante 8 minutos.Depois da centrifugação as células foram ressuspendidas em meio completoa uma concentração de 50000 células/ml. Para a realização do ensaio foramtomados 10 ml da suspensão de células e distribuídos em placas de 96compartimentos de fundo plano (Costar Corporation, Cambridge, EstadosUnidos), sendo colocados 100 μΙ/compartimento, e incubados por uma noite a 37°C e 5% CO2, o que permite a adesão das células ao fundo dos com-partimentos. Depois de transcorrido esse tempo, os peptídios a serem anali-sados foram acrescentados ao RPMI, a uma concentração de 200 μς/ηηΙ napresença de uma concentração de 200 pg/ml de TGFpi em RPMI (R&DSystems Europe Ltd., Abingdon, Reino Unido). A concentração final de FCSno compartimento foi de 2,5%. Depois de 24 horas de incubação adicionou-se 1 μΰί de timidina tritiada por compartimento ([metil-3H]-timidina 25 Ci/mmol, Amersham Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido) e a misturaincubada por mais 12 horas (Grubeck-Loebenstein B et al. (1989) J. Clin.Invest. 83:764-770; Brennan F. M. et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:278-285).
Uma vez terminados os períodos de incubação, as células foramliberadas do fundo dos compartimentos com tripsina-EDTA e recolhidas uti-lizando-se um coletor manual (Titertek cell harvester, Skatron InstrumentsInc., Sterling, Estados Unidos) que lisa as células recolhendo o DNA em filtros de nitrocelulose (Filter MAT 11731, Skatron Instruments Inc., Sterling,Estados Unidos) onde se fixam. Os filtros foram colocados individualmenteem tubos de polipropileno de 5 ml aos quais foram adicionados 4 ml de lí-quido de cintilação (Biogreen-11, Reactivos Scharlau S.A., Barcelona, Es-panha). A atividade de cada tubo foi quantificada durante 90 segundos emum contador de cintilação β LKD (Beta plate system, LKB, Upssala, Suíça).Estudo da inibição da união do TGF31 aos receptores celularesMarcação seletiva dos receptores celulares (Affinity labelinq)
As células MV-1-Lu foram liberadas dos frascos de cultura porincubação das mesmas a 37°C por 10 minutos, com 10 ml da solução 1 (NaCI 128 mM, KCI 5 mM, 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfonato 25mM pH 7,5, glicose 5 mM e EDTA 1 mM). As células assim liberadas foramressuspendidas na solução 2 (NaCI 128 mM, KCI 5 mM, 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfonato 50 mM pH 7,5, CaCI21,2 mM, MgSO41,2 mM e 5mg/ml BSA) e recolhidas por centrifugação a 1000 χ g durante 5 minutos.Depois da centrifugação, as células foram ressuspendidas na solução 2 auma concentração de 106 células/ml.
A partir desta suspensão celular foram feitas alíquotas de 0,5 mlem placas de 24 compartimentos (Greiner GmbH, Frickenhausen, Alema-nha) às quais os peptídios foram adicionados em 50 μΙ de uma solução 0,8mg/ml, e incubadas por 2 horas a 4°C com agitação. Em seguida adicionou-se 125I-TGFpI (2 μΟ'ι) a uma concentração final de 277,2 pM (125I-TGFpihuman recombinant 800-2200 Ci/mmol, Amersham Life Science, Buckin-ghamshire, Reino Unido) e a mistura foi incubada por mais duas horas a4°C com agitação.
Depois da incubação, as células foram transferidas para umtubo-centrífuga onde foram centrifugadas a frio a 12000 χ g durante 1 mi-nuto. Em seguida, elas foram lavadas 2 vezes na solução 2 fria e ressus-pendidas em 0,5 ml de solução 2 fria, 5 μΙ de dimetil sulfóxido (DMSO99,5%, Sigma Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos) e dissuccimidil su-berato (DSS, Pierce Chemical Co., Rockford, Estados Unidos) dando umaconcentração final de 0,25 mM de DSS. A reação foi interrompida depois de15 minutos por diluição, centrifugação e lavagem com uma solução quecontém sacarose 0,25 M, Tris 10 mM e EDTA 1 mM a um pH 7,4. O precipi-tado de células foi ressuspendido em 0,5 ml de Triton X-100 (Bio-Rad Labo-ratories, Hercules, Estados Unidos) 1% v/v, Tris 10 mM pH 7,0, EDTA 1 mM,fluoreto de fenilmetilsulfonila 0,1 mM, pepsatina 1 μg/ml e Ieupeptina 1μg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos) e incubado durante40 minutos a 4°C. A fração insolúvel em detergente é separada por centrifu-gação a 12000 χ g durante 15 minutos. As frações solúveis em detergente(sobrenadante) e insolúveis (precipitado) são congeladas a -20°C (Massa-gué J. e Like B. (1985) J. Biol. Chem. 260:2636-2645).
Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico
As frações solúveis e insolúveis em detergente são usadas paraanálise eletroforética em géis de acrilamida/bisacrilamida a 7,5% durante 5 -6 horas a 220 volts.
A coloração das proteínas foi feita com uma solução de azul deComassie brilhante® R250 (Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg1 Ale-manha) em metanol 50%, ácido acético 10% e água destilada, durante 30 minutos. As lavagens posteriores foram feitas com uma solução de metanol50%, ácido acético 10% e água destilada durante 15 minutos em uma pri-meira lavagem, e metanol 2,5%, ácido acético 0,5% e água destilada naslavagens subseqüentes, até a eliminação da cor de fundo.Citometria de fluxo
A inibição da união do TGFpi, mediada pelos peptídios, aosreceptores celulares foi medida pelo método da imunofluorescência direta.Para tal utilizou-se um kit de imunofluorescência (Fluorokine rh TGFp-biotin,R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Reino Unido). Este ensaio tem porbase a capacidade de união do TGFpi biotinilado aos receptores celulares de forma específica e a subseqüente interação da biotina com avidina fluo-resceinada; de modo que a intensidade do sinal dependerá da quantidadede TGFpi unido aos receptores celulares.
As células MV-1-Lu cultivadas em frascos de 162 cm2 foram li-beradas usando-se a solução 1 (descrita anteriormente) e ressuspendidasem soro fisiológico para centrifugação a 500 χ g durante 5 minutos. Depoisda centrifugação as células foram novamente ressuspendidas em soro fisi-ológico a uma concentração de 4 χ 106 células/ml. 25 μΙ da suspensão ce-lular foram adicionados a tubos de silicato de boro de 12 χ 75 mm aos quaiso peptídio a ser analisado foi adicionado em 40 μΙ de meio RPMI 1640, dan- do uma concentração final de 0,42 μg/μl e 10 μΙ de TGFpi biotinilado. Comocontrole da especificidade foram adicionados 10 μΙ de um reagente biotini-lado fornecido com o kit, como controle positivo foram adicionados 10 μΙ deTGFpi biotinilado e como controle negativo foram adicionados 20 μΙ de umanticorpo de bloqueio anti-TGFpi. Soro fisiológico foi adicionado a todos os controles até se obter um volume total de 75 μΙ. Todos os tubos foram incu-bados por uma hora a 4°C no escuro.
Transcorrido o período de incubação, 10 μΙ de avidina flúores-ceinada foram adicionados e a mistura incubada por 30 minutos a 4°C noescuro, depois do que foram adicionados 2 ml de uma solução de lavagem(RDF1) e a mistura centrifugada a 500 χ g durante 6 minutos. O precipitadocelular foi ressuspendido em 0,2 ml de PBS frio para análise citométrica(FCAScan, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Califórnia, EstadosUnidos). Este procedimento permite medir a fluorescência emitida por cadacélula ao se incidir sobre a mesma um raio laser por meio de um programade computador (Lisys II, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Cali-fórnia, Estados Unidos). A figura 16 mostra uma imagem típica da análisepor citometria de fluxo.
Para obtenção dos dados de inibição da união do TGFpi aosreceptores utilizou-se o controle positivo do ensaio para delimitar os camposcorrespondentes às células marcadas (M2), que se uniram ao TGFpi-biotina, e as células não marcadas (M1). Uma vez delimitados os campos,calculou-se a percentagem de células que se encontravam em cada um. Omesmo foi feito com os dados obtidos quando se incubou o peptídio comTGFpi-biotina ou com as células, segundo provenientes dos receptores oudo TGFpi, respectivamente. Com esses dados foi calculada a percentagemde inibição de cada peptídio por meio da seguinte fórmula: 100 - ((M2 peptí-dio - M2 negativo) χ 100 /(M2 positivo - M2 negativo)).
EXPERIMENTAÇÃO IN VIVO. MODELO DE FIBROSE EXPERIMENTAL
Camundongos machos brancos (raça Wistar albina), de ninha-das simultâneas (5 semanas ± 1,5 semana), foram usados com a finalidadede obter um grupo de idade e peso inicial homogêneos. Durante o períododa experiência, os animais foram mantidos em condições de temperaturaconstante (22°C) e com um ciclo de luz/escuridão de 12 horas. Tiveramacesso livre à água e comida.
Cirrose hepática (CH) foi induzida por inalação de tetracloretode carbono, durante 11 semanas, duas vezes por semana (López Novoa J.M. et al. (1976) Patologia IX:223-240; Camps J. et al. (1987) Gastroentero-Iogy 93:498-505). Exposição a CCI4 foi feita borbulhando-se ar comprimido,a um fluxo de 3 litros/minutos, através de um vaso de lavar gases. Come-çou-se com um minuto de exposição, aumentado-se um minuto por semanaaté chegar a 4 minutos na quarta semana. Durante a quinta semana não seadministrou CCI4, recomeçando-se na sexta semana com uma exposição de5 minutos. Esse tempo de exposição foi mantido até a semana 11. 400 mg/lde fenobarbital (Luminal®, Bayer1 Leverkusen, Alemanha) foram adiciona-dos à água de beber, desde uma semana antes do início da exposição aCCI4 até o final do período de experiência. Antes de iniciado o tratamentoesperou-se uma semana, durante a qual não houve administração de CCI4.Relembrando, durante o tratamento os animais receberam uma dose sema-nal de CCI4 (figura 2).
Distribuição dos animais
Os animais foram distribuídos em 4 grupos antes de iniciado oprocesso de indução de cirrose hepática.
Controles sadios (Co): Animais que não foram submetidos aoprocesso de fibrose.
Controles sadios tratados (Co+P144): Animais que não foramsubmetidos ao processo de fibrose e receberam o peptídio P144 durante as3 últimas semanas (coincidindo no tempo com o tratamento do grupos decamundongos Tto2).
Controles cirróticos 1 (Ci): Animais submetidos ao processo deindução de cirrose por inalação de CCI4 duas vezes por semana. Na quintasemana esses animais foram separados em 2 grupos:
Controles cirróticos 1 (Cii): Animais que continuaram com o pro-cesso de indução de fibrose até a semana 11, sem receber o peptídio P144.
Receberam soro imunizado, em dias alternados, durante o processo de in-dução (semanas 5 a 11).
Cirróticos tratados 1 (Tto1): Animais que receberam o peptídioP144 proveniente da seqüência do receptor tipo III, em dias alternados, du-rante o processo de indução de fibrose, da semana 5 até a semana 11.
Controles cirróticos 2 (Ci2)'. Animais que continuaram com o pro-cesso de indução de fibrose sem receber o peptídio P144 nem soro imuni-zado. Na semana 11 este grupo foi subdividido em dois.Controles cirróticos 2 (C17): Animais cirróticos que não foramsubmetidos a nenhum tipo de tratamento, sendo mantidos como controles.Estes animais receberam injeções de soro imunizado durante 3 semanas(semanas 13 a 15).
Cirróticos tratados 2 (Tto2:): Animais cirróticos que foram trata-dos com o peptídio proveniente da seqüência do receptor tipo Ill (P144),durante 3 semanas (semanas 13 a 15).
Tratamento dos animais
. Grupo Tto1: Estes animais foram submetidos a tratamento du-rante o processo de fibrose. O tratamento com o peptídio foi iniciado naquinta semana (antes da exposição a CCI4, durante 5 minutos) e continuouaté completar as onze semanas do processo de indução de cirrose.
. Grupo Tto2: Estes animais foram submetidos a tratamento de-pois de concluído o processo de indução de cirrose (11 semanas). O trata-mento foi iniciado uma semana depois da última inalação de CCI4 e continu-ou por 21 dias.
Antes de iniciado o tratamento e ao término do mesmo colheu-se sangue de todos os animais submetidos ao tratamento com o peptídio. Opeptídio foi administrado por injeção subcutânea, na zona abdominal, a umadose de 70 μg/animal em 500 μl de soro fisiológico.Sacrifício dos animais e dissecção do fígado
Terminado o tratamento dos animais com o peptídio, tanto nomodelo com camundongos como naquele com ratos, os animais foram sa-crificados por decapitação, depois de colhido sangue do plexo retrorbitalcom um capilar.
A dissecação do fígado foi feita logo em seguida e amostrasforam recolhidas.
As amostras foram cortadas e introduzidas em formol como so-lução fixadora, para posterior análise histológica. Outros fragmentos foramintroduzidos em criotubos que, depois de imersos em nitrogênio líquido, fo-ram mantidos a -80°C.Avaliação anatomopatológica do fígado
O estudo histológico foi realizado em fragmentos de fígado pre-viamente fixados em formol durante pelo menos 24 horas, depois das quaisforam introduzidos em etanol (70%).
Depois da desidratação foi feita a inclusão em pedaços de para-fina. Nos pedaços obtidos foram feitos cortes em série de 3 μητι de espessu-ra, empregando um micrótomo de rotação Leitz e cutelos de ferro. Antes deserem coloridos, os cortes foram desparafinados em xilol (AnalaR, BDH1Poole, Reino Unido) durante 15 minutos, em seguida aquecidos a 60°C emuma estufa durante 15 minutos, e foram hidratados em etapas sucessivascom álcoois de concentração decrescente de 100%, 96%, 80% e 70% ter-minando com água. Foram feitas as seguintes colorações:hematoxilina-eosina.
Tricrômico de Masson (Locquin M. e Langeron (1985) em Ma-nual de Microscopía Ed. Labor S. A. Barcelona): utiliza um corante específi-co para proteínas colagenosas (verde luz).
vermelho sírio: coloração específica para colágeno.
Confirmação da fibrose hepática: análise de imagem
Para análise de imagem das amostras obtidas usou-se um mi-croscópio de luz (Olympus BH-2, Tóquio, Japão) conectado a uma câmerade vídeo (Sony DXP-950P, Sony Co., Tóquio, Japão), com a qual foramcaptados campos diferentes de cada preparação. 6 campos foram escolhi-dos aleatoriamente a partir de cada preparação tingida de vermelho sírio. Asdiferentes imagens captadas foram analisadas por um programa de compu-tador (Visilog 4.1.5, Noesis, Orsay, França) capaz de calcular a área de fi-brose e a área total da preparação. Com esses dados foi calculado o índicede fibrose (área de fibrose/área total) de cada campo. Para empregar esteprograma foi preciso modificar a aquisição das imagens utilizando-se filtrosde luz polarizada (Olympus U-POT1 Tóquio, Japão) e de luz verde (OlympusIF550, Tóquio, Japão), o que permitiu a automatização do processo de aná-lise das amostras.Detecção de colágeno em cortes de 14 um de tecido parafinado
Os cortes de 14 μηι utilizados para esta técnica foram obtidosda mesma maneira que os cortes de 3 μιτι anteriormente mencionados. Es-ses cortes foram submetidos a um processo de desparafinização durante 12horas em xilol. Uma eliminada a parafina, as amostras foram hidratadaspassando-se as mesmas por diferentes graus de álcool 96%, 80%, 50%, oprocesso sendo finalizado com água destilada.
Uma vez hidratadas, as amostras foram submetidas a um pro-cesso de pré-coloração em uma solução de 160 mg de Fast Green FCF(Fluka Chemika-BioChemika, Buchs, Suíça) em 160 ml de ácido pícrico(Merk, Darmstadt, Alemanha) saturado durante 15 minutos no escuro. Asamostras foram lavadas por imersão em água até não mais colorir a água delavagem. Uma vez eliminado o corante residual, as amostras foram manti-das no escuro por 30 minutos em uma solução de 160 mg de Direct Red 80(Fluka Chemika-BioChemika Buchs, Suíça) e 64 mg de Fast Green, os doiscorantes em 160 ml de ácido pícrico saturado. As amostras foram nova-mente lavadas até eliminação do corante residual e as amostras foram sol-tadas das paredes ("portas") por raspagem da amostra com uma espátulapequena. Os cortes soltos foram introduzidos em tubos diferentes que con-tinham 3 ml de uma solução de NaOH 0,1 N (Quimón, Montplet & EstebanS.A., Barcelona, Espanha) e metanol (1:1). Alíquotas dos diferentes tubosforam retiradas para leitura no espectrofotômetro (Lambda 2 UV/VIS spec-trophotometer, Perkin-Elmer, Norwalk, Estados Unidos) a comprimentos deonda de 540 nm e 630 nm usando-se como controle uma alíquota da solu-ção de NaOH 0,1 N e metanol (López de León A. e Rojkind (1985) Histo-chem. Cytochem. 33:737-743; Gáudio E. et al. (1993) Int. J. Exp. Path.74:463-469).
De acordo com os trabalhos de Gáudio E. et al. (1993) Int. J.Exp. Path. 74:463-469 foram utilizadas as seguintes fórmulas para obtençãodas quantidades de colágeno e proteína total:
mg colágeno = (absorvência a 540 nm - absorvência a 630 nm)/37
mg colágeno/mg proteína total = mg colágeno/(mg colágeno + mg proteínasnão colagenosas)
proteínas não colagenosas = absorvência a 630 nm/3
Tratamento estatístico dos resultados
Os dados obtidos na experiência in vivo foram submetidos àanálise estatística. A normalidade das variáveis quantitativas foi comprova-da pelo ensaio de Shapiro-Wilks.
Como os dados não se ajustavam a uma distribuição normal,fez-se uma estatística não paramétrica. A comparação entre os grupos foifeita pela H de Kruskal-Wallis seguida da comparação de U de Mann-Whitney. Os dados foram representados graficamente por caixas sendo re-presentada a média dos dados, linha cheia dentro de cada caixa, junto coma classe interquártica, altura da caixa, ao passo que as vinhetas de cadacaixa representam as observações mais altas e mais baixas dentro de umadeterminada classe interquártica.
A associação entre variáveis foi estudada por meio da provaexata de Fisher. Fez-se uma regressão logística para estudar a indepen-dência da associação dessas variáveis.
O valor de P menor ou igual a 0,05 foi considerado significativo.Todas as análises estatísticas foram feitas utilizando-se o pro-grama SPSS para Windows V 6.1.3.
INIBIÇÃO IN VITRO DA ATIVIDADE DO TGFpi
Ensaio de inibição do crescimento celular da linha MV-1-Lu
TGFpi é uma citocina capaz de inibir o crescimento in vitro dalinha celular MV-1-Lu (Grubeck-Loebenstein B. et al. (1989) J. Clin. Invest.83:764-770; Brennan F. M. et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81:278-285),motivo pelo qual esta linha foi utilizada para analisar o efeito bloqueadordos peptídios no TGFpi. Por meio de diferentes combinações de meios,células e timidina, foi estudado o efeito de diferentes concentrações deTGFpi na incorporação de [metil-3H] timidina, por parte das células MV-1-Luem cultura, até serem determinadas as condições mais adequadas para oensaio. Essas condições estão mostradas na figura 3.
Uma vez determinadas tanto a concentração ótima de célulasMV-1-Lu (5000 células/compartimento) como a menor concentração deTGFpi capaz de produzir uma inibição de cerca de 90% (200 pg/ml, figura18), o efeito inibidor dos peptídios sintéticos à concentração de 200 μς/ητιΙfoi analisado.
Inibição in vitro da atividade de TGFB1 por meio de peptídios sintéticos
Os peptídios sintéticos potencialmente inibidores da atividadede TGFpi1 escolhidos da forma indicada acima na seção: escolha dospeptídios a serem sintetizados (tanto os provenientes de proteínas que seunem ao TGFpi como os provenientes do próprio TGFpi) foram analisadosusando-se a linha celular MV-1-Lu. Os peptídios foram dissolvidos em meioRPMI tamponado, isento de soro de vitela fetal e procedeu-se como a se-guir:
Os peptídios pertencentes à seqüência do receptor, ou comple-mentares aos picos de hidrofilicidade do TGFpi, foram incubados por 30minutos na presença desta citocina e imediatamente se agregaram à culturade células. Os peptídios da seqüência do TGFpi foram adicionados à cultu-ra de células antes da adição do TGFpi para interagirem com os receptoresda superfície celular. Estas incubações foram feitas em 100 μΙ do mesmomeio utilizado para adicionar as células. Os peptídios ativos permitiram ocrescimento celular em maior ou menor proporção segundo sua capacidadede inibir o TGFpI.
Inibição do TGFB1 pelos peptídios do TGFB1
Em uma primeira etapa foram sintetizados peptídios superpos-tos provenientes do TGFpi Esses peptídios (Tabela 2) foram sintetizadosporque se acreditava que algum deles poderia se unir aos receptores celu-lares, impedindo assim a união do TGFpi natural a esses receptores.Tabela 2. Peptídios provenientes do TGFpi. O número do peptídio está in-dicado junto à sua posição na seqüência completa, bem como sua seqüên-cia de aminoácidos. Por comodidade de síntese, todos os peptídios foramsintetizados com uma alanina acrescentada na extremidade C-terminal quenão está indicada na tabela.<table>table see original document page 19</column></row><table>
A figura 4 mostra o efeito inibidor dos peptídios da Tabela 2 naatividade do TGFpi. Visto que o TGFpi inibe o crescimento das células MV- 1-Lu, a inibição desta citocina pelos peptídios ajuda o restabelecimento docrescimento das células MV-1-Lu.
Como pode ser observado na figura 4, o peptídio P12, proveni-ente da seqüência do TGFpi, é aquele que apresenta maior atividade inibi-dora de TGFpi Com a finalidade de estudar mais detalhadamente o efeitoinibidor do peptídio P12, foi realizado um estudo do efeito da concentraçãodo peptídio na inibição de citocina, o qual está descrito abaixo.Ensaio dose-resposta da inibição de TGFB1 pelo peptídio P12
Estudou-se o efeito da concentração do peptídio P12 na inibiçãoda atividade do TGFpi Como este peptídio não foi facilmente solúvel nomeio de ensaio, foram preparadas soluções ou suspensões mãe de con-centração nominal de peptídio (aquela que seria obtida caso o peptídio hou-vesse dissolvido completamente) e das mesmas foram tomadas alíquotasque foram filtradas ou usadas diretamente nos ensaios de inibição.
A figura 5 estuda o efeito inibidor de concentrações nominais depeptídio, antes e depois da filtração. Observa-se que os peptídios P12 filtra-dos e não-filtrados têm praticamente a mesma atividade.
Uma vez obtidos os resultados com o peptídio P12, decidiu-seampliar o peptídio tanto no sentido N-terminal como no sentido C-terminal eestudar o efeito disso em sua atividade. Além disso, foram feitas modifica-ções em sua seqüência para melhorar sua solubilidade e estudar a impor-tância das duas cisteínas de sua seqüência sobre a atividade inibidora doTGFpi Os peptídios sintetizados estão indicados na Tabela 3.
Tabela 3. Peptídios provenientes da modificação do peptídio P12
<table>table see original document page 20</column></row><table>A figura 6 mostra os resultados da inibição do TGFpi pelospeptídios da Tabela 3.
Observa-se na figura 6 que o peptídio P29 é ativo. Este peptídioengloba o peptídio P12 testado anteriormente e tem 9 aminoácidos na dire-ção da extremidade N-terminal (figura 4). Estudos realizados por Quian S.W. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 89:6290-6294 e por Burmester J. K. etal. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. 90:8628-8632 utilizando proteínas quiméri-cas recombinantes identificaram uma região do TGFpi necessária para aatividade desta citocina (aminoácidos 40 a 82, na seqüência do TGFpI ma-duro). Especulou-se que o peptídio P29 (aminoácidos 34 a 56, na seqüênciado TGFpi maduro), por compreender uma zona maior que o peptídio P12(aminoácidos 43 a 56), poderia adquirir uma estrutura tridimensional maissemelhante à estrutura do TGFpi em circulação. Por este motivo o peptídioP29 foi usado para ensaios de união aos receptores celulares, com base namarcação por afinidade.
Ensaios de inibição da união do TGFB1 a seus receptores pelo peptídio P29(marcação por afinidade)
O peptídio P29 da seqüência do TGFpi foi usado nos ensaiosde marcação por afinidade para comprovar sua capacidade de inibição daunião do TGFpi aos seus receptores celulares (Material e Métodos).
Devido à diferente atividade dos lotes de 125I-TGFpi emprega-dos, as concentrações de peptídio usadas nos ensaios foram ajustadas emfunção da concentração do lote de 125I-TGFpi usado em cada caso. Os re-sultados desses ensaios estão mostrados nas figuras 7 e 8.
Foram realizados ensaios posteriores para verificar qual a con-centração mínima necessária para bloquear a união do 125I-TGFpi aos re-ceptores celulares.
Inibição do TGFB1 pelos peptídios da seqüência do receptor tipo Ill de ca-mundongo
Com a finalidade de encontrar novos peptídios inibidores da ati-vidade do TGFpi, foram sintetizados peptídios provenientes do receptor tipoIll de camundongo. Alguns peptídios foram escolhidos com base nas zonasde sua seqüência que foram previstas como complementares a resíduos deaminoácidos da seqüência do TGFpI. Esperava-se que esses peptídiosfossem capazes de se unir ao TGFpi livre, seqüestrando o mesmo e impe-dindo sua união aos receptores celulares.
Outros peptídios foram sintetizados sobrepondo 10 aminoácidose cobrindo parte da zona extracelular do receptor tipo Ill (aminoácidos 45 a410). Foi descrito que existe um receptor tipo Ill solúvel que corresponde àzona extracelular do receptor, esta zona é separada da membrana e agecomo seqüestrante do TGFpi em circulação (López Casillas f. et al. (1991)Cell 67:785-795). Estudos posteriores descreveram duas possíveis zonasde união ao TGFpI, sendo que uma delas fica na extremidade N-terminal doreceptor (López-Casillas et al. (1994) J. Cell Biol. 124:557-568) e a outrafica na zona mais próxima da membrana, na direção da extremidade C-terminal (Fukushima D. et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:22710-22715; PepinM. C. et al. (1995) FEBS Lett 377:368-372). Por esses motivos foram sinteti-zados peptídios da zona extracelular deste receptor supondo-se que essespeptídios poderiam ser capazes de seqüestrar o TGFpi circulante.
A Tabela 4 mostra os peptídios sintetizados.Tabela 4. Peptídios provenientes do receptor tipo Ill de camundongo. Estãoindicados o número do peptídio e sua seqüência. P39 a P65 são peptídiosprevistos como complementares do TGFpi e P66 a P138 são peptídios su-perpostos que cobrem a região extracelular do receptor. Para comodidadede síntese, todos os peptídios foram sintetizados com uma alanina acresci-da na extremidade C-terminal não indicada na tabela.Peptídio_Seqüência
AsnProIleAlaSerValHisThrHisHisLysProValPheLeuLeuAsnSerProGlnProLeuVaITrpSerProGlnProLeuValTrpHisLeuLysThrGluProGlnProLeuVa ITrpHisLeuLysThrGluArgTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSerProlIeValProSerVaIGlnLeuLeuProAspHisGlyAspGluGlyGluThrAlaProLeuSerArgAlaLeuSerArgAlaGlyVal ValValPheAsnCysSerLeuPheLeuValProSerProGlyVaIPheSerValLeuValProSerProGlyValPheSerValAlaGluGluLeuThrLeuCysSerArgLysLysGlySerLeuSerArgLysLysGlySerLeuLysLeuProArgCysSerLeuLysLeuProArgCysValThrProAspAspArgCysValThrProAspAspAlaCysThrSerLeuAspAspAlaCysThr SerLeuAspAlaThrMet I IeThrserLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetSerLeuAspAlaThrMetIleTrpThrMetMetGlnMetlleTrpThrMetMetGlnAsnLysLysThrPheMetGlnAsnLysLysThrPheThrLysProLeuAlaThrPheThrLysProLeuAlaValValLeuGlnValLysGluAsnValProSerThrLysAspSerSerProlIeProProSerThrLysAspSerSerProIleProProProProProGlnlleSerProIleProProProProProGlnlIePheHisGlyLeuAspProProProGlnlle PheHisGlyLeuAspThrLeuThrValMetPheHisGlyLeuAspThrLeuThrvalMetGlyIleAlaPheAlaThrLeuThrValMetGlyIIeAlaPheAlaAlaPheValIleGlyLeuLeuThrGlyAlaLeuTrpTyrIleTyrSerHisLeuMetGluSer PheThr Vc-ILeuSerGlyCysAla Ser ArgGlyThrValLeuSerGlyCy sAlaSer ArgGlyThrThrGlyLeuProCy SAlaSerArgGlyThrThrGlyLeuProArgGluVaIHisValThrThrGlyLeuProArgGl u ValHisValLeuAsnLeuArgSerArgGluValHisValLeuAsnLeuArgSerThrAspGlnGlyProLeuAsnLeuArgserThrAspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgThr AspGlnGlyProGlyGlnArgGlnArgGluValThrLeuHisGlyGlnArgGlnArgGluvalThrLeuHisLeuAsnProIleAla
P 39 (91-10; ; P40UO4. P4 1 (109- 120;P42U10. P43 .333- •344:P4 4u:8. Ί.-ilP4 5(5„. •5£c!P46i563. -S"1; ιP47(603. •61 íiP4 8 (605- -íit)P49(7C7. -715)P50(712. •7:3)P51í717- -7:6)P52(722. -733)P53 (727. -736)P54(731. -7C)P55 ( 732· -743)P56(737. -748 iP57 (742, -7s:iP58 (747. -75SIP59i761. -77Ϊ)Peo1766 -7B0)P61 !771 -785)P62(776 -7S0)P63(7b1 -75Ξ)P64(786 -8Cl·)P65(797 -80») 591P67(50. 64!P68(55. 6<fiP69(60. ' 4}P70(6s. •7»;P71 (70- •84)P72 (75. 85;Ρ73(80. <14.<table>table see original document page 24</column></row><table>P106,2„.,:í; SerAsnProTyrSerAla PheGlnValAsp I Ie I IeVa IAspIle
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P121i320.3j,, Arg AspAspIle Pr OSerThrGlnGluAsnLeuMet LysTrpAl a
P122(335_339, SerThrGlnGluAsnLeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyr
PP123,33o-34íl LeuMetLysTrpAlaLeuAspAsnGlyTyrArgProValThrSer
p12403s-3«s) LeuAspAsnGlyTyrArgProValThr SerTyrThrMetAlaPro
P125,3,0.3i4, ArgProValThr SerTyrThrMetAlaProValAlaAsnArgPhe
P126131S.359) TyrThrMetAla ProVa IAlaAsnArgPheHisLeuArgLeuGlu
P127(350.364) ValAlaAsnArgpheHisLeuArgLeuGluAsnAsnGluGluMet
P128 , 355-3£9, HisLeuArgLeuGluAsnAsnGluGluMetArgAspGluGluVal
P129(360.374, AsnAsnGluGluMetArgAspGluGluValHisThr Ile ProPro
P130(365.3„, ArgAspGluGluValHisThrI Ie ProProGluLeuArg I IeLeu
p!31 (370-3B4) HisThr I Ie ProProGluLeuArg I IeLeuLeuAsp ProAspHis
pl32 ms-ae») GluLeuArgI IeLeuLeuAspProAspHis ProProAlaLeuAsp
pl33 (390-394) LeuAspProAspHis Pro ProAlaLeuAspAsn ProLeuPhePro
P134(3e5.39S) Pro ProAlaLeuAspAsnProLeuPhe ProGlyGluGlySer Pro
P13 5,390-400 AsnProLeuPheProGlyGluGlySer ProAsnGlyGlyLeuPro
P136,395.40S) GlyGluGly Ser ProAsriGlyGlyLeuProPhe ProPheProAsp
pl37,400_„„ AsnGlyGlyLeuProPheProPheProAspIleProArgArgGly
P138 <405-«». PhePro PheProAspI Ie ProArgArgGlyTrpLysGluGlyGlu
Os peptídios da Tabela 4 foram analisados quanto a sua capa-cidade de bloquear o TGFpI no modelo de inibição da linha celular MV-1-Lu. Como o TGFpi é capaz de inibir o crescimento desta linha, a inibição doTGFpI pelos peptídios seria capaz de restabelecer o crescimento celular.
Esses ensaios estão mostrados nas figuras 9 a 12.
Como pode ser visto nas figuras 9 a 12, existem vários peptídioscapazes de inibir em maior ou menor extensão o crescimento da linha celu-lar MV-1-Lu, embora somente o peptídio P54 seja capaz de inibir quase quecompletamente a atividade do TGFpl Com a finalidade de realizar um es-tudo mais profundo sobre este peptídio, foram realizados ensaios usandodiferentes concentrações de peptídio face a uma concentração fixa deTGFpI de 200 pg/ml.
Ensaio dose-resposta da inibição do TGFpI pelo peptídio P54
Foi estudado o efeito da concentração do peptídio P54 na inibi-ção da atividade do TGFpI. Devido a pouca solubilidade deste peptídio fo-ram preparadas soluções mãe de concentração nominal de peptídio, damesma maneira que no caso do peptídio P12, e delas foram retiradas alí-quotas que foram filtradas ou então usadas diretamente nos ensaios de ini-bição.
A figura 13 estuda o efeito inibidor de concentrações nominaisde peptídio, antes e depois da filtração. Observa-se que o filtrado do peptídioP54 não tem atividade inibidora mensurável.
Uma vez comprovada a capacidade do peptídio P54 para inibir aatividade do TGFpi de forma dependente da dose usada procedeu-se à sín-tese de novos peptídios, tomando por base a seqüência do P54, com o pro-pósito de tentar melhorar a solubilidade e com isso sua atividade a dosesmais baixas. Também foram sintetizados dois peptídios provenientes do re-ceptor tipo Ill humano. Um desses peptídios (P144) é equivalente ao peptí-dio P54. O outro peptídio (P145) é similar ao peptídio P106 do receptor tipoIll de camundongo que também havia mostrado atividade. Esses novos pep-tídios estão indicados na Tabela 5.
Tabela 5. Peptídios provenientes da modificação do peptídio P54 (peptídiosP139 a P143) e do receptor tipo Ill humano (peptídios P144 e P145)
<table>table see original document page 26</column></row><table>O ensaio de atividade dos peptídios da Tabela 5 está indicadona figura 14.
Ensaio dose-resposta da inibição do TGFB1 pelo peptídio P144
Foi realizado um ensaio dose-resposta com o peptídio P144proveniente da seqüência do receptor tipo Ill humano com a finalidade dedemonstrar se sua atividade era dependente da concentração (figura 15).Pode-se observar que a atividade do peptídio é reduzida à medida que sediminui a concentração de peptídio usada nos ensaios.
Ensaio de inibição da união do TGFB1 aos seus receptores pelo peptídioP144 (marcação por afinidade)
O peptídio P144 proveniente da seqüência do receptor tipo Illhumano foi usado nos ensaios de marcação por afinidade para comprovarsua capacidade de inibição da união do TGFpi aos seus receptores celula-res (Material e Métodos).
Devido a diferente atividade dos lotes de 125I-TGFpi emprega-dos, as concentrações de peptídio usadas nos ensaios foram ajustadas emfunção da concentração do lote de 125I-TGFpi usado em cada caso. Os re-sultados desses ensaios estão mostrados na figura 15.
Uma vez comprovada a inibição da união do TGFpi aos seusreceptores celulares pelo peptídio P144, foi realizado um novo ensaio com afinalidade de titular o peptídio P144. Foi observado que o peptídio perdiasua atividade a uma concentração de 2 χ 105 vezes maior que a concentra-ção molar de 125I-TGFpi.
Inibição do TGFB1 por peptídios provenientes de outras proteínas com ca-pacidade de se unir ao TGFB1 e previstos como complementares ao TGFB1Nesta série foram sintetizados os peptídios da Tabela 6 prove-nientes de proteínas capazes de se unir ao TGFpi.
Tabela 6. Peptídios provenientes de proteínas distintas capazes de se unirao TGFpI (receptor tipo Il P146, fetuína P147 a P149, endoglina P150 aP154 e a2-macroglobulina P155 a P179). Estão indicados o número dopeptídio junto com sua posição na seqüência completa, sua seqüência deaminoácidos bem como sua procedência. Para comodidade de síntese, to-dos os peptídios foram sintetizados com uma alanina acrescida na extremi-dade C-terminal não indicada na tabela.
<table>table see original document page 28</column></row><table>P172 'IOOS- 1016· IleGlyTyrLeuAsnThrGlyTyrGlnArgGlnLeu α 2 -MacrcglobulinaP173 1062- 10731 LysArgLysGluValLeuLysS erLeuAsnGluGlu (X2 -MacroglobulinaP174 :193- 1204 VaIGlyHisPheTyrGluProGlnAl aProSerAla 0C2 -MacroglobulinaP!75 :: 09- ir: o: ThrSerTyrVaILeuLeuAlaTyrLeuThrGlnAla 0C2 -MaeroglobulinaP176 TyrvalLeuLeuAlaTyrLeuThrAlaGlnProAla 0C2 -MacroglobulinaP177 :;SÓ· 12Õ7' Va 1 AlaLeuHi s AlaLeuSerl.ysTyrGlyAl aAla <X2 -MacroglobulinaP178 »2J2 Í2J3. TyrG IyArgAsnGlnGlvAsnTh rTrpLe uThr Al a CC2 -MacroglobulinaP179 123*· 1245: ArgAsnGlnGlyAsnThrTrpLeuThrAlaPheVal C12 -Macroglobulina
As figuras 17 e 18 indicam a atividade inibidora dos peptídiosmostrados na Tabela 6.
Como pode ser observado nas figuras 17 e 18, somente o peptí-dio P150 apresentou atividade superior a 50%. Todavia, os peptídios P146 eP149 descritos como ativos por Demetriou M. et al. (1996) J. Biol. Chem.271:12755-12761 não se mostraram ativos nas condições usadas para esteensaio.
Medição por citometria de fluxo do efeito inibidor de peptídios sintéticos na união do TGFB1 aos seus receptores celulares
Peptídios proveniente de sínteses anteriores, tanto os sintetiza-dos a partir da seqüência do TGFpi como aqueles do receptor tipo III, foramusados para medir, por citometria de fluxo, sua capacidade inibidora da uni-ão do TGFpi aos receptores celulares. Nestes ensaios, as células foram incubadas com o peptídio antes de se adicionar a TGFpi-biotina que serárevelada usando avidina-FITC (Material e Métodos). Em seguida mede-se afluorescência emitida pela avidina-FITC, que será diretamente proporcional àquantidade de TGFpi unido às células e inversamente proporcional à ativi-dade do peptídio. A figura 19 e a Tabela 7 indicam os resultados obtidoscom os peptídios mais importantes.
Tabela 7. Comparação da atividade inibidora do TGFpi, de alguns peptídios,medida pelo bioensaio de inibição do crescimento das células MV-1-Lu1(concentração de peptídio 200 μg/ml) com a inibição da união do TGFpi aosseus receptores celulares medida por citometria de fluxo2 (concentração de peptídio 420 μg/ml).<table>table see original document page 30</column></row><table>
INIBIÇÃO IN VIVO DA ATIVIDADE DO TGF61
O peptídio P144 proveniente da seqüência do receptor tipo Illhumano, que havia se mostrado ativo nos bioensaios de inibição do cresci-mento da linha celular MV-1-Lu, foi utilizado nos ensaios in vivo para estudode seu efeito inibidor na indução de cirrose experimental com CCI4, em ummodelo de camundongos.
Modelo de cirrose experimental em camundongos Wistar
Neste modelo a cirrose hepática foi induzida mediante inalaçãode tetracloreto de carbono, por 11 semanas, duas vezes por semana (LópezNova J. M. et al. (1976) Patologia IX:223-240; Camps J. et al. (1987) Gas-troenterology 93:498-505) conforme indicado em Material e Métodos.
O peptídio P144 foi administrado de acordo com dois protocolos:1. Protocolo 1. O peptídio foi administrado em dias alternadospor via intraperitoneal durante o processo de indução da cirrose (11 sema-nas). Figuras 20 e 21.
2. Protocolo 2. O peptídio foi administrado em dias alternados por via intraperitoneal durante 3 semanas, uma vez estabelecida a cirrose,isto é, a 12 semanas do início da indução da cirrose. Figuras 22 e 23.
A produção de colágeno nos dois protocolos foi medida por duastécnicas.
As figuras 24 e 25 mostram a produção de colágeno total medi- da por coloração de cortes de fígado (dois por animal) tingidos com FastGreen e Direct Red, eluição da cor e leitura em espectrofotômetro (Material eMétodos) (López de León A. e Rojkind (1985) Histochem. Cytochem. 33:737-743; Gáudio E. et al. (1993) Int. J. Exp. Path. 74:463-469).
As figuras 21 e 23 mostram a produção de colágeno medida por análise de imagem a partir de cortes de fígado tingidos com vermelho sírio,usando microscopia de luz (Material e Métodos).
Como pode ser visto na figura 20, diferenças significativas (P <0,05) entre o grupo de camundongos tratados com o peptídio P144 (TtoO e ogrupo de camundongos cirróticos de controle (Ch) são observadas ao se estudar o quociente colágeno vs. proteína total. Na figura 27 as diferençasentre o grupo de camundongos tratados com o peptídio P144 (Ttoi) e o gru-po de camundongos cirróticos de controle (Cii) também são significativas (P< 0,001) ao se estudar a área de fibrose.
Como pode ser observado nas figuras 22 e 23, que apresentam osresultados dos camundongos tratados uma vez estabelecida a cirrose, as dife-renças entre o grupo de camundongos tratados com o peptídio P144 (Tt02) e ogrupo de camundongos cirróticos sem tratamento (Ci2) não são significativasquando se usa qualquer uma das duas técnicas de medição de fibrose.
As duas técnicas usadas para a medição de colágeno são com- paradas entre si por uma regressão linear com a finalidade de demonstrar aaleatoriedade na escolha dos campos de estudo em cada preparação e comisso a validade da análise de imagem, figuras 24 e 25.isso a validade da análise de imagem, figuras 24 e 25.
Como se pode observar nos gráficos 24 e 25, existe uma corre-lação entre ambas as técnicas com um R > 0,85 em ambos os casos, sendoaltamente significativo (F < 0,001). Isto confirma que a aquisição das ima-gens de estudo foi realizada de forma totalmente aleatória e com isso a va-lidade dos dados obtidos pela análise de imagem.
As figuras 26 e 27 mostram as imagens obtidas por microscopiade luz a partir de preparações de fígado coloridas com vermelho sírio a umaampliação de 10X obtidas de fígados dos camundongos tratados durante oprocesso de indução de cirrose (Ci1 e Tto1).
As imagens da figura 26 foram obtidas sem nenhum tipo de filtro.
A figura 27 mostra as imagens modificadas para estudo por umsoftware específico. Essas modificações consistem na aplicação de doisfiltros, um de luz polarizada e o outro de luz verde, com a finalidade de au-mentar a qualidade das imagens e facilitar seu estudo de forma automatizada.
Nas figuras 26 e 27 observa-se que existem diferenças entre asimagens provenientes dos camundongos cirróticos (Ci1) e as dos camundon-gos tratados com o peptídio P144 (Ttoi).
As diferenças de eficácia entre os protocolos 1 e 2 poderiam serdevidas ao fato de que a produção de TGFpi poderia ser muito menor umavez induzida a cirrose (protocolo 2) do que durante o processo de induçãode cirrose com CCI4 (protocolo 1), e ainda poderia estar em níveis normais,com o que o efeito do tratamento com o peptídio P144 seria menos acentu-ado no protocolo 2 do que no protocolo 1.
Comparando-se os grupos de camundongos cirróticos não tra-tados no final do processo de indução de cirrose (Ch) com os camundongoscirróticos não tratados 4 semanas depois de terminada a indução (Ci2) ob-serva-se que existem diferenças significativas (P = 0,016) entre ambos osgrupos (figura 28), o que indicaria que existe uma regressão parcial da cir-rose ao se eliminar o agente indutor de cirrose, observação esta que foi pu-blicada por diversos autores (Szende-B et al. (1992) In Vivo 6:355-361; Co-Iumbano A (1996) Carcinogenesis 17:395-400).Essas diferenças de eficácia entre os dois protocolos tambémpoderiam ser devidas ao próprio protocolo, já que os animais do protocolo 2foram tratados apenas por 3 semanas em dias alternados, ao passo que osanimais do protocolo 1 foram tratados por um período de tempo mais longo(7 semanas, também em dias alternados).
Os resultados obtidos demonstram que é possível inibir o TGFpitanto in vitro como in vivo por meio dos peptídios sintéticos provenientes dediferentes proteínas. No futuro seria interessante tentar aumentar a ativida-de biológica desses peptídios. Isto poderia ser feito por substituição siste-mática de cada um dos aminoácidos de suas seqüências pelos 19 restantes.Uma vez obtido o peptídio de maior atividade, seria conveniente prepararmimótopos (McConneII S. J. (1994) Gene 151:115-118; Steward M. W.(1995) J. Virol. 69:7668-7673) do mesmo com o objetivo de aumentar a vidamédia no organismo do agente inibidor.
Descrição das figuras
Figura 1. Inibição da união do TGFpi às células MV-1-Lu pelopeptídio P144, medida por citometria de fluxo. A - imagem obtida ao se ana-lisar as células incubadas com TGFpi biotinilado e reveladas com avidina-FITC. B - imagem obtida ao se analisar as células incubadas com avidina-FITC sem adição prévia de TGFpl C - imagem obtida ao se analisar ascélulas incubadas com TGFpI previamente incubado com o peptídio P144 auma concentração de 0,42 μg/μl, a revelação foi feita com avidina-FITC. Noeixo das abcissas está representada a fluorescência emitida e no das orde-nadas, o número de células para cada valor de fluorescência. Também es-tão indicados os campos correspondentes às células marcadas TGFpi-biotina e avidina-FITC (M2) e às células não marcadas (M1).
Figura 2. Esquema representativo do processo de cirrose porCCI4. As setas escuras cheias indicam quando os camundongos receberamduas doses semanais de CCI4 e as setas escuras listradas quando a dosefoi semanal. As setas cinzas indicam administração do peptídio A: controlessadios; B: controles sadios + P144, B1: com peptídio 70 μg/dia; C: cirróticos;C1 com solução salina; C2 com peptídio 70 μg/dia; D: cirróticos com CCI4 +fenobarbital; Di e solução salina; D2 e peptídio 70 μρ/ο^.
Figura 3. Efeito do TGFpi no crescimento de células MV-1-Lu.As células foram cultivadas a uma densidade de 5000 células por comparti-mento às concentrações de TGFpi em pg/ml indicadas. Abcissas: concen-tração TGFpi (pg/ml); ordenadas: c.p.m.
Figura 4. Percentagem de inibição do TGFpi (200 pg/ml) porpeptídios de TGFpi Todos os peptídios foram testados à concentração de200 μg/ml. Uma inibição de 100% do TGFpi corresponde ao crescimentodas células MV-1-Lu obtidas na ausência de TGFpl
Figura 5. Percentagem da inibição da atividade do TGFpi (200pg/ml) na presença de diferentes concentrações nominais do peptídio P12filtrado (♦) e não filtrado (·).
Figura 6. Percentagem de inibição do TGFpi (200 pg/ml) porpeptídios de TGFpi Todos os peptídios foram testados à concentração de200 μg/ml. Uma inibição de 100% do TGFpi corresponde ao crescimentodas células MV-1-Lu obtidas na ausência de TGFpi.
Figura 7. Auto-radiografia de um ensaio de marcação por afini-dade dos receptores de TGFpi Faixa C1: efeito da incubação das célulascom uma concentração 0,16 μΜ de 125TGFpi que corresponde a uma ativi-dade de 0,3 μΟί (controle positivo). Faixa C2: efeito da pré-incubação dascélulas com uma concentração de TGFpi não radioativo 10 vezes maiorque a de 125I-TGFpi (controle negativo). Faixa C3: a pré-incubação foi feitacom o peptídio P29 a uma concentração 106 vezes maior que a concentra-ção molar de 125I-TGFpi Pode-se observar a inibição da união de 125I-TGFpi aos receptores celulares tipo I, Il e Ill tanto pelo peptídio P29 comopelo TGFpi não radioativo.
Figura 8. Auto-radiografia de um ensaio de marcação por afini-dade dos receptores de TGFpi Faixas C1 a C6: efeito da pré-incubaçãodas células MV-1-Lu com diferentes concentrações do peptídio P29 (106, 8 χ105, 6 χ 105, 4 χ 105, 2 χ IO51 105 vezes a concentração molar de 125I-TGFpI,respectivamente), antes da adição de 125I-TGFpi Faixa C7: efeito da pré-incubação das células MV-1-Lu com TGFpi não marcado (102 vezes a con-centração molar de 125I-TGFpi) antes da adição de 125I-TGFpi (controle ne-gativo). Faixa C8: efeito da incubação das células MV-1-Lu com uma con-centração 0,42 μΜ de 125I-TGFpi que corresponde a uma atividade de 0,4μCi, sem pré-incubações anteriores (controle positivo).
Figura 9. Percentagem de inibição do TGFpi (200 pg/ml) porpeptídios do receptor previstos como complementares a zonas do TGFpI.Todos os peptídios foram testados à concentração de 200 μg/ml. Uma inibi-ção de 100% do TGFpi corresponde ao crescimento das células MV-1-Luobtidas na ausência de TGFpi.
Figura 10. Percentagem de inibição do TGFpi (200 pg/ml) porpeptídios superpostos provenientes da região extracelular do receptor tipoIII. Todos os peptídios foram testados à concentração de 200 μg/ml. Umainibição de 100% do TGFpi corresponde ao crescimento das células MV-1-Lu obtidas na ausência de TGFpi.
Figura 11. Percentagem de inibição do TGFpi (200 pg/ml) porpeptídios superpostos provenientes da região extracelular do receptor tipoIII. Todos os peptídios foram testados à concentração de 200 μg/ml. Umainibição de 100% do TGFpi corresponde ao crescimento das células MV-1-Lu obtidas na ausência de TGFpi.
Figura 12. Percentagem de inibição do TGFpi (200 pg/ml) porpeptídios superpostos provenientes da região extracelular do receptor tipoIII. Todos os peptídios foram testados à concentração de 200 μg/ml. Umainibição de 100% do TGFpi corresponde ao crescimento das células MV-1 -Lu obtidas na ausência de TGFpi.
Figura 13. Percentagem da inibição da atividade do TGFpi (200pg/ml) na presença de diferentes concentrações nominais do peptídio P54filtrado (<>) e não filtrado (o).
Figura 14. Percentagem de inibição do TGFpi (200 pg/ml) porpeptídios do receptor provenientes da modificação do peptídio P54 (p139 aP143) e dos peptídios provenientes do receptor tipo Ill humano (P144 aΡ145). Todos os peptídios foram testados à concentração de 200 μς/ηιΙ.Uma inibição de 100% do TGFpi corresponde ao crescimento das célulasMV-1-Lu obtidas na ausência de TGFpi.
Figura 15. Percentagem de inibição da atividade do TGFpi (200pg/ml) na presença de diferentes concentrações nominais do peptídio P144não filtrado.
Figura 16. Auto-radiografia de um ensaio de marcação por afini-dade dos receptores de TGFpi. Faixa C1: a pré-incubação foi feita com opeptídio P144 a uma concentração 106 vezes maior que a concentração molar de 125I-TGFpi. Faixas C2 e C3: efeito da pré-incubação das célulascom uma concentração de TGFpi não radioativo 10 vezes maior que a de125I-TGFpi (controle negativo). Faixa C4 e C5: efeito da incubação das cé-lulas com uma concentração de 0,1 μΜ de 125TGFpi que corresponde a umaatividade de 0,2 μΟϊ (controle positivo). Pode-se observar a inibição da uni-ão de 125I-TGFpi aos receptores celulares tanto pelo peptídio P144 comopelo TGFpi não radioativo.
Figura 17. Percentagem de inibição do TGFpi (200 pg/ml) porpeptídios provenientes do receptor tipo Il humano (P146), da fetuína (P147a P149) e da endoglina (P150 a P154). Todos os peptídios foram testados àconcentração de 200 μg/ml. Uma inibição de 100% do TGFpi correspondeao crescimento das células MV-1-Lu obtidas na ausência de TGFpi.
Figura 18. Percentagem de inibição do TGFpi (200 pg/ml) porpeptídios provenientes da a2-macroglobulina. Todos os peptídios foramtestados à concentração de 200 μg/ml. Uma inibição de 100% do TGFpicorresponde ao crescimento das células MV-1-Lu obtidas na ausência deTGFP1.
Figura 19. Percentagem de inibição da união do TGFpi a célu-las MV-1-Lu por diferentes peptídios sintéticos. A inibição foi estudada me-dindo-se a percentagem de células marcadas (emitindo fluorescência) e nãomarcadas (não emitindo fluorescência) para cada peptídio (Material e Méto-dos).Figura 20. Efeito da administração do peptídio P144 na síntesede colágeno durante a indução de cirrose experimental com CCI4. No eixodas ordenadas está representado o quociente colágeno versus proteína to-tal. No eixo das abcissas estão representados os diferentes grupos de ca-mundongos: Co = camundongos sadios; Co + P144 = camundongos sadiostratados com o peptídio P144; TtOi = camundongos submetidos à induçãode cirrose com CCI4 e que receberam o peptídio P144 em dias alternadosdurante esse período e Ci1 = camundongos submetidos à indução de cirrosecom CCI4 durante 11 semanas e não tratados com o peptídio P144.
Figura 21. Efeito da administração do peptídio P144 na síntesede colágeno durante a indução de cirrose experimental com CCI4. No eixodas ordenadas está representado o quociente entre a área de fibrose e aárea total em proporções de tecido tingido com vermelho sírio. No eixo dasabcissas estão representados os diferentes grupos de camundongos: Co =camundongos sadios; Co + P144 = camundongos sadios tratados com opeptídio P144; Ttoi = camundongos submetidos à indução de cirrose comCCI4 e que receberam o peptídio P144 em dias alternados durante esse pe-ríodo e Ci1 = camundongos submetidos à indução de cirrose com CCI4 du-rante 11 semanas e não tratados com o peptídio P144.
Figura 22. Efeito da administração do peptídio P144 na síntesede colágeno uma vez induzida a cirrose com CCI4. No eixo das ordenadasestá representado o quociente colágeno versus proteína total. No eixo dasabcissas estão representados os diferentes grupos de camundongos: Co =camundongos sadios; Co + P144 = camundongos sadios tratados com opeptídio P144; Tto2 = camundongos submetidos à indução de cirrose comCCI4 e que receberam o peptídio P144 em dias alternados no final desseperíodo e Ci2 = camundongos submetidos à indução de cirrose com CCI4durante 11 semanas e não tratados com o peptídio P144.
Figura 23. Efeito da administração do peptídio P144 na síntesede colágeno uma vez induzida a cirrose com CCI4. No eixo das ordenadasestá representado o quociente entre a área de fibrose e a área total em pre-parações de tecido. No eixo das abcissas estão representados os diferentesgrupos de camundongos: Co = camundongos sadios; Co + P144 = camun-dongos sadios tratados com o peptídio P144; Tto2 = camundongos submeti-dos à indução de cirrose com CCI4 e que receberam o peptídio P144 emdias alternados no final desse período e Ci2 = camundongos submetidos àindução de cirrose com CCI4 durante 11 semanas e não tratados com opeptídio P144.
Figura 24. Comparação entre os dados sobre quantidade decolágeno e área de fibrose obtidos por meio das duas técnicas usadas. Noeixo das abcissas estão indicados os valores do quociente entre a área defibrose e a área total, obtidos por análise de imagem. No eixo das ordena-das estão representados os valores do quociente entre os μg de colágeno eos μg de proteína total obtidos por análise espectrofotométrica de cortes defígado tingidos com "Direct Red e Fast Green". R2 está indicado (F < 0,001).
Figura 25. Comparação entre os dados sobre quantidade decolágeno e área de fibrose obtidos por meio das duas técnicas usadas paraestudo das amostras no final do protocolo 2. No eixo das abcissas estãoindicados os valores do quociente entre a área de fibrose e a área total, ob-tidos por análise de imagem. No eixo das ordenadas estão representadosos valores do quociente entre os μg de colágeno e os μg de proteína totalobtidos por análise espectrofotométrica de cortes de fígado tingidos com"Direct Red e Fast Green". R2 está indicado (F < 0,001).
Figura 26. Imagens representativas dos 24 campos obtidos pormicroscopia de luz (10X) a partir de preparações de fígado de camundongostingidas com vermelho sírio. Camundongos cirróticos (Ci1) ao final da indu-ção de cirrose com CCI4 e cirróticos tratados (Ttoi) com o peptídio P144 du-rante o processo de indução de cirrose com CCI4. Diferentes campos foramtomados das preparações de cada animal (R = camundongo e C = campo).
Figura 27. Imagens representativas dos 24 campos obtidos pormicroscopia de luz (10X) a partir de preparações de fígado de camundongostingidas com vermelho sírio. Camundongos cirróticos (Cii) ao final da indu-ção de cirrose com CCI4 e cirróticos tratados (TtOi) com o peptídio P144 du-rante o processo de indução de cirrose com CCI4. Diferentes campos foram7tomados das preparações de cada animal (R = camundongo e C = campo).Luz polarizada e filtro verde foram usados com o objetivo de distinguir asfibras de colágeno.
Figura 28. Comparação entre os dois grupos de camundongoscirróticos não tratados. C11 são camundongos cirróticos ao final de 12 sema-nas de indução de cirrose com CC14, C12 são camundongos cirróticos 4 se-manas depois do final do processo de indução de cirrose. P = 0,016. Orde-nadas: área de fibrose/área total.Listagem de Seqüências
<110> Instituto Científico e Tecnológico de Navarra (ICTN)
<120> Peptídios inibidores de TGFpI
<160> 10
<210> SEQ ID NO: 1
<211 >15
<212> Peptídio
<213> Seqüência artificial
<220> Domínio
<223> Proveniente de TGFpi, posição 319-333
<400> His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp
5 10
Ser Leu15
<210> SEQ ID NO: 2
<211>14
<212> Peptídio
<213> Seqüência artificial
<220> Domínio
<223> Proveniente de TGFpi, posição.322-335
<400> Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp
5 10
Thr
<210> SEQ ID NO: 3
<211>12
<212> Peptídio
<213> Seqüência artificial
<220> Domínio
<223> Deduzido como complementar a TGFpi; posição 731-742
<400> Thr Ser Leu Asp Ala Thr Met Ile Trp Thr Met Met
5 10
<210> SEQ ID NO: 4
<211>15
<212> Peptídio<213> Seqüência artificial<220> Domínio
<223> Superposto com a região extracelular do receptor tipo Ill de camun-
dongo posição 245-259
<400> Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Ile Val
5 10
Asp Ile15
<210> SEQ ID NO: 5<211> 9
<212> Peptídio
<213> Seqüência artificial
<220> Domínio
<223> Modificação P54 deduzido como complementar a TGFpi, posição731-742
<400> Thr Ser Leu Met Ile Trp Thr Met Met
5
<210> SEQ ID NO: 6<211> 14<212> Peptídio
<213> Seqüência artificial<220> Domínio
<223> Proveniente do receptor tipo Ill humano modificado, posição 729-742
<400> Thr Ser Leu Asp Ala Ser Ile Ile Trp Ala Met Met Gln5 10
Asn
<210> SEQ ID NO: 7<211> 14<212> Peptídio<213> Seqüência artificial<220> Domínio
<223> Proveniente do receptor tipo Ill humano modificado, posição 241-254
<400> Ser Asn Pro Tyr Ser Ala Phe Gln Val Asp Ile Thr Ile
5 10
Asp<210> SEQ ID NO: 8
<211> 18
<212> Peptidio
<213> Seqüência artificial
<220> Domínio
<223> Posição 247-261 de Ia Endoglina
<400> Glu Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser5 10
Trp Leu
15
<210> SEQ ID NO: 9
<211> 15
<212> Peptídio
<213> Seqüência artificial
<220> Domínio
<223> Posição 445-459 de Ia Endoglina
<400> Leu Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser5 10
Pro His15
<210> SEQ ID NO: 10
<211 >23
<212> Peptídio
<213> Seqüência artificial
<220> Domínio
<223> Modificação P12, isituação 322-335 de TGFpI
<400> His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly5 10
Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr15 20
Claims (4)
1. Peptídeos antagonistas da ligação de TGF-βΙ ao receptorTGF-βΙ tipo III ou endoglina, caracterizados pelo fato de que os referidospeptídeos possuem de 9 a 15 aminoácidos de extensão e são selecionadosdo grupo consistindo em um peptídeo compreendendo a seqüência de ami-noácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID N°: 5, SEQID N°: 6 e SEQ ID N°: 7.
2. Uso de pelo menos um dos peptídeos, como definidos na rei-vindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na produção de uma composi-ção farmacêutica útil para o tratamento de doenças do fígado.
3. Uso de pelo menos um DNA que codifica pelo menos um dospeptídeos, como definidos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de serpara a produção de uma composição farmacêutica útil para o tratamento dedoenças do fígado.
4. Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelofato de que a composição farmacêutica produzida é útil para o tratamento defibrose hepática.
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| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 26/07/2011, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
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| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 16A ANUIDADE. |
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| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2342 DE 24-11-2015 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |