KR101856114B1 - Ｅｔｆｂ의 세포 이상증식에 대한 적용 방법 및 이상증식 억제제 - Google Patents

Ｅｔｆｂ의 세포 이상증식에 대한 적용 방법 및 이상증식 억제제 Download PDF

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Abstract

섬유아세포의 이상증식을 조기에 감별하고, 이것을 억제하는 수단을 제공한다. ETFB(일렉트론트랜스퍼 플라보프로틴 베타 서브유닛)의 발현의 정도를 지표로 하는, 섬유아세포의 증식 상태의 감별법으로서, 당해 ETFB의 발현의 정도가 높은 경우에는, 섬유아세포의 이상증식이 발생했을 개연성이 높고, ETFB의 발현의 정도가 낮은 경우에는 섬유아세포의 증식이 정상으로 유지되고 있을 개연성이 높다고 판별하는 섬유아세포의 증식 상태의 감별법을 제공한다. 또한 ETFB를 저해함으로써, 섬유아세포의 이상증식을 억제할 수 있다.

Description

ＥＴＦＢ의 세포 이상증식에 대한 적용 방법 및 이상증식 억제제{METHOD OF APPLYING ETFB TO ABNORMAL PROLIFERATION OF CELL, AND ABNORMAL PROLIFERATION INHIBITOR}
본 발명은 일렉트론트랜스퍼 플라보프로틴 베타 서브유닛(Electron transfer flavoprotein beta subunit; ETFB)의 세포 증식에 대한 적용과, 그 억제제, 이 억제제로 이루어지는 세포의 이상증식증의 처치약에 관한 것이다.
섬유아세포의 이상증식은, 예를 들면, 상처의 자국에 발생하는 비후성 반흔이나, 폐에 있어서의 선유증이나 간경변, 신경화증 등과 같이 여러 질병에 관련되어 있다. 이들 이상증식을 유기하는 과정에서, TGF-β가 관여하고 있다고 하고 있지만(예를 들면, 특허문헌 1, 특허문헌 2, 특허문헌 3을 참조), TGF-β는 멀티태스크의 생체 물질이기 때문에, 단순한 억제로 대처할 수는 없는 면이 적지 않게 있고, 부작용이 적은 유효한 TGF-β저해제가 존재하지 않는 것도 그러한 것에 기인하는 것으로 생각된다. 즉, TGF-β의 하류에 있어서, 이 질환과 직결된 섬유아세포의 이상증식의 인자를 찾아내고, 이것을 선택적으로 억제하는 것이 상기 섬유아세포 이상증식증의 유효한 억제 수단이 된다고 생각된다.
한편, ETFB는 전자전달에 관련되는 단백질이며(예를 들면, 특허문헌 4, 특허문헌 5, 특허문헌 6, 특허문헌 7을 참조), 때로는, 바이오마커에 사용되는 경우도 있지만, 그 실태에 대해서는 그다지 알려져 있지 않다. 지질저류성 근질환에서는, ETFB의 변이가 보인다고 하는 보고(예를 들면, 비특허문헌 1을 참조), II형 당뇨병의 요인 중 하나라는 시사(예를 들면, 비특허문헌 2를 참조), 멀티플·아실 코엔자임A 디히드로게나제·디피션시(Multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency; MADD)의 1 요소라는 시사(예를 들면, 비특허문헌 3을 참조) 등이 알려져 있지만, 피부 등과의 관련도, 섬유아세포와의 관계도 전혀 알려져 있지 않다. 또한 ETFB와 TGF-β와의 관련도 전혀 알려져 있지 않다.
다른 한편, 섬유아세포를 콜라겐 겔 중에서 장력을 걸어 배양한 경우, 세포 증식이 항진되어, 콜라겐 발현 등이 상승하여, 섬유화에 근사한 현상이 관찰되며, 이것에 TGF-β가 존재한 경우, 섬유아세포의 마이오피브로블라스트로의 분화도 관찰되는 것은 이미 보고되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 4를 참조). 그렇지만, 이러한 현상에 있어서의 세포 증식의 인자는 밝혀져 있지 않다.
일본 특개 2010-222351호 공보 일본 특개 2010-59124호 공보 일본 특개 2009-40796호 공보 일본 특표 2010-508014호 공보 국제공개 WO2006/054722호 팜플렛 일본 특표 2010-514441호 공보 일본 특개 2010-107461호 공보
Wen B. et. al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 2010; 81(2): 231-6 Lu H. et. al., J. Mol. Cell Proteomics. 2008; 7(8): 1434-51 Schiff M. et.al., Mol. Genet. Metab. 2006; 88(2): 153-8 Au K. et. al., Exp. Mol. Pathol. 2010; 89(3): 236-240
본 발명은 이러한 상황하에 행해진 것으로, 섬유아세포의 이상증식을 조기에 감별하고, 이것을 억제하는 수단을 제공하는 것을 과제로 한다.
이러한 상황을 감안하여, 본 발명자들은 섬유아세포의 이상증식을 조기에 감별하고, 이것을 억제하는 수단을 찾아, 예의 연구 노력을 거듭한 결과, 섬유아세포를 장력 존재하에 콜라겐 겔 중에서 배양한 경우와, 장력 비존재하에 콜라겐 겔 중에서 배양한 경우의 발현 단백질의 비교를 행함으로써, ETFB의 발현이 앞의 조건에서 항진하는 것을 발견하고, 이것이 섬유아세포의 이상증식의 인자인 것을 규명하고, 발명을 완성시키게 되었다.
즉, 본 발명은 이하에 나타내는 바와 같다.
<1＞ ETFB(일렉트론트랜스퍼 플라보프로틴 베타 서브유닛)의 발현의 정도를 지표로 하는 섬유아세포의 증식 상태의 감별법으로서,
당해 ETFB의 발현의 정도가 높은 경우에는, 섬유아세포의 이상증식이 발생했을 개연성이 높고,
ETFB의 발현의 정도가 낮은 경우에는, 섬유아세포의 증식이 정상으로 유지되고 있을 개연성이 높다고 판별하는 섬유아세포의 증식 상태의 감별법.
<2> 상기 ETFB의 발현의 정도가 높은 경우가 피검 시료의 섬유아세포에서의 발현량이 대조의 섬유아세포에서의 발현량에 대하여 높은 경우이며,
상기 ETFB의 발현의 정도가 낮은 경우가 피검 시료의 섬유아세포에서의 발현량이 대조의 섬유아세포에서의 발현량에 대하여 동일 또는 낮은 경우인, <1>에 기재된 감별법.
<3> 상기 섬유아세포의 이상증식이 섬유화인, <1>에 기재된 감별법.
<4> 상기 섬유화가 섬유아세포의 마이오피브로블라스트로의 분화에 기인하고 있는 것인, <3>에 기재된 감별법.
<5> 섬유아세포의 이상증식이 비후성 반흔의 형성인, <1>에 기재된 감별법.
<6> 섬유화가 의심되는 장기의 섬유아세포에서의 ETFB의 발현의 정도를 지표로 하는, 장기에서의 섬유화의 감별법으로서,
ETFB의 발현의 정도가 높은 경우에는, 당해 장기에서 섬유화가 일어났을 개연성이 높다고 판별하고,
ETFB의 항진이 확인되지 않는 경우에는, 섬유화가 일어났을 개연성은 낮다고 판별하는, 장기에서의 섬유화의 감별법.
<7> 상기 ETFB의 발현의 정도가 높은 경우가 피검 시료의 장기에서의 발현량이 대조에서의 발현량에 대하여 높은 경우이며,
ETFB의 항진이 인정되지 않은 경우가 피검 시료의 장기에서의 발현량이 대조에서의 발현량에 대하여 동일 또는 낮은 경우인, <6>에 기재된 장기에서의 섬유화의 감별법.
<8> 상기 장기가 피부인, <7>에 기재된 장기에서의 섬유화의 감별법.
<9> 섬유아세포를, 장력의 존재하에 콜라겐 겔 중에서, 피검 물질의 존재하 및 비존재하에 배양하고,
피검 물질의 존재하에 배양한 경우, ETFB의 발현량이 비존재하에 배양했을 때보다도 낮은 경우에는, 당해 피검 물질이 섬유화 억제제라고 하는, 섬유화 억제제의 감별법.
<10> 상기 섬유화는 비후성 반흔의 형성인, <9>에 기재된 섬유화 억제제의 감별법.
<11> 상기 섬유화가 피부에서의 비후성 반흔인, <10>에 기재된 섬유화 억제제의 감별법.
<12> 상기 ETFB의 발현이 단백질의 발현인, <1>∼<11> 중 어느 하나에 기재된 감별법.
<13> 상기 ETFB의 발현이 RNA의 발현인, <1>∼<11> 중 어느 하나에 기재된 감별법.
<14＞ ETFB의 발현의 정도를 폴리머라이제이션 체인 리액션(PCR)으로 측정하는, <13>에 기재된 감별법.
<15> 상기 PCR에 사용하는 프라이머는,
서열번호 1에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이것을 부분 서열에 갖고, ETFB를 코드 하는 염기 서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 및,
서열번호 2에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이것을 부분 서열에 갖고, ETFB를 코드 하는 염기 서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드인, <14>에 기재된 감별법.
<16> 섬유아세포를, 장력의 존재하에 콜라겐 겔 중에서, 피검 물질의 존재하 및 비존재하에 배양하고, 피검 물질의 존재하에 배양한 경우, ETFB의 발현량이 비존재하에 배양했을 때보다도 낮은 피검 물질로 이루어지는, 섬유화 억제제.
<17> 상기 섬유화는 비후성 반흔의 형성인, <16>에 기재된 섬유화 억제제.
<18> <16>에 기재된 섬유화 억제제를 유효성분으로 하는, 비후성 반흔 처치약.
<19> 생성된 비후성 반흔의 치료용인 <18>에 기재된 비후성 반흔 처치약.
<20> 생성된 비후성 반흔이 악화되지 않기 위한 예방용인, <18>에 기재된 비후성 반흔 처치약.
<21> 발생할 개연성이 높은 반흔이 생기는 것을 방지하는 예방용인, <18>에 기재된 비후성 반흔 처치약.
<22＞ ETFB를 코드 하는 염기 서열을 증폭할 수 있는, 서열번호 1 또는 2에 표시되는 올리고뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 올리고뉴클레오티드.
본 발명에 의하면, 섬유아세포의 이상증식을 조기에 감별하고, 이것을 억제하는 수단을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1의 콜라겐 겔 내 배양의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 1의 ETFB의 섬유아세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 1의 TGF-β에서 유도되는 스트레스 파이버 형성에 대한 ETFB siRNA의 영향을 나타내는 도면(사진)이다. ETFB 또는 음성 대조(Negative control) siRNA를 도입한 CCD-1113sk 세포에 TGF-β(11ng/ml)를 첨가 후 3일 배양하고, Phalloidin 염색을 실시했다.
도 4는 실시예 1의 ETFB siRNA의 콜라겐 겔 수축에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. ETFB 또는 Negative control siRNA를 도입하고, 콜라겐 겔 내 배양을 실시하고, 겔 수축을 관찰했다(n=6).
도 5는 실시예 1의 ETFB siRNA의 α-평활근 엑틴(SMA)을 코드한 RNA의 생산량에 대한 영향(Negative control)을 나타내는 도면이다. ETFB 또는 Negative control siRNA를 도입하고, 콜라겐 겔 내 배양을 실시하고, 배양 1일마다 RNA를 수집하고, 콜라겐1A1(COL1A1)(B) 및 SMA(C)의 mRNA 발현을 qRT-PCR로 확인했다. A는 Negative control siRNA 도입하에, 부착 상태 및 유리 상태에서의 ETFB의 발현량을 나타내고, B는 Negative control siRNA 도입하에, 부착 상태 및 유리 상태에서의 COL1A1의 발현량을 나타내고, C는 Negative control siRNA 도입하에, 부착 상태 및 유리 상태에서의 SMA의 발현량을 나타낸다.
도 6은 실시예 1의 ETFB siRNA의 콜라겐 산생, SMA 산생에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. ETFB 또는 Negative control siRNA를 도입하고, TGF-β(300ng/ml)를 첨가 또는 비첨가한 상태에서 콜라겐 겔 내 배양을 실시하고, 배양 1일 후의 RNA를 수집하고, COL1A1(A), SMA(B) 및 ETFB(C)의 mRNA 발현을 qRT-PCR로 확인했다. A는 TGF-β존재 또는 비존재하에, Negative control siRNA 또는 ETFB siRNA 도입에 의한 COL1A1의 발현량의 변화를 나타내고, B는 TGF-β존재 또는 비존재하에, Negative control siRNA 또는 ETFB siRNA 도입에 의한 SMA의 발현량의 변화를 나타내고, C는 TGF-β 존재 또는 비존재하에, Negative control siRNA 또는 ETFB siRNA 도입에 의한 ETFB의 발현량의 변화를 나타낸다.
(ETFB)
본 발명의 주요소가 되는 ETFB는 일렉트론트랜스퍼 플라보프로틴 베타 서브유닛이라고도 불리며, 그 상세한 염기 서열, 아미노산 서열은 이미 유전자 은행 등의 유전자 데이터 뱅크에 등록되어 있다. 예를 들면, 인간형의 ETFB이면 유전자 은행에 CAG33108.1로 등록되어 있다. 이것은 이하의 절차를 거쳐, 섬유아세포의 증식 인자로서 동정되었다.
섬유아세포의 증식 인자의 동정에 사용하는, 콜라겐 겔 중에서의 장력 부하 조건에서의 배양에서는, 섬유아세포는 세포 증식, 콜라겐 발현 상승 등이 일어나고, 이 증식에서는, 세포의 형태, 액성 인자의 발현이 섬유화의 상태에 근사하고 있다. 한편, 장력의 부하가 없는 경우에는, 이러한 증식 현상은 관찰되지 않는다. 즉, 섬유아세포를 콜라겐 겔 중에서 장력 부하로 배양한 경우와, 장력을 부하하지 않고 배양한 경우의 발현 단백질 또는 발현 RNA를 비교하고, 장력 부하의 조건에서만 발현하는 또는 발현이 항진되는 단백질, RNA를 파악하면, 그것이 섬유아세포의 증식의 인자, 섬유화의 인자일 개연성이 높다. 이와 같이 하여 동정한 단백질 또는 RNA에 대하여, siRNA 등을 사용하여, 녹다운 실험을 행하고, 그 결과, 섬유아세포의 증식 또는 섬유화가 억제되면, 섬유아세포의 증식 인자 또는 섬유화의 인자라고 할 수 있다.
따라서, 본 발명에서는, RNA 등의 유전자를 타깃으로 할 수도 있고, 단백질을 타깃으로 할 수도 있다.
단백질을 타깃으로 하는 경우에는, 섬유아세포의 배양물 및/또는 배양 생산물에 대하여, 예를 들면, DD법(디퍼렌셜·디스플레이법)에 의한 프로테옴 해석 등을 행할 수 있다. 즉, 2차원 전기영동에 의한 전개, DD, 얻어진 스폿을 MALDI-TOF-MS로 동정한다. 동정된 단백질에 대한 기능 억제를 실시하고, 병태가 개선되거가 그 가능성이 있는지를 확인한다. 그리고 그 타깃이 되는 단백질의 입체구조를 조사하여, 활성 중심을 밝혀내고, 그 활성 중심에 높은 친화성으로 끼어 들어가는 화합물을 설계하자고 하는 것이다. 프로테옴 해석에서의 DD, siRNA 등에 의한 기능 억제 기술, 컴퓨터를 이용한 타깃 단백의 구조 해석 및 생물학적 실험에 의한 활성 중심의 검토를 행한다고 하는 절차이다.
이러한 해석에 사용하는 섬유아세포로서는 확립된 세포이면 특별히 한정 없이 사용할 수 있지만, 최종 실시형태가 인간의 섬유아세포이므로, 인간의 섬유아세포를 사용할 수 있다. 인간의 섬유아세포로서는 CCD-1113sk 세포(ATCC No. CRL2439, 인간 피부진피 정상 섬유아세포, 흑인 39세 여성 유래), CCD-1109Sk(ATCC No. CRL2361, 인간 피부진피 정상 섬유아세포, 백인 21세 남성 유래), 또는 CCD-1032Sk(ATCC No. CRL2439, 인간 피부진피 정상 섬유아세포, 백인 신생아 유래) 등을 적합하게 예시할 수 있고, 이것들은 ATCC 등으로부터 유상 분양하게 함으로써 이용할 수 있다. 이것들의 배양은 FBS 첨가 DMEM 배지나 RPMI 배지 등에서 배양할 수 있다.
또한 이와 같이 프로테옴 해석으로 단백질을 동정함으로써, 유전자 은행 등의 유전자 정보를 이용하여, 대응하는 유전자의 염기 서열을 추정할 수 있다. 이것에 의해, 대응하는 c-DNA나 RNA를 PCR에 의해 증폭할 수 있다. 또한 siRNA를 작성하여, 녹아웃 실험을 행할 수도 있다. 녹아웃 실험에 의해, 당해 타깃 단백질이 실제로 섬유아세포의 증식이나 섬유화에 기여하고 있는지도 검증할 수 있다.
(섬유아세포의 증식 상태의 감별법)
이러한 과정을 거쳐, 본원 발명자들은 섬유아세포의 콜라겐 겔 중에서의 장력 부하 배양, 구체적으로는, 세포가 배양기의 벽면 내지는 바닥면에 부착된 상태에서 배양되는 조건에서, ETFB가 특이적으로 산생되는 것을 발견했다. 즉, 섬유아세포의 콜라겐 겔 중에서의 배양에 있어서, ETFB의 생산량을 지표로 섬유화 등의 섬유아세포의 이상증식이 촉진되고 있는지 아닌지를 감별할 수 있다.
즉, 본 발명의 하나의 형태는, 섬유아세포의 증식 상태의 감별법에 있어서, ETFB(일렉트론트랜스퍼 플라보프로틴 베타 서브유닛)의 발현의 정도를 지표로 하는, 증식 상태의 감별법으로서,
ETFB의 발현의 정도가 높은 경우에는, 섬유아세포의 이상증식이 발생했을 개연성이 높고,
ETFB의 발현의 정도가 낮은 경우에는, 섬유아세포의 증식이 정상으로 유지되고 있을 개연성이 높다고 판별하는, 섬유아세포의 증식 상태의 감별법이다.
여기에서, 「ETFB의 발현의 정도를 지표로 하는」이란 「ETFB의 발현의 정도를 마커로서 측정한다」고 할 수도 있다.
「섬유아세포의 이상증식이 발생했을 개연성이 높은」이란 「섬유아세포의 이상증식이 발생했을 리스크가 높다」고 할 수도 있다. 「섬유아세포의 증식이 정상으로 유지되고 있을 개연성이 높은」이란 「섬유아세포의 이상증식이 발생했을 리스크가 낮다」고 할 수도 있다. 「섬유아세포의 증식 상태의 감별법」은 「섬유아세포의 이상증식의 리스크의 예측 방법」이라고 할 수도 있다.
ETFB의 발현의 정도가 높은 경우란 피검 시료의 섬유아세포에서의 발현량이 대조의 섬유아세포에서의 발현량에 대하여 높은 경우이며,
ETFB의 발현의 정도가 낮은 경우란 피검 시료의 섬유아세포에서의 발현량이 대조의 섬유아세포에서의 발현량에 대하여 동일 또는 낮은 경우일 수 있다.
ETFB의 발현의 정도가 높은 경우란, 한정되지 않지만, 예를 들면, 피검 시료의 섬유아세포에서는 발현되고 있지만, 대조의 섬유아세포에서는 발현되지 않고 있거나, 또는 피검 시료의 섬유아세포에서의 발현량이 대조의 섬유아세포에서의 발현량에 대하여 150% 이상, 300% 이상, 500% 이상일 수 있고,
ETFB의 발현의 정도가 낮은 경우란, 한정되지 않지만, 예를 들면, 피검 시료의 섬유아세포에서의 발현량이 대조의 섬유아세포에서의 발현량에 대하여 동일 또는 70% 이하, 50% 이하, 10% 이하일 수 있다.
피검 시료의 섬유아세포는 섬유아세포의 증식 상태를 감별할 필요가 있는 대상의 세포이며, 특별히 한정되지 않고, 인간, 돼지, 원숭이, 침팬지, 개, 소, 토끼, 래트, 마우스 등의 포유동물 유래의 세포일 수 있다.
대조의 섬유아세포는 대상의 정상 섬유아세포 또는 대상과 동일 또는 유사 생물종의 정상 섬유아세포 또는 확립된 정상 섬유아세포일 수 있다. 확립된 정상 섬유아세포로서는 상기와 같은 확립된 세포를 사용할 수 있다.
ETFB의 발현의 정도는, 후기와 같이, ETFB 단백질의 발현을 측정해도 되고, ETFB를 코드한 RNA 등의 유전자의 발현을 측정해도 된다. 섬유아세포에서의 ETFB 단백질 또는 ETFB를 코드한 유전자의 측정 방법은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 상법에 따라, 세포를 파쇄하고, ETFB 단백질 또는 ETFB를 코드한 유전자를 포함하는 세포추출액을 얻고, 세포 추출액에 포함되는 ETFB 단백질 또는 ETFB를 코드한 유전자를, 후기와 같은 통상의 측정 방법에 의해 측정함으로써 행할 수 있다.
본 발명에 있어서 「섬유아세포의 이상증식」이란 섬유아세포의 이상증식에 의한 질환 상태일 수 있다. 섬유아세포의 이상증식에 의한 질환 상태는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 섬유화(구체적으로는, 비후성 반흔, 켈로이드, 강피증, 면포 반흔, 폐선유증, 간선유증 등), 섬유아세포의 마이오피브로블라스트로의 분화에 기인하고 있는 섬유화 등일 수 있다.
본 발명의 다른 형태는, 섬유화가 의심되는 장기의 섬유아세포에 있어서의, ETFB의 발현의 정도를 지표로 하는, 장기에서의 섬유화의 감별법으로서, ETFB의 발현의 정도가 높은 경우에는, 당해 장기에 있어서 섬유화가 일어났을 개연성이 높다고 판별하고, ETFB의 항진이 인정을 받지 않을 경우에는, 섬유화가 일어났을 개연성은 낮다고 판별하는, 장기에서의 섬유화의 감별법이다.
여기에서, 「장기에서 섬유화가 일어났을 개연성이 높은」이란 「장기에서 섬유화가 일어났을 리스크이 높다」고 할 수도 있다. 「섬유화가 일어났을 개연성이 낮은」이란 「섬유화가 일어났을 리스크가 낮다」고 할 수도 있다. 「장기에서의 섬유화의 감별법」은 「장기에서의 섬유화의 리스크의 예측 방법」이라고 할 수도 있다.
ETFB의 발현의 정도가 높은 경우란 피검 시료의 장기에서의 발현량이 대조에서의 발현량에 대하여 높은 경우이며,
ETFB의 항진이 확인되지 않는 경우란 피검 시료의 장기에서의 발현량이 대조에서의 발현량에 대하여 동일 또는 낮은 경우일 수 있다.
ETFB의 발현의 정도가 높은 경우란, 한정되지 않지만, 예를 들면, 피검 시료의 장기에서는 발현되고 있지만, 대조에서는 발현되고 있지 않거나, 또는 피검 시료의 장기에서의 발현량이 대조에서의 발현량에 대하여 150% 이상, 300% 이상, 500% 이상일 수 있고,
ETFB의 발현의 정도가 낮은 경우란, 한정되지 않지만, 예를 들면, 피검 시료의 장기에서의 발현량이 대조에서의 발현량에 대하여 동일 또는 70% 이하, 50% 이하, 10% 이하일 수 있다.
피검 시료의 장기는 장기에서의 섬유화가 감별될 필요가 있는 대상의 장기이며, 특별히 한정되지 않고, 인간, 돼지, 원숭이, 침팬지, 개, 소, 토끼, 래트, 마우스 등의 포유 동물 유래의 장기일 수 있다. 또한, 대상의 장기로부터 얻어지는 배양 세포, 배양 조직, 혈액 등을 피검 시료로서 사용해도 된다.
대조는 대상이 동일 또는 다른 장기의 정상 부분 또는 대상과 동일 또는 유사한 생물종의 장기 또는 세포 또는 확립된 정상 세포일 수 있다. 확립된 정상 세포로서는 상기와 동일한 확립된 세포를 사용할 수 있다.
본 발명의 장기에서의 섬유화의 감별법의 대상이 되는 「장기」란 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 피부, 폐 또는 간장 등의 내장 등일 수 있다.
ETFB의 발현의 정도는, 후기한 바와 같이, ETFB 단백질의 발현을 측정해도 되고, ETFB를 코드한 RNA 등의 유전자의 발현을 측정해도 된다. 장기의 섬유아세포에서의 ETFB 단백질 또는 ETFB를 코드한 유전자의 측정 방법은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 상법에 따라, 세포를 파쇄하고, ETFB 단백질 또는 ETFB를 코드한 유전자를 포함하는 세포 추출액을 얻고, 세포 추출액에 포함되는 ETFB 단백질 또는 ETFB를 코드한 유전자를, 후기와 같은 통상의 측정 방법에 의해 측정함으로써 행할 수 있다.
(이상증식 억제제의 감별법)
본 발명의 섬유아세포의 증식 상태의 감별법을 응용하면, 피검 물질의 존재 하에서 ETFB의 생산량이 높아지거나, 억제되거나 하는 것에 의해 당해 피검 물질이 이상증식 촉진제인지, 이상증식 억제제인지가 감별된다.
여기에서, 이상증식이란 섬유아세포의 이상증식에 의한 질환 상태일 수 있다. 섬유아세포의 이상증식에 의한 질환 상태는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 섬유화(구체적으로는, 비후성 반흔, 켈로이드, 면포반흔, 강피증, 폐선유증, 간선유증 등), 섬유아세포의 마이오피브로블라스트로의 분화에 기인하고 있는 섬유화 등일 수 있다.
본 발명의 하나의 형태는 섬유아세포를 장력의 존재하에 콜라겐 겔 중에서, 피검 물질의 존재하 및 비존재하에 배양하고,
피검 물질의 존재하에 배양한 경우, ETFB의 발현량이 비존재하에 배양했을 때보다도 낮은 경우에는, 당해 피검 물질이 섬유화 억제제라고 하는, 섬유화 억제제의 감별법이다.
피검 물질의 존재하에 배양한 경우, ETFB의 발현량이 비존재하에 배양했을 때보다도 낮은 경우란 한정되지 않지만, 예를 들면, 피검 물질의 존재하에서 발현하지 않았거나, 피검 물질의 존재하에서의 발현량이 ETFB의 발현량이 비존재하에서의 발현량에 대하여 70% 이하, 50% 이하, 10% 이하일 수 있다.
콜라겐 겔 중에서의 피검 물질의 존재하 및 비존재하의 배양은 음성 대조 세포의 증식이 양호하며, 피검 물질의 존재하 및 비존재하에서 세포의 증식의 차이가 명확하게 되는 배양 조건이어도 되고, 한정되지 않지만, 예를 들면, 콜라겐 농도 0.05∼0.5wt% 겔 중에서, 30∼40℃, 12∼72시간의 배양에 의해, 행할 수 있다.
「섬유화 억제제의 감별법」은 「섬유화 억제제의 스크리닝법」이라고 할 수도 있다.
피검 물질로서는 천연물 또는 합성품의 어느 것이어도 되고, 통상 의약 등의 후보 물질이 될 수 있는 것이어도 되고, 구체적으로는, 식물 및 미생물 유래의 추출물 및 그 정제품, 저분자 합성 화합물, 항체, 펩티드, 앱타머, siRNA, 유전자 치료에 사용되는 핵산, 그 수식체나 유도체 등을 들 수 있다.
이러한 감별에 있어서, ETFB는 단백질로서 정량할 수도 있고, ETFB를 코드한 RNA 등의 유전자로서 정량할 수도 있다. 단백질 또는 유전자의 정량법으로서는 상법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 겔 전기영동법, 웨스턴블롯법, ELISA법 등의 면역측정법, 면역조직 화학 분석법, 노던블롯법, PCR법 등으로 측정할 수 있다. RNA 등의 유전자의 정량에는 PCR에 의한 증폭법을 응용할 수 있으므로, 특히 바람직하다.
ETFB를 단백질로서 정량하는 경우, 겔 중의 단백질을 염색 가능한 시약이나, ETFB를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하면 좋다. 항체는 모노클론 항체, 폴리클로널 항체 어느 것이어도 된다. 이들 항체는 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 항체는, 필요에 따라, 형광 색소, 방사성 동위원소, 효소 등으로 표식해도 된다.
ETFB를 유전자로서 정량하는 경우, ETFB의 mRNA와 특이적으로 하이브리드화 할 수 있는 핵산 프라이머 및 상기 mRNA를 주형으로 하여 합성되는 cDNA와 특이적으로 하이브리드화 할 수 있는 핵산 프라이머로 이루어지는 1쌍의 핵산 프라이머를 사용하면 된다. 프라이머는 측정 대상이 되는 유전자의 서열 정보에 기초하여 설계할 수 있다.
PCR 반응을 행하기 위한 프라이머로서는, 예를 들면, 서열표의 서열번호 1 또는 서열표의 서열번호 2에 나타내는 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 이러한 서열을 부분 서열로서 포함하고, ETFB를 코드 하는 염기 서열을 증폭할 수 있는, 동일한 효과를 나타내는 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 기술범위에 속한다. 동 올리고뉴클레오티드의 길이로서는 한정되지 않지만, 예를 들면, 10∼50 염기, 15∼30 염기 정도이다.
(이상증식 억제제)
이와 같이, 피검 물질을 평가하고, ETFB 발현의 억제 작용을 인정한 것에 대해서는, 섬유아세포 이상증식 억제제로 판별할 수 있다. 이러한 섬유아세포 이상증식 억제제는 동 억제제를 유효성분으로 하여 피부 외용제나, 의약조성물로 가공함으로써, 반흔, 특히 비후성 반흔 등의 섬유아세포 이상증식에 기인하는 질병의 예방 또는 치료용의 의약으로 할 수 있다. 예방약으로서는 반흔, 특히 비후성 반흔 등이 발생할 개연성이 높은 부위, 예를 들면, 수술에 있어서의 절제 개소의 주변 등에, 비후성 반흔이 발생하기 전에 미리 투여하여 비후성 반흔의 생성을 막는, 또한 생성된 비후성 반흔이 악화되지 않도록 미리 투여하는 것과 같은 사용을 바람직하게 개시할 수 있고, 치료에 있어서는, 이미 발생해 버린 비후성 반흔 등의 반흔에 투여하여, 당해 반흔을 축소시키는 사용을 바람직하게 예시할 수 있다. 당해 의약의 제제화는 상기 섬유아세포 이상증식 억제제와 제제화를 위한 임의 성분, 예를 들면, 부형제, 붕괴제, 결합제, 착색제, 교미제, 교취제, 분산제, 계면활성제 등을 가하여, 상법에 따라 처리함으로써, 의약 제제로 가공할 수 있다. 의약 제제로서는 내복약, 외용제, 주사제 등의 제형으로 가공 가능하지만, 외용제로 가공하는 것이 특히 바람직하다.
또한 피부편 등의 생체로부터 채취된 샘플에 대하여, 당해 샘플에서 ETFB가 어느 정도 발현했는지를, PCR 등에 의해 확인함으로서, 당해 샘플의 주변의 반흔화로의 경향을 알 수 있다.
이하, 실시예를 들어 더욱 상세하게 설명을 가한다.
실시예 1
(세포 배양)
인간 피부 정상 섬유아세포의 종류는 ATCC로부터 입수 가능한 세포가 다수 존재하지만, 켈로이드 세포주인 (KELFIB)의 프로필에 가장 가까운 CCD-1113sk 세포(39세 흑인 여성 유래)를 우선적으로 사용했다.
섬유아세포는 DMEM(D-6046, Sigma)에 FBS 10%(첨가한 배지에서 조직 배양 플라스크(353024, BD FALCON))에서 37℃, CO2 농도 5%의 환경하에 설정한 인큐베이터(M14-3158, Forma Scientific, 산요)에서 배양했다. 계대 시는 PBS에서 세포를 세정 후, 0.05% 트립신 용액(T4049, Sigma)을 첨가하고, 인큐베이터에서 2∼3분 인큐베이트 한 후에 세포를 회수, 계대하여 사용했다. 계대는 3∼4일 걸러 실시하고, 이 경우, 계대수는 7∼12까지의 것을 사용했다.
(콜라겐 겔 중에서의 세포 배양)
콜라겐 겔 중에서의 배양은 Varedi 등의 방법의 변법을 사용했다. 즉, 분말 배지로부터 통상의 5배로 농축한 DMEM(5xDMEM, D5523, Sigma)을 제작하고, 이하에 나타내는 혼합비로 최종적으로 DMEM 배지와 동일한 조성이 되도록 콜라겐 용액을 제작했다. 제작한 콜라겐 용액은 항온조에서 12℃로 사용 전까지 보존했다. 콜라겐 원액의 필요량(1mg/mL 시는 7mL), 5xDMEM 7mL, 200mM HEPES 3.5mL, 0.03% NaH2CO3 3.5mL, 0.01% NaOH 1.5mL, FBS 필요량(10% 시는 3.5mL), H2O로 총량 31.5mL로 했다. Basal layer를 제작하는 경우에는, 미리 24웰 또는 6웰 조직 배양 플레이트(24웰; 353047, 6웰; 353046, BD FALCON)에 24웰의 경우에는 250μL, 6웰의 경우에는 1mL의 콜라겐 용액을 첨가하고, 인큐베이터에서 15분 이상 정치하여 콜라겐을 고화시켰다.
1x106cells/mL의 세포 부유액을 제작하고, 12℃로 유지한 콜라겐 용액과, 콜라겐 용액:세포 부유액=9:1의 혼합비로 혼합하고, 잘 교반한 후에 신속하게 플레이트에 파종, 인큐베이터로 이동했다. 파종량은 24웰 플레이트에서는 1mL, 6웰 플레이트에서는 4mL(모두 1x105cells/mL)로 했다. 부유 겔을 제작하는 경우에는, 인큐베이터에서 2시간 배양 후, 스패튤러를 사용하여 웰의 가장자리로부터 겔을 떼어 유리시키고 배양을 계속했다.
(세포수의 계측)
각각의 실험에 의해 정해진 배양 시간 후, 최종 농도 310U/mL가 되도록 DMEM을 사용하여 조제한 콜라게나제 용액에, 콜라겐 겔을 스패튤러로 플레이트로부터 벗겨내어 첨가하고, 37℃에서 20∼40분 진탕하여 콜라겐을 소화했다. 소화한 세포 부유액을 1500rpm으로 3∼5분 원심분리하여 세포를 회수했다. 회수한 세포에 대하여 100μL의 배지를 첨가하고, 트리판 블루 염색을 시행한 후 Burkel-Turk 혈구 계산판에서 1/5의 희석률로 생세포수를 계측했다.
(TUNEL 염색)
콜라겐 겔의 콜라겐을 소화하고, 세포를 회수 후, 1mL의 DMEM 배지 및 세포고정액(Collection Fluid, 6768315, Thermo Shandon)을 가하고 뒤집어 섞었다. 그 세포 부유액을 Cytospin(Thermo scientific)으로 원심분리하고, 슬라이드 글래스에 부착시켜 표본을 제작했다. 제작한 표본에 in situ Apoptosis Detection Kit(MK500, Takara)로 취급설명서에 따라 TUNEL 염색을 하였다. 검경은 형광 현미경(ECLIPSE E600, Nikon)으로 100∼400배의 배율로 행하고, 부착 조건하 및 유리 조건하의 양성 세포 출현을 관찰했다.
(2차원 전기영동)
부착 상태 및 유리 상태 배양의 콜라겐 겔 플레이트를 각각 8∼10장 제작하고, 배양 후 1일에 있어서 전술의 수법과 동일하게 콜라겐을 소화했다. 단, 콜라게나제에 의한 비특이적인 단백질 분해를 가능한 한 억제하기 위하여, 1mM의 Benzamidinehydrochrolide Hydrate(B6506, Sigma) 및 0.1mM의 N-α-p-Tosyl-L-Lysine Chloromethylketone Hydrochloride(TLCK, T7254, Sigma) 존재하에서 실시했다.
소화 후의 세포를 원심분리에 의해 에펜도르프 튜브에 회수하고, PBS로 2회 세정했다. 이 동안의 작업은 가능한 한 빙냉 하에서 실시했다. 그때의 세포 습중량은 100∼200mg이었다. 막 획분의 추출은 ProteoPrep Membrane Extraction Kit(Sigma)를 취급설명서에 따라 사용했다. 또한, 세포를 융해할 때는 프로테아제(Protease Inhibitor Cocktail, P2714, Sigma) 및 포스파타아제 저해제(Phosphatase inhibitor cocktail I&II, P2850&P5726, Sigma)를 취급설명서에 따라 첨가했다. 추출한 단백질은 Coomassie Protein Assay Reagent Kit(2320, PIERCE)로 취급설명서에 따라 단백질량을 측정하고, 딥프리저에서 사용 전까지 보존했다. 1회의 추출에서의 추출률(세포의 습중량으로부터 얻어진 막 단백질의 양)은 약 1/300이었다.
2차원 전기영동은 파르마시아사의 2차원 전기영동 장치를 사용하여 실시했다. 등전점 전기영동은 18cm의 겔(Immobile Dry Strip, Amersham)을 사용하고, pI 레인지: 3∼10NL(non-linear), 5.5∼6.7 및 6∼9를 검토했다. 단백질의 어플라이량은 100∼300μg으로 했다. 등전점 전기영동은 취급설명서에 따라 Cup loading법으로 전개했다. 전기영동 장치는 Ettan IPGphor IEF System(Amersham)을 사용하고, 전개 조건은 이하에 나타내는 조건으로 했다.
50μA/Strip, 20℃
S1: Gradient 500V 1min.
S2: Gradient 4000V 4h
S3: Step-n-hold 8000V 10h
S4: Step-n-hold 6000V 회수까지
등전점 전기영동 후, Multiphor II electrophoresis unit(18-1018-06, Amersham) 및 Electrophoresis Power supply(19-3500-01, Amersham)로 SDS-PAGE를 실시했다. 겔은 프리캐스트 겔(Excel-Gel SDS, 80-1255-53, Amersham, 245×110mm, 0.5mm thin, Gradient 8-18%)을 사용하고, 영동 조건을 S1: 600V, 400mA, 13W, 30min., S2: 600V, 400mA, 30W, 16h로 했다. 전개 후의 겔은 자동 염색 장치(Hoefer Processor Plus, Amersham)로 Silver stain MS kit(299-58901, 와코쥰야쿠)를 사용하여 취급설명서에 따라 은 염색을 실시하고, 각 겔에서 염색 조건이 동등하게 되도록 염색을 실시했다. 또한, 현상 시간은 6분으로 했다. 이상의 조작을 반복하여, 부착 상태 및 유리 상태, pI 레인지당 각각 5장씩의 겔을 제작했다. MALDI-TOF-MS 해석까지, 8.7% Glycerol액 중에 4℃로 보존했다.
(디퍼렌셜·디스플레이 해석)
염색이 종료된 겔은 스캐너(Image Scanner III, 28-9076-07, Amersham)를 사용하여 컴퓨터에 받아들인다. 받아들인 화상은 화상 해석 소프트웨어(2D Master Elite Ver. 4.01, 2D Master Database Ver. 4.00, Amersham)를 사용하여 이하의 수순으로 해석을 실시했다. DD에 있어서의 전체적인 흐름은 이하에 나타낸다.
(1) 컴퓨터에 의한 스폿의 자동 검출, 육안 확인에 의한 중복 스폿의 수정
(2) 스폿으로서 검출되지 않은 겔의 백그라운드 및 염색된 스폿 전체의 염색 강도의 겔 사이에서의 표준화
(3) 겔 사이에서 이동도로부터 공통으로 존재한다고 인식되는 스폿의 넘버링(매칭, 여기에서 검출되는 번호를 Match No.라고 부름) 및 동일한 샘플의 영동상이 정말로 동등한지 아닌지의 통계 처리(본 처리에서 동등이라고 판단된 겔을 DD에 제공함).
(4) t 검정에 의한 DD(기각률 10%)
또한 동시에 육안으로 DD를 실시하고, 컴퓨터 처리에서 산출된 스폿이 정말로 염색 강도가 상이한지 아닌지의 판단 및 컴퓨터 처리에서는 유의하지 않았지만, 육안으로 강도가 상이한 스폿의 추가를 실시했다.
<1> 스폿 검출
Image Scanner III에서 받아들인 화상을 트리밍하여, 사이즈를 동등하게 했다. 2D Master Elite로 자동 스폿 검출을 이하의 패러미터로 실시했다.
Peak Dilation Parameters:
Min. Peak Area 85
Max. Peak Area 1100
Min. Aspect Ratio 0.4
Max. Aspect Ratio 4.5
Min. Area Ratio 50
<2> 백그라운드 제거 및 스폿 강도 표준화
2D Master Elite에 탑재되어 있는 백그라운드 제거 설정 및 스캔된 겔 염색 농도를 표준화하는 작업을 취급설명서에 따라 실시했다.
Max. Number of Touching Peaks 20
백그라운드 Intensity 0
Step Size 1
Smoothing Size 1
Histogram Equalization 없음
Tidy Edges 있음
그 후 육안으로 스폿을 확인하고, 중복해서 인식되고 있는 스폿의 수정을 실시했다.
<3> 스폿 매칭 및 겔 동등성 판단
스폿 이미지가 양호하고 스폿수가 많은 유리된 상태의 겔상을 Reference gel로 설정하고, 취급설명서에 따라 스폿의 매칭을 실시했다. 또한 2D Master Database에 탑재되어 있는 Test Hypothesis 기능을 사용하여 Reference gel과의 Dunnett 검정을 실시하고, 5장의 겔 중, 3장 이상 동등하다고 인정된 군에 대하여 <4>의 작업을 실시했다.
<4> 부착 상태 및 유리 상태에서의 배양 세포의 DD
2D Master Database를 사용하여, 매칭한 스폿에 대하여 기각률 10%의 t 검정을 실시하고, 스폿 강도에 차이의 있는 것을 추출했다. 그 후 산출된 스폿을 육안으로 확인하고, 육안으로도 차이가 있는지를 확인했다. 또한 동시에 스폿 전체에 대하여 육안으로 재확인하고, 컴퓨터 처리로 검출되지 않은, 부착 상태·유리 상태에서 농도에 차이가 있는 스폿을 추가했다.
상기의 절차로, 발현량에 차이가 있다고 인정된 스폿에 관하여, MALDI-TOF-MS에 의한 추정을 실시했다. 해석에 의해 동등하다고 판단된 3∼4장의 겔로부터, 발현량이 많은 쪽의 군의 스폿을 잘라냈다. 단백량이 적은 것이 예상되었으므로, 이것들의 겔 단편을 모아서 하나의 샘플로서 시험에 제공했다. 스폿의 탈은 및 트립신 소화는 96웰의 트립신 소화 장치 및 키트(Montage In-Gel Digest Kit, 밀리 포어)를 사용하여 취급설명서에 따라 실시했다. 트립신 소화를 실시한 단백질을 앵커 칩(74115, 브루커 달토닉스)에 매트릭스(CHCAmatrix; 10mg/mL α-CHCA in acetone-Ethanol 1:1v/v)와 함께 1μL 스폿 하고, 건조 후 MALDI-TOF-MS(AutoFlex II, 브루커 달토닉스)에서 Peptide Mass Fingerprinting(PMF) 해석을 실시했다. PMF 해석은 매트릭스로부터 튀어나오는 펩티드 단편의 질량 패턴으로부터 단백질을 추정하는 방법이다. 단백질량이 충분히 존재하는 스폿에 관해서는, 유사 MS/MS 해석이며, 아미노산 서열을 해석할 수 있는 Post Source Decay(PSD) 해석을 실시하여 동정을 시도했다. 이것들의 해석결과를 데이터베이스 검색에 걸어 결과를 얻었지만, 그 데이터베이스는, MASCOT(Ver. 1.9, Matrix science)를 사용하여, PMF 해석으로 얻은 결과는 MOWSE 알고리즘에 의한 스코어 분포에 있어서 확률 95% 이상이며, MASCOT 상에서 산출되고 있는 분자량 및 등전점이 동등한 것을 그 단백으로서 결정했다. PSD 해석은 그 아미노산 서열로부터 동 데이터베이스를 사용하여 후보를 검색하고, 분자량 및 등전점이 동등한 것을 그 단백질로 했다. 본 실험조건에서 BSA를 사용한 PMF 해석에 의한 검출 하한은 5fmol이었다.
합계 31의 스폿에 대하여 결정을 시도했다. MALDI-TOF-MS로 결정한 단백의 리스트를 표 1 및 2에 나타낸다. 31개의 스폿 중, 결정한 단백은 18개(중성 영역 8개, 염기성 영역 10개)이었다. 그간 부착 상태에서 발현량이 높았던 단백은 8개, 유리 상태에서 발현량이 높았던 단백은 9개, 스폿 시프트로 생각되는 단백이 1개이었다. 또한 막에 국재하고 있는 단백이 9, 핵이 2, 세포질 국재가 3, 분비 단백이 1, 불명이 3이었다. 외막의 단백은 얻어지지 않았지만, 세포 내의 막 단백에 대해서는 어느 정도 얻어졌고, 총 단백에서 많이 얻어지는 샤페론은 2종이며, 획분화는 효과가 있었던 것으로 생각되었다. 부착 상태에서 발현량이 높았던 8개의 단백은 미토콘드리아막에 국재하고 있는 것이 3종, 핵에 존재하고 있는 것이 2종, 막에 국재하고 있는 것이 1종, 국재 불명이 2종이었다. 또한 얻어진 단백 중에서 창상 치유 및 반흔 형성에 관한 보고가 있는 것은 Citrate synthase가 창상 형성 후 10일 중에 발현량이 높아진다고 하는 보고, Galectin-3의 녹아웃 마우스에서 각막 창상에 있어서의 재상피화의 지연이 확인되었다는 보고, ETFB가 저출력의 적색광을 섬유아세포에 조사했을 때에 발현 상승하는 보고가 있는 이외는 불분명했다.
Figure 112014028528677-pct00001
Figure 112014028528677-pct00002
(siRNA의 억제 효과 및 특이성 확인 시험)
세포는 상기와 마찬가지로 CCD-1113sk 세포(ATCC No. CRL2439, 인간 피부 진피 정상 섬유아세포, 흑인 39세 여성 유래)를 사용하여, 전술의 수법과 동일하게 유지했다. 도입 시약으로서 리포펙타민 2000(LF2000, 11668019, Invitrogen)을 취급설명서에 따라 사용했다. 도입 시에는 OPTI-MEM(31985062, Invitrogen)을 배지로서 사용했다. LF2000은 양이온성의 리포좀이며, 음이온성의 siRNA와 컴플렉스를 형성하고, 엔도좀 또는 리소좀을 경유하여 세포 내에 받아들여진다. siRNA는 표 3에 기재한 것을 사용하여, Galectin-3 이외는 구입했다. Galectin-3은 Takara의 HP에서의 siRNA Design Support System(http://www.takara-bio.co.jp/rnai/intro.htm)을 사용하여 설계했다. 사용 시에, 단층 배양으로 트랜스펙션 후 1일간 배양한 CCD-1113sk 세포를 사용하여, QuantiGene에 의해 mRNA의 발현 억제를 확인했다. 또한 사용한 siRNA의 특이성을 확인하기 위하여, BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에 의해 siRNA가 작용하는 서열을 검색하고, 그 유사 서열을 갖는 유전자에 대한 QuantiGene 프로브를 사용하여 동일한 샘플로부터 mRNA를 측정하고, 억제 효과가 확인되지 않은 siRNA를 사용했다. 또한 음성 대조로서 Silencer Negative control siRNA #1(4611, Ambion)을 사용했다.
Figure 112014028528677-pct00003
상기의 siRNA의 억제 효과 및 특이성 확인 시험에서는, CCD-1113sk 세포를 2.5x104개, 12웰 플레이트에 전날에 배양하고, LF2000을 사용하여 취급설명서에 따라 siRNA를 도입했다. 사용한 LF2000량은 최종 농도로 4μL/well, siRNA는 33nM, 배지량은 2mL이었다. 그대로 1일 배양하고, Lysis Buffer(QG0503, Panomics)를 1mL 첨가하여 QuantiGene에서의 측정 시료로 하고, 사용 전까지 딥프리저에서 보존했다. QuantiGene은 취급설명서에 따라 처리를 행하고, 1샘플당 n=2로 측정을 실시했다. 측정은 플레이트 리더(ARVO.SX, Wallac, PerkinElmer)를 사용하고, 45℃의 조건하에서 화학 발광의 측정을 실시했다. 이하의 식 1에서 억제율을 산출하고, 타깃 유전자의 억제율이 20% 이하이며, 특이성 확인 유전자가 억제되지 않은 것을 사용했다.
억제율(%)=(타깃 유전자 siRNA 도입시의 타깃 유전자의 화학 발광값-백그라운드값)/(타깃 유전자 siRNA 도입시의 GAPDH의 화학 발광값-백그라운드값) ...(식1)
콜라겐 겔 내 배양에서는, CCD-1113sk 세포를 1.5x105개/10cm 디쉬(353003, FALCON)에 파종하고, 하룻밤 배양 후, LF2000을 취급설명서에 따라 사용하고, siRNA 를 트랜스펙션했다. 1일 후, 이들 세포를 사용하여, 상기와 동일한 방법으로 1시점 유전자당 n=2로 하고 콜라겐 겔 내 배양을 실시했다. 콜라겐 겔 내 배양 개시일로부터 배양 후 4일까지 1일마다 겔 내의 세포수를 계측했다. 세포수의 계측은 상기의 방법으로 실시했다. 배양 개시일 및 배양 후 3∼4일의 계측에 사용한 세포는 각 군의 세포를 모아, Lysis Buffer를 100μL 첨가하고, QuantiGene에 의해 mRNA의 측정을 실시했다. 또한, QuantiGene은 이하의 표 4에 나타내는 프로브를 구입하여 사용했다.
Figure 112014028528677-pct00004
상기의 결과를 기초로, siRNA의 트랜스펙션에 의한, 섬유아세포 이상증식 억제 단백질의 동정을 행했다. 즉, 각각의 단백질의 siRNA를 구입하고, 10cm2 샤알레에서 24시간 배양 후에 siRNA 트랜스펙션 처리를 실시하고, 그 24시간 후에 콜라겐 겔 내 배양을 실시했다. 그 결과는 도 1에 나타낸다. 검은 막대그래프는 부착 상태의 결과, 흰 막대그래프는 유리 상태의 결과를 나타낸다. 부착 상태에서 세포 증식의 억제를 나타내는 인자는 GAL3, EHD1 및 ETFB이었다. 또한 DnaJB5는 세포수의 증식 항진을 확인했다. 한편, 유리 조건하에서 GAL3 및 DnaJB5는 세포수의 감소를 확인했고, 세포 독성이 시사되었다. MO25 및 CS는 세포 증식의 항진이 확인되었다. GAL3은 부착 상태에서 세포 증식 억제가 확인되었지만, 유리 상태하에서 세포수 감소를 확인했으므로, 이 세포 증식 억제는 세포 독성에 의한 가능성을 부정할 수 없었으므로 후보에서 제외했다. 한편, EHD1 및 ETFB는 유리 상태에서도 세포수의 현저한 저하를 확인할 수 없고, 또한, 부착 상태에서 세포 증식 억제를 나타냈다. 그래서, 2인자에 대하여 재현성을 확인하기 위해, 보다 상세하게 시험을 실시했다. 그 결과, EHD1은 재현성이 얻어지지 않았다. 한편, ETFB는 부착 상태에서 Negative control 보다도 세포 증식의 억제가 확인되고, 부착 상태에서는 세포수는 현저하게 저하되지 않고(도 2를 참조) 동일한 경향이 확인되어, 재현성이 얻어졌다.
(siRNA에 의한 녹다운 실험)
전술의 ETFB의 기능을 조사하기 위하여, siRNA에 의한 녹다운 실험을 행했다. 즉, CCD-1113sk 세포(ATCC No. CRL2439, 인간 피부 진피 정상 섬유아세포, 흑인 39세 여성 유래)를 사용하여, 상기와 같이 유지했다. siRNA 및 도입 시약은 상기와 동일한 것을 사용했다. 또한 음성 대조로서 Silencer Negative control siRNA #1(4611, Ambion), 또는 AllStars Negative Control siRNA(Cat. No.1027281, QIAGEN)를 사용했다. 도입 방법은 전술의 방법과 동일하게 실시했다.
TGF-β를 첨가하는 경우에는, 콜라겐 용액 제작시에 Human rTGF-β1(100-B-010, R&D Systems)을 첨가하여 혼합 후, 동일하게 파종했다.
mRNA의 측정은 qRT-PCR를 실시했다. 즉, 각 실험에서 회수한 세포로부터 RNeasy mini kit(74104, QIAGEN)을 취급설명서에 따라 total RNA를 정제했다. RNA 0.1μg으로부터 QuantiTect Reverse Transcription Kit(205311, QIAGEN)을 사용하여 취급설명서에 따라 cDNA를 조제했다. cDNA 5μL에 대하여 QuantiTect SYBR GreenPCR Kit(204145, QIAGEN)을 사용하여, real-time PCR machine(ABI PRISM 6700, Applied Biosystem Inc.)에 의해 mRNA 발현량을 측정했다. 또한, 측정은 triplicate로 하고, 동시에 GAPD의 발현량 측정을 실시했다. 프라이머는 표 5에 기재된 이하의 것을 사용했다. 또한 콜라겐 겔 배양을 실시하고, 배양 0일부터 스캐너(Multiscanner III, 아마샴)를 사용하여 24웰 플레이트를 촬영했다. 촬영 후, NIH Image를 사용하여 well 내의 겔의 면적을 측정했다. Well의 바닥면적을 100%로 하고, 측정한 면적의 퍼센트를 산출했다.
Figure 112014028528677-pct00005
CCD-1113sk 세포에 siRNA를 트랜스펙션 하고, 1일 배양 후, 5x104개의 세포를 커버 글라스를 넣은 6웰 플레이트에 파종했다. 그 때, Human rTGF-β1(100-B-010, R&D Systems)을 최종 농도로 0 또는 11ng/mL 첨가하고, 3일간 배양했다. 배양 후 PBS로 2회 세정하고, 10% 중성 완충 포르말린을 가하고 20분 실온에서 고정했다. PBS로 2회 세정 후에 0.2% Triton-X100을 포함하는 PBS로 15분 처리하고, TBS로 3회 세정했다. 그 후 Phalloidin Alexa 488(A-12379, Invitrogen)을 5μ/well 첨가하고, 20분간 실온 처리했다. TBS로 3회 세정 후에 슬라이드 글라스를 꺼내고, Fluoromount(K024, Diagnostics BioSystems(코스모 바이오))로 봉입하고, 형광 현미경(ECLIPSE E600, Nikon)으로 관찰했다. 결과를 도 3에 나타낸다. 상단 좌측 도면은 TGF-β11ng/mL 존재하에, Negative control siRNA 첨가계의 결과, 상단 우측 도면은 TGF-β11ng/mL 존재하에, ETFB siRNA 첨가계의 결과이다. 하단은 각각 상단의 도면의 확대도이다. 이것으로부터, siRNA 첨가계에서는 TGF-β 존재하에서도 엑틴 필라멘트의 형성이 보이지 않는 것을 알 수 있다.
ETFB에 대한 siRNA를 트랜스펙션한 세포에 대하여 겔 수축의 지연이 일어나지 않는지를 확인했다. 그 결과, ETFB에 대한 siRNA를 트랜스펙션한 세포에서는, Negative control siRNA를 처리한 섬유아세포와 마찬가지로 배양 1일에 거의 20%로 수축하고, 그 후도 거의 Negative control과 차이가 없는 수축률이었다(도 4를 참조). 이상으로부터 in vitro의 본 모델에서는 ETFB의 기능 결손은 상처를 막는 작용에 대하여 악영향을 주지 않는 것이 시사되었다. 또한 이 실험결과는, 비후성 반흔을 포함하는 켈로이드성의 섬유아세포이어도, 통상의 섬유아세포와 동일한 거동을 나타내는 것을 시사했다. 이것은 켈로이드 등의 섬유아세포의 증식에 대해서도 본원발명의 방법을 적용할 수 있는 것을 의미한다.
과잉 콜라겐 발현은 섬유아세포가 마이오피브로블라스트로 분화됨으로써 야기되며, 섬유아세포에서의 마이오피브로블라스트 분화 마커로서 SMA(α-smooth muscle actin)의 발현 상승이 보고되어 있다. 또한 SMA 발현 상승은 TGF-β의 자극에 의해 야기된다. 만약 ETFB 기능 억제가 콜라겐, SMA 발현을 억제하는 것이라면 본 인자는 섬유아세포의 과잉 세포수 증식을 억제함으로써 비후를 억제할 가능성과 아울러 비후성 반흔 치료약으로서의 기대가 높아진다. 그래서 이들 인자의 거동을 확인했다.
우선 콜라겐 겔 내 배양의 부착 상태에서의 ETFB, COL1A1, SMA mRNA의 거동을 Negative control 및 ETFB의 siRNA를 트랜스펙션한 상태에서 조사했다(도 5). Negative control에서는, ETFB는 배양 3일 후까지는 발현량이 증가했다. COL1A1은 편차는 있지만 배양 3일 후까지 발현량은 증가했다. SMA는 배양 1일이 최대값이 되고, 그 후 저하했다. 한편, ETFB siRNA를 처리한 군은 ETFB는 배양 4일 후까지 그 발현은 거의 확인되지 않고, siRNA의 효과가 지속되고 있었다.
TGF-β 존재하에서의 콜라겐 겔 내 배양으로 ETFB 기능 결손이 콜라겐, SMA 발현에 주는 영향을 확인했다. Negative control 또는 ETFB의 siRNA를 CCD-1113sk 세포에 트랜스펙션하고, 콜라겐 겔 내 배양을 개시할 때에 조제하는 콜라겐 겔 용액에 rTGF-β를 최종 농도로 300ng/mL가 되도록 첨가하고, 배양 1일 후에 콜라게나제를 사용하여 세포를 회수하고, ETFB, COL1A1 및 SMA의 mRNA의 발현량을 측정했다(도 6). 그 결과, ETFB 발현량은 TGF-β 첨가에 의해 약 1.5배 상승했다. COL1A1은 TGF-β 첨가에 의해 Negative control, ETFB siRNA 어느 처리에서도 2∼2.5배 발현량이 상승했다. 한편 SMA는 Negative control은 TGF-β 첨가에 의해 발현량이 1.7배 증가한 것에 반해, ETFB siRNA 처리군은 증가가 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터, ETFB의 기능 결손은 장력에 의해 야기되는 섬유아세포 증식을 억제함과 아울러, 콜라겐의 발현에는 영향이 없어, SMA 발현 상승, 즉 마이오피브로블라스트 분화를 억제하는 것을 알 수 있다.
이들 결과로부터, ETFB는 섬유아세포 이상증식의 인자인 것이 증명되었다. 이 동향을 모니터함으로써, 반흔 등의 섬유아세포의 이상증식이 일어날 개연성을 판별할 수 있는 것도 알 수 있다. 또한 콜라겐 겔 중에서의 섬유아세포의 배양에서, 장력존재하 및 비존재하에서의 ETFB의 동향이 피검 물질에 의해 어떻게 변화될지를 판별함으로써, 섬유아세포 이상증식을 억제하는 성분을 스크리닝할 수도 있다. 또한 이러한 조건으로 스크리닝 된 섬유아세포 이상증식을 억제하는 성분은, 섬유아세포 증식을 억제함과 아울러, SMA 발현 상승, 즉 마이오피브로블라스트 분화를 억제할 수 있다. 따라서, 동 성분은 섬유아세포 증식을 억제하고, 또한 섬유아세포가 마이오피브로블라스트로 분화됨으로써 야기되는 과잉 콜라겐 발현을 억제함으로써, 이러한 현상이 관여하는 질환, 즉, 섬유화 및 비후성 반흔 등의 치료 및 예방약으로서 사용할 수 있는 것을 알 수 있다.
본 발명은 섬유아세포 이상증식을 억제하는 의약의 개발에 응용할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> POLA PHARMA Inc. <120> ETFB의 세포 이상증식에 대한 적용 방법 및 이상증식 억제제 <130> OP-11349 <150> JP2011-206582 <151> 2011-09-05 <160> 6 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ggggacaagt tgaaagtgga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 cagagagctt ggaggtcagg 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gtggccatcc agctgacc 18 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 agtggtaggt gatgttctgg gag 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 tgcaccacca actgcttagc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 ggcatggact gtggtcatga g 21

Claims (22)

  1. 채취된 섬유아세포에서의 ETFB(일렉트론트랜스퍼 플라보프로틴 베타 서브유닛)의 발현의 정도를 지표로 하는 섬유아세포의 증식 상태의 감별법으로서,
    피검 시료의 섬유아세포에서의 ETFB의 발현량이 대조의 섬유아세포에서의 발현량에 대하여 높은 경우에는, 섬유아세포의 마이오피브로블라스트로의 분화에 기인하는 섬유화가 발생했을 개연성이 높고,
    피검 시료의 섬유아세포에서의 ETFB의 발현량이 대조의 섬유아세포에서의 발현량에 대하여 동일하거나 또는 낮은 경우에는, 섬유아세포의 증식이 정상으로 유지되고 있을 개연성이 높다고 판별하는 섬유아세포의 증식 상태의 감별법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    섬유화가 비후성 반흔의 형성인 것을 특징으로 하는 감별법.
  3. 제 1항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 ETFB의 발현이 단백질의 발현인 것을 특징으로 하는 감별법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 ETFB의 발현이 RNA의 발현인 것을 특징으로 하는 감별법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    ETFB의 발현의 정도를 PCR으로 측정하는 것을 특징으로 하는 감별법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 PCR에 사용하는 프라이머는
    서열번호 1에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이것을 부분서열에 갖고, ETFB를 코드하는 염기서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 및
    서열번호 2에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이것을 부분서열에 갖고, ETFB를 코드하는 염기서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 감별법.
  7. 섬유화가 의심되는 장기로부터 채취된 섬유아세포에서의 ETFB의 발현의 정도를 지표로 하는 장기에서의 섬유화의 감별법으로서,
    피검 시료의 섬유아세포에서의 ETFB의 발현량이, 대조의 섬유아세포에서의 발현량에 대하여 높은 경우에는, 당해 장기에서 섬유아세포의 마이오피브로블라스트로의 분화에 기인하는 섬유화가 일어났을 개연성이 높다고 판별하고,
    피검 시료의 섬유아세포에서의 ETFB의 발현량이 대조에서의 발현량에 대하여 동일하거나 또는 낮은 경우에는, 섬유화가 일어났을 개연성은 낮다고 판별하는 장기에서의 섬유화의 감별법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 장기가 피부인 것을 특징으로 하는 장기에서의 섬유화의 감별법.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 ETFB의 발현이 단백질의 발현인 것을 특징으로 하는 감별법.
  10. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    상기 ETFB의 발현이 RNA의 발현인 것을 특징으로 하는 감별법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    ETFB의 발현의 정도를 PCR으로 측정하는 것을 특징으로 하는 감별법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 PCR에 사용하는 프라이머는
    서열번호 1에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이것을 부분서열에 갖고, ETFB를 코드하는 염기서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 및
    서열번호 2에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이것을 부분서열에 갖고, ETFB를 코드하는 염기서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 감별법.
  13. 섬유아세포를 장력 및 TGF-β의 존재하에 콜라겐 겔 중에서 피검 물질의 존재하 및 비존재하에 배양하고,
    피검 물질의 존재하에 배양한 경우, ETFB의 발현량이 비존재하에 배양했을 때보다도 낮은 경우에는, 당해 피검 물질이 섬유아세포의 마이오피브로블라스트로의 분화에 기인하는 섬유화 억제제라고 하는 섬유화 억제제의 감별법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 섬유화는 비후성 반흔의 형성인 것을 특징으로 하는 섬유화 억제제의 감별법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 섬유화가 피부에서의 비후성 반흔인 것을 특징으로 하는 섬유화 억제제의 감별법.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ETFB의 발현이 단백질의 발현인 것을 특징으로 하는 감별법.
  17. 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 ETFB의 발현이 RNA의 발현인 것을 특징으로 하는 감별법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    ETFB의 발현의 정도를 PCR으로 측정하는 것을 특징으로 하는 감별법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 PCR에 사용하는 프라이머는
    서열번호 1에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이것을 부분 서열에 갖고, ETFB를 코드하는 염기 서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 및
    서열번호 2에 기재된 올리고뉴클레오티드 또는 이것을 부분 서열에 갖고, ETFB를 코드하는 염기 서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 감별법.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
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