JP6189466B2 - Etfbの細胞異常増殖への適用方法及び異常増殖抑制剤 - Google Patents
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Description
抑制剤、該抑制剤からなる細胞の異常増殖症の処置薬に関する。
一方、ETFBは電子伝達に係わる蛋白質であり(例えば、特許文献4、特許文献5、特許文献6、特許文献7を参照)、時として、バイオマーカーに使用されることもあるが、その実態についてはあまり知られていない。脂質貯留性筋疾患においては、ETFBの変異が見られるとの報告(例えば、非特許文献1を参照)、II型糖尿病の要因の一つであるとの示唆(例えば、非特許文献2を参照)、マルチプル・アシルコエンザイムAデヒドロゲナーゼ・デフィシェンシー(Multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency;MADD)の一要素であるとの示唆(例えば、非特許文献3を参照)などが知られているが、皮膚などとの関連も、線維芽細胞との関係も全く知られていない。また、ETFBとTGF−βとの関連も全く知られていない。
<1> ETFB(エレクトロントランスファー フラボプロテイン ベータ サブユニット)の発現の度合いを指標とする、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法であって、
当該ETFBの発現の度合いが高い場合には、線維芽細胞の異常増殖が生じている蓋然性が高く、
ETFBの発現の度合いが低い場合には、線維芽細胞の増殖が正常に保たれている蓋然性が高い、と判別する、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法。
<2> 前記ETFBの発現の度合いが高い場合が、被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して高い場合であり、
前記ETFBの発現の度合いが低い場合が、被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して同じ又は低い場合である、<1>に記載の鑑別法。
<3> 前記線維芽細胞の異常増殖が、繊維化である、<1>に記載の鑑別法。
<4> 前記線維化が、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因しているものである、<3>に記載の鑑別法。
<5> 線維芽細胞の異常増殖が、肥厚性瘢痕の形成である、<1>に記載の鑑別法。
<6> 線維化を疑われる臓器の線維芽細胞における、ETFBの発現の度合いを指標とする、臓器における線維化の鑑別法であって、
ETFBの発現の度合いが高い場合には、当該臓器において線維化が起こっている蓋然性が高いと判別し、
ETFBの亢進が認められない場合には、線維化が起こっている蓋然性は低いと判別する、臓器における線維化の鑑別法。
<7> 前記ETFBの発現の度合いが高い場合が、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して高い場合であり、
ETFBの亢進が認められない場合が、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して同じ又は低い場合である、<6>に記載の臓器における線維化の鑑別法。
<8> 前記臓器が皮膚である、<7>に記載の臓器における線維化の鑑別法。
<9> 線維芽細胞を、張力の存在下コラーゲンゲル中で、被検物質の存在下及び非存在下培養し、
被検物質の存在下培養した場合、ETFBの発現量が非存在下培養したときよりも低い場合には、当該被検物質が、線維化抑制剤であるとする、線維化抑制剤の鑑別法。
<10> 前記線維化は、肥厚性瘢痕の形成である、<9>に記載の異常線維化抑制剤の鑑別法。
<11> 前記線維化が皮膚における肥厚性瘢痕である、<10>に記載の線維化抑制剤の鑑別法。
<12> 前記ETFBの発現がタンパク質の発現である、<1>〜<11>の何れかに記載の鑑別法。
<13> 前記ETFBの発現がRNAの発現である、<1>〜<11>の何れかに記載の鑑別法。
<14> ETFBの発現の度合いをポリメリゼーションチェインリアクション(PCR)で測定する、<13>に記載の鑑別法。
<15> 前記PCRに用いるプライマーは、
配列番号1に記載のオリゴヌクレオチド又はこれを部分配列に持ち、ETFBをコードする塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチド、及び、
配列番号2に記載のオリゴヌクレオチド又はこれを部分配列に持ち、ETFBをコードする塩基配列を増幅することができるオリゴヌクレオチドである、<14>に記載の鑑別法。
<16> 線維芽細胞を、張力の存在下コラーゲンゲル中で、被検物質の存在下及び非存在下培養し、被検物質の存在下培養した場合、ETFBの発現量が非存在下培養したときよりも低い被検物質からなる、線維化抑制剤。
<17> 前記線維化は、肥厚性瘢痕の形成である、<16>に記載の線維化抑制剤。
<18> <16>に記載の線維化抑制剤を有効成分とする、肥厚性瘢痕処置薬。
<19> 生じた肥厚性瘢痕の治療用である、<18>に記載の肥厚性瘢痕処置薬。
<20> 生じた肥厚性瘢痕が悪化をしないための予防用である、<18>に記載の肥厚性瘢痕処置薬。
<21> 生じる蓋然性が高い瘢痕が生じることを防ぐ予防用である、<18>に記載の肥厚性瘢痕処置薬。
<22> ETFBをコードする塩基配列を増幅することができる、配列番号1又は2に
表されるオリゴヌクレオチドと実質同一なオリゴヌクレオチド。
本発明の主要素となる、ETFBは、エレクトロントランスファー フラボプロテイン
ベータ サブユニットとも称され、その詳細な塩基配列、アミノ酸配列は既にジーンバンクなどの遺伝子データバンクに登録されている。例えば、ヒト型のETFBであれば、ジーンバンクにCAG33108.1で登録されている。このものは、以下の手続を経て、線維芽細胞の増殖因子として同定された。
したがって、本発明では、RNA等の遺伝子をターゲットとすることも出来るし、蛋白質をターゲットとすることも出来る。
この様な過程を経て、本願発明者らは、線維芽細胞のコラーゲンゲル中での張力負荷培養、具体的には、細胞が培養器の壁面乃至は底面に付着した状態で培養される条件において、ETFBが特異的に産生されることを見出した。即ち、線維芽細胞のコラーゲンゲル中での培養において、ETFBの産生量を指標に線維化等の線維芽細胞の異常増殖が促進されているか否かを鑑別することが出来る。
すなわち、本発明の一形態は、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法において、ETFB(エレクトロントランスファー フラボプロテイン ベータ サブユニット)の発現の度合いを指標とする、増殖状態の鑑別法であって、
ETFBの発現の度合いが高い場合には、線維芽細胞の異常増殖が生じている蓋然性が高く、
ETFBの発現の度合いが低い場合には、線維芽細胞の増殖が正常に保たれている蓋然性が高い、と判別する、線維芽細胞の増殖状態の鑑別法である。
ここで、「ETFBの発現の度合いを指標とする」とは、「ETFBの発現の度合いをマーカーとして測定する」と言うこともできる。
「線維芽細胞の異常増殖が生じている蓋然性が高い」とは、「線維芽細胞の異常増殖が生じているリスクが高い」と言うこともできる。「線維芽細胞の増殖が正常に保たれている蓋然性が高い」とは、「線維芽細胞の異常増殖が生じているリスクが低い」と言うこともできる。「線維芽細胞の増殖状態の鑑別法」は、「線維芽細胞の異常増殖のリスクの予測方法」と言うこともできる。
ETFBの発現の度合いが高い場合とは、被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して高い場合であり、
ETFBの発現の度合いが低い場合とは、被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して同じ又は低い場合であり得る。
ETFBの発現の度合いが高い場合とは、限定されないが、例えば、被検試料の線維芽細胞においては発現しているが、対照の線維芽細胞においては発現していないか、又は被検試料の線維芽細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して150%以上、300%以上、500%以上であり得、
ETFBの発現の度合いが低い場合とは、限定されないが、例えば、被検試料の線維芽
細胞における発現量が、対照の線維芽細胞における発現量に対して同じ又は70%以下、50%以下、10%以下であり得る。
被検試料の線維芽細胞は、線維芽細胞の増殖状態を鑑別される必要のある対象の細胞であり、特に限定されず、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物等由来の細胞であり得る。
対照の線維芽細胞は、対象の正常線維芽細胞又は対象と同一又は類似の生物種の正常線維芽細胞又は確立された正常線維芽細胞であり得る。確立された正常線維芽細胞としては、上記と同様の確立された細胞を用いることが出来る。
ETFBの発現の度合いは、後記のとおり、ETFB蛋白質の発現を測定してもよく、ETFBをコードしたRNA等の遺伝子の発現を測定してもよい。線維芽細胞におけるETFB蛋白質又はETFBをコードした遺伝子の測定方法は、特に限定されず、例えば、常法に従って、細胞を破砕し、ETFB蛋白質又はETFBをコードした遺伝子を含む細胞抽出液を得て、細胞抽出液に含まれるETFB蛋白質又はETFBをコードした遺伝子を、後記のような通常の測定方法により測定することにより行うことが出来る。
本発明において「線維芽細胞の異常増殖」とは、線維芽細胞の異常増殖による疾患状態であり得る。線維芽細胞の異常増殖による疾患状態は、特に限定されず、例えば線維化(具体的には、肥厚性瘢痕、ケロイド、強皮症、面皰瘢痕、肺線維症、肝線維症等)、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因している線維化等であり得る。
度合いを指標とする、臓器における線維化の鑑別法であって、ETFBの発現の度合いが高い場合には、当該臓器において線維化が起こっている蓋然性が高いと判別し、ETFBの亢進が認められない場合には、線維化が起こっている蓋然性は低いと判別する、臓器における線維化の鑑別法である。
ここで、「臓器において線維化が起こっている蓋然性が高い」とは、「臓器において線維化が起こっているリスクが高い」と言うこともできる。「線維化が起こっている蓋然性が低い」とは、「線維化が起こっているリスクが低い」と言うこともできる。「臓器における線維化の鑑別法」は、「臓器における線維化のリスクの予測方法」と言うこともできる。
ETFBの発現の度合いが高い場合とは、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して高い場合であり、
ETFBの亢進が認められない場合とは、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して同じ又は低い場合であり得る。
ETFBの発現の度合いが高い場合とは、限定されないが、例えば、被検試料の臓器においては発現しているが、対照においては発現していないか、又は被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して150%以上、300%以上、500%以上であり得、
ETFBの発現の度合いが低い場合とは、限定されないが、例えば、被検試料の臓器における発現量が、対照における発現量に対して同じ又は70%以下、50%以下、10%以下であり得る。
被検試料の臓器は、臓器における線維化を鑑別される必要のある対象の臓器であり、特に限定されず、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス等の哺乳動物等由来の臓器であり得る。なお、対象の臓器から得られる培養細胞、培養組織、血液等を被検試料として用いてもよい。
対照は、対象の同じ又は別の臓器の正常部分又は対象と同一又は類似の生物種の臓器又は細胞あるいは確立された正常細胞であり得る。確立された正常細胞としては、上記と同様の確立された細胞を用いることが出来る。
本発明の臓器における線維化の鑑別法の対象となる「臓器」とは、特に限定されず、例えば皮膚、肺或いは肝臓などの内臓等であり得る。
ETFBの発現の度合いは、後記のとおり、ETFB蛋白質の発現を測定してもよく、ETFBをコードしたRNA等の遺伝子の発現を測定してもよい。臓器の線維芽細胞におけるETFB蛋白質又はETFBをコードした遺伝子の測定方法は、特に限定されず、例えば、常法に従って、細胞を破砕し、ETFB蛋白質又はETFBをコードした遺伝子を含む細胞抽出液を得て、細胞抽出液に含まれるETFB蛋白質又はETFBをコードした遺伝子を、後記のような通常の測定方法により測定することにより行うことが出来る。
本発明の線維芽細胞の増殖状態の鑑別法を応用すれば、被検物質の存在下でETFBの産生量が高まるか、抑制されるかで当該被検物質が異常増殖促進剤であるか、異常増殖抑制剤であるかが鑑別される。
ここで、異常増殖とは、線維芽細胞の異常増殖による疾患状態であり得る。線維芽細胞の異常増殖による疾患状態は、特に限定されず、例えば線維化(具体的には、肥厚性瘢痕、ケロイド、面皰瘢痕、強皮症、肺線維症、肝線維症等)、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因している線維化等であり得る。
本発明の一形態は、線維芽細胞を、張力の存在下コラーゲンゲル中で、被検物質の存在下及び非存在下培養し、
被検物質の存在下培養した場合、ETFBの発現量が非存在下培養したときよりも低い場合には、当該被検物質が、線維化抑制剤であるとする、線維化抑制剤の鑑別法である。
被検物質の存在下培養した場合、ETFBの発現量が非存在下培養したときよりも低い場合とは、限定されないが、例えば、被検物質の存在下において発現していないか、被検
物質の存在下における発現量が、ETFBの発現量が非存在下における発現量に対して70%以下、50%以下、10%以下であり得る。
コラーゲンゲル中での被検物質の存在下及び非存在下の培養は、陰性対照の細胞の増殖が良好であり、被検物質の存在下及び非存在下で細胞の増殖の差異が明確となるような培養条件であってよく、限定されないが、例えば、コラーゲン濃度0.05〜0.5wt%ゲル中で、30〜40℃、12〜72時間の培養により、行うことが出来る。
「線維化抑制剤の鑑別法」は、「線維化抑制剤のスクリーニング法」と言うこともできる。
被検物質としては、天然物又は合成品のいずれであってもよく、通常医薬等の候補物質となり得るものであってよく、具体的には、植物および微生物由来の抽出物およびその精製品、低分子合成化合物、抗体、ペプチド、アプタマー、siRNA、遺伝子治療に用いられる核酸、その修飾体や誘導体などを挙げることができる。
PCR反応を行うためのプライマーとしては、例えば、配列表の配列番号1或いは配列表の配列番号2に示すオリゴヌクレオチドを用いることが出来る。かかる配列を部分配列として含み、ETFBをコードする塩基配列を増幅することができる、同様の効果を示すオリゴヌクレオチドは、本発明の技術範囲に属する。同オリゴヌクレオチドの長さとしては、限定されないが、例えば、10〜50塩基、15〜30塩基程度である。
斯くの如くに、被検物質を評価し、ETFB発現の抑制作用を認めたものについては、線維芽細胞異常増殖抑制剤とし判別することが出来る。かかる線維芽細胞異常増殖抑制剤は、同抑制剤を有効成分として皮膚外用剤や、医薬組成物に加工することにより、瘢痕、特に肥厚性瘢痕などの線維芽細胞異常増殖に起因する疾病の予防又は治療用の医薬とすることが出来る。予防薬としては、瘢痕、特に肥厚性瘢痕などが生じる蓋然性の高い部位、例えば、手術における切除箇所の周辺などに、肥厚性瘢痕が生じる前に予め投与し肥厚性瘢痕の生成を防ぐ、また、生じた肥厚性瘢痕が悪化しない様に予め投与する様な使用が好ましく開示でき、治療においては、既に生じてしまった肥厚性瘢痕等の瘢痕に投与し、当該瘢痕を縮小させる使用が好ましく例示できる。当該医薬の製剤化は、前記線維芽異常増殖抑制剤と製剤化のための任意成分、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、分散剤、界面活性剤等を加えて、常法に従って処理することにより、医薬製剤に加工することが出来る。医薬製剤としては、内服薬、外用剤、注射剤などの剤形に加工可能であるが、外用剤に加工することが特に好ましい。
ヒト皮膚正常線維芽細胞の種類は、ATCCより入手可能な細胞が多数存在するが、ケロイド細胞株である(KELFIB)のプロファイルに最も近いCCD-1113Sk細胞(39歳黒人女性由来)を優先的に用いた。
コラーゲンゲル中での培養はVarediらの方法の変法を用いた。即ち、粉末培地より通常の5倍に濃縮したDMEM(5xDMEM、D5523、Sigma)を作製し、以下に示す混合比で最終的にDMEM培地と同様な組成となるようにコラーゲン溶液を作製した。作製したコラーゲン溶液は恒温槽にて12℃にて使用まで保存した。コラーゲン原液の必要量(1mg/mLの際は7mL)、5xDMEM 7mL、200mM HEPES 3.5mL、0.03% NaH2CO3 3.5mL、0.01% NaOH 1.5mL、FBS必要量(10%の際は3.5mL)、H2Oにて総量31.5mLとした。Basal layerを作製する場合には、あらかじめ24穴または6穴組織培養プレート(24穴;353047、6穴;353046、BD FALCON)に24穴の場合は250μL、6穴の場合には1mLのコラーゲン溶液を添加し、インキュベーターにて15分以上静置しコラーゲンを固化させた。
それぞれの実験によって決められた培養時間後、最終濃度310U/mLとなるようにDMEMを用いて調製したコラゲナーゼ溶液に、コラーゲンゲルをスパチュラでプレートよりはがして添加し、37℃にて20〜40分振盪しコラーゲンを消化した。消化した細胞浮遊液を1500rpmにて3〜5分遠心分離し細胞を回収した。回収した細胞に対し100μLの培地を添加し、トリパンブルー染色を施した後Burkel-Turk血球計算盤にて1/5の希釈率にて生細胞数を計測した。
コラーゲンゲルのコラーゲンを消化し、細胞を回収後、1mLのDMEM培地および細胞固定液(Collection Fluid、6768315、Thermo Shandon)を加え、転倒混和した。その細胞浮遊液をCytospin(Thermo scientific)にて分遠心し、スライドガラスに付着させ標本を作製した。作製した標本にin situ Apoptosis Detection Kit(MK500, Takara)にて取扱説明書にしたがってTUNEL染色を施した。検鏡は蛍光顕微鏡(ECLIPSE E600、Nikon)にて
100〜400倍の倍率で行い、付着条件下および遊離条件下の陽性細胞出現を観察した。
付着状態および遊離状態培養のコラーゲンゲルプレートをそれぞれ8〜10枚作製し、培養後1日において前述の手法と同様にコラーゲンを消化した。ただし、コラゲナーゼによる非特異的なタンパク質分解を可能な限り抑制するため、1mMのBenzamidinehydrochrolide Hydrate(B6506、Sigma)および0.1mMのN-α-p-Tosyl-L-Lysine Chloromethylketone Hydrochloride(TLCK、T7254、Sigma)存在下にて実施した。
50μA/Strip、20℃
S1:Gradient 500V 1min.
S2:Gradient 4000V 4h
S3:Step-n-hold 8000V 10h
S4:Step-n-hold 6000V 回収まで
染色が終了したゲルは、スキャナー(ImageScanner III、28-9076-07、Amersham)を用いてコンピューターに取り込んだ。取り込んだ画像は画像解析ソフト(2D Master Elite Ver. 4.01、2D Master Database Ver. 4.00、Amersham)を用いて以下の手順にて解析を実施した。DDにおける全体的な流れは以下に示す。
(1)コンピューターによるスポットの自動検出、目視確認による重複スポットの修正
(2)スポットとして検出されていないゲルのバックグランドおよび染色されたスポット全体の染色強度のゲル間での標準化
(3)ゲル間で移動度から共通に存在すると認識されるスポットのナンバリング(マッチング、ここで検出される番号をMatch No.と呼ぶ)、ならびに同じサンプルの泳動像が真
に同等であるかどうかの統計処理(本処理で同等と判断されたゲルをDDに供した)。
(4)t検定によるDD(棄却率10%)
また、同時に目視にてDDを実施し、コンピューター処理にて算出されたスポットが真に染色強度が異なるかどうかの判断、ならびにコンピューター処理では有意とはならなかったが、目視にて強度が異なるスポットの追加を実施した。
ImageScanner IIIにて取り込んだ画像をトリミングし、サイズを同等とした。2DMaster
Eliteにて自動スポット検出を以下のパラメーターで実施した。
Peak Dilation Parameters:
Min. Peak Area 85
Max. Peak Area 1100
Min. Aspect Ratio 0.4
Max. Aspect Ratio 4.5
Min. Area Ratio 50
2D Master Eliteに搭載されているバックグランド除去設定およびスキャンされたゲル染色濃度を標準化する作業を取扱説明書に従い実施した。
Max. Number of Touching Peaks 20
Background Intensity 0
Step Size 1
Smoothing Size 1
Histogram Equalization なし
Tidy Edges あり
その後目視によりスポットを確認し、重複して認識されているスポットの修正を実施した。
スポット像が良好でスポット数の多い遊離状態のゲル像をReference gelに設定し、取扱説明書に従いスポットのマッチングを実施した。また、2D Master Databaseに搭載されているTest Hypothesis機能を用いてReference gelとのDunnett検定を実施し、5枚のゲルのうち、3枚以上同等と認められた群について<4>の作業を実施した。
2D Master Databaseを用い、マッチングしたスポットについて棄却率10%のt検定を実施し、スポット強度に違いのあるものを抽出した。その後算出されたスポットを目視にて確認し、目視でも違いがあるかを確認した。また同時にスポット全体について目視にて再確認し、コンピューター処理で検出されなかった、付着状態・遊離状態で濃度に違いがあるスポットを追加した。
in acetone-Ethanol 1:1v/v)と共に1μLスポットし、乾燥後MALDI-TOF-MS(AutoFlex II、ブルカーダルトニクス)にてPeptide Mass Fingerprinting(PMF)解析を実施した。P
MF解析はマトリックスから飛び出すペプチド断片の質量パターンからタンパク質を推定する方法である。タンパク質量が十分存在するスポットに関しては、疑似MS/MS解析であり、アミノ酸配列を解析できるPost Source Decay(PSD)解析を実施し同定を試みた。これらの解析結果をデータベース検索にかけて結果を得たが、そのデータベースは、MASCOT(Ver.1.9、Matrix science)を用い、PMF解析で得た結果はMOWSEアルゴリズムによるスコア分布において確率95%以上であり、MASCOT上で算出されている分子量および等電点が同等のものをそのタンパクとして決定した。PSD解析はそのアミノ酸配列から同データベースを用いて候補を検索し、分子量および等電点が同等のものをそのタンパク質とした。本実験条件においてBSAを用いたPMF解析による検出下限は5fmolであった。
細胞は前述と同様にCCD-1113sk細胞(ATCC No. CRL2439、ヒト皮膚真皮正常線維芽細胞、黒人39歳女性由来)を用い、前述の手法と同様に維持した。導入試薬としてリポフェクタミン2000(LF2000、11668019、Invitrogen)を取扱説明書に従い用いた。導入の際にはOPTI-MEM(31985062、Invitrogen)を培地として使用した。LF2000は陽イオン性のリポソームであり、陰イオン性のsiRNAとコンプレックスを形成し、エンドソームまたはリソソームを経由して細胞内に取り込まれる。siRNAは表3に記載したものを用い、Galectin-3以外は購入した。Galectin-3はTakaraのHPでのsiRNA Design Support System(http://www.takara-bio.co.jp/rnai/intro.htm)を用いて設計した。使用に際し、単層培養にてトランスフェクション後1日間培養したCCD-1113sk細胞を用いて、QuantiGeneによりmRNAの発現抑制を確認した。また、使用したsiRNAの特異性を確認するために、BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)によりsiRNAが作用する配列を検索し、その類似配列を持つ遺伝子に対するQuantiGeneプローブを用いて同様のサンプルよりmRNAを測定し、抑制効果が認められかったsiRNAを使用した。また、陰性対照としてSilencer Negative control siRNA #1(4611、Ambion)を用いた。
よび培養後3〜4日の計測に用いた細胞は各群の細胞を集め、Lysis Bufferを100μL添加し、QuantiGeneによりmRNAの測定を実施した。なお、QuantiGeneは以下の表4に示すプローブを購入し使用した。
前述のETFBの機能を調べるために、siRNAによるノックダウン実験を行った。
即ち、CCD-1113sk細胞(ATCC No. CRL2439、ヒト皮膚真皮正常線維芽細胞、黒人39歳女性由来)を用い、上述と同様に維持した。siRNAおよび導入試薬は上述と同様のものを用いた。また、陰性対照としてSilencer Negative control siRNA #1(4611、Ambion)、またはAllStars Negative Control siRNA(Cat. No. 1027281, QIAGEN)を用いた。導入方法は前述の方法と同様に実施した。
TGF-βを添加する場合は、コラーゲン溶液作製時にHuman rTGF-β1(100-B-010、R&D Systems)を添加し混合後、同様に播種した。
mRNAの測定はqRT-PCRを実施した。すなわち、各実験にて回収した細胞よりRNeasy mini
kit(74104、QIAGEN)を取扱説明書にしたがってtotal RNAを精製した。RNA0.1μgよりQuantiTect Reverse Transcription Kit(205311、QIAGEN)を用いて取扱説明書に従いcDNAを調製した。cDNA5μLに対しQuantiTect SYBR GreenPCR Kit(204145、QIAGEN)を用いて、real-time PCR machine(ABI PRISM 6700、Applied Biosystem Inc.)によりmRNA発現量を測定した。なお、測定はtriplicateとし、同時にGAPDの発現量測定を実施した。プライマーは表5に記載の以下のものを使用した。また、コラーゲンゲル培養を実施し、培養0日からスキャナー(Multiscanner III、アマシャム)を用いて24穴プレートを撮影した。撮影後、NIH Imageを用いてwell内のゲルの面積を測定した。Wellの底面積を100%とし、測定した面積のパーセントを算出した。
11ng/mL存在下、ETFB siRNA添加系の結果である。下段は、それぞれ上段の図の拡大図である。これより、siRNA添加系ではTGF−β存在下でもアクチンフィラメントの形成が見られないことが判る。
egative control siRNAを処理した線維芽細胞と同様に培養1日でほぼ20%に収縮し、その後もほぼNegative controlと差異のない収縮率であった(図4を参照)。以上よりin vitroの本モデルにおいてはETFBの機能欠損は傷口を塞ぐ作用に対して悪影響を与えないことが示唆された。また、この実験結果は、肥厚性瘢痕を含むケロイド性の線維芽細胞でも、通常の線維芽細胞と同様の挙動を示すことを示唆した。これはケロイドなどの線維芽細胞の増殖に対しても本願発明の方法が適用できることを意味する。
Claims (1)
- エレクトロントランスファー フラボプロテイン ベータサブユニット(ETFB)をコードする塩基配列を増幅することができる、配列番号1に表されるオリゴヌクレオチド及び配列番号2に表されるオリゴヌクレオチドを含む、線維芽細胞のマイオファイブロブラストへの分化に起因する線維化評価用のキット。
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