JP7034072B2 - 薬物応答のバイオマーカーとしてのeb1の使用 - Google Patents
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Description
(式中、Rは、フェニルまたはピリジニルを表し;
フェニルは、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、アセチルアミノ、ハロゲンおよびニトロから独立して選択される1個または2個の置換基によって任意選択的に置換されており;かつ
ピリジニルは、アミノまたはハロゲンによって任意選択的に置換されており;
R1は、水素またはシアノ-低級アルキルを表し、かつ
低級という接頭語は、最大で4個までの炭素原子を有する基を意味する)
の化合物、または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の応答を予想するための、バイオマーカーとしてのEB1の使用を提供する。
バイオマーカーEB1は、被験体から採取された試料中で生体外にて測定され;
標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のEB1レベルが高いことによって、BAL27862またはBAL101553に対する膠芽腫多形の感受性が予測される。
バイオマーカーEB1は、被験体から採取された試料中で生体外にて測定され;
EB1のレベルが、その試料中のCSCにおいて、好ましくはCD133および/またはA2B5を発現するCSCにおいて測定され;
標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のCSCにおけるEB1レベルが高いことによって、BAL27862またはBAL101553に対する膠芽腫多形の感受性が予測される。
a)被験体から採取された試料中のEB1のレベルを測定して、このレベルを表す値を得る工程;
b)工程a)からのレベルの値を標準値または標準値のセットと比較し、その比較から式Iの化合物に対する奏効性を予測する、工程;
を含む方法を提供する。
a)ヒト被験体から採取された試料中のEB1のレベルを生体外で測定して、このレベルを表す値が得られる工程;
b)工程a)からのレベルの値を標準値または標準値のセットと比較し、その比較からBAL27862またはBAL101553に対する奏効性を予測する工程であって、
標準値または標準値のセットに対して、ヒト被験体から採取された試料中のEB1レベルが高いことによって、BAL27862またはBAL101553に対する膠芽腫多形の感受性が予測される、工程;
を含む方法を提供する。
a)ヒト被験体から採取された試料中の、CSCにおける、好ましくはCD133および/またはA2B5を発現するCSCにおけるEB1のレベルを生体外で測定して、このレベルを表す値が得られる工程;
b)工程a)からのレベルの値を標準値または標準値のセットと比較し、その比較からBAL27862またはBAL101553に対する奏効性を予測する工程であって、
標準値または標準値のセットに対して、ヒト被験体からの試料中のCSCにおけるEB1レベルが高いことによって、BAL27862またはBAL101553に対する膠芽腫多形の感受性が予測される、工程;
を含む方法を提供する。
a)前記被験体の体から生体材料の試料を採取する工程;
b)前記試料中のEB1のレベルを決定する工程;
c)前記試料中のEB1のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、被験体を式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体で治療する工程;
を含む方法を提供する。
a)前記ヒト被験体の体から生体材料の試料を採取する工程;
b)前記試料中のEB1のレベルを決定する工程;
c)前記試料中のEB1のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、ヒト被験体をBAL27862またはBAL101553で治療する工程;
を含む方法を提供する。
a)前記ヒト被験体の体から生体材料の試料を採取する工程;
b)前記試料中のCSCにおける、好ましくはCD133および/またはA2B5を発現するCSCにおけるEB1のレベルを決定する工程;
c)前記試料中のCSCにおけるEB1のレベルが標準値または標準値のセットよりも高い場合に、ヒト被験体をBAL27862またはBAL101553で治療する工程;
を含む方法を提供する。
式Iの好ましい化合物としては、式中、R、YおよびR1が以下:
脳新生物、例えば、脳腫瘍としては、限定されないが、グリアおよび非グリア腫瘍、星状細胞腫(膠芽腫多形および不特定の神経膠腫を含む)、乏突起細胞腫、上衣細胞腫、髄膜腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、頭蓋咽頭腫、原発性中枢神経系リンパ腫、胚細胞腫瘍、下垂体腫瘍、松果体部腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍(PNET)、髄芽腫、血管外皮細胞腫、脊髄腫瘍、例えば髄膜腫、脊索腫および遺伝的に由来する脳腫瘍、例えば神経線維腫症、末梢神経鞘腫瘍および結節性脳硬化症が挙げられる。好ましくは、脳新生物は、膠芽腫(膠芽腫多形とも呼ばれる)を意味する。
EB1のレベルの測定は、被験体由来の生体組織の試料に関して生体外で行われる。その試料は、例えば、正常組織、腫瘍組織、細胞系、末梢血(循環腫瘍細胞またはCSCなど)、脳脊髄液(CSCなど)、リンパ液、細胞溶解物、組織ライセート、尿および吸引液などの体から分離されたいずれかの生体材料であることができる。好ましくは、試料は、正常組織、腫瘍組織、細胞系、末梢血(循環腫瘍細胞またはCSCなど)、脳脊髄液(CSCなど)に由来する。さらに好ましくは、試料は、末梢血または脳脊髄液由来の腫瘍細胞または癌幹細胞に由来する。またさらに好ましくは、試料は、末梢血由来の腫瘍組織またはCSCに由来する。特に好ましい一実施形態において、試料は、腫瘍組織に由来する。例えば、癌細胞および/またはCSCにおけるEB1のレベルは、新鮮な、凍結された、またはホルマリン固定/パラフィンパラフィン包埋された腫瘍組織試料において測定され得る。代替方法として、試料が体液、例えば血液(例えば、末梢血)、血清および血漿、尿、脳脊髄液または唾液に由来する場合、EB1のレベルは、試料中の細胞外小胞において測定され得る。
試料中のCSCは、例えば、免疫組織化学またはフローサイトメトリーを使用したCSCマーカーの同定に基づく方法、および分化癌細胞によって保有されないが、CSCに特有の特性に対する選択に基づく方法、例えば多能性を有し、かつ/または生体外培養条件下にて増殖することができる細胞に対する選択に基づく方法など、当技術分野で公知の方法によって同定することができる。
本発明による対照は、治療が必要なヒトまたは動物であり得る。好ましくは、被験体はヒトである。
i)同じ腫瘍組織型を有する被験体からの標準値または標準値のセットに対する;または
ii)治療開始後に採取され、治療開始前に、同じ被験体から採取された試料と比較される;または
iii)正常細胞、組織または体液からの標準値または標準値のセットに対する;
試料中のEB1のレベルが高いほど、式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、脳腫瘍の感受性、好ましくは脳腫瘍のCSCの感受性が予想される。
i)同じ腫瘍組織型を有する被験体からの標準値または標準値のセットに対する;または
ii)治療開始後に採取され、治療開始前に、同じ被験体から採取された試料と比較される;
試料中のEB1レベルが高いほど、式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、脳腫瘍の感受性、好ましくは脳腫瘍のCSCの感受性が予想される。
固形癌効果判定基準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors)(RECIST)ガイドライン,
引用:Eisenhauer EA,Therasse P,Bogaerts J,Schwartz LH,Sargent D,Ford R,Dancey J,Arbuck S,Gwyther S,Mooney M,Rubinstein L,Shankar L,Dodd L,Kaplan R,Lacombe D,Verweij J.New Response Evaluation Criteria in solid tumors:改訂RECISTガイドライン(version 1.1).Eur J Cancer.2009;45:228-47;
ハイグレード神経膠腫に対するRANO基準(RANO Criteria for High-Grade Gliomas),引用:Wen PY,Macdonald DR,Reardon DA,Cloughesy TF,Sorensen AG,Galanis E,Degroot J,Wick W,Gilbert MR,Lassman AB,Tsien C,Mikkelsen T,Wong ET,Chamberlain MC,Stupp R,Lamborn KR,Vogelbaum MA,van den Bent MJ,Chang SM.Updated response assessment criteria for high-grade gliomas:response assessment in neuro-oncology working group.J Clin Oncol.2010;28(11):1963-72;
卵巣癌の応答に対するCA-125 Rustin基準(CA-125 Rustin Criteria for Ovarian Cancer Response),引用:Rustin GJ,Quinn M,Thigpen T,du Bois A,Pujade-Lauraine E,Jakobsen A,Eisenhauer E,Sagae S,Greven K,Vergote I,Cervantes A,Vermorken J.Re:New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors(ovarian cancer).J Natl Cancer Inst.2004;96(6):487-8;および
前立腺癌の応答に対するPSAワーキンググループ2基準(PSA Working Group 2 Criteria for Prostate Cancer Response),引用:Scher HI,Halabi S,Tannock I,Morris M,Sternberg CN,Carducci MA,Eisenberger MA,Higano C,Bubley GJ,Dreicer R,Petrylak D,Kantoff P,Basch E,Kelly WK,Figg WD,Small EJ,Beer TM,WildingG,Martin A,Hussain M;Prostate Cancer Clinical Trials Working Group.Design and endpoints of Clinical Trials for patients with progressive prostate cancer and castrate levels of testosterone:recommendations of the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group.JClinOncol.2008;26(7):1148-59.
を用いて評価することができる。
本明細書で使用されるEB1という用語は、先に記載の同義語すべてを包含し、かつ核酸レベルとタンパク質レベルの両方で適宜、この実態を意味する。核酸レベルは、例えばmRNA、cDNAまたはDNAを意味し、タンパク質という用語は、翻訳ポリペプチドまたはタンパク質配列および翻訳後に修飾されたその形態を含む。
EB1のレベルは、タンパク質レベルで、または核酸レベルで、例えばRNAまたはcDNAで検出することができる。EB1のレベルは、当業者によく知られる技術的手段によって試料中でアッセイすることができる。それは、転写または翻訳レベルでアッセイされ得る。
好ましい一実施形態において、バイオマーカーを使用して、上記で定義される式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、被験体における疾患の固有の感受性を予測する。
本発明は、一部の態様において治療方法および治療方法で使用されるEB1も含み、そのEB1レベルが最初に、標準レベルまたは標準レベルのセットまたは予備処理開始レベルに対して確立され、次いで、上記で定義される式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体が、前記試料中のEB1のレベルが標準値または標準値のセットよりも高いか、または予備処理開始レベルに対して減少していない場合に投与される。当業者によく知られているように、式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体は、医薬組成物の形で投与され得る。適切な組成および投薬量は、例えば国際公開第2004/103994A1号パンフレットの35~39ページに開示されており、本明細書により明確に組み込まれる。温血動物、特にヒトへの、経腸投与、経鼻投与、口腔投与、直腸投与など、または特に経口投与、および静脈内、筋肉内または皮下投与などの非経口投与用の組成物が特に好ましい。さらに詳しくは、静脈内または経口投与用の組成物が好ましい。一実施形態において、経口投与用の組成物が特に好ましい。
一態様において、本発明は、上記で定義される式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、被験体における好ましくは疾患の応答を予測するための、試料中のEB1のレベルを測定するのに必要な試剤を備えるキットに関し、他の態様では、デバイスに関する。好ましくは、その試剤は、EB1の検出体を含む捕捉剤と、検出剤と、を含む。
患者からの腫瘍試料
手術前に化学療法または放射線治療を受けていない患者からの膠芽腫(GBM)試料(世界保健機関,IVグレード)をインフォームド・コンセント後に入手した。新鮮な原発性GBM試料を術後に、0.5%ウシ胎児血清(FCS)(Gibco-Invitrogen,CergyPontoise)、1%ペニシリン-ストレプトマイシンおよび1%ピルビン酸ナトリウム(Gibco-Invitrogen)で補充されたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Life technologies,SaintAubin,France)に回収した。4時間以内に、腫瘍を洗浄し、切開し、Mcllwain組織チョッパーを使用して自動的に切片にし、トリプシン(Sigma-Aldrich,Paris,France)5mg/mLとDNAse(Sigma-Aldrich)200U/mLの両方で37℃にて10分間、酵素的に分離した。DMEM 10%FCSを添加することによって、反応を停止した。懸濁液を濾過し、回収された細胞を遠心分離した。次いで、細胞をカウントし、トリパンブルー染色(Sigma-Aldrich)によって、80%を超える細胞生存率が確認された。次いで、A2B5+抗原発現に基づくその分離まで、細胞をDMEM-FCS10%に再懸濁した。
腫瘍から単離された細胞を、リン酸緩衝生理食塩水、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA;Sigma-Aldrich)、2mM EDTA(Sigma-Aldrich)に再懸濁し、ブロッキング剤(MiltenyiBiotec,Paris,France)と共に4℃で10分間インキュベートした。次いで、抗A2B5ミクロビーズを添加し、4℃で15分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ポジティブ磁気細胞分離(MACS MiltenyiBiotec,Paris,France)を、MACSカラムを使用して行った。蛍光顕微鏡検査法によるA2B5対照-免疫染色によって評価された平均純度は、約93%(85~98%の範囲)であった。脳室下領域(GBM6)および皮質(GBM9)から生じる、2つの膠芽腫多形腫瘍からA2B5+細胞を単離した。
幹細胞許容培地として、ホルモン(5mg/mLインスリン,0.1mMプトレシン,100mg/mLトランスフェリン,2.10-8Mプロゲステロン;すべてSigma-Aldrich)、50mg/mLペニシリン-ストレプトマイシン(Life technologies)および10ng/mL塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF,Sigma-Aldrich)を含む成長因子、20ng/mL上皮成長因子(EGF)、(R&D systems,Lille,France)およびB27(Life technologies)で補充された、DMEM/F12培地(Life technologies)3.5mL中のGBM6またはGBM9細胞を30,000細胞/25cm3フラスコの密度でプレーティングし、CO25%/O295%に維持した。培養物に週2回フィードし、スフィアを2週毎に分離した。
ヒトEB1(NM_012325)を特異的にノックダウンするshRNAプラスミドおよびネガティブshRNA対照プラスミド(Mission(登録商標)非標的shRNA対照ベクター)をSigma-Aldrichから入手した。lipofectamine(商標)2000 system(Life technologies)を使用して、細胞をトランスフェクトした。安定なクローンを確立するために、トランスフェクトから24時間後に、2μg/mLピューロマイシン(Sigma-Aldrich)を含有する培地中でshRNA-トランスフェクト細胞および関連する対照クローンが選択された。
GBM CSCを溶解バッファー(トリス50mM(pH8.0),NaCl 250mM、Triton×100 1%、SDS0.1%およびプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤とのカクテル(すべてSigma-Aldrich))に溶解した。タンパク質ライセート全体の30μgを12%SDS-PAGEゲル上にローディングした。ニトロセルロース膜(Bio-Rad,Marnesla Coquette,France)を、0.1%Tween(pH7.4)(Sigma-Aldrich)を含有するPBS(Life technologies)中の5%ミルク(粉末)で1時間ブックし、次いでマウス抗EB1抗体(クローン5,BD Biosciences,Le pont deClaix,France)(1/1000)およびマウスα-チューブリン抗体(クローンDM1A,Sigma Aldrich)と共に同じ溶液中でインキュベートした。次いで、PBS-5%ミルク中で膜を15分間3回洗浄し、次いで抗マウスペルオキシダーゼ結合型二次抗体(Jackson Immuno research,Baltimore,USA)と共に1時間インキュベートし、続いてPBS中で3回、15分間洗浄した。次いで、化学発光検出キット(Millipore,Saint Quentinen Yvelines,France)を使用して、結合した抗体を検出した。シグナルをG:BOX(Syngene/Ozyme,Saint Quentin en Yvelines,France)で記録し、定量化にはImage Jソフトウェアを使用した。
予めポリ-DL-オルニチンでコートされたウェルプレートに、細胞(5000細胞/ウェル)をシーディングし(10μg/mL)、BAL27862で処理する前に24時間増殖させた。72時間後に、スルホロダミンBアッセイキット(Sigma-Aldrich)を使用して、細胞の増殖抑制を測定した。マイクロプレートリーダー(Labsystems Multiscan,Thermo,Villebon sur Yvette,France)を使用して、細胞密度を分析し、EC50の分析をGraphPad 5.0統計ソフトウェア(GraphPad Software,LaJolla,USA)で行った。少なくとも3つの独立した実験を行った。
予めポリ-DL-オルニチンでコートされた6ウェルプレートで、細胞(1000細胞/ウェル)を増殖させ、BAL27862で72時間処理した後に、5日までの間インキュベートした。20%メタノール(Sigma-Aldrich)中の1%クリスタルバイオレット溶液でコロニーを染色した。50個を超える細胞を有するコロニーをカウントした。少なくとも3つの独立した実験を行った。
DMEM中の幹細胞(50,000)をtranswell移動チャンバの上側(0.8μmフィルター,BD)に注いだ。チャンバの下側をDMEMで満たし、10%FCSを補充した。細胞を5時間移動させ、次いでチャンバを除去した。移動しなかった細胞は、フィルターの上部に留まり、綿棒でそれを除去し;フィルターの下側の細胞を1%グルタルアルデヒド(Sigma,Aldrich)で固定し、20%メタノール(Sigma-Aldrich)中の1%クリスタルバイオレット溶液で染色した。洗浄し、乾燥させた後に、倍率10倍で1条件につき6つの領域の写真を画像化し、移動細胞をカウントした。
幹細胞許容培地(5mg/mLインスリン,0.1mMプトレシン,100mg/mLトランスフェリン,2.10-8Mプロゲステロン,50mg/mLペニシリン-ストレプトマイシンおよび成長因子、例えば10ng/mL塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF),20ng/mL上皮成長因子(EGF)およびB27)中のGBM6細胞を300,000細胞/ウェルにて、ポリ-DL-オルニチンでコートされた6ウェルプレートにシーディングした(10μg/mL)(Sigma-Aldrich)。1日後、細胞をBAL27862で72時間処理した。次いで、細胞をトリプシン処理し、ブロッキング溶液(Miltenyi Biotec)を含有するハンクス液(HBSS)緩衝液(Life technologies)に懸濁し、A2B5-APC(クローン105HB29,参照130-093-582)およびCD133-PE(クローン293C3,参照130-090-853)抗体(Miltenyi Biotec)と共に10分間インキュベートした。次いで、細胞を10%パラホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich)で20分間固定し、フローサイトメトリー(FACS Calibur(商標),BD Biosciences)を使用して分析した。各試料に対して合計100,000のイベントがカウントされ、データをCellQuest Pro Software(BDBiosciences)で記録し、FlowJoソフトウェア(Tree Star Inc.,San Carlos,CA)およびDean-Jet-Foxモデル分析を用いて分析した。
予めポリ-DL-オルニチン(Sigma-Aldrich)でコートされた6ウェルプレートに、GBM6細胞をシーディングした(150,000細胞/ウェル)。24時間後、細胞をBAL27862で72時間処理するか、または処理しなかった。処理の最後に、上清を除去し、細胞を収集し、単細胞へと分離し、96ウェルプレートにプレーティングした(1~5細胞/ウェル)。8日後、倒立光学顕微鏡(Leica DMI 4000B)(Leica,Saint Jorioz,France)下にてスフィアをカウントした。少なくとも3つの独立した実験を行った。
GBM6 GFP sh0またはshEB1細胞のおよそ100,000細胞を、6週齢無胸腺ヌードマウスの脳室下域内(ブレグマより前方0.5mm、後方-1mm、および皮質表面より深度-2.1mm)に注入した。移植されたマウスに、25mg/kg BAL101553(神経膠腫移植から30、33および36日後の時点で3回)または賦形剤(対照)を静脈内投与して処置した。移植から45日後に、腫瘍体積(三次元脳再構成)の解析のために、またはFACS分析のために、各群の動物3匹を屠殺した。
腫瘍体積を解析するために、マウスを4%パラホルムアルデヒドで麻酔し、灌流した。脳を取り出し、4℃にて4%パラホルムアルデヒド中で2日間固定し、次いで、すすいで、解剖するまでPBS中で保存した。ビブラトーム(Leica)を使用して、矢状軸に沿って厚さ50~100μm切片へと脳を全体的に切断した。合計60切片/脳が得られた。Leica DMLB蛍光顕微鏡、Leica DC300Fデジタルカメラ、およびLeica FW4000イメージングソフトウェア(Leica)を使用して、GFP注入細胞および腫瘍のマッピングおよび分析を行った。FreeDソフトウェア(Andrey P.,Free-D:an integrated environment for three-dimensional reconstruction from serial sections.Journal of Neuroscience Methods.2005;145(1-2):233-244)を使用して、三次元脳再構成が得られた。簡潔には、Franklin and Paxinos atlasに基づく、脳室および脳梁を含むデジタル化された脳切片を取り付けて、これらの切片内の細胞を局在化した。デジタル化矢状切片60枚を用いて、マウスの脳全体を構築した。
麻酔した後、動物をPBSで灌流し、脳を除去し、2%FBSを含有するHBSS緩衝液で保存した。Gentle MACS dissociator(Miltenyi Biotech)を用いて、酵素のカクテル(DNaseI(Roche,Rotkreuz,Switzerland)、コラゲナーゼD(Roche)およびコラゲナーゼV(Sigma-Aldrich))中で細胞を分離させた。10%FCSを含有するDMEMを添加して、反応を停止した。懸濁液を濾過し、細胞を40%Percoll(Sigma-Aldrich)に再懸濁した。遠心分離後、ミエリンを除去し、2%FCSを含有するHBSS緩衝液に細胞を再懸濁した。2%FCSを含有するHBSS中の細胞をA2B5-APCおよびCD133-PE抗体と共に10分間インキュベートした。次いで、細胞を10%パラホルムアルデヒドで20分間固定し、フローサイトメトリーを使用して分析した。各試料に関して、合計100,000のイベントがカウントされ、データをCellQuest Pro Softwareで記録し、Dean-Jet-Foxモデル分析を選択するFlowJoソフトウェア(Tree Star Inc.,SanCarlos,CA)用いて分析した。
大きな(250~420mg)GBM10 flank腫瘍を保持するメス無胸腺ヌードマウス(無胸腺Ncr-nu/nu)を標準手順に従って安楽死させ、心臓穿刺によって、シリコーンコートBD Microtainer(登録商標)血液採取チューブ(BD Diagnostics,Sparks,MD,USA)に最大量の血液を引き抜いた。以下の製造元の説明書に従って、血液から血清を分離し、使用するまで、-80℃にて保存した。
EB1免疫ブロット法対照を以下のようにsiRNAトランスフェクションによって調製した:1.2×106ヒーラ細胞(ATCC,Manassas,VA,USA;参照CCL-2)をトランスフェクション前に7時間、75cm2組織培養フラスコにプレーティングした。製造元の説明書に従って、opti-MEM(Gibco)1000μLおよびHiperFect(登録商標)トランスフェクション試剤(QIAGEN,Venlo,Netherlands)60μLを使用して、非標的化対照(NTC)siRNA(Dharmacon GE Healthcare,Lafayette,CO,USA;参照D-001810-10-20)またはEB1 siRNA(Dharmacon GE Healthcare;参照L-006824-00-0005)20nMを細胞に一過的にトランスフェクトした。2×SDS試料緩衝液中に回収する前に、5%CO2の加湿雰囲気中で、細胞を37℃でさらに72時間培養した。
実施例1:GBM6およびGBM9CSCに対するBAL27862の細胞障害活性の比較
GBM6およびGBM9 CSCに対するBAL27862の細胞毒性活性の濃度反応曲線から、BAL27862が、EC50約20nMで両方の細胞系に対する同等の細胞毒性活性を有することが分かる(表1参照)。
GBM6対GBM9 CSCにおけるEB1発現レベルの免疫ブロット法による決定から、GBM6細胞がGBM9よりも高いレベルのEB1タンパク質を発現することが実証された(図1参照)。αチューブリンレベルに対して正規化すると、GBM6は、GBM9細胞よりも17.9倍多い量のEB1タンパク質を発現した。
GBM6およびGBM9細胞のTranswell移動アッセイは、非細胞毒性(6nM)および細胞毒性(20nM)として定義される、2種類の異なるBAL27862濃度で行われた(実施例1参照)。予想されるように、この細胞毒性濃度(20nM)によって劇的に、両方の細胞系の移動が同様な程度まで抑制され、この濃度での細胞に対する一般的な細胞毒性が示されている。しかしながら、6nMの非細胞毒性濃度で、GBM6細胞は、細胞移動の統計学的に有意な抑制を示したのに対して、GBM9細胞は応答しなかった(図2参照)。これは、BAL27862の低い非細胞毒性濃度、GBM9と比べて高いEB1レベルを伴う現象によって、GBM6の移動を特異的に抑制することができることを示す。
shRNA(shEB1)、非標的化対照shRNA(sh0)をトランスフェクトされた安定なGFP発現性GBM6細胞、および非処理GBM6を、免疫ブロット法によってEB1発現について試験した(図3参照)。測定されたシグナルは、α-チューブリン発現に対して正規化された。shEB1を安定にトランスフェクトされたGBM6細胞は、対照GBM6細胞と比較してEB1発現レベルの69%の減少を示す。
BAL27862濃度6nMで測定された細胞移動は、対照EB1発現細胞おいて、細胞移動の統計学的に有意な抑制を示したのに対し、EB1ダウンレギュレートGBM6細胞では、BAL27862処理の抑制作用は劇的に減少した(図4参照)。これによって、EB1タンパク質が、GBM CSCにおけるBAL27862の抗移動作用に関与することが実証されている。
DMSO対照または3、6および10nM BAL27862(非細胞毒性濃度)と共に72時間インキュベートした後に、GBM6 GFP sh0(正常なEB1レベル)およびGBM6 GFP shEB1(ダウンレギュレートされたEB1レベル)のコロニー形成能力を評価した(図5参照)。BAL27862は、EB1発現細胞のみで統計学的に有意な手法で準毒性用量6および10nMにて、GBM6 CSCのクローン原性能力を著しく損なった。これは、クローン原性アッセイにおいてBAL27862の活性にEB1が必要であることを示す。
BAL27862処理後のA2B5ポジティブGMB6細胞数のFAC分析から、EB1が発現された場合のみ(GBM6 GFP sh0細胞)、6nM BAL27862処理によって有意な抑制が示された(図6参照)。それと対照的に、A2B5に対してポジティブなGBM6細胞およびEB1発現に対してネガティブなGBM6細胞(GBM6 GFP shEB1,EB1ダウンレギュレート細胞)は、6nM BAL27862に対して感受性が低かった。A2B5発現の減少は分化と関連することから、これは、BAL27862がEB1発現依存的にGBM6 CSCの分化を誘導することを示す。
BAL27862(6nM)処理は、GBM6野生型およびGBM6 GFP sh0細胞(正常なEB1レベルを有する)において用量依存的にスフィアの形成を統計学的に優位に妨げる(図7参照)。しかしながら、EB1ダウンレギュレーション(GBM6 GFP shEB1細胞)によって、GBM6 CSCにおけるBAL27862の阻害活性が抑制される。スフィアを形成する能力の低下は分化と関連することから、これは、BAL27862が、EB1発現依存的にGBM6 CSCの分化を誘導することを示す。
0日目に脳室下領域内に定位的に移植されたGBM6 GFP sh0(正常なEB1発現レベル)またはGBM6 GFP shEB1(EB1ダウンレギュレートされた)細胞を受けたマウスを30/33/36日目に、25mg/kg BAL101553で静脈内投与にて、または賦形剤対照で処理し、脳を取り出すために45日目に屠殺した。マウスの脳を連続矢状切片に処理し、次いで蛍光顕微鏡を使用して、それを分析かつ記録した。単一セクションから撮影された写真を三次元再構成に使用した。EB1発現腫瘍において賦形剤処理と比較して、BAL101553処理した結果、腫瘍量(サイズ)および腫瘍の広がりが明らかに減少し、生体内での腫瘍成長および腫瘍細胞移動に対するBAL101553の抑制作用が示されている(図8参照)。しかしながら、BAL101553のこの作用は、EB1ネガティブ腫瘍において最小であり、CSCに対するBAL27862活性とEB1発現がポジティブに相関する場合の生体外データと一致する。
0日目に脳室下領域内に定位的に移植されたGBM6 GFP sh0(正常なEB1発現レベル)またはGBM6 GFP shEB1(EB1ダウンレギュレートされた)細胞を受けたマウスを30/33/36日目に、25mg/kg BAL101553で静脈内投与にて、または賦形剤対照で処理し、脳を取り出すために45日目に屠殺した。マウスの脳を単一の細胞浮遊液中に分離し、抗A2B5抗体を使用して、A2B5ポジティブGBMCSCを染色し、FACSによって分析した。A2B5ポジティブGBM6細胞に対するA2B5ネガティブ細胞の割合を計算した。EB1発現GBM6腫瘍のBAL101553処理によって、腫瘍細胞の割合がA2B5ネガティブ細胞の方に強くシフトし(ポジティブ20%に対してネガティブ80%)、それは対照と比較して明確なシフトである(ポジティブ60%に対してネガティブ40%)(図9参照)。それと対照的に、EB1ダウンレギュレートGBM6腫瘍では、BAL101553処理によって、A2B5ポジティブ細胞の割合がむしろ増加し(およそ60%から80%へ)、EB1発現腫瘍と比較して、EB1ダウンレギュレート脳腫瘍において未分化GBM6 CSCの含有率が高いことが示されている。
大きなGBM10 flank腫瘍を保持するマウスから単離された腫瘍および細胞外小胞を免疫ブロット法によって、EB1発現について分析した。健康なドナーからのヒト血清に由来する対照エキソソームおよび細胞外小胞(エキソソーム)マーカーとしてCD9を使用して、細胞外小胞(エキソソームなど)の効率的な単離が確認された(Zarovni et al.,Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids usingimmunocapture approaches.Methods,2015;87:46-58;Thery et al.,Molecular Characterization of Dendritic Cell-derived Exoxomes:Selective Accumulation of the Heat Shock Proteinhsc73.The Journal of Cell Biology,1999:3:599-610)。EB1発現に関する抽出腫瘍の免疫ブロット法から、3つの個々の腫瘍における一貫した発現が示された。EB1 siRNAで処理された細胞に由来するHeLa抽出物を用いて、EB1に対する抗体の特性が確認され、非標的化siRNA対照(NTC)抽出物と比較して、EB1の劇的な減少が示された(図11)。さらに、腫瘍保持マウスの血清から得られた細胞外小胞(エキソソームを含む)もまた、EB1タンパク質を含有することが分かり、これは、GBM腫瘍EB1発現分析の有用な代替源であり得ることを表す(図12)。
Claims (40)
- 標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のEB1レベルが高いことによって、前記式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する前記脳腫瘍の感受性が予測される、請求項1に記載の使用。
- 標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中の癌幹細胞(CSC)におけるEB1レベルが高いことによって、前記式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する前記脳腫瘍の感受性が予測される、請求項1に記載の使用。
- 前記応答が、前記式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、前記脳腫瘍の癌幹細胞(CSC)の応答である、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脳腫瘍が、多形性膠芽腫である、請求項1~4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記癌幹細胞(CSC)が、ALDH1、CD24、CD44、CD90、CD133、Hedgehog-Gli活性、α6-インテグリン、ABCB5、β-カテニン活性、CD26、CD29、CD166、LGR5、CD15、ネスチン、CD13、ABCG2、CD117、CD20、CD271、c-Met、CXCR4、Nodal-アクチビン、α2β1-インテグリンおよびTrop2からなる群から選択される少なくとも1種類の癌幹細胞マーカーを発現する、請求項3もしくは請求項4に記載のまたは請求項5が請求項3もしくは請求項4を引用する場合の請求項5に記載の使用。
- 前記癌幹細胞(CSC)が、CD15、CD90、CD133、α6-インテグリン、ネスチン、およびA2B5からなる群から選択される少なくとも1種類の癌幹細胞マーカーを発現する、請求項3もしくは請求項4に記載のまたは請求項5が請求項3もしくは請求項4を引用する場合の請求項5に記載の使用。
- 前記癌幹細胞(CSC)が、癌幹細胞マーカーCD133および/またはA2B5を発現する、請求項3もしくは請求項4に記載のまたは請求項5が請求項3もしくは請求項4を引用する場合の請求項5に記載の使用。
- 前記バイオマーカーEB1が、被験体から採取された1つまたは複数の試料において生体外(ex vivo)で測定される、請求項1~8のいずれか一項に記載の使用。
- 前記被験体がヒトである、請求項9に記載の使用。
- 前記試料が、正常な組織、腫瘍組織、細胞系、血液、脳脊髄液、循環腫瘍細胞または癌幹細胞(CSC)に由来する、請求項9または10に記載の使用。
- 前記試料が、腫瘍組織に由来する、請求項9または10に記載の使用。
- 前記試料が、体液に由来する、請求項9または10に記載の使用。
- 前記試料が、血液に由来する、請求項13に記載の使用。
- 前記試料が、血清に由来する、請求項13に記載の使用。
- 前記癌幹細胞(CSC)が前記試料中で同定され、かつ前記EB1レベルが、前記癌幹細胞(CSC)において測定される、請求項9~15が直接的または間接的に(i)請求項2または請求項3を引用しかつ(ii)請求項3または請求項4または請求項11を引用する場合の請求項9~15のいずれか一項に記載の使用。
- i)同じ腫瘍組織型を有する被験体からの標準値または標準値のセットに対する;または
ii)治療開始後に採取され、かつ治療開始前に同じ被験体から採取された試料と比較される;または
iii)正常細胞、組織または体液からの標準値または標準値のセットに対する;
前記試料中のEB1レベルが高いことによって、前記脳腫瘍の感受性が予測される、請求項9~16のいずれか一項に記載の使用。 - 前記感受性が、式Iの前記化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する、前記脳腫瘍の癌幹細胞(CSC)の感受性である、請求項17に記載の使用。
- より高いEB1レベルの決定が、EB1タンパク質レベルまたはEB1核酸レベルを測定することによって行われる、請求項9~18のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脳腫瘍が、グリアおよび非グリア腫瘍、星状細胞腫、乏突起細胞腫、上衣細胞腫、髄膜腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、頭蓋咽頭腫、原発性中枢神経系リンパ腫、胚細胞腫瘍、下垂体腫瘍、松果体部腫瘍、未分化神経外胚葉性腫瘍(PNET)、髄芽腫、血管外皮細胞腫、髄膜腫、脊索腫を含む脊髄腫瘍、および神経線維腫症、末梢神経鞘腫瘍および結節性硬化症を含む遺伝子に駆動される脳腫瘍からなる群から選択される、請求項1~19のいずれか一項に記載の使用。
- 前記脳腫瘍が、多形性膠芽腫である、請求項1~19のいずれか一項に記載の使用。
- 前記薬剤として許容される誘導体が、式Iの化合物の塩、溶媒和化合物、プロドラッグ、プロドラッグの塩からなる群から選択される、請求項1~23のいずれか一項に記載の使用。
- 前記薬剤として許容される誘導体がプロドラッグであり、かつ前記プロドラッグが、式Iの前記化合物のR基内に存在するアミノ基およびグリシン、アラニンまたはリジンのカルボキシ基から形成されるアミドである、請求項1~23のいずれか一項に記載の使用。
- 前記薬剤として許容される塩が、その塩酸塩である、請求項26に記載の使用。
- 前記薬剤として許容される塩が、その二塩酸塩である、請求項26に記載の使用。
- 請求項1~28のいずれか一項に記載の使用と組み合わせて用いられることを特徴とする、請求項1および22~28のいずれか一項で定義される式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体を含む医薬組成物。
- 請求項1および22~28のいずれか一項で定義される式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する脳腫瘍の応答を予測するためのキットであって、試料中のEB1のレベルを測定するのに必要な試剤を備える、キット。
- 前記試料中のEB1の前記レベルに対して比較される標準値または標準値のセットを含むコンパレーターモジュールをさらに備える、請求項30に記載のキット。
- 前記脳腫瘍が、多形性膠芽腫である、請求項30または31に記載のキット。
- 前記試剤が、EB1の検出体を含む捕捉剤と、検出剤と、を含む、請求項30~32のいずれか一項に記載のキット。
- 前記捕捉剤が、抗体である、請求項33に記載のキット。
- 試料中のEB1のレベルを測定するのに必要な試剤と、癌幹細胞(CSC)を同定かつ/または捕捉するのに必要な試剤と、を含む、請求項30~34のいずれか一項に記載のキット。
- BAL101553の二塩酸塩を備える、請求項36に記載のキット。
- 請求項1および22~28のいずれか一項で定義される式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体を投与することによる、被験体における脳腫瘍の治療に対する応答を予測する方法であって:
a)前記被験体から採取された試料中のEB1のレベルを測定して、このレベルを表す1つもしくは複数の値を得る工程;および
b)工程a)から得られた前記レベルの前記1つもしくは複数の値を標準値または標準値のセットと比較し、その比較から、式Iの前記化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する応答性が予測される、工程;
を含む、方法。 - 標準値または標準値のセットに対して、被験体から採取された試料中のEB1のレベルが高いことによって、前記式Iの化合物または薬剤として許容されるその誘導体に対する前記脳腫瘍の感受性が予測される、請求項38に記載の方法。
- 前記脳腫瘍が、多形性膠芽腫である、請求項38または39に記載の方法。
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