WO2020235671A1 - 性ホルモン非感受性ｇｒｅｂ１陽性腫瘍の治療剤 - Google Patents

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菊池　章
松本　真司
拓 山道
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for a sex hormone-insensitive GREB1 (Growth regulation by estrogen in breast cancer) -positive tumor (GREB1-positive tumor that is not sensitive to sex hormones). Furthermore, the present invention relates to a method for examining hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, and neuroblastoma using the expression level of GREB1 as an index.
  • Hepatoblastoma is a malignant tumor that develops in the liver of children and often develops by the age of 3 years, accounting for about 90% of liver malignancies in children under 4 years of age.
  • hepatoblastoma affects 40 to 30 people annually, and the frequency of hepatoblastoma is about 1 in 1 million worldwide, and it is classified as a rare cancer.
  • the etiology of hepatoblastoma is unknown, but nearly 70% of them have a deletion or activation mutation in the region containing exon 3 involved in ⁇ -catenin degradation, and a familial adenomatous species in which ⁇ -catenin accumulates. Since it is also common in families with sex colon polyposis (FAP), activation of Wnt signaling is considered to be involved in the pathology.
  • FAP sex colon polyposis
  • the prognosis is affected by the presence or absence of complete resection, so the treatment policy is selected by postoperative staging.
  • the prognosis is good at stage I of complete resection, but the 5-year disease-free survival rate drops to 36% at stage IV of distant metastases.
  • treatment of hepatoblastoma is a combination of chemotherapy and surgical resection.
  • chemotherapy a regimen containing cisplatin has been established as a standard treatment, but serious side effects such as suppression of bone marrow function and renal dysfunction have become problems.
  • GREB1 was discovered as one of the genes induced by estrogen in breast cancer cells (see Non-Patent Document 1), was directly induced to be expressed by estrogen receptor ⁇ (ER ⁇ ), and was highly expressed in ER ⁇ -positive breast cancer cells. However, it has been reported that it is not expressed in ER ⁇ -negative cells. It has been reported that ER ⁇ binds to the promoter region of the GREB1 gene, expresses GREB1, and activates its transcriptional activity by directly interacting with ER ⁇ (see Non-Patent Document 2). In fact, it has also been reported that the expression level of GREB1 mRNA correlates with the expression level of ER ⁇ in breast cancer (see Non-Patent Document 2).
  • Non-Patent Document 3 Since the GREB1 promoter region has an androgen response sequence, GREB1 is induced by androgen in androgen receptor (AR) -positive prostate cancer cells, but not in AR-negative cells (see Non-Patent Document 5). Thus, GREB1 has become a mediator for the growth of sex hormone-sensitive tumors.
  • AR androgen in androgen receptor
  • An object of the present invention is to provide a novel therapeutic agent for tumors. Another object of the present invention is to provide a test method for predicting the presence or absence of hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, and neuroblastoma.
  • hepatoblastoma cells hepatocancer cells, malignant melanoma cells, neuroblastoma cells, etc. are treated with sex hormones such as estrogen and androgen.
  • sex hormones such as estrogen and androgen.
  • tumor cells that do not promote growth but express GREB1
  • GREB1 is involved in the growth of tumor cells with these characteristics (ie, GREB1-positive tumors that do not show sex hormone sensitivity). I found that.
  • GREB1 is a target gene for Wnt / ⁇ -catenin signaling in hepatoblastoma and hepatocellular carcinoma
  • GREB1 is a transcription factor in malignant melanoma. It is a target gene of MITF (Microphthalmia-associated transcription factor), and it was found that GREB1 is gene-amplified in neuroblastoma.
  • MITF Microphthalmia-associated transcription factor
  • GREB1 is expressed specifically in tumor tissues in hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, and neuroblastoma.
  • the present invention has been completed by further studies based on these findings.
  • Item 1 A therapeutic agent for sex hormone-insensitive GREB1-positive tumors containing a substance that suppresses the expression of GREB1 as an active ingredient.
  • Item 2. Item 2. The therapeutic agent according to Item 1, wherein the substance is at least one nucleic acid drug selected from the group consisting of siRNA, shRNA, dsRNA, antisense nucleic acid, and ribozyme for GREB1.
  • Item 3. Item 3.
  • the therapeutic agent according to Item 1 or 2 wherein the tumor is hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, or neuroblastoma.
  • a test method for predicting the presence or absence of hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, or neuroblastoma comprising the step of measuring the expression level of GREB1 in liver tissue, skin tissue, or nerve tissue collected from a subject.
  • Item 5. The test method according to Item 4, wherein the expression level of GREB1 in the woven liver tissue, skin tissue, or nerve tissue is measured by tissue immunization using an anti-GREB1 antibody.
  • Item 7. Item 6.
  • Item 8. A method for treating a sex hormone-insensitive GREB1-positive tumor in which a therapeutically effective amount of a substance that suppresses the expression of GREB1 is administered to a patient suffering from a sex hormone-insensitive GREB1-positive tumor.
  • the treatment method according to Item 9, wherein the tumor is hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, or neuroblastoma.
  • Item 11 Use of a substance that suppresses the expression of GREB1 for the production of therapeutic agents for sex hormone-insensitive GREB1-positive tumors.
  • Item 11. Item 10. The use according to Item 10, wherein the tumor is hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, or neuroblastoma.
  • Item 12. A substance that suppresses the expression of GREB1 used in the treatment of sex hormone-insensitive GREB1-positive tumors.
  • Item 13 Item 2. The substance that suppresses the expression of GREB1 according to Item 12, wherein the tumor is hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, or neuroblastoma.
  • the therapeutic agent of the present invention was completed based on a new finding that GREB1 is a downstream target gene of Wnt / ⁇ -catenin signal in sex hormone-insensitive GREB1-positive tumors, and GREB1 is used as a target molecule. By suppressing its expression, the growth of the tumor cells can be effectively suppressed.
  • sex hormone-insensitive GREB1-positive tumors include hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, and neuroblastoma.
  • hepatoblastoma is a pediatric-specific disease and a rare cancer that occurs infrequently, the development of chemotherapeutic agents and molecular-targeted agents has not been sufficiently advanced in the past.
  • the morphology makes it possible to provide an excellent molecular target for hepatoblastoma.
  • the therapeutic agent of the present invention targeting GREB1 as a molecular target has few side effects. It can also be said to be innovative in that respect.
  • early hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, and malignant melanoma can be used by using the expression level of GREB1 in a biopsy specimen or a surgically resected specimen suspected to have a neoplastic disease as an index. , Or in the case of surgically resected specimens, it can be applied to the diagnosis of neuroblastoma and the extent of histological extension of these tumors.
  • Figure a shows the mRNA expression analysis of the target gene downstream of Wnt / ⁇ -catenin signaling using hepatoblastoma cells.
  • b shows the TCF4 binding sequence (-443 to -448) upstream of the human GREB1 gene, and the chromatin derived from HepG2 cells was immunoprecipitated with a predetermined antibody for the TCF4 binding site (-443 to -448). It is a figure which shows the result of the analysis by PCR using the region-specific primer.
  • c shows the results of measuring the expression level of GREB1 mRNA by real-time PCR analysis of HepG2 cells transfected with siRNA against control siRNA or ⁇ -catenin (left), and anti-GREB1 antibody and anti-GREB1 antibody in the cell lysate. It is a figure (right) which shows the result of probe with Axin2 antibody, anti- ⁇ -catenin antibody, and anti-HSP90 antibody.
  • e is a diagram showing the results of immunostaining of hepatoblastoma tissue specimens with anti-GREB1 antibody or anti- ⁇ -catenin antibody, and hematoxylin, and the solid box is the region where the degree of ⁇ -catenin staining is high, the dotted line. The box is the area where the degree of ⁇ -catenin staining is low.
  • f is a diagram showing the results of analysis of GREB1 mRNA expression levels in 50 tumor lesion sites and 5 non-tumor regions using 55 cases in the mRNA profile data set of hepatoblastoma (GEOID: gse75271).
  • .. g is the expression level of the target gene of the Wnt / ⁇ -catenin pathway (Y-axis) and the expression level of the GREB1 gene (X-axis) using 55 cases in the mRNA profile data set of hepatoblastoma (GEOID: gse75271). It is a figure which shows the result of having analyzed the correlation with).
  • A is a diagram showing the results of measuring the expression level of GREB1 mRNA by real-time PCR after treating HepG2 cells with the estrogen receptor antagonist ICI-182,786.
  • B is a diagram showing the results of measuring the expression level of GREB1 mRNA by real-time PCR after treating BMEL cells with the GSK3 inhibitor CHIR99021 (Wnt / ⁇ -catenin pathway activator) having a final concentration of 5 ⁇ M.
  • C is a diagram showing the results of measuring the expression levels of GREB1 mRNA and ⁇ -catenin mRNA by real-time PCR after introducing siRNA against ⁇ -catenin into Huh6 cells.
  • D is a diagram showing the results of measuring the expression level of GREB1 mRNA by real-time PCR for HepG2 cells and Huh6 cells.
  • E is a diagram showing the results of measuring the expression levels of GREB1 and Axin2 mRNA by real-time PCR after treating MCF7 cells with estrogen receptor antagonists ICI-182,786, CHIR99021, or a combination thereof.
  • F is a diagram showing the results of measuring the expression level of GREB1 mRNA by real-time PCR after treating HLE, SNU387, SNU449, and Huh7 cells, which are hepatocellular carcinoma cell lines, with CHIR99021 at a final concentration of 5 ⁇ M.
  • h is a diagram showing the results of immunostaining of hepatoblastoma tissue specimens with anti-GREB1 antibody and hematoxylin, the solid line box is the region where GREB1 staining is high (solid and non-polarized), and the dotted box is GREB1.
  • HepG2 cells or HepG2 cells expressing GREB1 are transfected with control siRNA or siRNA against ⁇ -catenin, and two-dimensional culture (culture in a plastic dish) is performed to increase the number of cells over time. It is a figure which shows the result of having measured.
  • b transfected control siRNA or two different siRNAs (GREB1 # 1 siRNA and GREB1 # 2 siRNA) into HepG2 cells and lysates the cell lysate with anti-GREB1 antibody, anti-Axin2 antibody, anti- ⁇ -catenin antibody, and anti. It is a figure which shows the result of probe with HSP90 antibody.
  • C is a diagram showing the results of real-time PCR analysis of GREB1 mRNA amount, PRLR mRNA amount, and XBP1 mRNA amount in HepG2 cells transfected with control siRNA or siRNA (GREB1 # 2 siRNA).
  • d is the expression level of the hepatoblastoma-specific marker gene (Y-axis) and the expression level of the GREB1 gene (X-axis) using 55 cases in the mRNA profile data set of hepatoblastoma (GEOID: gse75271). The result of analyzing the correlation of is shown.
  • E is a diagram showing the results of two-dimensional culture (culture in a plastic dish) of Huh6 cells expressing GFP or GFP-GREB1 and measuring the number of cells over time.
  • F is a diagram showing the results of three-dimensional culture (cultured in Matrigel) of Huh6 cells expressing mock or GREB1 and measurement of the size of the formed spheres.
  • g is an anti-GREB1 antibody and anti-GREB1 antibody against the cell lysate of HepG2 cells, HepG2 cells in which GREB1 is knocked out (GREB1 KO HepG2), or GREB1 KO HepG2 cells expressing GFP-GREB1 (GREB1 KO HepG2 / GREB1). It is a figure which shows the result of probe with the GFP antibody and the anti-Histone H3 antibody.
  • j is an anti-CyclinA antibody, anti-phosphorylated Histone H3 (against CyclinA antibody, anti-phosphorylated Histone H3) against the cell lysate of HepG2 cells, HepG2 cells in which GREB1 was knocked out (GREB1 KO), or GREB1 KO HepG2 cells (GREB1 KO / GREB1) expressing GREB1. It is a figure which shows the result of probe with a pHistone H3) antibody and an anti-Histone H3 antibody.
  • siRNAs for control siRNA or GREB1 are transfected into HepG2 cells into which mock or GREB1 has been introduced, and two-dimensional culture (culture in a plastic dish) is performed. It is a figure which shows the result of having performed and measuring the cell number with time.
  • HepG2 cells transfected with control siRNA or siRNA (GREB1 # 2 siRNA) were cultured in a three-dimensional matrigel for 5 days, the cells were stained with phalloidin, and polarized spheres having a sphere area and a lumen. It is a figure which shows the result of having calculated the ratio of.
  • c is a diagram showing the results of measuring the expression levels of GREB1 mRNA, DLK1 mRNA, AFP mRNA, and PEG3 mRNA by real-time PCR analysis of HepG2 cells transfected with control siRNA or siRNA against GREB1 (GREB1 # 2 siRNA). Is.
  • HepG2 cells transfected with two different siRNAs (GREB1 # 1 siRNA and GREB1 # 2 siRNA) against control siRNA or GREB1 were cultured in a medium containing 0.1% FBS for 1 day, and the cell lysate was used as anti-cyclinA.
  • f transfects HepG2 cells with two different siRNAs against control siRNA or GREB1 (GREB1 # 1 siRNA and GREB1 # 2 siRNA) and contains 0.1% FBS medium (with or without caspase inhibitor Z-VAD). ) For 2 days, stained with propidium iodide (PI) and Hoechst33342, and the cell viability was determined. g transfects HepG2 cells with two different siRNAs against control siRNA or GREB1 (GREB1 # 1 siRNA and GREB1 # 2 siRNA) and incubates for 2 days, and the cell lysate is subjected to anti-cleaved caspase 3 antibody and anti-PARP1.
  • PI propidium iodide
  • g transfects HepG2 cells with two different siRNAs against control siRNA or GREB1 (GREB1 # 1 siRNA and GREB1 # 2 siRNA) and incubates for 2 days, and the cell lysate is subjected
  • FIG. A is a schematic diagram of wild-type GREB1 and GREB1 ⁇ NLS mutants, and a diagram showing the results of staining X293T cells expressing the HA-FLAG-GREB1 ⁇ NLS mutant with anti-FLAG antibody, phalloidin, and Hoechst 33342.
  • b is the HA-FLAG-GREB1 wild type or HA-FLAG-GREB1 ⁇ NLS variant, and the cell lysate (Input) of X293T expressing GFP, GFP-Smad3, GFP-Smad4, or GFP-Smad7, and anti-GFP antibody.
  • C is a diagram showing the results of probing HepG2 cell lysate (Input) and immunoprecipitate (IP) with anti-Smad2 / 3 antibody with anti-Smad2 / 3 antibody and anti-GREB1 antibody.
  • d is a schematic diagram of Smad2 and Smad2 variants (N and C), and lysis of X293T cells expressing HA-FLAG-mGREB1 and GFP, or GFP-Smad2 (Full, variant N, or variant C).
  • f is a schematic diagram of GREB1 mutants (1-666: N, NLS / 667-1333: M, and NLS / 1334-1954: C), and X293T cells expressing the GFP-GREB1 mutant are used as anti-GFP antibodies and It is a figure which shows the result of staining with Hoechst 33342.
  • g is an anti-FLAG antibody or anti-FLAG antibody or anti-FLAG antibody or anti-fluorescent solution (Input) of X293T cells expressing FLAG-Smad3 and GFP, GFP-GREB1 or GFP-GREB1 mutant and immunoprecipitation (IP) by anti-GFP antibody. It is a figure which shows the result of probe with the GFP antibody.
  • A is a diagram showing the results of staining X293T cells expressing GFP-Smad3, GFP-Smad4, or GFP-Smad7 with an anti-GFP antibody and Hoechst 33342.
  • b shows the results of probed with anti-Smad2 / 3 antibody and anti-GFP antibody against the cell lysate (Input) of Huh6 expressing GFP-GREB1 and immunoprecipitation (IP) with anti-Smad2 / 3 antibody. It is a figure which shows.
  • c is an anti- ⁇ -catenin antibody against GFP, GFP-Smad3, GFP-Smad4, or X293T cell lysate (Input) expressing GFP-Smad7, and immunoprecipitation (IP) by anti-GFP antibody. It is a figure which shows the result of probe with the anti-c-Myc antibody or the anti-GFP antibody.
  • the lysate of Huh6 cells expressing GFP-GREB1 was precipitated with recombinant GST, recombinant GST-Smad2 / MH1, or recombinant GST-Smad2 / MH2, and precipitated with cell lysate (Input) and glutathione sepharose.
  • e is a schematic diagram of variants of GREB1 (NSL / 667-195 ( ⁇ N), ⁇ 667-1333 ( ⁇ M), NSL / 1-133 ( ⁇ C)), and FLAG-Smad3 and GFP, GFP-GREB1, or Immunoprecipitation with GFP-antibody lysate (Input) of X293T cells expressing GFP-GREB1 mutants (NSL / 667-195 ( ⁇ N), ⁇ 667-1333 ( ⁇ M), NSL / 1-1333 ( ⁇ C)) It is a figure which shows the result of probe with the anti-FLAG antibody or anti-GFP antibody with respect to IP).
  • a is the result of analyzing the expression levels of PAI-1 mRNA and GADD45B mRNA for 50 tumor lesion sites and 5 non-tumor regions using 55 cases in the mRNA profile data set of hepatoblastoma (GEOID: gse75271). It is a figure which shows.
  • b correlates the expression level of the target gene of TGF ⁇ signal (Y-axis) with the expression level of GREB1 gene (X-axis) using 55 cases in the mRNA profile data set of hepatoblastoma (GEOID: gse75271). It is a figure which shows the result of having analyzed.
  • HepG2 / GFP GFP-expressing HepG2 cells
  • GFP-GREB1 expressing HepG2 cells HepG2 / GFP-GREB1
  • control siRNA or GREB1 # 2 siRNA Control siRNA or GREB1 # 2 siRNA
  • intracellular PAI- It is a figure which shows the result of having measured the mRNA amount of 1 and SNAIL2.
  • HepG2 cells are transfected with control siRNA or GREB1 # 2 siRNA and cultured in the presence or absence of a TGF ⁇ receptor inhibitor (ALK5 inhibitor) to determine the amount of intracellular PAI-1 and SNAIL2 mRNA. It is a figure which shows the measurement result.
  • ALK5 inhibitor TGF ⁇ receptor inhibitor
  • e is an anti-p300 antibody, an anti-GREB1 antibody, or an anti-Smad2 antibody against a lysate (Input) of HepG2 cells transfected with control siRNA or GREB1 # 2 siRNA and an immunoprecipitate (IP) by an anti-Smad2 / 3 antibody. It is a figure which shows the result of probe with a / 3 antibody.
  • f is anti-p300 antibody, anti-p300 antibody, anti-p300 antibody against HA-FLAG-GREB1, GFP-Smad2 mutant (C), or lysate (Input) of X293T cells expressing GFP and immunoprecipitation (IP) by GFP antibody.
  • g is obtained by culturing HepG2 cells transfected with control siRNA or GREB1 # 2 siRNA in the presence or absence of TGF ⁇ , and PAI contained in the lysate (Input) and immunoprecipitation (IP) of the cultured cells. It is a figure which shows the result of having analyzed the exon 2 region of -1 by PCR using the region-specific primer.
  • H is a diagram showing the results of transfecting each of the illustrated plasmids into HepG2 cells and measuring the expression level of SNAIL2 mRNA, p15 mRNA, or Axin2 mRNA by real-time PCR.
  • i is a two-dimensional culture of HepG2 cells transfected with a combination of control siRNA, TGF ⁇ 1 siRNA, GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA) or TGF ⁇ 1 siRNA and GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA), and the number of cells is increased over time. It is the result of measurement.
  • control siRNA or GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA) was transfected into HepG2 cells and HepG2 cells (HepG2 / Smad2 / 3 KO) in which Smad2 / 3 was knocked out, and two-dimensional culture was performed. It is a figure which shows the result of the measurement.
  • a shows the results of analyzing the expression levels of Axin2 mRNA and DKK1 mRNA for 50 tumor lesion sites and 5 non-tumor regions using 55 cases in the mRNA profile data set of hepatoblastoma (GEOID: gse75271). It is a figure.
  • b is the result of real-time PCR analysis of the amount of PAI-1 mRNA in HepG2 cells (Control), HepG2 cells in which GREB1 was knocked out (GREB1 KO), or GREB1 KO HepG2 cells (GREB1 KO / GREB1) expressing GREB1. It is a figure which shows.
  • HepG2 cells transfected with control siRNA or siRNA against GREB1 were cultured for 30 minutes in the presence or absence of 10 ng / mL TGF ⁇ , and then the cells were stained with anti-Smad2 / 3 antibody and Hoechst 33342. It is a figure which shows the result of this.
  • HepG2 cells transfected with control siRNA or siRNA against GREB1 are cultured in the presence or absence of TGF ⁇ , and the cell lysate (Input) and immunoprecipitate with anti-Smad2 / 3 antibody.
  • F is a diagram showing the results of expressing the TGFBR1 / T204D mutant in HepG2 cells and analyzing the amounts of AFP mRNA and DLK1 mRNA by real-time PCR.
  • G is a diagram showing the results of probing HepG2 cells and lysates of HepG2 cells (HepG2 / Smad2 / 3 KO) in which Smad2 / 3 was knocked out with an anti-Smad2 / 3 antibody or an anti-HSP90 antibody.
  • FIG. A is a diagram showing the results of analyzing the gene expression levels of TGF ⁇ 1, TGFB2, or TGFB3 using RNA sequence data of HepG2 in the mRNA profile data set of Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE).
  • b is the amount of PAI-1 mRNA, TGFB1 mRNA and GREB1 mRNA in HepG2 cells transfected with a combination of control siRNA, TGF ⁇ 1 siRNA, GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA) or TGF ⁇ 1 and GREB1 (GREB1 # 2 siRNA) siRNA. It is a figure which shows the result of having analyzed the amount by real-time PCR.
  • c is an anti-GREB1 antibody, anti-TGFB1 antibody obtained by transfecting a lysate of HepG2 cells transfected with control siRNA, TGF ⁇ 1 siRNA, GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA), or a combination of TGF ⁇ 1 and GREB1 (GREB1 # 2 siRNA) siRNA. , Or the result of probe with anti-HSP90 antibody.
  • d refers to HepG2 cells transfected with control siRNA, TGF ⁇ 1 siRNA, or a combination of TGF ⁇ 1 siRNA and GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA) in the presence or absence of TGF ⁇ at a concentration of 0.01, 0.1, or 1 ng / ml 4
  • E is a diagram showing the results of real-time PCR analysis of the amount of p15 mRNA, p21 mRNA, and p27 mRNA in HepG2 cells transfected with control siRNA or siRNA (GREB1 # 2 siRNA) against GREB1.
  • HepG2 cells and HepG2 cells (HepG2 / Smad2 / 3 KO) in which Smad2 / 3 was knocked out were transfected with control siRNA or siRNA against GREB1 (GREB1 # 2siRNA), and the amount of p15 mRNA was analyzed by real-time PCR.
  • g is a two-dimensional culture (culture in a plastic dish) of HepG2 cells transfected with control siRNA, GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA), p15 siRNA, or a combination of GREB1 (GREB1 # 2 siRNA) and p15 siRNA.
  • h is a medium containing 0.1% FBS of HepG2 cells transfected with control siRNA, GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA), p15 siRNA, or a combination of GREB1 (GREB1 # 2 siRNA) and p15 siRNA (caspase inhibitor Z).
  • -It is a figure which shows the result of having determined the cell viability by culturing for 2 days with and without VAD and staining with propidium iodide (PI) and Hoechst33342.
  • I is a diagram showing the results of real-time PCR measurement of the expression levels of PAI-1 mRNA and GREB1 mRNA after treating MCF7 cells with the estrogen receptor antagonist ICI-182,786.
  • J is a diagram showing the results of transfecting MCF7 cells with siRNA against control siRNA or GREB1 (GREB1 # 2 siRNA) and analyzing the amount of PAI-1 mRNA or GREB1 mRNA by real-time PCR.
  • K is a diagram showing the results of probing MCF7 cell lysate (Input) and immunoprecipitate (IP) with anti-Smad2 / 3 antibody with anti-Smad2 / 3 antibody and anti-GREB1 antibody.
  • A is a diagram showing the results of immobilizing HepG2 cells expressing GFP-GREB1 and staining them with an anti-GFP antibody and Hoechst 33342.
  • B is a diagram showing the results of immobilizing HepG2 cells expressing GFP-GREB1 and staining with Hoechst 33342 with anti-GFP antibody, anti-Fibrillarin antibody, anti-SC35 antibody, anti-PML antibody or anti-Coilin antibody.
  • C is a diagram showing the results of immobilizing HepG2 cells expressing GFP-GREB1 and FLAG-SMAD3 and staining them with anti-GFP antibody, anti-FLAG antibody and Hoechst 33342.
  • D is a diagram showing the results of observing HepG2 cells immobilized in the presence of ethynyluridine (EU) for 30 minutes.
  • Figure a shows the results of culturing HepG2 cells in the presence or absence of 10 ng / mL TGF ⁇ for 30 minutes, immobilizing the cultured cells and staining them with anti-SMAD2 / 3 antibody, anti-GREB antibody, and Hoechst 33342. Is.
  • b shows the results of culturing HepG2 cells in the presence or absence of TGF ⁇ , immobilizing the cultured cells and staining them with anti-GREB1 antibody, anti-phosphorylated SMAD2 / 3 (pSMAD2 / 3) antibody, and Hoechst 33342. It is a figure.
  • HepG2 cells are cultured in the presence or absence of TGF ⁇ , the cultured cells are immobilized, a mouse anti-GREB1 antibody and a rabbit anti-SMAD2 / 3 antibody are reacted, and a secondary antibody (PLA probe) is further bound.
  • d shows the results of staining X293T cells expressing GFP-bound GREB1 mutants (1-666: N, NLS / 667-1333: M, and NLS / 1334-1954: C) with anti-GFP antibody.
  • e is an anti-GFP antibody, an anti-GREB1 antibody, which is obtained by incubating HepG2 cells expressing or not expressing GFP-SMAD3 and HA-FLAG-GREB1 in the presence of ethynyluridine (EU), and then immobilizing the cells.
  • EU ethynyluridine
  • b refers to liver tissue sections isolated from mice introduced with ⁇ N90 ⁇ -catenin and YAPS127A (BY model), ⁇ N90 ⁇ -catenin and c-Met (BM) model, or ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met (BYM model).
  • BY model liver tissue sections isolated from mice introduced with ⁇ N90 ⁇ -catenin and YAPS127A
  • BM ⁇ N90 ⁇ -catenin and c-Met
  • BYM model liver tissue sections isolated from mice introduced with ⁇ N90 ⁇ -catenin and YAPS127A (BY model), ⁇ N90 ⁇ -catenin and c-Met (BM) model, or ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met (BYM model).
  • A is a diagram showing the results of immobilizing Huh6 cells or HepG2 cells and staining them with an anti-YAP antibody and Hoechst 33342.
  • B is a diagram showing the results of measuring the expression levels of GREB1 mRNA, YAP mRNA, and TAZ mRNA by real-time PCR on HepG2 cells or Huh6 cells transfected with control siRNA or siRNA against YAP / TAZ.
  • c expresses GREB1 mRNA, Axin2 mRNA, and Cyr61 mRNA by real-time PCR after treating Huh6 cells with CHIR99021, XMU-MP1 which is an Mst1 / 2 kinase inhibitor (YAP activator), or a combination thereof. It is a figure which shows the result of having measured the amount.
  • d shows the results of measuring the expression levels of c-Met mRNA, Axin2 mRNA, GREB1 mRNA, ANKRD1 mRNA, and Cyr61 mRNA by real-time PCR on HepG2 cells transfected with siRNA against control siRNA or c-Met. Is.
  • e is an anti-c-Met antibody, an anti-phosphorylated ⁇ -catenin (pY654) antibody, an anti- ⁇ -catenin antibody, an anti-Axin2 antibody, and an anti-GREB1 lysate of HepG2 cells transfected with control siRNA or siRNA against c-Met. It is a figure which shows the result of probe with an antibody and an anti- ⁇ -Actin antibody.
  • a is the liver of mice introduced with ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met (BYM, control; C1-C7), mice administered with ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met together with GREB1 shRNA (BYM + GREB1 shRNA; BYM). It is a figure which shows the result of observing the liver of GREB1 KD mouse, K1 to K6), and the liver of untreated mouse (NL mouse).
  • B is a diagram showing the results of obtaining 6 tumor nodules from the BYM mice (C1 to C7) and measuring the expression level of hepatoblastoma-related genes.
  • C is a diagram showing the results of staining with hematoxylin and eosin on liver tissue sections isolated from BYM mice in the GREB1 high group (C4) and GREB1 low group (C3).
  • D is a diagram showing the results of staining liver tissue sections isolated from BYM mice in the GREB1 high group (C4) and GREB1 low group (C3) with anti-GREB1 antibody or anti-DLK1 antibody and hematoxylin.
  • E is a diagram showing the ratio of the weight of the liver obtained from each of the mice to the total weight and the result of measuring the serum AFP value of each of the mice.
  • f is 3 BYM mice (GREB1 high group: C1, C4, and C6), 4 BYM mice (GREB1 low group: C2, C3, C5, and C7), and 2 animals to which GREB1 shRNA was administered. It is a figure which shows the result of extracting the total RNA from the tumor nodule of BYM mouse (BYM GREB1 KD mouse; K2 and K4) and analyzing the mRNA amount of GREB1, DLK1 and TASCSTD1 by real-time PCR.
  • g shows the results of staining liver tissue sections of BYM mice (GREB1 high group: C4) and BYM mice (GREB1 shRNA: K2) to which GREB1 shRNA was administered with hematoxylin / eosin, or anti-GREB1 antibody and hematoxylin. Is.
  • h is the result of staining the liver tissue sections of BYM mice (GREB1 high group: C4) and BYM mice (GREB1 shRNA: K2) to which GREB1 shRNA was administered with anti-N-cadherin antibody and Hoechst 33342 (left figure), and It is a figure which shows the result (the figure below) which calculated the ratio of the N-cadherin expression level of a tumor lesion site with respect to the N-cadherin expression level of a non-tumor area.
  • a is a ⁇ N90 ⁇ -catenin introduced by obtaining tumor nodules from the livers of mice (BYM, controls; C1-C7) into which ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met were introduced, and the livers of untreated mice (NL mice). , YAPS127A, and c-Met are shown in the figure showing the results of measuring the expression levels.
  • c is the expression level (Y axis) of DLK1 mRNA, TACSTD1 mRNA, GPC3 mRNA, MEG3 mRNA, and Axin2 mRNA and the expression level of GREB1 gene (X) using the tumor nodules obtained from the BYM mice (C1 to C7).
  • the result of analyzing the correlation with (axis) is shown.
  • D is a diagram showing the results of staining with hematoxylin and eosin on liver tissue sections isolated from BYM mice in the GREB1 high group (C4) and GREB1 low group (C3).
  • e is an anti-GREB1 antibody, which is a lysate of HepG2 cells (Control), HepG2 cells knocked out of GREB1 (GREB1 KO), or HepG2 cells knocked out by combining GREB1 and Smad2 / 3 (GREB1 KO + Smad2 / 3 KO). It is a figure which shows the result of probe with the anti-Smad2 / 3 antibody and anti-HSP90 antibody.
  • f is a two-dimensional culture (in a plastic dish) of HepG2 cells (WT), HepG2 cells knocked out of GREB1 (GREB1 KO), or HepG2 cells knocked out by combining GREB1 and Smad2 / 3 (GREB1 KO / Smad2 / 3 KO). It is a figure which shows the result of culturing) and measuring the number of cells with time.
  • a is wild-type HepG2 cells (control), HepG2 cells in which GREB1 was knocked out (GREB1 KO), cells in which GREB1 was expressed in HepG2 cells in which GREB1 was knocked out (GREB1KO / GREB1), and GREB1 ⁇ NLS in HepG2 cells in which GREB1 was knocked out.
  • Matrigel containing HepG2 cells was transplanted into the liver of a nude mouse, and control ASO, GREB1 ASO-6921, or GREB1 ASO-7724 was subcutaneously administered twice a week from 3 days after transplantation, and 27 days after transplantation. It is a figure which shows the result of having observed the appearance of the tumor of a liver, and having calculated the tumor weight.
  • D is a diagram showing the results of staining a section of each liver tumor with an anti-Ki-67 antibody and hematoxylin to determine the ratio of Ki-67-positive cells to the number of hematoxylin-positive cells (total cells).
  • E is a diagram showing the results of staining a section of each liver tumor with an anti-caspase3 antibody and hematoxylin to determine the ratio of caspase3-positive cells to the number of hematoxylin-positive cells (total cells).
  • F is a diagram showing the results of real-time PCR analysis of the amounts of GREB1 and PAI-1 mRNA in each liver tumor. a is the result of transfecting HepG2 cells with control ASO or each GREB1 ASO, and probing the cell lysate with anti-GREB1 antibody and anti-HSP90 antibody.
  • Matrigel containing HepG2 cells was transplanted into the liver of a nude mouse, and control ASO, GREB1 ASO-6921, or GREB1 ASO-7724 was subcutaneously administered twice a week from 3 days after transplantation, and 27 days after transplantation. It is a figure which shows the result of having determined the ratio of the cleaved caspase3 positive cell by staining the section with the anti-cleaved caspase3 antibody and hematoxylin using the non-tumor part of the liver as a sample.
  • ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met were introduced into mice, and control ASO and ASO targeting mouse GREB1 (mGREB1 ASO-5715) were subcutaneously administered twice a week from 3 days after the introduction.
  • D is a diagram showing the results of real-time PCR analysis of the amount of GREB1 mRNA in each liver tumor.
  • A is a scatter plot showing the expression level of GREB1 mRNA in a cancer cell line obtained from The Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) using DepMap portal.
  • B is a diagram showing the results of probing the lysate of each cancer cell with an anti-GREB1 antibody and an anti-GAPDH antibody.
  • D is a table showing the result of analyzing the relationship between the protein amount of GREB1 and ⁇ -catenin based on the result of immunohistological analysis in C.
  • FIG. E is a diagram showing the results of two-dimensional culture (culture in a plastic dish) of CHP212 cells transfected with control ASO or GREB1 ASO and measuring the number of cells (mean ⁇ SD) over time.
  • B is a table showing the results of analyzing the relationship between the protein amounts of GREB1 and ⁇ -catenin based on the results of immunohistological analysis in A.
  • C is a diagram showing the results of probing the lysate of each cancer cell with an anti-GREB1 antibody and an anti-GAPDH antibody.
  • D is a diagram showing the results of probing the lysate of each cell transfected with control siRNA or ⁇ -catenin siRNA with anti-GREB1 antibody, anti- ⁇ -catenin antibody, and anti-GAPDH antibody.
  • E is a diagram showing the results of two-dimensional culture (culture in a plastic dish) of Hep3B cells or JHH7 cells transfected with control siRNA or GREB1 # 2 siRNA and measuring the number of cells over time.
  • the typical appearance of the tumor is the middle figure is the change over time of the tumor size, and the right figure is the result of measuring the tumor weight after 45 days.
  • the left figure shows a xenograft tumor excised 14 days after transplantation.
  • the typical appearance of the tumor is the change over time of the tumor size, and the right figure is the result of measuring the tumor weight after 14 days. ** P ⁇ 0.01; * P ⁇ 0.05.
  • A is a diagram showing the results of probing the lysate of each cell with an anti-GREB1 antibody and an anti-HSP90 antibody.
  • the figure on the left of B is a schematic diagram of the isoform of human GREB1 (in the figure, aa is an abbreviation for amino acid).
  • the figure on the right of B shows the average exon expression level of the human GREB1 gene in breast cancer and cutaneous malignant melanoma obtained from the TCGA data set using TCGA SpliceSeq (http://projects.insilico.us.com/TCGASpliceSeq).
  • OPKM Observations Per Kilobases of exon / splice per Million aligned reads).
  • C is the top 10 cells that were correlated with GREB1 expression in the data set of skin malignant melanoma obtained by TCGA using'R2: genomics analysis and visualization platform (http://r2.amc.nl)'. It is a table showing a list of genes of. R indicates Pearson's correlation coefficient, and * indicates a known downstream target gene of MITF. D is a diagram showing the results of immunostaining of skin malignant melanoma specimens with anti-GREB1 antibody, anti-MITF antibody, and hematoxylin.
  • E is a diagram showing the results of probing CLO679 cells (control) and CLO679 cells (MITFKO) in which MITF was knocked out with anti-GREB1 antibody, anti-MITF antibody, and anti-clathrin antibody.
  • F is a diagram showing the results of two-dimensional culture (culture in a plastic dish) of SKMEL28 cells transfected with control siRNA or GREB1 siRNA and measuring the number of cells (mean ⁇ SD) over time.
  • FIG. G is a diagram showing the results of two-dimensional culture (culture in a plastic dish) of SKMEL28 cells transfected with control ASO or GREB1 ASO and measuring the number of cells (mean ⁇ SD) over time.
  • the therapeutic agent of the present invention is a drug used for the treatment of sex hormone-insensitive GREB1-positive tumor, and the active ingredient is a substance that suppresses the expression of GREB1. It is characterized by.
  • the therapeutic agent of the present invention will be described in detail.
  • GREB1 becomes a target gene for Wnt / ⁇ -catenin signal and MITF in sex hormone-insensitive GREB1-positive tumor cells, and may also amplify the gene, and has an effect of promoting the growth of the tumor cells.
  • amino acid sequence and base sequence of GREB1 are also known.
  • amino acid sequence of human GREB1 (isoforma) is SEQ ID NO: 1
  • nucleotide sequence of human GREB1 (isoforma) mRNA is SEQ ID NO: 2
  • nucleotide sequence of cDNA encoding human GREB1 (isoforma) is SEQ ID NO: 3.
  • the "substance that suppresses the expression of GREB1" is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable and can suppress the expression of GREB1 from the DNA encoding GREB1 (GREB1 gene).
  • the substance that suppresses the expression of GREB1 may be a substance that exerts an inhibitory effect on the expression of GREB1 at any stage such as transcription, post-transcriptional regulation, translation, and post-translational modification of the GREB1 gene.
  • nucleic acid molecule that suppresses transcription of the GREB1 gene such as a decoy nucleic acid; an RNA molecule having an RNA interfering effect on the mRNA of GREB1 such as siRNA, shRNA, and dsRNA, or an RNA molecule thereof.
  • Nucleic acid drugs such as miRNA, antisense nucleic acid (antisense DNA, antisense RNA), nucleic acid molecule that suppresses translation of GREB1 mRNA such as ribozyme. These nucleic acid molecules may be used alone or in combination of two or more.
  • the nucleotide sequences of these nucleic acid molecules can be appropriately designed by a method known to those skilled in the art based on the information on the nucleotide sequence of the GREB1 gene.
  • siRNA, shRNA, dsRNA, antisense nucleic acid, and ribozyme are preferably mentioned from the viewpoint of ease of clinical application.
  • nucleic acid molecule may be subjected to various modifications generally applied to nucleic acids, if necessary, in order to impart resistance to nucleases and the like.
  • modifications include, for example, modification of sugar chain moieties such as 2'-fluoromation and 2'-O-methylation; modifications of base moieties; phosphorus such as amination, lower alkyl amination, acetylation, phosphorothioate and the like. Modification of the acid moiety and the like can be mentioned.
  • nucleic acid molecule may be one in which an artificial nucleic acid (bridged nucleic acid, peptide nucleic acid, locked nucleic acid, etc.) is introduced into a part of the RNA molecule and / or the DNA molecule.
  • an artificial nucleic acid bridged nucleic acid, peptide nucleic acid, locked nucleic acid, etc.
  • a preferred example of the bridged nucleic acid is a nucleotide having a structure represented by the following general formula (1).
  • Base is a base corresponding to the base sequence, and specifically, a purine-9-yl group or 2-oxo-1,2-dihydropyrimidine- which may be substituted with a substituent. Shows a 1-yl group.
  • the substituent include a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, a linear alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, and an amino group. Examples thereof include a group, a linear alkylamino group having 1 to 6 carbon atoms, and a halogen atom.
  • the base in the general formula (1), specifically, if the base is A (adenine), the 6-aminopurine-9-yl group may be substituted with a substituent; the base is G. In the case of (guanine), it may be substituted with a substituent 2-amino-6-hydroxypurine-9-yl group; if the base is C (cytosine), it is substituted with a substituent. May be 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group (eg, 4-amino-5-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group (5).
  • 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group eg, 4-amino-5-methyl-2-oxo-1,2-dihydropyrimidine-1-yl group (5).
  • R is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branched or ring, and the branched crotch is an alkenyl having 2 to 7 carbon atoms which may form a ring.
  • An aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may have a group or a substituent and may contain a heteroatom, or a carbon which may have a substituent and may contain a heteroatom.
  • substituents that can be contained in the aryl group or aralkyl group include a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and 1 carbon atom.
  • substituents that can be contained in the aryl group or aralkyl group include a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and 1 carbon atom.
  • substituent that can be contained in the aryl group or aralkyl group include a hydroxyl group, a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, and 1 carbon atom.
  • substituents that can be contained in the aryl group or aralkyl group include a hydroxyl group
  • R is preferably a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, a benzyl group for the crotch, more preferably a hydrogen atom or a methyl group, and particularly preferably a methyl group.
  • AmNA the 2', 4'-crosslinked nucleotide in which R in the general formula (1) is a methyl group
  • nucleotide having a structure represented by the following general formula (2) can be mentioned.
  • the nucleotide is a known 2', 4'-bridged nucleotide, which is also called a guanidine cross-linked nucleic acid (International Publication No. 2014/046212).
  • Base is the same as Base in the general formula (1).
  • R 1 , R 12 and R 13 represent alkyl groups having 1 to 7 carbon atoms which may form a hydrogen atom, a branch or a ring, which may be the same or different, and R 14 is , Indicates a hydrogen atom.
  • nucleotide having a structure represented by the following general formula (3) can be mentioned.
  • the nucleotide is a known 2', 4'-bridged nucleotide, also referred to as a spirocyclopropane-bridged nucleic acid (International Publication No. 2015/125783).
  • Base is the same as Base in the general formula (1).
  • R 21 and R 22 may be substituted with an aryl group having 3 to 12 carbon atoms, which may contain a hydrogen atom; a hetero atom, and may be branched. Alternatively, it is an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a ring; or an aralkyl group having an aryl moiety having 3 to 12 carbon atoms which may contain a heteroatom; or R 21 and R.
  • 22 is a group- (CH 2 ) n- [in the equation, n is an integer of 2-5].
  • nucleotide having a structure represented by the following general formula (4) or (4') can be mentioned.
  • the nucleotide is a known 2', 4'-bridged nucleotide, also referred to as an ethyleneoxy-bridged nucleic acid (International Publication No. 2016/017422).
  • Base is the same as Base in the general formula (1).
  • X 3 indicates an oxygen atom or a sulfur atom.
  • R 31 and R 32 are the same or different, hydrogen atom; hydroxyl group; alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring; branched or It indicates an alkoxy group having 1 to 7 carbon atoms which may form a ring; or an amino group.
  • the number 1 to 6 indicates a linear or branched alkylamino group
  • R 33 has a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, and a carbon number which may form a branch or a ring. It represents an alkoxy group of 1 to 7 or a linear or branched alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 34 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring, and an alkoxy having 1 to 7 carbon atoms which may form a branch or a ring.
  • a group or a linear or branched alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms is shown.
  • crosslinked nucleotides include, for example, the structures shown below.
  • Base and R in the following structural formula are the same as Base and R in the general formula (1).
  • nucleic acid molecules used in the present invention chemical modifications may be applied to the binding moiety between some nucleotides and / or nucleosides, and to the binding moiety between all creatides and / or nucleosides. You may.
  • the nucleic acid molecule used in the present invention is an antisense nucleic acid
  • at least 1, preferably 1 to 10, more preferably 2 to 8, and even more preferably 2 to 6 are used.
  • the 1st to 3rd nucleotides from the 5'terminal side and the 2nd and 3rd nucleotides from the 3'terminal side are 2', 4'-crosslinked type. It may be a nucleotide (preferably AmNA).
  • At least one of the binding portions between nucleosides is a phosphorothioate bond.
  • a phosphorothioate bond is contained, preferably 50% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 100%, per 100% of the total number of binding portions between nucleosides.
  • the binding moiety between all nucleosides is a phosphorothioate bond.
  • the nucleic acid molecule used in the present invention is an siRNA against human GREB1
  • a specific example thereof is a siRNA containing an antisense strand consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 and an antisense strand consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • positions 1 to 19 are RNA strands, and positions 20 and 21 are overhangs (deoxythymidine).
  • nucleic acid molecule used in the present invention is an antisense nucleic acid (antisense DNA, ASO) against human GREB1
  • specific examples thereof include chemically modified ASO consisting of the following sequences A to D. 5 (Y) ⁇ G (Y) ⁇ A (Y) ⁇ a ⁇ t ⁇ g ⁇ g ⁇ c ⁇ a ⁇ g ⁇ g ⁇ a ⁇ 5 (Y) ⁇ A (Y) ⁇ g (Array A: Example Used as ASO-6434 in) G (Y) ⁇ T (Y) ⁇ 5 (Y) ⁇ t ⁇ g ⁇ t ⁇ t ⁇ t ⁇ c ⁇ a ⁇ ⁇ ⁇ g ⁇ T (Y) ⁇ A (Y) ⁇ a (Sequence B: Example Used as ASO-6921 in) T (Y) ⁇ 5 (Y) ⁇ T (Y) ⁇ a ⁇ g t ⁇
  • G (Y) is a guanine having a structure of AmNA (2', 4'-crosslinked nucleotide in which R is a methyl group in the general formula (1)), "A (Y)”.
  • T (Y) is thymine with AmNA structure
  • 5 (Y) is 5-methylcytosine with AmNA structure
  • lowercase letters "a, t, c, g” are not.
  • Modified DNA, and " ⁇ " indicate phosphorothioate binding.
  • the nucleic acid molecule used in the present invention is an shRNA for mouse Greb1
  • a specific example of the DNA encoding the shRNA is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the nucleic acid molecule used in the present invention is an RNA molecule
  • it may be designed so that it can be produced in vivo.
  • the DNA encoding the RNA molecule may be inserted into an expression vector for mammalian cells.
  • an expression vector include viral vectors such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpesvirus, and Sendaivirus, animal cell expression plasmids, and the like.
  • GREB1 is specifically expressed in sex hormone-insensitive GREB1-positive tumor cells and promotes the growth of the tumor cells. Therefore, the therapeutic agent of the present invention suppresses the expression of GREB1 in the tumor cells. Growth suppression is possible. Therefore, the therapeutic agents of the present invention are used in the treatment of hormone-insensitive GREB1-positive tumors.
  • the GREB1-positive tumor refers to a tumor formed by tumor cells in which GREB1 expression is observed. Whether or not it is a GREB1-positive tumor can be confirmed by tissue immunization against the collected tumor lesion tissue. Specifically, the collected tumor lesion tissue is immunostained with an anti-GREB1 antibody, and if 5% or more of the tumor lesion site has GREB1 expression, it is judged to be GREB1 positive.
  • Whether or not the tumor is GREB1-positive can also be measured by collecting RNA from the collected tumor tissue and performing quantitative PCR.
  • the presence or absence of GREB1 expression may be determined using the tumor of the same case and the non-tumor site of the same tissue as an index. Specifically, if the amount of GREB1 in the cell lysate of the tumor tissue is larger than the amount of GREB1 in the cell lysate of the tumor in the same case and the non-tumor site of the same tissue, it is judged that the tumor is GREB1 positive. Will be done.
  • a sex hormone-insensitive GREB1-positive tumor (GREB1-positive tumor that does not show hormone sensitivity) is defined as "GREB1 expression is enhanced via hormone receptors by stimulation of sex hormones such as estrogen and androgen.
  • sex hormones such as estrogen and androgen.
  • sex hormone-sensitive GREB1-positive tumors include breast cancer and ovarian cancer as tumors whose growth is promoted by estrogen, and prostate cancer as tumors whose growth is promoted by androgen. These tumors are described in the present invention. Excluded from treatment.
  • sex hormone-insensitive GREB1-positive tumor to be treated in the present invention include hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, neuroblastoma, small cell lung cancer and the like. ..
  • the therapeutic agent of the present invention can be used not only for humans but also for mammals such as cows, pigs, dogs, cats, goats, rats, mice and rabbits, but is preferably used as a pharmaceutical product for humans. ..
  • the administration form of the therapeutic agent of the present invention may be either oral administration or parenteral administration as long as an antitumor effect can be obtained, and may be appropriately set according to the type of active ingredient used. ..
  • the administration form of the therapeutic agent of the present invention includes parenteral administration such as injection administration (intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, peritoneal injection, local injection into the affected area, etc.) and suppository administration.
  • the therapeutically effective amount may be appropriately set according to the type of active ingredient used, the administration form, the degree of progression of the sex hormone-insensitive GREB1-positive tumor to be applied, and the like.
  • a nucleic acid molecule when used as an active ingredient, usually 0.1 mg / kg body weight to 100 mg / kg body weight may be administered once every 3 to 7 days as a single dose of the nucleic acid molecule. Good.
  • the therapeutic agent of the present invention may be used alone, or may be used in combination with one or more other agents having antitumor activity and / or radiotherapy.
  • the therapeutic agent of the present invention is prepared in a formulation form according to the type of active ingredient and the administration form.
  • Examples of the formulation form of the antitumor agent of the present invention include liquid preparations such as liquid preparations, suspension preparations, emulsions, and injections.
  • the therapeutic agent of the present invention is formulated by adding a pharmaceutically acceptable carrier or additive according to the formulation form thereof.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or additive for example, in the case of a liquid preparation, it can be formulated using physiological saline, a buffer solution, or the like.
  • nucleic acid molecule when used as an active ingredient in the therapeutic agent of the present invention, it is desirable that the nucleic acid molecule is formulated together with a nucleic acid introduction aid so that the nucleic acid molecule can be easily transferred into tumor cells.
  • a nucleic acid introduction aid include lipofectamine, oligofectamine, RNAifect, liposome, polyamine, DEAE dextran, calcium phosphate, dendrimer and the like.
  • test method for hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, or neuroblastoma The test method of the present invention predicts the presence or absence of hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, or neuroblastoma. It is a test method for measuring the expression level of GREB1 in liver tissue, skin tissue, or nerve tissue collected from a subject. According to the present invention, by using the expression level of GREB1 in liver tissue, skin tissue, or nerve tissue collected from a subject as an index, the subject can have hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, malignant melanoma, or nerve. It becomes possible to diagnose whether or not the patient has blastoma.
  • hepatoblastoma or hepatocellular carcinoma When hepatoblastoma or hepatocellular carcinoma is to be tested, the expression level of GREB1 in liver tissue collected from a subject suspected of having neoplastic liver disease may be measured. Since hepatoblastoma is a malignant tumor that develops in the liver of a child, a subject to be tested for hepatoblastoma preferably includes a child suspected of having neoplastic liver disease.
  • the expression level of GREB1 in the skin tissue collected from a subject suspected of having a neoplastic skin disease may be measured.
  • the expression level of GREB1 in nerve tissue collected from a subject suspected of having a neoplastic neurological disease may be measured. Since neuroblastoma is a malignant tumor that easily develops in children, the subject to be tested for neuroblastoma in the test method of the present invention preferably includes children suspected of having neoplastic neurological disease.
  • the expression level of GREB1 in each tumor tissue collected from a subject it can be confirmed by tissue immunizing the collected tissue piece (lesion tissue piece). Specifically, the collected tumor tissue piece is immunostained with an anti-GREB1 antibody, and GREB1 is expressed when 5% or more of the region where GREB1 is suspected is present. Judged to be weighing. In addition, when 20% or more of the region where the expression of GREB1 is observed exists in the region where the tumor is suspected, it is judged that the expression level of GREB1 is high, and the region where the expression of GREB1 is observed is 50 in the region where the tumor is suspected. When it is present in% or more, it is judged that the expression level of GREB1 is particularly high.
  • the expression level of GREB1 in each tumor tissue collected from the subject can also be measured by quantitative PCR after collecting RNA from the tissue piece (lesion tissue piece).
  • the expression level of GREB1 may be determined using the tumor of the same case and the non-tumor site of the same tissue as an index. Specifically, when the amount of GREB1 in the cell lysate of the suspected tumor site is larger than the amount of GREB1 in the cell lysate of the non-tumor site of the same case, it is judged that GREB1 is expressed.
  • the present invention provides a reagent for detecting GREB1 as a test reagent for performing the above-mentioned test method.
  • Examples of the reagent for detecting GREB1 include an anti-GREB1 antibody and a fragment thereof.
  • the anti-GREB1 antibody may be labeled with biotin, a fluorescent label, magnetic beads or the like, if necessary.
  • the reagent for detecting GREB1 for example, a primer capable of hybridizing with GREB1 cDNA or GREB1 mRNA can be mentioned.
  • the test reagent of the present invention may contain a reagent necessary for performing PCR in addition to the primer.
  • cells used in the test may be described in the form of "cells expressing X” or the like, but “cells expressing X” are those in which protein X is transfected and artificially protein X is used.
  • X293T cells expressing GFP-GREB1 means X293T cells that have been transfected with the protein GFP-GREB1 and transformed to overexpress GFP-GREB1.
  • a protein may be described in the form of "A-B” (for example, GFP-GREB1 etc.), but the protein means a protein in which peptide B is fused to peptide A.
  • the cells transfected with various proteins used in the following tests were prepared according to a known genetic engineering method.
  • Test materials and methods 1-1 Cells and antibodies HepG2 cells, CHP212 cells, and SKNDZ cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MCF7 cells, HLE cells, Huh7 cells, HLF cells, NBTU110 cells, SKMEL28 cells, Mewo cells, G361 cells, and COLO679 cells were purchased from the Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB, Osaka, Japan). Lenti-X TM 293T (X293T) cells were purchased from Takara Bio Inc. (Japan). Huh6 cells used were those provided by Dr. H. Okuyama (Osaka University, Japan). As SNU387 cells, SNU449 cells, BMEL cells, and HepG2 cells, those provided by Dr. T. Kodama (Osaka University, Japan) were used.
  • HepG2 cells were grown in Eagle's minimum essential medium (EMEM) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), non-essential amino acids and glutamax.
  • HLE cells, Huh6 cells, X293T cells, Huh7 cells, SNU387 cells, SNU449 cells, and HLF cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% FBS.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • MCF7 cells were grown in DMEM containing 10% FBS, non-essential amino acids and 1 mM sodium pyruvate.
  • BMEL cells were grown in DMEM / F12 medium containing 10% FBS, 2.5 mM L-glutamine, 0.5 mM soudium pyruvate, 50 ng / ml EGF, 30 ng / ml IGF-II, and 10 ⁇ g / ml insulin.
  • SKMEL28 cells, Mewo cells, and G361 cells were grown on EMEM containing 10% FBS and non-essential amino acids.
  • CHP212 cells and SKNDZ cells were grown in DMEM containing 10% FBS and non-essential amino acids.
  • OLO679 cells were grown in RPMI 1640 (RPMI) containing 10% FBS and 2 mM L-glutamine.
  • Anti-GREB1 antibody (mouse monoclonal), anti-phosphorylated histone H3 (ser10) antibody, and anti-acetyl histone H4 antibody were purchased from Merck Millipore (Billerica, MA, USA).
  • Anti-HSP90 antibody, anti-Cyclin A antibody, anti-Cyclin B antibody, anti-Smad2 / 3 antibody (mouse monoclonal), anti- ⁇ -catenin antibody, and anti-clathrin antibody were purchased from BD Biosciences (San Jose, CA, USA).
  • the anti-GREB1 antibody (rabbit polyclonal), anti-Smad4 antibody, anti-p300 antibody, and anti-GFP compound (mouse monoclonal) were purchased from Santa Cruz Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA).
  • Anti-Smad 2/3 antibody (rabbit monoclonal), anti-phosphorylated SMAD2 (Ser465 / 467) / SMAD3 (Ser423 / 425) antibody, anti-cleaved caspase3 antibody, anti-PARP1 antibody, anti-Hystone H3 antibody, anti-YAP1 antibody (rabbit monoclonal), Anti-Ki67 antibody (rabbit monoclonal), anti-c-Myc antibody (rabbit monoclonal), anti-Smad2 / 3 (for rabbit monoclonal western brotting), anti-Axin2 antibody, and anti-MITF antibody (for western bloating) are Cell Signaling Technology.
  • Anti- ⁇ -tubulin antibody, anti- ⁇ -actin antibody, anti-phosphorylated ⁇ -catenin (pTyr654) antibody, and anti-MITF antibody were purchased from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany).
  • the anti-GFP antibody (rabbit polyclonal) was purchased from Life Technologies / Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA).
  • the anti-Smad 2/3 antibody (rabbit monoclonal) was purchased from Abcam (Cambridge, UK).
  • Anti-FLAG antibody and anti-GAPDH antibody were purchased from WAKO (Tokyo, Japan).
  • the anti-mouse DLK1 antibody (rabbit monoclonal) was purchased from R & D Systems (Minneapolis, MN, USA).
  • RNA Sequence Analysis A library of HepG2 cells transfected with control siRNA or ⁇ -catenin siRNA was prepared using the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep kit (Illumina, San Diego, CA). Sequence analysis was performed on the Illumina HiSeq 2500 platform in 75-base single-end mode. The base call was made using CASAVA 1.8.2 software (Illumina). Bowtie2 ver. 2.2.3 and SAMtools ver. 0.1.19 were combined, and TopHat v2.0.13 was used to map to the human reference genome sequence (hg19) and perform sequencing. Using Cuffnorm version 2.2.1, we calculated the number of fragments per kilobase of exons (FPKMs) to which one million fragments were mapped.
  • FPKMs kilobase of exons
  • HCC Hepatocellular carcinoma
  • the resected specimen was visually observed, the localized site and size of the tumor were measured, the specimen was fixed with 10% by volume formalin, a paraffin-embedded block was prepared, and histological analysis was performed.
  • the specimens used in the test were sectioned to a thickness of 4 ⁇ m, stained with hematoxylin, eosin (H & E), immunoperoxidase, immunoalkaline phosphatase, etc., and subjected to each analysis.
  • ⁇ N90 ⁇ -catenin is a ⁇ -catenin mutant in which the amino acids at positions 1 to 90 of human ⁇ -catenin are deleted
  • YAPS127A is a YAP mutant in which serine at position 127 of YAP is replaced with alanine.
  • Xenograft Liver Tumor Formation Assay by In vivo ASO Treatment HepG2 cell pellet (1 ⁇ 10 7 cells) was suspended in 100 ⁇ l high concentration Matrigel (Corning) and 8 weeks old male BALB / cAJcl-nu / nu mice. (Nude mice; CLEA Japan) was directly injected into the liver under anesthesia and transplanted.
  • ASO 50 ⁇ g / body; about 2.5 mg / kg
  • Mice were euthanized 27 days after transplantation, tumors were recovered and subjected to histological analysis.
  • RNAiMAX Life Technologies / Thermo Fisher Scientific
  • mouse anti-GREB1 antibody (1: 100), mouse anti- ⁇ -catenin antibody (1: 100) or rabbit anti-YAP1 antibody (1: 100) was added to the tissue specimen and incubated at 4 ° C. for 16 hours, and then Horseradish peroxidase (HRP) -labeled goat anti-mouse IgG or goat anti-rabbit IgG was incubated for 1 hour.
  • HRP Horseradish peroxidase
  • DAB Diaminobenzidine
  • tissue sections were counterstained with 0.1% (w / v) hematoxylin.
  • the ⁇ -catenin, GREB1, and YAP stained areas were classified in 3 stages ( ⁇ 5%, 5-30%, and 30-95%) and stained areas for tumor lesion areas (positive staining). ), But 5% or more of the tumors were judged to be positive.
  • Immobilized and permeabilized cells were incubated with the primary antibody overnight at room temperature for 3 hours or 4 ° C. and further incubated with the secondary antibody according to the manufacturer's protocol (Molecular Probes, Carlsbad, CA) to prepare samples. Sample analysis was performed by observing with an LSM880 laser confocal microscope (Carl-Zeiss, Jena, Germany).
  • Cell Proliferation Assay Cells were seeded on a plate at 1.0 ⁇ 10 4 cells / mL and replaced with medium containing 10% serum 12 hours later. The cells were cultured for up to 10 days while counting the number of cells every 48 hours. Cell counts were performed using Cyquant NF assays (Life Technologies / Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's recommended protocol.
  • X293T cells (60 mm diameter dish) transfected with HA-FLAG-GREB1, GFP-GREB1 mutant, GFP-Smad2 mutant, HA-Smad3, GFP-Smad3, GFP-Smad4, or GFP-Smad7 are lysed buffer. It was dissolved in 400 ⁇ l and the state of the complex of GREB1, Smad3, Smad4, and Smad7 was examined. The obtained lysate was immunoprecipitated with an anti-GFP antibody, and the immunoprecipitate was probed with a predetermined antibody.
  • amino acid sequences constituting the fusion protein used in this test are as follows: the amino acid sequence of the HA part is SEQ ID NO: 85; the amino acid sequence of the FLAG part is SEQ ID NO: 86; the amino acid sequence of the GFP part is the sequence. No. 87; GREB1 variant (mouse GREB1 ⁇ 310-319 ( ⁇ NLS)) is a GREB1 variant in which positions 310-319 of mouse GREB1 are deleted, and the amino acid sequence of that portion is SEQ ID NO: 88; GREB1 variant (No.
  • mouse GREB1 1-666 (N)) is a GREB1 variant consisting of the amino acid sequence at positions 1-666 of mouse GREB1, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 89; GREB1 variant (mouse GREB1 667-1333 (I)). Is a GREB1 variant consisting of the amino acid sequence at position 667-1333 of mouse GREB1, the amino acid sequence of which is SEQ ID NO: 90; GREB1 variant (mouse GREB1 1334-1954 (C)) is at position 1334-1954 of mouse GREB1.
  • the amino acid sequence is a GREB1 variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 91; the GREB1 variant (mouse GREB1 ⁇ 667-1333 ( ⁇ M)) is a GREB1 variant lacking the 667-1333 position of mouse GREB1.
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 92; the amino acid sequence of the human Smad2 part is SEQ ID NO: 93; the human Smad2 variant (human Smad2 1-265 (N)) is Smad2 consisting of the amino acid sequence of position 1-265 of human Smad2.
  • human Smad2 variant (human Smad2 266-467 (C)) is a Smad2 variant consisting of the amino acid sequence at positions 266-467 of human Smad2, and its amino acid sequence.
  • the amino acid sequence of the human Smad3 part is SEQ ID NO: 96; the amino acid sequence of the human Smad4 part is SEQ ID NO: 97; and the amino acid sequence of the human Smad7 part is SEQ ID NO: 98.
  • each fusion protein was linked by combining the amino acid sequences.
  • GST pull-down assay To analyze the binding of recombinant Smad2 / MH1 or recombinant Smad2 / MH2 to GREB1, 20 ⁇ g of glutathione bound to glutathione-Sepharose beads with whole cell lysate of HepG2 cells or Huh6 cells expressing GFP-GREB1. -Incubated with S-transferase (GST), GST-Smad2 / MH1, or GST-Smad2 / MH2 for 1 hour.
  • GST-transferase GST-Smad2 / MH1
  • GST-Smad2 / MH2 GST-Smad2 / MH2 for 1 hour.
  • Precipitate beads 3 times in cell lysis buffer (10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 140 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, 25 mM NaF, 20 mg / ml leupeptin, 20 mg / ml aprotinin, and 10 mM PMSF)
  • the sediment was washed and probed with anti-GREB1 antibody or anti-GFP antibody.
  • amino acid sequences constituting the fusion protein used in this test are as follows: the amino acid sequence of the GST portion is SEQ ID NO: 99; the amino acid sequence of Smad2 / MH1 is SEQ ID NO: 100; the amino acid sequence of Smad2 / MH2. Is SEQ ID NO: 101.
  • Xenograft Subcutaneous Tumor Formation Analysis A combination of medetomidine (0.3? Mg / kg) and midazolam (4? Mg / kg) was administered to 5-week-old BALB / cAJcl-nu / nu mice (nude mice; CLEA Japan). And anesthetized. Hep3B cells or JHH7 cells (1 ⁇ 10 7 cells) were then suspended in 150 ⁇ l of high-concentration Corning and transplanted subcutaneously into mice. From the 3rd day after transplantation, ASO (50 ⁇ g / body; about 2.5 mg / kg) was subcutaneously administered twice a week. Mice transplanted with Hep3B cells were euthanized 6.5 weeks after transplantation.
  • mice transplanted with JHH7 cells were euthanized 2 weeks after transplantation. Tumors were harvested from euthanized mice and subjected to histological analysis. All protocols for all animal experiments in this study were conducted under the approval of the Animal Care and Use Committee of Osaka University (No. 26-032-048).
  • sgRNA sequence targeting GREB1 or MITF and plasmid pX330 with blastsidine resistance HepG2 cells, Hep3B cells, JHH7 cells
  • GREB1 knockout cells or MITF knockout cells were selected by introducing into COLO679 cells and culturing in a medium containing 5 ⁇ g / mL of Blastsaidin S for 2 days. Single colonies were then harvested, mechanically dissociated and reseeded into individual wells of a 24-well plate.
  • a plasmid pRP [CRISPR] with dual-guided RNAs sequences targeting Smad2 / 3 was introduced into HepG2 cells, then a single colony was harvested, mechanically dissociated, and re-individually well on a 24-well plate. Sown.
  • Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay Confluent HepG2 cells in a 10 cm dish were stimulated in the presence or absence of 5 ng / ml TGF ⁇ 1 for 3 hours. The cells were then cross-linked with 1% formaldehyde at room temperature for 10 minutes and the cross-linking reaction was stopped with 0.125 M glycine. After washing the cells with cold PBS three times, the cells were peeled off and collected. In addition, cells were centrifuged and lysed in sodium dodecyl sulfate (SDS) lysis buffer (50 mM Tris / HCl [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 0.5% SDS).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the DNA was sheared by sonicating the cell lysate to a size of 200-1000 bp.
  • the sheared chromatin supernatant was diluted with ChIPdilution buffer (16.7 mM Tris / HCl [pH 8.0], 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, and 1.1% Triton X-100) containing a protease inhibitor and a phosphatase inhibitor.
  • Salmon sperm DNA / protein A-agarose beads (Millipore, Billerica, MA, USA) were added and pre-cleared.
  • anti-Tcf-4 antibody, anti- ⁇ -catenin antibody, anti-acetylated histone H4 antibody or negative control IgG (Diagenode, vide, Belgium) was added, and the mixture was incubated at 4 ° C. for 12 hours.
  • High-salt buffer (20 mM Tris / HCl [pH 8.0], 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% TritonX-100, and 2 mM) for the immune complex adsorbed on salmon sperm DNA / protein A-agarose beads.
  • a wrench viral vector was constructed by subcloning GFP and pEGFPC1-GREB1 into CSII-CMV-MCS-IRES2-Bsd provided by Dr. H. Miyoshi (RIKEN BioResource Center, Ibaraki, Japan).
  • the lentiviral vector was then transfected into X293T cells with the packaging vectors pCAG-HIV-gp and pCMV-VSV-G-RSV-Rev using the FuGENE HD transfection reagent (Roche Applied Science, Basel, Switzerland). , Wrench virus was made.
  • GFP was placed in each well of a 12-well plate by placing 5 ⁇ 10 4 cells HepG2 cells, treating with lentivirus and polybrene at 10 ⁇ g / ml, centrifuging at 1200 ⁇ g for 30 minutes, and then incubating for 24 hours.
  • HepG2 cells that stably express GFP-GREB1 (GREB1 to which GFP is linked) were prepared.
  • PT3-EF1a-cMET was purchased from Addgene (Cambridge, MA, USA).
  • the pLIVE-SB13 vector was donated by r. Toru Okamoto (Osaka University).
  • pT2BH- ⁇ N90 ⁇ -catenin-Luc was prepared by in-fusion cloning of the CAG promoter, human CTNNB1 sequence lacking amino acids 1-90, and luciferase into the pT2BH vector (Addgene).
  • pT2BH-YAPS127A was constructed by inserting a FLAG-tagged human YAPS127A fragment between the EcoRI and NotI sites of the pT2BH vector.
  • the pT2BH-GFP2ALuc mouse Greb1 shRNA was constructed by inserting the U6 promoter and the mGreb1 shRNA fragment amplified from Mission shRNA (TRCN0000216019) (Sigma-Aldrich) between the PstI site and the HindIII site of pT2BH-GFP2ALuc.
  • GREB1 is a downstream target gene for Wnt / ⁇ -catenin signaling.
  • ⁇ -catenin genes are truncated mutations in exons 3 and 4.
  • HepG2 hepatoblastoma cells with Wnt / ⁇ -catenin signaling were screened for new downstream target genes. RNA sequence analysis was performed on HepG2 cells transfected with control siRNA or siRNA ( ⁇ -catenin siRNA) against ⁇ -catenin.
  • the expression level was high (FPKM ⁇ 3), and among the cells transfected with ⁇ -catenin siRNA ( ⁇ -catenin knockdown cells), the cells transfected with control siRNA (control cells).
  • 76 genes were selected as candidate genes based on the fact that the expression level was 3 times or more lower than that (see a in Fig. 1).
  • candidate genes were selected based on the presence of the DNA binding site of TCF7L2 (TCF4) found by ChIP sequence analysis in HepG2. After narrowing down, 11 genes were selected (see a in FIG.
  • the lower figure of a in FIG. 1 shows a heat map of candidate genes whose expression levels are changed in control cells and ⁇ -catenin knockdown cells. Each gene shown on the left of the lower figure of a in FIG. 1 randomly shows 11 genes out of 76 fluctuated candidate genes.
  • GREB1 one of the candidate genes, is an estrogen-responsive gene in the estrogen receptor regulatory pathway and is known to be involved in hormone-dependent cancer cell proliferation in breast cancer and prostate cancer. Wnt / ⁇ - It has not been clarified in the past whether or not it is a downstream target gene of a catenin signal and is involved in tumorigenesis of cancer in which an estrogen receptor is not expressed. Therefore, we focused on GREB1 and conducted further analysis.
  • BMEL mouse fetal hepatocytes
  • CHIR99021 which has the effect of activating ⁇ -catenin signals
  • Huh6 cells a hepatoblastoma cell line with a G34V somatic mutation in the CTNNB1 ( ⁇ -catenin) gene, ⁇ -catenin knockdown reduced GREB1 expression (see c in Figure 2).
  • Huh6 had a lower expression level of GREB1 mRNA than HepG2 (see d in Fig. 2).
  • the region-specific expression pattern of GREB1 in hepatoblastoma tissue tended to show a positive correlation with ⁇ -catenin accumulation in serial sections (see e in FIG. 1).
  • 11 cases of hepatoblastoma tissue were stained with anti- ⁇ -catenin antibody and hematogillin.
  • GREB1 expression is involved in hepatoblastoma cell proliferation As previously reported, ⁇ -catenin knockdown reduced HepG2 cell proliferation (see a in Figure 3). In addition, exogenous GREB1 expression partially restored the ⁇ -catenin knockdown phenotype (see a in Figure 3). Therefore, GREB1 was knocked down using two different siRNAs to elucidate the role of GREB1 in HepG2 cells.
  • siRNA As a result of probing the lysate of cells in which GREB1 was knocked down with anti-GREB1 antibody, anti-Axin2 antibody, anti- ⁇ -catenin antibody, and anti-HSP90 antibody, siRNA (GREB1 # 1 siRNA and GREB1 # 2 siRNA) was found to be GREB1. (See b in Figure 3), but knockdown of GREB1 does not affect the expression of PRLR or XBP1 target genes for ER signals (see c in Figure 3), but ⁇ -catenin and Axin2. It was confirmed that it did not affect the expression (see b in Fig. 3). That is, these results suggest that GREB1 is not a gene that functions upstream of ER and Wnt / ⁇ -catenin signaling.
  • Control siRNA or two different siRNAs are transfected into Mock (only vector containing GREB1) or GREB1-introduced HepG2 cells and two-dimensional culture (in a plastic dish). Culture) was performed, and the relative cell number was determined over time by the Cyquant assay.
  • GREB1 knockdown reduced the proliferative capacity of HepG2 cells in two-dimensional culture, but when GREB1-introduced HepG2 cells were transfected with siRNA against GREB1 (GREB1 # 1 siRNA / GREB1 and GREB1 # 2 siRNA).
  • / GREB1 did not affect the proliferative capacity of HepG2 cells (see a in Figure 4).
  • the GREB1 knockdown reduced the sphere area by half (b in Figure 4).
  • knockdown of GREB1 was found to increase the proportion of spheres with polarized lumens (Fig. 4b).
  • the ratio of spheres having a polarized lumen was calculated as the ratio of spheres having F-actin-positive central microlumen to all spheres.
  • HepG2 cells transfected with control siRNA or GREB1 siRNA are cultured in a medium containing 1% FBS for 1 day, and the cell lysate is subjected to anti-cyclin A antibody, anti-cyclin B antibody, and anti-cyclin A antibody. It was probed with phosphorylated histone H3 antibody, anti-histone H3 antibody, anti-GREB1 antibody, and anti-HSP90 antibody. As a result, it was confirmed that knockdown of GREB1 reduced the expression of cell cycle regulators including cyclinA, cyclinB, and phosphorylated histone H3 (see d in FIG. 4).
  • HepG2 cells are transfected with control siRNA or siRNA (GREB1 # 1 siRNA and GREB1 # 2 siRNA) and cultured for 2 days in a medium containing 0.1% FBS (with or without the caspase inhibitor Z-VAD).
  • the cells were stained with propidium iodide (PI, live cells) and Hoechst33342 (nucleus), and the viability of the cells was evaluated.
  • PI propidium iodide
  • Hoechst33342 nucleus
  • control siRNA or siRNA (GREB1 # 1 siRNA and GREB1 # 2 siRNA) is transfected into HepG2 cells, cultured in a medium containing 0.1% FBS for 2 days, and the cell lysate is subjected to anti-cleaved caspase 3 antibody and anti-cleaved caspase 3 antibody. It was probed with PARP1 antibody and anti-HSP90 antibody. As a result, it was confirmed that the intracellular amounts of anti-cleaved caspase 3 and PARP1 which are markers of apoptotic cells were increased in HepG2 cells in which GREB1 was knocked out (see g in FIG. 4).
  • GREB1 is indispensable not only for cell proliferation through cell cycle control but also for cell survival in hepatoblastoma cells.
  • GREB1 is consistent with previous reports in breast cancer cells complexing with Smad2 / 3, and HA-FLAG-GREB1 was predominantly localized in the nucleus in X293T cells (see a in Figure 5).
  • the mutant GREB1 (HA-FLAG- ⁇ NLS-GREB1) lacking the amino acids at positions 310 to 319, which is the nuclear localization sequence (NLS) of GREB1, was localized in the cytoplasm (see a in FIG. 5).
  • Smad4 the central mediator of TGF ⁇ signaling.
  • Smad3 Co-mediator Smad, Co-Smad
  • Smad4 receptor-regulated Smad, R-Smad
  • Smad7 inhibitory Smad, I-Smad
  • GFP-Smad3 and GFP-Smad7 were mainly localized in the nucleus, and GFP-Smad4 was localized in the cytoplasm (see a in FIG. 6). Therefore, the ability of Smad3, Smad4, and Smad7 to form a complex with GREB1 was evaluated.
  • a cell lysate of HA-FLAG-GREB1 and X293T expressing GFP, GFP-Smad3, GFP-Smad4, or GFP-Smad7 was immunoprecipitated with an anti-GFP antibody.
  • the cell lysate (Input) and immunoprecipitate (IP) were then reacted with an anti-HA antibody or anti-GFP antibody.
  • IP immunoprecipitate
  • HA-FLAG-GREB1 forms a complex with Smad3 (Co-Smad) and Smad7 (I-Smad), but does not form a complex with Smad4 (R-Smad) ( See b in Figure 5).
  • Smad2 is known to have two functional areas, the MH1 domain and the MH2 domain (see d in Figure 5). Therefore, regarding Smad2, the full length Smad2 (Full), the C-terminal side (amino acids at positions 266 to 467) are deleted, and the Smad2 mutant (N) consisting only of the C-terminal side region containing the MH1 domain, and the N-terminal side ( The binding property to GREB1 was evaluated using the Smad2 mutant (C), which lacks amino acids at positions 1 to 265 and consists only of the C-terminal region containing the MH2 domain (see d in FIG. 5).
  • a lysate of X293T cells expressing HA-FLAG-mGREB1 and GFP or GFP-Smad2 was immunoprecipitated with an anti-GFP antibody.
  • the cell lysate (Input) and immunoprecipitate (IP) were then reacted with an anti-HA antibody or anti-GFP antibody.
  • GFP-Smad2 (mutant C) formed a complex with GREB1
  • GFP-Smad2 (mutant N) did not form a complex with GREB1 (see d in FIG. 5).
  • the recombinant GST-Smad2 / MH2 domain bound to endogenous GREB1 and GFP-GREB1 expressed in Huh6 cells by pull-down assay in the context of binding of endogenous Smad4 in HepG2 cells (e in FIG. 5). reference).
  • the recombinant GST-Smad2 / MH1 domain did not bind under the same conditions (see e in Figure 5).
  • the same tendency was observed in the case of Huh6 cells expressing GFP-GREB1 (see d in FIG. 6).
  • mutant N in which the amino acid at positions 667 to 1954 of GREB1 was deleted, and positions 1 to 666 of GREB1.
  • mutant M (667-1333) in which the amino acid at positions 1334-1954 was deleted, and mutant C (1334-1954) in which the amino acid at positions 1 to 1333 of GREB1 was deleted were prepared, and further, NLS NLS-GREB1 mutants (NLS / 667-1333 and NLS / 1334) in which 3 copies (SEQ ID NO: 109) of the NLS sequence derived from the SV40T antigen are bound to the N-terminal of mutants M and C that do not have -1954) was prepared (see f in Fig.
  • a variant in which the amino acids at positions 1 to 666 of GREB1 are deleted and three copies of the NLS sequence (SEQ ID NO: 109) derived from the SV40T antigen are bound to the N-terminal.
  • a variant ⁇ 667-1333 / ⁇ M in which the amino acid at positions 667 to 1333 of GREB1 was deleted, and a 3-copy NLS sequence in which the amino acid at positions 667 to 1333 of GREB1 was deleted and derived from the SV40T antigen at the N-terminal.
  • Variants (NLS / 1-1333 ( ⁇ C)) to which (SEQ ID NO: 109) was bound were prepared.
  • a lysate of X293T cells expressing these variants was immunoprecipitated with an anti-GFP antibody, and then further obtained.
  • the anti-FLAG antibody or anti-GFP antibody was reacted with the lysate (Input) and immunoprecipitate (IP) of the obtained cells (see e in FIG. 6).
  • IP immunoprecipitate
  • wild-type GREB1 bound to Smad3.
  • no binding to Smad3 was observed in the mutant lacking the amino acid at positions 667 to 1333 of GREB1 (see e in Fig. 6).
  • 667 of GREB1 It was revealed that the amino acid region at position ⁇ 1333 plays an important role in binding to Smad3.
  • these results include positions 666-1333 of GREB1 in the nucleus of hepatoblastoma cells. It was suggested that the amino acid region interacts with the NH2 domain of Smad2 / 3 to form a complex.
  • GREB1 acts as a negative regulator of TGF ⁇ signaling
  • the expression levels of ⁇ -catenin signal target genes Axin2 and DKK1 were significantly increased in the tumor lesions as compared with the non-tumor region (Fig.). See a in 8).
  • the expression level of the target gene PAI-1 or GADD45B of the TGF ⁇ signal was significantly reduced in the tumor lesion as compared with the non-tumor region (see a in FIG. 7).
  • a significant inverse correlation was observed between the expression level of GREB1 and the expression level of target genes for TGF ⁇ signaling (PAI-1, p21 / CDKN1A, TSP-1, and CTGF) (b in FIG. 7). reference).
  • HepG2 cells expressing GFP HepG2 / GFP
  • HepG2 cells expressing GFP-GREB1 HepG2 / GFP-GREB1
  • HepG2 cells are transfected with control siRNA or GREB1 # 2 siRNA, cultured in the presence or absence of a TGF ⁇ receptor inhibitor (ALK5 inhibitor), and the intracellular PAI-1 and SNAIL2 mRNA levels are measured. did. As a result, it was found that the increase in the amount of PAI-1 and SNAIL2 mRNA by knockdown of GREB1 was TGF ⁇ receptor signal-dependent (see d in FIG. 7).
  • ALK5 inhibitor TGF ⁇ receptor inhibitor
  • HepG2 cells transfected with control siRNA or GREB1 # 2 siRNA were cultured for 30 minutes in the presence or absence of 10 ng / mL TGF ⁇ .
  • the cultured cells were immobilized and immunostained with an anti-Smad2 / 3 antibody (see c in FIG. 8).
  • the lysate of the cultured cells was immunoprecipitated with an anti-Smad2 / 3 antibody.
  • the resulting cell lysate (Input) and immunoprecipitate (IP) were then reacted with an anti-Smad4 antibody or an anti-Smad2 / 3 antibody (see d in FIG. 8).
  • GREB1 knockdown did not affect TGF ⁇ -dependent nuclear translocation of Smad2 / 3, formation of a complex between Smad2 / 3 and Smad4, and phosphorylation of Smad2 / 3 (Fig.). See c to e in 8). From these results, it was clarified that GREB1 has an action of inhibiting the function of Smad2 / 3 in the nucleus, which inhibits the expression of TGF ⁇ -dependent genes.
  • Transcriptional activators such as CBP and p300 are known to have histone acetyltransferase (HAT) activity that modifies the chromatin structure. It is also known that R-Smads (Smad2 / 3) interact directly with CBP or p300 via the MH2 domain. Therefore, the effect of GREB1 knockdown on the binding between the transcriptional activator and Smad2 / 3 was examined below.
  • HAT histone acetyltransferase
  • IP immunoprecipitate
  • a cell lysate of X293T cells expressing HA-FLAG-GREB1, GFP-Smad2 mutant (C), or GFP was immunoprecipitated with an anti-GFP antibody. Then, an anti-p300 antibody, an anti-HA antibody, or an anti-GFP antibody was reacted with the obtained cell lysate (Input) and immunoprecipitate (IP).
  • IP immunoprecipitate
  • HepG2 cells transfected with control siRNA or GREB1 # 2 siRNA were cultured for 30 minutes in the presence or absence of 10 ng / mL TGF ⁇ .
  • the lysate of the cultured cells was immunoprecipitated with an anti-acetylated histone 4 (AcH4) antibody.
  • AcH4 antibody anti-acetylated histone 4
  • IP immunoprecipitate
  • the amount of AFP mRNA and DLK1 mRNA in HepG2 cells transfected with the TGFBR1 / T204D mutant was analyzed by real-time PCR.
  • TGFBR1 / T204D mutant a mutant in which threonine at position 204 of TGFBR1 was replaced with aspartic acid
  • TGF ⁇ signaling reduces AFP and DLK1 expression in rat fetal hepatocytes or liver cancer cells.
  • HepG2 / Smad2 / 3 KO HepG2 / Smad2 / 3 KO
  • Smad2 / 3 KO HepG2 cells and HepG2 cells in which Smad2 / 3 was knocked out
  • control siRNA or siRNA against GREB1 GREB1 # 2 siRNA
  • the amount of AFP mRNA was analyzed by real-time PCR.
  • GREB1 inhibits the binding of Smad2 / 3 to p300 and inhibits the expression of the target gene of TGF ⁇ -Smad signal.
  • TGF ⁇ 1, TGFB2, or TGFB3 were analyzed using the RNA sequence data of HepG2 in the mRNA profile data set of Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (https://portals.broadinstitute.org/ccle). As a result, HepG2 cells highly expressed TGF ⁇ 1 (see a in FIG. 9).
  • the amount of PAI-1 mRNA, TGF ⁇ 1 mRNA and GREB1 mRNA in HepG2 cells transfected with control siRNA, TGF ⁇ 1 siRNA, GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA), or TGF ⁇ 1 siRNA and GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA) in combination is analyzed.
  • double knockdown of TGF ⁇ 1 and GREB1 significantly suppressed the increase in PAI-1 gene expression due to knockdown of GREB1 (see b in FIG. 9).
  • anti-GREB1 antibody, anti-TGFB1 antibody, or anti-GREB1 antibody, anti-TGFB1 antibody, or anti-GREB1 antibody, anti-TGFB1 antibody, or anti-GREB1 antibody, anti-TGFB1 antibody, or anti-GREB1 antibody, anti-TGFB1 antibody, or anti-GREB1 antibody, anti-TGFB1 antibody, or anti-GREB1 antibody, anti-TGFB1 antibody, or anti It was probed with HSP90 antibody. As a result, it was clarified that the protein expression of TGF ⁇ 1 and GREB1 was efficiently suppressed by the double knockdown of TGF ⁇ 1 and GREB1 (see c in Fig. 9).
  • two-dimensional culture (culture in a plastic dish) was performed on HepG2 cells transfected with a combination of control siRNA, TGF ⁇ 1 siRNA, GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA) or TGF ⁇ 1 siRNA and GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA).
  • the number of cells was measured over time. As a result, it was found that the suppression of cell proliferation by knockdown of GREB1 was restored by double knockdown with TGF ⁇ 1 (see i in Fig. 7).
  • HepG2 cells transfected with control siRNA, GREB1 siRNA (GREB1 # 2 siRNA), p15 siRNA, or GREB1 (GREB1 # 2 siRNA) and p15 siRNA in combination are medium containing 0.1% FBS (caspase inhibitor Z-
  • FBS caspase inhibitor Z-
  • the cells were cultured for 2 days with and without VAD and stained with propidium iodide (PI) and Hoechst33342 to determine the cell viability.
  • PI propidium iodide
  • Hoechst33342 Hoechst33342
  • HepG2 cells were cultured for 30 minutes in the presence or absence of 10 ng / mL TGF ⁇ , and the cultured cells were immobilized and stained with anti-SMAD2 / 3 antibody, anti-GREB antibody, and Hoechst 33342.
  • the GREB1 fluorescence intensity in the nucleus and cytoplasm was measured, and the result was expressed as the ratio of the GREB1 fluorescence intensity in the nucleus to the GREB1 fluorescence intensity in the cytoplasm.
  • the endogenous GREB1 and Smad3 are present in both the cytoplasm and the nucleus, and that they are accumulated in the nucleus by the stimulation of TGF ⁇ (see a in FIG. 11).
  • HepG2 cells were also cultured in the presence or absence of 10 ng / mL TGF ⁇ for 30 minutes, and the cultured cells were immobilized with anti-GREB1 antibody, anti-phosphorylated SMAD2 / 3 (pSMAD2 / 3) antibody, and Hoechst 33342. Stained. As a result, it was confirmed that phosphorylated SMAD2 / 3 was accumulated in the nucleus and co-localized with GREB1 in the cells treated with TGF ⁇ (see b in FIG. 11).
  • HepG2 cells were cultured for 30 minutes in the presence or absence of 10 ng / mL TGF ⁇ , the cultured cells were immobilized, and mouse anti-GREB1 antibody and rabbit anti-SMAD2 / 3 antibody were added and incubated. Next, a secondary antibody (PLA (proximity ligation ligation) probe) was bound to these primary antibodies.
  • PLA proximity ligation ligation
  • GREB1 mutants (1-666 and NLS / 667-1333) are present throughout the nucleus but do not form intranuclear focus, and GREB1 mutants (NLS / 1334-1954) are similar to GREB1 (full length).
  • the formation of intranuclear focus suggests that the C-terminal region of GREB1 plays an important role in localization in a specific region within the nucleus of GREB1 (d in FIG. 11). reference).
  • RNA synthesis using ethynyluridine was visualized by analysis of RNA synthesis using ethynyluridine (EU) to clarify the functional interaction of specific localization of GREB1 and Smad2 / 3 in the nucleus.
  • EU ethynyluridine
  • HepG2 cells expressing GFP-SMAD3 and expressing or not expressing HA-FLAG-GREB1 were incubated for 30 minutes in the presence of EU at a final concentration of 1 mM. After incubation, cells were immobilized and stained with anti-GFP antibody, anti-FLAG antibody, and Hoechst 33342. It has been confirmed that EU-labeled nuclear regions can be detected by incubating HepG2 cells for 30 minutes in the presence of EU to immobilize the cells (see d in FIG. 10).
  • GREB1 has several mouse liver tumor models of hepatoblastoma and hepatoblastoma using oncogene genome manipulation and / or hydrodynamic transfection involved in the formation of hepatoblastoma-like tumors in vivo. It is being developed. It has also been reported that overexpression of constitutively activated ⁇ -catenin and YAP using hydrodynamic transfection rapidly leads to liver tumors with the characteristics of hepatocellular carcinoma and hepatoblastoma.
  • mice (BM model) into which ⁇ N90 ⁇ -catenin and c-Met were introduced in combination a small amount of GREB1 and DLK1 were immunohistologically expressed in the tumor mass formed in the liver 6 weeks after the introduction (Fig. 12).
  • mice (BYM model) into which ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met were introduced in combination large multiple tumor masses were formed in the liver 6 weeks after the introduction, and GREB1 and DLK1 were high immunohistologically. It was expressed (see b in Figure 12).
  • the BYM model is an appropriate model for in vivo functional analysis of GREB1 in hepatoblastoma.
  • mice were administered ⁇ N90 ⁇ -catenin, YapS127A, and c-Met together with GREB1 shRNA, and the liver was recovered 7 to 8 weeks after the administration.
  • mice introduced with ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met BYM mice, controls
  • multiple nodules were observed on the entire liver surface (see a in FIG. 14).
  • mice into which GREB1 shRNA was introduced together with ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met BYM GREB1 KD mice
  • nodules in the liver were suppressed (see a in FIG. 14).
  • tumor nodules were obtained from the livers of BYM mice (C1 to C7) and the livers of untreated mice (NL mice), and the expression levels of ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met were measured by real-time PCR. , BYM mice were confirmed to express all of the introduced ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met (see a in FIG. 15).
  • TACSD1, DLK1 hepatoblastoma marker gene
  • AFP hepatoblastoma marker gene
  • GFP3 undifferentiated hepatoblastoma marker gene
  • PEG3, MEG3, BEX1 imprinting gene
  • Axin2 tend to be higher than in the low GREB1 group.
  • the expression level of REB1 and the mRNA expression level of hepatoblastoma-related genes were measured using the tumor nodules obtained from the BYM mice (C1 to C7).
  • DLK1, TACSTD1, GPC3, MEG3, and Axin2 were measured using the tumor nodules obtained from the BYM mice (C1 to C7).
  • liver tissue sections isolated from BYM mice in the GREB1 high group (C4) and GREB1 low group (C3) were stained with hematoxylin and eosin.
  • C4 and C3 were stained with hematoxylin and eosin.
  • hematoxylin and eosin As a result, it was found that most of the tumors in the high GREB1 group had a high nuclear / cytoplasmic ratio and high proliferative potential (see c in FIG. 14 and d in FIG. 15).
  • tumors in the GREB1 low group mainly had a well-defined cytoplasm, a uniform round nucleus, and small nucleoli, and contained large differentiated cells (Fig. 14c, Fig. 15d). reference).
  • liver tissue sections isolated from BYM mice in the GREB1 high group (C4) and GREB1 low group (C3) were stained with anti-GREB1 antibody or anti-DLK1 antibody and hematoxylin.
  • C4 and C3 GREB1 high group
  • C3 GREB1 low group
  • BYM GREB1 KD mice When GREB was knocked down in BYM mice (BYM GREB1 KD mice; K1 to K6), the incidence of tumorigenesis decreased, and no tumor was observed in 4 of 6 mice (see a in FIG. 14). .. In addition, BYM + GREB1 shRNA mice had a dramatic decrease in liver weight and serum AFP levels compared to BYM mice that did not knock down GREB (see e in FIG. 15).
  • BYM mice C1, C4, and C6
  • 4 BYM mice C2, C3, C5, and C7
  • 2 BYM mice BYM GREB1 KD mice
  • Total RNA was extracted from the tumor nodules of K2 and K4), and the mRNA levels of GREB1, DLK1 and TASCSTD1 were analyzed by real-time PCR.
  • the tumors of BYM GREB1 KD mice K2 and K4 had low expression levels of GREB1 mRNA, and the expression levels of DLK1 and TACSTD1 were similar to those of the low GREB1 group of BYM mice (see f in Fig. 14). ..
  • liver tissue sections of BYM mice (C4) and BYM GREB1 KD mice (K2) were stained with hematoxylin / eosin, or anti-GREB1 antibody and hematoxylin. As a result, it was confirmed that these tumor cells had well-differentiated hepatoblastoma-like cells having a clear cytoplasm (see g in FIG. 14).
  • N-cadherin is a target gene for TGF ⁇ signal transduction, and is known to have a high expression level in hepatoblastoma cells rather than mesenchymal cells in tumor tissues. Therefore, liver tissue sections of BYM mice (C4) and BYM GREB1 KD mice (K2) were stained with anti-N-cadherin antibody and Hoechst 33342. As a result, in BYM mice, N-cadherin expression was lower at the tumor lesion site than at the non-tumor region.
  • N-cadherin was up-regulated at the tumor lesion site, and its expression level was found to be similar to that in the non-tumor region (see h in FIG. 14). That is, this result suggests that TGF ⁇ signaling is activated by suppressing the expression of GREB1.
  • GREB1 is involved in hepatoblastoma-like histological pattern, marker gene expression, and tumorigenesis in this mouse model.
  • GREB1 can be a target molecule for hepatoblastoma
  • HepG2 cells GREB1 KO cells
  • GREB1 that knocked out GREB1 using the CRISPR / Cas9 system.
  • GGREB1 expressed cells in HepG2 cells knocked out GREB1 KO / GREB1 cells
  • cells in which GREB1 ⁇ NLS was introduced into HepG2 cells knocked out GREB1 GREB1 KO / GREB1 ⁇ NLS cells
  • GREB1 and Smad2 / 3 were knocked out.
  • Wild-type HepG2 cells (Control), GREB1 KO cells, GREB1 KO / GREB1 cells, GREB1 KO / GREB1 ⁇ NLS cells, or GREB1 KO / Smad2 / 3 KO cells (7 ⁇ 10 6 cells) in 5-week-old male BALB / cAnNCrj- It was transplanted subcutaneously into nu nude mice. Mice were killed 28 days after transplantation and xenograft tumor pieces were removed. The appearance and weight of xenograft tumor pieces were measured.
  • GREB1 knockout HepG2 cells had reduced tumor size and weight (see a in FIG. 16).
  • GREB1 expression restored the phenotype induced by GREB1 knockout, but GREB1 ⁇ NLS expression did not (see a in FIG. 16).
  • Smad2 / 3 knockout restored the phenotype induced by GREB1 knockout, confirming that GREB1 inhibits TGF ⁇ signal-dependent suppression of cell proliferation in vivo.
  • anti-GREB1 antibody, anti-GREB1 antibody, anti-GREB1 antibody, anti-GREB1 antibody, anti-GREB1 antibody, anti-GREB1 antibody (Control), HepG2 cells in which GREB1 was knocked out (GREB1 KO), or HepG2 cells in which GREB1 and Smad2 / 3 were knocked out (GREB1 KO + Smad2 / 3 KO).
  • Smad2 / 3 antibody and anti-HSP90 antibody As a result, it was revealed that the protein expression of GREB1 or Smad2 / 3 was abolished (see e in FIG. 15).
  • Antisense oligonucleotides against GREB1 have been added to the secondary structure of GREB1 mRNA to examine the effect of antisense oligonucleotides (GREB1 ASO) on human GREB1 on tumor growth, which reduce hepatoblastoma cell proliferation and tumorigenesis.
  • GREB1 ASO antisense oligonucleotides
  • the nucleotide sequence (15 nucleotides) of human GREB1 that is the target of GREB1 ASO was designed. Specifically, first, from among thousands of GREB1 ASO candidates, those that may show cytotoxicity were excluded, and 20 GREB1 ASO sequences were selected by high-dimensional structure prediction. Based on these sequences, GREB1 ASO with various modifications was designed and synthesized (Table 8).
  • control ASO or each GREB1 ASO was transfected into HepG2 cells, cultured in a medium containing 10% FBS for 2 days, and the cell lysate was probed with anti-GREB1 antibody and anti-HSP90 antibody.
  • ASO-6434, ASO-6921, ASO-6968, and ASO-7724 were not cytotoxic and strongly suppressed GREB1 expression in HepG2 cells (Fig. 17). See a).
  • GREB1ASOs-6921 and -7724 were found to inhibit GREB1 expression in liver tumors and reduce the number of Ki-67-positive cells (see d in FIG. 16).
  • mGREB1 ASO-5715 and control ASO were prepared and their effects on liver tumor formation in the BYM model were analyzed.
  • ⁇ N90 ⁇ -catenin, YAPS127A, and c-Met (BYM) were introduced into nude mice, and 3 days after the introduction, control ASO and 50 ⁇ g of ASO (mGREB1 ASO-5715) targeting mouse GREB1 were subcutaneously administered twice a week.
  • the appearance of the liver tumor 6 to 7 weeks after transplantation was observed, and the ratio of liver weight to total weight was analyzed.
  • administration of mGREB1 ASO-5715 tended to suppress the formation of liver tumors (see c in Fig. 17).
  • GREB1 analyzed the mRNA expression of GREB1 in various human cancer cell lines overexpressed in neuroblastoma based on the data set of The Cancer Cell Line Encyclopedia 1 (CCLE). GREB1 was highly expressed in skin cancer (melanoma) cell lines, neuroblastoma cell lines, and some hepatocellular carcinoma cell lines in addition to the previously reported breast cancer cell lines (Fig.). See A in 18). When the expression of GREB1 in the neuroblastoma cell line SKNDZ cells, CHP212 cells, and NBTU110 cells was analyzed at the protein level, hepatocytes with high GREB1 expression were found to be comparable to HepG2 cells in the hepatoblastoma cell line that highly express GREB1.
  • GREB1 is expressed as a downstream target gene of ⁇ -catenin.
  • GREB1 was detected in the nucleus of tumor cells in 4 cases (30.7%) of neuroblastoma, and ⁇ -catenin was detected in the cytoplasm or nucleus in 11 cases (84.6%) (see C in FIG. 18).
  • No significant expression correlation was found between GREB1 and ⁇ -catenin expression (see D in Figure 18).
  • GREB1 is important for cell proliferation in neuroblastoma.
  • GREB1 is overexpressed in some hepatocellular carcinomas and is involved in cell proliferation and tumorigenesis As mentioned above, GREB1 is expressed as a downstream target gene for ⁇ -catenin in hepatoblastoma, a childhood liver cancer. On the other hand, the CCLE dataset suggested that GREB1 was also highly expressed in some adult hepatocellular carcinomas (see A in Figure 18). Therefore, the expression of GREB1 and ⁇ -catenin in 210 cases of hepatocellular carcinoma tissue was examined immunohistologically.
  • GREB1 was expressed at a slightly lower level than GREB1-positive breast cancer cell line MCF7 cells and hepatoblastoma cell line HepG2 cells, and GREB1 weakly expressed hepatoblasts. Higher expression was observed as compared with the tumor cell line Huh6 cells. On the other hand, GREB1 expression was not observed in HLE cells and HLF cells (see C in FIG. 19). The ⁇ -catenin dependence of GREB1 in GREB1 highly expressed hepatocellular carcinoma cell lines was investigated.
  • GREB1 GREB1 expression was suppressed by siRNA in Hep3B and JHH7 cells, cell proliferation was suppressed under planar culture conditions (see E in FIG. 19). Furthermore, in order to clarify the involvement of GREB1 in in vivo tumorigenesis of hepatocellular carcinoma, Hep3B and JHH7 cells in which GREB1 was knocked out were prepared and xenograft subcutaneous tumorigenesis analysis was performed.
  • the tumor weight of the Hep3B cells and JHH7 cells in which GREB1 was knocked out was significantly suppressed 6.5 weeks after transplantation (Hep3B cells) and 2 weeks after transplantation (JHH7 cells) as compared with the control cells (Fig. See F and G in 19). From these results, it was revealed that GREB1 plays an important role in cell proliferation of hepatocellular carcinoma and tumorigenesis in vivo.
  • GREB1 is overexpressed in skin melanoma, and the CCLE dataset involved in cell proliferation suggests that GREB1 is frequently and highly expressed in skin melanoma cells (see A in Figure 18). Therefore, the expression of GREB1 in Mewo cells, SKMEL28 cells, and G361 cells, which are melanoma cell lines in which GREB1 was highly expressed from the CCLE data set, was analyzed by Western blotting. As a result, GREB1 was detected in the wild-type around 216 kDa in hepatoblastoma cells HepG2 cells, whereas it was detected in the vicinity of 100 kDa in all melanoma cells (see A in FIG. 20).
  • IS1 is also called GREB1a, a full-length version of 1949 amino acids (216 kDa); IS2 is also called GREB1b, a transcript of 457 amino acids (49 kDa) lacking the C-terminal 454-1949 amino acids; IS3 is also called GREB1c , A transcript of 409 amino acids (43 kDa) lacking the C-terminal 410-1949 amino acid; IS4 is a transcript of 947 amino acids (107 kDa) lacking the N-terminal 1-1002 amino acid (Fig. 20). See B). GREB1 was composed of 38 exons and was expressed throughout the protein-encoding exons (exons 4-38) in breast cancer tissues.
  • MITF melanin biosynthetic enzyme genes
  • RPE retinal pigment epithelial cells
  • GREB1 may be a target gene for MITF in melanoma. Therefore, when MITF knockout cells were prepared in GREB1 high-expressing melanoma cell line COLO679 cells, GREB1 expression was suppressed as compared with control cells (see E in FIG. 20).
  • GREB1 The effect of GREB1 on cell proliferation in skin melanoma cells was investigated.
  • GREB1 was suppressed in SKMEL28 cells and COLO679 cells using siRNA (SKMEL28 cells) or antisense oligonucleotide (ASO) (COLO679 cells)
  • Fig. 20 cell proliferation under flat culture conditions was suppressed in both cases (Fig. 20). See F and G). From these results, it was clarified that GREB1 IS4, which is specifically expressed in skin melanoma, is important for cell proliferation of melanoma.

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Abstract

本発明の目的は、新たな腫瘍治療剤を提供することである。　性ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍において、GREB1がWnt/β-カテニンシグナルの下流標的遺伝子になっており、GREB1の発現を抑制できる物質を有効成分として使用することにより、性ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制し、当該腫瘍の治療が可能になる。

Description

性ホルモン非感受性ＧＲＥＢ１陽性腫瘍の治療剤
　本発明は、性ホルモン非感受性GREB1（Growth regulation by estrogen in breast cancer）陽性腫瘍（性ホルモンに感受性を示さないGREB1陽性腫瘍）の治療剤に関する。更に、本発明は、GREB1の発現量を指標とする肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、及び神経芽腫の検査方法に関する。
　肝芽腫は、小児の肝臓に発症する悪性腫瘍で、3歳までに発症することが多く、4歳未満の小児における肝悪性腫瘍の約90％を占めている。日本国内では、肝芽腫は年間40～30名が発症し、世界的には100万人に1人程度の発症頻度であり、希少がんに位置付けられている。肝芽腫の発症病因は不明であるが、その7割近くにβ-カテニンの分解に関わるエクソン3を含む領域の欠失又は活性化変異を認め、また、β-カテニンが蓄積する家族性腺種性大腸ポリポーシス（FAP）の家系でも好発することから、Wntシグナルの活性化が病態に関与していると考えられている。
　肝芽腫では、完全切除の有無が予後に影響するため、術後病期分類により治療方針が選択されている。完全切除の病期（ステージ）Iでは予後が良好であるが、遠隔転移の病期IVでは5年無病生存率は36％にまで低下する。従来、肝芽腫の治療は、化学療法と外科的切除を組み合わせて行われている。化学療法については、シスプラチンを含むレジメンが標準的治療として確立されているが、骨髄機能抑制や腎機能障害等の重篤な副作用が問題となっている。
　一方、GREB1は、乳がん細胞においてエストロゲンによって誘導される遺伝子の1つとして発見され（非特許文献１参照）、エストロゲンレセプターα（ERα）によって直接的に発現誘導され、ERα陽性乳がん細胞で高発現されるが、ERα陰性細胞では発現されないことが報告されている。ERαは、GREB1遺伝子のプロモーター領域に結合し、GREB1を発現し、ERαと直接相互作用することにより、その転写活性を活性化することが報告されている（非特許文献２参照）。実際、GREB1 mRNAの発現量は、乳がんにおけるERα発現量と相関していることも報告されている（非特許文献２参照）。更に、GREB1のノックダウンは乳がん細胞の増殖を抑制し、GREB1の過剰発現は乳がん細胞の増殖を促進することも分かっている（非特許文献３参照）。更に、GREB1は、ERα陰性細胞では発現せず、ERα陽性卵巣がん細胞で発現し、卵巣がん細胞増殖にGREB1が重要な役割を果たしていることも報告されている（非特許文献４参照）。GREB1プロモーター領域はアンドロゲン応答配列を有するため、アンドロゲン受容体（AR）陽性前立腺がん細胞ではアンドロゲンによってGREB1が誘発されるが、AR陰性細胞では誘導されない（非特許文献５参照）。このように、GREB1は、性ホルモン感受性腫瘍の増殖に関するメディエーターになっている。
　しかしながら、GREB1の発現が性ホルモン感受性腫瘍以外の腫瘍形成に関与しているか否かは依然として解明されていない。
Cancer Res. Nov 15;60(22):6367-75. Cell Rep. 2013 Feb 21;3(2):342-9. Breast Cancer Res Treat. 2005 Jul;92(2):141-9. Int J Cancer. 2014 Sep 1;135(5):1072-84. Prostate. 2006 Jun 1;66(8):886-94.
　本発明の目的は、新規の腫瘍治療剤を提供することである。また、本発明の他の目的は、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、及び神経芽腫の罹患の有無を予測するための検査方法を提供することである。
　本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、肝芽腫細胞、肝がん細胞、悪性黒色腫細胞、神経芽腫細胞等では、エストロゲンやアンドロゲンのような性ホルモンによって増殖が促進されないが、GREB1が発現している腫瘍細胞が存在しており、このような特性を有する腫瘍細胞（即ち、性ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍）の増殖には、GREB1が関与していることを見出した。具体的には、性ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍の内、肝芽腫と肝細胞がんではGREB1がWnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子になっており、悪性黒色腫ではGREB1が転写因子MITF(Microphthalmia-associated transcription factor)の標的遺伝子になっており、神経芽腫ではGREB1が遺伝子増幅しているることを見出した。また、性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍は、GREB1に対するsiRNAやアンチセンスオリゴヌクレオチドによって増殖が抑制されることを見出した。更に、また、免疫化学的検討から、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、及び神経芽腫において、腫瘍組織特異的にGREB1が発現していることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
　即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　GREB1の発現を抑制する物質を有効成分とする、性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍の治療剤。
項２．　前記物質が、GREB1に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、アンチセンス核酸、及びリボザイムよりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、項１に記載の治療剤。
項３．　前記腫瘍が、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫である、項１又は２に記載の治療剤。
項４．　肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫の罹患の有無を予測するための検査方法であって、
　被験者から採取された肝臓組織、皮膚組織、又は神経組織において、GREB1の発現量を測定する工程を含む、検査方法。
項５．　前記織肝臓組織、皮膚組織、又は神経組織におけるGREB1の発現量を、抗GREB1抗体を用いた組織免疫によって測定する、項４に記載の検査方法。
項６．　GREB1を検出するための試薬を含む、肝芽腫の検査薬。
項７．　GREB1を検出するための試薬が、抗GREB1抗体又はその断片、或はGREB1 mRNA又はGREB1 cDNAとハイブリダイズできるプライマーである、項６に記載の検査薬。
項８．　性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍を罹患している患者に、GREB1の発現を抑制する物質を治療有効量投与する、性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍の治療方法。
項９．　前記腫瘍が、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫である、項９に記載の治療方法。
項１０．　GREB1の発現を抑制する物質の、性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍の治療剤の製造のための使用。
項１１．　前記腫瘍が、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫である、項１０に記載の使用。
項１２．　性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍の治療に使用される、GREB1の発現を抑制する物質。
項１３．　前記腫瘍が、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫である、項１２に記載のGREB1の発現を抑制する物質。
　本発明の治療剤は、性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍において、GREB1がWnt/β-カテニンシグナルの下流標的遺伝子になっているという新たな知見に基づいて完成したものであり、GREB1を標的分子として、その発現を抑制することによって、効果的に当該腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍としては、例えば、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、神経芽腫等がある。例えば、肝芽腫は、小児特異的疾患であって発生頻度も低い希少がんであることから、従来、化学療法薬や分子標的薬の開発は十分に進んでいなかったが、本発明の一形態によれば、肝芽腫に対する優れた分子標薬を提供することが可能になる。また、遺伝子発現データベースを用いた解析から、GREB1は他の主要正常組織では発現が極めて限局的であることが分かっているので、GREB1を分子標的にしている本発明の治療剤は、副作用の少ない点でも革新的といえる。
　また、本発明の検査方法によれば、腫瘍性疾患が疑われる生検標本や手術切除標本におけるGREB1の発現量を指標とすることにより、早期の肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫の診断、また手術切除標本の場合にはこれらの腫瘍の組織的進展範囲の診断に応用できる。
aは、肝芽腫細胞を用いて、Wnt/β-カテニンシグナル伝達の下流にある標的遺伝子のmRNA発現解析を行った図である。　bは、ヒトGREB1遺伝子上流にあるTCF4結合配列（-443～-448）を示す図、及びHepG2細胞由来のクロマチンを、所定の抗体で免疫沈降させ、TCF4結合部位（-443～-448）について領域特異的プライマーを用いてPCRにより分析した結果を示す図である。　cは、コントロールsiRNA又はβカテニンに対するsiRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞について、リアルタイムPCR分析にてGREB1 mRNAの発現量を測定した結果を示す図(左)と、その細胞溶解液に抗GREB1抗体、抗Axin2抗体、抗β-カテニン抗体、及び抗HSP90抗体でプローブ化した結果を示す図（右）である。　dは、肝芽腫組織（n=11）を抗GREB1抗体及びヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す図、並びに腫瘍病変部位の総面積に対してGREB1の免疫染色によって染色された面積の割合３つのカテゴリー(<5%、5-30%、及び30-95%)に分類した結果を示す図である。　eは、肝芽腫組織の標本を、抗GREB1抗体又は抗β-カテニン抗体、及びヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す図であり、実線のボックスはβ-カテニンの染色の程度が高い領域、点線のボックスはβ-カテニンの染色の程度が低い領域である。　fは、肝芽腫（GEO ID：gse75271）のmRNAプロファイルデータセット中の55症例を用いて、50の腫瘍病変部位及び5つの非腫瘍領域についてGREB1 mRNA発現量を分析した結果を示す図である。　gは、肝芽腫（GEO ID：gse75271）のmRNAプロファイルデータセット中の55症例を用いて、Wnt/β-カテニン経路の標的遺伝子の発現量（Y軸）とGREB1遺伝子の発現量（X軸）との相関を分析した結果を示す図である。 aは、HepG2細胞をエストロゲン受容体アンタゴニストICI-182,786で処理した後に、リアルタイムPCRにてGREB1 mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　bは、BMEL細胞を終濃度5μMのGSK3阻害剤CHIR99021（Wnt/β-カテニン経路活性化剤）で処理した後に、リアルタイムPCRにてGREB1 mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　cは、Huh6細胞にβ-カテニンに対するsiRNAを導入した後、リアルタイムPCRにてGREB1 mRNAとβ-カテニン mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　dは、HepG2細胞とHuh6細胞について、リアルタイムPCRにてGREB1 mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　eは、MCF7細胞をエストロゲン受容体アンタゴニストICI-182,786、CHIR99021、又はそれらを組み合わせて処理した後に、リアルタイムPCRにてGREB1とAxin2 mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　fは、肝細胞がん細胞株であるHLE、SNU387、SNU449、及びHuh7細胞を終濃度5μMのCHIR99021で処理した後に、リアルタイムPCRにてGREB1 mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　gは、肝芽腫組織（n=11）を抗β-カテニン抗体及びヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す図、並びに腫瘍病変部位の総面積に対してβ-カテニンの免疫染色によって染色された面積の割合３つのカテゴリー(<5%、5-30%、及び30-95%)に分類した結果を示す図である。　hは、肝芽腫組織の標本を抗GREB1抗体及びヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す図、実線のボックスはGREB1の染色程度が高い領域（充実性で非極性化）、点線のボックスはGREB1の染色程度が低い領域（管状で極性化）である。　iは、肝芽腫（GEO ID：gse75271）のmRNAプロファイルデータセット中の55症例を用いて、エストロゲンシグナル経路の標的遺伝子の発現量（Y軸）とGREB1遺伝子の発現量（X軸）との相関を分析した結果を示す。　jは、肝芽腫（GEO ID：gse75271）のmRNAプロファイルデータセット中の55症例を用いて、β-カテニン遺伝子のエクソン３及び４が野生型（n=3）、点変異（n=19）、または欠失（n=28）を有する症例におけるGREB1mRNA、GS mRNA、またはLGR5 mRNAの発現量を分析した結果を示す図である。 aは、HepG2細胞又はGREB1を発現させたHepG2細胞（HepG2/GREB1）にコントロールsiRNA又はβ-カテニンに対するsiRNAをトランスフェクトし、二次元培養（プラスチックディッシュでの培養）を行い、細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。　bは、HepG2細胞にコントロールsiRNA又は2つの異なるsiRNA（GREB1 #1 siRNA及びGREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトし、その細胞溶解液に抗GREB1抗体、抗Axin2抗体、抗β-カテニン抗体、及び抗HSP90抗体でプローブ化した結果を示す図である。　cは、コントロールsiRNA又はsiRNA（GREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞におけるGREB1 mRNA量、PRLR mRNA量及びXBP1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。　dは、肝芽腫（GEO ID：gse75271）のmRNAプロファイルデータセット中の55症例を用いて、肝芽腫特異的マーカー遺伝子の発現量（Y軸）とGREB1遺伝子の発現量（X軸）との相関を分析した結果を示す。　eは、GFP又はGFP-GREB1を発現するHuh6細胞を二次元培養（プラスチックディッシュで培養）し、細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。　fは、mock又はGREB1を発現するHuh6細胞を三次元培養（マトリゲルで培養）し、形成されたスフェアのサイズを測定した結果を示す図である。　gは、HepG2細胞、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO HepG2）、又はGFP-GREB1を発現させたGREB1 KO HepG2細胞（GREB1 KO HepG2/GREB1）の細胞溶解液に対して、抗GREB1抗体、抗GFP抗体、及び抗HistoneH3抗体でプローブ化した結果を示す図である。　hは、HepG2細胞（Control）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO）、又はGREB1を発現させたGREB1 KO HepG2細胞（GREB1 KO/GREB1）を二次元培養（プラスチックディッシュで培養）し、細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。　iは、HepG2細胞、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO）、又はGREB1を発現させたGREB1 KO HepG2細胞（GREB1 KO/GREB1）におけるDLK1 mRNA量、及びAFP mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。　jは、HepG2細胞、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO）、又はGREB1を発現させたGREB1 KO HepG2細胞（GREB1 KO/GREB1）の細胞溶解液に対して、抗CyclinA抗体、抗リン酸化HistoneH3（pHistoneH3）抗体、及び抗HistoneH3抗体でプローブ化した結果を示す図である。 aは、mock又はGREB1を導入したHepG2細胞に、コントロールsiRNA又はGREB1に対する2つの異なるsiRNA（GREB1 #1 siRNA及びGREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトして、二次元培養（プラスチックディッシュでの培養）を行い、細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。　bは、コントロールsiRNA又はsiRNA（GREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞を三次元マトリゲル中で5日間培養し、細胞をファロイジンで染色し、スフェアの面積、及び内腔を有する極性化したスフェアの割合を求めた結果を示す図である。　cは、コントロールsiRNA又はGREB1に対するsiRNA（GREB1 ＃2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞について、リアルタイムPCR分析にてGREB1 mRNA、DLK1 mRNA、AFP mRNA、及びPEG3 mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　dは、コントロールsiRNA又はGREB1に対する2つの異なるsiRNA（GREB1 #1 siRNA及びGREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞を0.1% FBSを含む培地で1日間培養し、その細胞溶解液を、抗cyclinA抗体、抗cyclinB抗体、抗リン酸化ヒストンH3抗体、抗ヒストンH3抗体、抗GREB1抗体、及び抗HSP90抗体でプローブ化した結果を示す図である。　eは、肝芽腫（GEO ID：gse75271）のmRNAプロファイルデータセット中の55症例を用いて、細胞増殖のマーカー遺伝子（Y軸）とGREB1遺伝子の発現量（X軸）との相関を分析した結果を示す図である。　fは、HepG2細胞にコントロールsiRNA又はGREB1に対する2つの異なるsiRNA（GREB1 #1siRNA及びGREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトし、0.1% FBSを含む培地（カスパーゼ阻害剤Z-VADを含む場合と含まない場合）で2日間培養し、ヨウ化プロピジウム（PI）及びHoechst33342で染色し、細胞の生存率を求めた結果を示す図である。　gは、HepG2細胞にコントロールsiRNA又はGREB1に対する2つの異なるsiRNA（GREB1 #1 siRNA及びGREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトして2日間培養し、その細胞溶解液を、抗cleaved caspase 3抗体、抗PARP1抗体、及び抗HSP90抗体でプローブ化した結果を示す図である。 aは、野生型GREB1、及びGREB1ΔNLS変異体の模式図、並びにHA-FLAG-GREB1ΔNLS変異体を発現するX293T細胞を抗FLAG抗体、ファロイジン、及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。　bは、HA-FLAG-GREB1野生型又はHA-FLAG-GREB1ΔNLS変異体、及びGFP、GFP-Smad3、GFP-Smad4、又はGFP-Smad7を発現するX293Tの細胞溶解液(Input)、及び抗GFP抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗HA抗体又は抗GFP抗体でプローブ化した結果を示す図である。　cは、HepG2の細胞溶解液(Input)及び抗Smad2/3抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗Smad2/3抗体及び抗GREB1抗体でプローブ化した結果を示す図である。　dは、Smad2、及びSmad2変異体（N及びC）の模式図、並びにHA-FLAG-mGREB1及びGFP、又はGFP-Smad2（Full、変異体N、又は変異体C）を発現するX293T細胞の溶解液（Input）及び抗GFP抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗FLAG抗体又は抗GFP抗体でプローブ化した結果を示す図である。　eは、HepG2細胞の溶解液をリコンビナントGST、リコンビナントGST-Smad2/MH1、又はリコンビナントGST-Smad2/MH2を用いて沈降し、細胞溶解液(Input)及びglutathione-sepharoseによる沈降物（pulldown）に対して、CBB染色、又は抗GREB1抗体及び抗Smad4抗体でプローブ化した結果を示す図である。　fは、GREB1変異体（1-666:N、NLS/667-1333:M、及びNLS/1334-1954:C）の模式図、並びにGFP-GREB1変異体を発現するX293T細胞を抗GFP抗体及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。　gは、FLAG-Smad3及びGFP、GFP-GREB1、又はGFP-GREB1変異体を発現するX293T細胞の溶解液（Input）及び抗GFP抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗FLAG抗体又は抗GFP抗体でプローブ化した結果を示す図である。 aは、GFP-Smad3、GFP-Smad4、又はGFP-Smad7を発現するX293T細胞を抗GFP抗体及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。　bは、GFP-GREB1を発現させたHuh6の細胞溶解液(Input)及び抗Smad2/3抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗Smad2/3抗体及び抗GFP抗体でプローブ化した結果を示す図である。　cは、GFP、GFP-Smad3、GFP-Smad4、又はGFP-Smad7を発現するX293Tの細胞溶解液(Input)、及び抗GFP抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗β-カテニン抗体、抗c-Myc抗体、又は抗GFP抗体でプローブ化した結果を示す図である。　dは、GFP-GREB1を発現させたHuh6細胞の溶解液をリコンビナントGST、リコンビナントGST-Smad2/MH1、又はリコンビナントGST-Smad2/MH2を用いて沈降し、細胞溶解液(Input)及びglutathione sepharoseによる沈降物（pulldown）に対して、CBB染色、又は抗GFP抗体でプローブ化した結果を示す図である。　eは、GREB1の変異体（NSL/667-195(ΔN)、Δ667-1333(ΔM)、NSL/1-133(ΔC)）の模式図、並びに、FLAG-Smad3及びGFP、GFP-GREB1、又はGFP-GREB1変異体（NSL/667-195(ΔN)、Δ667-1333(ΔM)、NSL/1-1333(ΔC)）を発現するX293T細胞の溶解液（Input）及びGFP抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗FLAG抗体又は抗GFP抗体でプローブ化した結果を示す図である。 aは、肝芽腫（GEO ID：gse75271）のmRNAプロファイルデータセット中の55症例を用いて、50の腫瘍病変部位及び5つの非腫瘍領域についてPAI-1 mRNA及びGADD45B mRNA発現量を分析した結果を示す図である。　bは、肝芽腫（GEO ID：gse75271）のmRNAプロファイルデータセット中の55症例を用いて、TGFβシグナルの標的遺伝子の発現量（Y軸）とGREB1遺伝子の発現量（X軸）との相関を分析した結果を示す図である。　cは、GFPを発現するHepG2細胞(HepG2/GFP)、又はGFP-GREB1を発現するHepG2細胞(HepG2/GFP-GREB1)に、コントロールsiRNA又はGREB1 #2 siRNAをトランスフェクトし、細胞内のPAI-1及びSNAIL2のmRNA量を測定した結果を示す図である。　dは、HepG2細胞に、コントロールsiRNA又はGREB1 #2 siRNAをトランスフェクトし、TGFβ受容体阻害剤（ALK5 inhibitor）存在下又は非存在下で培養し、細胞内のPAI-1及びSNAIL2のmRNA量を測定した結果を示す図である。　eは、コントロールsiRNA又はGREB1 #2 siRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞の溶解液（Input）及び抗Smad2/3抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗p300抗体、抗GREB1抗体、又は抗Smad2/3抗体でプローブ化した結果を示す図である。　fは、HA-FLAG-GREB1、GFP-Smad2変異体(C)、又はGFPを発現するX293T細胞の溶解液（Input）及びGFP抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗p300抗体、抗FLAG抗体、又は抗GFP抗体でプローブ化した結果を示す図である。　gは、コントロールsiRNA又はGREB1 #2 siRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞を、TGFβ存在下又は非存在下で培養し、培養後の細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に含まれるPAI-1のエクソン2領域について領域特異的プライマーを用いたPCRによって分析した結果を示す図である。　hは、HepG2細胞に対して図示する各プラスミドをトランスフェクションし、リアルタイムPCRにてSNAIL2 mRNA、p15 mRNA、又はAxin2 mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　iは、コントロールsiRNA、TGFβ1 siRNA、GREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）又はTGFβ1 siRNAとGREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）を組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞について、二次元培養を行い、細胞数を経時的に測定した結果である。　jは、HepG2細胞及びSmad2/3をノックアウトしたHepG2細胞(HepG2/Smad2/3 KO)にコントロールsiRNA、又はGREB1 siRNA（GREB1＃2 siRNA）をトランスフェクトし、二次元培養を行い、細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。 aは、肝芽腫（GEO ID：gse75271）のmRNAプロファイルデータセット中の55症例を用いて、50の腫瘍病変部位及び5つの非腫瘍領域についてAxin2 mRNA及びDKK1 mRNA発現量を分析した結果を示す図である。　bは、HepG2細胞(Control)、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞(GREB1 KO)、又はGREB1を発現させたGREB1 KO HepG2細胞(GREB1 KO/GREB1)におけるPAI-1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。　cは、コントロールsiRNA又はGREB1に対するsiRNA（GREB1 ＃2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞を10ng/mLのTGFβ存在下又は非存在下で30分間培養後、細胞を抗Smad2/3抗体及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。　dは、コントロールsiRNA又はGREB1に対するsiRNA（GREB1 ＃2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞をTGFβ存在下又は非存在下で培養し、細胞の溶解液（Input）及び抗Smad2/3抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗Smad4抗体又は抗Smad2/3抗体でプローブ化した結果を示す図である。　eは、コントロールsiRNA又はGREB1に対するsiRNA（GREB1 ＃2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞をTGFβ存在下又は非存在下で培養し、細胞の溶解液を抗GREB1抗体、抗リン酸化Smad2/3(pSmad2/3)抗体、又は抗Smad2/3抗体でプローブ化した結果を示す図である。　fは、HepG2細胞にTGFBR1/T204D変異体を発現し、AFP mRNA及びDLK1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。　gは、HepG2細胞、及びSmad2/3をノックアウトしたHepG2細胞(HepG2/Smad2/3 KO)の溶解液を抗Smad2/3抗体、又は抗HSP90抗体でプローブ化した結果を示す図である。　ｈは、HepG2細胞、及びSmad2/3をノックアウトしたHepG2細胞(HepG2/Smad2/3 KO)にコントロールsiRNA又はGREB1に対するsiRNA（GREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトし、AFP mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。 aは、Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)のmRNAプロファイルデータセット中のHepG2のRNAシークエンスデータを用いて、TGFβ1、TGFB2、又はTGFB3の遺伝子発現量を分析した結果を示す図である。　bは、コントロールsiRNA、TGFβ1 siRNA、GREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）又はTGFβ1とGREB1（GREB1 ＃2 siRNA）のsiRNAを組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞におけるPAI-1 mRNA量、TGFB1 mRNA量及びGREB1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。　cは、コントロールsiRNA、TGFβ1 siRNA、GREB1 siRNA（GREB1 #2 siRNA）、又はTGFβ1とGREB1（GREB1 #2 siRNA）のsiRNAを組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞の溶解液を、抗GREB1抗体、抗TGFB1抗体、又は抗HSP90抗体でプローブ化した結果を示す図である。　dは、コントロールsiRNA、TGFβ1 siRNA、又はTGFβ1 siRNAとGREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）を組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞を0.01, 0.1, 又は1 ng/ml濃度のTGFβ存在下又は非存在下で4時間培養後、PAI-1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。　eは、コントロールsiRNA又はGREB1に対するsiRNA（GREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞におけるp15 mRNA量、p21 mRNA量、及びp27 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。　fは、HepG2細胞及びSmad2/3をノックアウトしたHepG2細胞（HepG2/Smad2/3 KO）にコントロールsiRNA又はGREB1に対するsiRNA（GREB1 ＃2siRNA）をトランスフェクトし、p15 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。　gは、コントロールsiRNA、GREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）、p15 siRNA、又はGREB1（GREB1 #2 siRNA）とp15のsiRNAを組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞の二次元培養（プラスチックディッシュでの培養）を行い、細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。　hは、コントロールsiRNA、GREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）、p15 siRNA、又はGREB1（GREB1 ＃2 siRNA）とp15のsiRNAを組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞を0.1% FBSを含む培地（カスパーゼ阻害剤Z-VADを含む場合と含まない場合）で2日間培養し、ヨウ化プロピジウム（PI）及びHoechst33342で染色し、細胞の生存率を求めた結果を示す図である。　iは、MCF7細胞をエストロゲン受容体アンタゴニストICI-182,786で処理した後に、リアルタイムPCRにてPAI-1 mRNA及びGREB1 mRNAの発現量をリアルタイムPCRにて測定した結果を示す図である。　jは、MCF7細胞にコントロールsiRNA又はGREB1に対するsiRNA（GREB1 ＃2 siRNA）をトランスフェクトし、PAI-1 mRNA又はGREB1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果を示す図である。　kは、MCF7の細胞溶解液(Input)及び抗Smad2/3抗体による免疫沈降物（IP）に対して、抗Smad2/3抗体及び抗GREB1抗体でプローブ化した結果を示す図である。 aは、GFP-GREB1を発現するHepG2細胞を固定化して、抗GFP抗体及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。　bは、GFP-GREB1を発現するHepG2細胞を固定化して、抗GFP抗体、抗Fibrillarin抗体、抗SC35抗体、抗PML抗体又は抗Coilin抗体と、Hoechst33342で染色した結果を示す図である。　cは、GFP-GREB1及びFLAG-SMAD3を発現するHepG2細胞を固定化して、抗GFP抗体、抗FLAG抗体及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。　dは、HepG2細胞をエチニルウリジン（EU）存在下で30分間インキュベートした後に、細胞を固定化して観察した結果を示す図である。 aは、HepG2細胞を10ng/mLのTGFβ存在下又は非存在下で30分間培養し、培養後の細胞を固定化して抗SMAD2/3抗体、抗GREB抗体、及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。　bは、HepG2細胞をTGFβ存在下又は非存在下で培養し、培養後の細胞を固定化して抗GREB1抗体、抗リン酸化SMAD2/3(pSMAD2/3)抗体、及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。　cは、HepG2細胞をTGFβ存在下又は非存在下で培養し、培養後の細胞を固定化し、マウス抗GREB1抗体及びウサギ抗SMAD2/3抗体を反応させ、更に二次抗体（PLAプローブ）を結合させた結果を示す図（左）と、核に点状のPLAシグナルを有する細胞の割合を示した図（右）である。　dは、GFPを結合させたGREB1変異体（1-666:N、NLS/667-1333:M、及びNLS/1334-1954:C）を発現するX293T細胞を抗GFP抗体で染色した結果を示す図である。　eは、GFP-SMAD3を発現し、且つHA-FLAG-GREB1を発現又は非発現のHepG2細胞をエチニルウリジン（EU）存在下でインキュベートした後に、細胞を固定化して抗GFP抗体、抗GREB1抗体、及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。 aは、肝芽腫組織（n=11）を抗β-カテニン抗体及びヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す図、並びに腫瘍病変部位の総面積に対してβ-カテニンの免疫染色によって染色された面積の割合３つのカテゴリー(<5%、5-30%、及び30-95%)に分類した結果を示す図である。　bは、ΔN90βカテニン及びYAPS127A（BYモデル）、ΔN90βカテニン及びc-Met（BM）モデル、又はΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Met（BYMモデル）を導入したマウスから分離された肝臓の組織切片について、抗GREB1抗体又は抗DLK1抗体とヘマトキシリンで染色した結果、及び肝臓を観察した結果を示す図である。　cは、ΔN90βカテニン及びYAPS127A（BYモデル）、ΔN90βカテニン及びc-Met（BMモデル）、又はΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Met（BYMモデル）を導入したマウスの肝臓腫瘍結節(BY:n=3; BM:n=7; BYM:n=11)から全RNAを抽出し、GREB1、及びTASCSTD1のmRNA量をリアルタイムPCRにて分析した結果を示す図である。 aは、Huh6細胞又はHepG2細胞を固定化して抗YAP抗体、及びHoechst33342で染色した結果を示す図である。　bは、コントロールsiRNA又はYAP/TAZに対するsiRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞又はHuh6細胞について、リアルタイムPCRにてGREB1 mRNA、YAP mRNA、及びTAZ mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　cは、Huh6細胞をCHIR99021、Mst1/2キナーゼ阻害剤（YAP活性化剤）であるXMU-MP1、又はそれらを組み合わせて処理した後に、リアルタイムPCRにてGREB1 mRNA、Axin2 mRNA、及びCyr61 mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　dは、コントロールsiRNA又はc-Metに対するsiRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞について、リアルタイムPCRにてc-Met mRNA、Axin2 mRNA、GREB1 mRNA、ANKRD1 mRNA、及びCyr61 mRNAの発現量を測定した結果を示す図である。　eは、コントロールsiRNA又はc-Metに対するsiRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞の溶解液を抗c-Met抗体、抗リン酸化β-カテニン（pY654）抗体、抗β-カテニン抗体、抗Axin2抗体、抗GREB1抗体、及び抗β-Actin抗体でプローブ化した結果を示す図である。 aは、ΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metを導入したマウス（BYM、コントロール；C1～C7）の肝臓、GREB1 shRNAと共にΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metを投与したマウス（BYM+ GREB1 shRNA；BYM GREB1 KDマウス、K1～K6）の肝臓、及び未処理のマウス（NLマウス）の肝臓を観察した結果を示す図である。　bは、前記BYMマウス（C1～C7）から6つの腫瘍結節を取得し、肝芽腫関連遺伝子の発現量を測定した結果を示す図である。　cは、GREB1高群(C4)及びGREB1低群(C3)のBYMマウスから分離された肝臓の組織切片について、ヘマトキシリン・エオシンで染色した結果を示す図である。　dは、GREB1高群(C4)及びGREB1低群(C3)のBYMマウスから分離された肝臓の組織切片について、抗GREB1抗体又は抗DLK1抗体とヘマトキシリンで染色した結果を示す図である。　eは、前記各マウスから得られた肝臓の重量の全体重に対する比率、及び前記各マウスの血清AFP値を測定した結果を示す図である。　fは、3匹のBYMマウス（GREB1高群：C1、C4、及びC6）、4匹のBYMマウス（GREB1低群：C2、C3、C5、及びC7）、及びGREB1 shRNAが投与された2匹のBYMマウス（BYM GREB1 KDマウス；K2及びK4）の腫瘍結節から全RNAを抽出し、GREB1、DLK1及びTASCSTD1のmRNA量をリアルタイムPCRにて分析した結果を示す図である。　gは、BYMマウス（GREB1高群：C4）及びGREB1 shRNAが投与されたBYMマウス（GREB1 shRNA：K2）の肝臓の組織切片をヘマトキシリン・エオシン、又は抗GREB1抗体及びヘマトキシリンで染色した結果を示す図である。　hは、BYMマウス（GREB1高群：C4）及びGREB1 shRNAが投与されたBYMマウス（GREB1 shRNA：K2）の肝臓の組織切片を抗N-カドヘリン抗体及びHoechst33342で染色した結果（左図）、並びに非腫瘍領域のN-カドヘリン発現量に対する腫瘍病変部位のN-カドヘリン発現量の割合を求めた結果（下図）を示す図である。 aは、ΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metを導入したマウス（BYM、コントロール；C1～C7）の肝臓、及び未処理のマウス（NLマウス）の肝臓から腫瘍結節を取得し、導入したΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metの発現量を測定した結果を示す図である。　bは、未処理マウス(NL)の肝臓、ΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metを導入したマウス（BYM）の腫瘍結節(n=42)、及び当該BYMマウスの非腫瘍組織(n=8)から全RNAを抽出し、リアルタイムPCRにてGREB1のmRNA量を測定した結果を示す図である。　cは、前記BYMマウス（C1～C7）から取得した腫瘍結節を用いて、DLK 1mRNA、TACSTD1 mRNA、GPC3 mRNA、MEG3 mRNA、及びAxin2 mRNAの発現量（Y軸）とGREB1遺伝子の発現量（X軸）との相関を分析した結果を示す。　dは、GREB1高群(C4)及びGREB1低群(C3)のBYMマウスから分離された肝臓の組織切片について、ヘマトキシリン・エオシンで染色した結果を示す図である。　eは、HepG2細胞（Control）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO）、又はGREB1とSmad2/3を組み合わせてノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO+Smad2/3 KO）の溶解液を抗GREB1抗体、抗Smad2/3抗体、及び抗HSP90抗体でプローブ化した結果を示す図である。　fは、HepG2細胞（WT）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO）、又はGREB1とSmad2/3を組み合わせてノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO/Smad2/3 KO）を二次元培養（プラスチックディッシュで培養）し、細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。 aは、野生型HepG2細胞（コントロール）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞にGREB1を発現させた細胞（GREB1KO/GREB1）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞にGREB1ΔNLSを発現させた細胞（GREB1KO/GREB1ΔNLS）、又はGREB1とSmad2/3を組み合わせてノックアウトした細胞（GREB1 KO/Smad2/3 KO）をマウスの皮下に移植し、移植28日後に異種移植腫瘍片の外観と重量を測定した結果を示す図である。　bは、GFP又はGFP-GREB1を発現するHepG2細胞にコントロールASO又は各GREB1 ASOをトランスフェクトして、三次元マトリゲル中で培養を行い、培養後の細胞をファロイジン及びHoechst33342で染色してスフェアの面積を求めた結果を示す図である。　cは、HepG2細胞を含むマトリゲルをヌードマウスの肝臓に移植し、移植から3日後からコントロールASO、GREB1 ASO-6921、又はGREB1 ASO-7724を週に2回皮下投与し、移植から2７日目の肝臓の腫瘍の外観を観察し、腫瘍重量を求めた結果を示す図である。　dは、前記各肝臓の腫瘍の切片を、抗Ki-67抗体及びヘマトキシリンで染色し、ヘマトキシリン陽性細胞（全細胞）数に対するKi-67陽性細胞の割合を求めた結果を示す図である。　eは、前記各肝臓の腫瘍の切片を、抗cleaved-caspase3抗体及びヘマトキシリンで染色し、ヘマトキシリン陽性細胞（全細胞）数に対するcleaved-caspase3陽性細胞の割合を求めた結果を示す図である。　fは、前記各肝臓の腫瘍中のGREB1及びPAI-1のmRNA量をリアルタイムPCRで分析した結果を示す図である。 aは、HepG2細胞にコントロールASO又は各GREB1 ASOをトランスフェクトし、その細胞溶解液を、抗GREB1抗体及び抗HSP90抗体でプローブ化した結果である。　bは、HepG2細胞を含むマトリゲルをヌードマウスの肝臓に移植し、移植から3日後からコントロールASO、GREB1 ASO-6921、又はGREB1 ASO-7724を週に2回皮下投与し、移植から27日目に肝臓の非腫瘍部分をサンプルとして、その切片を抗cleaved caspase3抗体及びヘマトキシリンで染色し、cleaved caspase3陽性細胞の割合を求めた結果を示す図である。　cは、ΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Met（BYM）をマウスへ導入し、導入から3日後からコントロールASO、マウスGREB1を標的としたASO（mGREB1 ASO-5715）を週に2回皮下投与し、移植から6～7週間後の肝臓の腫瘍の外観を観察し、肝臓の重量の全体重に対する比率を求めた結果を示す図である。　dは、前記各肝臓の腫瘍中のGREB1 mRNA量をリアルタイムPCRで分析した結果を示す図である。 Ａは、DepMap portalを用いてThe Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)から得られた、がん細胞株におけるGREB1 mRNA発現量を示す散布図である。　Ｂは、各がん細胞の溶解液を抗GREB1抗体及び抗GAPDH抗体でプローブ化した結果を示す図である。　Ｃは、神経芽腫組織の標本（n=13）を抗GREB1抗体、抗β-カテニン抗体、及びヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す図、並びに腫瘍病変部位の総面積に対してGREB1又はβ-カテニンの免疫染色によって染色された面積の割合３つのカテゴリー(<5%、5-30%、及び30-95%)に分類した結果を示す図である。Ｄは、Ｃにおける免疫組織学的分析の結果に基づいて、GREB1とβ-カテニンのタンパク質量の関係を分析した結果を示す表である。Ｅは、コントロールASO又はGREB1 ASOをトランスフェクトしたCHP212細胞を二次元培養（プラスチックディッシュで培養）し、細胞数（平均値± SD）を経時的に測定した結果を示す図である。 Ａは、肝細胞がん組織の標本（n=210）を抗GREB1抗体、抗β-カテニン抗体、及びヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す図である。　Ｂは、Ａにおける免疫組織学的分析の結果に基づいて、GREB1とβ-カテニンのタンパク質量の関係を分析した結果を示す表である。　Ｃは、各がん細胞の溶解液を抗GREB1抗体及び抗GAPDH抗体でプローブ化した結果を示す図である。　Ｄは、コントロールsiRNA又はβ-カテニン siRNAをトランスフェクトした各細胞の溶解液を抗GREB1抗体、抗β-カテニン抗体、及び抗GAPDH抗体でプローブ化した結果を示す図である。　Ｅは、コントロールsiRNA又はGREB1#2 siRNAをトランスフェクトしたHep3B細胞又はJHH7細胞を二次元培養（プラスチックディッシュで培養）し、細胞数を経時的に測定した結果を示す図である。　Ｆは、Hep3B細胞（Control KO）及びGREB1をノックアウトしたHep3B細胞（GREB1 KO）をヌードマウス(n=6)に皮下移植した結果であり、左図は移植から45日後に摘出された異種移植腫瘍の代表的な外観、中図は腫瘍サイズの経時変化、右図は45日後の腫瘍重量を測定した結果である。　Ｇは、JHH7細胞（Control KO）及びGREB1をノックアウトしたJHH7細胞（GREB1 KO）をヌードマウス(n=6)に皮下移植した結果であり、左図は移植から14日後に摘出された異種移植腫瘍の代表的な外観、中図は腫瘍サイズの経時変化、右図は14日後の腫瘍重量を測定した結果である。**P < 0.01; *P < 0.05. Ａは、各細胞の溶解液を抗GREB1抗体及び抗HSP90抗体でプローブ化した結果を示す図である。　Ｂの左図は、ヒトGREB1のアイソフォームの模式図（図中、aaはアミノ酸の略記）である。Ｂの右図は、TCGA SpliceSeq (http://projects.insilico.us.com/TCGASpliceSeq)を用いたTCGAデータセットから得られた、乳がん及び皮膚悪性黒色腫におけるヒトGREB1遺伝子の平均エクソン発現量（OPKM；Observations Per Kilobases of exon/splice per Million aligned reads）を示す図である。　Ｃは、'R2: genomics analysis and visualization platform (http://r2.amc.nl)'を用いたTCGAで得られた皮膚悪性黒色腫のデータセットにおいてGREB1発現と相関が認められた上位10個の遺伝子のリストを示す表である。RはPearsonの相関係数、*はMITFの既知の下流標的遺伝子を示す。　Ｄは、皮膚悪性黒色腫の標本を抗GREB1抗体、抗MITF抗体、及びヘマトキシリンで免疫染色した結果を示す図である。　Ｅは、CLO679細胞（コントロール）及びMITFをノックアウトしたCLO679細胞（MITF KO）を抗GREB1抗体、抗MITF抗体、及び抗クラスリン抗体でプローブ化した結果を示す図である。　Ｆは、コントロールsiRNA又はGREB1 siRNAをトランスフェクトしたSKMEL28細胞を二次元培養（プラスチックディッシュで培養）し、細胞数（平均値± SD）を経時的に測定した結果を示す図である。Ｇは、コントロールASO又はGREB1 ASOをトランスフェクトしたSKMEL28細胞を二次元培養（プラスチックディッシュで培養）し、細胞数（平均値± SD）を経時的に測定した結果を示す図である。
１．ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍の治療剤
　本発明の治療剤は、性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍の治療に使用される医薬であって、有効成分としてGREB1の発現を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の治療剤について詳述する。
［有効成分］
　本発明の治療剤では、有効成分として、GREB1の発現を抑制する物質を使用する。GREB1は、性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍細胞においてWnt/β-カテニンシグナルやMITFの標的遺伝子になり、遺伝子増幅することもあり、当該腫瘍細胞の増殖を亢進させる作用がある。本発明の治療剤では、GREB1の発現を抑制することによって、当該腫瘍の増殖を効果的に抑制させることが可能になっている。
　GREB1のアミノ酸配列及び塩基配列についても公知である。例えば、ヒトGREB1（isoform a）のアミノ酸配列は配列番号１、ヒトGREB1（isoform a）のmRNAの塩基配列は配列番号２、ヒトGREB1（isoform a）をコードするcDNAの塩基配列は配列番号３として知られている。
　本発明において、「GREB1の発現を抑制する物質」としては、薬学的に許容され、且つGREB1をコードするDNA（GREB1遺伝子）からGREB1の発現を抑制できることを限度として特に制限されない。GREB1の発現を抑制する物質は、GREB1遺伝子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾等のいずれの段階でGREB1の発現に対する抑制作用を発揮するものであってもよい。GREB1の発現を抑制する物質として、具体的には、デコイ核酸等のGREB1遺伝子の転写を抑制する核酸分子；siRNA、shRNA、dsRNA等のGREB1のmRNAに対してRNA干渉作用を有するRNA分子又はその前駆体；miRNA、アンチセンス核酸（アンチセンスDNA、アンチセンスRNA）、リボザイム等のGREB1のmRNAの翻訳を抑制する核酸分子等の核酸医薬が挙げられる。これらの核酸分子は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの核酸分子の塩基配列は、GREB1遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者が公知の手法により適宜設計することができる。
　これらの核酸分子の中でも、臨床応用への容易性等の観点から、好ましくは、siRNA、shRNA、dsRNA、アンチセンス核酸、及びリボザイム、更に好ましくはsiRNA、shRNA及びアンチセンス核酸が挙げられる。
　また、前記核酸分子は、ヌクレアーゼ等に対する耐性を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、２’－フルオロ化、２’－Ｏ－メチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化、ホスホロチオエート等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。更に、前記核酸分子には、ＲＮＡ分子及び／又はＤＮＡ分子の一部に人工核酸（架橋型核酸、ペプチド核酸、ロックド核酸等）が導入されているものであってもよい。
　例えば、架橋型核酸の好適な例としては、以下の一般式(1)に示す構造を有するヌクレオチドが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　一般式(1)において、Baseは、塩基配列に対応する塩基であり、具体的には置換基で置換されていてもよいプリン-9-イル基又は2-オキソ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基を示す。当該置換基としては、具体的には、水酸基、炭素数1～6の直鎖アルキル基、炭素数1～6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1～6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1～6の直鎖アルキルアミノ基、及びハロゲン原子等が挙げられる。
　また、一般式(1)におけるBaseとして、具体的には、塩基がA（アデニン）の場合であれば、置換基で置換されていてもよい6-アミノプリン-9-イル基；塩基がG（グアニン）の場合であれば、置換基で置換されていてもよい2-アミノ-6-ヒドロキシプリン-9-イル基；塩基がC（シトシン）の場合であれば、置換基で置換されていてもよい２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル基（例えば、4-アミノ-5-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基(5-メチルシトシン-1-イル基、2'-O-メチルシトシン-1-イル基等が含まれる)；塩基がT（チミン）の場合であれば、置換基で置換されていてもよい2-オキソ-4-ヒドロキシ-5-メチル-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基が挙げられる。
　一般式(1)において、Rは、水素原子、分岐又は環を形成していてもよい炭素数1～7のアルキル基、分岐股は環を形成していてもよい炭素数2～7のアルケニル基、置換基を有していてもよく、且つヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3～12のアリール基、置換基を有していてもよく、且つヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3～12のアリール部分を有するアラルキル基を表す。当該アリール基又はアラルキル基に含まれ得る置換基としては、具体的には、水酸基、炭素数1～6の直鎖アルキル基、炭素数1～6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数1～6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1～6の直鎖アルキルアミノ基、及びハロゲン原子等が挙げられる。Rとして、好ましくは、水素原子、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、股はベンジル基が挙げられ、更に好ましくは水素原子又はメチル基、特に好ましくはメチル基が挙げられる。本明細書において、一般式(1)におけるRがメチル基である2',4'-架橋型ヌクレオチドは「AmNA」と表記することがある。
　また、架橋型ヌクレオチドの他の例としては、以下の一般式(2)に示す構造を有するヌクレオチドが挙げられる。当該ヌクレオチドは、グアニジン架橋型核酸とも称される公知の2',4'-架橋型ヌクレオチドである（国際公開第2014/046212号）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　一般式(2)において、Baseは、前記一般式(1)におけるBaseと同様である。一般式(2)において、Ｒ1、Ｒ12、及びＲ13は、同一又は異なって、水素原子、分岐又は環を形成していてもよい炭素数１～７のアルキル基を示し、Ｒ14は、水素原子を示す。
　また、架橋型ヌクレオチドの他の例としては、以下の一般式(3)に示す構造を有するヌクレオチドが挙げられる。当該ヌクレオチドは、スピロシクロプロパン架橋型核酸とも称される公知の2',4'-架橋型ヌクレオチドである（国際公開第2015/125783号）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　一般式(3)において、Baseは、前記一般式(1)におけるBaseと同様である。また、一般式(3)において、Ｒ21及びＲ22は、同一又は異なって、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１～７のアルキル基；又はヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、或はＲ21及びＲ22は一緒になって、基－（ＣＨ2）n－［式中、ｎは２～５の整数］である。
　また、架橋型ヌクレオチドの他の例としては、以下の一般式(4)又は(4')に示す構造を有するヌクレオチドが挙げられる。当該ヌクレオチドは、エチレンオキシ架橋型核酸とも称される公知の2',4'-架橋型ヌクレオチドである（国際公開第2016/017422号）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　一般式(4)及び(4')において、Baseは、前記一般式(1)におけるBaseと同様である。また、一般式(4)及び(4')において、X3は酸素原子又は硫黄原子を示す。
　一般式(4)及び(4')において、R31及びR32は、同一又は異なって、水素原子；水酸基；分岐又は環を形成していてもよい炭素数１～７のアルキル基；分岐又は環を形成していてもよい炭素数１～７のアルコキシ基；又はアミノ基を示す。また、一般式(4)の場合には、R31及びR32は一緒になって、基＝C（R35）R36［式中、R35及びR36は、同一又は異なって、水素原子、水酸基、メルカプト基、アミノ基、炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルコキシ基、炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１～６のシアノアルコキシ基、或は炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキルアミノ基を示す］を形成していてもよい。
　一般式(4)及び(4')において、R33は、水素原子、分岐又は環を形成していてもよい炭素数１～７のアルキル基、分岐又は環を形成していてもよい炭素数１～７のアルコキシ基、又は炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキルチオ基を示す。
　一般式(4)において、R34は、水素原子、分岐又は環を形成していてもよい炭素数１～７のアルキル基、分岐又は環を形成していてもよい炭素数１～７のアルコキシ基、又は炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキルチオ基を示す。
　更に、架橋型ヌクレオチドの他の例としては、例えば、以下に示す構造が挙げられる。下記構造式中のBase及びRは、前記一般式(1)におけるBase及びRと同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本発明で使用される核酸分子において、化学修飾は、一部のヌクレオチド及び／又はヌクレオシド間の結合部分に施されていてもよく、また全てのクレオチド及び／又はヌクレオシド間の結合部分に施されていてもよい。
　本発明で使用される核酸分子がアンチセンス核酸である場合、化学修飾の好適な例として、少なくとも1個、好ましくは1～10個、より好ましくは2～8個、更に好ましくは2～6個、特に好ましくは５個の2',4'-架橋型ヌクレオチドを含んでいることが挙げられる。また、2',4'-架橋型ヌクレオチドを含む場合の好適な例として、5'末端側から1～3番目及び3'末端側から2及び3番目のヌクレオチドが2',4'-架橋型ヌクレオチド（好ましくはAmNA）であることが挙げられる。
　また、本発明で使用される核酸分子に施される化学修飾の好適な例として、ヌクレオシド間の結合部分の少なくとも1個がホスホロチオエート結合であることが挙げられる。また、ホスホロチオエート結合を含む場合の好適な例として、ヌクレオシド間の結合部分の総数100％当たり、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上、特に好ましくは100％（全てのヌクレオシド間の結合部分）がホスホロチオエート結合であることが挙げられる。
　本発明で使用される核酸分子がヒトGREB1に対するsiRNAである場合、その具体例としては、配列番号４に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号５に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖を含むsiRNA；及び配列番号６に示す塩基配列からなるセンス鎖と配列番号７に示す塩基配列からなるアンチセンス鎖を含むsiRNAが挙げられる。なお、配列列番号４～６において、１～１９位はRNA鎖であり、２０及び２１位はオーバーハング（デオキシチミジン）である。
　また、本発明で使用される核酸分子がヒトGREB1に対するアンチセンス核酸（アンチセンスDNA、ASO）である場合、その具体例としては、下記配列Ａ～Ｄからなる化学修飾ASOが挙げられる。
5(Y)^G(Y)^A(Y)^a^t^g^g^c^a^g^g^a^5(Y)^A(Y)^g（配列Ａ：実施例においてASO-6434として使用）
G(Y)^T(Y)^5(Y)^t^g^t^t^t^c^a^a^g^T(Y)^A(Y)^a（配列Ｂ：実施例においてASO-6921として使用）
T(Y)^5(Y)^T(Y)^a^g^t^t^c^t^c^a^t^5(Y)^A(Y)^a（配列Ｃ：実施例においてASO-6968として使用）
A(Y)^T(Y)^T(Y)^g^a^g^g^g^t^a^g^g^5(Y)^A(Y)^a（配列Ｄ：実施例においてASO-7724として使用）
　前記配列Ａ～Ｄにおいて、「G(Y)」はAmNA（前記一般式(1)においてRがメチル基である2',4'-架橋型ヌクレオチド）の構造のグアニン、「A(Y)」はAmNAの構造のアデニン、「T(Y)」はAmNAの構造のチミン、「5(Y)」はAmNAの構造の5-メチルシトシン、小文字の「ａ、t、ｃ、ｇ」はそれぞれ非修飾型DNA、及び「^」はホスホロチオエート結合を示す。
　また、本発明で使用される核酸分子がマウスGreb1に対するshRNAである場合、当該shRNAをコードしているDNAの具体例としては、配列番号８に示す塩基配列が挙げられる。
　また、本発明で使用される核酸分子がRNA分子である場合は、生体内で生成し得るようにデザインされたものであってもよい。具体的には、当該RNA分子をコードしているDNAを哺乳動物細胞用の発現ベクターに挿入したものであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミド等が挙げられる。
［対象疾患］
　GREB1は、性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍細胞において特異的に発現し、当該腫瘍細胞の増殖を亢進させているので、本発明の治療剤では、GREB1の発現を抑制することにより、当該腫瘍細胞の増殖抑制が可能になっている。従って、本発明の治療剤はホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍の治療に使用される。
　本発明において、GREB1陽性腫瘍とは、GREB1の発現が認められる腫瘍細胞によって形成されている腫瘍を指す。GREB1陽性腫瘍であるか否かは、採取した腫瘍病変組織に対して組織免疫することによって確認することができる。具体的には、採取した腫瘍病変組織に対して、抗GREB1抗体を用いて免疫染色し、腫瘍病変部位においてGREB1の発現が認められる領域が5％以上存在する場合には、GREB1陽性と判断される。本発明の治療剤の治療対象となる腫瘍の好適な例として、好ましくは、腫瘍病変部位においてGREB1の高発現領域が20％以上存在する腫瘍、特に好ましくは、腫瘍病変部位においてGREB1の高発現領域が50％以上存在する腫瘍が挙げられる。
　また、GREB1陽性腫瘍であるか否かについては、採取した腫瘍組織からRNAを回収し、定量的PCRによって測定することもできる。この場合、GREB1の発現の有無の判定は、同一症例の腫瘍と同組織の非腫瘍部位を指標として行えばよい。具体的には、腫瘍組織の細胞溶解液におけるGREB1量が、同一症例の腫瘍と同組織の非腫瘍部位の細胞溶解液におけるGREB1量よりも多い場合には、当該腫瘍ではGREB1陽性であると判断される。
　また、本発明において、性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍（ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍）とは、「エストロゲンやアンドロゲンのような性ホルモンの刺激によってホルモン受容体を介してGREB1の発現が亢進し、増殖が促進される特性」を有さないGREB1陽性腫瘍細胞によって形成されている腫瘍を指す。性ホルモン感受性GREB1陽性腫瘍としては、例えば、エストロゲンによって増殖が促進される腫瘍として乳がん及び卵巣がん、アンドロゲンによって増殖が促進される腫瘍として前立腺がん等があり、これらの腫瘍は、本発明において治療対象からは除外される。
　本発明において、治療対象となる性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍としては、具体的には、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫（メラノーマ）、神経芽腫、小細胞肺がん等が挙げられる。
　また、本発明の治療剤は、ヒトのみならず、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヤギ、ラット、マウス、ウサギ等の哺乳動物に対して使用できるが、ヒト用の医薬品として好適に使用される。
［投与態様］
　本発明の治療剤の投与形態については、抗腫瘍効果が得られることを限度として、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよく、使用する有効成分の種類に応じて適宜設定すればよい。具体的には、本発明の治療剤の投与形態として、注射投与（静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、患部への局所注射等）、座薬投与等の非経口投与が挙げられる。
　本発明の治療剤の投与量については、使用する有効成分の種類、投与形態、適用対象となる性ホルモン非感受性GREB1陽性腫瘍の進行の程度等に応じて治療有効量を適宜設定すればよい。例えば、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、核酸分子の１回量として、通常0.1mg/kg体重～100mg/kg体重程度を3～7日間に１回程度の頻度で投与すればよい。
　本発明の治療剤は、単独で使用してもよいが、１種又は２種以上の抗腫瘍作用を有する他の薬剤及び／又は放射線療法と併用してもよい。
［製剤形態］
　本発明の治療剤は、有効成分の種類や投与形態に応じた製剤形態に調製される。本発明の抗腫瘍剤の製剤形態としては、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤等の液状製剤等が挙げられる。
　また、本発明の治療剤は、その製剤形態に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。
　また、本発明の治療剤において、有効成分として核酸分子を使用する場合であれば、当該核酸分子が腫瘍細胞内に移行され易いように、核酸導入補助剤と共に製剤化されていることが望ましい。核酸導入補助剤としては、具体的には、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、ＲＮＡｉフェクト、リポソーム、ポリアミン、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー等が挙げられる。
２．肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫の検査方法
　本発明の検査方法は、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫の罹患の有無を予測するための検査方法であって、被験者から採取された肝臓組織、皮膚組織、又は神経組織において、GREB1の発現量を測定する工程を含むことを特徴とする。本発明によれば、被験者から採取された肝臓組織、皮膚組織、又は神経組織中のGREB1の発現量を指標とすることにより、被験者が肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫に罹患しているか否かを診断することが可能になる。
　肝芽腫又は肝細胞がんを検査対象とする場合、腫瘍性肝疾患が疑われる被験者から採取された肝臓組織におけるGREB1の発現量を測定すればよい。肝芽腫は小児の肝臓に発症する悪性腫瘍であるので、肝芽腫の検査対象となる被験者として、好ましくは腫瘍性肝疾患が疑われる小児が挙げられる。
　悪性黒色腫を検査対象とする場合、腫瘍性皮膚疾患が疑われる被験者から採取された皮膚組織におけるGREB1の発現量を測定すればよい。
　神経芽腫を検査対象とする場合、腫瘍性神経疾患が疑われる被験者から採取された神経組織におけるGREB1の発現量を測定すればよい。神経芽腫は小児に発症し易い悪性腫瘍であるので、本発明の検査方法において、神経芽腫の検査対象となる被験者として、好ましくは腫瘍性神経疾患が疑われる小児が挙げられる。
　被験者から採取された各腫瘍組織中のGREB1の発現量を測定するには、採取した組織片（病変組織片）に対して組織免疫することによって確認することができる。具体的には、採取した腫瘍組織片に対して、抗GREB1抗体を用いて免疫染色し、腫瘍が疑われる領域においてGREB1の発現が認められる領域が5％以上存在する場合には、GREB1が発現量していると判断される。また、腫瘍が疑われる領域においてGREB1の発現が認められる領域が20％以上存在する場合には、GREB1の発現量が多いと判断され、腫瘍が疑われる領域においてGREB1の発現が認められる領域が50％以上存在する場合には、GREB1の発現量が特に多いと判断される。
　また、被験者から採取された各腫瘍組織中のGREB1の発現量は、当該組織片（病変組織片）からRNAを回収し、定量的PCRによって測定することもできる。この場合、GREB1の発現量は、同一症例の腫瘍と同組織の非腫瘍部位を指標として行えばよい。具体的には、腫瘍が疑われる部位の細胞溶解液におけるGREB1量が、同一症例の非腫瘍部位の細胞溶解液におけるGREB1量よりも多い場合には、GREB1が発現していると判断される。
　本発明の検査方法において、前記各腫瘍組織中のGREB1の発現量が多い程、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫に罹患している可能性が高いと推測される。
　更に、本発明は、前記検査方法を行うための検査試薬として、GREB1を検出するための試薬を提供する。
　GREB1を検出するための試薬としては、例えば、抗GREB1抗体、及びその断片等が挙げられる。抗GREB1抗体には、必要に応じて、ビオチン、蛍光標識、磁気ビーズ等によって標識化されていてもよい。
　また、GREB1を検出するための試薬の他の例としては、例えば、GREB1 cDNA又はGREB1 mRNAとハイブリダイズできるプライマーが挙げられる。GREB1を検出するための試薬として当該プライマーを使用する場合、本発明の検査試薬には、当該プライマーの他に、PCRを行うために必要な試薬が含まれていてもよい。
　以下、実験データに基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　なお、以下、試験に使用した細胞について「Xを発現する細胞」等の形式で表記することがあるが、「Xを発現する細胞」とは、タンパク質Xがトランスフェクトされ、人為的にタンパク質Xが発現するように形質転換された細胞を意味する。例えば、「GFP-GREB1を発現するX293T細胞」とは、タンパク質GFP-GREB1がトランスフェクトされ、GFP-GREB1が過剰発現するように形質転換されたX293T細胞を意味する。
　また、以下、タンパク質について「A-B」(例えば、GFP-GREB1等)という形式で表記することがあるが、当該タンパク質はペプチドＡにペプチドＢが融合しているタンパク質を意味する。
　なお、以下の試験で使用した各種タンパク質をトランスフェクションした細胞は、公知の遺伝子工学的手法に従って作製した。
１．試験材料及び方法
１－１．細胞及び抗体
　HepG2細胞、CHP212細胞、及びSKNDZ細胞は、American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)より購入した。MCF7細胞、HLE細胞、Huh7細胞、HLF細胞、NBTU110細胞、SKMEL28細胞、Mewo細胞、G361細胞、及びCOLO679細胞は、Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB, 大阪, 日本)より購入した。また、Lenti-XTM293T (X293T)細胞は、タカラバイオ株式会社（日本）から購入した。Huh6細胞は、Dr. H. Okuyama （大阪大学、日本）から提供されたものを使用した。SNU387細胞、SNU449細胞、BMEL細胞、及びHepG2細胞は、Dr. T. Kodama（大阪大学、日本）から提供されたものを使用した。
　HepG2細胞は、10％ウシ胎児血清(FBS)、非必須アミノ酸とglutamaxを含むEagle’s minimum essential medium (EMEM)培地で増殖させた。HLE細胞、Huh6細胞、X293T細胞、Huh7細胞、SNU387細胞、SNU449細胞、及びHLF細胞は、10％ FBSを含むDulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)で増殖させた。MCF7細胞は、10% FBS、非必須アミノ酸及び1 mMピルビン酸ナトリウムを含むDMEMで増殖させた。BMEL細胞は、10% FBS、2.5 mM L-glutamine、0.5 mM soudium pyruvate、50 ng/ml EGF、30 ng/ml IGF-II、及び10 μg/ml insuliinを含むDMEM/F12培地で増殖させた。SKMEL28細胞、Mewo細胞、及びG361細胞は、10% FBS及び非必須アミノ酸及を含むEMEMで増殖させた。CHP212細胞、及びSKNDZ細胞は、10% FBS及び非必須アミノ酸及を含むDMEMで増殖させた。OLO679細胞は、10% FBS及び2 mM L-glutamineを含むRPMI 1640 (RPMI) で増殖させた。
　抗GREB1抗体（マウスモノクローナル）、抗リン酸化ヒストンH3（ser10）抗体、及び抗アセチルヒストンH4抗体は、Merck Millipore (Billerica, MA, USA)から購入した。抗HSP90抗体、抗CyclinA抗体、抗CyclinB抗体、抗Smad2/3抗体（マウスモノクローナル）、抗β-カテニン抗体、及び抗クラスリン抗体は、BD Biosciences (San Jose, CA, USA)から購入した。抗GREB1抗体(ラビットポリクローナル)、抗Smad4抗体、抗p300抗体、抗GFP体（マウスモノクローナル）は、Santa Cruz Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)から購入した。抗Smad 2/3抗体（ラビットモノクローナル）、抗リン酸化SMAD2 (Ser465/467)/SMAD3 (Ser423/425)抗体、抗cleaved caspase3抗体、抗PARP1抗体、 抗HystoneH3抗体、抗YAP1抗体（ラビットモノクローナル）、抗Ki67抗体（ラビットモノクローナル）、抗c-Myc抗体（ラビットモノクローナル）、抗Smad2/3（ラビットモノクローナル ウェスタンブロッテイング用）、抗Axin2抗体、及び抗MITF抗体（ウェスタンブロッテイング用）は、Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)から購入した。抗β-チューブリン抗体、抗β-アクチン抗体、抗リン酸化β-カテニン（pTyr654）抗体、及び抗MITF抗体（免疫組織染色用）は、Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)から購入した。抗GFP抗体（ウサギポリクローナル）は、Life Technologies/Thermo Fisher Scientific (Carlsbad, CA, USA)から購入した。抗Smad2/3抗体（ラビットモノクローナル）はAbcam (Cambridge, UK)から購入した。抗FLAG抗体、及び抗GAPDH抗体はWAKO (Tokyo, Japan)から購入した。抗マウスDLK1抗体（ラビットモノクローナル）はR&D Systems (Minneapolis, MN, USA)から購入した。
１－２．RNA配列解析
　TruSeq Stranded mRNA Sample Prep kit (Illumina, San Diego, CA)を用いて、コントロールsiRNA又はβ-カテニン siRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞のライブラリーを作製した。Illumina HiSeq 2500 platformにて、75-base single-endモードで、配列解析を行った。ベースコールは、CASAVA 1.8.2 software (Illumina)を用いて行った。Bowtie2 ver. 2.2.3とSAMtools ver. 0.1.19を組み合わせて、TopHat v2.0.13を使用して、ヒト参照ゲノム配列（hg19）にマッピングし、配列解読を行った。Cuffnorm version 2.2.1を用いて、百万個のフラグメントがマッピングされたエクソン1キロベース当たりのフラグメント数（FPKMs）を計算した。
　全23,284の遺伝子の中で、正規化されたFPKM値で3.0よりも大きい遺伝子として8,929の遺伝子を抽出した。β-カテニンノックダウン細胞では、コントロール細胞と比較して、76遺伝子で3倍以上ダウンレギュレートされていた（P <0.001 [ウェルチのt検定]）。GREB1に対する結合ピークをENCODE Transcriptio Factor Binding Site Profiles resource (http://amp.pharm.mssm.edu/Harmonizome/gene#set/TCF7L2#HepG2#hg19#1/ENCODE+Transcri tion+Factor+Binding+Site+Profiles)からTCF7L2#HepG2#hg19#1 geneset (465 genes)としてダウンロードした。最終的にダウンレギュレートされた遺伝子11個を見出した。
１－３．オープンソース・クリニカルデータ解析
　がん患者のクリニカルデータは、ウェブサイト‘depmap portal (https://depmap.org/portal/)’、TCGA SpliceSeq (http://projects.insilico.us.com/TCGASpliceSeq)、及び'R2: Genomics Analysis and Visualization Platform (http://r2.amc.nl)'から得られるThe Cancer Genome Atlas (TCGA) datasetsを用いて、分析及び取得した。全ての遺伝子発現のデータ、P値、及びｒ値をダウンロードした。
１－４．患者及びがん組織
　2008年1月～2015年3月の間に大阪大学医学部付属病院にて外科的処置を受けた肝芽腫患者から得られた肝芽腫組織（n=11）を本試験に使用した。患者の年齢は、0～16歳（中央値は3歳）である。
　また、大阪大学医学部付属病院にて外科的処置を受けた患者の神経芽腫組織（13名）及び皮膚悪性黒色腫組織（50名）、及び神戸学医学部付属病院にて外科的処置を受けた患者210名の肝細胞がん(HCC)組織（ステージI～IV）についても、本試験に使用した。
　切除した標本を肉眼で観察し、腫瘍の局在部位とサイズを測定し、標本を10容量％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋ブロックを作製し組織学的分析を行った。試験に使用した標本は、4μmの厚みに切片化して、ヘマトキシリン、エオシン（H&E）、免疫ペルオキシダーゼ、免疫アルカリフォスファターゼ等で染色し、各分析に供した。
　後述する２－１～２～８の項に示す試験は、大阪大学医学部倫理審査委員会の承認（No. 13552）の下で行った。また、後述する２－９～２～１１の項に示す試験は、ヘルシンキ宣言に従い、大阪大学医学部倫理審査委員会の承認（No. 13455, 19292）及び神戸大学医学部倫理審査委員会の承認(No. B190073)の下で行った。全ての患者から書面によるインフォームドコンセント得た。
１－５．HTVi（hydrodynamic tail vein injection）による腫瘍形成の評価
　Greb1 shRNA#3（配列番号８）(20 μg)又はコントロールとpLIVE-SB13 (8 μg)の存在下、pT2BH-YAPS127A (20 μg)、pT2BH-ΔN90βカテニン-mutLuc3 (20 μg)、pT3-EF1a-cMET (20 μg)、及びGFP2ALucを、生理食塩水2.5 mlに希釈し、8～9週齢のold wild-type C57BL6/N雄マウスの尾静脈に5～7秒以内で注射した。肝臓を、注射後の一定時間（又は罹患時）に採取して、腫瘍形成に関する種々のパラメーターを調べた。なお、具体的手法は、Tao, J. et al., (2014). Gastroenterology 147, 690-701.及びTward, A. D. et al, (2007). Proc Natl Acad Sci U S A 104, 14771-14776を参照した。なお、ΔN90βカテニンとはヒトβ-カテニンの1～90位のアミノ酸を欠失させたβカテニン変異体であり、YAPS127AとはYAPの127位のセリンをアラニンに置換したYAP変異体である。
１－６．GREB1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製
　AmNAモノマーを含み、ホスホチオエート化された15-merのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASOs）を準備した（GeneDesign (Ibaraki, Japan)によって合成）。合成したASOsの配列は、表８及び９に示す通りである。なお、本明細書において、「hGREB1-6424-AmNA(15)」は、単に「ASO-6424」又は「GREB1 ASO-6424」と略記する。他のASOsについても同様に略記する。RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を使用して、HepG2又はCOLO679細胞を10 nMのASOsでトランスフェクトした。実験には、トランスフェクトから36～48時間後の細胞を使用した。
１－７．in vivo ASO処理による異種移植肝腫瘍形成アッセイ
　HepG2細胞のペレット(1×107 cells)を100μlの高濃度マトリゲル(Corning)中に懸濁させ、8週齢の雄BALB/cAJcl-nu/nu mice (nude mice; CLEA Japan)に麻酔下で肝臓に直接注射し移植した。0日目から週2回の頻度で、ASO (50 μg/body;約2.5 mg/kg)を皮下投与した。移植から27日後にマウスを安楽死させ、腫瘍を回収し、組織学的分析に供した。
１－８．siRNAによるタンパク質のノックダウン
　siRNAを用いた分析において、使用したsiRNAの塩基配列は、表１に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　RNAiMAX(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)を用いてHepG2細胞、Huh6細胞、Hep3B細胞、JHH7細胞、及びSKMEL28細胞に、各siRNA (10 nm)をトランスフェクトした。実験には、トランスフェクトから48～120時間後の細胞を使用した。
１－９．免疫組織化学的分析
　組織標本の免疫組織化学的染色は、DakoRealTMEnVisionTM Detection System (Dako, Carpentaria, CA, USA)及びWarp Red？ Chromogen Kit (Biocare Medical, Concord, CA, USA)を用いて、製造元の推奨する方法に従って行った。具体的には、decloaking chamber (Biocare Medical, Walnut Creek, CA, USA)を用いて、組織標本の抗原賦活化を行った。次いで、内在性ペルオキシダーゼ活性を3% H2O2-メタノールで15分間ブロックし、次いで切片をヤギ血清と共に1時間インキュベートして、非特異的抗体結合部位をブロックした。その後、組織標本にマウス抗GREB1抗体（1：100）、マウス抗β-カテニン抗体（1：100）又はラビット抗YAP1抗体（1：100）を添加して4℃で16時間インキュベートし、次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウスIgG又はヤギ抗ラビットIgGで1時間インキュベートした。色素原としてジアミノベンジジン（DAB）（Dako）を用いて、組織切片に結合しているマウス抗GREB1抗体、マウス抗β-カテニン抗体、又はラビット抗YAP1抗体を可視化した。更に、組織切片を0.1％（w/v）のヘマトキシリンで対比染色した。β-カテニン、GREB1、及びYAPの染色された領域は、3段階（<5%、5-30%、及び30-95%）で分類し、腫瘍病変領域に対して染色された領域（陽性染色）が、5％以上である腫瘍は、陽性と判定した。
１－１０．免疫蛍光染色
　ガラスカバースリップ上で増殖させた細胞を、4％（w/v）パラホルムアルデヒドを含有するPBS中で室温で10分間固定し、0.2％（w/v）Triton X-100及び2mg/mlのBSAを含むPBS中で10分間透過処理した。また、三次元培養にて増殖させた細胞を、4％（w / v）パラホルムアルデヒドを含有するPBS中で室温で30分間固定し、0.5％（w/v）Triton X-100及び40mg/mlのBSAを含有するPBS中で30分間ブロッキングした。固定及び透過処理した細胞を一次抗体と共に室温で3時間又は4℃で終夜インキュベートし、更に製造元のプロトコール(Molecular Probes, Carlsbad, CA)に従い、二次抗体共にインキュベートして、サンプルを作製した。サンプルの分析は、LSM880レーザー共焦点顕微鏡（Carl-Zeiss、Jena、Germany）を用いて観察することによって行った。
１－１１．遺伝子発現のヒートマップによる可視化
　各遺伝子発現量の値は、GAPDH mRNAで標準化し、正常肝臓に対する比率として算出した。データをmin-max normalizationによって正規化した後に、Excel software (Microsoft, Redmond, WA, USA)を用いてカラー化したヒートマップを作製した。
１－１２．細胞増殖アッセイ
　細胞をプレートに1.0×104cells/mLとなるように播種し、12時間後に10％血清を含む培地に交換した。48時間毎に細胞数を計測しながら、最長10日間培養した。細胞数の計測は、Cyquant NF assays (Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)を用いて、製造元の推奨プロトコールに従って行った。
１－１３．定量的RT-PCR
　定量的RT-PCRでは、表２に示すプライマーを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
１－１４．複合体の形成及び免疫沈降
　HepG2細胞(直径100mmディッシュ)を、細胞溶解バッファー(10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 140 mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP40, 25mM NaF, 20mg/ml leupeptin, 20mg/ml aprotinin, and 10 mMPMSF)400μlで溶解させた。得られた溶解液を抗Smad2/3抗体で免疫沈降させ、免疫沈降物を所定の抗体でプローブ化した。
　HA-FLAG-GREB1、GFP-GREB1変異体、GFP-Smad2変異体、HA-Smad3、GFP-Smad3、GFP-Smad4、又はGFP-Smad7をトランスフェクトしたX293T細胞(直径60mmディッシュ)を、細胞溶解バッファー400μlで溶解させ、GREB1、Smad3、Smad4、及びSmad7の複合体の状態を調べた。得られた溶解液は、抗GFP抗体で免疫沈降させ、免疫沈降物を所定の抗体でプローブ化した。
　なお、本試験で使用した融合タンパク質を構成する各アミノ酸配列は、以下の通りである：HA部分のアミノ酸配列は配列番号８５；FLAG部分のアミノ酸配列は配列番号８６；GFP部分のアミノ酸配列は配列番号８７；GREB1変異体（mouse GREB1 Δ310-319 (ΔNLS)）は、マウスGREB1の310-319位を欠失させたGREB1変異体であり、その部分のアミノ酸配列は配列番号８８；GREB1変異体（mouse GREB1 1-666(N)）は、マウスGREB1の1-666位のアミノ酸配列からなるGREB1変異体であり、そのアミノ酸配列は配列番号８９；GREB1変異体（mouse GREB1 667-1333(I)）は、マウスGREB1の667-1333位のアミノ酸配列からなるGREB1変異体であり、そのアミノ酸配列は配列番号９０；GREB1変異体（mouse GREB1 1334-1954(C)）は、マウスGREB1の1334-1954位のアミノ酸配列からなるGREB1変異体であり、そのアミノ酸配列は配列番号９１；GREB1変異体（mouse GREB1 Δ667-1333(ΔM)）は、マウスGREB1の667-1333位を欠失させたGREB1変異体であり、そのアミノ酸配列は配列番号９２；human Smad2部分のアミノ酸配列は配列番号９３；human Smad2変異体（human Smad2 1-265(N)）は、ヒトSmad2の1-265位のアミノ酸配列からなるSmad2変異体であり、そのアミノ酸配列は配列番号９４；human Smad2変異体（human Smad2 266-467(C)）は、ヒトSmad2の266-467位のアミノ酸配列からなるSmad2変異体であり、そのアミノ酸配列は配列番号９５；human Smad3部分のアミノ酸配列は配列番号９６；human Smad4部分のアミノ酸配列は配列番号９７；及びhuman Smad7部分のアミノ酸配列は配列番号９８。また、他の試験でも、各融合タンパク質は、前記アミノ酸配列を組み合わせて連結したものを使用した。
１－１５．GSTプルダウンアッセイ
　リコンビナントSmad2/MH1又はリコンビナントSmad2/MH2とGREB1との結合を分析するために、HepG2細胞又はGFP-GREB1を発現するHuh6細胞の全細胞溶解液をglutathione-Sepharoseビーズに結合した20μgのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、GST-Smad2/MH1、又はGST-Smad2/MH2と1時間インキュベーションした。沈降後のビーズを細胞溶解バッファー(10 mM Tris-HCl [pH 7.4], 140 mM NaCl, 5mM EDTA, 1% NP40, 25mM NaF, 20mg/ml leupeptin, 20mg/ml aprotinin, and 10 mMPMSF)で3回洗浄し、得られた沈降物を抗GREB1抗体又は抗GFP抗体でプローブ化した。
　なお、本試験で使用した融合タンパク質を構成する各アミノ酸配列は、以下の通りである：GST部分のアミノ酸配列は配列番号９９；Smad2/MH1のアミノ酸配列は配列番号１００；Smad2/MH2のアミノ酸配列は配列番号１０１。
１－１６．エチニルウリジン(EU)による細胞の標識
　HA-FLAG-GREB1を発現又は非発現のGFP-Smad3発現細胞に対して、1 mMのEUで30分間処理した後に、固定化し、Click-iT RNA Alexa Fluor 594 Imaging Kit (Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA)を用いた検出を行った。
１－１７．異種移植腫瘍の形成分析
　5週齢の雄BALB/cAnNCrj-nuヌードマウス（Charles River Laboratory Japan Inc, Osaka, Japan）をメデトミジン（0.3 mg/kg体重）及びミダゾラム（4 mg/kg体重）で麻酔を行った後に、100μlの高濃度マトリゲル(Corning, NY, USA)に懸濁したHepG2細胞（7×106 cells）を背部の皮下に注入した。次いで、移植から28日後にヌードマウスを殺して、移植細胞を含む領域を測定し、免疫組織化学的分析のための処理に供した。本試験における全ての動物実験に関する全てのプロトコールは、大阪大学動物実験委員会の承認（No. 2867）の下で行った。
１－１８．異種移植皮下腫瘍形成分析
　5週齢のBALB/cAJcl-nu/nu mice (nude mice; CLEA Japan)に対してメデトミジン(0.3？mg/kg)及びミダゾラム(4？mg/kg)を組み合わせて投与して麻酔を行った。次いで、Hep3B細胞又はJHH7細胞(1×107 cells)を150 μlの高濃度マトリゲル(Corning)中に懸濁させ、マウスの皮下に移植した。移植後3日目から1週間に2回の頻度で、ASO (50 μg/body;約2.5 mg/kg)を皮下投与した。Hep3B細胞を移植したマウスは、移植から6.5週間後に安楽死させた。JHH7細胞を移植したマウスは、移植から2週間後に安楽死させた。安楽死させたマウスから腫瘍を回収し、組織学的分析に供した。本試験における全ての動物実験に関する全てのプロトコールは、大阪大学動物実験委員会の承認（No. 26-032-048)の下で行った。
１－１９．ノックアウト細胞の作製
　CRISPR Genome Engineering Resources (http://www.genome-engineering.org/crispr/)を利用して、ヒトGREB1の標的配列5’-CTTCTCGGTGTTGAAGCCGA-3’（配列番号１０２）をデザインした。pX330(addgene#42230)のBbsIサイトに所定のオリゴヌクレオチドをライゲートすることにより、hCas9及びシングルガイドRNA(sgRNA)を発現するプラスミドを作製した。Lipofectamine LTX reagent (Life Technologies/Thermo Fisher Scientific)を用いて、製造元の推奨プロトコールに従って、GREB1又はMITFを標的とするsgRNA配列及びブラストサイジン耐性を有するプラスミドpX330を、HepG2細胞、Hep3B細胞、JHH7細胞、又はCOLO679細胞に導入し、5μg/mLのブラストサイジンSを含む培地で2日間培養することによって、GREB1ノックアウト細胞又はMITFノックアウト細胞を選択した。次いで、単一のコロニーを採取し、機械的に解離させ、24ウェルプレートの個々のウェルに再度播種した。
　また、Smad2及びSmad3（Smad2/3）の二重ノックアウト細胞を作製するために、pRP[CRISPR]にhCas9及びデュアルガイドRNAsを組み込んだプラスミドをVectorBuilder Inc. (Guangzhou, China)にて設計し、合成した。ヒトSmad2に対するgRNAの標的配列として5’-TATATTGCCGATTATGGCGC-3’（配列番号１０３）、及びヒトSmad3に対するgRNAの標的配列として5’-GGAATGTCTCCCCGACGCGC-3’（配列番号１０４）をデザインした。Smad2/3を標的とするデュアルガイドRNAs配列を有するプラスミドpRP[CRISPR]をHepG2細胞に導入し、次いで、単一のコロニーを採取し、機械的に解離させ、24ウェルプレートの個々のウェルに再度播種した。
１－２０．クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイ
　10cmディッシュ中のコンフルエントなHepG2細胞を、5 ng/mlのTGFβ1の存在下又は非存在下で3時間刺激した。その後、細胞を1％ホルムアルデヒドで室温で10分間架橋させ、0.125 Mグリシンで架橋反応を停止させた。冷PBSで細胞を3回洗浄した後に、細胞を剥がして回収した。更に、細胞を遠心分離にて沈降させて、硫酸ドデシルナトリウム(SDS)溶解バッファー(50 mM Tris/HCl [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 0.5% SDS)で溶解させた。細胞溶解液に超音波処理を行うことによりDNAを剪断し、DNAのサイズを200～1000bpにした。剪断したクロマチン上澄液を、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を含むChIPdilution buffer (16.7 mM Tris/HCl [pH 8.0], 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, and 1.1% Triton X-100)で希釈し、サケ精子DNA/プロテインA-アガロースビーズ(Millipore, Billerica, MA, USA)を加えてプレクリアした。次いで、抗Tcf-4抗体、抗β-カテニン抗体、抗アセチル化ヒストンH4抗体又はネガティブコントロールIgG (Diagenode, Liege, Belgium)を加えて、4℃で12時間インキュベートした。サケ精子DNA/プロテインA-アガロースビーズに吸着した免疫複合体に対して、高塩バッファー(20 mM Tris/HCl [pH 8.0], 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% TritonX-100, and 2 mM EDTA)で1回洗浄、更にLiClバッファー(10 mM Tris/HCl [pH 8.0], 0.25 M LiCl, 1 mM EDTA, 1% deoxycholic acid, and 1% Nonidet P-40)で1回洗浄、及びTEバッファー(10 mM Tris/HCl (pH 8.0), and 1 mM EDTA)で4回洗浄を行った。次いで、溶出バッファー(50 mM Tris/HCl [pH 8.0], 10 mM EDTA, 1% SDS)中で65℃で4時間インキュベートすることにより、免疫複合体をビーズから溶出させ、脱クロスリンクを行った。次いで、サンプルにRNase Aを添加して37℃で30分間処理し、更にproteinase Kを添加して55℃で1時間処理した。そして、フェノール－クロロホルム抽出によりDNAを精製し、表３に示すプライマーを用いてPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
１－２１．プラスミドの構築、及びcDNAを有するレンチウイルスを用いたトランスフェクション
　標準的な組換えDNA技術を用いて、全長GREB1又はその各種突然変異体を有するプラスミドを設計した。NSL（nuclear localization sequence）融合GREB1変異体を作成するために、SV40 T抗原由来のNSLの3コピーをGFP-GREB1変異体のN末端に結合させた。
　Dr. H. Miyoshi (RIKEN BioResource Center, Ibaraki, Japan)から供与されたCSII-CMV-MCS-IRES2-Bsdに、GFP及びpEGFPC1-GREB1をサブクローニングすることによりレンチウイルスベクターを構築した。
　次いで、FuGENE HD transfection reagent (Roche Applied Science, Basel, Switzerland)を用いて、レンチウイルスベクターを、パッケージングベクターpCAG-HIV-gp及びpCMV-VSV-G-RSV-Revと共にX293T細胞にトランスフェクトして、レンチウイルスを作製した。また、12ウェルプレートの各ウェルに5×104 cellsのHepG2細胞を入れて、レンチウイルス及びポリブレン10μg/ mlで処理し、1200×gで30分間遠心分離した後に24時間インキュベートすることにより、GFP又はGFP-GREB1（GFPが連結しているGREB1）を安定に発現するHepG2細胞を作製した。
　pT3-EF1a-cMETは、Addgene (Cambridge, MA, USA)から購入した。pLIVE-SB13ベクターは、r. Toru Okamoto (Osaka university)から供与してもらった。pT2BH-ΔN90βカテニン-Lucは、CAGプロモーター、1-90位のアミノ酸を欠いているヒトCTNNB1配列、及びルシフェラーゼを、pT2BHベクター(Addgene)にin-fusionクローニングすることにより作製した。pT2BH-YAPS127Aは、pT2BHベクターのEcoRIサイトとNotIサイトの間に、FLAGでタグ化したヒトYAPS127Aフラグメントをインサートすることにより構築した。pT2BH-GFP2ALuc mouse Greb1 shRNAは、pT2BH-GFP2ALucのPstIサイトとHindIIIサイトの間に、U6プロモーター及び、Mission shRNA (TRCN0000216019) (Sigma-Aldrich)から増幅させたmGreb1 shRNAフラグメントをインサートすることにより構築した。
１－２２．統計分析
　各試験は、少なくとも3回実施した。統計分析は、Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA)及びGraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)を用いて行った。P値が0.05未満の場合には、統計学的に有意差があるとみなした。
２．試験結果
２－１．ヒト肝芽腫において、GREB1はWnt/β-カテニンシグナルの下流標的遺伝子である
　肝芽腫の腫瘍形成メカニズムを解明するために、エキソン3及び4でβ-カテニン遺伝子が短縮型変異（truncated mutation）を有しているHepG2肝芽腫細胞を使用して、Wnt/β-カテニンシグナルの下流新規標的遺伝子をスクリーニングした。コントロールsiRNA又はβ-カテニンに対するsiRNA（β-カテニン siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞において、RNA配列解析を行った。その結果、8929遺伝子の内、発現量が高いこと(FPKM≧3)、且つβ-カテニン siRNAをトランスフェクトした細胞（β-カテニンノックダウン細胞）において、コントロールsiRNAをトランスフェクトした細胞（コントロール細胞）よりも発現量が3倍以上低下していることを基準として、候補遺伝子として76遺伝子が選択された（図1のa参照）。更に、ENCODE Transcription Factor Binding Site Profiles (TCF7L2#HepG2#hg19#1)の遺伝子セットを用いてHepG2におけるChIP配列解析で見出されたTCF7L2 (TCF4)のDNA結合部位の存在を基準として、候補遺伝子を絞り込むと、11種の遺伝子が選択された（図1のa、及び表４参照）。図1のaの下図には、コントロール細胞とβ-カテニンノックダウン細胞において、発現量が変化している候補遺伝子のヒートマップを示している。図1のaの下図の左に示す各遺伝子は、変動した76種の候補遺伝子のうち11遺伝子をランダムに示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　NKD1、LGR5、SP5、ZNRF3、RNF43、Axin2、CCND1、及びDKK1を含む選択された候補遺伝子の殆どは、Wnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子として公知のものであった。候補遺伝子の一つであるGREB1は、エストロゲンレセプター調節経路におけるエストロゲン応答性遺伝子であり、乳がん及び前立腺がんにおけるホルモン依存性がん細胞増殖に関与することが知られているが、Wnt/β-カテニンシグナルの下流標的遺伝子となり、エストロゲン受容体が発現していないがんの腫瘍形成に関与しているか否かは従来解明されていない。そこで、GREB1に着目して更なる分析を行った。
　クロマチン免疫沈降アッセイによって、TCF4及びβ-カテニンが、ヒトのGREB1遺伝子の5'-上流領域-443～-448にあるTCF4結合部位と複合体を形成することが明らかになった（図1のb参照）。実際、βカテニンをノックダウンしたHepG2細胞において、GREB1の発現量の低下、及びタンパク質量の低下が認められた（図1のc参照）。一方、HepG2細胞をエストロゲン受容体アンタゴニストICI-182,786で48時間処理した後に、GREB1 mRNAの発現量をリアルタイムPCR分析にて測定したところ、GREB1の発現量はICI-182,786による影響を受けないことが確認された（図2のa参照）。両分化能を有するマウス胎児肝細胞(BMEL)細胞においては、β-カテニンシグナルの活性化作用を有するCHIR99021処理によってAxin2と同様にGREB1の発現が上昇した（図2のb参照）。CTNNB1（β-カテニン）遺伝子にG34V体細胞変異を有する肝芽腫細胞株であるHuh6細胞においてはβ-カテニンのノックダウンによってGREB1の発現量が減少した（図2のc参照）。Huh6はHepG2と比較してGREB1 mRNAの発現量は少なかった（図2のd参照）。エストロゲン受容体陽性の乳がん細胞株であるMCF7においては、ICI-182,786処理によってGREB1の発現は劇的に減少したが、ICI-182,786の存在下又は非存在下いずれにおいても、Wnt/β-カテニンシグナルの活性化作用を有するCHIR99021の処理によってAxin2の発現が上昇するのに対してGREB1の発現は上昇しなかった（図2のe参照）。更に、ヒト肝細胞がん細胞であるHLE、SNU-387、SNU-449、Huh7において、CHIR99021の処理によってAxin2の発現が上昇するのも対してGREB1の発現は上昇しなかった（図2のf参照）。これらの結果から、GREB1は、肝芽腫細胞又は未成熟な肝前駆細胞における特異的なWnt/β-カテニンシグナルの下流標的遺伝子であることが示唆された。
　肝芽腫11症例で解析を行った。具体的には、11症例の肝芽腫組織を抗GREB1抗体及びヘマトキリンで染色した。その結果、11症例中、10症例(90.9%)で腫瘍病変部位においてGREB1の発現が認められたが、非腫瘍領域ではGREB1の発現は認められなかった（表５、図1のd参照）。腫瘍病変部位の総面積に対してGREB1の免疫染色によって染色された面積の割合３つのカテゴリー(<5%（Negative）、5-30%（Low）、及び30-95%(High))に分類し、≧5%の染色を示した症例をGREB1陽性とみなした。肝芽腫組織におけるGREB1の領域特異的発現パターンは、連続切片においてβ-カテニンの蓄積と正の相関を示す傾向が認められた（図1のe参照）。肝芽腫組織には組織学的に2つのタイプがあり、一方は充実性で非極性化した細胞で構成されるタイプであり、他方は管状で極性化した細胞で構成されるタイプであった。それらのうち、GREB1前者の組織型（充実性で非極性化した細胞）において特異的に高発現していた。また、11症例の肝芽腫組織を抗β-カテニン抗体及びヘマトキリンで染色した。その結果、腫瘍病変部位では、非腫瘍領域に比べて、β-カテニンの発現量が増大していることが確認された（図2のg参照）。腫瘍病変部位の総面積に対してβ-カテニンの免疫染色によって染色された面積の割合３つのカテゴリー(<5%（Negative）、5-30%（Low）、及び30-95%(High))に分類し、≧5%の染色を示した症例をβ-カテニン陽性とみなした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　更に、R2 genomicsから得られる肝芽腫患者の公的データセットとvisualization platform database (http:// r2.amc.nl)を用いて、GREB1遺伝子の発現と、肝芽腫におけるWnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子の発現との相関を分析した。GREB1遺伝子の発現と標的遺伝子の発現に関する2つのパラメータは、肝芽腫の症例において50の腫瘍病変部位及び5つの非腫瘍領域について利用可能であった。分析の結果、腫瘍病変部位では、GREB1 mRNAは非腫瘍領域の領域と比較して有意にアップレギュレートされていることが分かった（図1のf参照）。更に、Axin2、DKK1、NKD1、及びglutamine synthetase(GS)等のWnt/β-カテニンシグナルの標的遺伝子の発現量とGREB1の発現量との間に有意な正の相関が認められた（図1のg参照）。一方で、PRLRやXBP1といったエストロゲン受容体の下流標的遺伝子の発現は有意に変動しなかった（図2のi参照）。即ち、これらの結果から、肝芽腫において、エストロゲン受容体シグナルではなく、Wnt/β-カテニンシグナルの活性化がGREB1の発現を増大させていることが確認された。
　肝芽腫患者の公的データセットによると、肝芽腫症例のCTNNB1遺伝子のエクソン３又はエクソン４の領域に変異または欠失を有する症例は、変異を有さない症例と比較して、GREB1の発現は有意に変化していなかった（図2のj参照）。β-カテニンの下流標的遺伝子であるAxin2及びGSについても同様にCTNNB1遺伝子の異常の有無に関わらず発現が変動していなかった。これらの結果から、肝芽腫におけるGREB1の発現はβ-カテニンシグナルの活性に相関するが、CTNNB1遺伝子のエクソン３又はエクソン４の領域の変異には必ずしも関連しないことが明らかとなった。そのため、別種のCTNNB1遺伝子変異又はCTNNB1遺伝子の変異に非依存的なβ-カテニンシグナルの活性化が起こっている可能性が示唆された。
２－２．GREB1発現は、肝芽腫細胞の増殖に関与する
　過去に報告されている通り、β-カテニンのノックダウンはHepG2細胞の細胞増殖を低下させた（図3のa参照）。また、外来性のGREB1の発現は、β-カテニンのノックダウンの表現型を部分的に回復させた（図3のa参照）。そこで、HepG2細胞におけるGREB1の役割を解明するために２つの異なるsiRNAを使用してGREB1をノックダウンした。GREB1をノックダウンした細胞の溶解液に、抗GREB1抗体、抗Axin2抗体、抗β-カテニン抗体、及び抗HSP90抗体でプローブ化した結果、siRNA（GREB1 #1 siRNA及びGREB1 #2 siRNA）は、GREB1をノックダウンさせるが（図3のb参照）、GREB1のノックダウンは、ERシグナルの標的遺伝子であるPRLRやXBP1の発現には影響せず（図3のc参照）、β-カテニン及びAxin2の発現にも影響しないことが確認された（図3のb参照）。即ち、これらの結果は、GREB1は、ER及びWnt/β-カテニンシグナルの上流で機能する遺伝子ではないことが示唆された。
　Mock（GREB1を含まないベクターのみ）又はGREB1を導入したHepG2細胞に、コントロールsiRNA又は2つの異なるsiRNA（GREB1 #1 siRNA及びGREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトして、二次元培養（プラスチックディッシュでの培養）を行い、Cyquantアッセイによって相対的細胞数を経時的に求めた。その結果、GREB1ノックダウンでは、HepG2細胞の二次元培養における増殖能を低減させたが、GREB1を導入したHepG2細胞にGREB1に対するsiRNAをトランスフェクトした場合（GREB1 #1 siRNA/GREB1及びGREB1 #2 siRNA/GREB1）では、HepG2細胞の増殖能に影響はなかった（図4のa参照）。
　更に、コントロールsiRNA又はsiRNA（GREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞を三次マトリゲルで5日間培養して、細胞をファロイジンで染色し、スフェアの面積を計測した（n=20）。その結果、GREB1のノックダウンは、スフェア面積を半分にまで低減させた（図4のb）。対照的に、GREB1のノックダウンした場合では、極性化した内腔を有するスフェアの割合が増加することが確認された（図４のb）。なお、極性化した内腔を有するスフェアの割合は、全スフェアに対するF-actin陽性central microlumenを有するスフェアの割合として算出した。これらの結果は、GREB1をノックダウンしたHepG2細胞は、上皮極性化を有する分化状態に形質転換されたことが示唆された。これらの結果は、GREB1が肝芽腫組織において、充実性で非極性化した細胞において特異的に発現しているという結果（図2のh参照）と一致していた。実際、GREB1のノックダウンは未分化な肝前駆細胞マーカー遺伝子であるDLK1、AFP及びPEG3の発現を有意に低下させた（図４のc）。これらの結果と一致して、肝芽腫患者の公的データセットでも、DLK1やTACSTD1等の遺伝子の肝芽腫マーカー遺伝子の発現量とGREB1の発現量との間に有意な正の相関が認められた（図3のd参照）。
　また、GREB1の発現量が低いHuh6細胞では、GFP又はGFP-GREB1をトランスフェクトすると、GFP-GREB1を導入してGREB1を過剰発現させた場合に、二次元培養及び三次元培養において増殖能の増大が認められた（図3のe及びf参照）。即ち、これらの結果から、肝芽腫細胞におけるGREB1の発現は、増殖能を向上させる一因になっていることが明らかとなった。
　コントロールsiRNA又はGREB1 siRNA（GREB1 #1 siRNA及びGREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトしたHepG2細胞を1% FBSを含む培地で1日間培養し、その細胞溶解液を、抗cyclinA抗体、抗cyclinB抗体、抗リン酸化ヒストンH3抗体、抗ヒストンH3抗体、抗GREB1抗体、及び抗HSP90抗体でプローブ化した。その結果、GREB1のノックダウンは、cyclinA、cyclinB、及びリン酸化ヒストンH3を含む細胞サイクル制御因子の発現を低下させることが確認された（図４のd参照）。
　また、公的データベースを用いた解析によって、肝芽腫細胞において、GREB1の発現量と、MKI67、GMMN、及びPCNAの発現量には、正の相関があることが分かった（図４のe参照）。
　また、HepG2細胞におけるGREB1のノックダウンによる肝芽腫マーカーの発現、細胞増殖、及び細胞周期における表現型は、CRISPR/Cas9によって作製したGREB1をノックアウトしたHepG2細胞においても同様に確認され、その表現型は外来性のGREB1の発現によって回復した（図３のg～j参照）。
　更に、HepG2細胞にコントロールsiRNA又はsiRNA（GREB1 #1 siRNA及びGREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトし、0.1% FBSを含む培地（カスパーゼ阻害剤Z-VADを含む場合と含まない場合）で2日間培養し、ヨウ化プロピジウム（PI、生細胞）及びHoechst33342（核）で染色し、細胞の生存率を評価した。この結果、Z-VADを含まない培地を使用した場合に、GREB1のノックダウンによって、HepG2細胞の細胞死を増加させることが確認された（図４のf参照）。
　更に、HepG2細胞にコントロールsiRNA又はsiRNA（GREB1 #1 siRNA及びGREB1 #2 siRNA）をトランスフェクトし、0.1% FBSを含む培地で2日間培養し、その細胞溶解液を、抗cleaved caspase 3抗体、抗PARP1抗体、及び抗HSP90抗体でプローブ化した。その結果、アポトーシス細胞のマーカーである抗cleaved caspase 3及びPARP1の細胞内の量は、GREB1がノックアウトされているHepG2細胞において増加していることが確認された（図４のg参照）。
　即ち、これらの結果から、肝芽腫細胞において、GREB1は、細胞周期制御を介した細胞増殖だけでなく、細胞生存にも不可欠になっていることが示唆された。
２－３．GREB1は、Smad2/3と複合体を形成する
　過去の乳がん細胞での報告と一致して、X293T細胞ではHA-FLAG-GREB1は主に核内に局在した（図5のa参照）。GREB1の核局在配列（NLS）である310～319位のアミノ酸を欠失させた変異体GREB1（HA-FLAG-ΔNLS-GREB1）は細胞質に局在位した（図5のa参照）。どのような機構でGREB1がERシグナルとは独立して肝芽腫細胞の増殖を制御しているかを解明するために、Biological General Repository for Interaction Datasets (BioGRID) (https://thebiogrid.org/)を用いて、GREB1と相互作用し得る候補タンパク質を同定した。その結果、GREB1と相互作用し得る候補タンパク質として、表６に示すタンパク質が見出された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　これらの候補タンパク質の中で、TGFβシグナルのセントラルメディエーターであるSmad4に着目した。Smadタンパク質は、機能に応じて、Smad3（Co-mediator Smad、Co-Smad）、Smad4（receptor-regulated Smad、R-Smad）、及びSmad7（inhibitory Smad、I-Smad）の３つのクラスがある。X293T細胞においてGFP-Smad3とGFP-Smad7は主に核内に局在し、GFP-Smad4は細胞質に局在した（図6のa参照）。そこで、Smad3、Smad4及びSmad7について、GREB1との複合体の形成能を評価した。具体的には、先ず、HA-FLAG-GREB1及びGFP、GFP-Smad3、GFP-Smad4、又はGFP-Smad7を発現するX293Tの細胞溶解液を抗GFP抗体で免疫沈降させた。次いで、細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗HA抗体又は抗GFP抗体を反応させた。その結果、HA-FLAG-GREB1は、Smad3 (Co-Smad)及びSmad7(I-Smad)と複合体を形成するが、Smad4 (R-Smad)とは複合体を形成しないことが確認された（図5のb参照）。一方、HA-FLAG-ΔNLS-GREB1はSmad4 (R-Smad)と複合体を形成するが、Smad3(Co-Smad)及びSmad7(I-Smad)とは複合体を形成しないことが確認された（図5のb参照）。これらの結果から、GREB1は細胞内局在に依存して全てのSmadファミリーと結合することが示唆された。また、HepG2細胞の溶解液を抗Smad2/3抗体で免疫沈降させ、得られた免疫沈降物（IP）に対して、抗Smad2/3抗体及び抗GREB1抗体を反応させたところ、GREB1は内在するSmad2/3との結合が認められたものの（図5のc参照）、GREB1とSmad4又はSmad7との相互作用は殆ど認められなかった（データは示さない）。GFP-GREB1を発現させたHuh6においても、細胞の溶解液を抗GFP抗体で免疫沈降させ、得られた免疫沈降物（IP）に対して、抗Smad2/3抗体及び抗GREB1抗体を反応させたところ、GREB1は内在するSmad2/3との結合が認められた（図6のb参照）。一方、他の核タンパク質であるβ-カテニンやc-Mycは、GFP-Smad3、GFP-Smad4又はGFP-Smad7との相互作用は認められなかった（図6のc参照）。そこで、GREB1とSmad2/3との間の機能的相互作用について更なる検討を行った。
　Smad2は、MH1ドメイン及びMH2ドメインの2つの機能領域を有していることが知られている（図5のd参照）。そこで、Smad2について、全長Smad2（Full）、C末端側（266～467位のアミノ酸）が欠失し、MH1ドメインを含むC末端側領域のみからなるSmad2変異体（N）、及びN末端側（1～265位のアミノ酸）が欠失し、MH2ドメインを含むC末端側領域のみからなるSmad2変異体（C）を用いて、GREB1との結合性について評価した（図5のd参照）。先ず、HA-FLAG-mGREB1及びGFP、又はGFP-Smad2（Full、変異体N、又は変異体C）を発現するX293T細胞の溶解液を抗GFP抗体で免疫沈降させた。次いで、細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗HA抗体又は抗GFP抗体を反応させた。その結果、GFP-Smad2（変異体C）はGREB1との複合体を形成したが、GFP-Smad2（変異体N）はGREB1との複合体を形成しなかった（図5のd参照）。更に、リコンビナントのGST-Smad2/MH2ドメインはプルダウンアッセイによって、HepG2細胞の内在性のSmad4が結合する状況で、内在性のGREB1、及びHuh6細胞に発現したGFP-GREB1と結合した（図5のe参照）。一方、同一の条件でリコンビナントのGST-Smad2/MH1ドメインは結合しなかった（図5のe参照）。また、GFP-GREB1を発現させたHuh6細胞の場合についても、同様の傾向が認められた（図6のd参照）。これらの結果から、肝芽腫細胞においてGREB1は直接Smad2/3と結合することが示唆された。
　更に、GREB1のどの領域でSmad2/3と相互作用しているかを分析するために、GREB1の667～1954位のアミノ酸を欠失させた変異体N（1-666）、GREB1の1～666位及び1334～1954位のアミノ酸を欠失させた変異体M（667-1333）、並びにGREB1の1～1333位のアミノ酸を欠失させた変異体C（1334-1954）を作製し、更に、NLSを有さない変異体変異体M及びCのN末端にSV40T抗原に由来するNLS配列の3コピー(配列番号１０９)を結合させたNLS-GREB1変異体（NLS/667-1333、及びNLS/1334-1954）を作製した（図5のf参照）。そして、GFP-GREB1変異体を発現するX293T細胞を抗GFP抗体及びHoechst33342で染色した（図5のf参照）。その結果、GREB1変異体（1-666、NLS/667-1333、及びNLS/1334-1954）は、核内に局在化していることが確認された。
　また、FLAG-Smad3及びGFP、GFP-GREB1、又はGFP-GREB1変異体を発現するX293T細胞の溶解液を抗GFP抗体で免疫沈降させた。次いで、更に得られた細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗FLAG抗体又は抗GFP抗体を反応させた。その結果、X293T細胞において、GREB1変異体（NLS/667-1333）はSmad3と結合するが、GREB1変異体(1-666及びNLS/1334-1954）はSmad3とは殆ど結合しないことが分かった（図5のg参照）。
　また、GREB1の1～666位のアミノ酸を欠失させ且つN末端にSV40T抗原に由来する3コピーのNLS配列(配列番号１０９)を結合させた変異体（NLS/667-1954(ΔN)）、GREB1の667～1333位のアミノ酸を欠失させた変異体（Δ667-1333/ΔM）、及びGREB1の667～1333位のアミノ酸を欠失させ且つN末端にSV40T抗原に由来する3コピーのNLS配列（配列番号１０９)を結合させた変異体（NLS/1-1333(ΔC)を作製した。これらの変異体を発現するX293T細胞の溶解液を抗GFP抗体で免疫沈降させた。次いで、更に得られた細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗FLAG抗体又は抗GFP抗体を反応させた（図6のe参照）。その結果、野生型GREB1は、Smad3と結合することが確認されたが、GREB1の667～1333位のアミノ酸を欠失させた変異体では、Smad3との結合は認められなかった（図6のe参照）。以上の結果から、GREB1の667～1333位のアミノ酸領域が、Smad3との結合に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。更に、これらの結果は、肝芽腫細胞の核内において、GREB1の667～1333位を含むアミノ酸領域が、Smad2/3のNH2ドメインと相互作用して複合体を形成していることが示唆された。
２－４．GREB1は、TGFβシグナルのネガティブレギュレーターとして機能する
　TGFβシグナルにおけるGREB1の役割を解明するために、標的遺伝子の発現、Smad2の核内移行、Smad2/3とSmad4との複合体の形成、及び内在レベルでのSmad2/3のリン酸化について検討を行った。
　肝芽腫患者の公的データセットを分析した結果、β-カテニンシグナルの標的遺伝子Axin2やDKK1の発現量は非腫瘍領域と比較して、腫瘍病変部において有意に発現が上昇していた（図8のa参照）。一方、TGFβシグナルの標的遺伝子PAI-1又はGADD45Bの発現量は非腫瘍領域と比較して、腫瘍病変部において有意に発現が減少していた（図7のa参照）。更に、GREB1の発現量と、TGFβシグナルの標的遺伝子（PAI-1、p21/CDKN1A、TSP-1、及びCTGF）の発現量との間では、有意な逆相関が認められた（図7のb参照）。GFPを発現するHepG2細胞(HepG2/GFP)、又はGFP-GREB1を発現するHepG2細胞(HepG2/GFP-GREB1)に、コントロールsiRNA又はGREB1 #2 siRNAをトランスフェクトした。これらの細胞について、リアルタイムPCRにてPAI-1及びSNAIL2のmRNA量を測定した(n=3)。この結果、GREB1をノックダウンしたHepG2細胞(HepG2/GFP)では、TGFβシグナルのターゲット遺伝子であるPAI-1及びSNAIL2の発現量が増大しており、これらの表現型はGFP-GREB1の発現により回復した（図7のc参照）。
　また、HepG2細胞(Control)、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞(GREB1 KO)、又はGREB1を発現させたGREB1 KO HepG2細胞(GREB1 KO/GREB1)におけるPAI-1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した。その結果、GREB1のノックアウトによってPAI-1 mRNA量が有意に増加し、外来性のGREB1の発現によってGREB1のノックアウトによる表現型が回復することが分かった（図8のb参照）。
　また、HepG2細胞に、コントロールsiRNA又はGREB1 #2 siRNAをトランスフェクトし、TGFβ受容体阻害剤（ALK5 inhibitor）存在下又は非存在下で培養し、細胞内のPAI-1及びSNAIL2のmRNA量を測定した。その結果、GREB1のノックダウンによるPAI-1及びSNAIL2のmRNA量増加はTGFβ受容体シグナル依存的であることが分かった（図7のd参照）。
　また、コントロールsiRNA又はGREB1 #2 siRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞を、10ng/mLのTGFβ存在下又は非存在下で30分間培養した。前記培養後の細胞を固定化して、抗Smad2/3抗体で免疫染色した（図8のc参照）。また、前記培養後の細胞の溶解液を抗Smad2/3抗体で免疫沈降させた。次いで、得られた細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗Smad4抗体又は抗Smad2/3抗体を反応させた（図8のd参照）。更に、前記培養後の細胞の溶解液に、抗GREB1抗体、抗リン酸化Smad2/3(pSmad2/3)抗体、又は抗Smad2/3抗体を反応させた（図8のe参照）。その結果、GREB1のノックダウンは、TGFβ依存的なSmad2/3の核内移行、Smad2/3とSmad4との複合体の形成、及びSmad2/3のリン酸化には影響しないことが分かった（図8のc～e参照）。これらの結果から、GREB1は、核内のSmad2/3の機能を阻害する作用があり、これによってTGFβ依存的な遺伝子の発現が阻害されることが明らかとなった。
　CBP及びp300等の転写活性化因子は、クロマチン構造を改変するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）活性を有していることが知られている。また、R-Smads(Smad2/3)は、MH2ドメインを介して、CBP又はp300に直接的に相互作用することも知られている。そこで、以下、GREB1のノックダウンが、転写活性化因子とSmad2/3との結合に及ぼす影響について検討した。
　コントロールsiRNA又はGREB1 #2 siRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞の溶解液を抗Smad2/3抗体で免疫沈降させた。次いで、得られた細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗p300抗体、抗GREB1抗体、又は抗Smad2/3抗体を反応させた（図7のe参照）。この結果、HepG2細胞において、GREB1をノックダウンした場合にはSmad2/3のp300への結合が増大していた（図7のe参照）。
　また、HA-FLAG-GREB1、GFP-Smad2変異体(C)、又はGFPを発現するX293T細胞の細胞溶解液を抗GFP抗体で免疫沈降させた。次いで、更に得られた細胞の溶解液（Input）及び免疫沈降物（IP）に対して、抗p300抗体、抗HA抗体、又は抗GFP抗体を反応させた。その結果、X293T細胞において、MH2ドメインを有するSmad2/C変異体(C)はp300と相互作用を示し、HA-FLAG-GREB1の過剰発現はSmad2/C変異体(C)とp300との相互作用を阻害することが分かった（図7のf参照）。
　また、コントロールsiRNA又はGREB1 #2 siRNAをトランスフェクトしたHepG2細胞を、10ng/mLのTGFβ存在下又は非存在下で30分間培養した。培養後の細胞の溶解液を抗アセチル化ヒストン4(AcH4)抗体で免疫沈降させた。次いで、細胞溶解液（Input）及び免疫沈降物(IP)に含まれるPAI-1のエクソン2領域について領域特異的プライマーを用いたPCRによって分析した。この結果、GREB1のノックダウンは、HepG2細胞のPAI-1遺伝子座（エキソン2）においてアセチル化ヒストン4量を増大させることが確認された（図7のg参照）。
　HepG2細胞に対して恒常的活性化型のTGFBR1変異体（T204D）をGFP、GFP-GREB1、又はGFP-GREB1変異体（Δ667-1333/ΔM）と共に過剰発現させ、SNAIL2又はp15遺伝子のmRNA発現を定量したところ、GREB1の発現によって恒常的活性化型TGFBR1依存的なSNAIL2又はp15の遺伝子発現が阻害されたが、GREB1変異体（Δ667-1333/ΔM）の発現によってはSNAIL2又はp15遺伝子発現は有意に阻害されなかった（図7のh参照）。また、同一条件下でGREB1の過剰発現はAxin2の発現に対しては影響を与えなかった（図7のh参照）。
　また、TGFBR1/T204D変異体（TGFBR1の204位のトレオニンをアスパラギン酸に置換した変異体）をトランスフェクトしたHepG2細胞におけるAFP mRNA及びDLK1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した。その結果、恒常的活性化型のTGFBR1変異体（T204D）の過剰発現は、HepG2細胞のAFP及びDLK1の発現を減少させることが分かった（図8のf参照）。この結果は、TGFβシグナルはラット胎児肝細胞又は肝がん細胞において、AFP及びDLK1の発現を減少させるとの過去の報告と一致している。
　また、HepG2細胞、及びSmad2/3をノックアウトしたHepG2細胞(HepG2/Smad2/3 KO) の溶解液を抗Smad2/3抗体、又は抗HSP90抗体でプローブ化した。更に、HepG2細胞、及びSmad2/3をノックアウトしたHepG2細胞(HepG2/Smad2/3 KO)にコントロールsiRNA又はGREB1に対するsiRNA（GREB1 ＃2 siRNA）をトランスフェクトし、AFP mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した。その結果、Smad2/3のノックアウトは、GREB1のノックダウンによるAFPの発現低下を回復させたが、DLK1の発現低下には影響しないことが確認された（図8のg及びｈ参照）。
　以上の結果から、GREB1は、Smad2/3のp300への結合を妨げており、TGFβ-Smadシグナルの標的遺伝子発現を阻害することが示唆された。
　また、Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)(https://portals.broadinstitute.org/ccle)のmRNAプロファイルデータセット中のHepG2のRNAシークエンスデータを用いて、TGFβ1、TGFB2、又はTGFB3の遺伝子発現量を分析したところ、HepG2細胞はTGFβ1を高発現していた（図9のa参照）。
　また、コントロールsiRNA、TGFβ1 siRNA、GREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）、又はTGFβ1 siRNAとGREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）を組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞におけるPAI-1 mRNA量、TGFβ1 mRNA量及びGREB1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した結果、TGFβ1とGREB1の二重ノックダウンによって、GREB1のノックダウンによるPAI-1の遺伝子発現上昇が有意に抑制されていた（図9のb参照）。
　また、コントロールsiRNA、TGFβ1 siRNA、GREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）又はTGFβ1とGREB1（GREB1 ＃2 siRNA）のsiRNAを組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞の溶解液を抗GREB1抗体、抗TGFB1抗体、又は抗HSP90抗体でプローブ化した。その結果、TGFβ1とGREB1の二重ノックダウンによって、TGFβ1とGREB1のタンパク発現が効率よく抑制されていることが明らかとなった（図9のc参照）
　更に、コントロールsiRNA、TGFβ1 siRNA、GREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）又はTGFβ1 siRNAとGREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）を組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞について二次元培養（プラスチックディッシュでの培養）を行い、細胞数を経時的に測定した。その結果、GREB1のノックダウンによる細胞増殖抑制がTGFβ1との二重ノックダウンによって回復することが分かった（図7のi参照）。
　コントロールsiRNA、TGFβ1 siRNA、GREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）、又はTGFβ1 siRNAとGREB1 siRNA（GREB1 ＃2 siRNA）を組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞を、0.01～1 ng/ml濃度のTGFB1非存在下で4時間培養後、PAI-1 mRNA量をリアルタイムPCRにより分析した。その結果、GREβ1及びTGFβ1のノックダウンによってTGFβ依存的なPAI-1mRNA発現の亢進が認められた（図9のd参照）。
　また、HepG2細胞においてGREB1をノックダウンしたところ、TGFβシグナルの下流で細胞増殖の抑制を制御する標的遺伝子であるp15、p21、p27のうち、p15の発現が劇的に上昇した。GREB1のノックダウンによるp15の発現上昇はSmad2/3のノックアウトで抑制された（図9のe参照）。更に、HepG2細胞においてp15をノックダウンしたところ、GREB1の発現抑制による細胞増殖抑制と細胞死亢進の表現型が回復した（図9のf参照）。これらの結果から、GREB1の発現抑制による細胞増殖抑制と細胞死亢進の表現型においては、p15が重要であることが示唆された。この結果と一致して、HepG2細胞でのSmad2/3のノックアウトはGREB1ノックダウンによる細胞増殖抑制を阻害した（図7のj参照）。
　更に、コントロールsiRNA、GREB1 siRNA（GREB1 #2 siRNA）、p15 siRNA、又はGREB1（GREB1 #2 siRNA）とp15のsiRNAを組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞の二次元培養（プラスチックディッシュでの培養）を行い、細胞数を経時的に測定した。その結果、GREB1のノックダウンによる細胞増殖の抑制はp15のノックダウンによって回復することから、p15依存的な表現型であることが明らかとなった（図9のg参照）。
　また、コントロールsiRNA、GREB1 siRNA（GREB1 #2 siRNA）、p15 siRNA、又はGREB1（GREB1 #2 siRNA）とp15のsiRNAを組み合わせてトランスフェクトしたHepG2細胞を0.1% FBSを含む培地（カスパーゼ阻害剤Z-VADを含む場合と含まない場合）で2日間培養し、ヨウ化プロピジウム（PI）及びHoechst33342で染色し、細胞の生存率を求めた。その結果、GREB1のノックダウンによる細胞死の亢進はp15のノックダウンによって回復することから、p15依存的な表現型であることが明らかとなった（図9のh参照）。
　これらの結果から、GREB1ノックダウンによってTGFβに対する感受性が増強し、細胞増殖の抑制と細胞死が誘導されることが示唆された。
　また、乳がん細胞MCF7において、エストロゲン受容体アンタゴニスト（ICI.182.780）の処理、又はGREB1のノックダウンは、PAI-1のmRNA発現を抑制した（図９のi及びj参照）。更に、MCF7細胞において、GREB1は内在性のSmad2/3と結合した（図９のk参照）。これらの結果から、GREB1のTGFβシグナルに対するネガティブレギュレーターとしての機能は、肝芽腫細胞だけでなく、乳がん細胞でも同様であることが示唆された。
２－５．核内の制限された領域において、GREB1及びSmad2/3の相互作用は、転写を阻害する
　GFP-GREB1を発現するHepG2細胞を固定化して、抗GFP抗体及びHoechst33342で染色した結果、GFP-GREB1は、クロマチン領域ではなく、クロマチン間の区画でドットとして観察された（図10のa参照）。また、GFP-GREB1を発現するHepG2細胞を固定化して、抗GFP抗体、抗Fibrillarin抗体、抗SC34抗体、抗PML抗体、又は抗Coilin抗体とHoechst33342で染色したところ、GREB1の染色が認められるドットは、フィブリラリン、SC35、PML、及びCoilinとは共存していないことが確認された（図10のb参照）。これらの結果から、GREB1は、核小体、核スペックル、PML(Promyelocytic leukemia)体、及びカハール小体とは、独立して存在していることが示唆された。また、GFP-GREB1及びFLAG-SMAD3を発現するHepG2細胞を固定化して、抗GFP抗体、抗FLAG抗体及びHoechst33342で染色したところ、GFP-GREB1及びFLAG-Smad3は複合体を形成し、クロマチン間の区画に存在することが観察された（図10のc参照）。
　また、HepG2細胞を10ng/mLのTGFβ存在下又は非存在下で30分間培養し、培養後の細胞を固定化して抗SMAD2/3抗体、抗GREB抗体、及びHoechst33342で染色した。その結果、核及び細胞質におけるGREB1蛍光強度を測定し、その結果を、細胞質のGREB1蛍光強度に対する核のGREB1蛍光強度の比率として表した。その結果、内在するGREB1及びSmad3は、細胞質及び核の双方に存在し、それらはTGFβの刺激によって核内に蓄積することが確認された（図11のa参照）。
　また、HepG2細胞を10ng/mLのTGFβ存在下又は非存在下で30分間培養し、培養後の細胞を固定化して抗GREB1抗体、抗リン酸化SMAD2/3(pSMAD2/3)抗体、及びHoechst33342で染色した。その結果、TGFβで処理した細胞において、リン酸化SMAD2/3は核内で集積し、GREB1と共局在していることが確認された（図11のb参照）。
　更に、HepG2細胞を10ng/mLのTGFβ存在下又は非存在下で30分間培養し、培養後の細胞を固定化し、マウス抗GREB1抗体及びウサギ抗SMAD2/3抗体を添加してインキュベートした。次いで、これらの一次抗体に対して、二次抗体（PLA（proximity ligation assay）プローブ）を結合させた。その結果、TGFβ刺激依存的に、Smad2/3は、クロマチン領域とクロマチン間領域の境界部において、GREB1と近接して存在することが分かった（図11のc参照）。GREB1変異体（1-666及びNLS/667-1333）は、核全体に存在するが核内フォーカスを形成しておらず、GREB1変異体（NLS/1334-1954）はGREB1（全長）と同様に核内フォーカスを形成していることから、GREB1のC末端領域は、GREB1の核内の特異的領域で局在化する上で重要な役割を担っていることが示唆された（図11のd参照）。
　核内のGREB1及びSmad2/3の特異的局在の機能的相互作用を明らかにするために、エチニルウリジン（EU）を用いてRNA合成の分析により転写活性を可視化した。具体的には、先ず、GFP-SMAD3を発現し、且つHA-FLAG-GREB1を発現又は非発現のHepG2細胞を終濃度１mMのEU存在下で30分間インキュベートした。インキュベート後の細胞を固定化し、抗GFP抗体、抗FLAG抗体、及びHoechst33342で染色した。なお、HepG2細胞をEU存在下で30分間インキュベートして細胞を固定化すると、EUで標識された核内領域を検出できることが確認されている（図10のd参照）。前記試験の結果、GFP-SMAD3を発現するHepG2細胞において、新生RNA分子が核質全体で観察され、それらのいくつかはGFP-Smad3の核内フォーカスと共局在していることが観察された（図11のe参照）。一方、GFP-SMAD3及びHA-FLAG-GREB1を発現するHepG2細胞では、EU標識は、GFP-Smad3の核内フォーカスと共局在しなかった（図11のe参照）。即ち、これらの結果から、TGFβ-SMADシグナルに関連する転写活性は、クロマチン領域とクロマチン間領域の境界部においてSmad2/3とGREB1が相互作用することにより選択的に抑制されることが示唆された。
２－６．GREB1はin vivoにおいて肝芽腫様の腫瘍の形成に関与する
　がん遺伝子のゲノム操作及び／又はハイドロダイナミックトランスフェクションを用いて、肝細胞がん及び肝芽腫のマウス肝臓腫瘍モデルが、いくつか開発されている。また、ハイドロダイナミックトランスフェクションを用いた恒常的活性化型β-カテニン及びYAPの過剰発現は、肝細胞がん及び肝芽腫の特徴を伴う肝腫瘍を急速に導くことが報告されている。実際、肝芽腫組織（n=11）を抗β-カテニン抗体及びヘマトキシリンで免疫染色したところ、YAPは11例の肝芽腫組織において、9例（陽性率81.8％）で腫瘍細胞特異的に細胞質又は核内で過剰発現しており、当該9例は全例、β-カテニン及びGREB1が陽性であった（図12のa参照）。更に、HGF-c-Met経路は肝芽腫において活性化されており、マウスにおいてβ-カテニン及びc-Metの構成的に活性な形態の同時発現は、肝腫瘍を誘導することも報告されている。
　β-カテニン、YAP及びc-Metのいずれの組み合わせがハイドロダイナミックトランスフェクション法による肝芽腫形成に効果的であるかを分析した。ヒトβ-カテニンの1-90までのアミノ酸が欠失しているΔN90βカテニンと、127番目のセリンがアラニンに置換されセリンのリン酸化を生じないようにしたYAP変異体であるYAPS127Aとを組み合わせて導入したマウス（BYモデル）では、導入後6週間で肝臓に小さな腫瘍塊が形成されたが、免疫組織学的にGREB1とDLK1はほとんど発現していなかった（図12のb参照）。ΔN90β-カテニン及びc-Metを組み合わせて導入したマウス（BMモデル）では、導入後6週間で肝臓に形成された腫瘍塊において免疫組織学的にGREB1とDLK1が少量発現していた（図12のb参照）。一方、ΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metを組み合わせて導入したマウス（BYMモデル）では、導入後6週間で肝臓に大きな多発性の腫瘍塊が形成され、免疫組織学的にGREB1とDLK1が高発現していた（図12のb参照）。また、BYモデル、BMモデル、及びBYMモデルの腫瘍結節におけるGREB1とTACSTD1のmRNA量をリアルタイムPCRにて測定したところ、BYMマウスでは、BYモデル及びBMモデルに比べて、当該mRNA量が高くなっていた（図12のc参照）。これらの結果から、BYMモデルは肝芽腫におけるGREB1の生体内機能解析を行う上で適切なモデルであるといえる。
　次に、YAPとc-Metが肝芽腫においてGREB1の発現を制御する機構を分析した。Huh6細胞又はHepG2細胞を固定化して抗YAP抗体、及びHoechst33342で染色したところ、YAPはHepG2細胞と比べてHuh6細胞において強く核に集積していることが分かった（図13のa参照）。しかしながら、Huh6細胞及びHepG2細胞においてYAP/TAZをノックダウンしてもGREB1の発現には影響しなかった（図13のb参照）。更に、Huh6細胞をCHIR99021で処理、又はMst1/2キナーゼの阻害作用を有し、YAPの活性化剤であるXMU-MP1で処理、又はそれらを組み合わせて処理した場合、GREB1のmRNA発現はAxin2のmRNA発現と同様に抑制された（図13のc参照）。これらの結果から、YAP/TAZは肝芽腫の形成に必要であるが、GREB1の発現には必須ではないことが示唆された。
　また、HepG2細胞においてc-Metをノックダウンしたところ、Axin2 mRNAとGREB1 mRNAの発現が抑制され、YAPの下流標的遺伝子であるANKRD1とCyr61の発現は上昇した（図13のd参照）。HGF-c-Metシグナル経路はβ-カテニンの654番目のチロシンのリン酸化と、β-カテニンの核移行を促進し、β-カテニンシグナルを活性化することが報告されている。実際、HepG2細胞においてc-Metをノックダウンしたところ、β-カテニンの654番目のチロシンのリン酸化が減弱し、GREB1とAxin2の発現が減少していた（図13のe参照）。これらの結果から、c-Metはβ-カテニンのチロシンのリン酸化を誘導することでβ-カテニンシグナルを活性化し、GREB1の発現を上昇させることが示唆された。
　また、マウスにGREB1 shRNAと共に、ΔN90βカテニン、YapS127A、及びc-Metを投与し、投与から7～8週間後に肝臓を回収した。その結果、ΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metを導入したマウス（BYMマウス、コントロール）では、肝臓表面全体に複数の結節が認められた（図14のa参照）。これに対して、ΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metと共にGREB1 shRNAを導入したマウス（BYM GREB1 KDマウス）では、肝臓における結節は抑制されていた（図14のa参照）。更に、BYMマウス（C1～C7）の肝臓、及び未処理のマウス（NLマウス）の肝臓から腫瘍結節を取得し、ΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metの発現量をリアルタイムPCRにて測定したところ、BYMマウスでは、導入したΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Metをいずれも発現していることが確認された（図15のa参照）。
　更に、未処理マウス(NL)の肝臓、BYMマウスの腫瘍結節(n=42)、及びBYMマウスの非腫瘍組織(n=8)から全RNAを抽出し、リアルタイムPCRにてGREB1のmRNA量を測定した。その結果、各腫瘍結節におけるGREB1のmRNA量は、非腫瘍組織及び正常肝組織に比べて高くなっていた（図15のb参照）。
　また、各BYMマウス（C1～C7）から6つの腫瘍結節を取得し、肝芽腫関連遺伝子の発現及び組織学的外観を調べた。その結果、ヒートマップの可視化により、個々のマウスの腫瘍結節に応じて、GREB1のmRNA量が異なっていることが分かった（図14のb参照）。そして、GREB1のmRNA量が高い群（GREB1高群：C1、C4、及びC6）と低い群（GREB1低群：C2、C3、C5、及びC7）に分類した。GREB1高群では、TACSD1、DLK1（肝芽腫マーカー遺伝子）、AFP、GFP3（未分化肝芽細胞マーカー遺伝子）、PEG3、MEG3、BEX1（インプリンティング遺伝子）及びAxin2が、GREB1低群よりも高い傾向があった（図14のb参照）。また、前記BYMマウス（C1～C7）から取得した腫瘍結節を用いて、REB1の発現量と肝芽腫関連遺伝子（DLK 1、TACSTD1、GPC3、MEG3、及びAxin2）のmRNAの発現量を測定した結果、GREB1の発現量と肝芽腫関連遺伝子の発現量との間には、強い正の相関が認められた（図15のc、表７参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　また、GREB1高群(C4)及びGREB1低群(C3)のBYMマウスから分離された肝臓の組織切片について、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。その結果、GREB1高群の腫瘍の大部分が、高い核／細胞質比を有し、増殖能が高いことが分かった（図14のc、図15のd参照）。また、GREB1低群の腫瘍は、主に、明確な細胞質、均一な丸い核、及び小さな核小体を有しており、分化した大きな細胞を含んでいた（図14のc、図15のd参照）。
　また、GREB1高群(C4)及びGREB1低群(C3)のBYMマウスから分離された肝臓の組織切片について、抗GREB1抗体又は抗DLK1抗体とヘマトキシリンで染色した。その結果、腫瘍病変部位におけるGREB1及びDLK1の発現は、非腫瘍領域よりも高いことが免疫組織化学的に確認され、その染色レベルは分化の程度と相関していた（図14のd参照）。
　BYMマウスにおいてGREBをノックダウンした場合（BYM GREB1 KDマウス；K1～K6）、腫瘍形成の発生率は低下し、6匹中4匹のマウスで腫瘍は観察されなかった（図14のa参照）。また、BYM+ GREB1 shRNAマウスでは、GREBをノックダウンしなかったBYMマウスと比較して、肝臓重量及び血清AFP値が劇的に減少していた（図15のe参照）。
　また、3匹のBYMマウス（C1、C4、及びC6）、4匹のBYMマウス（C2、C3、C5、及びC7）、及びGREB1 shRNAが投与された2匹のBYMマウス（BYM GREB1 KDマウス；K2及びK4）の腫瘍結節から全RNAを抽出し、GREB1、DLK1及びTASCSTD1のmRNA量をリアルタイムPCRにて分析した。その結果、BYM GREB1 KDマウス（K2及びK4）の腫瘍は、GREB1 mRNAの発現量が低く、DLK1及びTACSTD1の発現量は、BYMマウスのGREB1低群と同等であった（図14のf参照）。更に、BYMマウス（C4）及びBYM GREB1 KDマウス（K2）の肝臓の組織切片をヘマトキシリン・エオシン、又は抗GREB1抗体及びヘマトキシリンで染色した。その結果、これらの腫瘍細胞は、明確な細胞質を有するよく分化した肝芽腫様細胞を有していることが確認された（図14のg参照）。
　また、N-カドヘリンは、TGFβシグナル伝達の標的遺伝子であり、腫瘍組織内の間葉系細胞よりも、むしろ肝芽腫細胞において発現量が多いことが知られている。そこで、BYMマウス（C4）及びBYM GREB1 KDマウス（K2）の肝臓の組織切片を抗N-カドヘリン抗体及びHoechst33342で染色した。その結果、BYMマウスでは、N-カドヘリン発現は、非腫瘍領域よりも、腫瘍病変部位において低かった。一方、BYM GREB1 KDマウスでは、腫瘍病変部位でN-カドヘリンはアップレギュレートされ、その発現量は非腫瘍領域と同程度であることが明らかになった（図14のh参照）。即ち、本結果から、TGFβシグナル伝達がGREB1の発現抑制によって活性化されることが示唆された。
　これらの結果から、GREB1が、本マウスモデルにおいて、肝芽腫様の組織学的パターン、マーカー遺伝子発現、及び腫瘍形成に関与していることが明らかとなった。
２－７．GREB1が肝芽腫の標的分子になり得る
　GREB1が肝芽腫治療の標的分子になり得るかを調べるために、CRISPR/Cas9系を用いて、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO細胞）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞にGGREB1を発現させた細胞（GREB1 KO/GREB1細胞）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞にGREB1ΔNLSを導入した細胞（GREB1 KO/GREB1ΔNLS細胞）、及びGREB1とSmad2/3をノックアウトした細胞（GREB1 KO/Smad2/3 KO細胞）を作製した。
　野生型HepG2細胞（Control）、GREB1 KO細胞、GREB1 KO/GREB1細胞、GREB1 KO/GREB1ΔNLS細胞、又はGREB1 KO/Smad2/3 KO細胞(7×106 cells)を5週齢の雄BALB/cAnNCrj-nuヌードマウスの皮下に移植した。移植から28日後にマウスを殺し、異種移植腫瘍片を摘出した。異種移植腫瘍片の外観と重量を測定した。その結果、野生型HepG2細胞では皮下異種移植腫瘍を形成したが、GREB1ノックアウトHepG2細胞は腫瘍の大きさ及び重量が減少していた（図16のa参照）。また、GREB1の発現は、GREB1ノックアウトによって誘導された表現型を回復させたが、GREB1ΔNLSの発現では当該回復は認められなかった（図16のa参照）。更に、Smad2/3のノックアウトはGREB1ノックアウトによって誘導された表現型を回復させたことから、GREB1は生体内でTGFβシグナル依存的な細胞増殖の抑制を阻害することが確認された。
　また、HepG2細胞（Control）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO）、又はGREB1とSmad2/3を組み合わせてノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO+Smad2/3 KO）の溶解液を抗GREB1抗体、抗Smad2/3抗体、及び抗HSP90抗体でプローブ化した。その結果、GREB1又はSmad2/3のタンパク質発現が消失していることが明らかになった（図15のe参照）。更に、HepG2細胞（WT）、GREB1をノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO）、又はGREB1とSmad2/3を組み合わせてノックアウトしたHepG2細胞（GREB1 KO/Smad2/3 KO）を二次元培養（プラスチックディッシュで培養）し、細胞数を経時的に測定した。その結果、GREB1のノックアウトによる細胞増殖の抑制はSmad2/3のノックアウトによって回復することから、Smad2/3依存的な表現型であることが明らかとなった（図15のf参照）。これらの結果からも、GREB1は生体内でTGFβシグナル依存的な細胞増殖の抑制を阻害し得ることが確認された。
２－８．　GREB1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、肝芽腫細胞の増殖と腫瘍形成を低下させる
　ヒトGREB1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（GREB1 ASO）の腫瘍の増殖に対する効果を検証するために、GREB1 mRNAの二次構造に基づいて、GREB1 ASOの標的となるヒトGREB1の塩基配列（15ヌクレオチド）を設計した。具体的には、先ず、数千個のGREB1 ASOの候補の中から、細胞毒性を示す可能性があるものを排除し、高次元構造予測によって20個のGREB1 ASO配列を選択した。それらの配列に基づいて、各種修飾を施したGREB1 ASOを設計して合成した（表８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　次いで、コントロールASO又は前記各GREB1 ASOをHepG2細胞にトランスフェクトし、10%FBSを含む培地で2日間培養し、その細胞溶解液を、抗GREB1抗体及び抗HSP90抗体でプローブ化した。その結果、20個のGREB1 ASOの内、ASO-6434、ASO-6921、ASO-6968、及びASO-7724は、細胞毒性がなく、HepG2細胞におけるGREB1発現を強く抑制することが分かった（図17のa参照）。
　また、GFP又はGFP-GREB1を発現するHepG2細胞にコントロールASO又は前記各GREB1 ASOをトランスフェクトし、三次元マトリゲル中で4日間培養を行った。培養後の細胞をファロイジン及びHoechst33342で染色し、スフェアの面積を計算した(n=50)。その結果、ASO-6434、ASO-6921、ASO-6968、及びASO-7724は、HepG2細胞のスフェア形成活性を抑制できており、ASO耐性のGREB1を発現するHepG2細胞（GFP-GREB1を発現するHepG2細胞）では、ASO-6921、ASO-6968、及びASO-7724によるスフェア形成活性の阻害効果が消失した（図16のb参照）。この結果から、少なくともASO-6921、ASO-6968、及びASO-7724はオンターゲット効果によって（オフターゲット効果ではない）、HepG2細胞のスフェア形成を抑制することが明らかになった。
　0日目に、HepG2細胞(1.0 × 107 cells)を含むマトリゲルをヌードマウスの肝臓に移植した。3日目から、コントロールASO（n=9）、GREB1 ASO-6921（n=5）、又はGREB1 ASO-7724（n=6）50μgを週に2回皮下投与した。移植から29日目にマウスを安楽死させ、腫瘍を観察した。その結果、GREB1 ASO-6921及びGREB1 ASO-7724の双方において、コントロールASOと比較してHepG2細胞による腫瘍形成が抑制され、腫瘍重量が減少していた（図16のc参照）。また、各肝臓の腫瘍におけるGREB1及びPAI-1のmRNA量をリアルタイムPCRで分析した。更に、各肝臓の腫瘍の切片を、抗Ki-67抗体及びヘマトキシリンで染色し、ヘマトキシリン陽性細胞（全細胞）数に対するKi-67陽性細胞の割合を求めた。その結果、GREB1ASOs-6921及び-7724は、肝臓の腫瘍におけるGREB1発現を阻害し、Ki-67陽性細胞の数を減少させていることが分かった（図16のd参照）。また、各肝臓の腫瘍の切片を、抗cleaved caspase3抗体及びヘマトキシリンで染色し、ヘマトキシリン陽性細胞（全細胞）数に対するcleaved caspase3陽性細胞の割合を求めた。その結果、GREB1 ASO-6921及び-7724によって、腫瘍細胞のアポトーシスが誘導されていることが分かった（図16のe参照）。更に、前記各肝臓の腫瘍中のGREB1及びPAI-1のmRNA量をリアルタイムPCRで分析したところ、肝芽腫の腫瘍においてPAI-1遺伝子発現は、GREB1 ASO-6921及び-7724によって増加する傾向が認められ（図16のf参照）、TGFβシグナル伝達の活性化によって、腫瘍細胞の増殖及び生存が抑制されることが示唆された。また、各肝臓の非腫瘍部分の切片を、抗cleaved caspase3抗体及びヘマトキシリンで染色した。その結果、GREB1 ASO-6921及び-7724は、肝臓の非腫瘍領域において組織学的損傷または細胞死を誘導しないことが確認された（図17のb参照）。以上の結果から、GREB1に対するASOは、肝芽腫の新規な治療薬であり得ることが明らかとなった。
　更に、マウスGREB1を標的としたmGREB1 ASO-5715及びコントロールASO（表９参照）を作製し、BYMモデルにおける肝腫瘍形成に与える影響を分析した。ΔN90βカテニン、YAPS127A、及びc-Met（BYM）をヌードマウスへ導入し、導入から3日後からコントロールASO、マウスGREB1を標的としたASO（mGREB1 ASO-5715）50μgを週に2回皮下投与した。移植から6～7週間後の肝臓の腫瘍の外観を観察し、肝臓の重量の全体重に対する比率を分析した。その結果、mGREB1 ASO-5715の投与によって、肝腫瘍の形成が抑制される傾向が認められた（図17のc参照）。また、前記各肝臓の腫瘍中のGREB1 mRNA量をリアルタイムPCRで分析したところ、mGREB1 ASO-5715を投与したBMYマウスでは、腫瘍組織におけるGREB1の発現が抑制されていることが確認された（図17のd）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
２－９．　GREB1は神経芽腫において過剰発現する
　各種ヒトがん細胞株におけるGREB1のmRNA発現について、The Cancer Cell Line Encyclopedia 1 (CCLE)のデータセットをもとに解析した。GREB1は、これまでに報告されている乳がん細胞株に加えて、皮膚がん（メラノーマ）細胞株、神経芽腫細胞株、及び一部の肝細胞がん細胞株において高発現していた（図18のA参照）。神経芽腫細胞株SKNDZ細胞、CHP212細胞、及びNBTU110細胞におけるGREB1の発現をタンパク質レベルで解析したところ、GREB1を高発現する肝芽腫細胞株HepG2細胞と同程度、且つGREB1高発現の肝細胞がん細胞株Hep3B細胞及びJHH7細胞より高い発現を認めた（図18のB参照）。13症例の神経芽腫組織におけるGREB1とβ-カテニンの発現を免疫組織学的に検討した。前記の通り、小児肝がんである肝芽腫においては、GREB1はβ-カテニンの下流標的遺伝子として発現する。GREB1は、神経芽腫4例（30.7％）で腫瘍細胞の核に検出され、β-カテニンは11例（84.6％）で細胞質又は核に検出された（図18のC参照）。GREB1とβ-カテニンの発現の間に有意な発現相関は認められなかった（図18のD参照）。これらの結果から、GREB1は神経芽腫細胞においてβ-カテニン非依存的に過剰発現することが示唆された。
　神経芽腫細胞において、GREB1が細胞増殖に与える影響を検討した。CHP212細胞において、GREB1をアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を用いて発現抑制したところ、平面培養条件下での細胞増殖が抑制された（図18のE参照）。この結果から、神経芽腫においてGREB1は、細胞増殖に重要であることが明らかになった。
２－１０．　GREB1は一部の肝細胞がんにおいて過剰発現し、細胞増殖と腫瘍形成に関与する
　前記の通り、GREB1は小児肝がんである肝芽腫において、β-カテニンの下流標的遺伝子として発現する。一方、CCLEデータセットからGREB1は一部の成人肝細胞がんにおいても高発現することが示唆された（図18のA参照）。そこで、210症例の肝細胞がん組織におけるGREB1とβ-カテニンの発現を免疫組織学的に検討した。その結果、GREB1のみが核に高発現する症例、β-カテニンのみが核または細胞質に高発現する症例、GREB1とβ-カテニンがともに高発現する症例、又は共に染色が認められない陰性症例が認められた（図19のA参照）。GREB1は、肝細胞がん73例（34.7％）で腫瘍細胞の核に検出され、β-カテニンは93例（44.2%）で細胞質または核に検出された（図19のB参照）。また、GREB1とβ-カテニンの発現の間には有意な正の発現相関（ファイ相関係数: 0.41、P値＜0.0001）が認められた（図19のB参照）。更に、CCLEデータセットからGREB1が高発現していたHep3B細胞、JHH7細胞、Huh7細胞、及びGREB1が低発現であったHLE細胞、HLF細胞におけるGREB1の発現をウエスタンブロット法で解析した。その結果、肝細胞がん細胞Hep3B細胞、JHH7細胞、及びHuh7細胞において、GREB1はGREB1陽性乳がん細胞株MCF7細胞と肝芽腫細胞株HepG2細胞と比較するとやや低い発現量で、GREB1弱発現肝芽腫細胞株Huh6細胞と比較すると高い発現を認めた。一方、HLE細胞及びHLF細胞においてはGREB1の発現は認められなかった（図19のC参照）。GREB1高発現肝細胞がん細胞株におけるGREB1のβ-カテニン依存性を検討した。Hep3B細胞、JHH7細胞、及びHuh7細胞においてβ-カテニンを、siRNAを用いて発現抑制したところ、いずれもGREB1の発現が抑制された（図19のD参照）。これらの結果から、GREB1は一部の肝細胞がん細胞において、β-カテニン依存的に過剰発現することが示された。
　次に、肝細胞がん細胞において、GREB1が細胞増殖に与える影響を検討した。Hep3BおよびJHH7細胞において、GREB1をsiRNAにて発現抑制したところ、平面培養条件下での細胞増殖が抑制された（図19のE参照）。更に、肝細胞がんのin vivo腫瘍形成におけるGREB1の関与を明らかにする目的で、GREB1をノックアウトしたHep3BおよびJHH7細胞を作製し、異種移植皮下腫瘍形成分析を行った。その結果、GREB1をノックアウトしたHep3B細胞及びJHH7細胞は、コントロール細胞と比較して、移植6.5週後（Hep3B細胞）、移植2週後（JHH7細胞）において、腫瘍重量が有意に抑制された（図19のF及びG参照）。これらの結果から、GREB1は、肝細胞がんの細胞増殖とin vivoでの腫瘍形成において重要な役割を担っていることが判明した。
２－１１．　GREB1は皮膚メラノーマにおいて過剰発現し、細胞増殖に関与する
　CCLEデータセットからGREB1は皮膚メラノーマ細胞において高頻度に高発現することが示唆された（図18のA参照）。そこで、CCLEデータセットからGREB1が高発現していたメラノーマ細胞株であるMewo細胞、SKMEL28細胞、及びG361細胞におけるGREB1の発現をウエスタンブロット法で解析した。その結果、肝芽腫細胞HepG2細胞においてGREB1は野生型である216 kDa付近に検出されるのに対して、メラノーマ細胞ではいずれも100 kDa付近に検出された（図20のA参照）。そこで、GREB1の転写バリアントの発現を明らかにするために、TCGAデータセットをもとに、TCGA SpliceSeq (http://projects.insilico.us.com/TCGASpliceSeq)を用いて、乳がんと皮膚メラノーマにおけるGREB1のエクソン発現を検討した。GREB1には、The Universal Protein Resource (UniProt)上に４つのアイソフォーム（isoform; IS）（転写バリアント）が登録されている。IS1はGREB1aとも呼ばれ、1949アミノ酸（216kDa）の全長型；IS2はGREB1bとも呼ばれ、C末端側458-1949アミノ酸を欠失した457アミノ酸（49 kDa）の転写物；IS3はGREB1cとも呼ばれ、C末端側410-1949アミノ酸を欠失した409アミノ酸（43 kDa）の転写物；IS4はN末端側1－1002アミノ酸を欠失した947アミノ酸（107 kDa）の転写物である（図20のB参照）。GREB1は38のエクソンから構成され、乳がん組織においてはタンパクをコードするエクソン（エクソン4-38）全体にわたって発現を認めた。一方で、皮膚メラノーマにおいてGREB1は、エクソン24以降が発現しており、IS4が特異的に発現することが明らかになった（図20のB参照）。TCGA上では、IS4を発現するがんは皮膚及び眼内メラノーマのみであった（データ示さない）。
　皮膚メラノーマにおけるGREB1の発現制御機構を明らかにするために、TCGAデータセットを用いて、メラノーマにおいてGREB1と正の発現相関する遺伝子群を同定した。それらの遺伝子群のうち、相関係数が高い上位10の遺伝子にはMITFと、MITFの既知の下流標的遺伝子が8つ含まれていた（図20のC参照）。MITFはメラニン生合成系酵素遺伝子の発現を制御している転写因子であり、メラノサイトや網膜色素上皮細胞(RPE)等の分化を制御する。ヒトメラノーマ組織におけるGREB1とMITFの発現を免疫組織学的に検討したところ、連続標本においてGREB1とMITFは同一腫瘍領域で共発現していた（図20のD参照）。この結果から、GREB1がメラノーマにおいてMITFの標的遺伝子である可能性が示唆された。そこで、GREB1高発現メラノーマ細胞株COLO679細胞において、MITFのノックアウト細胞を作製したところ、コントロール細胞と比較してGREB1の発現が抑制されていた（図20のE参照）。
　皮膚メラノーマ細胞において、GREB1が細胞増殖に与える影響を検討した。SKMEL28細胞及びCOLO679細胞において、GREB1をsiRNA（SKMEL28細胞）またはantisense oligonucleotide (ASO) (COLO679細胞)を用いて発現抑制したところ、平面培養条件下での細胞増殖がいずれも抑制された（図20のF及びG参照）。これらの結果から、皮膚メラノーマにおいて特異的に発現するGREB1 IS4は、メラノーマの細胞増殖に重要であることが明らかになった。

Claims (13)

  1. 　GREB1の発現を抑制する物質を有効成分とする、性ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍の治療剤。
  2. 　前記物質が、GREB1に対するsiRNA、shRNA、dsRNA、アンチセンス核酸、及びリボザイムよりなる群から選択される少なくとも１種の核酸医薬である、請求項１に記載の治療剤。
  3. 　前記腫瘍が、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫である、請求項１又は２に記載の治療剤。
  4. 　肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫の罹患の有無を予測するための検査方法であって、
    　被験者から採取された肝臓組織、皮膚組織、又は神経組織において、GREB1の発現量を測定する工程を含む、検査方法。
  5. 　前記肝臓組織、皮膚組織、又は神経組織におけるGREB1の発現量を、抗GREB1抗体を用いた組織免疫によって測定する、請求項４に記載の検査方法。
  6. 　GREB1を検出するための試薬を含む、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫の検査薬。
  7. 　GREB1を検出するための試薬が、抗GREB1抗体又はその断片、或はGREB1 mRNA又はGREB1 cDNAとハイブリダイズできるプライマーである、請求項６に記載の検査薬。
  8. 　性ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍を罹患している患者に、GREB1の発現を抑制する物質を治療有効量投与する、性ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍の治療方法。
  9. 　前記腫瘍が、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫である、請求項９に記載の治療方法。
  10. 　GREB1の発現を抑制する物質の、性ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍の治療剤の製造のための使用。
  11. 　前記腫瘍が、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫である、請求項１０に記載の使用。
  12. 　性ホルモン感受性を示さないGREB1陽性腫瘍の治療に使用される、GREB1の発現を抑制する物質。
  13. 　前記腫瘍が、肝芽腫、肝細胞がん、悪性黒色腫、又は神経芽腫である、請求項１２に記載のGREB1の発現を抑制する物質。
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Title
MATSUMOTO, SHINJI ET AL.: "GREB1 induced by Wnt signaling promotes development of hepatoblastoma by suppressing TGFbeta signaling", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 10, 28 August 2019 (2019-08-28), pages 3882, XP055762899 *

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