CN103328978B - stathmin作为呋咱并苯并咪唑类药物应答的生物标记的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及stathmin作为生物标记用于预测针对化合物的应答，例如抗性，的用途，其中所述化合物是通式I的呋咱并苯并咪唑化合物

Description

stathmin作为呋咱并苯并咪唑类药物应答的生物标记的用途
技术领域
本发明涉及stathmin作为生物标记用于预测疾病应答的用途，所述疾病例如赘生性疾病或自身免疫疾病，优选癌症；本发明还涉及通式I的化合物，例如3-(4-{1-[2-(4-氨基-苯基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈（BAL27862）。在其他方面，本发明涉及使用生物标记的方法和试剂盒、以及治疗方法。
背景技术
微管是细胞骨架的组分之一，由α和β微管蛋白的异二聚体组成。靶向微管的试剂属于具有广谱活性的最有效的细胞毒性化学治疗剂。微管失稳剂（例如长春花生物碱,如长春花新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)和长春瑞滨(vinorelbine)）用于例如治疗几个类型的血液学恶性肿瘤，例如成淋巴细胞白血病和淋巴瘤、以及实体瘤例如肺癌。微管稳定剂（例如紫杉烷类(taxanes)，例如紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)）用于治疗例如实体瘤，包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌。
然而，可以出现对这些已知微管靶向剂的抗性。抗性可以是固有的、或可以在暴露于这些试剂后获得。此类抗性因此影响患者存活率、以及治疗方案的选择。几种潜在的抗性机制已得到鉴定，包括在微管靶标中的缺陷，例如升高水平的β-微管蛋白亚型III、和已知减少紫杉烷结合的β-微管蛋白亚型I中的获得性突变。此外，也已经提出了，其他细胞蛋白质中的缺陷与抵抗某些微管靶向试剂的抗性相关，例如p-糖蛋白（P-gp，也称为多药抗性蛋白1或MDR1）的过表达。此类因子随后可以用作针对这些常规微管靶向剂的抗性的生物标记。
相对近期发现的一类微管失稳剂是下式所涵盖的化合物：
其中
R表示苯基、噻吩基或吡啶基，
其中苯基任选地被一个或两个取代基取代，所述取代基独立地选自：烷基；卤代-低级烷基；羟基-低级烷基；低级烷氧基-低级烷基；酰氧基-低级烷基；苯基；羟基；低级烷氧基；羟基-低级烷氧基；低级烷氧基-低级烷氧基；苯基-低级烷氧基；低级烷基羰基氧基；氨基；单烷基氨基；二烷基氨基；低级烷氧基羰基氨基；低级烷基羰基氨基；取代的氨基，其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基；低级烷基羰基；羧基；低级烷氧基羰基；氰基；卤素；和硝基；且其中两个相邻的取代基为亚甲二氧基；
并且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示基团C＝Y，其中Y表示被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮；
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；
R2、R3和R6表示氢；
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基；
或R4和R5共同表示亚甲二氧基；
及其药学可接受的衍生物；
或其中
R表示苯基或吡啶基，
其中苯基任选地被一个或两个取代基取代，所述取代基独立地选自：烷基；卤代-低级烷基；羟基-低级烷基；低级烷氧基-低级烷基；酰氧基-低级烷基；苯基；羟基；低级烷氧基；羟基-低级烷氧基；低级烷氧基-低级烷氧基；苯基-低级烷氧基；低级烷基羰基氧基；氨基；单烷基氨基；二烷基氨基；低级烷氧基羰基氨基；低级烷基羰基氨基；取代的氨基，其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基；低级烷基羰基；羧基；低级烷氧基羰基；甲酰基；氰基；卤素；和硝基；且其中两个相邻的取代基为亚甲二氧基；
并且其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示氧；
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；
R2、R3和R6表示氢；
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基；
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
及其药学可接受的衍生物；
并且其中前缀“低级”表示具有至多且包括最多7个碳原子，尤其是至多且包括最多4个碳原子的基团。
这些化合物公开于引入本文作为交叉参考的WO2004/103994A1中。这些化合物已显示阻滞肿瘤细胞增殖且诱导细胞凋亡。
式I的化合物的合成在引入本文作为交叉参考的WO2004/103994A1中描述，一般描述见第29-35页，且具体描述见第39-55页。它们可以如公开的、或通过与其中描述的方案相似的方法进行制备。
属于此类别的一个化合物，称为BAL27862，作为实施例58显示于WO2004/103994A1中，在此特别引入本文作为参考；该化合物具有下面的结构和化学名称：
化学名称：3-(4-{1-[2-(4-氨基-苯基)-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基)-丙腈，
或在本文中为化合物A。
WO2004/103994A1中分别作为实施例50和79例示的其它化合物（在此特别引入本文作为交叉参考）具有下面的结构和化学名称：
化学名称：2-[2-（4-氨基-呋咱-3-基）-苯并咪唑-1-基]-1-（4-氨基-苯基）-乙酮
或在本文中作为化合物B；
和
化学名称：3-（4-{1-[2-（6-氨基-吡啶-3-基）-2-氧代-乙基]-1H-苯并咪唑-2-基}-呋咱-3-基氨基）-丙腈
或在本文中作为化合物C。
BAL27862在广泛的实体瘤异种移植物实验模型上具有活性。此外，甚至对选择的抗常规微管靶向试剂（包括长春花生物碱微管失稳剂和微管稳定剂紫杉醇和环氧噻唑酮B(epothiloneB)）的肿瘤模型，保留活性。BAL27862的活性在体外测试的任何模型中以及在人乳腺肿瘤异种移植物中均不受P-gp泵过表达的影响。另外，尽管升高水平的β-微管蛋白亚型III和微管蛋白亚型I中的突变，BAL27862保留其活性。
因此，BAL27862活性不受许多赋予对常规微管靶向试剂的抗性的因子影响。
此外，已知与其他微管靶向试剂（包括其他微管失稳剂）相比较，通式I的化合物对细胞表型具有不同影响。用通式I的化合物处理，在源自多个器官（例如肺、宫颈和乳腺）的肿瘤细胞系中诱导一致的微管表型，参见图1。用抗α-微管蛋白抗体染色这些细胞中的微管显示，与未经处理的细胞的有丝分裂纺锤丝不同，在经处理的细胞中仅可见点样结构。在图2A和2B中在肺癌细胞系A549上分别使用化合物C和B，也显示了相同的效果。然而，这非常不同于用常规微管靶向试剂长春花碱、秋水仙碱、紫杉醇和噻氨酯哒唑(nocodazole)所观察到的效果，分别见图3B、3C、3D和4。微管用抗α-微管蛋白抗体染色，并且细胞在1000x放大倍数观察（图3、4）。对于用BAL27862处理的细胞，可见多个点样结构，而形成鲜明对比的是，其他常规药物产生丝状微管结构、或致密的微管聚集体结构。在就抗增殖效应而言视为最佳的化合物剂量上，在表型水平上的这些差异表明了在分子水平上的作用模式的差异。
此外，已知BAL27862在其他微管靶向试剂的存在下引起显性的微管表型。单独用长春花碱、秋水仙碱、紫杉醇或噻氨酯哒唑处理诱导了这些试剂所特有的微管表型（分别为图5A、5D、5G、6C-6F）。然而，最后4个小时用BAL27862组合治疗导致了这些表型的破坏；尽管长春花碱、秋水仙碱、紫杉醇或噻氨酯哒唑持续存在（分别为图5B、5E、5H、6G-6J）。相比之下，首先用BAL27862处理、随后与长春花碱、秋水仙碱、紫杉醇或噻氨酯哒唑组合处理4小时，对于与BAL27862处理相符的表型的产生，没有影响（分别为图5C、5F、5I、6K-6N）。
这些数据都证实，BAL27862与常规微管靶向试剂以不同的方式影响微管生物学。
因此，从有关常规微管靶向试剂的信息，不能预测特定基因是否或如何参与通式I的化合物的作用。
发明概述
本发明的一个目的是，鉴定与针对式I化合物或其药学可接受衍生物的应答相关的因子，例如鉴定与针对式I化合物（特别是BAL27862）或其药学可接受衍生物的抗性相关的因子，如下文定义的。
已惊讶地发现，stathmin可以用作通式I的化合物或其药学可接受衍生物的治疗应答的生物标记，如下文定义的。
在本发明的一个优选实施方案中，在肿瘤样品中相对高的stathmin水平与针对BAL27862的固有抗性相关。
人stathmin具有人基因命名委员会识别号HGNCID：6510和Entrez基因ID3925。名称stathmin由Sobel等人在大鼠脑中研究该蛋白质后提出，该名称来自希腊语“stathmos”，意思是“接转”。（SobelA，BoutterinMC，BerettaL，ChneiweissH，DoyeV，Peyro-Saint-PaulH.，JBiolChem.1989Mar5；264（7）:3765-72.“Intracellularsubstratesforextracellularsignaling.Characterizationofaubiquitous，neuron-enrichedphosphoprotein（stathmin）.”）
stathmin也称为stathmin1；STMN1、癌蛋白18；OP18；prosolin；metablastin；白血病相关磷蛋白p18；LAP18；Lag；PP17；磷蛋白19；PP19；PR22；C1orf215；FLJ32206；MGC138869；MGC138870和SMN。为了简单起见，术语stathmin在本文中应该涵盖所有这些前面提及的同义词，且酌情指核酸（例如mRNA、cDNA、DNA）和蛋白质水平（包括所表达蛋白质的同种型和翻译后修饰形式）上的该实体。
在人中，stathmin基因位于染色体1上。编码stathmin同种型a和同种型b的蛋白质序列可分别经由美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）（NCBI）登记号NP_005554和NP_001138926获得。这些同种型在此处也以SEQIDNo.1（NP_005554.1）和SEQIDNo.2（NP_001138926.1）显示。对于stathmin同种型a,已知多个mRNA转录物变体。
本发明的一个方面涉及stathmin作为生物标记用于预测针对化合物的应答的用途，其中所述化合物是通式I的化合物，
其中
R表示苯基、噻吩基或吡啶基，
其中苯基任选地被一个或两个取代基取代，所述取代基独立地选自：烷基；卤代-低级烷基；羟基-低级烷基；低级烷氧基-低级烷基；酰氧基-低级烷基；苯基；羟基；低级烷氧基；羟基-低级烷氧基；低级烷氧基-低级烷氧基；苯基-低级烷氧基；低级烷基羰基氧基；氨基；单烷基氨基；二烷基氨基；低级烷氧基羰基氨基；低级烷基羰基氨基；取代的氨基，其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基；低级烷基羰基；羧基；低级烷氧基羰基；氰基；卤素；和硝基；且其中两个相邻的取代基为亚甲二氧基；
并且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示基团C＝Y，其中Y表示被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮；
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；
R2、R3和R6表示氢；
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基；
或R4和R5共同表示亚甲二氧基；
及其药学可接受的衍生物；
或其中
R表示苯基或吡啶基，
其中苯基任选地被一个或两个取代基取代，所述取代基独立地选自：烷基；卤代-低级烷基；羟基-低级烷基；低级烷氧基-低级烷基；酰氧基-低级烷基；苯基；羟基；低级烷氧基；羟基-低级烷氧基；低级烷氧基-低级烷氧基；苯基-低级烷氧基；低级烷基羰基氧基；氨基；单烷基氨基；二烷基氨基；低级烷氧基羰基氨基；低级烷基羰基氨基；取代的氨基，其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基；低级烷基羰基；羧基；低级烷氧基羰基；甲酰基；氰基；卤素；和硝基；且其中两个相邻的取代基为亚甲二氧基；
并且其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示氧；
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；
R2、R3和R6表示氢；
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基；
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
及其药学可接受的衍生物；
并且其中前缀“低级”表示具有至多且包括最多7个碳原子，尤其是至多且包括最多4个碳原子的基团。
优选地，应答可以针对受试者中的疾病。还优选地，应答可以针对治疗，即用通式I的化合物或其药学可接受衍生物的治疗。
生物标记stathmin在取自人体或动物体（优选得自人体）的一种或多种样品中离体进行测量。
在优选实施方案中，本发明涉及stathmin作为生物标记用于预测受试者中疾病对上文定义的通式I化合物或其药学可接受衍生物的抗性的用途。
优选地，药学可接受的衍生物选自通式I化合物的盐、溶剂合物、前体药物、前体药物的盐、多晶形物和异构体。前体药物优选是天然存在的氨基酸、小肽或聚乙二醇化羟酸的酯和酰胺。更优选地，前体药物是由通式I的化合物的R基团内存在的氨基和甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的羧基形成的酰胺。
特别优选地，化合物是
或其药学可接受的盐，优选其盐酸盐，最优选其二盐酸盐。
本发明的另一个方面涉及用于预测受试者中疾病针对如上文定义的通式I化合物或其药学可接受衍生物的应答的方法，其包括步骤：
a）在预先获自受试者的样品中测量stathmin水平，以获得代表这个水平的一个或多个值；和
b）将来自步骤a）的该一个或多个值与标准值或一组标准值进行比较。
进一步优选地，预测的应答是抗性。
stathmin水平（一个或多个）的测量在预先得自受试者的一个或多个样品中离体执行。“预先获得”是指，先获得样品、之后对样品实施涉及测量生物标记水平的任何方法，并且“预先获得”不应理解为与治疗有关。
在优选实施方案中，相对于标准值或一组标准值，来自受试者的样品中更高水平的stathmin预测抗性。
还优选地，疾病是赘生性或自身免疫疾病。更优选地，疾病是癌症。尤其优选地，癌症选自乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、胃癌、卵巢癌、结肠直肠癌（即包括结肠癌和直肠癌）、胰腺癌、肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液学恶性肿瘤、黑素瘤和肉瘤。更尤其优选地，癌症选自乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肺癌和黑素瘤。特别优选地，癌症选自胃癌、肺癌和黑素瘤。
在进一步方面，本发明涉及在有需要的受试者中治疗赘生性或自身免疫疾病，优选癌症，的方法，其包括测量来自受试者的样品中的stathmin水平，以获得代表该水平的一个或多个值，和如果所述样品中的stathmin水平不高于标准值（一个或一组），则用如上文定义的通式I化合物或其药学可接受衍生物治疗受试者。
在再进一步的方面，本发明涉及stathmin用于赘生性或自身免疫疾病（优选癌症）的治疗，其包括测量来自受试者的样品中的stathmin水平，以获得代表该水平的一个或多个值，和如果所述stathmin水平不高于标准值（一个或一组），则用如上文定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗受试者。
stathmin水平的测量在预先得自受试者的样品中离体执行。
在另一个方面，本发明还涉及治疗赘生性或自身免疫疾病，优选癌症，的方法：首先降低受试者中的stathmin水平，其中所述受试者的样品具有与一个或一组标准水平相比较更高水平的stathmin；随后用如上文定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗受试者。
在另外一个方面，本发明涉及用于预测针对如上文定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的应答的试剂盒，其包含测量样品中的stathmin水平所需的试剂。更优选地，试剂盒还包含比较器组件，其包含与样品中的stathmin水平进行比较的一个或一组标准值。
此外，优选地，试剂盒包含如上文定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物。在尤其优选的实施方案中，试剂盒包含下式的化合物或其药学可接受的盐：
化学名称：S-2,6-二氨基-己酸[4-（2-{2-[4-（2-氰基-乙基氨基）-呋咱-3-基]-苯并咪唑-1-基}-乙酰基）-苯基]-酰胺。
在特别优选的实施方案中，药学可接受的盐是二盐酸盐。
本发明的再一方面涉及用于预测针对如上文定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的应答的装置，其包含测量样品中的stathmin水平所需的试剂，和包含与样品中的stathmin水平进行比较的一个或一组标准值的比较器组件。
在优选实施方案中，试剂盒或装置中的试剂包括含有stathmin的检测物的捕获试剂和检测试剂。尤其优选地，捕获试剂是抗体。还优选地，当stathmin相对于一个或一组标准值更高时，疾病预测为对用所述化合物的治疗具有抗性。在优选实施方案中，比较器组件包括在试剂盒的使用说明书中。在另一个优选实施方案中，比较器组件为展示装置的形式。
本发明的实施方案现在将通过参考附图以举例方式进行描述。然而，本发明不应理解为限制于这些实施方案。
附图简述
图1显示：用50nMBAL27862处理来自不同组织类型的人肿瘤细胞系。在用50nMBAL27862或媒介物对照24小时处理后，染色有丝分裂或G2/M停滞的细胞的微管。
图1A和1B：A549NSCLC细胞；
图1C和1D：HeLa宫颈癌细胞；
图1E和1F：SKBR3乳腺癌细胞
媒介物对照处理：图1A、1C&1E，
BAL27862处理：图1B、1D&1F。
图2显示：用化合物B和C处理A549NSCLC细胞。在分别用80nM或20nM化合物B和C进行24小时处理后，染色有丝分裂或G2/M停滞的A549NSCLC细胞的微管。白色比例条代表10微米。
图2A：用20nM化合物C处理
图2B：用80nM化合物B处理
图3显示：与常规微管靶向试剂相比较，用BAL27862处理的细胞。在用50nMA：BAL27862；B：长春花碱；C：秋水仙碱；D：紫杉醇进行24小时处理后，染色有丝分裂或G2/M停滞的A549NSCLC细胞的微管。通过使用ImageJ软件，处理按每1μm获取的多叠图像。
图4显示：与噻氨酯哒唑相比较，用BAL27862处理的A549NSCLC细胞。在用多个浓度的噻氨酯哒唑（B、C&D）和BAL27862（E、F&G）处理24小时后，染色有丝分裂或G2/M停滞的细胞的微管。A：对照，B：噻氨酯哒唑50nM，C：噻氨酯哒唑100nM，D：噻氨酯哒唑200nM，E：BAL2786220nM；F：BAL2786230nM和G：BAL2786250nM。白色比例条代表10微米。显示了观察到的微管表型的代表性图像。
图5显示：用BAL27862和常规微管靶向试剂的治疗组合。在处理以下所示的时间后，染色有丝分裂或G2/M停滞的A549NSCLC细胞的微管。使用50nMBAL27862、50nM长春花碱、50nM秋水仙碱和25nM紫杉醇。白色比例条代表10微米。
图5A:24小时长春花碱处理；
图5B:24小时长春花碱处理，其中最后4小时包括BAL27862；
图5C:24小时BAL27862处理，其中最后4小时包括长春花碱。
图5D:24小时秋水仙碱处理；
图5E:24小时秋水仙碱处理，其中最后4小时包括BAL27862；
图5F:24小时BAL27862处理，其中最后4小时包括秋水仙碱.
图5G:24小时紫杉醇处理；
图5H:24小时紫杉醇处理，其中最后4小时包括BAL27862；
图5I:24小时BAL27862处理，其中最后4小时包括紫杉醇。
图6显示：用BAL27862和噻氨酯哒唑的治疗组合。在处理下示时间后，染色有丝分裂或G2/M停滞的A549NSCLC细胞的微管。使用25nMBAL27862和下示浓度的噻氨酯哒唑。白色比例条代表10微米。
图6A：24小时对照处理；
图6B：24小时25nMBAL27862处理；
图6C：24小时50nM噻氨酯哒唑处理
图6D：24小时100nM噻氨酯哒唑处理
图6E：24小时150nM噻氨酯哒唑处理
图6F：24小时200nM噻氨酯哒唑处理
图6G：24小时50nM噻氨酯哒唑处理，其中最后4小时包括25nMBAL27862；
图6H：24小时100nM噻氨酯哒唑处理，其中最后4小时包括25nMBAL27862；
图6I：24小时150nM噻氨酯哒唑处理，其中最后4小时包括25nMBAL27862；
图6J：24小时200nM噻氨酯哒唑处理，其中最后4小时包括25nMBAL27862；
图6K：24小时25nMBAL27862处理，其中最后4小时包括50nM噻氨酯哒唑；
图6L：24小时25nMBAL27862处理，其中最后4小时包括100nM噻氨酯哒唑；
图6M：24小时25nMBAL27862处理，其中最后4小时包括150nM噻氨酯哒唑；
图6N：24小时25nMBAL27862处理，其中最后4小时包括200nM噻氨酯哒唑。
图7：由得自皮下异种移植小鼠的患者来源的胃癌（图7A）和肺癌（图7B）和黑素瘤（图7C）肿瘤，制备蛋白质提取物，并且通过免疫印迹分析stathmin表达，其中包括肌动蛋白作为上样对照。在每种情况下分析三个独立肿瘤（1–3）。BAL27862、紫杉醇和长春花碱抗性和敏感性如表1中定义。
图8：患者来源的异种移植胃肿瘤中的stathmin水平的免疫组织化学分析。GXF251：BAL27862敏感的；GXF97：BAL27862抗性的。BAL27862、紫杉醇和长春花碱抗性和敏感性如表1中定义。
图9：在掺入重组stathmin的人血清中stathmin的ELISA定量的标准曲线。（参见图10）。Y轴=在450nm处的光密度，X轴=stathmin浓度（ng/mL）。y=0.2723x+0.2806，R2=0.9314。
图10：掺入stathmin的人血清的ELISA分析。基于图9中的标准曲线，计算测量的实际浓度（y轴）。
图11显示：对于stathmin，在肿瘤细胞中的蛋白质水平通过其RNA表达水平反映。图11A：由HeLa、H460和A549细胞系制备样品，并且对这些执行定量RT-PCR，以测量RNA水平。将HeLa结果设为100%，图中显示相对于HeLa值，在H460和A549样品中的RNA表达水平。由同世代的HeLa、H460和A549细胞系，制备全细胞蛋白质提取物，并且随后通过免疫印迹分析stathmin蛋白表达。肌动蛋白水平充当上样对照。
图12A显示：stathmin同种型a[智人]的蛋白质序列（序列IDNo.1）。
图12B显示：stathmin同种型b[智人]的蛋白质序列（序列IDNo.2）。
图13显示：智人stathmin转录物变体3的核酸序列（SEQ.ID.No.3）。
图14显示：智人stathmin转录物变体2的核酸序列（SEQ.ID.No.4）。
图15显示：智人stathmin转录物变体1的核酸序列（SEQ.ID.No.5）。
图16显示：智人stathmin1（STMN1）转录物变体4的核酸序列（SEQ.ID.No.6）。
发明详述
式I的化合物
根据本发明的化合物由通式I表示：
其中
R表示苯基、噻吩基或吡啶基，
其中苯基任选地被一个或两个取代基取代，所述取代基独立地选自：烷基；卤代-低级烷基；羟基-低级烷基；低级烷氧基-低级烷基；酰氧基-低级烷基；苯基；羟基；低级烷氧基；羟基-低级烷氧基；低级烷氧基-低级烷氧基；苯基-低级烷氧基；低级烷基羰基氧基；氨基；单烷基氨基；二烷基氨基；低级烷氧基羰基氨基；低级烷基羰基氨基；取代的氨基，其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基；低级烷基羰基；羧基；低级烷氧基羰基；氰基；卤素；和硝基；且其中两个相邻的取代基为亚甲二氧基；
并且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示基团C＝Y，其中Y表示被羟基或低级烷氧基取代的氧或氮；
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；
R2、R3和R6表示氢；
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基；
或R4和R5共同表示亚甲二氧基；
及其药学可接受的衍生物；
或其中
R表示苯基或吡啶基，
其中苯基任选地被一个或两个取代基取代，所述取代基独立地选自：烷基；卤代-低级烷基；羟基-低级烷基；低级烷氧基-低级烷基；酰氧基-低级烷基；苯基；羟基；低级烷氧基；羟基-低级烷氧基；低级烷氧基-低级烷氧基；苯基-低级烷氧基；低级烷基羰基氧基；氨基；单烷基氨基；二烷基氨基；低级烷氧基羰基氨基；低级烷基羰基氨基；取代的氨基，其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基；低级烷基羰基；羧基；低级烷氧基羰基；甲酰基；氰基；卤素；和硝基；且其中两个相邻的取代基为亚甲二氧基；
并且其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示氧；
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；
R2、R3和R6表示氢；
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基；
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
及其药学可接受的衍生物；
并且其中前缀“低级”表示具有至多且包括最多7个碳原子，尤其是至多且包括最多4个碳原子的基团。
杂环基优选表示含有4-10个原子、包括1、2或3个选自氮、氧和硫的杂原子的饱和、部分饱和或不饱和单环或双环，除非另有说明，它们可以为碳或氮连接的，其中环氮原子可以任选被选自低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基和酰基的基团取代，且环碳原子可以被低级烷基、氨基-低级烷基、芳基、芳基-低级烷基、杂芳基、低级烷氧基、羟基或氧代取代。杂环基的实例为吡咯烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、二氧戊环基和四氢吡喃基。
酰基例如表示烷基羰基、环己基羰基、芳基羰基、芳基-低级烷基羰基或杂芳基羰基。低级酰基优选为低级烷基羰基，特别是丙酰基或乙酰基。
优选地，根据本发明的通式I的化合物被定义为其中R1选自氢、乙酰基、CH2CH2CN和CH2CH2CH2OH。
在一个优选实施方案中，根据本发明的通式I的化合物选自：
4-(1-苯甲酰甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-呋咱-3-基胺，
4-[1-(4-溴苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺肟，
N-{4-[1-(4-氯苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基}-乙酰胺，
4-[1-(4-氯苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基-N-(2-氰基乙基)-胺，
4-[1-(4-氯苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基-N-(3-羟基丙基)-胺，
4-[1-(3-氨基-4-氯苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺，
4-[1-(3-甲氧基-4-甲氧基甲氧基-苯甲酰甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺，
及其药学可接受的衍生物。
在另一个优选实施方案中，根据本发明的通式I的化合物是：
其中
R、Y和R1如下定义：
及其药学可接受的衍生物。
在另外一个优选实施方案中，根据本发明的通式I的化合物选自：
4-(1-苯氧基甲基-1H-苯并咪唑-2-基)-呋咱-3-基胺，
4-[1-(4-氟苯氧基甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基胺，
4-[1-(3,4-二甲基苯氧基甲基)-1H-苯并咪唑-2-基]-呋咱-3-基-N-(2-氰基乙基)-胺，
和由下式表示的化合物：
其中R和R1如下定义
或其药学可接受的衍生物。
在另外一个优选实施方案中，根据本发明的通式I的化合物是：
其中R、R4和R5如下定义
或其药学可接受的衍生物。
更优选地，根据本发明的化合物是通式I的化合物：
其中
R表示苯基或吡啶基，
其中苯基任选被独立地选自低级烷基、低级烷氧基、氨基、乙酰氨基、卤素和硝基的一个或两个取代基取代；
和其中吡啶基任选被氨基或卤素取代；
X表示基团C=O；
R1表示氢或氰基-低级烷基；
R2、R3、R4、R5和R6表示氢；
及其药学可接受的衍生物，
并且其中前缀“低级”表示具有至多且包括最多7个碳原子，尤其是至多且包括最多4个碳原子的基团。
尤其优选地，根据本发明的化合物由下式表示：
其中R、Y和R1如下定义：
或其药学可接受的衍生物。
更尤其优选地，根据本发明的化合物由下式表示：
其中R、Y和R1如下定义：
或其药学可接受的衍生物。
特别优选地，根据本发明的通式的化合物是：
或其药学可接受的衍生物。
在短语通式I的化合物的“药学可接受的衍生物”中，术语“衍生物”涉及其盐、溶剂合物和复合物，并且涉及其盐的溶剂合物和复合物，以及其前体药物、多晶形物和异构体(包括光学、几何和互变异构体)以及其前体药物的盐。在更优选的实施方案中，它涉及盐和前体药物，以及其前体药物的盐。
盐优选是酸加成盐。盐优选由含有碱性氮原子的式(I)化合物与有机酸或无机酸形成，尤其是药学上可接受的盐。合适的无机酸例如为：氢卤酸如盐酸、硫酸或磷酸。合适的有机酸例如为羧酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、乙醇酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、氨基酸如谷氨酸或天冬氨酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、环己烷羧酸、金刚烷-羧酸、苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、邻苯二甲酸、苯基乙酸、扁桃酸、肉桂酸、甲-或乙-磺酸、2-羟基乙磺酸、乙-1,2-二磺酸、苯磺酸、2-萘磺酸、1,5-萘-二磺酸、2-、3-或4-甲基-苯磺酸、甲基硫酸、乙基硫酸、十二烷基硫酸、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-、N-乙基-或N-丙基-氨基磺酸或其它有机质子酸，如抗坏血酸。
根据本发明的化合物可以以前体药物的形式施用，所述前体药物在人体或动物体内分解，以给出式I的化合物。前体药物的例子包括式I的化合物的可在体内水解的酯和酰胺。考虑的特定前体药物是天然存在的氨基酸的酯和酰胺，以及小肽的酯或酰胺（特别是由至多五个、优选两个或三个氨基酸组成的小肽），以及聚乙二醇化羟酸（优选羟基乙酸和乳酸）的酯和酰胺。前体药物酯可以由氨基酸的酸官能团或肽的C末端和式I的化合物中的合适羟基形成。前体药物酰胺可以由氨基酸的氨基官能团或肽的N末端和式I的化合物中的合适羧基形成，或由氨基酸的酸官能团或肽的C末端和式I的化合物中的合适氨基形成。特别优选地，前体药物酰胺由式I的R基团内存在的氨基形成。
更优选地，前体药物通过对式I的化合物添加甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸形成。
甚至更优选地，通式I的化合物为选自下式化合物的前体药物的形式：
在尤其优选的实施方案中，根据本发明的化合物为具有下式的前体药物的形式：
在最尤其优选的实施方案中，根据本发明的化合物是下式的化合物的药学可接受的盐、优选盐酸盐、最优选二盐酸盐：
在此情况下体内的药物活性代谢物是BAL27862。
这些前体药物可以通过本身已知的方法进行制备，特别是这样的方法，其中式(II)的化合物
其中R1如式(I)中的定义且Z是CH或N、
或包含被保护的官能团的该化合物的衍生物、
或其盐
(1)由式(III)的氨基酸酰化
其中
R10选自氢(Gly)；甲基(Ala)和受保护的氨基丁基(Lys)，并且R11是合适的氨基保护基团，和
(2)去除所得到的化合物的受保护的衍生物中的任何保护基团，以获得如上所述的前体药物，和如果需要的话，
(3)通过用酸处理将所述前体药物转换成盐，或将式(II)的化合物的盐转换成相应的式(II)的游离化合物或另一种盐，和/或将异构体产物化合物的混合物拆分成单个异构体。
用式(III)的氨基酸酰化式(II)的化合物可以以本身已知的方式执行，通常在合适的极性或偶极非质子溶剂的存在下，按需要进行冷却或加热，例如在约-80℃到约+150℃、更优选-30℃到+120℃的温度范围中，尤其是在大致约0℃到所使用溶剂的回流温度的范围中。任选地，添加合适的碱，特别是芳香族碱，如吡啶或可力丁、或叔胺碱例如三乙胺或二异丙基乙胺、或无机碱盐例如碳酸钾或钠。
酰化可以在肽化学中本身已知的用于酰胺形成的条件下完成，例如对于羧基，使用活化剂例如碳化二亚胺，如N,N’-二乙基-、N,N’-二丙基-、N,N’-二异丙基-、N,N’-二环己基碳化二亚胺和N-(3-二甲基氨基异丙基)-N’-乙基碳化二亚胺-盐酸盐(EDC)，或用试剂例如1-羟基苯并三唑(HOBt)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐(BOP)、O-(7-氮杂-苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基-脲四氟磷酸盐(HATU)、2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1,1,3,3-四甲基-脲四氟硼酸盐(TPTU)，任选在合适的碱、催化剂或共试剂的存在下。羧基还可以，任选地在合适的碱、催化剂或共试剂的存在下，例如通过与亚硫酰氯或草酰氯反应而活化为酰卤、优选活化为酰氯，或例如通过与卤代甲酸酯如氯甲酸乙基酯反应而活化为对称或不对称酐。
如果在式(II)或(III)的化合物中一个或多个其它官能团例如羧基、羟基或氨基因为不应参与反应而被保护或需要被保护，则这些是通常应用于酰胺等（特别是肽化合物、头孢菌素、青霉素、核酸衍生物和糖）合成中的保护基团，其是本领域技术人员已知的。关于氨基的合适保护基团是例如叔丁基氨基甲酸酯、苄基氨基甲酸酯、或9-芴基甲基氨基甲酸酯。
保护基团可以已存在于前体中，并且应保护有关的官能团不发生不想要的次级反应，例如烷基化、酰化、醚化、酯化、氧化、溶剂分解和类似反应。保护基团的特征是，其导致自身容易去除（即不发生不想要的次级反应），典型地通过溶剂分解、还原、光解或通过酶活性，例如在类似于生理条件的条件下；而且其不存在于终产物中。技术人员知道或可以容易地确定何种保护基团对于上文和下文提及的反应是合适的。
关于此类保护基团对官能团的保护、保护基团自身及其去除反应，描述在例如肽合成的标准参考书和关于保护基团的专业书中，例如J.F.W.McOmie，"ProtectiveGroupsinOrganicChemistry"，PlenumPress，LondonandNewYork1973，in"MethodenderorganischenChemie"(Methodsoforganicchemistry)，Houben-Weyl，第4版，第15/I卷，GeorgThiemeVerlag，Stuttgart1974，和T.W.Greene，G.M.Wuts"ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis"，Wiley，NewYork，2006。
疾病
根据本发明的通式I的化合物已显示阻滞细胞增殖、且例如通过细胞凋亡，诱导细胞死亡。
细胞增殖失调或缺乏适当的细胞死亡具有广泛的临床内涵。与这类失调相关的许多疾病包括增殖过度、炎症、组织重塑和修复。在这类中常见的适应征包括癌症、再狭窄、新内膜增生、血管生成、子宫内膜异位、淋巴增生疾病、移植相关性病理情况(移植物排斥)、息肉病、组织重塑情况中的神经功能丧失等。
癌症与异常细胞增殖和细胞死亡率相关。由于细胞凋亡在大部分类型的增生性、赘生性疾病中受到抑制或延缓，因此诱导细胞凋亡是癌症、尤其是表现出对传统化疗、放疗和免疫疗法耐受的癌症类型的治疗选择(《细胞凋亡与癌症化疗》(ApoptosisandCancerChemotherapy)，Hickman和Dive编辑，BlackwellPublishing，1999)。另外，在自身免疫和移植相关性疾病和病理情况中，诱导细胞凋亡的化合物可以用于恢复正常细胞死亡过程且由此可以根除症状并可能治愈该病。诱导细胞凋亡的化合物可进一步应用于再狭窄，即动脉壁上血管平滑肌细胞的聚集，和因无法根除细菌和病毒感染的细胞而导致的持续感染。此外，在上皮细胞、内皮细胞、肌细胞和其它已经与胞外基质丧失接触的细胞中可以诱导或重建细胞凋亡。
根据通式I的化合物或其药学可接受的衍生物可以用于人体或动物体的预防或尤其是治疗，特别是用于治疗赘生性疾病、自身免疫疾病、移植相关病理情况和/或变性疾病。此类赘生性疾病的例子包括但不限于，上皮瘤、鳞状细胞瘤、基底细胞瘤、移行细胞乳头状瘤和癌、腺瘤和腺癌、附件和皮肤附件瘤、粘液表皮样瘤、囊性瘤、粘液性和浆液性瘤、导管-、小叶和髓瘤、腺泡细胞瘤、复合性上皮瘤、特化的生殖腺瘤(specializedgonadalneoplasm)、副神经节瘤和血管球瘤、痣和黑素瘤、软组织肿瘤和肉瘤、纤维瘤、粘液瘤、脂肪瘤、肌瘤、复合混合型间质瘤(complexmixedandstromalneoplasm)、纤维上皮瘤(fibroepithelialneoplasm)、滑液样瘤、间皮瘤、生殖细胞瘤、滋养层瘤、中肾瘤、血管肿瘤、淋巴管瘤、骨和软骨瘤、巨细胞瘤、杂类骨瘤(miscellaneousbonetumor)、牙源性肿瘤、神经胶质瘤、神经上皮瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、颗粒细胞瘤和软组织腺泡状肉瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、其它淋巴网状内皮细胞(lymphoreticular)瘤、浆细胞瘤、肥大细胞瘤、免疫增生性疾病、白血病、杂类骨髓增生性障碍、淋巴增生性障碍和骨髓增生异常综合征。
通式I的化合物或其药学可接受的衍生物可以用于治疗自身免疫疾病。此类自身免疫疾病的例子包括但不限于，系统性、盘状或亚急性皮肤型红斑狼疮；类风湿性关节炎；抗磷脂综合征；CREST；进行性全身性硬化症；混合性结缔组织病(Sharp综合征)；赖特尔综合征；幼年关节炎；冷凝集素病；原发性混合型冷球蛋白血症；风湿热；强直性脊椎炎；慢性多发性关节炎；重症肌无力；多发性硬化；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病；格-巴综合征；皮肌炎/多发性肌炎；自身免疫性溶血性贫血；血小板减少性紫癜(thrompocytopenicpurpura)；中性白细胞减少；I型糖尿病；甲状腺炎(包括桥本病和格雷夫斯病)；艾迪生病；多腺体综合征；天疱疮(寻常性天疱疮、落叶性天疱疮、皮脂性天疱疮(sebaceous)和增殖性天疱疮)；大疱性和瘢痕性类天疱疮；妊娠性类天疱疮(pemphigoidgestationis)；后天性大疱性表皮松解；线状IgA病；硬化萎缩性苔癣；杜林病(morbusDuhring)；寻常型银屑病；滴状、泛发性脓疱性牛皮癣和局限性脓疱性银屑病；白癜风；斑形脱发；原发性胆汁性肝硬变；自身免疫性肝炎；所有形式的肾小球肾炎；肺出血(肺出血-肾炎综合征)；IgA肾病；恶性贫血和自身免疫性胃炎；炎性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)；贝赫切特病；乳麋泻病(Celic-Spruedisease)；自身免疫性葡萄膜炎；自身免疫性心肌炎；肉芽肿性睾丸炎；无睾丸炎的精子形成缺乏；特发性和继发性肺纤维化；带有自身免疫性发病机制可能性的炎性疾病，如坏疽性脓皮病、红苔藓、结节病(包括Lofgren和皮肤/皮下类型)、环形肉芽肿、过敏性I型和IV型免疫反应、支气管哮喘、花粉热、特应性、接触性和空气播散皮炎；大血管血管炎(巨细胞和高安动脉炎)、中等尺寸血管的血管炎(结节性多动脉炎、川畸病)；小血管血管炎(韦氏肉芽肿、丘-斯综合征、microscopicpolangiitis；亨-舍紫癜；原发性冷球蛋白血症性血管炎、皮肤白细胞分裂性血管炎)；高敏综合征；中毒性表皮坏死松解症(斯-约综合征、多形性红斑)；因药物副作用导致的疾病、因I-VI型(Coombs分类)免疫反应形式导致的所有形式的皮肤、器官特异性和全身作用；移植相关性病理情况，如急性和慢性移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病，涉及所有器官(皮肤、心脏、肾、骨髓、眼、肝、脾、肺、肌肉、中枢神经系统和外周神经系统、结缔组织、骨、血液和淋巴管、生殖泌尿系统、耳、软骨、原发性和继发性淋巴系统，包括骨髓、淋巴结、胸腺、胃肠道，包括口咽、食管、胃、小肠、结肠和直肠，包括下至单细胞水平和亚结构的上述器官的部分，例如干细胞)。
特别优选地，根据本发明的疾病是赘生性或自身免疫疾病。在尤其优选的实施方案中，疾病是癌症。
就受累身体器官和部分而言,癌症的例子包括但不限于,乳腺、宫颈、卵巢、结肠、直肠(包括结肠和直肠，即结肠直肠癌)、肺(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌和间皮瘤)、内分泌系统、骨、肾上腺、胸腺、肝、胃、肠(包括胃癌)、胰腺、骨髓、血液学恶性肿瘤(例如淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴样恶性肿瘤)、膀胱、泌尿道、肾、皮肤、甲状腺、脑、头、颈、前列腺和睾丸。优选地，癌症选自乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液学恶性肿瘤、黑素瘤和肉瘤。尤其优选地，癌症选自乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肺癌和黑素瘤。更尤其优选地，癌症选自胃癌、肺癌和黑素瘤。
样品
stathmin水平的测量可以在体外、对源自受试者的生物材料的样品执行。样品可以是从身体分离的任何生物材料，例如正常组织、肿瘤组织、细胞系、血浆、血清、全血、脑脊髓液、淋巴液、循环肿瘤细胞、细胞裂解物、组织裂解物、尿和抽吸物。优选地，样品源自正常组织、肿瘤组织、细胞系、循环肿瘤细胞、血清、血浆或全血。更优选地，样品源自肿瘤组织、循环肿瘤细胞或血清。甚至更优选地，样品源自肿瘤组织或血清。在一个特别优选的实施方案中，样品源自肿瘤组织。例如，stathmin水平可以在新鲜、冷冻或福尔马林固定/石蜡包埋的肿瘤组织样品中进行测量。在另一个特别优选的实施方案中，样品源自血清。
从受试者中预先获得样品，之后对样品实施涵盖测量生物标记水平的方法步骤。用于取出样品的方法是本领域众所周知的，并且它可以例如通过活组织检查从受试者中取出，例如通过穿刺活检、空芯针穿刺活检或细针抽吸活检、内窥镜活检或表面活检。可以通过静脉穿刺，收集全血、血浆或血清样品，并且根据标准技术进一步加工。也可以基于例如大小(例如ISET–通过上皮肿瘤细胞大小的分离)或免疫磁性细胞富集(例如，Veridex，Raritan，NJ)，从血液中获得循环肿瘤细胞。
样品比较
根据本发明的受试者可以是人或动物。优选地，受试者是人。
生物标记stathmin在得自人体或动物体，优选得自人体，的一或多个样品中离体进行测量。从人体或动物体中预先获得、优选从人体中预先获得该一或多个样品，之后对样品实施涉及测量生物标记水平的方法步骤。
生物标记一般指这样的物质，其可以用作对给定治疗的生物学应答的指标，优选用作对给定治疗的敏感性的指标，在本申请中所述给定治疗是用通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的治疗。
在特别优选的实施方案中，相对于一个或一组标准值，样品中更高的stathmin水平预测抗性。
如本文使用的，相对于一个或一组标准水平，增加的或相对高的或高的或更高的水平意指，相对于该一个或一组标准水平，样品中生物标记的量或浓度可检测地更大。这包括，相对于标准，增加或高至少约1%的水平，优选相对于标准，增加至少约5%。更优选地，它是相对于标准，增加或高至少约10%的水平。更特别优选地，它是相对于标准，增加或高至少约20%的水平。例如此类增加或更高水平可以包括但不限于，相对于标准，至少约1%、约10%、约20%、约30%、约50%、约70%、约80%、约100%、约150%或约200%或更多。
优选地，
i)相对于来自具有相同肿瘤组织类型的受试者的一个或一组标准值；或
ii)相对于来自正常细胞、组织或体液的一个或一组标准值；
一个或多个样品中更高的stathmin水平预测抗性。
stathmin水平的测量在预先得自受试者的样品中离体执行。进一步优选地，待预测的应答是抗性。
尤其优选地，相对于得自具有相同肿瘤组织类型的受试者的一个或一组标准值，一个或多个样品中更高的stathmin水平预测抗性。
在一个优选实施方案中，对于其中将一个或多个样品中的测量结果与得自正常细胞或组织的一个或一组标准值进行比较的情况ii)，可以由正常(即非肿瘤)细胞、组织或体液的样品建立该一个或一组标准值。此类数据可以从受试者群体中收集，以便产生该一个或一组标准值。
在另一个优选实施方案中，对于其中将一个或多个样品中的测量结果与得自与该待比较样品具有相同肿瘤组织类型的受试者的样品的一个或一组标准值进行比较的情况i)，可以由取自具有该癌症类型的受试者群体的样品，建立该一个或一组标准值。来自这些标准受试者的样品可以例如源自肿瘤组织或循环肿瘤细胞、血清、血浆或全血，条件是样品的来源在标准和待比较的样品之间是一致的。由预先获得的样品离体建立该一个或一组标准值，所述预先获得的样品可以是来自细胞系、或优选是得自至少一个受试者的生物材料，且更优选来自受试者的平均值(例如n=2至1000或更多)。该一个或一组标准值随后可以与相同细胞系或相同受试者对通式I化合物或其药学可接受衍生物治疗的应答数据关联。根据这个关联，可以建立比较器组件，例如以相对评级或评分系统的形式，任选地包括截断值或阈值，该比较器组件指示与针对式I化合物或其药学可接受衍生物的应答水平谱相关的生物标记水平。应答水平谱可以包括对化合物的治疗活性的相对敏感性(例如高敏感性到低敏感性)、以及对治疗活性的抗性。在优选实施方案中，该比较器组件包括预测对治疗的抗性的一个或一组截断值。
例如，如果免疫组织化学方法用于测量样品中的stathmin水平，则标准值可以为评分系统的形式。此类系统可以考虑其中存在stathmin染色的细胞的百分比。该系统还可以考虑单个细胞中的相对染色强度。stathmin水平的该一个或一组标准值随后可以与指示受试者或组织或细胞系对通式I化合物或其药学可接受衍生物的治疗活性的应答，尤其是抗性，的数据相关联。此类数据随后可以形成比较器组件的部分。
应答是细胞系、或优选受试者、或更优选受试者的疾病针对通式I化合物或其药学可接受衍生物的治疗活性的反应。应答水平谱可以包括对化合物的治疗活性的相对敏感性(例如高敏感性到低敏感性)、以及对治疗活性的抗性。应答数据可以例如就下述进行监测：客观应答率、达疾病进展的时间、无进展存活和总体存活。
癌性疾病的应答可以通过使用癌症治疗领域的技术人员众所周知的标准进行评估，例如但不限于：
实体肿瘤应答评估标准指南(ResponseEvaluationCriteriainSolidTumors(RECIST)Guidelines)，出处:EisenhauerEA，TherasseP，BogaertsJ，SchwartzLH，SargentD，FordR，DanceyJ，ArbuckS,GwytherS，MooneyM，RubinsteinL，ShankarL，DoddL，KaplanR，LacombeD，VerweijJ.新实体肿瘤应答评估标准：修订的RECIST指南（Newresponseevaluationcriteriainsolidtumours:revisedRECISTguideline）(版本1.1).EurJCancer.2009；45:228-47；
高分级神经胶质瘤的RANO标准(RANOCriteriaforHigh-GradeGliomas)，出处:WenPY，MacdonaldDR，ReardonDA，CloughesyTF，SorensenAG，GalanisE，DegrootJ，WickW，GilbertMR，LassmanAB，TsienC，MikkelsenT，WongET，ChamberlainMC，StuppR，LambornKR，VogelbaumMA，vandenBentMJ，ChangSM.更新的高级别神经胶质瘤应答评价标准：在神经学-肿瘤学工作组中的应答评价（Updatedresponseassessmentcriteriaforhigh-gradegliomas:responseassessmentinneuro-oncologyworkinggroup）.JClinOncol.2010；28(11):1963-72；
CA-125Rustin的卵巢癌应答标准(CA-125RustinCriteriaforOvarianCancerResponse)，出处:RustinGJ，QuinnM，ThigpenT，duBoisA，Pujade-LauraineE，JakobsenA，EisenhauerE，SagaeS,GrevenK，VergoteI，CervantesA，VermorkenJ.回复：评价实体肿瘤(卵巢癌)治疗应答的新指南(Re:Newguidelinestoevaluatetheresponsetotreatmentinsolidtumors(ovariancancer)).JNatlCancerInst.2004；96(6):487-8；
和
PSA工作组2的前列腺癌症应答标准(PSAWorkingGroup2CriteriaforProstateCancerResponse)，出处:ScherHI，HalabiS，TannockI，MorrisM，SternbergCN，CarducciMA，EisenbergerMA，HiganoC,BubleyGJ，DreicerR，PetrylakD，KantoffP，BaschE，KellyWK，FiggWD，SmallEJ，BeerTM，WildingG，MartinA，HussainM；前列腺癌临床试验工作组，用于具有进行性前列腺癌和阉割水平的睾酮的患者的临床试验设计和终点：前列腺癌临床试验工作组的建议（ProstateCancerClinicalTrialsWorkingGroup.Designandendpointsofclinicaltrialsforpatientswithprogressiveprostatecancerandcastratelevelsoftestosterone:recommendationsoftheProstateCancerClinicalTrialsWorkingGroup）.JClinOncol.2008；26(7):1148-59。
抗性与不存在下述之一或多项的可观察和/或可测量的减少、或不存在下述之一或多项相关：异常细胞（优选癌性细胞）数目的减少，或异常细胞（优选癌性细胞）的缺乏；对于癌性疾病：肿瘤大小的减小；进一步的肿瘤生长的抑制(即，一定程度地放缓且优选停止)；肿瘤标记例如PSA和CA-125水平的减少，癌细胞浸润到其他器官(包括癌扩散到软组织和骨)的抑制(即，一定程度地放缓且优选停止)；肿瘤转移的抑制(即，一定程度地放缓且优选停止)；与特定癌症相关的一种或多种症状的减轻；以及减少的发病率和死亡率。
在优选实施方案中，抗性意指不存在下述标准之一个或多个的可观察到和/或可测量的减少、或不存在下述标准之一个或多个：肿瘤大小的减少；进一步的肿瘤生长的抑制，癌细胞浸润到其他器官的抑制；和肿瘤转移的抑制。
在更优选的实施方案中，抗性指下述标准之一或多个：无肿瘤大小的减少；无进一步的肿瘤生长的抑制，无癌细胞浸润到其他器官的抑制；和无肿瘤转移的抑制。
上述抗性标准的测量可以根据癌症治疗领域人员众所周知的临床指导，例如上文针对测量癌性疾病应答所列出的那些。
应答还可以在体外通过评价细胞增殖和/或细胞死亡进行确定。例如，对细胞死亡或增殖的影响可以在体外通过下述成熟的测定法中的一种或多种进行评价：A)使用Hoechst33342染料的细胞核染色，提供有关核形态和DNA片段化(细胞凋亡标志)的信息。B)膜联蛋白V结合测定法，其反映出质膜的外脂双层中磷脂酰丝氨酸的含量。该事件被认为是细胞凋亡的早期标志。C)TUNEL测定法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记测定法)，一种通过标记核酸末端来测量DNA片段化从而用于评估经历细胞凋亡或坏死的细胞的荧光方法。D)测定细胞代谢活性的MTS增殖测定法。存活的细胞是代谢活性的，而呼吸链受损的细胞在该试验中表现出减少的活性。E)结晶紫染色测定法，其中通过细胞组分的直接染色以监控对细胞数目的影响。F)通过掺入溴代脱氧尿苷(BrdU)来监控DNA合成的增殖测定法。可以直接测定对生长/增殖的抑制作用。G)涉及不能透过膜的、荧光的、单体花菁(核酸染料)的YO-PRO测定法，所述染料允许分析濒死的(例如细胞凋亡)细胞，而不干扰细胞生存力。还可以在细胞透化后分析对细胞数目的总体影响。H)细胞周期分布的碘化丙锭染色，其显示在细胞周期的不同时期之间分布的改变。可以测定细胞周期停滞点。I)锚定不依赖性生长测定法，例如集落生长测定法，其评价单细胞悬液在软琼脂中生长成集落的能力。
在涉及抗性测定的优选实施方案中，体外抗性意指不存在异常细胞增殖率的降低和/或异常细胞数目的减少。更优选地，抗性意指不存在癌性细胞增殖率的降低和/或不存在癌性细胞数目的减少。异常细胞（优选癌性细胞）数目的减少可以通过多种编程和非编程的细胞死亡机制发生。细胞凋亡、胱天蛋白酶非依赖性的细胞程序化死亡和自体吞噬性细胞死亡是细胞程序化死亡的例子。然而，本发明的实施方案中涉及的细胞死亡标准不应视为限制于任何一种细胞死亡机制。
stathmin
如上所述，术语stathmin在本文中用于涵盖所有先前提及的同义词和同种型，且酌情指在核酸和蛋白质水平上的该实体。核酸水平指例如mRNA、cDNA或DNA，并且术语蛋白质包括翻译的多肽或蛋白质序列及其翻译后修饰形式。
stathmin(人stathmin)的蛋白质序列的优选例子在SEQ.IDNo.1和2(分别为同种型a和b)中列出。然而，术语stathmin还包含这些序列的同源物、突变形式、等位基因变体、同种型、剪接变体和等价物。这些序列的人同源物、突变形式、等位基因变体、同种型、剪接变体和等价物是更优选的实施方案。更优选地，它涵盖与SEQ.ID.No.1或2所示序列任一具有至少大约75%同一性、尤其优选至少约85%同一性、特别优选至少约95%同一性、和更特别优选约99%同一性的序列。在尤其优选的实施方案中，stathmin是在核酸或蛋白质水平上的实体，其在蛋白质水平上由SEQIDNO.1或2或与这些序列任一具有至少95%同一性、优选与这些序列任一具有至少99%同一性的序列代表。在特别优选的实施方案中，stathmin是在核酸或蛋白质水平上的实体，其在蛋白质水平上由SEQIDNO.1或与这个序列具有至少95%同一性、优选至少99%同一性的序列代表。在更特别优选的实施方案中，stathmin是在核酸或蛋白质水平上的实体，其在蛋白质水平上由SEQIDNO.1或2代表。在更加特别优选的实施方案中，stathmin是在核酸或蛋白质水平上的实体，其在蛋白质水平上由SEQIDNO.1代表。
人stathmin基因的多个剪接变体是已知的。stathmin(人stathmin)的核酸序列的优选例子可经由NCBI参考序列NM_005563；NM_203399；NM_203401和NM_001145454获得，且分别在SEQ.ID.No.3(NM_005563.3)；No.4(NM_203399.1)；No.5(NM_203401.1)和No.6(NM_001145454.1)(图13-16)中列出。这些是智人stathmin1(STMN1)转录物变体1-4。转录物变体1、2和3编码同种型a，而转录物变体4编码同种型b。
术语stathmin还涵盖所述序列的修饰、更简并的变体、所述序列的互补体、和与所述序列之一杂交的寡核苷酸。此类修饰包括但不限于一个或多个核苷酸的突变、插入、缺失和置换。更优选地，它涵盖与所述序列具有至少约75%同一性、尤其优选至少约85%同一性、特别优选至少约95%同一性、和更特别优选约99%同一性的序列。
在另外一个优选实施方案中，stathmin是在核酸或蛋白质水平上的实体，其在核酸水平上由选自SEQIDNO.3、4、5和6的序列、和与这些序列具有至少95%同一性、优选与这些序列具有至少99%同一性的序列代表。更优选地，stathmin是在核酸或蛋白质水平上的实体，其在核酸水平上由SEQIDNO.3、或与这个序列具有至少95%同一性、优选与这个序列具有至少99%同一性的序列代表。在进一步优选的实施方案中，stathmin是在核酸或蛋白质水平上的实体，其在核酸水平上由选自SEQIDNO.3、4、5和6的序列代表。
stathmin的水平
stathmin的水平可以通过技术人员众所周知的技术方法在样品中进行测定。它可以在转录或翻译水平上进行测试。
在一个优选实施方案中，测量样品中的stathmin核酸，优选stathminmRNA，水平。适合于测量在核酸水平上的stathmin水平的本领域已知基因表达分析方法的例子包括但不限于：i)使用能够与mRNA杂交的标记探针；ii)使用涉及基于stathmin基因序列的一个或多个引物的PCR，例如使用标记探针例如荧光探针的定量PCR方法，例如定量实时PCR；iii)微阵列；IV)Northern印迹；V)基因表达系列分析(SAGE)，READS(消化cDNAs的限制性酶扩增)、差异显示和测量microRNA。
在优选实施方案中，测量在蛋白质水平上的stathmin水平。适合于测量在蛋白质水平上的stathmin水平的本领域已知蛋白质表达分析方法的例子包括但不限于：i)免疫组织化学(IHC)分析，ii)western印迹，iii)免疫沉淀，iv)酶联免疫吸附测定法(ELISA)，v)放射免疫测定法，vi)荧光激活细胞分选(FACS)，vii)质谱法，包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI，例如MALDI-TOF)和表面增强激光解吸/电离(SELDI，例如SELDI-TOF)。
上述方法中的一些涉及的抗体可以是单克隆或多克隆抗体、抗体片段和/或多个类型的合成抗体，包括嵌合抗体。抗体可以进行标记，以使它在与一种或多种其它物质反应后能够被检测或能够检测，例如使用标记的或能够产生可检测结果的二抗。对stathmin特异性的抗体可以从Epitomics，Abcam，CellSignalingTechnology，Inc.和SantaCruz商购可得，或可以经由本领域技术人员众所周知的常规抗体生成方法进行制备。
蛋白质分析的优选方法是ELISA、质谱技术、免疫组织化学和蛋白质印迹，更优选ELISA、蛋白质印迹和免疫组织化学，更特别优选蛋白质印迹和免疫组织化学。在蛋白质印迹（也称为免疫印迹）中，标记的抗体可以用于评价蛋白质水平，其中来自可检测标记的信号强度对应于蛋白质的量，并且可以例如通过密度测定法进行定量。
免疫组织化学也可以使用标记的抗体以检测生物标记的存在和相对量。它可以用于评价其中存在生物标记的细胞的百分比。它还可以用于评价在单个细胞中生物标记的定位或相对量；后者作为染色强度的函数可见。
ELISA代表酶联免疫吸附测定法，这是因为它使用与抗体或抗原连接的酶用于检测特定蛋白质。ELISA一般如下执行(但是可以存在方法学上的其他变化)：将固体基底例如96孔板用识别生物标记的一抗包被。结合的生物标记随后由对于生物标记特异性的二抗识别。这可以直接连接至酶，或可以使用与酶连接的第三抗免疫球蛋白抗体。加入底物且酶催化反应，生成特定的颜色。通过测量这种颜色的光密度，可以测定生物标记的存在和量。
生物标记的用途
生物标记可以用于预测受试者中疾病对如上文定义的通式I化合物或其药学可接受衍生物的固有抗性。
对于用如上文定义的通式I化合物或其药学可接受衍生物治疗，生物标记可以用于选择患有或易患疾病（优选癌症）的受试者。生物标记的水平可以用于鉴定可能响应或不响应此类活性剂治疗的受试者。可以进行受试者的分层，以便避免非必需的治疗方案。特别地，生物标记可以用于鉴定这样的受试者，相对于一个或一组标准水平，来自所述受试者的一个或多个样品不显示更高水平的stathmin，因此随后此受试者可以被选择用于如上文定义的通式I化合物或其药学可接受衍生物的治疗。
生物标记还可以用于帮助决定治疗方案，有关给药量和时间表。另外，生物标记可以用于帮助选择待给予受试者的药物组合，包括一种或多种通式I的化合物或其药学可接受的衍生物，和另一种或多种化学治疗(细胞毒性)剂。此外，生物标记可以用于帮助决定受试者中的治疗策略，包括通式I的化合物或其药学可接受的衍生物是否待与靶向疗法、内分泌疗法、放射疗法、免疫疗法或手术干预或这些的组合进行组合施用。
stathmin还可以与其他生物标记组合使用，以预测针对通式I的化合物或其药学可接受的衍生物的应答并决定治疗方案。它可以进一步与化学敏感性测试组合使用，以预测抗性且决定治疗方案。化学敏感性测试涉及将通式I的化合物直接应用于得自受试者的细胞（例如得自具有血液学恶性肿瘤或可接近的实体瘤例如乳腺、头颈癌或黑素瘤的受试者），以测定细胞对化合物的应答。
治疗方法
在一些方面，本发明还涉及治疗方法和stathmin在治疗方法中的使用，其中首先相对于一个或一组标准水平，建立stathmin的水平，并且随后如果所述样品中的stathmin水平不高于一个或一组标准值，则施用如上文定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物。如本领域技术人员众所周知的，通式I的化合物或其药学可接受的衍生物可以在药物组合物中施用。合适的组合物和剂量例如公开于特别引入本文作为参考的WO2004/103994A1第35-39页中。尤其优选用于给温血动物，尤其是人进行经肠道施用例如鼻、颊、直肠或尤其是经口施用、和肠胃外施用例如静脉内、肌内或皮下施用的组合物。更特别地，用于静脉内施用的组合物是优选的。
组合物包含活性成分和药学可接受的载体。组合物的例子包括但不限于下述：如下制备5000个软明胶胶囊，每个包含0.05g通式(I)的化合物之一作为活性成分：将250g粉碎的活性成分悬浮于2升(丙二醇月桂酸酯，GattefosséS.A.，SaintPriest，法国)中，并且在湿粉碎机中磨碎，以产生约1–3μm的粒子大小。随后使用胶囊装填机，将0.419g混合物部分引入软明胶胶囊内。
在一个方面，本发明还涉及治疗赘生性或自身免疫疾病（优选癌症）的方法：首先降低受试者中的stathmin水平，其中所述受试者具有与一个或一组标准水平相比stathmin水平更高的样品，随后用如上文定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物治疗受试者。stathmin的水平可以通过直接或间接化学或遗传方法进行降低。此类方法的例子是用导致stathmin表达减少的药物治疗，病毒、质粒或肽构建体或抗体或siRNA或反义分子的靶向递送，以下调stathmin的水平。例如，siRNA可以用于减少在细胞中表达的stathmin水平。受试者随后可以用通式I的化合物或其药学可接受的衍生物进行治疗。
通式I的化合物或其药学可接受的衍生物可以单独或与一种或多种其他治疗剂组合施用。可能的组合疗法可以采取固定组合的形式、或将本发明的化合物和一种或多种其他治疗剂彼此错开或彼此独立地施用、或固定组合和一种或多种其他治疗剂的组合施用。
此外或另外，通式I的化合物或其药学可接受的衍生物可以，与化学疗法(细胞毒疗法)、靶向疗法、内分泌疗法、放射疗法、免疫疗法或手术干预或这些的组合，进行组合施用，以尤其用于肿瘤治疗。长期治疗同样是可以的，如在其他如上所述治疗策略中作为辅助疗法。其他可能的治疗是在肿瘤消退后维持患者状态的疗法、或甚至化学预防疗法，例如在有风险的患者中。
试剂盒和装置
本发明在一个方面涉及用于预测受试者中的疾病对如上文定义的通式I化合物或其药学可接受衍生物的应答的试剂盒、和在另一个方面涉及用于该用途的装置，其包含测量样品中的stathmin水平所需的试剂。优选地，试剂包括捕获试剂（含有针对stathmin的检测物）和检测试剂。
试剂盒和装置还可以优选包含比较器组件，其包含待与样品中的stathmin水平进行比较的一个或一组标准值。在优选实施方案中，比较器组件包括在试剂盒的使用说明书中。在另一个优选实施方案中，比较器组件为显示装置的形式，例如色带或数字编码材料，其设计为放置在样品测量的读出结果旁边，以指示抗性水平。该一个或一组标准值可以如上所述进行测定。
试剂优选是与stathmin选择性结合的抗体或抗体片段。这些可以例如为一种与stathmin结合的特定一抗、和与一抗结合且自身进行了检测标记的二抗。一抗也可以进行标记以用于直接检测。试剂盒或装置还可以任选含有一种或多种洗涤溶液，在洗涤后相比于其他生物标记，所述洗涤溶液选择性允许保留与捕获试剂结合的生物标记。此试剂盒随后可以用于ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫组织化学或其他免疫化学方法中，以检测生物标记的水平。
在另一个优选实施方案中，试剂还可以是能够测量样品中的stathmin核酸水平的那些试剂。合适的样品是组织或肿瘤样品、固定并石蜡包埋的或冷冻的组织或肿瘤样本的切片、循环肿瘤细胞、以及血液和体液来源的样品。优选地，试剂包含标记的探针或引物，用于与样品中的stathmin核酸杂交。基于PCR扩增技术或标记探针的检测的合适检测系统，允许定量样品中的stathmin核酸。这可以：i)在样本自身上原位，优选在来自石蜡包埋或冷冻的样本的切片中，ii)在来自肿瘤、组织或血液来源样本的提取物中进行，其中合适的试剂对于核酸进行选择性富集。试剂盒或装置使得能够通过基于探针自身的特定理化性质或与引物连接的报道分子的方法、测量和定量：i)与样本原位杂交的标记探针的量，或ii)基于引物的扩增产物的量。
此外，装置可以包含成像装置或测量装置(例如但不限于荧光的测量)，其进一步处理测量的信号且将其转化为比较器组件中的等级。更优选地，试剂盒包含如上文定义的通式I的化合物或其药学可接受的衍生物。该化合物随后可以，依照来自受试者的样品中的生物标记水平（如通过试剂盒中包含的试剂测量），施用于受试者。因此根据本发明的试剂盒可以用于如上文定义的根据本发明的治疗方法中。在尤其优选的实施方案中，试剂盒包含下式的化合物或其药学可接受的衍生物：
在试剂盒的特别优选的实施方案中，药学可接受的盐是二盐酸盐。在另一个方面，本发明涉及如上所述的试剂盒的用途。
在本说明书中，单词“包含”或“含有”或“包括”应理解为意在涵盖所述项目或项目组，但不排除任何其他项目或项目组。
实验方法学
培养细胞的免疫荧光染色
将A549人非小细胞肺癌(NSCLC，ATCC参考号CCL-185)细胞、HeLa宫颈癌细胞(ATCC参考号CCL-2)和SKBR3乳腺癌细胞(ATCC参考号HTB-30)以50%的密度种植到圆形显微镜盖玻片上，且在含有10%FCS(也称为FBS)的RPMI-1640中在37℃、5%CO2培养24小时。将待测试的化合物溶解于DMSO中。将细胞培养基替换为含有一种或多种稀释化合物(紫杉醇、长春花碱、秋水仙碱和噻氨酯哒唑购自Sigma-Aldrich)或媒介物的培养基。在处理如附图简述中指出的时间后，将盖玻片洗涤且将细胞在甲醇/丙酮(1:1)中在室温固定5分钟，且随后在封闭缓冲液(PBS中0.5%BSA和0.1%TX-100)中在室温温育30分钟。随后将样本与抗α-微管蛋白抗体(Sigma，1:2000)在室温在封闭缓冲液中温育1小时。在几个洗涤步骤后，将细胞与AlexaFluor-488山羊抗小鼠IgG(MolecularProbes，1:3000)在室温温育1小时，随后用封闭缓冲液进行几个洗涤步骤。随后将样本用ProLongGoldantifade(MolecularProbes)封固，用指甲油密封且用Leica免疫荧光显微镜检查。用冷却的CCD相机捕获图像且通过ImageJ软件处理。
集落生长测定法：
制备患者来源的肿瘤异种移植物(维持于裸鼠中)的单细胞悬浮液。对于集落生长测定法，根据Hamburger&Salmon介绍的测定法(Primarybioassayofhumantumourstemcells，Science，1977,197:461-463)，将细胞在24孔板中种在软琼脂中。将在0.2mL含有0.4%琼脂的培养基中的2x104-6x104个细胞，铺在0.75%琼脂的底层上。将测试化合物应用于0.2mL培养基中。每块24孔板含有未经处理的对照和一式三份的样品。将培养物在37℃和7.5%CO2培养5–28天。在分析前24小时，用可代谢的四唑盐的溶液染色活集落(AlleyMC等人，LifeSci.1982，31:3071-3078)，并且用自动图像分析系统(Omnicon3600，BiosysGmbH)计数。
使用在经处理的孔和对照孔中的平均集落数目的比值，表示相对药物效应。通过将化合物浓度与相对集落计数进行绘图，确定IC70值。
蛋白质提取
肿瘤提取：在含有50mMHEPES(pH7.5)、150mMNaCl、25mMβ-甘油磷酸酯、25mMNaF、5mMEGTA、1mMEDTA、0.1%NP40、15mM焦磷酸盐、2mM原钒酸钠、10mM钼酸钠、亮抑酶肽(10μg/mL)、抑酶肽(10μg/mL)和1mMPMSF(1mL提取体积/45mg肿瘤)的冰冷裂解缓冲液中，提取肿瘤。在通过Polytron匀浆化后，将裂解产物调整至1%NP40并且在冰上温育20分钟。通过离心澄清裂解产物且冷冻于-80℃。
肿瘤细胞系提取：将细胞用含有1mMPMSF的冰冷PBS和不含NP40的冰冷裂解缓冲液(参见上文)洗涤。在含有1%NP40的相同裂解缓冲液中提取细胞。在均质化后，通过离心澄清裂解产物且冷冻于-80℃。
免疫印迹/蛋白质印迹
使用20μg总蛋白质/泳道，执行免疫印迹。用BCA蛋白质测定法(Pierce)测定蛋白质浓度。将蛋白质在12.5%SDS-凝胶上分离，且使用SemidryBlotting(90分钟，50mA/凝胶)转移至PVDF膜。用于免疫印迹的一抗如下：
stathminAb.No.1:(可从Epitomics获得，参考号1972-1)来源：兔，单克隆的，稀释度1:10,000，缓冲液条件：在PBS/0.1%Tween中的3%BSA
stathminAb.No.2:(可从Abcam获得，参考号ab47468)来源：兔，多克隆的，稀释度1:1000，缓冲液条件：在PBS/0.1%Tween中的3%BSA
肌动蛋白：(可从Chemicon获得，参考号MAB1501)来源：小鼠，单克隆的，稀释度1:5000，缓冲液条件：在PBS/0.1%Tween中的3%BSA
用于免疫印迹的二抗是过氧化物酶缀合的山羊抗兔或山羊抗小鼠(可从JacksonImmunoResearchLaboratoriesINC获得：参考号111-035-144JIR和115-035-146JIR)，稀释度1:5000，缓冲液条件：在PBS/0.1%Tween中的0.5%乳。使用RaytestStella3200高性能成像系统，显现标记的条带。
免疫组织化学
在含有4%甲醛的10%中性缓冲福尔马林中，在室温执行患者来源的肿瘤异种移植物(维持于裸鼠中)的固定，20–28小时。将固定的样本保持在70%乙醇溶液中最多一周，之后使用下文列出的条件，根据标准程序，进行脱水和石蜡包埋：
切成约2μm的石蜡切片，并且通过使用自动化免疫染色器BenchmarkXT(Roche)、运行标准加工步骤进行加工。用DAB(3,3-二氨基联苯胺)以浓度5mg/ml作为生色底物，显现特定抗体的染色。下述一抗和加工条件用于染色：
血清的ELISA分析
自异氟烷麻醉的小鼠收集血液到MicrotainerSST管(BDTransductionLaboratories，参考号365968)中，随后根据制造商的方案进行加工，以制备小鼠血清。这包括在室温30分钟的温育时间，随后以6000-15000g离心1.5分钟。将来自健康人志愿者的血液收集到S-Monovette管(Sarstedt，参考02.1063)中，随后以1250g离心20分钟，制备人血清。将血清上清液贮存于-80℃。ELISA板(Nunc，maxisorp)孔用stathmin兔单克隆抗体(Epitomics，参考号1972-1，1:1000)在碳酸盐缓冲液pH9,6中在4℃包被过夜。在用PBS/1%BSA封闭ELISA板孔后，加入在PBS中预稀释的血清样品且在4℃温育过夜。使用stathmin小鼠单克隆抗体(可从SantaCruz获得，参考号55531，稀释度1:100)，随后用山羊抗小鼠HRP标记的抗体(JacksonImmunoResearch，1:5000)，检测stathmin。使用“SureBlueTMB微孔过氧化物酶底物”(TMB=3,3′,5,5′-四甲基联苯胺；KPL)进行显色，在5-10分钟后使用TMB停止溶液(KPL)停止颜色生成。在SpectraMax250板阅读器(MolecularDevices)中在450nm处测量吸光度。
使用GraphPadPrism软件，在扣除合适的血清阴性对照后，由源自人重组stathmin(Calbiochem，参考号569390)的标准曲线，计算stathmin蛋白浓度。
对于其中人血清“掺入”了stathmin的实验，使用人重组stathmin(Calbiochem，参考号569390)。对于源自荷瘤小鼠的血清的测试，肿瘤在裸鼠中皮下生长直至大小400–800mm3时。处死小鼠且如上所述制备血清。
定量实时PCR
HeLa宫颈癌、A549NSCLC和H460NSCLC(ATCC参考号HTB-177)细胞在10cm皿中生长直至它们达到80%汇合时，随后胰蛋白酶消化、沉淀和重悬浮于1mlTrizol试剂(Invitrogen)中。根据制造商的说明书，分离总RNA。使用ABIPrism7000序列检测系统，使用TaqManRNA-to-Ct1-步试剂盒(AppliedBiosystems，参考号4392938)和基因表达测定试验(AppliedBiosystems)、以100ngRNA/反应，执行实时PCR。使用下述基因表达测定法：测定法IDHS01027515_gH用于定量stathmin，或测定法IDHS99999901_s1用于定量18S-RNA。所有样品一式三份地进行分析。使用SDS软件(AppliedBiosystems)执行数据分析。stathmin表达水平针对18S-RNA进行标准化。
实施例详述
实施例1：通过通式I的化合物诱导的独特有丝分裂表型
用化合物A(BAL27862)或用化合物B或化合物C处理，在测试的所有肿瘤细胞系中诱导了高度重现的和独特的微管表型(图1中对于BAL27862显示了A549、HeLa和SKBR3细胞，以及图2中对于化合物C和化合物B显示了A549细胞)。在分裂细胞中，发生有丝分裂纺锤体的明显断裂，导致点样结构的形成(图1)。这个表型被证实不同于用常规微管靶向试剂观察到的表型，所述常规微管靶向试剂例如微管稳定剂紫杉醇以及微管失稳剂长春花碱和秋水仙碱(图3)和噻氨酯哒唑(图4)。
实施例2：BAL27862以显性方式克服由常规微管靶向药物诱导的微管表型
为了显示其对微管的活性的独特性，使用A549细胞，将BAL27862与长春花碱、秋水仙碱和紫杉醇(图5)以及噻氨酯哒唑(图6)组合进行测试。单独用长春花碱、秋水仙碱、紫杉醇或噻氨酯哒唑处理，诱导了这些试剂所特有的有丝分裂微管表型。然而，最后4小时与BAL27862的组合处理导致了微管结构的破坏；产生与单独的BAL27862处理一致的表型，尽管长春花碱、秋水仙碱、紫杉醇或噻氨酯哒唑持续存在。相比之下，首先用BAL27862处理且随后与长春花碱、秋水仙碱、紫杉醇或噻氨酯哒唑组合处理4小时，对观察到的微管表型没有影响，所述微管表型与用BAL27862处理是一致的。
这些数据证实，式I的化合物与常规微管靶向试剂一样影响微管生物学，但方式不同。
本发明实施例的详述
实施例3：高stathmin表达水平与患者来源的肿瘤细胞对BAL27862 处理的高度抗性具有相关性
基于集落生长测定法，使用在小鼠中作为异种移植物维持的源自患者来源肿瘤的肿瘤细胞，从黑素瘤以及胃癌和肺癌中，鉴定了BAL27862敏感性或高度抗性的肿瘤细胞(参见表1)。表1显示相对于对照观察到70%生长抑制发生时的浓度(IC70)。在这个表中，BAL27862敏感的肿瘤细胞是具有在低纳摩尔范围中的IC70值的那些，而BAL27862抗性的肿瘤细胞具有>600纳摩尔的IC70值。从7个肿瘤模型中的6个获得了紫杉醇和长春花碱数据（使用相同离体测定法）。在这6个模型中，全部对紫杉醇处理具有抗性，而5个对长春花碱处理是敏感的。
表1
随后使用两种抗体(显示于图7中，用得自Abcam的抗体)，执行免疫印迹分析，以便测量作为异种移植物维持的相同肿瘤中的stathmin水平。肌动蛋白水平作为上样对照包括在免疫印迹上。
stathmin水平的分析说明，在测量的所有肿瘤之间，stathmin蛋白表达急剧改变(图7)。
基于集落生长测定法和相同IC70标准，在紫杉醇或长春花碱抗性与高stathmin表达水平之间不存在相关性。例如，对于胃模型，可见缺乏该相关性。尽管GXF251和GXF97对紫杉醇都是抗性的，但对于GXF251，stathmin水平实质上是无法检测的，而对于GXF97，该水平是相当更高的。在胃模型中对于长春花生物碱而言相同相关性的缺乏是对的，这是因为这两种肿瘤对长春花碱都是敏感的。因此，在患者来源的肿瘤模型中，stathmin水平被证实不合适作为针对常规微管试剂紫杉醇和长春花碱的抗性的可靠生物标记。
令人惊讶的是，相比之下，当BAL27862抗性数据(如通过集落生长测定法定义)与stathmin水平相比较时，stathmin表达显示出仅在抗性肿瘤中更高，并且在源自相同肿瘤组织类型的敏感肿瘤中则不是。增加的表达水平因此一致地指示针对BAL27862的抗性。因此，stathmin水平被证实是对于根据本发明的化合物BAL27862的抗性的生物标记。
实施例4：胃肿瘤异种移植物的免疫组织化学分析
对胃肿瘤异种移植物执行免疫组织化学分析(图8)，揭示肿瘤模型GXF97中stathmin的高表达。再次，在stathmin的高表达水平和针对BAL27862的抗性之间见到了清楚的相关性(肿瘤模型GXF97是BAL27862抗性的，而肿瘤模型GXF251是BAL27862敏感的；如通过集落生长测定法定义的)。因此，stathmin蛋白表达水平再次被证实是对于本发明化合物BAL27862的抗性的生物标记。
实施例5：血清中stathmin的检测。
在由健康人志愿者血液制备的血清中掺入了已知量的重组stathmin，随后以1:25和1:100稀释度进行ELISA分析。基于同时产生的标准曲线(图9)，如图10中呈现的，计算了stathmin浓度。数据显示，尽管存在对掺入的stathmin浓度的一般低估，但需要1:25稀释度以分辨<300ng/ml的较低stathmin浓度，而需要1:100稀释度以分辨>300ng/ml的较高浓度。令人惊讶的是，当血清由荷有表1中列出的肿瘤的小鼠制备时(使用2只小鼠/肿瘤类型)，以1:25的稀释度分析，仅荷有源自抗性细胞的肿瘤的小鼠具有升高的血清stathmin水平的证据(表2)。
表2
实施例6：stathminRNA表达水平对蛋白质表达水平
为了证实stathminRNA表达水平反映蛋白质表达水平，并且因此RNA表达水平可以用于预测针对BAL27862的抗性，如下在RNA和蛋白质水平上测量stathmin表达水平。由HeLa、H460和A549细胞系制备全细胞蛋白质提取物，并且通过免疫印迹分析stathmin蛋白表达(图11B)。由相同细胞代制备RNA样品，并且执行定量RT-PCR。(图11A)。免疫印迹数据(图11B)和RT-PCR数据(图11A)的比较指示，在这些系中stathmin的蛋白质和RNA表达水平之间存在良好相关性。
缩写列表

Claims (40)

1.用于检测作为生物标记的stathmin的水平的试剂在制备用于预测针对化合物的疾病之应答的试剂盒中的用途，其中所述化合物是通式I的化合物
其中
R表示苯基、噻吩基或吡啶基，
其中苯基任选地被一个或两个取代基取代，所述取代基独立地选自：烷基；卤代-低级烷基；羟基-低级烷基；低级烷氧基-低级烷基；酰氧基-低级烷基；苯基；羟基；低级烷氧基；羟基-低级烷氧基；低级烷氧基-低级烷氧基；苯基-低级烷氧基；低级烷基羰基氧基；氨基；单烷基氨基；二烷基氨基；低级烷氧基羰基氨基；低级烷基羰基氨基；取代的氨基，其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基；低级烷基羰基；羧基；低级烷氧基羰基；氰基；卤素；和硝基；且其中两个相邻的取代基为亚甲二氧基；
并且其中吡啶基任选地被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示基团C＝Y，其中Y表示a)氧或b)被羟基或低级烷氧基取代的氮；
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；
R2、R3和R6表示氢；
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基；
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
及其药学可接受的衍生物；
或者其中
R表示苯基或吡啶基，
其中苯基任选地被一个或两个取代基取代，所述取代基独立地选自：烷基；卤代-低级烷基；羟基-低级烷基；低级烷氧基-低级烷基；酰氧基-低级烷基；苯基；羟基；低级烷氧基；羟基-低级烷氧基；低级烷氧基-低级烷氧基；苯基-低级烷氧基；低级烷基羰基氧基；氨基；单烷基氨基；二烷基氨基；低级烷氧基羰基氨基；低级烷基羰基氨基；取代的氨基，其中氮上的两个取代基与氮一起形成杂环基；低级烷基羰基；羧基；低级烷氧基羰基；甲酰基；氰基；卤素；和硝基；且其中两个相邻的取代基为亚甲二氧基；
并且其中吡啶基任选被低级烷氧基、氨基或卤素取代；
X表示氧；
R1表示氢、低级烷基羰基、羟基-低级烷基或氰基-低级烷基；
R2、R3和R6表示氢；
R4和R5彼此独立地表示氢、低级烷基或低级烷氧基；
或R4和R5一起表示亚甲二氧基；
及其药学可接受的衍生物；
并且其中前缀“低级”表示具有至多且包括最多7个碳原子的基团。
2.根据权利要求1的用途，其中前缀“低级”表示至多且包括最多4个碳原子的基团。
3.根据权利要求1的用途，其中所述应答是动物受试者中的疾病的应答，并且所述生物标记stathmin在取自所述动物体的一个或多个样品中离体进行测量。
4.根据权利要求1的用途，其中所述应答是人受试者中的疾病的应答，并且所述生物标记stathmin在取自所述人体的一个或多个样品中离体进行测量。
5.根据权利要求1的用途，其中在通式I的化合物中
R表示苯基或吡啶基，
其中苯基任选地被独立地选自低级烷基、低级烷氧基、氨基、乙酰氨基、卤素和硝基的一个或两个取代基取代；
和其中吡啶基任选地被氨基或卤素取代；
X表示基团C＝O；
R1表示氢或氰基-低级烷基；
R2、R3、R4、R5和R6表示氢；
及其药学可接受的衍生物，
并且其中前缀“低级”表示具有至多且包括最多7个碳原子的基团。
6.根据权利要求5的用途，其中前缀“低级”表示至多且包括最多4个碳原子的基团。
7.根据权利要求1的用途，其中所述化合物由下式表示：
其中R、Y和R1如下定义：
或其药学可接受的衍生物。
8.根据权利要求1的用途，其中所述化合物是
或其药学可接受的衍生物。
9.根据权利要求1的用途，其中药学可接受的衍生物选自权利要求1的通式I的化合物的盐、溶剂合物、前体药物、前体药物的盐、多晶形物和异构体。
10.根据权利要求9的用途，其中所述前体药物是由权利要求1的通式I的化合物的R基团内存在的氨基和甘氨酸、丙氨酸或赖氨酸的羧基形成的酰胺。
11.根据权利要求1的用途，其中所述化合物是
或其药学可接受的盐。
12.权利要求11的用途，其中所述化合物的药学可接受的盐是所述化合物的盐酸盐。
13.权利要求12的用途，其中所述化合物的盐酸盐是所述化合物的二盐酸盐。
14.根据权利要求1的用途，用于预测受试者中的疾病针对所述化合物的抗性。
15.根据权利要求1的用途，其中所述疾病是赘生性疾病或自身免疫疾病。
16.根据权利要求15的用途，其中所述疾病是癌症。
17.根据权利要求1的用途，其中所述疾病选自乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、神经内分泌癌、肺癌、肾癌、血液学恶性肿瘤、黑素瘤和肉瘤。
18.根据权利要求17的用途，其中所述疾病选自乳腺癌、宫颈癌、胃癌、肺癌和黑素瘤。
19.根据权利要求18的用途，其中所述疾病选自胃癌、肺癌和黑素瘤。
20.根据权利要求4的用途，其中相对于一个或一组标准值，来自所述人受试者的样品中更高水平的stathmin预测抗性。
21.根据权利要求20的用途，其中
i)相对于来自具有相同肿瘤组织类型的患者的一个或一组标准值，或
ii)相对于来自正常组织的一个或一组标准值，
在一个或多个样品中更高的stathmin水平预测抗性。
22.根据权利要求1的用途，其中所述生物标记用于选择患有或易患疾病的受试者，以接受权利要求1-11中任一项所定义的通式I化合物或其药学可接受衍生物治疗。
23.根据权利要求22的用途，其中所述疾病是癌症。
24.根据权利要求4的用途，其中所述样品源自肿瘤组织、正常组织、循环肿瘤细胞、细胞系、血浆、全血或血清。
25.根据权利要求24的用途，其中所述样品源自肿瘤组织。
26.根据权利要求24的用途，其中所述样品源自血清。
27.根据权利要求1的用途，其中所述试剂包括检测试剂和含有stathmin的检测物的捕获试剂。
28.根据权利要求27的用途，其中所述的捕获试剂是抗体。
29.根据权利要求27的用途，其中所述试剂包含与stathmin结合的一抗、和与一抗结合且自身经标记以用于检测的二抗。
30.根据权利要求27的用途，其中所述试剂包含与stathmin结合的且自身经标记以用于检测的一抗。
31.根据权利要求1的用途，其中所述试剂包含用于与stathmin核酸杂交的经标记的探针或引物。
32.根据权利要求1的用途，其中所述试剂包含在核酸水平测量stathmin水平的微阵列。
33.用于预测针对权利要求1-11中任一项定义的通式I化合物或其药学可接受衍生物的应答的试剂盒，其包含用于测量来自癌症受试者的样品中的stathmin水平所需的试剂，和还包含比较器组件，所述比较器组件包含待与样品中的stathmin水平比较的stathmin水平的一个或一组标准值，所述stathmin水平的一个或一组标准值来自具有相同肿瘤组织类型的受试者的肿瘤组织、血清或循环肿瘤细胞的样品，其中所述试剂盒包含下述式的化合物或其药学可接受盐：
34.根据权利要求33的试剂盒，其中所述试剂包括检测试剂和含有stathmin的检测物的捕获试剂。
35.根据权利要求34的试剂盒，其中所述捕获试剂是抗体。
36.根据权利要求34的试剂盒，其中所述试剂包含与stathmin结合的一抗、和与一抗结合且自身经标记以用于检测的二抗。
37.根据权利要求34的试剂盒，其中所述试剂包含与stathmin结合的且自身经标记以用于检测的一抗。
38.根据权利要求33的试剂盒，其中所述试剂包含用于与stathmin核酸杂交的经标记的探针或引物。
39.根据权利要求33的试剂盒，其中所述试剂包含在核酸水平测量stathmin水平的微阵列。
40.根据权利要求33的试剂盒，其中具有下述结构的所述化合物的药学上可接受的盐是其二盐酸盐：
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