ES2937269T3 - Letalidad sintética y el tratamiento del cáncer - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen compuestos, composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer. También se describen métodos y usos para identificar sujetos con cáncer que son adecuados para el tratamiento con los compuestos, la composición y los métodos que se describen en el presente documento. En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene un cáncer deficiente en NMT2, que comprende: administrar a dicho sujeto un inhibidor de NMT. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Letalidad sintética y el tratamiento del cáncer
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de los Estados Unidos número 61/510,686, presentada el 22 de julio de 2011.
Campo de la invención
El campo de la invención generalmente se relaciona con compuestos, composiciones y kits para usar en el tratamiento del cáncer, como se define en las reivindicaciones.
Antecedentes de la invención
El cáncer es una de las principales causas de muerte en Canadá. La Sociedad Canadiense del Cáncer estima que habrá aproximadamente 170 000 nuevos casos de cáncer en 2011 y aproximadamente 75 000 muertes como resultado del cáncer.
Un enfoque emergente para el tratamiento del cáncer se relaciona con el concepto de letalidad sintética. Dos genes (o dos productos de genes) son letales sintéticos si la mutación de cualquiera de ellos solo es compatible con la viabilidad, pero la mutación de ambos conduce a la muerte. Dicho de otro modo, la "letalidad sintética" describe situaciones donde una mutación y un fármaco (por ejemplo) juntos causan la muerte de una célula cancerosa; cualquiera de los dos, la mutación o el fármaco, no provocarían la muerte celular. El direccionamiento a un gen (o producto génico) que es letal sintético para una mutación relevante para el cáncer debería matar solo las células cancerosas y evitar las células normales. Por lo tanto, la letalidad sintética proporciona un marco para el desarrollo de agentes específicos contra el cáncer.
El enfoque de la letalidad sintética para el tratamiento del cáncer es emergente, todavía no es un enfoque de rutina en gran parte debido a la ausencia de identificación de genes letales sintéticos (y productos genéticos).
La N-miristoilación de proteínas es una modificación en la que el miristato (un ácido graso saturado de 14 carbonos) se une covalentemente al NH2 glicina terminal de una variedad de oncoproteínas, virales y celulares (por ejemplo, tirosina quinasas relacionadas con Src oncogénicas, subunidades G alfa heterotriméricas, etc.).
Las proteínas miristoiladas celulares tienen diversas funciones biológicas en la transducción de señales y la oncogénesis. La modificación de proteínas por miristoilación es necesaria para el direccionamiento subcelular, la conformación de proteínas y la actividad biológica de muchas proteínas importantes en las células eucariotas, que incluyen las necesarias para la transducción de señales y funciones reguladoras importantes en el crecimiento celular. Las tirosina quinasas de la familia Src (protooncogenes) se encuentran entre las proteínas miristoiladas más estudiadas.
La miristoilación de proteínas es catalizada por la N-miristoiltransferasa (NMT). La NMT es la responsable de esta actividad en las células eucariotas y actúa al modificar su sustrato polipeptídico después de la eliminación del residuo iniciador de metionina por la metionil aminopeptidasa. Esta modificación ocurre principalmente como un proceso cotraduccional, aunque la miristoilación también puede ocurrir postraduccionalmente después de la escisión proteolítica de las proteínas, típicamente durante la apoptosis. Se han clonado dos isoenzimas de las enzimas NMT de mamíferos y se denominan NMT1 y NMT2. Los n Mt desempeñan un papel pro-supervivencia en las células. Los dos NMT están presentes en todas las células normales.
Persiste la necesidad de compuestos, composición y método para el tratamiento del cáncer.
Barnes J.A. Y OTROS: "Evaluation of the addition of rituximab to CODOX-M/IVAC for Burkitt's lymphoma: a retrospective analysis", Annals of Oncology, vol. 22, núm. 8, 1 de agosto de 2011 (2011-08-01), páginas 1859-1864, describe que CODOX-M/IVAC (ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina y metotrexato en dosis altas, que se alternan con ifosfamida, etopósido y citarabina), con o sin rituximab, es un régimen altamente efectivo para el tratamiento del linfoma de Burkitt en adultos.
Resumen de la invención
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier materia que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente para propósitos informativos. Las referencias a métodos de tratamiento en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para usar en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un kit para usar en el tratamiento del cáncer en un sujeto que tiene un cáncer deficiente en NMT2, que comprende: un inhibidor de NMT en donde dicho inhibidor de NMT es DDD85646, en donde dicho cáncer deficiente en n MT2 es el linfoma de Burkitt, e instrucciones para usar los mismos.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un inhibidor de NMT para usar en un método para tratar un cáncer deficiente en NMT2, en donde dicho método comprende determinar si una muestra obtenida de un sujeto tiene deficiencia en NMT2, y tratar el sujeto con el inhibidor de NMT, en donde dicho inhibidor de NMT es DDD85646, en donde dicho cáncer deficiente en NMT2 es el linfoma de Burkitt.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un inhibidor de NMT para usar en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer deficiente en NMT2, en donde dicho inhibidor es DDD85646, en donde dicho cáncer deficiente en NMT2 es el linfoma de Burkitt.
En un ejemplo específico, el cáncer es el linfoma de Burkitt.
En un aspecto específico, dicho inhibidor de NMT es DDD85646.
En un aspecto específico, dicho sujeto es un sujeto humano.
En otro aspecto de la presente invención, el inhibidor de NMT DDD85646 comprende además la administración de un agente quimioterapéutico. En un ejemplo específico, dicho agente quimioterapéutico es CHOP, GAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEFF(B), CAMP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, MTX-CHOP, CEM, CEVD, CAVP, EVAP o EPOCH. En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene linfoma de Burkitt que comprende: medir una muestra de dicho sujeto para determinar si dicha muestra es deficiente en NMT2; y administrar un inhibidor de NMT a dicho sujeto, es decir, DDD85646, cuando dicha muestra es deficiente en NMT2. En un ejemplo específico, dicho inhibidor de NMT es DDD85646.
En un aspecto específico, dicho cáncer es el linfoma de Burkitt.
En un aspecto específico, dicho inhibidor de NMT es DDD85646.
En un aspecto específico, dicho sujeto es un sujeto humano.
En otro aspecto de la presente invención, el método comprende además administrar un agente quimioterapéutico. En un ejemplo específico, dicho agente quimioterapéutico es CHOP, GAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEFF(B), CAMP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, MTX-CHOP, CEM, CEVD, CAVP, EVAP o EPOCH.
En otro aspecto, la medición de dicha muestra se lleva a cabo mediante el uso de la clasificación celular activada por fluorescencia cuantitativa, el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, la inmunohistoquímica, la inmunohistoquímica cuantitativa, la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, la transferencia de energía por resonancia de Forster, la complementación de fluorescencia biomolecular, la espectrometría de masas, el ensayo de inmunotransferencia o el ensayo de coinmunoprecipitación.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un kit para tratar el linfoma de Burkitt en un sujeto que tiene un cáncer deficiente en NMT2, que comprende: un inhibidor de NMT, es decir, DDD85646; e instrucciones para usar los mismos. En un ejemplo, dicho inhibidor de NMT es DDD85646.
En un aspecto específico, dicho cáncer es el linfoma de Burkitt.
En un aspecto específico, el compuesto usado es DDD85646.
En un aspecto específico, dicho sujeto es un sujeto humano.
En otro aspecto de la presente invención, el método comprende además administrar un agente quimioterapéutico. En un ejemplo específico, dicho agente quimioterapéutico es CHOP, GAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEFF(B), CAMP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, MTX-CHOP, CEM, CEVD, CAVP, EVAP o EPOCH.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un inhibidor de NMT, es decir, DDD85646, para tratar a un sujeto que tiene un cáncer deficiente en NMT2, es decir, linfoma de Burkitt. En un ejemplo específico, dicho inhibidor de NMT es DDD85646.
En un aspecto específico, dicho cáncer es el linfoma de Burkitt.
En un ejemplo específico, dicho inhibidor de NMT es DDD85646.
En un aspecto específico, dicho sujeto es un sujeto humano.
En otro aspecto de la presente invención, el método comprende además administrar un agente quimioterapéutico. En un ejemplo específico, dicho agente quimioterapéutico es CHOP, GAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEFF(B), CAMP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, MTX-CHOP, CEM, CEVD, CAVP, EVAP o EPOCH.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un inhibidor de NMT, es decir, DDD85646, para la preparación de un medicamento para tratar a un sujeto que tiene un cáncer deficiente en NMT2, es decir, el linfoma de Burkitt.
En un aspecto específico, dicho inhibidor de NMT es DDD85646.
En un aspecto específico, dicho cáncer es el linfoma de Burkitt.
En un aspecto específico, dicho inhibidor de NMT es DDD85646.
En un aspecto específico, dicho sujeto es un sujeto humano.
En otro aspecto de la presente invención, el método comprende además administrar un agente quimioterapéutico. En un ejemplo específico, dicho agente quimioterapéutico es CHOP, GAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEFF(B), CAMP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, MTX-CHOP, CEM, CEVD, CAVP, EVAP o EPOCH.
En otro aspecto, se proporciona un uso de NMT2 como marcador para uno o más de diagnóstico, pronóstico, clasificación o monitoreo del linfoma de Burkitt en un sujeto.
En otro aspecto, se proporciona un uso de la miristoilación de proteínas como un marcador para uno o más de diagnóstico, pronóstico, clasificación o monitoreo del cáncer en un sujeto.
En otro aspecto, se proporciona un uso de la acilación de proteínas como un marcador para uno o más de diagnóstico, pronóstico, clasificación o monitoreo del cáncer en un sujeto.
En un aspecto específico, dicho cáncer es el linfoma de Burkitt.
En un aspecto específico, dicho marcador se mide mediante el uso de un ensayo seleccionado de inmunoensayos o detección de ácidos nucleicos, o actividad de proteínas.
Breve descripción de las figuras
Las modalidades de la presente invención se describirán ahora, a manera de ejemplo solamente, con referencia a las figuras adjuntas en donde:
La Figura 1 representa el análisis de inmunotransferencia de la expresión de NMT1 y NMT2 en un tipo de células B normales (L0) y diversos linfomas de células B y leucemias de células T;
la Figura 2 (Referencia) es un gráfico que ilustra la sensibilidad de diversas células normales y diversos linfomas de células B y leucemias de células T a los inhibidores de NMT tris-dibencilidenoacetona-dipaladio (Tris-DBA); la Figura 3 (Referencia) es un gráfico de barras que ilustra la inhibición de N-miristoiltransferasa (NMT) por trisdibencilidenoacetona-dipaladio (Tris-DBA); y
la Figura 4 son inmunotransferencias que representan líneas celulares de linfoma sondeadas con anticuerpos contra NMT1 y NMT2.
La Figura 5 es un gráfico lineal que muestra la sensibilidad de los inhibidores de NMT en una línea celular de linfoma de Burkitt en comparación con una línea celular linfocítica B normal inmortalizada; y
la Figura 6 (Referencia) representa los resultados de la transfección de células de linfoma B Ramos con pcDNA3.1-V5-NMT2 que muestra un aumento de la supervivencia a TrisDBA (5 ug/ml) de 2,5 veces frente a las células de control transfectadas con un vector de plásmido vacío (Panel A) que muestra la viabilidad celular, y (Panel B) una inmunotransferencia.
En la Descripción detallada que sigue, los números en negrita sirven para identificar las partes componentes que se describen y se mencionan en relación con las figuras que representan diversas modalidades de la invención. Se debe señalar que, al describir las diversas modalidades de la presente invención, se han usado los mismos números de referencia para identificar elementos similares. Además, en aras de la simplicidad, se han omitido partes de algunas figuras de las figuras.
Descripción detallada
Como se describirá con más detalle más abajo, en la presente descripción se describen compuestos, composición y métodos para el tratamiento de un sujeto con cáncer, como se define en las reivindicaciones.
También se describen aquí métodos para identificar sujetos con cáncer que son adecuados para el tratamiento con los compuestos, la composición y los métodos que se describen en la presente descripción. También se describen aquí métodos para identificar sujetos con cáncer.
La presente solicitud proporciona métodos y composiciones para el tratamiento de un cáncer deficiente en NMT2, como se define en las reivindicaciones.
El término “cáncer”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una variedad de afecciones causadas por el crecimiento anormal e incontrolado de las células. Las células capaces de causar cáncer, denominadas "células cancerosas", poseen propiedades características tales como la proliferación incontrolada, la inmortalidad, el potencial metastásico, la velocidad de crecimiento y proliferación rápidos, y/o ciertas características morfológicas típicas. Las células cancerosas pueden estar en forma de un tumor, pero dichas células también pueden existir solas dentro de un sujeto, o pueden ser células cancerosas no tumorigénicas. Un cáncer puede detectarse de varias formas, que incluyen, pero no se limitan a, la detección de la presencia de un tumor o tumores (por ejemplo, por medios clínicos o radiológicos), el examen de las células dentro de un tumor o de otra muestra biológica (por ejemplo, a partir de una biopsia de tejido), la medición de marcadores sanguíneos indicativos de cáncer, y la detección un genotipo indicativo de cáncer. Sin embargo, un resultado negativo en uno o más de los métodos de detección anteriores no indica necesariamente la ausencia de cáncer, por ejemplo, un paciente que ha mostrado una respuesta completa a un tratamiento contra el cáncer aún puede tener un cáncer, como lo evidencia una recaída subsecuente.
En un ejemplo específico, pero que no forma parte de la presente descripción, el cáncer es un linfoma.
El término "linfoma", como se usa en la presente descripción, se refiere a un crecimiento maligno de células B o T en el sistema linfático. "Linfoma" incluye numerosos tipos de crecimientos malignos, que incluyen el linfoma de Hodgkin y el linfoma no Hodgkin. El término "linfoma no Hodgkin", como se usa en la presente descripción, se refiere a un crecimiento maligno de células B o T en el sistema linfático que no es un linfoma de Hodgkin (que se caracteriza, por ejemplo, por la presencia de células Reed-Sternberg en el área del tumor canceroso). Los linfomas no Hodgkin abarcan más de 29 tipos de linfoma, cuyas distinciones se basan en el tipo de células cancerosas.
En un ejemplo más específico, pero que no forma parte de la presente invención, el cáncer es un linfoma B.
Por tanto, en una modalidad, que no forma parte de la presente invención, los compuestos, composiciones y métodos son adecuados para el tratamiento de un sujeto con linfoma de células B.
Los ejemplos de linfomas de células B incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, linfoma folicular, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células del manto, B-CLL/SLL, inmunocitoma/Waldenstrom y linfoma de células B monocitoide/tipo MALT y linfomas pediátricos tales como el linfoma de Burkitt, el linfoma difuso de células B grandes, el linfoma folicular, el precursor B-LBL, el precursor T-LBL y el linfoma anaplásico de células grandes.
El término "sujeto", como se usa en la presente descripción, se refiere a un animal y puede incluir, por ejemplo, animales domésticos, tales como gatos, perros, etc., ganado (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc. ), animales de laboratorio (por ejemplo, ratón, conejo, rata, conejillo de Indias, etc.), mamíferos, mamíferos no humanos, primates, primates no humanos, roedores, aves, reptiles, anfibios, peces y cualquier otro animal. En un ejemplo específico, el sujeto es un humano.
El término "tratamiento" o "tratar", tal y como se usa en la presente descripción, se refiere a la obtención de resultados beneficiosos o deseados, que incluyen a los resultados clínicos. Los resultados clínicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no se limitan a, el alivio o la mejora de uno o más síntomas o afecciones, la disminución de la extensión de la enfermedad, la estabilización (es decir, el no empeoramiento) del estado de la enfermedad, la prevención de la propagación de la enfermedad, el retraso o la ralentización de la progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad, la disminución de la reaparición de la enfermedad y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable. "Que se trata" y "tratamiento" también pueden significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. "Que se trata" y "tratamiento" como se usa en la presente descripción, también incluyen tratamiento profiláctico. Por ejemplo, un sujeto con cáncer temprano, por ejemplo, un linfoma en etapa temprana puede tratarse para prevenir la progresión o, alternativamente, un sujeto en remisión puede tratarse con un compuesto o composición descritos en la presente descripción para prevenir la recurrencia.
Se muestra en la presente descripción que las células de linterna de células B expresan NMT1, pero no NMT2. Esto es lo contrario de lo que ocurre con las células leucémicas y otras células analizadas que expresan tanto NMT1 como NMT2. (Como se muestra en las Figuras 1 y 4)
Se ha demostrado, además, en la presente descripción, que las células de linterna B son sensibles a la inhibición de la viabilidad celular por inhibidores de NMT.
En un ejemplo, el inhibidor de NMT es tris-dibencilidenoacetona-dipaladio (T ris-DBA) (Referencia Figura 2)
En otros ejemplos, que no forman parte de la presente invención, el inhibidor de NMT 2-hidroximiristae (HMA) se usa para inhibir las células de linfoma B.
En aún otro ejemplo, el inhibidor de pirazol sulfonamida de T. brucie NMT [J.A.Frearson y otros (2010) Nature. 464.728­ 723)] (DDD85646) se usa para inhibir las células del linfoma B. (Figura 5).
En un ejemplo específico, el tratamiento de un sujeto con linfoma B comprende administrar a dicho sujeto un inhibidor de NMT como se define en las reivindicaciones.
El compuesto inhibidor de NMT puede usarse en la presente invención para el tratamiento del cáncer deficiente en NMT2.
El término "deficiente", como se usa en la presente descripción, se refiere ampliamente a la inhibición, reducción o eliminación de (en comparación con las muestras de control o de referencia), por ejemplo, la síntesis, los niveles, la actividad o la función de NMT, así como también la inhibición de la inducción o estimulación de la síntesis, los niveles, la actividad o la función de la proteína de NMT (NMT2). El término también se refiere a cualquier trayectoria metabólica o reguladora que pueda regular la síntesis, los niveles, la actividad o la función de NMT. El término incluye también incluye la inhibición, reducción o eliminación resultante de formar uniones con otras moléculas y formación de complejos. Por lo tanto, el término "NMT deficiente" se refiere a aquello que da como resultado la inhibición, reducción o eliminación de la función de la proteína o la función de la trayectoria de la proteína. Sin embargo, el término no implica que todas y cada una de estas funciones deban inhibirse al mismo tiempo.
En algunos ejemplos, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT mediante la determinación de la presencia de una mutación en un gen de NMT. Dichos métodos de detección y amplificación de ácidos nucleicos son bien conocidos por el experto en la técnica.
Por ejemplo, el ácido nucleico a amplificar puede ser de una muestra biológica. Diversos métodos (tales como la extracción con fenol y cloroformo) de extracción son adecuados para aislar el ADN o el ARN. El ácido nucleico extraído de una muestra puede amplificarse mediante el uso de técnicas de amplificación de ácidos nucleicos bien conocidas en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen la reacción en cadena (PCR), la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), la PCR anidada, la reacción en cadena de la ligasa, los indicadores de ARN amplificables, la replicación Q-beta, la amplificación basada en la transcripción, la amplificación bumerán de ADN, la activación por desplazamiento de hebra, la tecnología de sonda cíclica, la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos isotérmicos (NASBA) o también pueden usarse otros ensayos de replicación de secuencias o ensayos de amplificación de señales.
Los métodos de amplificación son bien conocidos en la técnica. Algunos métodos emplean la transcripción inversa de ARN a ADNc.
En un ejemplo, la PCR se usa para amplificar una secuencia objetivo de interés, por ejemplo, una secuencia NMT2.
Los ácidos nucleicos pueden amplificarse antes de la detección o pueden detectarse directamente durante una etapa de amplificación, por ejemplo, métodos en "tiempo real". En algunas modalidades, la secuencia objetivo se amplifica mediante el uso de un cebador marcado de manera que el amplicón resultante se marque de forma detectable. En algunas modalidades, el cebador está marcado con fluorescencia. En algunas modalidades, la secuencia objetivo se amplifica y el amplicón resultante se detecta mediante electroforesis.
El nivel de expresión génica puede determinarse mediante la evaluación de la cantidad de ARNm de NMT2 en una muestra. Los métodos para medir el ARNm en muestras son conocidos en la técnica. Para medir los niveles de ARNm, las células de las muestras pueden lisarse y los niveles de ARNm en los lisados o en el ARN purificado o semipurificado a partir de lisados pueden medirse mediante cualquier variedad de métodos familiares para los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen, sin limitación, ensayos de hibridación mediante el uso de sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable, por ejemplo, inmunotransferencia Northern, o metodologías de RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa mediante el uso de cebadores de oligonucleótidos apropiados. Alternativamente, pueden llevarse a cabo ensayos de hibridación in situ cuantitativos o semicuantitativos mediante el uso, por ejemplo, de secciones de tejido o suspensiones de células no lisadas, y sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable, por ejemplo, fluorescentes o marcadas con enzimas. Los métodos adicionales para cuantificar el ARNm incluyen el ensayo de protección de ARN ("RPA"), las micromatrices de ADNc (microchips de ADN) y oligonucleótidos, el análisis de diferencia de representación ("RDA"), la visualización diferencial, el análisis de secuencia EST, el análisis en serie de la expresión génica ("SAGE") y la amplificación en formato múltiple mediada por ligadura con el Luminex FlexMAP ("LMF").
La amplificación también puede monitorearse mediante el uso de métodos de "tiempo real". La PCR en tiempo real permite la detección y cuantificación de un objetivo de ácido nucleico. Típicamente, este enfoque de la PCR cuantitativa utiliza un colorante fluorescente, que puede ser un colorante específico de doble hebra, tal como SYBR Green.RTM. I. Alternativamente, pueden conjugarse otros colorantes fluorescentes, por ejemplo, FAM o HEX, con una sonda de oligonucleótidos o un cebador. Se conocen en la técnica diversos instrumentos capaces de realizar PCR en tiempo real. La señal fluorescente generada en cada ciclo de PCR es proporcional a la cantidad de producto de PCR. Se usa un gráfico de fluorescencia frente a un número de ciclo para describir la cinética de amplificación y se usa un nivel de umbral de fluorescencia para definir un número de ciclo fraccionario relacionado con la concentración de plantilla inicial. Cuando la amplificación se realiza y detecta en un instrumento capaz de leer la fluorescencia durante los ciclos térmicos, el producto de PCR previsto de los productos de PCR no específicos puede diferenciarse mediante el análisis de fusión. Al medir el cambio en la fluorescencia mientras se aumenta gradualmente la temperatura de la reacción subsecuente a la amplificación y la generación de la señal, puede ser posible determinar el (Act) de los productos previstos, así como también del producto no específico.
Los métodos pueden incluir la amplificación de múltiples ácidos nucleicos en la muestra, también conocida como "detección múltiple" o "formato múltiple". Como se usa en la presente descripción, el término "PCR en formato múltiple" se refiere a la PCR, que implica añadir más de un conjunto de cebadores de PCR a la reacción para detectar y cuantificar múltiples ácidos nucleicos, que incluyen los ácidos nucleicos de uno o más marcadores de genes objetivo. Además, el formato múltiple con un control interno, por ejemplo, 18s ARNr, GADPH o beta-actina, proporciona un control para la PCR sin reacción.
En algunos ejemplos, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT mediante la determinación de la inactivación epigenética de un gen de NMT, o la pérdida de la función proteica.
En algunos ejemplos, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT mediante la determinación de la actividad de NMT (que incluye NMT1 o NMT2) en una muestra de células de un sujeto. La actividad puede determinarse con relación a un control, por ejemplo, en el caso de defectos en células cancerosas, en relación con células no cancerosas, preferentemente del mismo tejido. Por tanto, un cáncer deficiente en NMT puede haber reducido o eliminado la actividad y/o expresión de NMT. La actividad de NMT puede determinarse mediante el uso de técnicas bien conocidas en la técnica. En estos ejemplos, un cáncer deficiente en NMT tiene una actividad reducida o eliminada.
En algunos ejemplos, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT mediante la determinación de la cantidad, concentración y/o niveles de proteína NMT.
En algunos ejemplos, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT mediante la determinación de la cantidad de proteínas miristoiladas en una muestra biológica de un sujeto con cáncer, o sospechoso de tener cáncer. En este ejemplo, la presencia, ausencia o cantidad de proteína miristoilada puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso de química clic mediante el uso de análogos de ácidos grasos apropiados. Los métodos no limitantes se describen en la presente descripción, en Materiales y Método. El experto en la técnica conocerá métodos alternativos para determinar la presencia, ausencia o cantidad de proteínas miristoiladas. Una muestra que tiene una cantidad reducida de proteína miristoilada en una muestra (opcionalmente en comparación con un control) es indicativa de una muestra deficiente en NMT o cáncer deficiente en NMT.
En algunos ejemplos, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT mediante la determinación de la cantidad de acilación de proteínas en una muestra biológica de un sujeto con cáncer, o sospechoso de tener cáncer. En este ejemplo, puede determinarse la presencia, ausencia o cantidad de acilación de proteínas. Dichos métodos serían conocidos por el experto en la técnica. Una muestra que como una cantidad reducida de acilación de proteínas en una muestra (opcionalmente en comparación con un control) es indicativa de una muestra deficiente en NMT o cáncer deficiente en NMT.
En algunos ejemplos, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT mediante la determinación de la presencia de una o más variaciones de secuencia, tales como mutaciones y polimorfismos, que pueden incluir una eliminación, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, con relación a la secuencia de nucleótidos naturales. La una o más variaciones pueden estar en una región codificante o no codificante de la secuencia de ácido nucleico y pueden reducir o suprimir la expresión o función de NMT. Por tanto, el ácido nucleico variante puede codificar un polipéptido variante que tiene actividad reducida o abolida o puede codificar un polipéptido natural que tiene poca o ninguna expresión dentro de la célula, por ejemplo, a través de la actividad alterada de un elemento regulador.
Puede usarse una variedad de métodos para determinar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico particular en una muestra obtenida de un sujeto.
En algunos ejemplos, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT mediante la evaluación del nivel de expresión o actividad de un regulador positivo o negativo de NMT de un componente de la trayectoria de NMT. Los niveles de expresión pueden determinarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos, tales como las inmunotransferencias y ELISA, y métodos de detección de ácidos nucleicos, tales como RT-PCR, tecnología de nanocadenas, secuenciación de ARN, hibridación de ácidos nucleicos o análisis cariotípico.
En algunos ejemplos, un cáncer puede identificarse como deficiente en NMT mediante la determinación de la presencia en una muestra de células del individuo de una o más variaciones, por ejemplo, polimorfismos o mutaciones en NMT.
Las mutaciones y polimorfismos asociados con el cáncer también pueden detectarse a nivel de proteína mediante la detección de la presencia de un polipéptido variante (es decir, una variante mutante o alélica).
En otro ejemplo, se proporciona un método para tratar a un sujeto con cáncer, en donde dicho cáncer comprende células cancerosas que son deficientes en n MT2, que comprende administrar a dicho sujeto un inhibidor de NMT y/o un inhibidor de NMT1.
El término "inhibir" o "inhibidor", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier método o técnica que inhiba la síntesis, los niveles, la actividad o la función de proteínas, así como también los métodos para inhibir la inducción o estimulación de la síntesis, los niveles, la actividad o la función de la proteína de interés, por ejemplo, NMT2. El término también se refiere a cualquier trayectoria metabólica o reguladora que pueda regular la síntesis, los niveles, la actividad o la función de la proteína de interés. El término incluye la unión con otras moléculas y la formación de complejos. Por lo tanto, el término "inhibidor" se refiere a cualquier agente o compuesto, cuya aplicación da como resultado la inhibición de la función de la proteína o la función de la trayectoria de la proteína. Sin embargo, el término no implica que todas y cada una de estas funciones deban inhibirse al mismo tiempo.
En otro ejemplo, se proporciona un método para tratar a un sujeto con cáncer, en donde dicho cáncer comprende células cancerosas deficientes en NMT2, que comprende administrar a dicho sujeto un inhibidor de NMT y/o un inhibidor de NMT2.
En algunos ejemplos, los métodos de tratamiento comprenden la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto descrito en la presente descripción y, opcionalmente, consisten en una sola administración o, alternativamente, comprenden una serie de aplicaciones. En un ejemplo concreto, dicho compuesto es un inhibidor de NMT, un inhibidor de NMT 1 y/o un inhibidor de NMT2.
En un ejemplo más específico, el inhibidor de NMT es DDD85646.
En otros ejemplos, los compuestos y/o composiciones se proporcionan en una cantidad con efecto farmacéutico adecuada para la administración a un sujeto.
El término "cantidad farmacéuticamente efectiva", como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad de un fármaco o agente farmacéutico que provocará la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o ser humano buscada por un investigador o un clínico. Esta cantidad puede ser una cantidad terapéuticamente efectiva.
Los compuestos y composiciones se proporcionan en una forma farmacéuticamente aceptable.
El término "farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente descripción, incluye compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de un sujeto sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, proporcional a una relación beneficio/riesgo razonable. Cada portador, excipiente, etc. también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación.
La cantidad real administrada, y la velocidad y el tiempo de administración, dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que se esté trata. La prescripción de tratamientos, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y otros facultativos, y típicamente tiene en cuenta el trastorno a tratar, la condición de cada paciente, el lugar de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los facultativos.
Un compuesto o composición puede administrarse solo o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultánea o secuencialmente, en dependencia de la afección a tratar.
Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de unidad de dosificación y pueden prepararse por cualquiera de los métodos que se conocen bien en la técnica de farmacia. Dichos métodos incluyen la etapa de poner el compuesto activo en asociación con un portador, que puede constituir uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan mediante la asociación uniforme e íntima del compuesto activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos, o ambos, y luego, si es necesario, se da forma al producto.
Los compuestos y composiciones pueden administrarse a un sujeto por cualquier vía de administración conveniente, ya sea sistémica/periférica o en el lugar de la acción deseada, que incluye, pero no se limita a, oral (por ejemplo, por ingestión); tópica (que incluye, por ejemplo, transdérmica, intranasal, ocular, bucal y sublingual); pulmonar (por ejemplo, mediante terapia de inhalación o insuflación mediante el uso, por ejemplo, de un aerosol, por ejemplo, a través de la boca o la nariz); rectal; vaginal; parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intratecal, intraespinal, intracapsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcuticular, intraarticular, subaracnoidea e intraesternal; por implante de un depósito / por ejemplo, subcutáneo o intramuscular.
Las formulaciones adecuadas para la administración oral (por ejemplo, por ingestión) pueden presentarse como unidades discretas, tales como cápsulas, sobres o tabletas, cada una de las cuales contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo; como polvo o gránulos; como solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como emulsión líquida de aceite en agua o emulsión líquida de agua en aceite; como bolo; como electuario; o como pasta.
Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral (por ejemplo, mediante inyección, que incluye la cutánea, subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica), incluyen soluciones de inyección estériles, isotónicas, libres de pirógenos, acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, conservantes, estabilizadores, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del destinatario previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes, y liposomas u otros sistemas de micropartículas que están diseñados para dirigir el compuesto a componentes sanguíneos o a uno o más órganos. Ejemplos de vehículos isotónicos adecuados para su uso en dichas formulaciones incluyen la inyección de cloruro de sodio, la solución de Ringer o la inyección de Ringer lactato.
Las formulaciones pueden presentarse en envases sellados unidosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse liofilizadas, lo que requiere únicamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para inyectables, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas pueden prepararse a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles. Las formulaciones pueden estar en forma de liposomas u otros sistemas de micropartículas que están diseñados para dirigir el compuesto activo a componentes sanguíneos o a uno o más órganos.
Las composiciones que comprenden los compuestos descritos en la presente descripción pueden usarse en los métodos descritos en la presente descripción en combinación con regímenes quimioterapéuticos estándar o junto con radioterapia.
En el caso de linfoma en un paciente, los tratamientos conocidos son dependientes del sujeto a tratar, el tipo de enfermedad y su etapa. Las modalidades de tratamiento existentes para el linfoma son conocidas por el experto en la técnica. En consecuencia, pueden usarse tratamientos conocidos junto con el inhibidor de NMT descrito en la presente descripción.
Las combinaciones de fármacos habituales para usar en el tratamiento de linfomas incluyen CHOP (es decir, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona), GAP-BOP (es decir, ciclofosfamida, doxorrubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina y prednisona), m-BACOD (es decir, metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona y leucovorina), ProMACE-MOPP (es decir, prednisona, metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, leucovorina con MOPP estándar), ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina) y MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorina). Para el linfoma no Hodgkin agresivo recidivante, pueden usarse las siguientes combinaciones de fármacos de quimioterapia con los compuestos y composiciones descritos en la presente descripción: IMVP-16 (es decir, ifosfamida, metotrexato y etopósido), MIME (es decir, metil-gag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), DHAP (es decir, dexametasona, - 16 dosis alta de citarabina y cisplatino), ESHAP (es decir, etopósido, metilprednisona, citarabina en dosis altas y cisplatino), CEFF(B) (es decir, ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina) y CAMP (es decir, lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona).
El tratamiento para la quimioterapia de rescate que se usa para ciertos linfomas incluye VABCD (es decir, vinblastina, doxorrubicina, dacarbazina, lomustina y bleomicina), a Bd IC (es decir, doxorrubicina, bleomicina, dacarbazina, lomustina y prednisona), CBVD (es decir, lomustina, bleomicina, vinblastina, dexametasona), PCVP (es decir, vinblastina, procarbazina, ciclofosfamida y prednisona), CEP (es decir, lomustina, etopósido y prednimustina), EVA (es decir, etopósido, vinblastina y doxorrubicina), MOPLACE (es decir, ciclofosfamida, etopósido, prednisona, metotrexato, citaravina y vincristina), MIME (es decir, metil-gag, ifosfamida, metotrexato y etopósido), MINE (es decir, mitocuazona, ifosfamida, vinorelbina y etopósido), MTX-CHOP (es decir, metotrexato y CHOP), CEM (es decir, lomustina, etopósido y metotrexato), CEVD (es decir, lomustina, etopósido, vindesina y dexametasona), CAVP (es decir, lomustina, melfalán, etopósido y prednisona), EVAP (es decir, etopósido, vinblastina, citarabina, y cisplatino), y EPOCH (es decir, etopósido, vincristina, doxorrubicina, ciclofosfamida y prednisona).
Se apreciará que pueden usarse métodos alternativos, pero que no forman parte de la presente invención, para inhibir NMT1 o NMT2 en una estrategia letal sintética para el tratamiento del cáncer, y en particular el tratamiento del linfoma de células B. Por ejemplo, la expresión de NMT1 o NMT2 puede inhibirse mediante el uso de tecnología antisentido o ARNi. El experto en la técnica conoce el uso de estos enfoques para la regulación negativa de la expresión génica y/o la actividad proteica.
En otra modalidad de la presente descripción, se proporciona un método para determinar el beneficio del tratamiento con un inhibidor de NMT2 y/o un inhibidor de NMT 1 de un paciente.
En un ejemplo, un método de la presente descripción comprende determinar cualitativa o cuantitativamente, analizar o medir una muestra de un sujeto con cáncer, o sospechoso de tener cáncer, para la presencia o ausencia, o cantidad o concentración, de NMT2.
En otro ejemplo, un método de la presente descripción comprende determinar cualitativa o cuantitativamente, analizar o medir una muestra de un sujeto con cáncer, o sospechoso de tener cáncer, para la presencia o ausencia, o cantidad o concentración, de proteínas miristoladas.
En otro ejemplo, un método de la presente descripción comprende determinar cualitativa o cuantitativamente, analizar o medir una muestra de un sujeto con cáncer, o sospechoso de tener cáncer, para la presencia o ausencia, o cantidad o concentración, de proteínas aciladas.
El término "muestra" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier muestra de un sujeto, que incluye, pero no se limita a, una muestra de fluido, célula o tejido que comprende células cancerosas, o que se sospecha que contiene células cancerosas, que pueda ensayarse para determinar los niveles de expresión génica, los niveles de proteínas, los niveles de actividad enzimática, y similares. La muestra puede incluir, por ejemplo, una muestra de sangre, una muestra de sangre fraccionada, una muestra de médula ósea, una biopsia, una muestra de tejido congelado, un espécimen de tejido fresco, una muestra de células y/o una sección embebida en parafina, material del cual el ARN puede extraerse en cantidades suficientes y con la calidad adecuada para permitir la medición de los niveles relativos de ARNm, o el material del que pueden extraerse los polipéptidos en cantidades suficientes y con la calidad adecuada para permitir la medición de los niveles relativos del polipéptido.
La determinación, análisis o medición de NMT2, o la presencia o ausencia de NMT2 puede correlacionarse con el beneficio del tratamiento del cáncer con inhibidores de NMT 1 o inhibidores de NMT2 en el paciente.
La determinación, el análisis o la medición de proteínas miristoliadas, o la presencia o ausencia de proteínas miristoliadas pueden correlacionarse con el beneficio del tratamiento del cáncer con inhibidores de NMT 1 o inhibidores de NMT2 en el paciente.
En un ejemplo específico, pero que no forma parte de la presente invención, los anticuerpos son inmunorreactivos o inmunoespecíficos y, por lo tanto, se unen específica y selectivamente a una proteína de interés, por ejemplo, la proteína NMT1 o NMT2. En un ejemplo, pueden usarse anticuerpos que son inmunorreactivos e inmunoespecíficos para NMT1 o NMT2 humana. Los anticuerpos para NMT1 o NMT2 humanos son preferentemente inmunoespecíficos. El término "anticuerpo" y "anticuerpos" incluye, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales y policlonales.
En otro ejemplo, los anticuerpos son inmunorreactivos o inmunoespecíficos y, por lo tanto, se unen específica y selectivamente tanto a la proteína NMT1 como a la NMT2. En este ejemplo, pueden usarse anticuerpos que son inmunorreactivos e inmunoespecíficos tanto para NMT1 como para n MT2 humanos. Los anticuerpos para NMT1 y NMT2 humanos son preferentemente inmunoespecíficos. En este ejemplo, y debido a la diferente masa molecular de NMT1 y NMT2, es posible identificar la presencia o ausencia de ambas proteínas mediante el uso de un solo anticuerpo, mediante el uso, por ejemplo, de SDS-PAGE e inmunotransferencia. El término "anticuerpo" y "anticuerpos" incluye, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales y policlonales.
El término "se une específicamente" se refiere a la unión de alta avidez y/o alta afinidad de un anticuerpo a un polipéptido específico, por ejemplo, un epítopo de NMT1 o NMT2. La unión del anticuerpo a su epítopo en este polipéptido específico es más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, particularmente aquellos que pueden estar presentes en moléculas en asociación con, o en la misma muestra, que el polipéptido específico de interés. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de interés pueden ser capaces de unirse a otros polipéptidos a un nivel débil, pero detectable. Dicha unión débil, o unión de fondo, es fácilmente discernible de la unión del anticuerpo específico al compuesto o polipéptido de interés, por ejemplo, mediante el uso de controles apropiados, como sabrá el experto en la técnica.
En un ejemplo, una muestra que contiene células cancerosas o que se sospecha que contiene células cancerosas se obtiene de un sujeto con cáncer. La recogida de una muestra de este tipo es bien conocida por el experto en la técnica. En un ejemplo específico, la muestra es una muestra de sangre. Los métodos para obtener una muestra, procesamiento y/o almacenamiento de dicha muestra también son bien conocidos por el experto en la técnica.
En un ejemplo específico, la detección, el análisis o la medición de la proteína NMT1 o NMT2 dentro de una muestra se lleva a cabo mediante el uso de inmunohistoquímica. Quedará claro para el experto en la técnica que en la presente invención pueden usarse otros inmunoensayos, tanto cualitativos como cuantitativos.
Otros ejemplos que pueden usarse en la detección, análisis o medición de NMT1 o NMT2 incluyen, pero no se limitan a, inmunotransferencia, ELISA, inmunofluorescencia indirecta, tecnología de microesferas en formato múltiple, inmunoprecipitación y espectrometría de masas a partir de muestras obtenidas del sujeto. En la práctica, en el ejemplo en el que se determina que la muestra de un paciente tiene una tinción de NMT2 baja o nula, el sujeto se considera un buen candidato para la terapia con inhibidores de NMT.
En otro ejemplo, un método de la presente descripción comprende determinar cualitativa o cuantitativamente, analizar o medir la actividad de la proteína NMT1 y/o NMT2 en una muestra biológica de un sujeto con un paciente con cáncer para la presencia o ausencia o cantidad de actividad NMT1 y/o NMT2. En este ejemplo, los usos de sustratos (naturales o sintéticos) de NMT1 o NMT2 se usan para identificar una muestra en la que la actividad de NMT1 o NMT2 está presente, ausente o la cantidad de la misma.
En la práctica, en el ejemplo en el que se determina que la muestra de un sujeto es deficiente en NMT2, el sujeto se considera un buen candidato para la administración de un inhibidor de NMT.
En la práctica, en el ejemplo en el que se determina que la muestra de un paciente tiene actividad NMT2 baja o nula, el sujeto se considera un buen candidato para la administración de un inhibidor de NMT.
En la práctica, en el ejemplo en el que se determina que la muestra de un paciente tiene una cantidad baja o nula de proteína miristolada, el sujeto se considera un buen candidato para la administración de un inhibidor de NMT.
En la práctica, en el ejemplo en el que se determina que la muestra de un sujeto tiene una cantidad baja o nula de proteína acilada, el sujeto se considera un buen candidato para la administración de un inhibidor de NMT.
En otro ejemplo, un método de la presente descripción comprende identificar una mutación, eliminación o similar, en el gen NMT1 o NMT2 en una muestra de un sujeto con cáncer o sospechoso de tener cáncer. En donde, dicha mutación, eliminación o similar, en el gen NMT1 o NMT2 da como resultado una pérdida o disminución de la actividad de la proteína NMT1 o NMT2 en células cancerosas dentro de dicha muestra. Los métodos para identificar dichas mutaciones, eliminaciones o similares en NMT1 o NMT2 son conocidos por el experto en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, RFLP, RT-PCT, análisis de micromatrices y/o cualquier tipo adecuado de secuenciación de ADN. En la práctica, en el ejemplo en el que se determina que una muestra de un paciente tiene una mutación, eliminación o similar, en NMT2 que da como resultado una actividad de la proteína n MT2 baja o nula, el sujeto se considera un buen candidato para la terapia con inhibidores de NMT.
En otro ejemplo, un método de la presente descripción comprende identificar una mutación, eliminación o similar, en el ARNm de NMT1 o NMT2 en una muestra de un sujeto con cáncer o sospechoso de tener cáncer. En donde, dicha mutación, eliminación o similar, en el ARNm de NMT1 o NMT2 da como resultado una pérdida o disminución de la actividad de la proteína NMT1 o NMT2 en células cancerosas dentro de dicha muestra. Los métodos para identificar dichas mutaciones, eliminaciones o similares, en el ARNm de NMT1 o NMT2 son conocidos por el experto en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, inmunotransferencia Northern, RT-PCR, análisis de micromatrices y/o cualquier tipo adecuado de secuenciación de ARNm. En la práctica, en el ejemplo en el que se determina que una muestra de un paciente tiene una mutación, eliminación o similar, en el ARNm de NMT2 que da como resultado una actividad de la proteína NMT2 baja o nula, el sujeto se considera un buen candidato para la terapia con inhibidores de NMT.
En otro ejemplo, un método de la presente descripción, se proporciona un método para el tratamiento de un sujeto que padece linfoma de Burkitt, asociado con un defecto en NMT2, que comprende administrar a dicho sujeto un inhibidor de NMT como se define en las reivindicaciones.
Los ejemplos de inhibidores incluyen DDD85646.
Un defecto en NMT2 es un fenotipo deficiente en NMT2 que puede ser deficiente en un componente de una trayectoria mediada por NMT2, es decir, la expresión de la actividad de un componente de la trayectoria puede reducirse o abolirse en la célula cancerosa con relación a las células de control. En algunas modalidades, la célula cancerosa puede ser deficiente en NMT2, es decir, la expresión de la actividad de NMT2 puede reducirse o anularse en la célula cancerosa con relación a las células de control.
En consecuencia, se proporciona el uso de NMT2 como marcador para uno o más diagnósticos, pronósticos, clasificación o monitoreo del cáncer en un sujeto. En algunos ejemplos, se dice que NMT2 se mide mediante el uso de un ensayo seleccionado de inmunoensayos o detección de ácidos nucleicos o actividad de proteínas.
También se proporciona el uso de miristoilación de proteínas como marcador para uno o más de diagnóstico, pronóstico, clasificación o monitoreo del cáncer en un sujeto.
También se proporciona el uso de la acilación de proteínas como marcador para uno o más de diagnóstico, pronóstico, clasificación o monitoreo del cáncer en un sujeto.
En algún ejemplo, dicho cáncer es el linfoma de Burkitt.
Los métodos de la invención se practican convenientemente al proporcionar los compuestos y/o composiciones usadas en dicho método en forma de kit. Dicho kit contiene preferentemente la composición. Dicho kit contiene preferentemente instrucciones para el uso del mismo.
Para obtener una mejor comprensión de la invención descrita en la presente descripción, se exponen los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos son únicamente para fines ilustrativos. Por lo tanto, no deben limitar el alcance de esta invención de ninguna manera.
Ejemplos
En los siguientes ejemplos, se emplearon metodologías estándar, como apreciará el experto en la técnica.
Materiales y métodos
Anticuerpos y reactivos.
Tris dibutilbencinilideno acetona paladio (TrisDBA) fue un amable obsequio del Dr. Arbiser (U. Alabama). DDD85646 se sintetizó como se describió en [J.A.Frearson y otros (2010) Nature. 464.728-723)] y se obtuvo del Dr. David Gray y Paul Wyatt, Universidad de Dundee)
Los anticuerpos anti-NMT1 de ratón (clon 14; 1:1000) y anti-NMT2 de ratón (clon 30; 1:2000) procedían de BD Biosciences, San José, CA, EE. UU. El anti-NMT1 de conejo (policlonal, 1:3000) se adquirió de Proteintech, Chicago, IL, EE. UU. Los anticuerpos de conejo anti-GFP (1:20000), anti-PARP-1 (1:5000), anti-GAPDH (1:5000) y anti-PAK2 terminal (1:2000) procedían de Eusera (www.eusera.com), Edmonton, AB, Canadá. Los anticuerpos anti-a-tubulina de ratón (1:15000) y anti-V5 de conejo (1:10000) se adquirieron de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Ee . UU. El anti-His de ratón (1:2000) procedía de Qiagen, Alemania. La caspasa-8 anti-escindida de conejo (1:1000) y la caspasa-3 anti­ escindida (1:1000) procedían ambas de Cell Signaling, Danvers, MA, EE. UU. Los kits de detección de inmunotransferencia Western de quimioluminiscencia mejorada (ECL) Plus y ECL Prime se adquirieron a GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE.UU. A menos que se indique de cualquier otra manera, todos los productos químicos usados se compraron a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) y eran de la mayor pureza disponible.
Construcciones de ADN. Ingeniería de construcciones NMT1 y NMT2 marcadas con V5 e His. Los vectores de entrada NMT1 y NMT2 que son compatibles con el sistema de clonación Gateway (Life Technologies, Grand Island, N.Y., EE. UU.) se adquirieron de Genecopoeia (Rockville, MD, EE. UU.). Incorporar los genes NMT1 y NMT2 al vector de destino pcDNA3.1/nV5 DEST (Life Technologies) mediante el uso de la enzima clonasa LR (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para generar los plásmidos N-terminal-marcado NMT (His-NMT1, His-NMT2, V5-NMT1 y V5-NMT2). Usar construcciones de NMT marcadas con V5 para la expresión de células de mamífero, mientras que usar construcciones de His-NMT para la expresión bacteriana. Confirmar los productos de clonación mediante secuenciación de ADN (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL, EE. UU.).
Cultivo celular. El origen de las células B fue un regalo del Dr. Jim Stone o se obtuvieron de la ATCC. Todos los reactivos del cultivo celular se adquirieron de Invitrogen. Cultivar las células B a 37 °C y CO2 al 5 % en un incubador humidificado y mantenerlas en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10 %, 100 U/ml de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina.
Lisis celular. Lavar las células en PBS frío, lisarlas en tampón SDS-RIPA al 0,1 % [Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Igepal CA-630 al 1 %, NaDC al 0,5 %, MgCl 2 mM2 , y 1x inhibidor de proteasa completo (Roche Diagnostics); pH 8,0] y agitar durante 15 min a 4 °C. Obtener el sobrenadante de los lisados celulares después de centrifugar a 16000 g durante 15 min a 4 °C.
Inducción de la apoptosis. A menos que se indique de cualquier otra manera, inducir la apoptosis mediante el uso de estaurosporina (STS) 2,5 pM (Sigma Aldrich, St. Louise, MO, EE. UU.) y cicloheximida 5 pg/ml (ICN Biochemicals Inc. Aurora, Oh , EE. UU.) para inhibir la traducción de proteínas y mejorar la inducción de la apoptosis.
Incubación con inhibidores de NMT. El tris dibutilbencinilideno acetona paladio (TrisDBA) fue un amable regalo del Dr. Arbiser. Incubar las células a concentraciones en aumento durante 24 horas con TrisDBA (o DMSO para el control) o durante 24 y 48 horas con DDD85646.
Transfección de células B. Transfectar las células B mediante el uso del sistema de transfección Neon® (tecnologías Life) mediante el seguimiento de las instrucciones del fabricante y el protocolo optimizado para la transfección de células B Ramos (tensión de pulso 1300 V; ancho de pulso 20 ms, 2 pulsos y 7,7,106 células/ml) adaptado para puntas de 100 |jl. Clásicamente, extraer dos transfecciones para obtener suficientes células vivas para realizar un ensayo de viabilidad.
Ensayo de la viabilidad celular. Medir la viabilidad celular de B y T mediante el uso del método de exclusión con azul de tripano. Cultivar las células en condiciones de confluencia (2 * 106 células/ml como máximo) para asegurar la mínima apoptosis basal. Después de incubar con inhibidores de NMT, incubar aproximadamente 20000 células (10 jl) con 10 j l de Colorante azul tripano TC10™ (Biorad) durante 15 min. Cuantificar la viabilidad celular mediante el uso del contador celular automatizado TC10™ (Biorad).
Ensayo de actividad de NMT in vitro. Adaptar el protocolo de ensayo de actividad de N-miristoiltransferasa de Raju, R. V., y Sharma, R. K. (1999) Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase. Methods Mol Biol 116, 193-211. Para cada experimento recién sintetizar [3H] miristoil-CoA, tal y como se describió anteriormente en Towler, D., y Glaser, L. (1986) Protein fatty acid acylation: enzymatic synthesis of an N-myristoylglycyl peptide. Proc Natl Acad Sci U S A 83, 2812-2816. Resuspender brevemente, las células en tampón sacarosa 0,25 M (NaH2 PO4 50 mM, pH 7,4) y someterlas a 2 rondas de sonicación a nivel 6,0 en un Branson Sonicator. La mezcla de reacción está compuesta por 10 j l de extracto celular (aproximadamente 20 jg de proteínas) incubado en tampón de actividad NMT (Tris-HCl 0,26 M, EGTA 3,25 mM, EDTA 2,92 mM y 2-mercaptoetanol 29,25 mM, Triton X-100 al 1 %, pH 7,4) y decapéptido miristoilable o no miristoilable correspondiente a la secuencia N-terminal de Bid truncado (0,1 mM disuelto en agua). Iniciar la reacción mediante la adición de 7,4 j l (“ 10pMol) de [3H] miristoil-CoA recién sintetizado (volumen final de la mezcla = 25 j l ) e incubar durante 15 min a 30 °C. Detener la reacción al colocar 15 j l de la mezcla de reacción en un disco de papel de fosfocelulosa P81 (Whatman, Kent, Reino Unido) y secar durante 30 segundos. Lavar los discos (tampón de lavado: tampón Tris 25 mM, pH 7,4) para eliminar la radiactividad residual ([3H]-miristato y [3H]-miristoil-CoA) y mientras retener [3H]-miristoilpéptido en el papel de fosfocelulosa. Cuantificar la radiactividad mediante recuento de centelleo líquido y convertir en pMol de péptido miristoilado (Raju, R. V., y Sharma, R. K. (1999) Preparation and assay of myristoyl-CoA:protein N-myristoyltransferase. Methods Mol Biol 116, 193-211
Realizar RT-PCR. qRT-PCR con sondas Taqman NMT1 y NMT2 mediante el uso de una sonda 18S como control interno. Calcular la diferencia en el número de tiempos de ciclo (Act) al restar el tiempo de ciclo (ct) en el que se observa un aumento exponencial en la expresión del control interno 18S para cada tipo de célula del tiempo de ciclo de NMT, nuevamente en un punto donde se observa un aumento exponencial de la señal.
Ejemplo 1
La Figura 1 representa el análisis de la expresión de NMT 1 y NMT2 en células normales y diversos linfomas de células B y leucemias de células T. Esta figura muestra la ausencia casi completa de expresión de NMT2 en líneas celulares de linfoma B (BL-2, Ramos), que expresan solo NMT1 en comparación con las células B normales (linfocitos B humanos transformados con EBV, L0) y líneas de células T leucémicas humanas (Jurkat, MOLT-4, CEM).
Aunque no se desea ceñirse a la teoría, es probable que aquellas células que expresan sólo una isoenzima de NMT, por ejemplo, las células de linfoma de Burkitt que muestran la ausencia casi completa de NMT2, tengan perfiles de proteína miristoilada alterados.
Una muestra que tiene una cantidad reducida de proteína miristoilada en una muestra (opcionalmente en comparación con un control) es indicativa de una muestra deficiente en NMT o cáncer deficiente en NMT. Dicho cáncer deficiente en NMT es adecuado para el tratamiento con un inhibidor o NMT1.
Ejemplo 2 (Referencia)
La Figura 2 representa la sensibilidad de diversos linfomas de células B y leucemias de células T a los inhibidores de NMT tris-dibencilidenoacetona-dipaladio (Tris-DBA). Incubar diversas células B y T durante 24 h con concentraciones en aumento de Tris DBA. Medir la viabilidad celular mediante el uso del método de exclusión con azul de tripano y ajustar al 100 % para el control. Las curvas de supervivencia celular medidas por exclusión con azul de tripano muestran que los linfomas de células B son más sensibles al inhibidor de NMT tris-dibencilidenoacetona-dipaladio (Tris-DBA).
Ejemplo 3 (Referencia)
La Figura 3 representa la inhibición de N-miristoiltransferasa (NMT) por tris-dibencilidenoacetona-dipaladio (Tris-DBA).
Ensayar la actividad de NMT mediante el uso de un ensayo de miristoilación de péptidos con NMT1 y NMT2 recombinantes purificados. Calcular la actividad de NMT a partir de la cantidad de miristoilpéptido radiomarcado producido y detectado en papel de fosfocelulosa (adaptado de King y otros 1991, Anal Biochem.).
Esta figura muestra que la tris-dibencilidenoacetona-dipaladio (Tris-DBA) inhibe la NMT in vitro mediante el uso de enzimas NMT recombinantes purificadas.
Ejemplo 4
La figura 4 representa los resultados de las inmunotransferencias en las que se sondaron las líneas celulares de linfoma con anticuerpos contra NMT 1 (Panel A) y NMT 2 (Panel B). La leyenda de la Figura 4 corresponde a lo siguiente: IM9: linfoblasto B; BL2: linfoma de Burkitt; CEM: leucemia de células T; Karpa 299: linfoma de células T; Sup-M2: LACG; UCONN: ALCL (ALCL: linfoma anaplásico de células grandes); DAUDI: linfoma de Burkitt; Ramos: linfoma de Burkitt; BJAB: linfoma de Burkitt; HD-MYZ: Linfoma de Hodgkin; KM-H2: Linfoma de Hodgkin; L428: Linfoma de Hodgkin; Jurkat: Leucemia de células T.
Ejemplo 5
La Figura 5 representa la efectividad de los inhibidores de NMT en la línea celular de linfoma de Burkitt Ramos en comparación con la línea celular linfocítica B normal inmortalizada (IM9) después de 48 horas, a diferentes concentraciones.
Ejemplo 6 (Referencia)
En este ejemplo, la transfección de células de linfoma B Ramos (que, como se muestra en la presente descripción, expresa NMT1) con pcDNA3.1-V5-NMT2 aumentó la supervivencia a TrisDBA (5 ug/ml) 2,5 veces frente a las células de control transfectadas con un vector de plásmido vacío. En la Figura 6, 20 * 106 se transfectaron células de linfoma B Ramos con 32 |jg de ADN (pcDNA3.1-V5-vacío o pcDNA3.1-V5-NMT2) mediante el uso del Sistema de transfección de neón (Invitrogen) al seguir el protocolo recomendado para la línea celular Ramos (1350 voltios, 30 ms). Centrifugar las células transfectadas durante 5 minutos a 1200 rpm para eliminar las células muertas y los restos celulares. Permitir que las células del sobrenadante se recuperen durante 6 horas en RPMI completo. Después de lavar con PBS, resuspender las células y cultivarlas en RPMI que contiene TrisDBA (5 jg/m l) durante 24 horas y luego se contarlas mediante el uso del método de exclusión con azul de tripano (Panel A). Lisar las células y realizar la inmunotransferencia Western (ECL) para confirmar la expresión de NMT2 con anticuerpos contra NMT2 y GAPDH para el control de carga (Panel B).
Ejemplo 7
En este ejemplo, qRT-PCR se realizó con sondas Taqman NMT1 y NMT2 mediante el uso de una sonda 18S como control interno. Calcular la diferencia en el número de tiempos de ciclo (Act) al restar el tiempo de ciclo (ct) en el que se observa un aumento exponencial en la expresión del control interno 18S para cada tipo de célula del tiempo de ciclo de NMT, nuevamente en un punto donde se observa un aumento exponencial de la señal. Como se muestra en la Tabla 1, más abajo, la relación de expresión de NMT2 a NMT1 disminuye (hasta 60 veces) en las líneas celulares de linfoma B. Sin pretender ceñirnos a la teoría, estos resultados pueden sugerir que una reducción del ARNm que codifica para NMT2 puede ser responsable de la reducción de los niveles de proteína NMT 2 evaluados mediante la inmunotransferencia Western.
Tabla 1
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Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un kit para usar en el tratamiento del cáncer en un sujeto que tiene un cáncer deficiente en NMT2, que comprende: un inhibidor de NMT en donde dicho inhibidor de NMT es DDD85646; en donde dicho cáncer deficiente en NMT2 es el linfoma de Burkitt, e instrucciones para el uso del mismo.
2. El kit para usar de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho kit comprende además un agente quimioterapéutico o una combinación de agentes quimioterapéuticos, preferentemente dicha combinación de agentes quimioterapéuticos es CHOP, GAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEFF(B), CAMP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, MTX-CHOP, CEM, CEVD, CAVP, EVAP o EPOCH.
3. Un inhibidor de NMT para usar en un método para tratar un cáncer deficiente en NMT2, en donde dicho método comprende determinar si una muestra obtenida de un sujeto tiene deficiencia en NMT2, y tratar al sujeto con el inhibidor de NMT, en donde dicho inhibidor de NMT es DDD85646, donde dicho cáncer deficiente en NMT2 es el linfoma de Burkitt.
4. El inhibidor para usar de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende además el uso de un agente quimioterapéutico o una combinación de agentes quimioterapéuticos, preferentemente dicha combinación de agentes quimioterapéuticos es CHOP, GAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEFF(B), CAMP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, MTX-CHOP, CEM, CEVD, CAVP, EVAP o EPOCH.
5. Un inhibidor de NMT para usar en el tratamiento de un sujeto que tiene un cáncer deficiente en NMT2, en donde dicho inhibidor es DDD85646, en donde dicho cáncer deficiente en NMT2 es el linfoma de Burkitt.
6. El inhibidor para usar de acuerdo con la reivindicación 5, dicho uso comprende además administrar un agente quimioterapéutico o una combinación de agentes quimioterapéuticos, preferentemente dicha combinación de agentes quimioterapéuticos es CHOP, GAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEFF(B), CAMP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, MTX-CHOP, CEM, CEVD, CAVP, EVAP o EPOCH.
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