BR112015009607B1 - Método e kit para identificar um sujeito adequado para o tratamento com um inibidor de nmt1 ou nmt, e seus usos - Google Patents

Abstract

LETALIDADE SINTÉTICA E O TRATAMENTO DE CÂNCER. São aqui descritos compostos, composições e métodos para o tratamento de câncer. Também são descritos métodos e usos para a identificação de um indivíduo com câncer que são adequados para o tratamento com os compostos, composição e métodos aqui descritos. Em um aspecto da presente invenção, é proporcionado um método de tratamento de um indivíduo tendo um câncer deficiente em NMT2, que compreende: a administração ao referido indivíduo de um inibidor NMT.

Description

PEDIDOS CRUZADOS RELACIONADOS Este pedido reivindica a aos pedidos US 61/720,218, depositado em 30 de outubro de 2012, US 61/870,418, depositado em 27 de agosto de 2013, US 61/870,435, depositado em 27 de agosto, 2013, os conteúdos completos de todos estão aqui incorporados por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] O campo da invenção se refere, de uma forma geral, a compostos, composições e métodos para o tratamento de câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] O câncer é uma das principais causas de morte no Canadá. A Canadian Cancer Society estima que haverá cerca de 170 mil novos casos de câncer em 2011, e cerca de 75 mil mortes em decorrência de câncer.

[0003] Uma abordagem recente para o tratamento de câncer se relaciona com o conceito de letalidade sintética. Dois genes (ou dois produtos do gene) são letais se a mutação, de ambos por si só é compatível com a viabilidade, mas a mutação de ambos conduz à morte. Dito de outra forma, "letalidade sintética" descreve situações, em que uma mutação e um fármaco (por exemplo) em conjunto causam a morte de uma célula cancerosa - ou a mutação ou o fármaco não resultaria em morte celular. Visando um gene (ou produto do gene) que é sintético letal a uma mutação relevante de câncer deve matar as células cancerosas apenas e reposição de células normais. Portanto letalidade sintética fornece uma estrutura para o desenvolvimento de agentes anticâncer específicos.

[0004] A abordagem de letalidade sintética para o tratamento do câncer está a emergir, ainda não é uma abordagem de rotina em grande parte devido à ausência de identificação de genes letais (sintéticos e produtos de genes).

[0005] N-miristoilação de proteínas é uma modificação em que o miristato (um ácido graxo saturado de 14 carbonos) está covalentemente ligado à glicina terminal NH2 de uma variedade de proteínas celulares, onco e virais (por exemplo, tirosina- quinases oncogênicas relacionadas com Src, subunidades alfa G heterotriméricas, etc.).

[0006] Proteínas celulares miristoiladas têm diversas funções biológicas na transdução de sinal e oncogênese. A modificação de proteínas por miristoilação é necessária para o direcionamento subcelular, conformação da proteína e a atividade biológica de muitas proteínas importantes em células eucariotas, incluindo as necessárias para a transdução de sinal e funções reguladoras importantes no crescimento celular. As tirosina-quinases da família Src (proto-oncogenes) estão entre as proteínas mais extensivamente estudadas com ácido mirístico.

[0007] Miristoilação de proteínas é catalisada por N- miristoiltransferase(NMT). NMT é responsável por esta atividade em células eucarióticas e funciona através da modificação do seu substrato polipeptídeo após a remoção do resíduo de metionina iniciador por metionila aminopeptidase. Esta modificação ocorre primariamente como um processo cotranslational, embora miristoilação também possa ocorrer após a tradução após a clivagem proteolítica das proteínas, tipicamente, durante a apoptose. Duas isozimas das enzimas de mamíferos NMT foram clonadas e são designadas NMT1 e NMT2. NMTs desempenham um papel pro-sobrevivência em células. As duas NMTs estão presentes em todas as células normais.

[0008] Continua a haver uma necessidade de compostos, composição e método para o tratamento de câncer.

[0009] Este conhecimento de informação é fornecido com o propósito de tornar a informação conhecida acreditado pelo requerente para ser de possível relevância para a presente invenção. Nenhuma admissão é necessariamente pretendida, nem deve ser interpretada, que qualquer uma das informações anteriores constitui o estado da técnica contra a presente invenção.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] De acordo com um aspecto da presente invenção proporciona-se compostos e composições para o tratamento de um indivíduo com câncer. Existem também métodos fornecidos para a identificação de indivíduos com câncer que são adequados para o tratamento com os compostos, composição e métodos aqui descritos.

[0011] De acordo com um aspecto, proporciona-se um método de tratamento de um indivíduo tendo um câncer deficiente em NMT2, que compreende: a administração ao referido indivíduo um inibidor NMT.

[0012] Em um aspecto específico, o referido inibidor de NMT compreende um inibidor NMT1.

[0013] Em um aspecto específico, o referido inibidor NMT1 compreende uma molécula pequena, um anticorpo, um fragmento de peptídeo, um ácido nucleico, ou suas combinações.

[0014] Em um aspecto específico, a referida pequena molécula compreende Tris-DBA, HMA, ou DDD85646, DDD86481, ou um seu derivado.

[0015] Em um aspecto específico, o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.

[0016] Em um aspecto específico, o referido ácido nucleico compreende uma molécula de RNAdc, uma molécula de RNAi, uma molécula de miRNA, uma ribozima, uma molécula de shRNA, ou uma molécula de siRNA.

[0017] Em um aspecto específico, o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B- CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não-pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0018] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é um indivíduo humano.

[0019] De acordo com outro aspecto, é proporcionado um método para tratar um indivíduo com um câncer ou suspeito de ter um câncer, compreendendo: pedir um teste fornecendo os resultados de uma análise para determinar se uma amostra a partir do indivíduo expressa NMT2, e administração de um inibidor NMT1 para o indivíduo, se a amostra é deficiente em NMT2.

[0020] De acordo com outro aspecto, proporciona-se um método, que compreende: a obtenção de uma amostra de um indivíduo com um câncer ou suspeito de ter um câncer; processamento da referida amostra; realizando um ensaio de ligação que compreende o contacto da amostra com um anticorpo processado para NMT2 para formar um complexo entre o anticorpo e proteína NMT2 presente na amostra processada, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo; em que a administração de um inibidor NMTl ao referido indivíduo é indicado quando a quantidade de proteína NMT2 referida amostra é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle.

[0021] De acordo com outro aspecto, proporciona-se um método, que compreende: a obtenção de uma amostra de um indivíduo tendo um câncer ou suspeito de ter um câncer; processamento da referida amostra; realizando um ensaio de ligação que compreende o contato da amostra processada com um anticorpo para proteína NMT2 para formar um complexo entre o anticorpo e proteína NMT2 presente na amostra processada, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo; e administração de um inibidor NMTl ao referido indivíduo, quando a quantidade de NMT2 proteína na referida amostra é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle.

[0022] Em um aspecto específico, a referida análise para determinar se a referida amostra a partir do indivíduo expressa NMT2, compreende a realização de um ensaio de ligação que compreende o contato da amostra com um anticorpo processado para NMT2 para formar um complexo entre o anticorpo e NMT2 presente na amostra processada, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo.

[0023] Em um aspecto específico, o referido ensaio de ligação compreende triagem celular ativado por fluorescência, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima, imunohistoquímica quantitativa, transferência de energia de ressonância de fluorescência, transferência de energia de ressonância de Forster, biomolecular complementação de fluorescência, espectrometria de massa, ou ensaio de imunotransferência ou ensaio de coimmunoprecipitação.

[0024] Em um aspecto específico, instrumentos que tenham um detector regulado para detectar o complexo formado entre o referido anticorpo e o referido NMT2, em que a referida amostra é utilizada para determinar uma quantidade de complexo na referida amostra.

[0025] Em um aspecto específico, a referida instrumentação é um espectrofotômetro, espectrofluorômetro, dispositivo óptico ou dispositivo eletroquímico.

[0026] Em um aspecto específico, o referido câncer em que o referido câncer é linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não- pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0027] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é humano.

[0028] Em outro aspecto, é proporcionado um método, que compreende: a obtenção de uma amostra de um indivíduo tendo um câncer ou suspeito de ter um câncer; processamento da referida amostra; realizando um ensaio de ligação que compreende o contacto da amostra processada com um marcador detectável que se liga a Ácido nucleico NMT2 para formar um complexo entre a marcador detectável e Ácido nucleico NMT2 presente na amostra, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo; em que a administração de um inibidor NMT1 ao referido indivíduo é indicado quando a quantidade de ácido nucleico na referida amostra NMT2 é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle.

[0029] Em outro aspecto, é proporcionado um método, que compreende: a obtenção de uma amostra de um indivíduo tendo um câncer ou suspeito de ter um câncer; processamento da referida amostra; realizando um ensaio de ligação que compreende o contacto da amostra processada com um marcador detectável que se liga a Ácido nucleico NMT2 para formar um complexo entre a marcador detectável e Ácido nucleico NMT2 presente na amostra, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo; e administração de um inibidor NMT1 ao referido indivíduo, quando a quantidade de ácido nucleico na referida amostra NMT2 é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle.

[0030] Em um aspecto específico, a referida análise para determinar se a referida amostra a partir do indivíduo expressa NMT2, compreende a realização de um ensaio de ligação que compreende o contacto da amostra processada com um marcador detectável que se liga a Ácido nucleico NMT2 para formar um complexo entre o marcador detectável e Ácido nucleico NMT2 presente na amostra, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo.

[0031] Em um aspecto específico, o referido ensaio de ligação compreende um ensaio de hibridização usando sondas de DNA ou de RNA marcados de forma detectável.

[0032] Em um aspecto específico, o referido ensaio de hibridização é quantitativa ou semi-quantitativa.

[0033] Em um aspecto específico, o referido ensaio de hibridização é o RT-PCR, a hibridização in situ, ensaio de proteção de RNA ("APD"), cDNA microarray e oligonucleotídeo, análise de diferença representação ("RDA"), apresentação diferencial, análise da sequência do EST, análise em série da expressão genética ("SAGE"), e amplificação mediada por ligadura multiplex com Luminex FlexMAP ("LMF").

[0034] Em um aspecto específico, instrumentos que tenham um detector regulado para detectar o complexo entre a marcador detectável e Ácido nucleico NMT2 presente na amostra é utilizada para determinar uma quantidade de complexo na referida amostra.

[0035] Em um aspecto específico, a referida instrumentação é um espectrofotômetro, espectrofluorômetro, dispositivo óptico, ou dispositivo electroquímico.

[0036] Em um aspecto específico, o referido câncer em que o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não- pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0037] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é um humano.

[0038] Em outro aspecto, é proporcionado um método, que compreende: a obtenção de uma amostra de um indivíduo tendo um câncer ou suspeito de ter um câncer; processamento da referida amostra; realizando um ensaio de ligação que compreende o contacto da amostra processada com um anticorpo ao qual se liga a proteína com ácido mirístico, ou marcado com azido-biotina com proteínas com ácido mirístico, dentro da amostra de modo a formar um complexo entre a marcador detectável e proteína com ácido mirístico presente na amostra, o referido ensaio de ligação geradora de pelo menos um perfil de miristoilação indicativa do referido complexo; em que a administração de um inibidor NMTl ao referido indivíduo é indicada quando o referido perfil de miristoilação indica que o referido câncer é deficiente em NMT2, opcionalmente, em comparação com um controle.

[0039] Em outro aspecto, é proporcionado um método, que compreende: a obtenção de uma amostra de um indivíduo tendo um câncer ou suspeito de ter um câncer; processamento da referida amostra; realizando um ensaio de ligação que compreende o contacto da amostra processada com um anticorpo ao qual se liga a proteína com ácido mirístico, ou azido- biotina marcado com proteínas com ácido mirístico, dentro da amostra de modo a formar um complexo entre a marcador detectável e proteína com ácido mirístico presente na amostra, o referido ensaio de ligação geradora de pelo menos um perfil de miristoilação indicativa do referido complexo; e administração de um inibidor NMTl ao referido indivíduo é, quando o referido perfil miristoilação indica que o referido câncer é deficiente em NMT2, opcionalmente, em comparação com um controle

[0040] Em um aspecto específico, o dito processamento compreende o tratamento da referida amostra com alquilnil- miristato e destiobiotina biotina azido-PEG.

[0041] Em um aspecto específico, o referido ensaio de ligação compreende triagem celular ativado por fluorescência, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima, imunohistoquímica quantitativa, transferência de energia de ressonância de fluorescência, transferência de energia de ressonância de Forster, complementação biomolecular de fluorescência, espectrometria de massa ou ensaio de imunotransferência ou ensaio de coimunoprecipitação.

[0042] Em um aspecto específico, instrumentos que tenham um detector regulado para detectar o complexo formado entre o referido anticorpo e o referido NMT2 em que a referida amostra é utilizada para determinar uma quantidade de complexo na referida amostra.

[0043] Em um aspecto específico, a referida instrumentação é um espectrofotômetro, espectrofluorômetro, dispositivo óptico, ou dispositivo eletroquímico.

[0044] Em um aspecto específico, o referido câncer em que o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não- pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0045] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é humano.

[0046] Em outro aspecto, é proporcionado um uso de um inibidor NMT para o tratamento de um indivíduo tendo um câncer deficiente em NMT2.

[0047] Em um aspecto específico, o referido inibidor de NMT compreende um inibidor NMT1.

[0048] Em um aspecto específico, o referido inibidor NMT1 compreende uma molécula pequena, um anticorpo, um fragmento de peptídeo, um ácido nucleico, ou suas combinações.

[0049] Em um aspecto específico, a referida pequena molécula compreende Tris-DBA, AHM, ou DDD85646, DDD86481, ou um seu derivado.

[0050] Em um aspecto específico, a referida pequena molécula compreende DDD86481.

[0051] Em um aspecto específico, o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.

[0052] Em um aspecto específico, o referido ácido nucleico compreende uma molécula de RNAdc, uma molécula de RNAi, uma molécula de miRNA, uma ribozima, uma molécula de shRNA, ou uma molécula de siRNA.

[0053] Em um aspecto específico, o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B- CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não-pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0054] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é um indivíduo humano.

[0055] Em outro aspecto, é proporcionada a utilização de um inibidor NMT1 para tratar um indivíduo com um câncer, ou suspeito de ter um câncer, em que o referido inibidor é indicativo NMT1 de utilização quando a quantidade de proteína em uma amostra NMT2 de referido indivíduo é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle, em que um ensaio de ligação que compreende o contacto de uma amostra processada a partir do referido indivíduo com um anticorpo para NMT2 para formar um complexo entre o anticorpo e proteína NMT2 presente na amostra processada gera pelo menos um resultado do ensaio indicativo do referido complexo; em que o referido resultado do doseamento é indicativo de que a referida quantidade de proteína NMT2 na referida amostra.

[0056] Em um aspecto específico, referido análise para determinar se a referida amostra a partir do indivíduo expressa NMT2, compreende a realização de um ensaio de ligação que compreende o contacto da amostra com um anticorpo processado para NMT2 para formar um complexo entre o anticorpo e NMT2 presente na amostra processada, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo.

[0057] Em um aspecto específico, o referido ensaio de ligação compreende triagem celular ativado por fluorescência, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima, imunohistoquímica quantitativa, transferência de energia de ressonância de fluorescência, transferência de energia de ressonância de Forster, biomolecular complementação de fluorescência, espectrometria de massa, ou ensaio de imunotransferência ou ensaio de coimunoprecipitação.

[0058] Em um aspecto específico, instrumentos que tenham um detector regulado para detectar o complexo formado entre o referido anticorpo e o referido NMT2, em que a referida amostra é utilizada para determinar uma quantidade de complexo na referida amostra.

[0059] Em um aspecto específico, a referida instrumentação é um espectrofotômetro, espectrofluorômetro, dispositivo óptico, ou dispositivo eletroquímico.

[0060] Em um aspecto específico, referido em que o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não-pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0061] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é humano.

[0062] Em outro aspecto, é proporcionada a utilização de um inibidor NMTl para tratar um indivíduo com um câncer, ou suspeito de ter um câncer, em que o referido inibidor é indicada NMTl de utilização quando a quantidade de ácido nucleico em uma amostra NMT2 a partir do referido indivíduo é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle, em que um ensaio de ligação que compreende o contacto de uma amostra processada a partir do referido indivíduo com um marcador detectável que se liga a Ácido nucleico NMT2 para formar um complexo entre a marcação detectável e ácido nucleico em NMT2 a referida amostra, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo.

[0063] Em um aspecto específico, a referido análise para determinar se a referida amostra a partir do indivíduo expressa NMT2, compreende a realização de um ensaio de ligação que compreende o contato da amostra processada com um marcador detectável que se liga a Ácido nucleico NMT2 para formar um complexo entre a marcador detectável e Ácido nucleico NMT2 presente na amostra, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo.

[0064] Em um aspecto específico, o referido ensaio de ligação compreende, de um ensaio de hibridização usando sondas de DNA ou de RNA marcados de forma detectável.

[0065] Em um aspecto específico, o referido ensaio de hibridização é quantitativa ou semiquantitativa.

[0066] Em um aspecto específico, o referido ensaio de hibridização é o RT-PCR, a hibridização in situ, ensaio de proteção de RNA ("APD"), cDNA microarray e oligonucleotídeo, análise de diferença representação ("RDA"), apresentação diferencial, análise da sequência do EST, análise em série da expressão genética ("SAGE"), e amplificação mediada por ligadura multiplex com Luminex FlexMAP ("LMF").

[0067] Em um aspecto específico, instrumentos que tenham um detector regulado para detectar o complexo entre a marcador detectável e Ácido nucleico NMT2 presente na amostra é utilizada para determinar uma quantidade de complexo na referida amostra.

[0068] Em um aspecto específico, referido instrumentação é um espectrofotómetro, espectrofluorómetro, dispositivo óptico, ou dispositivo electroquímico.

[0069] Em um aspecto específico, o referido câncer em que o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não- pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0070] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é um humano.

[0071] Em um aspecto, proporciona-se uma utilização de um inibidor NMTl para tratar um indivíduo com um câncer, ou suspeito de ter um câncer, em que a referida utilização do referido inibidor NMTl é indicado quando um perfil de miristoilação de uma amostra do referido indivíduo indica o referido câncer é deficiente em NMT2, opcionalmente, em comparação com um controle, em que a realização de um ensaio de ligação que compreende o contato de uma amostra processada com um anticorpo que se liga a proteína com ácido mirístico, ou azido-biotina marcado com proteínas com ácido mirístico, dentro da amostra de modo a formar um complexo entre o marcador detectável e proteína com ácido mirístico presente na amostra, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um perfil de miristoilação do referido complexo indicativo

[0072] Em um aspecto específico, o dito processamento compreende o tratamento da referida amostra com aliquinil- miristato e destiobiotina azido-PEG biotina.

[0073] Em um aspecto específico, o referido ensaio de ligação compreende triagem celular activado por fluorescência, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima, imuno- histoquímica quantitativa, transferência de energia de ressonância de fluorescência, transferência de energia de ressonância de Forster, biomolecular complementação de fluorescência, espectrometria de massa, ou ensaio de imunotransferência e ensaios de coimunoprecipitação.

[0074] Em um aspecto específico, instrumentos que tenham um detector regulado para detectar o complexo formado entre o referido anticorpo e o referido NMT2 em que a referida amostra é utilizada para determinar uma quantidade de complexo na referida amostra.

[0075] Em um aspecto específico, a referida instrumentação é um espectrofotômetro, espectrofluorômetro, dispositivo óptico, ou dispositivo eletroquímico.

[0076] Em um aspecto específico, o referido câncer em que o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não- pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0077] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é humano.

[0078] Em outro aspecto, é proporcionado um método para identificar um indivíduo adequado para tratamento com um inibidor NMT1, compreendendo: a obtenção de uma amostra do referido indivíduo com um câncer ou suspeito de ter um câncer; processamento da referida amostra; realização de um ensaio de ligação que compreende o contato da amostra com um anticorpo processado para NMT2 para formar um complexo entre o anticorpo e proteína NMT2 presente na amostra processada, a referida ligação de geração de ensaio, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo; em que o tratamento com o referido inibidor NMT1 é indicado quando a quantidade de proteína NMT2 referida amostra é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle.

[0079] Em um aspecto específico, a referida análise para determinar se a referida amostra a partir do indivíduo expressa NMT2, compreende a realização de um ensaio de ligação que compreende o contato da amostra com um anticorpo processado para NMT2 para formar um complexo entre o anticorpo e NMT2 presente na amostra processada, o referido ensaio de ligação gerando, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo.

[0080] Em um aspecto específico, o referido ensaio de ligação compreende triagem celular ativada por fluorescência, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima, imunohistoquímica quantitativa, transferência de energia de ressonância de fluorescência, transferência de energia de ressonância de Forster, complementação biomolecular de fluorescência, espectrometria de massa, ou ensaio de imunotransferência ou ensaios de coimunoprecipitação.

[0081] Em um aspecto específico, instrumentos que tenham um detector regulado para detectar o complexo formado entre o referido anticorpo e o referido NMT2 na referida amostra é utilizada para determinar uma quantidade de complexo na referida amostra.

[0082] Em um aspecto específico, a referida instrumentação é um espectrofotômetro, espectrofluorômetro, dispositivo ótico ou dispositivo eletroquímico.

[0083] Em um aspecto específico, o referido câncer é o o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B- CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não-pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0084] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é humano.

[0085] Em outro aspecto, é proporcionado um método para identificar um indivíduo adequado para tratamento com um inibidor NMT1, compreendendo: a obtenção de uma amostra de um indivíduo tendo um câncer ou suspeito de ter um câncer; processamento da referida amostra; realização de um ensaio de ligação que compreende o contato da amostra processada com um marcador detectável que se liga a Ácido nucleico NMT2 para formar um complexo entre o marcador detectável e Ácido nucleico NMT2 presente na amostra, o referido ensaio de ligação gerando, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo; em que a administração de um inibidor NMT1 ao referido indivíduo é indicado quando a quantidade de ácido nucleico na referida amostra NMT2 é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle.

[0086] Em um aspecto específico, a referido análise para determinar se a referida amostra a partir do indivíduo expressa NMT2, compreende a realização de um ensaio de ligação que compreende o contato da amostra processada com um marcador detectável que se liga a ácido nucleico NMT2 para formar um complexo entre o marcador detectável e o ácido nucleico NMT2 presente na amostra, o referido ensaio de ligação gerando, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo.

[0087] Em um aspecto específico, o referido ensaio de ligação compreende um ensaio de hibridização usando sondas de DNA ou de RNA marcadas de forma detectável.

[0088] Em um aspecto específico, o referido ensaio de hibridização é quantitativo ou semi-quantitativo.

[0089] Em um aspecto específico, o referido ensaio de hibridização é o RT-PCR, a hibridização in situ, ensaio de proteção de RNA ("APD"), cDNA microarray e oligonucleotídeo, análise de diferença de representação ("RDA"), apresentação diferencial, análise da sequência EST, análise em série da expressão genética ("SAGE"), e amplificação mediada por ligação multiplex com Luminex FlexMAP ("LMF").

[0090] Em um aspecto específico, em que a instrumentação tendo um detector regulado para detectar o complexo entre o marcador detectável e ácido nucleico NMT2 presente na amostra é utilizada para determinar uma quantidade de complexo na referida amostra.

[0091] Em um aspecto específico, em que a referida instrumentação é um espectrofotômetro, espectrofluorômetro, dispositivo ótic, ou dispositivo eletroquímico.

[0092] Em um aspecto específico, o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B- CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não-pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[0093] Em um aspecto específico, o referido indivíduo é um humano.

[0094] Em outro aspecto, é proporcionado um método para identificar um indivíduo adequado para tratamento com um inibidor NMT1, compreendendo: a obtenção de uma amostra de um indivíduo tendo um câncer ou suspeito de ter um câncer; processamento da referida amostra; realização de um ensaio de ligação que compreende o contato da amostra processada com um anticorpo ao qual se liga a proteína com ácido mirístico, ou azido-biotina marcada com proteínas com ácido mirístico, dentro da amostra, de modo a formar um complexo entre a marcador detectável e proteína com ácido mirístico presente na amostra, o referido ensaio de ligação gerando de pelo menos um perfil de miristoilação indicativo do referido complexo; em que a administração de um inibidor NMT1 ao referido indivíduo é indicado quando o referido perfil de miristoilação indica que o referido câncer é deficiente em NMT2, opcionalmente, em comparação com um controle.

[0095] Em um aspecto específico, o dito processamento compreende o tratamento da referida amostra com aliquinil- miristato e destiobiotina azido-PEG biotina.

[0096] Em um aspecto específico, o referido ensaio de ligação compreende triagem celular ativado por fluorescência, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima, imunohistoquímica quantitativa, transferência de energia de ressonância de fluorescência, transferência de energia de ressonância de Forster, biomolecular complementação de fluorescência, espectrometria de massa, ou ensaio de imunotransferência ou ensaio de coimunoprecipitação.

[0097] Em um aspecto específico, instrumentos que tenham um detector regulado para detectar o complexo formado entre o referido anticorpo e o referido NMT2 na referida amostra é utilizada para determinar uma quantidade de complexo na referida amostra.

[0098] Em um aspecto específico, a referida instrumentação é um espectrofotômetro, espectrofluorômetro, dispositivo ótico, ou dispositivo eletroquímico.

[0099] Em um aspecto específico, o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B- CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica de fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma intestinal, Carcinoma celular do pulmão pequeno, Carcinoma celular escamoso esofágico, Osso, Carcinoma duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não-pequenas células lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[00100] Em um aspecto específico, em que o referido indivíduo é um ser humano.

[00101] Em outro aspecto, é proporcionado um kit para identificar um indivíduo adequado para tratamento com um inibidor NMT1, compreendendo: um anticorpo para NMT2; instruções para identificar o dito indivíduo de acordo com método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 68-74.

[00102] Em um aspecto específico, o kit compreende ainda um controle.

[00103] Em outro aspecto, é proporcionado um kit para identificar um indivíduo adequado para tratamento com um inibidor NMT1, compreendendo: um ácido nucleico para ligação a NMT2; instruções para identificar o dito indivíduo de acordo com método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 75 - 83.

[00104] Em um aspecto específico, o kit compreende ainda um controle.

[00105] O kit da reivindicação 93, em que o referido ácido nucleico é RNA ou DNA.

[00106] Em outro aspecto, é proporcionado um kit para identificar um indivíduo adequado para tratamento com um inibidor NMT1, compreendendo: NeutrAvidinTM-HRP; e instruções para identificação do referido indivíduo de acordo com qualquer uma das reivindicações 84 - 90.

[00107] Em um aspecto específico, o kit compreende ainda um controle.

[00108] Em um aspecto específico, o kit compreende ainda aliqunil-miristato ou destiobiotina azido-PEG biotina. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00109] As concretizações da presente invenção serão agora descritas, a título de exemplo apenas, com referência às figuras anexas, em que:

[00110] A Figura 1 representa a análise de imunotransferência da expressão de NMT1 e NMT2 em um tipo de células B normais (L0) e vários linfomas de células B e leucemias de células T;

[00111] A figura 2 é um gráfico que ilustra a sensibilidade de diversas células normais e vários linfomas de células B e leucemias de células T para os inibidores NMT de tris-dibenzilideneacetona-dipaládio (Tris-DB A);

[00112] A figura 3 é um gráfico de barras que ilustra a inibição de N-miristoyltransferase(NMT) por tris- dibenzilidenoacetona-dipaládio (Tris-DBA); e

[00113] A Figura 4 são immunoblotts retratando linhagens de células de linfoma sondadas com anticorpos contra NMT1 e NMT2.

[00114] A Figura 5 é um gráfico de linhagens que mostra a sensibilidade de inibidores NMT na linhagem celular de linfoma de Burkitt em comparação com uma linha celular linfóide B normal imortalizada;

[00115] A Figura 6 representa os resultados da transfecção de células de linfoma B Ramos com pcDNA3.1-V5- NMT2 mostrando o aumento da sobrevida para TrisDBA (5 ug / ml) em 2,5 vezes versus as células de controle transfectadas com o plasmídeo vector vazio (Painel A) de células mostrando viabilidade, e (Painel B) um immunoblott;

[00116] A Figura 7 representa as diferenças nos níveis de proteína NMT2 presentes em várias linhaGENS de células linfocíticas e tumores de linfoma de sólidos;

[00117] As Figuras 8 A e B descrevem as diferenças nos níveis de proteína NMT2 presentes em vários tumores de linfoma sólido analisados por imunohistoquímica: coloração de imunohistoquímica NMT dos gânglios linfáticos normais, linfoma de Burkitt (BL) e linfoma difuso de grandes células B (LDGCB), no painel C, o log2 (intensidade de fluorescência NMT micro-matriz) para NMTl e NMT2 é traçada para todas as linhagens de células de banco de dados LECC, no Painel D o log2 (intensidade de fluorescência NMT micro-matriz) para NMTl e NMT2 é traçada para 100 linhagens de células de banco de dados LECC com o menor nível de expressão NMT2, (painel E), a expressão de NMT2 de linfoma de Burkitt, célula grande difuso B e linfoma folicular foi analisada por imuno- histoquímica e a coloração da peroxidase foi quantificado usando o Imagem linfa J. normal conteúdo em nó é NMT2 0,392 +/- 0,3 (unidade relativa, dados não mostrados);

[00118] A Figura 9 apresenta viabilidade residual de várias linhagens de células linfocíticas B tratados com DDD85646 (painel A), DDD86481 (Painel B), e DDD73226 (Painel C), durante 72 horas, Painel D mostra a confirmação da inibição de miristoilação por DDD86481 nos linfocitos IM9 (i) e BL2 (ii), Painel E mostra a dose mínima de DDD86481 necessária para inibir em miristoilação IM-9, Ramos e BL2 linhagens celulares;

[00119] A Figura 10 (painel A) mostra a sensibilidade de L0 vários linfócitos B normais imortalizadas, células de linfoma B malignas (Ramos e BL2), e, leucemia das células T (CEM) para o NMT inibidor TrisDBA durante 24 horas, (Painel B) descreve a transfecção de células de linfoma B Ramos com pcDNA3.1-V5-NMT2 aumentou a sobrevivência TrisDBA (5 µg / ml) em 2,5 vezes versus as células de controle transfectadas com vector vazio plasmídeo.

[00120] A Figura 11 ilustra os níveis de expressão NMT na coleção de linhagens de células de câncer (967 LECC) de banco de dados (painel A), expressão NMT2 no seleto câncer usando uma caixa (painel B), as linhagens de células 50 LECC com a menor expressão NMT2 são listadas e classificadas por tipo de câncer;

[00121] A Figura 12 mostra que NMTs são clivadas durante a apoptose, mas permanecem ativas;

[00122] A Figura 13 representa a purificação de hNMTl e hNMT2 GST- e His6-tag recombinantes;

[00123] A Figura 14 mostra a comparação de atividades enzimáticas entre His6-NMT1 purificada recombinante e "capsídeo-truncado" ct-His6-NMT1 recombinante de comprimento total;

[00124] A Figura 15 descreve a comparação da EC50 e IC50 de vários inibidores NMT e diferentes linhagens celulares;

[00125] A Figura 16 mostra a indução de apoptose DDD86481;

[00126] A Figura 17 representa (Painel A) uma imunotransferência com as linhagens de células linfóides indicadas sondadas para a presença de NMT2, e (Painel B), o nível de expressão de mRNA NMT2 mostrado como log2 (intensidade de fluorescência micro-matriz) para as linhagens celulares NMT2 indicadas dos dados LECC;

[00127] A Figura 18 representa a utilização de uma sonda destiobiotina-PEG-azida para grupo de proteínas- miristoiladas-alcinilo w pós-tradução em células T de Jurkat de leucemia, utilizando esferas de estreptavidina-sefarose;

[00128] A Figura 19 representa uso escalado-up de uma sonda destiobiotina-PEG-azida para puxar para baixo após a tradução co-miristoilada-alcinilo proteínas em células T Jurkat leucêmicas usando esferas de estreptavidina-magnético;

[00129] A Figura 20 mostra os perfis miristoilação de células "normais" imortalizadas B (IM9) e células BL (BL2 e Ramos) marcadas com alcinil- miristato;

[00130] A Figura 21 ilustram tempo e dose de gráficos de citotoxicidade dependente da combinação de DDD 86.481 e doxorubixina;

[00131] A Figura 22 representa imunotransferência realizada com células incubadas com DMSO, Estaurosporina, a FAS, ou veículo sozinho;

[00132] A Figura 23 ilustra que a referida caspase truncado NMT2 é 3 - 4 vezes mais ativo do que o NMT2 de comprimento completo;

[00133] A Figura 24 ilustra immunoblotts de células B "normais" (IM9) e células malignas BL (Ramos, BL2) tratadas com 1 µM de SAHA (classe HDAC inibidor Ml) por 24 h;

[00134] A Figura 25 ilustra que os níveis de proteína NMT2 são reduzidos em várias linhagens celulares BL;

[00135] A Figura 26 representa a degradação proteossomal que não é a causa da destruição das células em NMT2 BL;

[00136] A Figura 27 representa NMTl é clivada pela caspase-8, mas não NMT2;

[00136] A Figura 28 representa tanto NMT1 quanto NMT2 que foram clivados pelo caspase-3;

[00137] A Figura 29 mostra os locais de clivagem de caspase de NMT1 e NMT2 conforme identificado por degradação de Edman mostrado em negrito e caixa de lisina carregada positivamente (K) é destacada nas sequências de aminoácidos NMT1 e NMT2 (aminoácidos 1 - 80);

[00138] A figura 30 representa a confirmação dos locais de clivagem NMT por mutagênese dirigida ao local;

[00139] A Figura 31 mostra os locais de clivagem caspase de NMT1 e NMT2 conforme identificado por degradação Edman mostrado em negrito e caixa de lisina carregada positivamente (K) é destacada nas sequências de aminoácidos NMT1 e NMT2 (aminoácidos 1 - 80);

[00140] A Figura 32 ilustra alterações aos níveis NMT conforme as células sofreram apoptose;

[00141] A Figura 33 representa a atividade NMT inicial nos lisados de células COS 7 transfectadas de forma transiente;

[00142] A Figura 34 representa a atividade NMT inicial nos lisados de células COS 7 transfectadas de forma transiente.

[00143] A Figura 35 representa a atividade NMT em células COS7 que expressam transitoriamente V5- NMT1 e V5- NMT2 incubadas com estaurosporina (2,5 µM) e ciclo-heximida (5 µg / mL);

[00144] A Figura 36 ilustra a purificação de hexahistidina recombinante (His) marcada de comprimento total e hNMTl clivada pela caspase;

[00145] A Figura 37 ilustra a purificação de hexahistidina recombinante (His) marcada de comprimento total e hNMT2 clivada pela caspase;

[00146] A Figura 38 ilustra a atividade NMT de comprimento total purificado e hexahistidina clivada pela caspase (Suas) -NMTs testada usando um ensaio de peptídeo miristoilação;

[00147] A Figura 39 representa o fracionamento subcelular de NMTs endógenas em Células HeLa durante a apoptose;

[00148] A Figura 40 ilustra a quantificação da quantidade de NMT em diferentes frações após o fracionamento subcelular de NMTs endógenos em células HeLa durante a apoptose; e

[00149] A Figura 41 mostra o fracionamento sub-celular de células HeLa em apoptose marcado com alquinila-miristato; e

[00150] A Figura 42 ilustra o efeito do ácido 2- hidroximirístico (HMA) sobre a indução de apoptose. As células T de Jurkat foram tratadas com ou sem HMA (1 mM) e a apoptose foi induzida com anti-Fas (150 ng / ml) e ciclo- heximida (5 µg / ml).

[00151] Na descrição detalhada que se segue, os números em negrito servem para identificar os componentes que são descritos e referidos em relação aos desenhos que descrevem várias concretizações da invenção. Deve ser notado que na descrição de várias concretizações da presente invenção, os mesmos números de referência foram utilizados para identificar os mesmos elementos semelhantes. Além disso, por uma questão de simplicidade, algumas partes das figuras foram omitidas nos desenhos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00152] Conforme será descrito em mais detalhes a seguir, aqui é descrito compostos, composição e métodos para o tratamento de um indivíduo com câncer. Há também descrição aqui de métodos para a identificação de indivíduos com câncer que são adequados para o tratamento com os compostos, composição e métodos aqui descritos. Há também descrições aqui de métodos para identificar indivíduos com câncer.

[00153] O presente pedido proporciona métodos e composições para o tratamento de cânceres deficientes em NMT em um indivíduo. Cânceres deficiente em NMT incluem cânceres deficientes em NMT2 ou NMT1. Em um exemplo específico, o câncer deficiente NMT é um câncer deficiente NMT2.

[00154] O termo "câncer", tal como aqui utilizado, se refere a uma variedade de condições causadas pelo crescimento anormal e descontrolado de células. As células capazes de causar câncer, chamados de "células cancerosas", possuem propriedades características, como a proliferação descontrolada, imortalidade potencial metastática, o rápido crescimento e a taxa de proliferação e / ou certas características morfológicas típicas. As células cancerosas podem ser na forma de um tumor, mas estas células podem também existir apenas dentro de um indivíduo, ou pode ser uma célula de câncer não tumorigênica. Um câncer pode ser detectado em qualquer um de uma série de maneiras, incluindo, mas não se limitando a, detecção da presença de um tumor ou tumores (por exemplo, por meio clínico ou radiológico), examinando as células dentro de um tumor ou de uma outra amostra biológica (por exemplo, a partir de uma biopsia de tecido), medição de marcadores de sangue indicativos de câncer e a detecção de um genótipo indicativo de um câncer. No entanto, um resultado negativo em um ou mais dos métodos de detecção acima não indica necessariamente a ausência de câncer, por exemplo, um paciente que exibiu uma resposta completa a um tratamento contra o câncer pode ainda ter um câncer, tal como evidenciado por uma subsequente reincidência.

[00155] Em um exemplo específico da presente divulgação, o câncer é o linfoma.

[00156] O termo "linfoma" como aqui utilizado se refere a um crescimento maligno de células B ou T no sistema linfático. "O linfoma" inclui vários tipos de tumores malignos, incluindo o linfoma de Hodgkin e linfoma não- Hodgkin. O termo " linfoma não-Hodgkin", tal como aqui utilizado, se refere a um crescimento maligno de células B ou T no sistema linfático, que não é um linfoma de Hodgkin (que se caracteriza, por exemplo, pela presença de células de Reed-Sternberg na área cancerosa). Os linfomas não-Hodgkin englobam mais de 29 tipos de linfomas, as distinções entre os quais são baseados no tipo de células cancerosas.

[00157] Em um exemplo mais específico da presente divulgação, o câncer é um linfoma-B.

[00158] Deste modo, em uma concretização, os compostos, composições e métodos da divulgação são adequados para o tratamento de um indivíduo com linfoma de células B.

[00159] Os exemplos de linfomas de células B incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, o linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma de Waldenstrom, e linfoma de células B monocitóides/ tipo MALT. Também contemplados são o tratamento de linfomas pediátricos, tais como linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, um precursor de B-LBL, precursor LLB-T, e o linfoma anaplásico de grandes células.

[00160] Em outra concretização, o câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma / de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia Mielóide Crônica fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma Intestinal, Carcinoma adenoescamoso misto do pulmão, Carcinoma pulmonar de pequenas células, pulmão, Carcinoma de células escamosas Esófago, Osso, Carcinoma do duto da mama, Adenocarcinoma difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariana, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não- pequenas das células de lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma do endométrio ou carcinoma escamoso esofágico.

[00161] O termo "indivíduo", tal como aqui utilizado, se refere a um animal, e pode incluir, por exemplo, animais domésticos, tais como gatos, cães, etc., animais de fazenda (por exemplo, gado, cavalos, porcos, ovelhas, cabras , etc.), animais de laboratório (por exemplo, camundongo, coelho, rato, porquinho da índia, etc.), mamíferos, mamíferos não humanos, primatas, primatas não-humanos, roedores, aves, répteis, anfíbios, peixes, e qualquer outro animal. Em um exemplo específico, o indivíduo é um ser humano.

[00162] O termo "tratamento" ou "tratar", tal como aqui utilizado, se refere a obtenção de resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, mas não estão limitados a, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas ou condições, diminuição da extensão da doença, estabilização (ou seja, sem piora), estado de doença, prevenção da disseminação da doença, atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença, diminuição da recorrência da doença, e remissão (quer parcial ou total), quer seja detectável ou não detectável. "Tratar" e "tratamento" também pode significar prolongar a sobrevivência, em comparação com a sobrevivência esperada se não receber o tratamento. "Tratar" e "tratamento", tal como aqui utilizado também inclui tratamento profilático. Por exemplo, um indivíduo com câncer mais cedo, por exemplo, um linfoma de fase inicial, pode ser tratado para prevenir a progressão ou, alternativamente, um indivíduo em remissão pode ser tratado com um composto ou uma composição aqui descrita para evitar a recorrência.

[00163] É aqui mostrado que as células de linfoma de células B expressam NMT1, mas não NMT2. Isto está em contraste com as células de leucemia e outras testados que exprimem tanto NMT1 e NMT2. (Como mostrado nas Figuras 1 e 4).

[00164] É ainda aqui mostrado que as células do linfoma B são sensíveis à inibição da viabilidade celular por inibidores NMT.

[00165] Em um exemplo, o inibidor é NMT tris- dibenzilidenoacetona-dipaládio (Tris-DBA) (Figura 2).

[00166] Em outros exemplos, o inibidor NMT é 2- hidroximiristae (HMA), o qual é usado para inibir células de linfoma B.

[00167] Ainda em outro exemplo, o inibidor sulfonamida pirazol de T. Brucie NMT [JAFrearson et ai (2010) Nature. 464,728-723)] (DDD85646) é usado para inibir células de linfoma B. (Figura 5).

[00168] Em outro exemplo, o inibidor é DDD86481.

[00169] Em um exemplo específico, o tratamento de um indivíduo com linfoma B compreende a administração do referido indivíduo com um inibidor NMT.

[00170] Os compostos inibidores de NMT ou derivados podem ser utilizados na presente invenção para o tratamento de câncer deficiente NMT2.

[00171] O termo "deficiente", tal como aqui utilizado se refere, de um modo geral, a inibição, redução ou eliminação de (em comparação com amostras de controle ou do tipo selvagem), por exemplo, síntese NMT, níveis, a atividade ou função, bem como a inibição da indução ou estimulação da síntese, os níveis, a atividade ou a função da proteína de NMT (por exemplo, NMT 1 ou NMT2). O termo também se refere a qualquer metabólico ou via regulatória, que possa regular a síntese, os níveis, atividade ou função de NMT. O termo inclui também a inibição, redução ou eliminação resultantes da forma de ligação com outras moléculas e a formação do complexo. Portanto, o termo "deficiente em NMT " se refere ao que resulta na inibição, redução, ou eliminação da função da proteína ou função da via da proteína. Contudo, o termo não implica que cada uma destas funções deva ser inibida ao mesmo tempo.

[00172] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como sendo deficientes em NMT por determinação da presença de uma mutação em um gene NMT. Tais métodos de detecção de ácido nucleico e amplificação são bem conhecidos do técnico versado no assunto.

[00173] Por exemplo, o ácido nucleico a ser amplificado pode ser a partir de uma amostra biológica. Vários métodos de extração (tais como, fenol e clorofórmio) são adequados para isolar o DNA ou RNA. O ácido nucleico extraído a partir de uma amostra pode ser amplificado utilizando técnicas de amplificação de ácido nucleico bem conhecidas no estado da técnica. Os exemplos não limitantes incluem a reação em cadeia (PCR), reação em cadeia com polimerase transcriptase reversa (RT-PCR), PCR aninhada, a reação em cadeia da ligase, repórteres de RNA amplificáveis, replicação Q-beta, amplificação baseada na transcrição, a amplificação de DNA boomerang, ativação por deslocamento de cadeia, tecnologia de sondas de ciclismo, a amplificação de sequência de ácido nucleico baseada isotérmica (NASBA), ou outros ensaios de replicação de sequência ou ensaios de amplificação de sinal também pode ser usado.

[00174] Os métodos de amplificação são bem conhecidos no estado da técnica. Alguns métodos empregam transcrição reversa de RNA em DNAc.

[00175] Em um exemplo, a PCR é utilizada para amplificar uma sequência alvo de interesse, por exemplo, uma sequência NMT2.

[00176] Os ácidos nucleicos podem ser amplificados antes da detecção ou pode ser diretamente detectado durante uma etapa de amplificação, por exemplo, métodos de "tempo real". Em algumas concretizações, a sequência alvo é amplificada utilizando um iniciador marcado, de modo a que o fragmento amplificado resultante seja marcado de forma detectável. Em algumas concretizações, o iniciador é marcado fluorescentemente. Em algumas concretizações, a sequência alvo é amplificada e o fragmento amplificado resultante é detectado por eletroforese.

[00177] O nível de expressão do gene pode ser determinado através da avaliação da quantidade de RNAm NMT2 em uma amostra. Métodos de medição do mRNA em amostras são conhecidos no estado da técnica. Para medir os níveis de RNAm, as células nas amostras podem ser submetidas a lise e os níveis de RNAm nos lisados ou em RNA purificado ou semi- purificado a partir de lisados pode ser medida por qualquer variedade de métodos familiares dos técnicos versados no assunto. Tais métodos incluem, sem limitação, os ensaios de hibridização usando sondas de DNA ou de RNA marcados de forma detectável, por exemplo, Northern blot, ou metodologias quantitativos ou semi-quantitativos de RT-PCR utilizando iniciadores oligonucleotidicos apropriados. Alternativamente, ensaios de hibridização quantitativa ou semi-quantitativa em in situ podem ser realizados utilizando, por exemplo, seções de tecido, suspensões celulares, ou não lisadas, e marcado de forma detectável, por exemplo, fluorescente, ou, sondas de DNA ou RNA marcados com enzimas. Métodos adicionais para quantificar mRNA incluem ensaio de proteção RNA ("RPA"), de cDNA e de oligonucleotídeos microarrays, a análise diferença representação ("RDA"), exibição diferencial, análise de sequências EST, análise serial da expressão gênica ("SAGE"), e ligadura multiplex amplificação mediada com Luminex FlexMAP ("LMF").

[00178] A amplificação também pode ser controlada por meio de métodos "em tempo real". PCR em Tempo Real permite a detecção e a quantificação de um ácido nucleico alvo. Normalmente, esta abordagem de PCR quantitativo utiliza um corante fluorescente, que pode ser um corante específico para cadeia dupla, tal como SYBR Green.RTM. I. Alternativamente, outros corantes fluorescentes, por exemplo, FAM ou HEX, pode ser conjugado com uma sonda de oligonucleótido ou um primer. Vários instrumentos capazes de realizar um PCR em tempo real são conhecidos no estado da técnica. O sinal fluorescente gerado em cada ciclo de PCR é proporcional à quantidade de produto de PCR. Um gráfico da fluorescência em função do número do ciclo é usado para descrever a cinética de amplificação e um nível de limiar de fluorescência é usado para definir um número de ciclo fraccionada relacionada com a concentração de molde inicial. Quando é realizada a amplificação e detecção de um instrumento capaz de ler a fluorescência durante os ciclos térmicos, o produto pretendido por PCR a partir de produtos PCR não específicos pode ser diferenciado por meio de análise de fusão. Através da medição da alteração na fluorescência ao aumentar gradualmente a temperatura da reação para subsequente amplificação e geração de sinal, pode ser possível determinar a (Act) do produto pretendido (s), bem como a do produto não específica.

[00179] Os métodos podem incluir amplificar múltiplos ácidos nucleicos na amostra, também conhecidas como "detecção multiplex" ou "multiplexação". Tal como aqui utilizado, o termo "PCR multiplex" se refere a PCR, a qual envolve a adição de mais do que um conjunto de iniciadores de PCR para a reação, a fim de detectar e quantificar vários ácidos nucleicos, incluindo ácidos nucleicos a partir de um ou mais marcadores de genes-alvo. Além disso, a multiplexação com um controle interno, por exemplo, 18s rRNA, GADPH, ou beta- actina) fornece um controle para a PCR, sem reação.

[00180] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como sendo deficientes em NMT determinando a inativação epigenética um gene NMT.

[00181] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como sendo deficientes em NMT através da determinação da atividade de NMT (incluindo NMTl ou NMT2) em uma amostra de células de um indivíduo. A atividade pode ser determinada relativamente a um controle, por exemplo, no caso de defeitos de células cancerosas, em relação a células não- cancerosas, de preferência, a partir do mesmo tecido. Assim, um câncer deficiente em NMT pode ter a atividade e / ou expressão NMT reduzida ou eliminada. A atividade de NMT pode ser determinado utilizando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, e / ou como aqui descrito. Nestes exemplos, um câncer deficiente em NMT tem uma atividade reduzida ou eliminada.

[00182] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como o NMT (por exemplo, NMTl, NMT2, ou ambos) deficiente pela determinação da quantidade, concentração e / ou níveis de proteína NMT (s).

[00183] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como o deficiente NMT pela determinação da quantidade de proteínas miristoiladas em uma amostra biológica de um indivíduo com câncer, ou suspeitos de terem câncer. Neste exemplo, a presença, ausência ou quantidade de proteína com ácido mirístico pode ser determinada, por exemplo, usando o clique química utilizando análogos de ácidos graxos adequados. Métodos não limitativos são aqui descritos. Métodos alternativos de determinar a presença, ausência, ou a quantidade de proteínas miristoiladas será conhecida do técnico versado no assunto. Uma amostra que possui uma quantidade reduzida de proteína miristoilada em uma amostra (opcionalmente, em comparação com um controle) é indicativa de uma amostra deficiente NMT, ou câncer deficiente NMT. Em alguns exemplos, uma amostra que tem uma quantidade reduzida de proteína com ácido mirístico em uma amostra é indicativa de uma amostra NMT2 deficiente, ou um câncer deficiente NMT2.

[00184] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como o NMT deficiente pela determinação da quantidade da quantidade de acilação de proteínas em uma amostra biológica de um indivíduo com câncer, ou suspeito de ter câncer. Neste exemplo, a presença, ausência ou quantidade de acilação de proteínas pode ser determinada. Tais métodos seria conhecido do técnico versado no assunto. Uma amostra que possui uma quantidade reduzida de acilação de proteínas em uma amostra (opcionalmente, em comparação com um controle) é indicativa de uma amostra deficiente NMT, ou câncer deficiente NMT. Em alguns exemplos, uma amostra que tem uma quantidade reduzida de uma acilação de proteínas em uma amostra é indicativa de uma amostra NMT2 deficiente, ou um câncer deficiente NMT2.

[00185] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como um deficiente NMT, por determinação da presença de uma ou mais variações de sequência, tais como mutações e polimorfismos podem incluir uma deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, em relação a sequência de nucleotídeos tipo selvagem. As uma ou mais variações podem estar em uma região de codificação ou de não codificação da sequência de ácido nucleico e, pode reduzir ou abolir a expressão ou função de NMT. Assim, o ácido nucleico pode codificar uma variante de polipeptídeo variante que reduziu ou aboliu a atividade ou pode codificar um polipeptídeo do tipo selvagem que tem pouca ou nenhuma expressão no interior da célula, por exemplo, através da atividade alterada de um elemento regulador.

[00186] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como deficiente NMT determinando o gene (s) que ou negativamente regula o efeito da expressão de NMT.

[00187] Uma variedade de métodos pode ser usada para determinar a presença ou ausência de uma sequência particular de ácidos nucleicos em uma amostra obtida de um indivíduo.

[00188] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como o deficiente NMT em avaliar o nível de expressão ou atividade de um regulador positivo ou negativo de NMT de um componente da via de NMT. Os níveis de expressão podem ser determinadaos, por exemplo, por imunoensaios, tais como ELISA e immoblotts, e métodos de detecção de ácidos nucleicos, tais como RT-PCR, tecnologia nanostring, RNA-seq, hibridização de ácido nucleico ou de análise de cariótipos.

[00189] Em alguns exemplos, um câncer pode ser identificado como sendo deficientes em NMT1 e / ou NMT2 através da determinação da presença, em uma amostra de células do indivíduo de um ou mais variações de, por exemplo, polimorfismos ou mutações em NMT1 e / ou NMT2.

[00190] As mutações e polimorfismos associados com o câncer podem também ser detectados ao nível da proteína através da detecção da presença de uma variante (isto é, uma variante alélica ou mutante) polipeptídeo.

[00191] Em outro exemplo, proporciona-se um método de tratamento de um indivíduo com câncer, em que o referido câncer compreende células cancerosas que são deficientes em NMT2, compreendendo a administração ao referido indivíduo de um inibidor NMT e / ou um inibidor NMT1.

[00192] O termo "inibição" ou "inibidor", como aqui utilizado, se refere a qualquer método ou técnica que inibe a síntese de proteínas, os níveis, a atividade ou função, bem como métodos de inibição da indução ou estimulação da síntese, os níveis, atividade ou função da proteína de interesse, por exemplo, NMT2. O termo também se refere a qualquer metabólico ou via reguladora, que possa regular a síntese, os níveis, a atividade ou a função da proteína de interesse. O termo inclui ligação com outras moléculas e a formação do complexo. Portanto, o termo "inibidor" se refere a qualquer agente ou composto, a aplicação do que resulta na inibição da função da proteína ou função via da proteína. Contudo, o termo não implica que cada uma destas funções deva ser inibida ao mesmo tempo.

[00193] Em outro exemplo, proporciona-se um método de tratamento de um indivíduo com câncer, em que o referido câncer compreende células cancerosas deficientes em NMT1, compreendendo a administração ao referido indivíduo de um inibidor NMT e / ou um inibidor NMT2.

[00194] Em alguns exemplos, os métodos de tratamento compreendem a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto aqui descrito e, opcionalmente, é constituído por uma única administração ou aplicação, ou alternativamente, compreender uma série de administrações ou aplicações. Em um exemplo específico, o referido composto inibidor de NMT é um inibidor NMT 1 e / ou um inibidor NMT2.

[00195] Em um exemplo mais específico, o inibidor é NMT Tris-DBA, AHM, DDD85646, DDD86481, ou seus derivados.

[00196] Em outros exemplos, os compostos e / ou composições são fornecidas em uma quantidade eficaz farmaceuticamente adequada para administração a um indivíduo.

[00197] O termo "quantidade farmaceuticamente eficaz", tal como aqui utilizado se refere à quantidade de uma droga ou agente farmacêutico que irá desencadear a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema, animal ou humano que está a ser procurada por um investigador ou clínico. Esta quantidade pode ser uma quantidade terapeuticamente eficaz.

[00198] Os compostos e as composições são fornecidos em uma forma farmaceuticamente aceitável.

[00199] O termo "farmaceuticamente aceitável", tal como aqui utilizado inclui compostos, materiais, composições e / ou formas de dosagem (tais como unidades de dosagem) que são adequados para utilização em contacto com os tecidos de um indivíduo sem toxicidade excessiva, irritação, respostas de reações alérgicas ou outro problema ou complicação, comensurável com uma relação benefício / risco razoável. Cada transportador, excipiente, etc., também é para ser "aceitável" no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação.

[00200] A quantidade real administrada e a taxa e tempo -Curso de administração, irão depender da natureza e gravidade do que está a ser tratada. A prescrição do tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem etc., é da responsabilidade dos clínicos gerais e outros médicos, e tipicamente tem em conta a desordem a ser tratada, a condição do paciente individual, o local de entrega, o método de administração e outros factores conhecidos dos praticantes.

[00201] Um composto ou composição pode ser administrado sozinho ou em combinação com outros tratamentos, simultaneamente ou sequencialmente, dependendo da condição a ser tratada.

[00202] As formulações podem ser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos no estado da técnica de farmácia. Tais métodos incluem a etapa de colocar o composto ativo em associação com um veículo, o qual pode constituir um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas uniformemente e intimamente para colocar em associação o composto ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos, e depois, se necessário, moldando o produto.

[00203] Os compostos e composições podem ser administrados a um indivíduo por qualquer via de administração conveniente, quer sistemicamente / perifericamente ou no local de ação desejado, incluindo, mas não limitado a, oral (por exemplo, por ingestão); tópica (incluindo por exemplo, transdérmica, intranasal, ocular, bucal, e sublingual); pulmonar (por exemplo, através de inalação ou insuflação usando terapia, por exemplo, um aerossol, por exemplo, através da boca ou nariz); rectal; vaginal; parentérica, por exemplo, por injeção, incluindo subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intracardíaca, intratecal, intra-espinal, intracapsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcuticular, intra-articular, subaracnóide, e intrasternal; por implante, por exemplo, um depot, por via subcutânea ou intramuscular.

[00204] As formulações adequadas para administração oral (por exemplo, por ingestão) podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas, pílulas ou comprimidos, cada uma contendo uma quantidade pré-determinada do composto ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou suspensão em um líquido aquoso ou não-aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou água-em-uma emulsão líquida de óleo; na forma de bolus; como um electuário; ou como uma pasta.

[00205] As formulações adequadas para administração parentérica (por exemplo, por injeção, incluindo a cutânea, subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica), incluem,, soluções de injeção aquosas e não aquosas, isotônicas, livre de pirogênios, estéreis, que podem conter anti-oxidantes, tampões, conservantes, estabilizantes, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes, e lipossomas ou outros sistemas de micropartículas que são concebidos para direcionar o composto para componentes do sangue ou a um ou mais órgãos. Exemplos de veículos isotônicos adequados para utilização nessas formulações incluem injeção de cloreto de sódio, solução de Ringer, ou Injeção de Ringer com Lactato.

[00206] As formulações podem ser apresentadas em dose unitária ou multi-dose de contentores vedados, por exemplo, ampolas e frascos e podem ser armazenadas em um liofilizador- (Liofilizada) necessitando apenas da adição do veículo líquido estéril, por exemplo água para injeções, imediatamente antes da utilização. As soluções e suspensões injetáveis extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos. As formulações podem ser na forma de lipossomas ou outros sistemas de micropartículas que são concebidos para direccionar o composto activo para componentes do sangue ou um ou mais órgãos.

[00207] As composições compreendendo os compostos aqui divulgados podem ser utilizados nos métodos aqui descritos em combinação com regimes quimioterapêuticos padrão ou em conjunto com a radioterapia.

[00208] Em caso de linfoma em um paciente, os tratamentos conhecidos são dependentes do indivíduo a ser tratado, o tipo de doença, e a sua fase. Modalidades atuais de tratamento para o linfoma são conhecidos do técnico versado no assunto. Por conseguinte, os tratamentos conhecidos podem ser utilizados em conjunto com os inibidores NMT aqui divulgados.

[00209] Combinações comuns de fármacos para utilização no tratamento de linfomas incluem, mas não estão limitados, ao CHOP (isto é, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona), GAP-BOP (isto é, ciclofosfamida, doxorubicina, procarbazina, bleomicina, vincristina, e prednisona), m-BACOD (isto é, metotrexato, bleomicina, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona e leucovorina), PROMACE-MOPP (isto é, prednisona, metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, etoposide, leucovorin com padrão MOPP), PROMACE-CytaBOM (prednisona, doxorrubicina, ciclofosfamida, etoposido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato, e leucovorina), e MACOP-B (metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina e leucovorina). Para o linfoma não-Hodgkin de reencidência agressiva as seguintes combinações de fármacos de quimioterapia podem ser utilizadas com os compostos e as composições aqui descritos: IMVP-16 (ou seja, a ifosfamida, metotrexato, e etoposido), MIME (isto é, metil-gag, ifosfamida, metotrexato, e etoposido), DHAP (isto é, dexametasona, - 16 elevada dose de citarabina, e cisplatina), ESHAP (isto é, etoposido, metilprednisona, citarabina alta dosagem, e cisplatina), Ceff (B) (isto é, ciclofosfamida, etoposido, procarbazina, prednisona, e bleomicina), e CAMP (ie, lomustine, mitoxantrona, citarabina, e prednisona).

[00210] O tratamento por quimioterapia de recuperação usado para certos linfomas, tais como, por recaída, a doença de Hodgkin resistente incluem, mas não estão limitados a VABCD (isto é, vinblastina, doxorubicina, dacarbazina, lomustina e bleomicina), ABDIC (isto é, doxorrubicina, bleomicina, dacarbazina, lomustina, e prednisona), DCBV (isto é, lomustina, bleomicina, vinblastina, dexametasona), PCVP (isto é, vinblastina, procarbazina, ciclofosfamida e prednisona), CEP (isto é, lomustina, etoposido, e prednimustina), EVA (isto é, etoposido , vinblastina, e doxorubicina), MOPLACE (isto é, ciclofosfamida, etoposido, prednisona, metotrexato, cytaravine, e vincristina), MIME (isto é, metil-gag, ifosfamida, metotrexato, e etoposido), MINA (isto é, mitoquazone, ifosfamida, vinorelbina e etoposido), MTX-CHOP (isto é, o metotrexato e CHOP), CEM (isto é, lomustina, etoposido, e metotrexato), CEVd (isto é, lomustina, etoposido, vindesina, e dexametasona), CAVP (isto é, lomustina, melfalano, etoposido, e prednisona), EVAP (isto é, o etoposido, a vinblastina, a citarabina, e cisplatina), e Epoch (isto é, etoposido, vincristina,; doxorubicina, ciclofosfamida e prednisona).

[00211] Faz-se observar que os métodos alternativos para inibir NMT1 ou NMT2 pode ser utilizado em uma estratégia sintética letal para o tratamento de câncer e, em particular, o tratamento de linfoma de células B. Por exemplo, a expressão de NMT1 ou NMT2 pode ser inibida utilizando tecnologia de RNAi ou anti-senso. A utilização destas abordagens para regular negativamente a expressão do gene e / ou atividade da proteína é conhecido pelo técnico versado no assunto.

[00212] Em uma outra concretização da presente invenção, é proporcionado um método para determinar a vantagem do inibidor NMT2- e / ou inibidor NMT1 para o tratamento de um paciente.

[00213] Em um exemplo, um método da presente invenção compreende a determinação quantitativa ou qualitativamente, a análise ou a medição de uma amostra de um indivíduo com câncer, ou suspeito de ter câncer, para detectar a presença ou ausência, ou a quantidade ou concentração, e de NMT1 / ou NMT2.

[00214] Em outro exemplo, um método da presente invenção compreende a determinação quantitativa ou qualitativamente, a análise ou a medição de uma amostra de um indivíduo com câncer, ou suspeito de ter câncer, para detectar a presença ou ausência, ou a quantidade ou concentração, de proteínas miristolatadas.

[00215] Em outro exemplo, um método da presente invenção compreende a determinação quantitativa ou qualitativamente, a análise ou a medição de uma amostra de um indivíduo com câncer, ou suspeito de ter câncer, para detectar a presença ou ausência, ou a quantidade de concentração de proteínas aciladas.

[00216] O termo "amostra", tal como aqui utilizado se refere a qualquer amostra de um indivíduo, incluindo mas não se limitando a um fluido de células ou amostra de tecido que compreende células cancerosas, ou que é suspeito de conter células cancerosas, que pode ser ensaiado para os níveis de expressão de genes, os níveis de proteínas, os níveis de atividade enzimática, e semelhantes. A amostra pode incluir, por exemplo, uma amostra de sangue, uma amostra de sangue fracionado, uma amostra de medula óssea, biopsia, uma amostra de tecido congelado, uma amostra fresca de tecido, uma amostra de células, e / ou uma secção embebida em parafina, o material a partir do qual o RNA possa ser extraído em quantidade suficiente e com qualidade adequada para permitir a medição de níveis de RNAm relativos, ou de material a partir do qual os polipeptídeos podem ser extraídos em quantidades suficientes e com qualidade adequada para permitir a medição de níveis de polipeptídeo relativos.

[00217] A determinação, análise ou medição de NMTl ou NMT2, ou a presença ou ausência de NMTl e / ou NMT2 pode ser correlacionada com o benefício do inibidor NMTl ou inibidor NMT2 no tratamento de câncer no paciente.

[00218] A determinação, a análise ou a dosagem das proteínas miristolatadas, ou a presença ou ausência de proteínas miristolatadas pode ser correlacionada com o benefício de do inibidor NMTl ou inibidor NMT2 no tratamento de câncer no paciente.

[00219] A determinação, a análise ou a dosagem das proteínas acilados, ou a presença ou ausência de proteínas miristolatadas pode ser correlacionada com o benefício de do inibidor NMTl ou inibidor NMT2 no tratamento de câncer no paciente.

[00220] Em um exemplo específico, os anticorpos da presente invenção são imunorreativos ou imuno-específico para, e, por conseguinte, especificamente e selectivamente se ligam a uma proteína de interesse, por exemplo, a proteína NMTl ou NMT2. Em um exemplo, os anticorpos que são imunorreativos e imunoespecífico para NMTl ou NMT2 humano pode ser utilizado. Anticorpos para NMTl ou NMT2 humano são preferencialmente imunoespecífico. O termo "anticorpo" e "anticorpos" inclui, mas não está limitado a, anticorpos monoclonais e policlonais.

[00221] Em outro exemplo, os anticorpos da presente invenção são imunorreativos ou imuno-específico para, e, por conseguinte, especificamente e seletivamente ligam-se a ambas proteínas NMT1 ou NMT2. Neste exemplo, os anticorpos que são imunorreativos e imunoespecífico tanto para NMT1 ou NMT2 humano pode ser utilizado. Anticorpos para NMT1 humano ou NMT2 são preferencialmente imunoespecífico. Neste exemplo, e, devido ao diferente peso molecular de NMT1 e NMT2, é possível identificar a presença ou ausência de ambas as proteínas utilizando um único anticorpo, utilizando, por exemplo, SDS- PAGE e imunoblotting. O termo "anticorpo" e "anticorpos" inclui, mas não está limitado a, anticorpos monoclonais e policlonais.

[00222] O termo "liga especificamente" se refere a elevada avidez e / ou a ligação de um anticorpo para um polipeptídeo específico, por exemplo, um epítopo de NMT1 ou NMT2 de alta afinidade. Ligação ao seu epítopo neste polipeptídeo específico é mais forte do que o anticorpo de ligação do mesmo anticorpo a qualquer outro epítopo, particularmente, aqueles que podem estar presentes em moléculas em associação com, ou na mesma amostra, como o polipeptídeo específico de interesse. Os anticorpos que se ligam especificamente a um polipeptídeo de interesse podem ser capazes de se ligarem a outros polipeptídeos, mas num nível detectável, fraco. Tal ligação fraca, ou ligação de fundo, é facilmente discernível da ligação específica do anticorpo ao composto ou polipeptídeo de interesse, por exemplo, pelo uso de controles apropriados, como será do conhecimento do técnico versado no assunto.

[00223] Em um exemplo, uma amostra contendo células cancerosas ou que se suspeita que contém células cancerosas é obtida a partir de um indivíduo com câncer. Coleta, de tal amostra é bem conhecido para o técnico versado no assunto. Em um exemplo específico, a amostra é uma amostra de sangue. Métodos de obtenção de uma amostra de exemplo, o processamento e / ou armazenamento de uma tal amostra também são bem conhecidos do técnico versado no assunto.

[00224] Em um exemplo específico, a detecção, a análise ou a medição da proteína NMT1 ou NMT2 dentro de uma amostra é efetuada usando imuno-histoquímica. Em um exemplo mais específico, a detecção, a análise, ou medição de NMT 2 dentro de uma amostra é efetuada usando imuno-histoquímica. Será claro para o técnico versado no assunto que outros imuno- ensaios, tanto qualitativos ou quantitativos podem ser utilizados na presente invenção.

[00225] Em exemplos adicionais, imuno-histoquímica (IHC) pode ser realizada utilizando qualquer método adequado ou sistema de imuno-histoquímica. Não exemplos limitativos incluem sistemas automatizados, IHC quantitativa, IHC semi- quantitativa e métodos manuais.

[00226] O termo imunohistoquímica "quantitativo" se refere a um método automatizado de varredura e de pontuação de amostras que tenham sido submetidas a imunohistoquímica, para identificar e quantificar a presença de um biomarcador especificado, tal como um antígeno ou outras proteínas. Por exemplo, para quantificar NMT1 e / ou NMT2. A pontuação para a amostra dada é uma representação numérica da intensidade da coloração imunohistoquímica da amostra, e representa a quantidade de biomarcador alvo (tal como, NMT1 ou NMT2) presente na amostra. Tal como aqui utilizado, a densidade ótica (OD) é uma pontuação numérica que representa a intensidade de coloração, bem como a percentagem de células que são coradas. Tal como aqui utilizado, imunohistoquímica semi-quantitativa se refere a pontuação de imunofenotipagem por olho humano, em que um operador qualificado classifica os resultados numericamente (por exemplo, como 0 [coloração fraca ou ausente], 1 ou 2 [coloração forte]).

[00227] Processamento de amostras automatizado, digitalização e análise de sistemas adequados para utilização com imunohistoquímica são conhecidos no estado da técnica, e podem ser utilizados com a presente invenção. Tais sistemas podem incluir coloração automática e digitalização microscópica, análise de imagem computadorizada, a comparação seção serial (para controlar a variação na orientação e tamanho da amostra), a geração de relatórios digitais e arquivamento e rastreamento de amostras (como slides em que cortes de tecidos são colocados). Sistemas de imagem celulares estão comercialmente disponíveis, que combinam microscópios convencionais de luz com sistemas de processamento de imagens digitais para realizar a análise quantitativa em células e tecidos, incluindo amostras de imunomarcação.

[00228] Na prática, no exemplo em que uma amostra do doente é determinada para ter a coloração baixa (por exemplo, fraca ou ausente) NMT2 tumor, o paciente é considerado um bom candidato para tratamento com inibidor NMT1. Em um outro exemplo específico, um determinado paciente ter alta coloração do tumor (por exemplo, forte) NMT2, o qual é considerado um candidato pobre para tratamento inibidor NMT1.

[00229] Deve notar-se que o ponto de corte para a IHQ negativa vs determinação positiva é uma determinação semi- quantitativa, e feita por um patologista experiente utilizando métodos semi-quantitiativos e microscopia de luz.

[00230] Por exemplo, IHC pode ser marcado em qualquer uma das seguintes maneiras: 1. Qualquer coloração vs sem coloração; 2. Forte vs coloração fraca; 3. Nenhuma vs fraco vs forte; 4. Uma pontuação de H composto de fórmula (% nenhum x 0) + (% fraco x 100); + (% X moderada 200) + (% strong x 300); 5. Software de análise computadorizada de imagens para pontiação quantitativa assistida.

[00231] Os pontos de corte são inicialmente definidos pela variável de sensibilidade ao fármaco in vitro. Uma vez que os fármacos batem no ensaios clínicos, ponto de corte sensível vs ponto de corte não sensível poderão ser aperfeiçoadas e validados.

[00232] Em um exemplo, para determinar se existe uma coloração do tumor NMT2 alta (por exemplo, forte) ou baixa (por exemplo, fraca ou ausente), a amostra do paciente pode ser comparado com um ou mais amostras de controle. Em um exemplo, uma amostra de controle teve nível conhecido e / ou de coloração do tumor NMT2 estabelecido. Em um exemplo, uma amostra de controle é uma amostra do paciente que possui níveis conhecidos e / ou de coloração do tumor estabelecidos NMT2 e / ou evolução clínica conhecida. Em um exemplo, um controle é uma linhagem de células que tem uma quantidade conhecida de coloração NMT2.

[00233] Opções de continuação do tratamento para os pacientes que são considerados ser um candidato pobre para tratamento inibidor NMT1 são conhecidos do trabalhador qualificado.

[00234] Será apreciado que em algumas circunstâncias, um doente que responde inicialmente a tratamento com inibidor NTM1 pode recorrer. Tal recaída pode manifestar-se e é várias maneiras, incluindo mas não se limitando a, a recorrência do tumor e o desenvolvimento de metástases primária. Além de, ou, em alternativa, um tumor suplementar distinto podem surgir.

[00235] De acordo com um aspecto da presente invenção, proporciona-se um método que compreende: a) obter uma amostra de um indivíduo com, ou suspeitos como tendo, câncer; b) contatar a amostra com um anticorpo para NMT2 para formar um complexo entre o anticorpo e NMT2 presente na amostra; c) medição do complexo formado, para determinar uma quantidade ou uma concentração de NMT2 na amostra; e d) determinar o benefício do tratamento com inibidor de NMT1, em que o referido câncer no referido indivíduo, em que a determinação de benefício de tratamento inibidor NMT1 é determinado pelo nível de NMT2 na referida amostra.

[00236] Em um aspecto específico, a administração de um inibidor NMT1 ao referido indivíduo é indicado quando a quantidade de NMT2, em que a referida amostra é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle.

[00237] De acordo com um aspecto da presente invenção, proporciona-se um método, que compreende: a obtenção de uma amostra de um indivíduo; processamento da referida amostra; realização de um ensaio de ligação que compreende o contato da amostra com um anticorpo processado para NMT2 para formar um complexo entre o anticorpo e NMT2 presente na amostra, o referido ensaio de ligação gerando, pelo menos, um resultado de ensaio indicativo do referido complexo; e administração de um inibidor NMTl ao referido indivíduo, quando a quantidade de NMT2, em que a referida amostra é baixa ou ausente, opcionalmente, em comparação com um controle.

[00238] Em alguns aspectos, a instrumentação tendo um detector regulado para detectar o complexo formado entre o anticorpo e NMT2, em que a referida amostra é utilizado para determinar a quantidade de complexo na amostra. Em alguns exemplos, a instrumentação é um espectrofotômetro, espectrofluorômetro, dispositivo ótico, ou dispositivo eletroquímico. Em alguns exemplos, o anticorpo para NMT2 é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal.

[00239] Outros exemplos que podem ser utilizados na detecção, medição ou análise de NMTl ou NMT2 incluem, mas não estão limitados a, immunoblotting, ELISA, imuno-fluorescência indireta, tecnologia de multiplexação de grânulo, imunoprecipitação e espectrometria de massa de amostra de obteção do indivíduo. Na prática, no exemplo em que uma amostra do doente é determinada para ter a coloração baixa ou ausente de NMT2, o indivíduo é considerado um bom candidato para a terapia inibidor NMT.

[00240] Em um exemplo, a amostra é analisada por microscopia de luz por exame direto ou por captura de imagem e análise, ou por microscopia fluorescente utilizando o exame direto de captura e análise por imagem.

[00241] Em outro exemplo, um método da presente invenção compreende a determinação qualitativa ou quantitativamente, ou analise ou medição da atividade da proteína NMTl e /ou a atividade da proteína NMT2 na amostra biológica de um indivíduo com paciente de câncer para detectar a presença ou ausência ou a quantidade de atividade NMTl e / ou atividade NMT2. Neste exemplo, as utilizações dos substratos (naturais ou sintéticos) de NMTl ou NMT2 são utilizados para identificar uma amostra, na qual a atividade NMTl ou NMT2 está presente, ausente, ou a quantidade da mesma.

[00242] Na prática, no exemplo em que uma amostra do indivíduo é determinada como sendo NMT2 deficiente, o indivíduo é considerado um bom candidato para a administração de um inibidor NMTl.

[00243] Na prática, no exemplo em que uma amostra do indivíduo é determinada a ter níveis baixos ou ausentes da proteína NMT2, o indivíduo é considerado um bom candidato para a administração de um inibidor NMTl.

[00244] Na prática, no exemplo em que uma amostra do indivíduo é determinada a ter uma atividade reduzida ou nula de NMT2, o indivíduo é considerado um bom candidato para a administração de um inibidor NMTl.

[00245] Na prática, no exemplo em que amostra de um indivíduo é determinado a ter uma quantidade baixa ou ausente de proteína com ácido mirístico, o indivíduo é considerado um bom candidato para a administração em um inibidor NMTl.

[00246] Na prática, no exemplo em que a amostra de um indivíduo é determinada a ter uma quantidade baixa ou ausente de proteína acilada, o indivíduo é considerado um bom candidato para a administração em um inibidor NMT2.

[00247] Em outro exemplo, um método da presente invenção compreende a identificação de uma mutação, deleção, ou semelhante, no gene NMTl ou NMT2 em uma amostra proveniente de um indivíduo com câncer ou suspeito de ter câncer. Em que, a referida mutação, deleção, ou semelhante no gene NMTl ou NMT2 resulta em uma perda de diminuição da atividade da proteína NMTl ou NMT2 em células cancerosas no interior na referida amostra. Os métodos de identificação de tais mutações, deleções, ou semelhantes, em NMTl ou NMT2 são conhecidos de um técnico versado no assunto, e incluem, mas não estão limitados a, RFLP, RT-PCT, análise de microarray, e / ou qualquer tipo adequado de sequenciamento de DNA. Na prática, no exemplo em que uma amostra do indivíduo é determinada para ter uma mutação, deleção, ou semelhante, em NMT2, o que resulta em uma baixa ou nula atividade de proteína NMT2, o indivíduo é considerado um bom candidato para a terapia com inibidor NMT.

[00248] Em outro exemplo, um método da presente invenção compreende a identificação de uma mutação, deleção, ou semelhantes, no RNAm de NMTl ou NMT2 em uma amostra de um indivíduo com câncer ou suspeito de ter câncer. Em que, a referida mutação, deleção, ou semelhante, os resultados do RNAm de NMTl ou NMT2 em uma perda de diminuição da atividade da proteína NMTl ou NMT2 em células cancerosas no interior da referida amostra. Os métodos de identificação de tais mutações, deleções, ou semelhantes, no RNAm NMTl ou NMT2 são conhecidos para o técnico versado no assunto, e incluem, mas não estão limitadas a, Northern blot, RT-PCR, análise de microarray, e / ou qualquer tipo adequado de sequenciamento de mRNA. Na prática, no exemplo em que uma amostra do indivíduo é determinado para ter uma mutação, deleção, ou semelhante, no RNAm NMT2, a qual resulta em uma baixa ou nula atividade de proteína NMT2, o indivíduo é considerado um bom candidato para a terapia um inibidor NMT.

[00249] Em outro exemplo, um método da presente invenção, é proporcionado um método para o tratamento de um indivíduo que sofre de câncer, associado a uma deficiência em NMTl ou NMT2, compreendendo a administração ao referido indivíduo de um inibidor de NMT. Em um exemplo específico, o câncer está associado com uma deficiência na NMT2, e o inibidor é um inibidor NMTl.

[00250] Em outro exemplo, proporciona-se uma utilização de um inibidor NMTl para o tratamento de um câncer deficiente em NMT2.

[00251] Em outro exemplo, proporciona-se uma utilização de um inibidor NMTl para o tratamento de um câncer, em que o referido câncer é o linfoma, linfoma das células B, linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma / de Waldenstrom, linfoma de células B monocitóides / do tipo MALT, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrico, linfoma anaplásico de grandes células, leucemia mielóide aguda, leucemia Mielóide Crônica fase blástica, o linfoma de Burkitt, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma Intestinal, Carcinoma adenoescamoso misto do pulmão, Carcinoma pulmonar de pequenas células, pulmão, Carcinoma de células escamosas Esófago, Osso, Carcinoma do duto da mama, Adenocarcinoma difuso estomacal, Carcinoma medular de tireóide, carcinoma de células transicionais do trato urinário, mieloma, carcinoma de células claras ovariana, carcinoma de células de transição (ureter e câncer de bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma de células não-pequenas das células de lunch, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma do endométrio ou carcinoma escamoso esofágico. Em um exemplo mais específico, o referido câncer é determinado como sendo um câncer deficiente em NMT2.

[00252] Exemplos de inibidores incluem, mas não estão limitados a, moléculas pequenas, anticorpos, fragmentos de peptídeos e / ou moléculas de ácidos nucleicos.

[00253] Os exemplos específicos de moléculas pequenas incluem Tris-DBA, AHM, DDD85646, DDD86481, e seus derivados. O termo "derivados", tal como aqui utilizado inclui, mas não está limitado a, sais, complexos de coordenação, ésteres, tais como ésteres hidrolisáveis in vivo, os ácidos ou bases livres, hidratos, pró-fármacos ou lipídios, parceiros de acoplamento.

[00254] Os fragmentos peptídicos podem ser preparados total ou parcialmente por síntese química que ativa o local de NMT1. Os fragmentos peptídicos podem ser preparados de acordo com os métodos estabelecidos de padrão de síntese de peptídeos de fase sólida ou líquida, que são conhecidos do técnico versado no assunto.

[00255] Os inibidores de ácidos nucleicos, ou respectivos complementos, inibem a atividade ou a função por uma produção regular negativamente do polipeptídeo ativo. Isto pode ser monitorado utilizando métodos convencionais bem conhecidos no estado da técnica, por exemplo, por rastreio utilizando PCR em tempo real, tal como descrito nos exemplos.

[00256] Exemplos de inibidores de ácido nucleico incluem tecnologia de RNAi ou anti-senso, cuja utilização é para sub-regular a expressão gênica e está bem estabelecida no estado da técnica. Os oligonucleotídeos anti-senso podem ser concebidos para hibridizar com a sequência de ácido nucleico complementar, pré-RNAm ou RNAm maduro, interferindo com a produção do componente via de reparação de excisão de bases, de modo que a sua expressão é reduzida ou completamente ou substancialmente completamente impedido. Em adição a sequência de codificação alvo, pode ser utilizada técnicas anti-sentido a sequências alvo de controle de um gene, por exemplo, na sequência flanqueadora 5', através do qual os oligonucleotídeos anti-senso podem interferir com sequências de controle de expressão.

[00257] Uma alternativa aos anti-senso é utilizar uma cópia de todo ou parte do gene alvo inserido na orientação senso, que é a mesma orientação que o gene alvo, para alcançar uma redução na expressão do gene alvo por co- supressão.

[00258] Para além disso, o silenciamento do RNA de cadeia dupla (dsRNA) pode ser utilizado. Silenciamento de dsRNA mediado é gene específico e é frequentemente denominado RNA interferente (RNAi).

[00259] Em outro exemplo, o ácido nucleico que é utilizado na transcrição produz uma ribozima, capaz de cortar o ácido nucleico em um local específico e, por conseguinte, também útil para influenciar a NMT.

[00260] Ainda em outro exemplo, pequenas moléculas de RNA podem ser utilizadas para regular a expressão do gene. Estas incluem a degradação de mRNAs alvo de pequenos RNAs de interferência (siRNAs), o silenciamento pós transcricional (PTGs), desenvolvimento de regulação específica da sequência de repressão da tradução do mRNA por micro-RNAs (miRNAs) e silenciamento gênico transcricional direcionado.

[00261] Ainda em outro exemplo, pode ser usada a expressão de uma molécula de RNA hairpin curta (shRNA) na célula. Um shRNA consiste em repetições invertidas curtas separadas por uma sequência de ansa pequena. Uma repetição invertida é gratuita para o gene alvo. Na célula do shRNA é processado por um siRNA DICER em que degrada o RNAm do gene alvo NMT e suprime a expressão. Em uma concretização preferida, o shRNA é produzido endogenamente (dentro de uma célula) por transcrição a partir de um vetor.

[00262] Um defeito em NMTl ou NMT2, é um NMTl ou NMT2 deficiente, respectivamente, fenótipo que pode ser deficiente em um componente de uma via mediada por NMTl ou NMT2, ou seja, a expressão da atividade de um componente da via pode ser reduzida ou abolida em relação a células de câncer para controlar células. Em algumas concretizações, a célula cancerosa pode ser deficiente em NMTl ou NMT2, ou seja, a expressão da atividade de NMTl ou NMT2 pode ser reduzida ou abolida em relação à célula de câncer com células de controle.

[00263] Deste modo, é proporcionada a utilização de NMT2 como um marcador para um ou mais de diagnóstico, prognóstico, classificação, ou monitoração de câncer em um indivíduo. Em alguns exemplos, NMT2 é medida utilizando um ensaio selecionado de imunoensaios ou detecção de ácido nucleico, ou a atividade da proteína.

[00264] O termo "prognóstico", tal como aqui utilizado se refere a previsão da probabilidade de morte ou a progressão do câncer atribuíveis, incluindo recorrência, disseminação metastática, e resistência a drogas, de uma doença neoplásica, tais como o câncer da mama.

[00265] O termo "marcador de prognóstico", tal como aqui utilizado se refere a um marcador que informa sobre o resultado de um paciente na ausência de terapia sistêmica ou anuncia um resultado diferente do que os de pacientes sem o marcador, apesar da terapia sistêmica empírica (não alvejada para o marcador).

[00266] O termo "marcador de previsão" como aqui utilizado se refere a um marcador que prevê que a eficácia diferencial (benefício) de uma terapia particular, com base no estado do marcador.

[00267] O termo "diagnóstico" como aqui utilizado, se refere à identificação de uma doença ou condição ou estado molecular e / ou patológico, tal como a identificação de câncer da mama, ou outro tipo de câncer.

[00268] É também proporcionado o uso de proteína miristoilação como um marcador para um ou mais de diagnóstico, prognóstico, classificar ou monitoração de câncer em um indivíduo.

[00269] É também proporcionado o uso de proteína de acilação como um marcador para um ou mais de diagnóstico, prognóstico, classificar ou monitoração de câncer em um indivíduo.

[00270] Em alguns exemplos, o referido câncer é o linfoma. Em exemplos mais específicos, o dito linfoma é linfoma de células B. Em exemplos mais específicos, o dito linfoma das células B é o linfoma folicular, linfoma difuso de grandes células B, linfoma das células do manto, B-CLL / SLL, imunocitoma, do tipo MALT / monocitóides linfoma de células B de Waldenstrom, linfoma de Burkitt, linfoma pediátrica, ou linfoma anaplásico de grandes células.

[00271] Em alguns exemplos, o câncer é a leucemia mielóide aguda, linfoma de células B, leucemia mielóide crônica em fase blástica, o linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células B, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma Intestinal, carcinoma pulmonar misto adenoescamoso, Carcinoma de Pequenas Células de Lunch, pulmonar, Carcinoma esofágico de células escamosas, óssea, Carcinoma do duto da mama, Adenocarcinoma difuso estomacal, Carcinoma medular da tiróide, carcinoma do Trato Urinário de células transicionais.

[00272] Em alguns exemplos, o câncer é o linfoma de células B, linfoma de Burkitt, linfoma difuso de grandes células, leucemia mielóide aguda, mieloma múltiplo, carcinoma de células claras do ovário, carcinoma de células de transição (câncer de ureter e da bexiga), leucemia mielóide crônica (LMC), linfoma-CLL, o carcinoma do pulmão de células pequenas, carcinoma da mama, adenocarcinoma coloretal, adenocarcinoma do pâncreas, carcinoma do ovário, carcinoma do pulmão de células não pequenas, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico.

[00273] Os métodos da invenção são convenientemente praticados fornecendo os compostos e / ou composições utilizadas em tal método sob a forma de um kit. Tal kit contém de preferência da composição. Tal kit contém de preferência instruções para a sua utilização.

[00274] Para obter uma melhor compreensão da invenção aqui descrita, os seguintes exemplos são apresentados. Deve ser entendido que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos. Por conseguinte, eles não devem limitar o escopo da presente invenção de qualquer forma.

[00275] EXEMPLOS

[00276] Nos exemplos seguintes, foram empregadas metodologias padrão, como será apreciado pelos técnicos versados no assunto.

[00277] MATERIAIS E MÉTODOS

[00278] Anticorpos e Reagentes.

[00279] Tris dibutylbenzinylidene acetona Paladium (TrisDBA) foi cedido pelo Dr. Arbiser (U. Alabama). DDD85646 foi sintetizado como descrito [JAFrearson et al (2010) Nature. 464,728-723)] e / ou DDD86481 foi obtida a partir de Dr. David Gray e Paul Wyatt, Universidade de Dundee)

[00280] os anticorpos de Camundongos anti-NMTl (clone 14; 1: 1000) e de camundongos anti-NMT2 (clone 30; 1: 2000), foram da BD Biosciences, San Jose, CA, EUA. Anti-NMTl de coelho (policlonal, 1: 3000) foi adquirido a partir de Proteintech, Chicago, IL, EUA. anti-GFP de coelho (1: 20.000), anti-PARP-1 (1: 5000), anti-GAPDH (1: 5000) e antic-terminal de pAK2 (1: 2000) a partir de anticorpos foram Eusera (www eusera.com), Edmonton, AB, Canadá. Anticorpos anti-a-tubulina de camundongo (1: 15.000) e anti-V5 de coelho (1: 10.000) foram adquiridos a Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA. De ratinho anti-His (1: 2000) foi de Qiagen, Alemanha. De coelho anti-caspase-8 clivada (1: 1000) e anti-caspase-3 clivada (1: 1000) eram ambos de Cell Signaling, Danvers, MA, EUA. Kits de detecção Chemiluminesce reforçada ocidentais blot (ECL) Plus e ECL Prime foram adquiridos da GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EUA. A menos que indicado de outra forma, todos os produtos químicos utilizados foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) e foram da mais elevada pureza disponível.

[00281] Constructos de DNA. Engenharia de V5- e marcadas com His NMT1 e constructos NMT2. Vetores de entrada NMT1 e NMT2, que são compatíveis com o sistema de clonagem de Gateway (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) foram adquiridos da Genecopoeia (Rockville, MD, EUA). Os genes NMT1 e NMT2 foram incorporados no vetor pcDNA3.1 / destino NV5 DEST (Life Technologies), utilizando a enzima clonase LR (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante para gerar os plasmídeos no terminal-N STA tagged (His-1 NMT, His-NMT2, V5 e V5-NMT1-NMT2). Constructos V5 NMT marcados foram usadas para a expressão de células de mamíferos, enquanto que os constructos NMT foram usadas para a expressão bacteriana. Os produtos de clonagem foram confirmados por sequenciamento de DNA (MWG Eurofins Operon, Huntsville, AL, EUA).

[00282] A cultura celular. Origem das células B foram um presente do Dr. Jim Stone ou foram obtidos a partir de ATCC. Todos os reagentes de cultura celular foram adquiridos a partir de Invitrogen. As células B foram cultivadas a 37 ° C e 5% de C02 em uma incubadora umidificada e mantida em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina e 0,1 mg / ml de estreptomicina.

[00283] A lise celular. As células foram lavadas em PBS frio, lisadas em 0,1% SDS-tampão RIPA [Tris 50 mM, NaCl 150 mM, 1% de Igepal CA-630, 0,5% NADC, 2 mM de MgCl 2 , e lx inibidor de protease completa (Roche Diagnostics); pH 8,0] e agitados durante 15 min a 4° C. Lisados celulares sobrenadante foram obtidas após centrifugação a 16.000 g durante 15 min a 4 ° C.

[00284] A indução de apoptose. Salvo indicação ao contrário, a apoptose foi induzida com 2,5 µM estaurosporina (STS) (Sigma Aldrich, St. Louise, MO, EUA) e 5 ug / mL cicloheximida (ICN Bioquímicos Inc. Aurora, OH, EUA), a fim de inibir a tradução de proteínas e melhorar a indução de apoptose.

[00285] A incubação com os inibidores NMT. Tris Paladium dibutylbenzinylidene acetona (TrisDBA) foi cedida pelo Dr. Arbiser. As células foram incubadas em concentrações crescentes durante 24 horas com TrisDBA (ou DMSO para controle) ou para 24 e 48 horas com DDD85646.

[00286] Transfecção de células B. As células B foram transfectadas usando o sistema de transfecção Neon ® (Life Technologies), seguindo as instruções do fabricante e protocolo otimizado para Ramos de transfecção de células B (tensão de pulso 1,300V; largura de pulso de 20 ms, 2 pulsos e 7.7.10 6 células / mL) adaptados para 100 µl. Classicamente, duas transfecções foram puxados para células vivas obtidas suficientes para realizar um ensaio de viabilidade.

[00287] Ensaio de viabilidade celular. Viabilidade de células T e B foi medida utilizando o método de exclusão de azul de tripano. As células foram cultivadas em condições de confluência (2 x 106 células / mL máximo) assegurando a apoptose mínimo basal. Após incubação com os inibidores NMT, cerca de 20 000 células (10 uL) foram incubados com 10 µ't. TCI de 0 ™ Trypan Blue Dye (Biorad) durante 15 min. A viabilidade celular foi quantificada através do contador de células automatizado TC10 ™ (Biorad).

[00288] Em ensaio in vitro de atividade NMT. Protocolo de ensaio de atividade N-miristoiltransferase foi adaptado a partir de Raju, VD, e Sharma, RK (1999) Preparação e ensaio de miristoil-CoA: proteína N-myristoyltransferase. Methods Mol Biol 116, 193-211. [3H] miristoil-CoA foi recém- sintetizado para cada experiência, tal como foi previamente descrito por Towler, D., e Glaser, L. acilação de ácidos graxos (1986) Protein: síntese enzimática de um peptídeo N- myristoylglycyl. Proc Natl Acad Sci EUA 83, 2812-2816. Resumidamente, as células foram ressuspensas em tampão de 0,25 M de sacarose (50 mM de NaH 2 P04, pH 7,4) e indivíduo a dois ciclos de sonicação a nível de 6.0 em um sonicador Branson. A mistura de reação é composta por 10 µl de extrato de células (cerca de 20 ug de proteínas) incubadas em tampão de atividade NMT (0.26m de Tris-HCl, EGTA 3,25 mM, EDTA 2,92 mM e 29,25 mM de 2-mercaptoetanol, 1% de Triton X-100, pH 7,4) e miristoilable ou não decapeptídeo -myristoylable que corresponde à sequência N-terminal da truncado-Bid (0,1 mM dissolvidos em água). A reação foi iniciada pela adição de 7,4 µ'l. (~ LOpMol) de recém-sintetizada [3H] miristoil-CoA (volume final = 25 µl mistura) e incubadas durante 15 min a 30 ° C. A reação é parada através da identificação de 15 µl. A mistura de reação sobre um disco de papel de fosfocelulose P81 (Whatman, Kent, Reino Unido) e secou-se durante 30 segundos. Os discos foram lavados (tampão de lavagem: tampão Tris 25 mM, pH 7,4) para remover a radioatividade residual ( [3H] -miristate e [3H] miristoil-CoA), enquanto que [3H] miristoil-peptídeo é retido no papel de fosfocelulose. A radioatividade foi quantificada por contagem de cintilação líquida e convertida em pmol de peptídeo com ácido mirístico (Raju, VD, e Sharma, RK (1999) Preparação e ensaio de miristoil-CoA:. Proteína N-myristoyltransferase Methods Mol Biol 116, 193-21 1

[00289] RT-PCR. qRT-PCR foi realizada com sondas Taqman NMT1 e NMT2 usando uma sonda de 18S como um controle interno. A diferença no número de tempos de ciclo (Act) foi calculada subtraindo o tempo de ciclo (CT) na qual podemos ver um aumento exponencial na expressão de 18S controle interno para cada tipo de células a partir do tempo de ciclo NMT, novamente em um ponto onde é visto aumento exponencial do sinal.

[00290] Mutação de locais de clivagem de caspase em V5- NMT por mutagênese local dirigido

[00291] Os locais de clivagem de caspase NMT1 e NMT2 identificados por sequenciamento de degradação de Edman (Alphalyse) foram mutados por mutagênese dirigida ao local. Portanto, foi utilizado anteriormente vetores clonados V5- NMT1 e V5-NMT2 de gateway para mutar os locais de clivagem caspase identificados. Por isso, o resíduo de Asp-72 de V5- NMT1 e os resíduos Asp-25, Asp-67 e Asp- 25,67 (mutante duplo) de V5-NMT2 foram mutados usando o kit de mutagênese dirigida ao local Quickchange® (Agilent Technologies), de acordo com as instruções do fabricante.

[00292] Resumidamente, a mutagênese dirigida ao local foi realizada utilizando 5 a 50 ng de dsDNA (vetor), 5 µl de tampão de reação lO x, 125 ng de iniciadores dissolvidos em água isenta de nuclease e foi trazido até um volume de reação final de 50 µl, com água livre de nuclease. 2,5 U de DNA polimerase PfuTurbo (Agilent Technologies) foi adicionado à mistura antes de se iniciar a reação, a qual foi realizada durante 18 ciclos no termociclador Eppendorf Mastercycler 1. Subsequentemente, o dsDNA parental foi digerido através da adição de 10 U de enzima de restrição Dpnl para cada reação e incubando durante 1 h a 37 ° C. Além disso, os primers para mutagênese dirigida foram projetados usando o programa PrimerX (^ttp: //www.bioinformatics.org/primerx) (listados na tabela 2.6). É importante ressaltar que os resíduos de aspartato (D) dos locais de clivagem caspase foram mutado em resíduos de glutamato (e) para gerar os seguintes vetores; V5-NMT1 (D72E), V5-NMT2 (D25E), V5-NMT2 (D67E) e V5-NMT2 (D25,67E). As mutações foram confirmadas por sequenciamento de DNA automatizado (MWG Eurofins Operon).

[00293] Geração de His-tag, vetores NMT truncados clivados pela caspase

[00294] O seguinte caspase clivada, STA truncados foram gerados por clonagem molecular; His-73NMT1, His-26NMT2 e His- 68NMT2. As sequências de DNA truncados foram clonadas no vector pET-19b (Novagen®), que tem um sequência hexa histidina N-terminal (His)-tag.

[00295] Vetores clonados de gateway Anteriormente, GFP e GFP-NMT1-NMT2 foram utilizados como moldes para estas reações de PCR. As reações de PCR foram realizadas utilizando DNA polimerase Platiem um Pfx® (Life Technologies) e as reações de PCR foram concebidas de acordo com as instruções do fabricante. Cada reação de PCR foi preparado como se segue; Molde de DNA 200 ng, 5 µl de tampão de amplificação 10X Pfx, 5 µl de solução potenciadora 10X PCR, MgS04 1 mM, mistura dNTP 0,3 mM, 0,5 µM cada um para a frente e primers (listadas na tabela 2.6), 1 U Platiem um Pfx® DNA reverter polimerase e água livre de nuclease até 50 µl. A reação foi criada no termociclador Eppendorf Mastercycler 1, de acordo com as orientações fornecidas com o kit Platiem um Pfx® de DNA polimerase e as reações foram realizadas em 30 ciclos.

[00296] A inibição de caspases

[00297] As células foram pré-tratadas com 10 µM de inibidores de caspase estabelecidos adquiridos de EMD Chemicals, 1 hora antes da indução de apoptose. Os inibidores da caspase utilizados foram inibidores de caspase geral (z- VAD-FMK), caspase-3 (Z-DEVD-FMK), caspase-8 (IETD-z-FMK), caspase-9 (z-LEHD-FMK) e contrele negativo (z-FA-FMK). As células de controle foram tratadas com DMSO (1:1000).

[00298] O tratamento das células com MG-132

[00299] As células IM9, KMH2, BL2 e Ramos foram plaqueadas (3x106 células por poço em uma placa de 6 poços) e tratou-se com 10 µM MG-132 durante 5 horas. Quantidade igual de DMSO foi adicionado às amostras de controle. As células foram então lisadas e sujeitas a SDS-PAGE / Western blot.

[00300] O tratamento das células com ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA)

[00301] As células IM9, BL2 e Ramos foram plaqueadas a 3x106 células por cavidade em uma placa de 6 poços e tratadas com 1 µM suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA), que é um inibidor reversível da classe I e classe II histona desacetilases (HDACs), durante 24 horas. Quantidade igual de DMSO foi adicionado às células como um controle. As células foram lisadas e sujeitas a SDS-PAGE as análises Western blot.

[00302] A indução de apoptose

[00303] 150 ou 300 ng / mL de anticorpo de murganho anti-Fas foi utilizado para estimular a apoptose através da via extrínseca e 2,5 µM estaurosporina (STS) foi utilizado para estimular a apoptose através da via intrínseca. Onde indicado, cicloheximida (5 ug / ml) foi usada para inibir a tradução de proteínas e para promover a morte celular.

[00304] O tratamento de células com o inibidor de NMT, ácido 2-hidroximirístico (HMA)

[00305] HMA foi saponificado e conjugado com albumina de soro bovino (BSA) antes da adição às células para facilitar a sua absorção celular, tal como descrito anteriormente (Yap et al., 2010). Resumidamente, HMA foi incubado com um excesso molar de 20% de hidróxido de potássio (KOH) a 65 ° C durante 15 min. Posteriormente, uma solução 20X foi preparada dissolvendo o KOH HMA saponificado em meio RPMI isento de soro contendo 20% de BSA livre de ácido graxo a 37° C, seguido por mais 15 minutos de incubação adicional a 37° C. Uma vez que o miristato de sódio foi usado como um controle, foi também incubado em meio RPMI isento de soro contendo 20% de BSA livre de ácido graxo a 37° C antes da adição às células. Subsequentemente, as células T de Jurkat (1 x 107 células) foram incubadas ou com HMA Imm ou miristato de sódio IMM conjugado com BSA isento de ácido graxo (concentração final em cultura de células de 1%) durante 1 h a 37 ° C em meio RPMI (sem FBS, suplementos ou antibióticos). Após a incubação, a apoptose foi induzida utilizando anticorpos anti-Fas (150 ng / mL) ou 2,5 (STS µM) com ciclo-heximida (5 ug / mL) ou veículo sozinho (DMSO). As amostras foram recolhidas a cada 2 horas durante um período de 8 h, lavou-se com PBS frio e lisadas com 0,3 mL de 1% de sulfato dodecil de sódio (SDS) -Radio-ensaio de imuno-precipitação (PIR A) de tampão e indivíduo a dois ciclos de sonicação durante 15 segundos a uma potência de 5,5-6,5 em um sonicador Branson e colocado em gelo durante 2 minutos entre cada ciclo.

[00306] O tratamento de linhagens de células linfocitárias com inibidor de NMT, Tris DBA

[00307] 2 x 10 6 células (CEM, L0, e BL2 Ramos) foram cultivadas em placas de 6 poços e incubadas com quantidades crescentes (0, 1, 2 e 5 ug / ml) de tris (dibenzilidenoacetona) dipaládio (Tris DBA) (Bhandarkar et al., 2008). A viabilidade das células tratadas com Tris DBA foi medida com um ensaio de exclusão com azul de tripano (Hudson, 1976).

[00308] O tratamento de linhagens de células linfocitárias com inibidores de NMT, DDD85646 e DDD73226

[00309] 1 x 10 5 células [KMH2 (linfoma de Hodgkins), IM9 (células B "normais" imortalizadas por EBV), BL2, Ramos] (100 µTAvell) foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas com quantidades crescentes de sulfonamida pirazole baseado NMT inibidor DDD85646 [peso molecular (MW) 495,43] (Frearson et al., 2010) e um menos potente baseado DDD73228 analógico -pirazole sulfonamida (MW = 362,5) por 24, 48 e 72 horas. Os fármacos foram dissolvidos em DMSO para fazer soluções de reserva 100X para cada concentração testada, de modo que o volume final de DMSO em cada cavidade foi de 1%. A viabilidade das células tratadas com estes inibidores foi medida com um ensaio de exclusão com azul de tripano (Hudson, 1976).

[00310] O tratamento de linhagens de células linfocitárias com inibidor de NMT, DDD86481

[00311] 1 x 105 células [KMH2 (linfoma de Hodgkin), IM9 (EBV imortalizada celular "normal" B), BL2, Ramos] (100 µl, Avell) foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas com quantidades crescentes de DDD86481 [PM 610,5]. Os fármacos foram dissolvidos em DMSO para fazer soluções de reserva 100X para cada concentração testada, de modo que o volume final de DMSO em cada cavidade foi de 1%. MTS [(3- (4,5-dimetiltiazol- 2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H- tetrazólio)] ensaio foi utilizado para medir a citotoxicidade do fármaco (Cory et al., 1991).

[00312] A lise celular

[00313] Tipicamente, as células foram lavadas em PBS a frio, colhidas, lisadas em tampão de 0,1% de SDS-RIPA ou 0,1% de tampão de SDS-RIPA-HEPES (quando as células foram marcadas com ácidos graxos-alcino) que foi suplementado com IX completa inibidor de protease. A suspensão de células foi sacudida durante 15 minutos a 4 ° C. os lisados celulares foram então centrifugados a 16.000 g durante 10 min a 4 ° C e o sobrenadante pós-nuclear foi recolhido. As concentrações de proteínas foram medidas utilizando kit de de ensaio de proteína ácido bicinconínico PierceTM (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).

[00314] Lise de amostras de tecido de linfoma

[00315] Tecidos de Linfoma difuso de grandes células B humano (LDGCB) e linfoma folicular (FL) foram cedidos pelo Dr. Raymond Lai (Cross Cancer Institut, Alberta, Canadá). Os tecidos de tumor congelados foram cortados em pequenas peças (~ 1 mm3) e misturado com 1% de SDS-IX RIPA com inibidor de protease completo. As amostras foram homogeneizadas usando um homogeneizador Dounce pequeno e, em seguida sonicado repetidamente durante 2 minutos com um mínimo de intervalos (em gelo) entre eles a uma potência de 6,0 (sonicador Branson 450) até que os tecidos tumorais foram dissolvidos no tampão de lise. As amostras foram em seguida centrifugadas a 16.000 g durante 10 min a 4°C e o sobrenadante pós-nuclear foi recolhido para análise de western blot.

[00316] Western blot usando o scanner Odyssey

[00317] Este método foi usado somente para a caspase-3 clivada blot fornecida em, todos os outros western blotting foram feitos usando o procedimento padrão. Após a electroforese, os géis foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose e bloqueados em 5% de NFM em PBS com 0,1% de Tween 20 (PBS-T) durante 1 hora. O anticorpo primário (Coelho anti-caspase-3 clivada; Cell Signaling) também foi diluído a 1: 2000 em 5% de NFM em PBS-T, adicionou-se à membrana e incubada durante 24 h. Em seguida, as membranas foram sujeitas a 6 ciclos de lavagem, durando 5 min cada; 2 lavagens em PBS, 2 lavagens em PBS-T e, finalmente, duas lavagens em PBS. O anticorpo secundário (Alex Fluor 680 cabra-anti-coelho; Life Technologies) foi adicionado após diluição em PBS-T (1: 5000) e as membranas foram cobertas com folha de alumínio e incubou-se com o anticorpo secundário durante lh e submetido ao mesmo 6X ciclo de lavagem com PBS e PBS-T como antes. As manchas foram digitalizadas no sistema de imagem Odyssey ® fluorescência de LI-COR Inc. em uma resolução de digitalização de 84 µin (Intensidade: 5-7) no canal 700 (para o coelho).

[00318] Fracionamento subcelular

[00319] As células HeLa foram crescidas até à confluência em placas de 150 mm e foram induzidas a sofrer apoptose com anti-Fas (300 ng / mL) (extrínseca) ou STS (intrínsecos) durante um período de 5 h. As células foram então marcadas metabolicamente com alcino-C14 (descrito em detalhe na secção a seguir) (Yap et al., 2010) e submetida a lise hipotônica.

[00320] Em resumo, as células foram lavadas com tampão PBS frio, raspadas das placas utilizando um tirante de células, e foi recolhido. As amostras foram em seguida centrifugadas a 2000 g durante 5 min, o sobrenadante foi aspirado e as células foram ressuspensas em 600 µl. de tampão hipotónico, que faz com que as células inchar (tampão de ressuspensão Mg) e incubado em gelo durante 20 min. A suspensão celular foi transferida para um homogeneizador de Dounce e homogeneizados com 45 movimentos usando o pilão apertado. Por conseguinte, 400 µl de tampão de homogeneização 2,5X isento de EDTA (HB) foi adicionado ao homogenato e as células foram homogeneizadas com 15 movimentos no homogeneizador de Dounce usando o pilão solto. O homogeneizado foi então centrifugado a 1000 g durante 5 min e o sobrenadante pós-nuclear (SNP) foi recolhido. Em seguida, 200 µl de PNS foi guardado e restante (-750 µl) foi centrifugado a 100.000 g durante 45 min em um rotor Beckman TLA 120.2, o que resultou em uma fração citosólica (SI 00) e uma pelete de membrana leve (P100).

[00321] O sedimento P100 foi lavado uma vez com 1 X HB e as frações P100 foram ajustados para o volume da fracção SI 00 cognato usando IX HB. Seguindo este, o sobrenadante resultante pós-nuclear (SNP), frações citosólicas (SI 00) e frações de membrana (P100) foram ajustadas para conter 1% de SDS. Por conseguinte, o mesmo volume de fração foi submetido a análise de níveis de proteína e western blot foram quantificados utilizando software de imagem J (http://rsbweb.nih.gov/ij).

[00322] Marcação metabólica de células usando ácido mirístico bio-ortogonal w-alquinil e clique químico

[00323] Marcação metabólica de células usando ácido mirístico w -alcinil

[00324] As células foram marcadas com ácido mirístico 100-25 µM M-alcinilo 30 min antes da colheita das células e lisaram-se em tampão de 0,1% de SDS-RIPA-HEPES. A proteína (50 -30 µg) a partir dos lisados celulares resultantes reagiram com 100 µM azido-biotina, utilizando o clique química e processada como descrito previamente (Yap et al., 2010). Resumidamente, as células foram privadas de ácidos graxos por incubação em meio (RPMI ou DMEM), as quais foram suplementadas com 5% carvão revestido por dextrano tratado com FBS (DCC-FBS) durante 1 hora antes da marcação. Em seguida, ácido mirístico w-alcinilo foi dissolvido em DMSO para gerar 25 ou 100 mM de soluções de estoque. Tipicamente, a absorção celular de ácido mirístico w-alcinilo tipicamente foi melhorado com a saponificação e a conjugação a BSA. Assim, antes da marcação, o ácido mirístico w-alcinilo foi saponificado com 20% de excesso molar de hidróxido de potássio a 65 ° C durante 15 min. Em seguida, o meio de cultura isento de soro (pré-aquecido), contendo 20% de BSA livre de ácido graxo a 37° C foi adicionado ao ácido mirístico w-alcinilo saponificado e incubou-se durante mais 15 min a 37 ° C.

[00325] Posteriormente, as células privadas de ácidos graxos foram lavadas uma vez com PBS quente e incubadas em fresco RPMI ou DMEM sem quaisquer suplementos. Em seguida, o volume adequado de 20X de ácido graxo-BSA em meio isento de soro foi adicionado às células, para assegurar que a concentração final do BSA foi de 1% e ? ácido alquinil mirístico foi na concentração indicada (25 µM ou 100 µM) para cada respectivo experimento. DMSO ou ácidos graxos não marcados conjugados com BSA foram usados como controles para as experiências realizadas. As células foram marcadas com ácido mirístico w-alcinilo durante 30 min a 37° C em uma incubadora de 5% de CO2 umidificado, antes da colheita. As células foram colhidas em tampão de 0,1% de SDS-RIPA-HEPES que foi suplementado com inibidor de protease IX completo (EDTA-livre).

[00326] Clique químico

[00327] Após a marcação das células com ácido w alquinil mirístico, os lisados resultantes foram sujeitados a clique química com azido-biotina para permitir a detecção das proteínas miristoiladas por ECL como descrito anteriormente (Yap et al., 2010). Tipicamente, os lisados de células (30 - 50 µg de proteína) foram ajustados para conter 1% de SDS e incubadas com 100 µM Tris- (benziltriazolilmetil) amina (TBTA), CuS04 1 mM, 1 mM Tris-carboxietilfosfeno (TCEP), e 100 µM azido-biotina a 37° C durante 30 minutos na escuridão, para que a reação prossiga a clique. Em seguida, 10 volumes de acetona resfriada em gelo foi adicionado para parar a reação de clique e as proteínas foram precipitadas a -20° C durante a noite. Subsequentemente, as proteínas precipitadas em acetona foram centrifugadas a 16.000 g durante 10 min, ressuspensas em tampão de amostra de SDS-PAGE IX com 20 mM de DTT. As amostras foram, em seguida, aquecidas a 95° C durante 5 minutos e sujeitadas a SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF para análise de Western blot.

[00328] O tratamento das membranas de PVDF com neutro Tris-HCl ou KOH

[00329] Amostras de proteína foram carregadas em duplicata em géis SDS-PAGE para os experimentos com membranas de PVDF foram tratados com KOH ou Tris-HCl neutro. Após a eletroforese, o KOH das membranas tratadas com PVDF foram incubados em 100 ml de 0,1 N de KOH em metanol [1 N de KOH em metanol: H20 1: 9 (v / v)], enquanto que o outro foi incubado em 0,1 N de Tris-HCl pH 7,0 em metanol [1 N de Tris-HCl, pH 7,0: metanol 1: 9 (v / v)] à temperatura ambiente durante 45 min com agitação suave. Subsequentemente, as membranas tratadas foram lavadas exaustivamente com PBS, sondadas com estreptavidina-HRP ou neutravidina-HRP e detectadas com ECL.

[00330] Ensaio de atividade de NMT radioativa em células que sofrem apoptose

[00331] Atividade NMT foi medida por adaptação de um protocolo desenvolvido no laboratório e Sharma (King e Sharma, 1991; Raju e Sharma, 1999). Uma solução fresca de estoque de [3H] miristoil-CoA foi preparado e sintetizada como descrito anteriormente (Towler e Glaser, 1986). Para fazer uma solução estoque de 200 µ't de [3H] miristoil-CoA, 97 µl, de tampão geração miristoílo-CoA foi combinado com 20 do DL ATP mM 50, 10D D DL de LiCoA mM 20, 60 µl, de pseudomonas acil -COA sintetase e 13 µl, de [9,10 - 3H] ácido -mirístico. A solução foi misturada suavemente e incubada a 37 ° C durante 30 min.

[00332] Para este ensaio, as células COS-7 transitoriamente transfectadas com plasmídeos que codificam para V5- NMT1 e V5-NMT2 foram induzidas a sofrer apoptose com STS (2,5 µM) e ciclo-heximida (5 µ A ini) ou não, e, colhidas em 0, 1, 2, 4 e 8 pontos h tempo. As células foram sonicadas usando um sonicador Branson 450 e ~ 20 µg de lisado (lisadas em 50 mM de NaH2P04 pH 7,4, 0,25 M de tampão de sacarose) foram utilizados para cada reação. Para cada reação de ensaio NMT, 3,85 µl, de tampão de ensaio NMT, 1,25 µ't, 20% de Triton X-100 e 2,5 µl, (0,1 mM) (BID G: GNRSSHSRLG) ou não- miristoláveis (BID A: ANRSSHSRLG) decapeptídeo (adquirido a partir do Peptídeo 2,0 Inc.) que corresponde à sequência N- terminal de ct-Bid (IMM estoque em etanol) foi adicionado a um tubo de microcentrífuga e foi mantida em gelo antes do inicio da reação. No início da reação, 7,4 µl, (10 pMol) de recém-sintetizado de [3H] miristoilo CoA foram adicionados a cada tubo de microcentrífuga contendo a mistura de ensaio NMT a intervalos de 15 segundos e 25 µ't, as reações foram incubadas durante 15 min a 30oC. A reação foi terminada através da identificação de 15 µl, da mistura de reação sobre um disco de papel de fosfocelulose P81 (Whatman) em intervalos de 15 segundos e seca com um secador de cabelo, durante 30 segundos.

[00333] Em seguida, os discos de papel de fosfocelulose p81 foram transferidos para a unidade de lavagem e lavou-se 3 vezes, 30 minutos cada, com tampão de lavagem NMT ensaio durante um período total de 90 min. Subsequentemente, a radioatividade remanescente na fosfocelulose (que corresponde ao peptídeo com ácido mirístico) foi quantificado em 5 mL de mistura de cintilação líquida usando um contador de cintilação Beckman Coulter LS6500. A atividade NMT foi calculada como fmol / min / µg de proteína.

[00334] O uso de um ensaio radioativo para medir a atividade NMT em NMTs His-marcados purificados.

[00335] A atividade NMT de comprimento completo e truncado marcada com His foram medidos utilizando o mesmo protocolo como descrito acima. No entanto, apenas 1 µg de proteína purificada (o volume foi levado até 10 µl, em tampão de ensaio NMT) foi utilizado neste ensaio.

[00336] Ensaio in vitro de clivagem NMT

[00337] O ensaio in vitro de clivagem NMT foi realizada através da incubação de 10 g de D purificado His-NMTl e His- NMT2 com 1 mg de -8 em caspase tampão ativo humano recombinante caspase-3 ou ensaio de clivagem em 100 µl, reações para 1 hora a 37 oC. A reação foi terminada com a adição de 10 µM inibidor de caspase geral z-VAD-FMK e, subsequentemente, tampão de carregamento de amostra 5X foram adicionados. Amostras reagidas foram separadas em um gel de 10% SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de PVDF. As bandas foram visualizadas por fragmentos de coloração azul de Coomassie e de clivagem foram excisadas da membrana e enviado para a degradação de Edman para Alphalyse em Palo Alto, CA.

[00338] Purificação de proteínas recombinantes de His- STA

[00339] Lemo21 (DE3) pLysS competentes (New England Biolabs) foram transformadas com His-NMTl e Seus-NMT2 vectores de acordo com o protocolo do fabricante. Proteínas NMT1 e NMT2 foram preparadas como se segue: uma cultura de arranque 3 ml foi cultivada em caldo LB (1% de triptona, 0,5% de extracto de levedura, 0,5% de NaCl, 100 ug / mL de ampicilina e 34 ug / mL de cloranfenicol) durante 4 h a 37oC, agitando a 225 rpm. A cultura inteira foi utilizada para inocular uma cultura de 50 mL que foi cultivado a 37 ° C durante 16 h. Em seguida, as células bacterianas foram sedimentadas por centrifugação a 6000 xg durante 10 min à temperatura ambiente. O sedimento bacteriano foi ressuspenso em 10 mL de LB e 5 mL de ressuspensão foi usada para inocular 500 ml de LB que foi incubada a 37 ° C com agitação vigorosa (225 rpm) até uma DO600 de 0,5 - 0,6 foi atingido.

[00340] Em seguida, a expressão da proteína foi induzida com 0,5 mM de isopropil-ß Dl-tiogalactopiranósido (IPTG) a 30oC adição com agitação vigorosa (225 rpm) durante 4 h. A suspensão foi centrifugada a 6000 xg, a 4 ° C durante 20 min e o sedimento bacteriano foi congelado durante a noite. Subsequentemente, o pelete bacteriano descongelado foi ressuspenso em 25 mL de tampão de lise bacteriana suplementado com inibidor de protease completo (CPI) de Roche e incubada em gelo durante 30 min. As amostras foram então sonicadas três vezes durante 1 min, com intervalos de um mínimo de entre a potência de 5.0 (Branson Sonfier 450) e incubados a 37 ° C durante 30 minutos antes de centrifugação a 15.000 xg durante 1 h a 4 ° C.

[00341] Enquanto isso, colares de agarose Ni-NTA (His- Pure resina Ni-NTA de Thermo Fisher Scientific) foram empacotados em colunas, de acordo com as instruções do fabricante e lavadas com tampão de coluna três vezes. O sobrenadante límpido obtido a partir da centrifugação anterior foi então carregado na coluna e incubada com agitação suave a 4 ° C durante 1 h. A amostra foi então eluida a partir da coluna por meio de fluxo por gravidade e a coluna foi lavada duas vezes com 5 ml de tampão de lavagem (tampão de coluna com 20 mM de imidazol, pH 8,0). Em seguida, 2 x 5 ml de tampão de eluição 1 (tampão de coluna com imidazole 75 mM, pH 8,0) foi usado para eluir as duas primeiras frações e 2 x 5 ml de tampão de eluição 2 (tampão de coluna com 150 mM de imidazole, pH 8,0) estava utilizado para eluir as próximas duas fracções. A última fração foi eluída com tampão de eluição 3 (tampão de coluna com 250 mM de imidazole, pH 8,0). Por fim, 20% de glicerol foi adicionado a cada uma das frações recolhidas antes de congelar a -80 ° C. As amostras de cada etapa do processo de purificação da proteína foram recolhidas, executadas em um gel de 12,5% SDS-PAGE e coradas com azul de Coomassie, a fim de determinar que a fração (s) que têm a maior concentração de proteína.

[00342] Uma vez que as amostras a partir dos primeiros quatro eluições teve a mais alta concentração de proteína, foram reunidas e dialisadas para remover qualquer imidazol presente. Assim, as amostras reunidas foram carregadas em Spectra / Por 2 (Spectrum Laboratories) tubagem de diálise com um peso molecular de corte (MWCO) 12 - 14 kDa, para remover quaisquer pequenos fragmentos de proteínas degradadas. As amostras de proteína foram então dialisadas em 4 L de tampão de diálise refrigerada durante 2 horas a 4 ° C com agitação suave, seguindo-se a diálise durante a noite com o mesmo tampão a 4 ° C com um adicional de 4 L de fresco, tampão gelado. As amostras de proteína foram dialisadas concentrada por fiação em Amicon Ultra-15 filtro centrífugo com MWCO de 30 kDa (Millipore), a 5.000 g, 4 ° C até que foram atingidos os volumes desejados.

[00343] qRT-PCR de linhagens de células de linfoma de células B

[00344] O RNA foi isolado a partir de células IM9, KMH2, Ramos e BL2 usando Trizol® reagente de acordo com os protocolos do fabricante. Em seguida, o kit High Capacity cDNA de transcrição reversa com um esquema de iniciadores aleatórios a partir de Applied Biosciences foi utilizado para sintetizar DNAc a partir do RNA isolado, de acordo com as instruções do fabricante. Reações de PCR quantitativo em tempo real (qRT PCR) foram definidas usando o TaqMan® Universal Master Mix II e NMT1, NMT2 e 18 sondas Taqman® compradas da Life Technologies (Carlsbad, CA) e três repetições de cada reação foram criadas de acordo com a orientações do fornecedor. qRT PCR foi realizada em um termociclador Mastercycler® ep realplex (Eppendorf) e os resultados foram analisados utilizando o software Realplex (Eppendorf).

[00345] Ensaio de Exclusão Trypan Blue

[00346] A viabilidade das células tratadas com Tris DBA, DDD73228, e DDD85646 foi medida através da incubação de células com Trypan Blue Dye TC10TM (Biorad) (Hudson, 1976), de acordo com as instruções do fabricante. A viabilidade celular foi então quantificada utilizando o contador de células automatizado TC10TM (Biorad).

[00347] MTS [(3- (2-ilo 4,5-dimetiltiazol) -5- (3- carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio)] Ensaio

[00348] A viabilidade das células tratadas com DDD86481 foi medida usando o ensaio de proliferação celular não radioactivo CellTiter 96 Aqueous (MTS) (Cory et al., 1991) a partir de Promega de acordo com as instruções do fabricante.

[00349] A imunohistoquímica

[00350] Tumores de linfoma de células B foram fixados em formalina e embebidos em parafina e cortado em um micrótomo de espessura desejada (~ 5 microns ou µm) e fixada em um Superfrost® mais corrediça carregado positivamente (Fisher Scientific). Antes da coloração, as lâminas contendo tecidos tumorais foram desparafinizadas, por imersão em xileno 3 vezes durante 10 minutos cada, uma série de lavagens com etanol [20 mergulhos em 100% de etanol (4 vezes) repetir, 20 mergulhos em etanol a 80%, e 20 imersões em 50% de etanol] e uma lavagem final em água corrente fria por 10 min.

[00351] Para a recuperação de antígeno, as lâminas foram colocadas em porta-lâminas e colocou-se em uma panela de pressão de microondas Nordicware® e 800 mL de 10 mM de tampão de citrato de pH 6,0 foi adicionado a ele. A panela de pressão foi bem fechado, colocado em um forno de microondas e microondas em alta por 20 min. Em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente fria durante 10 min. O bloqueio da peroxidase foi realizada por lâminas de imersão em 3% de H2O2 em metanol durante 10 minutos e lavagem com água corrente quente durante 10 minutos antes da lavagem em PBS durante 3 min.

[00352] Em seguida, o excesso de PBS foi removido e um círculo hidrofóbico foi desenhada ao redor da amostra com uma caneta PAP (Sigma-Aldrich). anti-NMTl de coelho (Proteintech) ou anti-NMT2 de coelho (Origene) foram diluídos com tampão diluente de anticorpo da Dako (Dako, Agilent Technologies) a 1: 50 de diluição e adicionados com uma pipeta de Pasteur (400 DL por lâmina) e incubadas em uma umidade durante a noite câmara a 4oC. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em PBS duas vezes durante 5 min cada e ~ 4 gotas de DAKO EnVision + Sistema-polímero marcado com HRP (anti-coelho) (Dako, Agilent Technologies) foi adicionado a cada lâmina e incubaram-se à temperatura ambiente durante 30 min. As lâminas foram lavadas novamente duas vezes em PBS durante 5 min cada, 4 gotas de DAB líquido (diaminobenzidina) + substrato cromogénio (preparado de acordo com as instruções do fabricante; Dako, Agilent Technologies) foi adicionado, desenvolvida durante 5 minutos e enxaguada com água fria corrente durante 10 min.

[00353] As lâminas foram então embebidas em 1% CuS04 por 5 min, lavadas brevemente com água corrente fria, contra- coradas com hematoxilina para 60 seg e enxaguada com água fria corrente até que a água tornasse clara. Em seguida, as lâminas foram mergulhadas em carbonato de lítio 3 vezes e enxaguada com água corrente da torneira brevemente. As lâminas foram então desidratadas em uma série de passos; 20 mergulhos em etanol a 50%, 20 mergulhos em etanol a 80% e 20 mergulhos em 100% de etanol (repete 4 vezes) e, finalmente, em xileno (3 vezes em 10 min cada). As lamelas foram então adicionadas às lâminas de microscopia e as amostras de tumor foram realizadas usando uma Nikon Eclipse 80i microscop. Imagens foram criados usando uma câmera científica Qlmaging (Qimaging).

[00354] Exemplo 1

[00355] A Figura 1 representa a análise de expressão NMT1 e NMT2 em células normais e vários linfomas de células B e leucemias de células T. Esta figura mostra a quase ausência completa da expressão de NMT2 em linhagens celulares de linfoma B (BL-2, Ramos), que expressam apenas NMT1 em comparação com as células B normais (linfócitos B humanos transformados com EBV, L0) e linhagens de células T leucêmicas humanas (Jurkat, MOLT-4, CEM).

[00356] Embora não se deseja estar limitado pela teoria, as células que expressam apenas uma isozima NMT, por exemplo células de linfoma de Burkitt, que mostra a quase completa ausência de NMT2, são susceptíveis de ter perfis alterado de proteínas com ácido mirístico.

[00357] Uma amostra que possui uma quantidade reduzida de proteína miristoilada em uma amostra (opcionalmente, em comparação com um controle) é indicativa de uma amostra deficiente NMT, ou câncer deficiente NMT. Tal câncer deficiente NMT é adequado para tratamento com um inibidor ou NMT1.

[00358] Exemplo 2

[00359] A figura 2 mostra a sensibilidade de vários linfomas de células B e leucemias de células T para inibidores NMT de tris-dibenzilidenoacetona-dipaládio (Tris-DBA). Várias células B e T foram incubadas durante 24 h com concentrações crescentes de Tris DBA. A viabilidade celular foi medida utilizando o método de exclusão de azul de tripano e ajustou-se 100% de controle. As curvas de sobrevivência celular medido por exclusão de azul de tripano mostram que os linfomas de células B são mais sensíveis ao inibidor de tris- dibenzilidenoacetona-dipaládio NMT (Tris-DBA).

[00360] Exemplo 3

[00361] A Figura 3 descreve a inibição de N- miristoiltransferase (NMT) por tris-dibenzy lideneacetone- dipaládio (Tris-DB A).

[00362] Atividade NMT foi ensaiada utilizando um ensaio de peptídeo miristoilação com NMTl recombinante purificada e NMT2. Atividade NMT foi calculada a partir da quantidade de miristoilpeptídeo radiomarcado produzido e detectado no papel de fosfocelulose (adaptado de King et al., 1991, Anal Biochem.).

[00363] Esta figura mostra que o tris- dibenzilidenoacetona-dipaládio (Tris DBA) NMT inibe in vitro utilizando enzimas purificadas NMTs recombinantes.

[00364] Exemplo 4

[00365] A figura 4 ilustra os resultados de immunoblotts em que as linhas celulares de linfoma foram sondadas com anticorpos contra NMT 1 (Painel A) e NMT 2 (painel B). A legenda da figura 4 corresponde a seguinte: IM9: B linfoblasto; BL2: linfoma de Burkitt; CEM: leucemia de células T; Karpas 299: linfoma de células T; Sup-M2: ALCL; UCONN: ALCL (ALCL: o linfoma de grandes células anaplásico); DAUDI: linfoma de Burkitt; Ramos: o linfoma de Burkitt BJAB: linfoma de Burkitt; HD-MYZ: Linfoma de Hodgkin; KM-H2: linfoma de Hodgkin; L428: linfoma de Hodgkin; Jurkat: leucemia de células T.

[00366] Exemplo 5

[00367] A Figura 5 ilustra a eficácia dos inibidores NMT na linhagem celular ramos em linfoma de Burkitt em comparação com a linhagem imortalizada de células normais linfocítica B (IM9) depois de 48 horas, em diferentes concentrações.

[00368] Exemplo 6

[00369] Neste exemplo, a transfecção de células de linfoma B Ramos (que, como mostrado aqui, expressa NMTl) com pcDNA3.1-V5-NMT2 aumentou a sobrevivência TrisDBA (5 ug / ml) em 2,5 vezes versus as células de controle transfectadas com vector vazio plasmídeo. Na Figura 6, 20 X 106 células de linfoma B Ramos foram transfectadas com DNA de 32µg (PcDNA3.1-V5-vazio ou pcDNA3.1-V5-NMT2) utilizando o Sistema de Transfecção de néon (Invitrogen) seguindo o protocolo recomendado para linhagem celular Ramos (1350 Volt, 30 ms). As células transfectadas foram centrifugadas 5 minutos a 1200 rpm para remover as células mortas e detritos celulares. As células presentes no sobrenadante foram deixados a recuperar durante 6 horas em completa RPMI. Após uma lavagem com PBS, as células foram ressuspensas e cultivadas em meio RPMI contendo TrisDBA (5 ug / ml) durante 24 horas, em seguida, contou-se utilizando o método de exclusão de azul de tripano (Painel A). As células foram lisadas e western blotting (ECL) foi realizada para confirmar a expressão NMT2 com anticorpos contra NMT2, GAPDH e de controle de carga (Painel B).

[00370] Exemplo 7

[00371] Neste exemplo, qRT-PCR foi realizada com TaqMan e sondas NMTl e NMT2 usando uma sonda 18S como um controle interno. A diferença no número de tempos de ciclo (Act) foi calculado subtraindo o tempo de ciclo (CT) na qual podemos ver um aumento exponencial na expressão de 18S controle interno para cada tipo de células a partir do tempo de ciclo NMT, novamente em um ponto onde é visto aumento exponencial do sinal. Como mostrado na Tabela 1, abaixo, o rácio de NMT2 a expressão é diminuída NMTl (até 60 vezes) em linhas celulares de linfoma B. Embora não desejando estar limitado pela teoria, estes resultados podem sugerir que essa redução na codificação de mRNA para NMT2 pode ser responsável pela redução dos níveis de proteína NMT 2 avaliadas por transferência de Western.

[00372] A Tabela 1 Análise da expressão de RNAm de NMT por qRT-PCR

[00373] Exemplo 8

[00374] Neste exemplo, na Figura 7, as diferenças nos níveis de proteína NMT2 presentes em várias linhagens de células linfocíticas e tumores de linfoma sólidos são mostrados. (A) Níveis de NMTl e NMT2 são avaliados por western blotting de vários tipos de linfoma humano sólido (linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) e linfoma folicular (FL) lisados tumorais. STA foi detectado por Western blotting usando as mesmas concentrações de anticorpos para ambos os painéis mostrados: anti-NMTl de coelho (1: 2500), anticorpo monoclonal anti-NMT2 (1: 2500). Mostra-se que em numerosas amostras de tumores de cada tipo de queda sob a média do nível de expressão NMT2 (0,392 + / _ 0,30).

[00375] No Painel A, mostra-se que as linhagens celulares de linfoma de Burkitt BL-2, Daudi, Ramos e BJAB são desprovidos de NMT2.

[00376] No Painel B, é mostrado que 4 das 5 DLBCL e um de 6 FL lisados tumorais humanos têm acentuada diminuição na NMT2.

[00377] Exemplo 9

[00378] Neste exemplo, na Figura 8, painéis A e B, as diferenças nos níveis de proteína NMT2 presentes em vários tumores de linfoma sólidos foram determinados por imunohistoquímica:

[00379] Tumores de linfoma de células B foram fixados em formalina e embebidos em parafina e cortado em um micrótomo de espessura desejada (~ 5 microns ou µin) e fixada em um Superfrost® mais corrediça carregado positivamente (Fisher Scientific). Antes da coloração, as lâminas contendo tecidos tumorais foram desparafinizadas, por imersão em xileno 3 vezes durante 10 minutos cada, uma série de lavagens com etanol [20 mergulhos em 100% de etanol (4 vezes) repetir, 20 mergulhos in80% de etanol, e 20 imersões em 50 % de etanol] e uma lavagem final em água corrente fria por 10 min.

[00380] Para a recuperação antigênica, as lâminas foram colocadas em porta-lâminas e colocou-se em uma panela de pressão de microondas Nordicware® e 800 mL de 10 mM de tampão de citrato de pH 6,0 foi adicionado a ele. A panela de pressão foi bem fechado, colocado em um forno de microondas e microondas em alta por 20 min. Em seguida, as lâminas foram lavadas em água corrente fria durante 10 min. O bloqueio da peroxidase foi realizada por lâminas de imersão em H202 a 3% em metanol durante 10 minutos e lavagem com água corrente quente durante 10 minutos antes da lavagem em PBS durante 3 min.

[00381] Em seguida, o excesso de PBS foi removido e um círculo hidrofóbico foi desenhada em redor da amostra com uma caneta PAP (Sigma-Aldrich). Anti-NMTl de coelho (Proteintech) ou anti-NMT2 de coelho (Origene) foram diluídas com tampão diluente de anticorpo da Dako (Dako, Agilent Technologies) a 1:50 de diluição e adicionados com uma pipeta de Pasteur (400 mL por lâmina) e incubadas em uma umidade durante a noite câmara a 4oC. Posteriormente, as lâminas foram lavadas em PBS duas vezes durante 5 min cada e ~ 4 gotas de DAKO EnVision + Sistema-polímero marcado com HRP (anti-coelho) (Dako, Agilent Technologies) foi adicionado a cada lâmina e incubaram-se à temperatura ambiente durante 30 min. As lâminas foram lavadas novamente duas vezes em PBS durante 5 min cada, 4 gotas de DAB líquido (diaminobenzidina) + substrato cromogênico (preparado de acordo com as instruções do fabricante; Dako, Agilent Technologies) foi adicionado, desenvolvida durante 5 minutos e enxaguada com água fria corrente durante 10 min.

[00382] As lâminas foram então embebidas em 1% CuS04 por 5 min, lavadas brevemente com água corrente fria, contra- coradas com hematoxilina para 60 seg e enxaguada com água fria corrente até que a água correu clara. Em seguida, as lâminas foram mergulhadas em carbonato de lítio 3 vezes e enxaguada com água corrente da torneira brevemente. As lâminas foram então desidratadas em uma série de passos; 20 mergulhos em etanol a 50%, 20 mergulhos em etanol a 80% e 20 mergulhos em 100% de etanol (repete 4 vezes) e, finalmente, em xileno (3 vezes em 10 min cada). As lamelas foram então adicionadas às lâminas de microscopia e as amostras de tumor foram realizadas usando uma Nikon Eclipse 80i microscop. Imagens foram criados usando uma câmera científica Qlmaging (Qimaging).

[00383] Coloração imunohistoquímica NMT dos gânglios linfáticos normais, linfoma de Burkitt (BL) e linfoma difuso de grandes células B (LDGCB ou LCL). A) coloração NMT1: Ambos os linfonodos normais, e cada um dos três casos independentes de não tratada linfoma de Burkitt (BL1-3) e DLBCL (LCL 1-3) coloração uniforme e fortemente positiva (cor marrom produto da reação peroxidase [mostrada na cor cinza escuro] ) para a proteína NMT1. Não foram observadas diferenças. O controle negativo foi obtido através da omissão do anticorpo primário. Linha superior: Nl, linfonodos normais N2, controle negativo Neg. Linha do meio: três linfoma de Burkitt (BL1-3) casos. Linha inferior: três DLBCL (LCLl-3) casos. Ambos os linfonodos normais e linfoma mostram manchas fortes. B) coloração NMT2: Ambos os nós linfáticos normais manchar uniforme e fortemente positiva (cor Brown, mostrado na cor cinza escuro) para a proteína NMT2. Em contraste marcante, cada um dos três casos de linfoma não tratada independentes Burkitt e DLBCL mostrar apenas coloração muito fraca para NMT2 (mostrado como cinza claro ou azul claro). O controle negativo foi obtido através da omissão do anticorpo primário. Linha superior: Nl, linfonodo normal de N2, Controle negativo Neg. Linha do meio: três linfoma de Burkitt (BL1-3); Linha inferior: três DLBCL (LCLl-3).

[00384] Na Figura 8, Painel C e Painel D demonstram que a expressão de NMT1 não é significativamente aumentada em linhagens de células que não possuem expressão NMT2. No painel C, o log2 (micro-matriz intensidade de fluorescência NMT) para NMT1 e NMT2 é traçada para todas as linhagens de células de banco de dados LECC. No Painel D, o log2 (micro-array intensidade de fluorescência NMT) para NMT1 e NMT2 é traçado para as linhagens de células 100 do banco de dados LECC com o menor nível de expressão NMT2.

[00385] Na Figura 8, o Painel E mostra um exemplo em que os ensaios foram quantificados utilizando NMT2 luz assistidas por computador densitométricos microscópicas. Visualmente, estes números relacionados bem para a força de coloração dos linfócitos malignos. Os pontos de corte escolhidos eram fortes vs sem coloração / fraco.

[00386] Exemplo 10

[00387] Neste exemplo, na Figura 9, a viabilidade residual de várias linhagens de células linfocíticas B tratados com DDD85646 durante 72 horas é mostrado (Figura 9A). As curvas na figura 9A foram calculadas de acordo com uma equação de quatro parâmetros, como descrito em Leatherbarrow, RJ (2009) GraFit versão 6, Erithacus Software Ltd., Horley, Reino Unido para a análise GraFit usando a equação:

[00388]

[00389] em que a amplitude é o valor desinibida equipada menos o fundo, e s é um fator de inclinação. A equação assume que y diminui com o aumento de x. A e B. Pontos combinados (n = 4).

[00390] Na Figura 9, Painel A, as concentrações crescentes de DDD85646 foram usadas para tratar as linhagens celulares (BL BL-2) e Ramos, juntamente com os controles relevantes [IM9 (linfócitos "normal" B) e KMH2 (linhagem de células HL) que expressa tanto STA]. Um ensaio de azul Trypan foi utilizado para medir a citotoxicidade da DDD85646 aos 24, 48 e 72 horas. Embora os dados foram recolhidos a 24h e 48h pontos de tempo (dados não mostrados), o efeito mais notável da DDD85646 foi observada no ponto de tempo de 72 horas.

[00391] As taxas de sobrevivência foram reduzidas nas linhagens de células de linfoma B utilizados (Ramos: DDD85646 CE 50 = 0,37 +/- 0, 05 µM e BL2: DDD85646 CE 50 = 0,43 +/- 0,2 µM) de uma forma dependente da concentração DDD85646. As taxas de sobrevivência de linhagens de células de controle, IM-9 (DDD85646 CE 50 = 7,08 +/- 2,32 µM) e KMH2 (DDD85646 EC50 = 29,6 +/- 10,6 µM) foram maiores. Os dados de EC50 estão resumidos como se segue.

[00392] A Tabela 2

[00393] DDD85646 exibiu uma EC 50 baixo (a concentração que mata 50% das células cancerosas) em células BL, e exibiu um EC50 maior em células HL (KMH2). Assim, DDD85646 exibiu um índice de morte seletiva de alta para as células cancerosas. Tal como aqui utilizado, define-se o índice de morte seletiva como o razãoda EC50 de célula B imortalizada "normal" / EC50 de células malignas. O índice de morte seletiva para DDD85646 foi de 16,4 e 19,1 para as células BL-2 e Ramos, respectivamente.

[00394] Na Figura 9, Painel B, DDD86481 foi utilizado para tratar células BL e linhagens de células de controle [IM9 (linfócitos "normal" B) e KMH2 (linha de células HL) que expressa tanto STA]. A viabilidade celular foi medida utilizando o ensaio NMTs às 48h e 72h, ainda não observamos uma mudança significativa para a viabilidade celular às 48h (dados não mostrados), verificou-se que a taxa de sobrevivência das linhagens celulares BL testadas diminuiu significativamente no 72 h ponto de tempo (Ramos: DDD86481 EC50= 42 nM e BL2: DDD86481 EC50 = 58 nM) de um modo dependente da concentração DDD86481. As taxas de sobrevivência das linhagens de células de controle, IM-9 (DDD86481 EC50 = 2,2 µM) e KMH2 (DDD86481 EC50 = 12,6 µM), foram maiores. O índice de morte seletiva calculado para DDD86481 foi de 37,9 e 52,3 para as células BL-2 e Ramos, respectivamente. Os dados de EC50 estão resumidos como se segue.

[00395] A Tabela 3

[00396] [00210] [00209] A seguinte tabela, apresentando a descrição do tipo de célula e EC50 para DDD85646 e DDD864841, células de linfoma B (BL-2 e Ramos) que expressam apenas um NMT (NMT1) são -15-72 vezes mais sensíveis para DDD85646 ou DDD86481 que as células B imortalizadas "normais" ou linhagens de células de linfoma não-Hodgkin que expressam ambos os NMTs.

[00397] A Tabela 4

[00398] A tabela a seguir apresenta um resumo dos EC50 farmacológicos e dados EC90 para DDD86481 em linhagens celulares de linfoma de Burkitt (LB-2 e Ramos) e células B imortalizadas "normais" (dados calculados a partir da Fig. 9B).

[00399] Os índices de seletividade mostram as relações entre as CE50 e EC90, o que indica que DDD86481 preferencialmente mata as células cancerosas por um fator > 300 vezes (uma vez que, a concentração necessária para matar a linhagem de células B normais é muito maior).

[00400] A Tabela 5

[00401] Na Figura 9C, DDD73226, foi usada para tratar linhagens celulares (BL-2 e Ramos), juntamente com os controles relevantes [IM9 (linfócitos B "normal") e KMH2 (linhagem celular HL) que expressa ambos NMTs)]. A citotoxicidade de DDD73226 foi medida usando um ensaio de exclusão com azul de tripano às 72h. Não se observaram alterações significativas para a viabilidade celular às 24 e 48 horas (dados não mostrados). Além disso, não houve mudança significativa na viabilidade de IM9, KMH2 e as células de Ramos, quando as células foram tratadas com DDD73226 a concentrações tão elevadas como 100 µM no ponto de tempo de 72 horas. Houve, contudo, uma ligeira diminuição na viabilidade celular observada em células tratadas com BL2 em 100 µM de DDD73226 às 72 horas, quando comparado com outras células. Embora não desejando ser limitados pela teoria, isto pode ser porque, além de ter diminuído severamente níveis NMT2, BL2 também tem níveis mais baixos quando comparados com NMTl Ramos e outras linhagens de células e, portanto, pode ser mais sensível à ação ainda de inibidores NMT menos potente.

[00402] Na Figura 9D (painéis i e ii), em uma experiência ao longo do tempo é apresentada, em que as células IM-9 e BL2 foram marcadas com 100 µM w-alcinil- miristato de lh após tratamento com DDD86481 (0, 1 e 10 µM) durante 0, 1 ou 4 horas. As amostras de proteínas reagiram com azido-biotina, utilizando clique química e visualizados por western blot com NeutrAvidin ™ -HRP. A ação inibidora de DDD86481 foi rápida, com uma inibição quase completa de miristoilação nas células (tanto IM-9 e BL2) tratada com 1 µM DDD86481 depois de uma hora de tratamento.

[00403] Na Figura 9 E, a dose mínima de DDD86481 necessária para inibir em miristoilação IM-9, e linhagens de células BL2 e Ramos, foi determinada. As células foram tratadas com DDD86481 a 0, 10, 50, 100, 500 e 1000 nM concentrações durante 2 h com marcação metabólica celular com miristato-alquinil na última lh de tratamento. Miristoilação DDD86481 inibiu de uma maneira dependente da concentração em todas as linhagens celulares testadas. Linhagens celulares BL-2 e Ramos foram mais sensíveis à ação inibidora de DDD86481, como uma diminuição na incorporação do marcador alquino-miristato nas proteínas miristoiladas foi aparente a partir de 50 nM para ambas as linhagens celulares do LB quando comparado com IM-9 onde incorporação de rótulo alcino- miristato diminuição começando na concentração de 100 nM.

[00404] A Tabela 6 mostra a caracterização pré-clínico preliminar de DDD85646 ou DDD86481

[00405] Exemplo 11

[00406] Neste exemplo, na Figura 10, a sensibilidade de vários linfócitos B normais imortalizadas LO (obtido do Dr. Riabowol, U. of Calgary), células de linfoma B malignas (Ramos e BL2), e, leucemia das células T (CEM ) é mostrada para o inibidor NMT TrisDBA durante 24 horas (A) a viabilidade residual de várias linhagens de células tratadas com TrisDBA durante 24 horas (n = 9) (B) Efeito sobre a atividade de TrisDBA N-miristoyltransferase em células COS7 que expressam transitoriamente NMT1 ou NMT2 incubadas durante 24 h com TrisDBA. In vitro do IC50 para TrisDBA é de aproximadamente 2 µM para NMT1 e 5 µM para NMT2. As linhagens celulares de linfoma de Burkitt e Ramos BL-2 são mais sensíveis ao inibidor TrisDBA NMT.

[00407] Exemplo 12

[00408] Neste exemplo, na Figura 11, os níveis de expressão em NMT a 967 linhagens de células de câncer da enciclopédia (LECC) do banco de dados foi determinada. Painel A) O banco de dados LECC foi consultado para a expressão de NMT1 e NMT2 e respectivos níveis de NMT foram plotados. NMT2 mostra uma grande variedade de expressão (-3-11) em comparação com NMT1 (~ 6 - 9). Painel B) Box-Whisker de linhagens celulares de câncer de vários subtipos de câncer são plotados e comparados com o enredo de todas as 967 linhagens celulares de câncer. Testes-t de Student foram realizados comparando cada grupo para todos os tumores. ** Denota valores p <0,001. Painel C) O banco de dados LECC foi consultado para as 50 linhagens de células que expressam os níveis mais baixos NMT2 e mostrados em um formato de tabela. Linhagens de células de tumor derivadas de vários tecidos linfóides e hematopoiéticas representam 76% (38 de 50) das linhagens de células que expressam e menor NMT2 são destacadas em várias cores.

[00409] Exemplo 13

[00410] Neste exemplo, na Figura 12, NMTs são clivados durante a apoptose, mas permanecem ativo. Painel A e B. Os lisados de células Jurkat induzidas para sofrer anti-Fas ou estaurosporina apoptose mediada foram sondadas com anti-NMTl e anti-NMT2 por Western blotting e apresentam um tempo de clivagem dependente de ambas as enzimas. Western blotting foi realizado nas mesmas amostras utilizando anticorpos contra PAK2 e GAPDH. Painel C e D. A incorporação de w-alcinil- miristato em células Jurkat induzidas para sofrer anti-Fas ou estaurosporina apoptose mediada ilustra uma alteração nos perfis miristoilados como células que começam a morrer e sugerem que, embora os NMTs são clivados ainda estão ativos. As células Jurkat foram marcadas metabolicamente com 25 µM- alquinil-miristato após a indução da apoptose com anti-FAS (LOONG / ml) e ciclo-heximida (5 µg / mL) (C) ou estaurosporina (2,5 µM) e ciclo-heximida (5 ug / ml) (D). As amostras de proteínas foram feitas reagir com azido-biotina, utilizando o clique química e visualizados por western blotting com NeutrAvidinTM-HRP. Antes da avaliação da incorporação de marcação por Western blotting de membranas foram incubadas em 0,1 M de KOH (B e D). Painel (E) nas diferentes datas indicadas, atividade NMT foi testada usando ct-Bid N-terminal decapeptido e [3H] miristoil-CoA. Embora ambas as enzimas NMT sejam clivadas, ambas permanecem cataliticamente ativo e apenas NMTl exibe uma perda significativa de atividade. (F) Reconstituição da clicagem de NMTl por caspases-8 e -3, e, clivagem NMT2 por caspase-3 in vitro (gel corado com Coomassie). Purificou-His-His-NMTl e NMT2 (5 µg de cada) foi incubada com a caspase activa 3 e 8 (500 ng de cada) durante 1 hora a 37 ° C. Um inibidor de caspase geral (z-VAD-fmk) foi adicionado para parar a reação a partir de prosseguir no final da incubação. As amostras foram imediatamente fervidas com tampão de carregamento de amostra 5x com beta-mercaptoetanol e carregadas em um gel de acrilamida a 10% e transferidas para uma membrana de PVDF. A membrana foi depois corada com azul de Coomassie para visualizar as proteínas. Os fragmentos clivados, que foram enviados para a degradação Edman estão em caixa e permitiu a identificação de locais de clivagem caspase em NMTl após D72 e NMT2 após D25 e D67.

[00411] Exemplo 14

[00412] Neste exemplo, na Figura 13, a purificação de GST recombinante e His6-tag hNMTl e hNMT2 é mostrado. O painel (A) de GST-NMT1 e (B) purificação em agarose de glutationa GST-NMT2, (C) e His6-NMT1 (D) His6-NMT2 purificação por cromatografia em Ni-quelante e cromatografia de permuta iônica Resource S. Na figura 13, Painéis C e D, as faixas são como se segue. O painel (C) Gela: Purificação de NMT1: 1) Todos marcadores azul, 2) piscina coluna de Ni-NTA, 3) piscina de filtração em gel, 4) de FT Resource S, 5) Fracção 8 (f8), 6) 16 f, 7) f 18, 8) FL9, 9) 120, 10) 121, 11) 122, 12) ft 1, 13) f42, 14) F66, 15) F67. O painel (D) Gel B: Purificação de NMT2: 1) Todos marcadores azul, 2) Ni- NTA piscina coluna, 3) piscina de filtração em gel, 4) de FT Resource S, 5) Fracção 21 (121), 6) 128, 7) 138, 8) 139, 9) f40, 10) F41, 11) f42, 12) F44.

[00413] Exemplo 15

[00414] Neste exemplo, na Figura 14, a comparação das atividades enzimáticas entre purificada de comprimento total recombinante His6-NMT1 e recombinante "truncado-caspase" ct- Hise-NMTl é mostrado. Full-length Sua 6 -NMT1 (aa 73-496). Atividade NMT foi ensaiada utilizando um ensaio de peptídeo miristoilação adaptado de King et al. 1999, Anal Biochem. Experimentos em duplicado.

[00415] Exemplo 16

[00416] Neste exemplo, na Figura 15, a comparação da EC50 e IC50 de vários inibidores NMT e diferentes linhagens de células é mostrada. O gráfico mostra a correlação entre a potência da bioquímica de 8 inibidores NMT no ensaio bioquímico enzimático (CI50) e a sua potência em um ensaio de viabilidade celular azul de alamar 7 utilizando linhagens celulares (EC50). A análise de regressão foi realizada em cada linhagem celular e deu um valor médio de 0,9 R2 (escala O,82 - 0,96). Este elevado grau de correlação entre os vários IC50 e EC50 é uma forte evidência de que a atividade das moléculas no ensaio de viabilidade das células é devido à sua atividade inibitória em NMT. Note-se que dois pares de moléculas possuem potências semelhantes no ensaio bioquímico.

[00417] Exemplo 17

[00418] Neste exemplo, na Figura 16, indução de DDD86481 de apoptose em células BL é mostrado.

[00419] Linfócitos B imortalizadas "Normal" (IM9), KMH2 (linfoma de Hodgkin) e BL (BL2 e Ramos) as células foram incubadas com concentrações crescentes (nM) de DDD86481 e monitoradas a clivagem de polimerase- poli-ADP-ribose 1 (PARP-1) e caspase-3, depois do ponto de tempo de 72 horas. Western blotting foi realizada em lisados de células para monitorizar a clivagem ou PARP-1 e a caspase-3, bem como a presença de GAPDH como controle de carga (géis compósitos). Tanto a PARP-1 e a caspase-3 de clivagem ocorreu de um modo dependente da dose, quando as linhas celulares do LB foram tratadas com o inibidor, indicando que estas células sofrem apoptose. Nenhuma PARP-1 ou caspase-3 clivagem foi observada nas células "normais" IM9 tratados com o inibidor. PARP-1 em células de clivagem (HL) KMH2 foi observada em concentrações mais elevadas, embora foi mínima quando comparada com a clivagem de PARP-1 observado nas células BL. Assim, verificou-se que as células BL estão mais inclinados a sofrer apoptose de células "normais" B quando tratados com DDD86481.

[00420] Exemplo 18

[00421] Neste exemplo, na Figura 17, proporciona-se uma estimativa de um limiar para a perda de NMT2 em tumores humanos. Na Tabela 7, o nível de expressão de mRNA NMT2 é mostrado como o log2 (micro-matriz NMT2 intensidade de fluorescência) para as linhagens celulares indicadas dos dados LECC definidos quando disponíveis. Tabela 7

[00422] Na Figura 17, painel A, as linhagens de células linfóides indicadas foram sondadas para a presença de NMT2 por western blotting. Na Figura 17, painel B, comparando Painel A e Tabela 7, que demonstram a um log2 (micro-matriz intensidade de fluorescência NMT2) = 5,64 observada em células Toledo, não há NMT2 detectável por western blotting. Apesar de o valor real para a perda de expressão NMT2 pode ser superior a 5,64, que são, neste exemplo, utilizando-se este número como um limiar para estabelecer a prevalência de perda aproximada de NMT2 na população humana (Painel B). Os dados indicam que a perda de NMT2 não só é prevalente em linfoma de Burkitt e linfoma difuso de células B, mas também em uma grande variedade de outros tipos de tumores (ver também a Figura 11C para obter uma lista de linha 50 celular que expressa o menos NMT2 e para a tabela prevalência de perda de NMT2 em vários tipos de câncer).

[00423] Em conformidade, é aqui proporcionado um método para identificar aqueles cânceres NMT2-deficitent adequados para o tratamento com um ou mais inibidores de NMT1. Em um exemplo, uma amostra do doente com os níveis de mRNA ou concentração abaixo de cerca de um valor limiar, indica que o referido paciente é um bom candidato para tratamento com um inibidor NMT1. Em alguns exemplos, um nível abaixo de cerca de RNAm do limiar é referido como a baixa expressão. Em um exemplo, uma amostra do doente com os níveis de mRNA ou concentração acima de cerca de um valor limiar, indica que o referido paciente é um candidato pobre para o tratamento com um inibidor da NMT1. Em alguns exemplos, um nível de RNAm de cima sobre o limiar é referido como expressão elevada.

[00424] Deve notar-se que, além de, ou em vez de, o valor de limiar estabelecido em relação a células de Toledo, fontes alternativas podem servir de valores de limiar adequados. Em alguns exemplos, a fonte ou controle utilizado para obter um valor de limiar é o mesmo tipo de célula como o câncer a ser testado para. Em alguns exemplos, os valores de limiar de fonte ou de controle são armazenados ou encontrado em uma base de dados.

[00425] Exemplo 19

[00426] Neste exemplo, na Figura 18, a utilização de uma sonda destiobiotina-PEG-azida para puxar para baixo as proteínas pós-tradução w-alcinil-miristoiladas em células T de Jurkat de leucemia, utilizando esferas de estreptavidina- sefarose é mostrado.

[00427] Destiobiotina (mostrada em I) é um análogo de biotina que se ligam reversivelmente às proteínas avidina e avidina-like. Nós projetamos e ordenou a síntese de destiobiotina-PEG-azida (I) e biotina-PEG-azida (II).

[00428] Em (B) As células T Jurkat foram cultivadas na presença de co-miristato-alcinilo e induzidas a sofrer anti- Fas apoptose mediada na presença de cicloheximida. Após a lise celular, lisados foram feitos reagir com destiobiotina- PEG-azida utilizando clique química ou não, misturados com os grânulos de neutravidina-Sepharose, lavou-se e eluiu-se com lOmM biotina. O painel B (i) mostra que desthiobiotinylated- pós-tradução da proteína miristoilada pode ser puxado para baixo e recuperados de forma eficiente a partir de grânulos de neutravidina pistas 5,6,7 e B (iii). No painel B (ii), um controle, no qual a destiobiotina-PEG-azida foi omitido da reação é mostrado clique. Neste caso, muito poucas proteínas ligadas às esferas de neutravidina e foram eluídas (apenas uma banda fraca pode ser visto na 75kDa). Estes resultados indicam o desenvolvimento de um método para permitir uma análise proteomic e avaliar o conteúdo de proteínas celulares ou myristoylomes co- e pós-tradução miristoiladas.

[00429] Exemplo 20

[00430] Neste exemplo, a Figura 19, mostra-se em escala uso de uma sonda de PEG-azida desthiobiotin- para puxar para baixo co-miristoiladas-alcinilo pós-tradução de proteínas em células T de Jurkat de leucemia, utilizando esferas de estreptavidina-magnético. As células Jurkat foram induzidas a sofrer apoptose com 2,5 µM de estaurosporina durante 3 h, em seguida, marcadas com 100 µM de miristato (Cl 4) (Painel A) ou alcinilo-miristato (AlkCl4) (Painel B), ambos conjugados com BSA durante 1 h a 37° C. As células foram recolhidas, lisadas e feito reagir com azido-destiobiotina usando clique químico. Destiobiotina-miristoiladas-alcinilo proteínas foram ligadas a esferas magnéticas com estreptavidina, lavou-se e eluiu-se com 50 mM de biotina com 2% de SDS a 37 ° C durante 15 min. A eluição 1 (painel B) contém a maioria das proteínas miristoilada-destiobiotina enquanto pequeno encontram-se na eluição 1 a partir de células marcadas com miristato (painel A). Tempo de exposição: 5 segundos.

[00431] Exemplo 21

[00432] Neste exemplo, na Figura 20, os perfis de miristoilação de células "normais" imortalizadas B (IM9) e células BL (BL2 e Ramos) marcadas com alcinilo-miristato são mostrados. As células foram marcadas metabolicamente com 100 µM alcinilo-miristato durante 1 hora antes da colheita. As amostras de proteínas foram feitos reagir com azido-biotina, utilizando o clique química, 25 ug de proteína de cada ligado de células separadas por SDS-PAGE e visualizadas por western blotting utilizando NeutrAvidinTM-HRP. As setas indicam as proteínas, que estão presentes em imortalizada IM9 "normal" de linfócitos B miristoilada-alcinilo biotinilado, mas não foram observadas em células BL2 (BL) e Ramos.

[00433] Exemplo 22

[00434] Neste exemplo, na Figura 21, o tempo e dose de gráficos de citotoxicidade dependente da combinação de DDD86481 e doxorubixin são mostrados. Linhagens de células B linfocítica IM-9 (A) e de BL-2 (B) foram tratadas com concentrações crescentes de DDD86481 (0, 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10 e lOOµM) a 0 (Azul), 17 (vermelho) e 86 nm (verde) doxorrubicina hidroxi por 24, 48 ou 72 horas (de cima para baixo). Os ensaios do STM demonstram morte celular induzida por concentrações de doxorrubicina e DDD86481 que são individualmente muito menos tóxico; este efeito é consistente com uma interacção sinérgica. Este é caracterizado por uma diminuição de 6 vezes do ECso, quando ambos os compostos são usados em conjunto em comparação com o de ECso para DDD86481 usado sozinho a 24 e 48 horas de pontos de tempo.

[00435] Exemplo 23

[00436] Neste exemplo, na Tabela 8, abaixo, proporciona- se uma avaliação da prevalência aproximada da perda de NMT2 em vários cânceres humanos na América do Norte. Foi estabelecido um valor mínimo de corte de 5,64 para o log 2 (intensidade de fluorescência microarray), que corresponde a células sem NMT2 (Toledo, ver Exemplo 18) e constatou que 114 de 967 linhas celulares caem sob esse limite (-12%) . As taxas de incidência norte-americanos para cada tipo de tumor, número de pacientes que indicam beneficiar de uma terapia NMT inibidor (incidência X% abaixo do limiar) e as razões para as necessidades médicas de cânceres selecionados também são mostrados. TABELA 8

[00437] Exemplo 24

[00438] Neste exemplo, na Figura 22, immunoblotting foi realizado com células incubadas com DMSO, estaurosporina, um FAS, ou veículo sozinho. Os immunoblotts resultantes foram sondados com anticorpo anti-NMTl, anti-NMT2, anticorpo anti- PARP-1 murino, e anticorpo anti-GAPDH. Estes dados incluem na NMT seja clivado após a indução de apoptose.

[00439] Em particular, no presente exemplo, na figura 22 A, o papel (s) de STA em vivo e as células moribundas foi investigada. Células T Jurkat induzidas a sofrer a morte celular programada com anti-Fas ou STS foram analisados pelo seu conteúdo em STA. Células T Jurkat foram tratadas com DMSO, estaurosporina (2,5 µM) ou anti-Fas (300 ng / ml) com cicloheximida (5 mg / mL) e as amostras foram coletadas nos tempos 0, 2, 4, 6 e 8 pontos h tempo. As células foram lisadas e a presença de NMTl, NMT2, a PARP-1 e GAPDH foi avaliada por Western blotting utilizando ECL. O tratamento de células T de Jurkat com anticorpo anti-Fas ou STS resultou na clivagem dependente do tempo tanto NMTl e NMT2 (Figura 22A). A clivagem de NMTl começou 2 horas depois da indução da morte celular, enquanto que de NMT2 foi apenas detectável após 4 h de apoptose.

[00440] A clivagem de NMTl migrando a uma aparente 67 kDa(PM previsto = 56,8 kDa) resultou em um aparente fragmento de ~ 46 kDa (Fig. 3.1). A clivagem de NMT2 que migra como uma proteína de 65 kDa aparente (PM previsto = 56,9) produziu um fragmento de ~ aparente de 55 kDa em pontos de tempo iniciais, o qual foi convertido em um fragmento mais curto que migra a ou abaixo de ~ 46 kDa em pontos de tempo posteriores (4 e 8 h). Este fragmento mais curto NMT2 foi visto com sobreposição de uma banda de proteína não- específica. No entanto, foi mais visível nos lisados de células Jurkat tratadas-Fas nas figuras 3,2 (8 h) e 3,4 A (4h e 8h). Assim, as clivagens de NMT1 e NMT2 resultaram principalmente inicialmente na perda de fragmentos de ~ 11 kDa e ~ de 10 kDa, respectivamente. A razão para as discrepâncias entre as migrações aparentes e pesos moleculares previstos de STA não é conhecido. O momento da clivagem de STA em paralelo que o marcador de apoptose de PARP-1, sugerindo que é devido à acção das caspases

[00441] NMT1 é um substrato de caspases-3 e -8, e NMT2 é um substrato da caspase-3

[00442] Na experiência da Figura 22, painel B, para investigar se as caspases estão envolvidas na clivagem da STA, que induziu apoptose mediada anti-Fas por células T de Jurkat, na presença ou ausência de inibidores irreversíveis bem caracterizados de caspases-3, -8, -9 e juntamente com um inibidor geral de caspases e analisados os conteúdos celulares, tanto para STA. As células T de Jurkat foram tratadas com 10 inibidores de caspase µM durante uma hora e, em seguida, tratados com anti-Fas (300 ng / ml) e ciclo- heximida (5 ug / ml) para induzir a apoptose. As amostras foram coletadas em 0, 4 e 8 h pontos no tempo. As células foram lisadas e a presença de NMT1, NMT2 e PARP-1 foi avaliada por transferência Western utilizando ECL. As manchas foram, em seguida, despojado e sondado com anti-tubulina (controle de carga) (géis Composto).

[00443] A clivagem de NMT1 foi anulada por inibidores específicos da caspase-8 e em geral, ao passo que foi apenas parcialmente bloqueada pelo inibidor da caspase-3 -específica (Figura 22B), o que sugere que NMT1 é um substrato de caspases-3 ou -8. Em contraste, a clivagem NMT2 era visivelmente inibida por todos os inibidores de caspases utilizados (Figura 22-B). Isto sugere que é provável que NMT2 seja um substrato da caspase-3, uma vez que a inibição do iniciador caspases-8 ou -9, que por sua vez inibem a clivagem de ativação e do efetor da caspase-3. A progressão da apoptose induzida por anti-Fas foi verificada por western blotting com anticorpo anti-PARP-1 (Figura 22B). A extensão da clivagem da PARP-1 foi concomitante com e proporcional ao de NMT1 e NMT2.

[00444] Exemplo 25

[00445] Neste exemplo, na Figura 23, é mostrado que a caspase truncado NMT2 é 3 - 4 vezes mais ativa do que NMT2 de comprimento completo. Atividade NMT de comprimento total purificada e hexahistidina clivada pela caspase (HIS) -NMTs foi testada usando um ensaio de peptídeo miristoilação. N- Miristoiltransferase atividade foi calculada a partir da quantidade de miristoilpeptídeo radiomarcado produzido e detectado no papel de fosfocelulose (adaptado de King et al.1991, Anal Biochem.). Cada ensaio NMT foi realizado em triplicata. Controle utilizado é eluição 5 da His- NMTlpurification. Caspase truncado NMT2 é 3 - 4 vezes mais ativa do que o NMT2 de comprimento total

[00446] Exemplo 26

[00447] Neste exemplo, na Figura 24, mostra-se que a redução dos níveis de NMT2 em células BL envolve a ação de histonas desacetilases.

[00448] Nos experimentos da figura 24, buscou-se avaliar o possível envolvimento de silenciamento de genes no locus NMT2. A acetilação do grupo e-amino de resíduos de lisina em histonas por acetilases histonas (HATs) resulta na redução da carga positiva de histonas, que relaxa a conformação da cromatina e permitindo que a maquinaria de transcrição de um melhor acesso ao DNA (BRNAeda-Zahonero, B. e M. Parra 2012. Histinas deacetilases e câncer Mol Oncol 6:579 - 589). Portanto, a acetilação de histona está tipicamente associada com a ativação do gene. Por outro lado, a remoção dos grupos acetil por histonas desacetilases (HDAC) induz a condensação da cromatina e resulta na repressão transcricional ou silenciamento de genes.

[00449] Para testar se a redução em RNAm NMT2 foi devido a silenciamento da cromatina que trataram células B "normais" (IM9) e células malignas BL com ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA) (também chamado vorinostat), uma classe I e classe II de inibidor de histonas desacetilase, durante 24 horas e monitorada os níveis de NMT 1 e NMT2 por western blot. Em particular, as células "normais" B (IM9) e células malignas BL (Ramos, BL2) tratados com 1 µM de SAHA (HDAC de classe I inibidor / II) durante 24 h. As células foram então lisadas, sujeitadas a SDS-PAGE e Western blot foi realizada com NMT1, NMT2, anticorpos p21 / wafl e GAPDH.

[00450] Foi descoberto que o uso de SAHA aumentou os níveis NMT2 em células BL, onde os níveis NMT2 normalmente são esgotados, enquanto níveis NMT1 permaneceram relativamente inalterados. wafl p21, uma proteína se liga a e inibe a atividade de uma quinase dependente de ciclina (CDK1) ou complexos de CDK2, foi utilizado como controle para verificar a eficácia de SAHA, que é conhecido por aumentar a expressão do gene p21 em células wafl. Todas as células tratadas com SAHA continuaram aumentando os níveis p21 wafl. Embora não desejando estar limitado pela teoria, estes dados sugerem que uma classe I ou de classe II HDAC silencia o gene NMT2 por desacetilação de histonas e compactando, assim, o locus NMT2 em células BL.

[00451] Em um exemplo, um inibidor de HDAC é usado para tratar o câncer deficiente NTM2.

[00452] Exemplo 27

[00453] Neste exemplo, na Figura 25, mostra-se que os níveis de proteína NMT2 são reduzidos em várias linhagens celulares de BL. Lisados de várias linhagens de células linfocitárias recolhidas a partir de investigadores locais e analisados pelo seu conteúdo NMT. Os resultados demonstram que os níveis de proteína NMT2 foram reduzidas em todo o linfoma de Burkitt (SA2, Daudi, BJAB e Ramos) linhagens celulares testadas quando comparado com o "normal", imortalizada de linhagens celulares de linfoblastos B, IM9, L0 e VDS.

[00454] Exemplo 28

[00455] Neste exemplo, na Figura 26, mostra-se que a degradação proteossomal não é a causa da destruição das células em NMT2 BL. Nestas experiências, linfócitos B imortalizado (IM9) "Normal" e células de linfoma maligno B [linfoma de Hodgkin (KMH2) e BL (Ramos, BL2)] tratado com 10 µM de inibidor proteossomal (MG-132) durante 5 h. Western blotting foi realizada em lisados celulares para controlar os níveis de NMT 1, NMT2, Mcl-1, e GAPDH.

[00456] Para investigar se a degradação do NMT2 foi aumentada como resultado de uma mutação desestabilizadora ou a presença de um fator desconhecido que possa desestabilizar NMT2 em células cancerosas, tratando linfócitos normais e malignas com o inibidor da degradação proteossomal MG-132 durante 5 h. Os lisados celulares foram indivíduos a Western blotting para analisar a presença de NMT1, NMT2 e de células de leucemia mielóide proteína-1 (Mcl-1), o qual foi utilizado como um controle para verificar a eficácia de MG-132, uma vez que é indivíduo a degradação proteossomal. Os resultados indicam que os níveis NMT2 não aumentou em células BL após tratamento com MG-132, sugerindo uma mutação desestabilizadora ou fator de desestabilização presente em linfócitos malignos que conduzem à degradação da NMT2 não está presente. O tratamento de células com MG-132 conduz a níveis elevados de Mcl-1 em todos os tipos de células.

[00457] Exemplo 29

[00458] Neste Exemplo, na Figura 27, é mostrado NMTl é clivada pela caspase-8, mas não NMT2. Células T Jurkat (A) e células T Jurkat que expressam uma caspase-8 mutante dominante negativo (B) foram tratadas com DMSO ou anti-Fas (150 ng / mL) e as amostras foram coletadas em 0, 4 e 8 pontos h tempo. As células foram lisadas e a presença de NMTl, a PARP-1 e clivada da caspase-8 foi avaliada por transferência Western utilizando ECL. * Indica as bandas não específicas.

[00459] A clivagem de NMTl foi investigada no tipo selvagem T de Jurkat e células T de Jurkat que expressam uma caspase-8 mutante negativo dominante (C8DN) (Juo et al., 1998). A expressão de C8DN em células T de Jurkat, apoptóticas revogada a clivagem de NMTl quando comparados com os níveis observados no tipo selvagem de células T de Jurkat (Fig. 27 A e B). Uma quantidade mínima de NMT2 clivagem foi observada em células Jurkat-C8DN após 8 h de indução de apoptose (Fig. 27 B). A clivagem de PARP-1 e a caspase-8 foi também inibida em células T de Jurkat-C8DN.

[00460] Exemplo 30

[00461] Neste Exemplo, na Figura 28, ambos NMTl e NMT2 foram clivados pela caspase-3. MCF7 (A) e MCF7 expressando caspase 3 (MCF7 / caspase 3) (B) foram tratadas com DMSO ou STS (2,5 µM) com cicloheximida (5 mg / mL) e as amostras foram coletadas em 0, 4 e 8 pontos h tempo. As células foram lisadas e a presença de NMT2, a PARP-1 e caspase 3 clivada foi avaliada por transferência Western utilizando ECL.

[00462] Verificou-se que tanto NMTl e NMT2 não foram clivados na Células MCF-7 apoptótica no ponto de tempo de 8 horas (Fig. 28 A). Em contraste, ambas as enzimas foram prontamente clivadas em células MCF-7 apoptótica que expressam estavelmente a caspase-3 (Kagawa et al., 2001) (Fig. 28 B). A clivagem da caspase-3 conhecida / -7 substrato de PARP-1 também foi confirmada em ambos as linhagens celulares MCF-7 quando a apoptose foi induzida (Figs. 27 A e B) (Walsh et al., 2008). Portanto, ambos as NTMs parecem ser substratos de caspase-3.

[00463] Exemplo 31

[00464] Neste exemplo, na Figura 29, os locais de clivagem de caspase NMT1 e NMT2 identificados pela degradação de Edman são mostradas em negrito e caixa de lisina carregada positivamente (K) é destacada nas sequências de aminoácidos NMT1 e NMT2 (aminoácidos 1 a 80).

[00465] A sequenciamento N-terminal mostrou que NMT2 foi clivada em ambos os locais D-25 e D-67 (Fig. 29). Os locais de clivagem para ambos NMT1 e NMT2 foram localizados no terminal N das enzimas e não no domínio C-terminal de catalisador, o que sugere que as enzimas ainda podem ser clivados ativo durante a apoptose.

[00466] Exemplo 32

[00467] Neste Exemplo, na Figura 30, descreve a confirmação de locais de clivagem NMT por mutagénese dirigida ao local. Células HeLa que expressam transitoriamente o de tipo selvagem e mutantes construções V5-NMT foram incubadas com NTMs (2,5 µM). As células transfectadas com construções V5-NMT1 ou V5-NMT2 foram lisadas em 4 h e 5 h pontos de tempo, respectivamente. Western blotting foi realizado nas amostras utilizando anticorpos e V5-tubulina (controle de carga).

[00468] Para validar os locais de clivagem NMT reveladas por sequenciamento N-terminal, foi construído vetores V5-NMT marcados N-terminal e usaram o kit de mutagênese dirigida ao local Quickchange® (Stratagene) para criar mutações pontuais nos locais de clivagem NMT. A mutação D72E engenharia em V5- NMT1 revogada a clivagem de caspase-V5-NMT1 em células HeLa transfectadas adequadamente induzidas para sofrer apoptose com STS durante 4 h enquanto os níveis de WT-V5 NMT1 foram severamente diminuídas nestas células (Fig. 30). Isto confirmou D72 como o local caspase-clivagem em NMT1.

[00469] Uma vez que o sequenciamento N-terminal revelou dois locais de clivagem de caspase (D25 e D67) para NMT2 (Fig. 30), que ambos os mutantes D25 e D67 para os resíduos de glutamato (E), independentemente, resíduos [V5-NMT2 (D25E), V5- NMT2 (D67E)] e, em conjunto [V5-NMT2 (D25,67E)]. Observamos que a clivagem do V5-NMT2 (D25,67E) mutante duplo foi severamente revogada em células HeLa apoptóticos transfectadas adequadamente enquanto os mutantes simples [V5- NMT2 (D25E), V5-NMT2 (D67E)] tinha vários efeitos (Fig 30.) e do tipo selvagem V5-NMT2 foi principalmente clivada após 5 h após a indução de apoptose (Fig. 3.8). Quando se compara a integridade dos mutantes individuais durante a apoptose, observou-se que V5-NMT2 (D25E) foi reprodutivelmente ligeiramente menos do que clivada V5-NMT2 (D67E) (Fig. 30), sugerindo que D25 pode ser o local de clivagem primária de NMT2, considerando D67 pode ser um local de clivagem secundário.

[00470] Exemplo 33

[00471] Neste exemplo, na Figura 31, descreve alterações no perfil de miristoilação como as células sofrem apoptose. As células Jurkat foram marcadas metabolicamente com 25 µM alcinilo-Tnyristate após a indução da apoptose com anti-Fas (150 ng / ml) e ciclo-heximida (5 ug / ml). As amostras de proteínas foram feitos reagir com azido-biotina, utilizando o clique química e visualizados por western blotting com NeutrAvidinTM-HRP. Antes da avaliação da incorporação de etiquetas por Western blotting, as membranas foram incubadas em 0,1 M de Tris-HCl 0,1 M ou KOH.

[00472] As células T Jurkat foram induzidas a sofrer apoptose utilizando anticorpos anti-Fas e metabolicamente marcadas durante 30 min com ácido-w-alcinilo mirístico antes ABATER células em vários pontos de tempo (0, 1, 2, 4 e 8 h). Cicloheximida também foi adicionada a células para inibir a tradução de proteínas como parte do estimulo apoptótica, bloqueando assim a co-translacional miristoilação durante a apoptose. Os lisados celulares foram feitos reagir com azido- biotina, utilizando o clique química e proteínas biotiniladas-'myristoylated foram visualizados por análise de western blotting utilizando NeutrAvidinTM-HRP, como descrito anteriormente (Yap et al., 2010).

[00473] O perfil de miristoilação no tempo 0 h correlacionadas com o padrão de miristoilação co- translacional observada previamente em células não apoptóticas (Fig. 31) (Martin et al, 2008; Yap et al, 2010). O deliberadamente baixa de exposição mostra apenas algumas proteínas miristoiladas nos lisados celulares. O tratamento das membranas com 0,1 M KOH confirmou que o ácido a-alcinil- mirístico é incorporada em proteínas via uma ligação amida resistente alcalino, uma vez que o tratamento alcalino removido da marcação a partir de apenas alguns bands. Este tratamento com proteína alcalina hidrolisa ligações tioéster encontrados em palmitoilado proteínas (armah e Mensa-Wilmot, 1999; Zhao et al., 2000;. Vilas et al, 2006). Após a indução da apoptose com anti-Fas e ciclo-heximida para lh, co- translacional miristoilação foi reduzido, presumivelmente como tradução da proteína é inibida pela ciclo-heximida. Isto foi seguido por uma mudança no conteúdo celular de proteínas miristoiladas como ilustrado pelas grandes diferenças nos perfis de proteínas miristoiladas electroforéticos, começando com 2 h de pós-indução de apoptose e permanente para a duração da experiência (Fig. 31).

[00474] Exemplo 34

[00475] Neste exemplo, na Figura 32, descreve alterações aos níveis NMT como as células sofrem apoptose. As células Jurkat foram marcadas metabolicamente com 25-miristato µM alcinilo após a indução da apoptose com anti-Fas (150 ng / ml) e ciclo-heximida (5 ug / ml). Western blotting foi realizado nas mesmas amostras que na Figura 31 usundo anticorpos contra NMT1, NMT2 e GAPDH. (*) Indica a bandas não específicas

[00476] Estes resultados mostram que, embora a NTMs são clivadas para várias extensões durante a apoptose, a miristoilação atividade parece permanecer em células até 8 h após a indução da apoptose.

[00477] O Exemplo 35

[00478] Neste exemplo, na Figura 33, descreve a indução de células COS7 que expressam transitoriamente V5-NMT1 e V5- NMT2 a apoptose com estaurosporina e ciclo-heximida. Atividade NMT foi ensaiada utilizando um ensaio de peptídeo miristoilação e western blotting foi realizado sobre a amostra, utilizando anticorpos contra v5 e alfa-tubulina (controle de carga).

[00479] A Figura 34 representa a atividade NMT inicial nos lisados de células COS 7 transfectadas de forma transiente. Células COS7 que expressam transitoriamente V5 e V5-NMT1-NMT2 foram incubadas com STS (2,5 µM) e ciclo- heximida (5 ug / ml). Atividade NMT foi ensaiada utilizando um ensaio de miristoilação peptídeo, tal como descrito em materiais e métodos. Atividade de N-Miristoiltransferase foi calculada a partir da quantidade de miristoylpeptídeo radiomarcado produzido e detectado no papel de fosfocelulose (adaptado de King et al.1991, Anal Biochem.). Os níveis de atividade foram normalizados para atividade NMT1 em t = 0h. NMT1 representa a média de três experiências independentes feitas em duplicado. NMT2 representa a média de quatro experiências independentes feitas em duplicado.

[00480] A Figura 35 representa a atividade NMT em células COS7 que expressam transitoriamente V5- NMT1 e V5- NMT2 incubadas com estaurosporina (2,5 µM) e ciclo-heximida (5 ug / ml). Atividade NMT foi ensaiada utilizando um ensaio de miristoilação peptídica como descrito em materiais e métodos. Atividade N-Miristoyltransferase foi calculada a partir da quantidade de miristoilpeptídeo radiomarcado produzido e detectado no papel de fosfocelulose (adaptado de King et al.1991, Anal Biochem.). Atividade NMT foi normalizada para 100% em t = 0 h para cada NMT. NMT1 representa a média de três experiências independentes feitas em duplicado. NMT2 representa a média de quatro experiências independentes feitas em duplicado. As diferenças são indicadas por (*) e mostra significância estatística (* <p = 0,05, ** <p = 0,005), quando comparado com o ponto de tempo 0 h para ambos os STA.

[00481] Para avaliar se NMTs clivados eram ainda cataliticamente ativo, foi medida a atividade enzimática V5- NMT de células transitoriamente transfectadas que expressam quer V5-NMT usando um filtro de ensaio à base de peptídeo (King e Sharma, 1991; Raju e Sharma, 1999) durante o início da apoptose. Células COS-7 transfectadas transitoriamente com V5-NMT1, V5-NMT2 ou vetor vazio foram induzidas a sofrer apoptose mediada / STS-ciclo-heximida e utilizados como fonte de enzima. Atividade NMT foi medida a diferentes tempos de apoptose utilizando [3H] miristoil-CoA e miristoiláveis- ou não-myristoiláveis (G-> A) decapeptídeos Lance truncados foram usadas como substratos (King e Sharma, 1991; Raju e Sharma, 1999). Atividade NMT foi calculada a partir da quantidade de peptídeo radiomarcado que permaneceu ligada ao papel de fosfocelulose e detectada por contagem de cintilação.

[00482] Apesar de as células COS-7 transfectadas células expressaram níveis similares de STA quiméricos (Fig. 32), as que expressam V5-NMT1 mostraram uma quase 5 vezes maior do que a atividade NMT aqueles que expressam V5-NMT2 em t = 0h (figura 34). A quantidade de -NMTs V5 intactas encontradas em lisados celulares diminuiu ao longo do tempo de indução de apoptose (Fig. 33) e seguiram uma tendência similar como os NMTs endógenos (Fig. 32), embora quase toda a super- expressãode NMT1 foi clivada depois 4h e 8h de apoptose e todos NMT2 super-expresso após 8 horas (Fig. 3,33). Embora maior do que 90% de V5-NMT1 é clivada (Fig. 3,33) em 4 h após a indução da apoptose, a atividade NMT nessas células permaneceu relativamente inalterada até 8 h após a morte celular foi iniciado. Houve uma ligeira tendência para o aumento (embora não significativa) na atividade NMT catalítica em t = 2h e 4h, nos lisados de células COS-7 que sobre-expressam NMT1 quando comparada com a atividade em t = 0h (Fig. 3.35). Isto sugere que V5-NMT1 clicada é cataliticamente ativa durante a apoptose quando miristoilação pós-tradução é iniciada. No entanto, observou-se uma diminuição significativa na atividade NMT (20%, p <0,05) às 8h após indução de apoptose quando comparado com o ponto de tempo Oh em que as células transfectadas com V5-NMT1 (Fig. 35).

[00483] A atividade das células que expressam NMT V5- NMT2 não foi significativamente afetada de Oh a 4h, até que a clivagem de caspase de V5-NMT2 resultou em um (p <0,005) redução (33% de decréscimo estatisticamente significativa quando comparada com a atividade a t = 0h) da atividade enzimática após 8 h de indução de apoptose (Fig. 35). Curiosamente, embora os níveis de NMT2 são drasticamente reduzidas devido à clivagem durante a apoptose caspase (Fig. 33), 66% de atividade de NMT2 ainda permanece após 8 horas de indução de apoptose (Fig. 33), indicando que NMT2 também desempenha um papel na miristoilação de proteínas pós- translacional durante a apoptose

[00484] Exemplo 36

[00485] Neste exemplo, na Figura 36, descreve a purificação de hexa-histidina recombinante (His) marcada de comprimento completo e hNMTl clivada pela caspase. A purificação foi efetuada utilizando cromatografia em Ni-NTA (ver materiais e métodos). As proteínas purificadas foram visualizadas por coloração de géis com Coomassie azul de gel. (FT: através do fluxo, W: lavagem e E: frações eluídas)

[00486] A Figura 37 ilustra a purificação de hexahistidina recombinante (His) marcada de comprimento total e clivada pela caspase hNMT2. A purificação foi efetuada utilizando cromatografia em Ni-NTA (ver materiais e métodos). As proteínas purificadas foram visualizadas por coloração de géis com Coomassie azul mancha de gel. (FT: através do fluxo, W: lavagem e E: frações eluídas).

[00487] A Figura 38 ilustra a atividade NMT de comprimento total purificado e hexahistidina clivada pela caspase (Suas) -NMTs testada usando um ensaio de peptídeo miristoilação. Atividade de N-Miristoiltransferase foi calculada a partir da quantidade de miristoilpeptídeo radiomarcado produzido e detectado no papel de fosfocelulose (adaptado de King et al.1991, Anal Biochem). Cada ensaio foi realizado NMT em triplicado. Controle utilizado foi eluição 5 da His-NMTlpurification.

[00488] Foi gerado His-tag de corpo inteiro (His-NMTl e His-NMT2) e vetores caspase truncado (His-73NMT1, His-26NMT2 e His-68NMT2) NMT humanos e usou esses vetores para expressão bacteriana e purificação de proteínas (Fig. 36 e 37). Utilizando o ensaio peptídeo baseado em filtro NMT (King e Sharma, 1991; Raju e Sharma, 1999), verificou-se que tanto de corpo inteiro e caspase clivada truncado NMTl e NMT2 foram cataliticamente ativo, quando comparado com o controle em um ambiente in vitro (Fig. 37). A clivagem NMT2 parecem melhorar a sua atividade como caspase clivada truncado NMT2 parecia ter ~ 3 vezes (His-26NMT2) e ~ 4 vezes (His-68NMT2) mais atividade quando comparado com NMT2 de comprimento total (Fig 38).

[00489] Exemplo 37

[00490] Neste exemplo, a Figura 39 representa o fracionamento subcelular de NTMs endógenos em células HeLa durante a apoptose. As células HeLa foram tratadas com DMSO, o STS (2,5 µM) ou anti-Fas (300 ng / mL) com ciclo-heximida (5 ug / ml) e as amostras foram recolhidas no ponto de tempo de 5 h e sujeita a fracionamento subcelular, tal como descrito em materiais e métodos. O mesmo volume de frações P100 e S100 foram submetidas a western blotting utilizando anticorpos NMTl e NMT2.

[00491] A Figura 40 ilustra a quantificação da quantidade de NMT em diferentes frações após o fraccionamento subcelular de STA endógenos em células HeLa durante a apoptose. As células HeLa foram tratadas com DMSO, o NTMs (2,5 µM) ou anti-Fas (300 ng / mL) com ciclo-heximida (5 ug / ml) e as amostras foram recolhidas no ponto de tempo de 5 h e sujeita a fracionamento sub-celular (Fig. 39). Os níveis de full-length (completo) e clivada NMTl (A) e NMT2 (B) entre o PI 00 (P) e SI 00 (s) frações foram quantificados usando o Image J (http://rsbweb.nih.gov/ ij /). Percentagens apresentadas foram calculadas como os níveis de cada banda mais total das duas frações (P100 + S100). Os gráficos representam a média de três experiências independentes,

[00492] A Figura 41 mostra o fraccionamento sub-celular de células HeLa em apoptose marcado com miristato-alcinilo. Antes do fraccionamento sub-celular (Figs. 39 e 40), células HeLa foram metabolicamente marcadas com 25-miristato µM alcinilo após a indução de apoptose. Após fracionamento, as amostras de proteína foram feitos reagir com azido-biotina, utilizando o clique química e visualizados por western blotting com NeutrAvidinTM-HRP. Antes da avaliação da incorporação de etiquetas por transferência de Western membranas foram incubadas em 0,1 M Tris-HCl neutro (A) ou 0,1 M de KOH (B).

[00493] A clivagem de caspase de muitas proteínas, muitas vezes resulta em alterações na localização celular (Enari et al, 1998; Zha et al, 2000; Jakobi, 2004; Vilas et al., 2006); portanto, delinear a localização dos NTMs clivados durante a apoptose se realizaram experiências de fracionamento subcelular (Fig. 39) em células normais e apoptóticos. Descobrimos que NMTl foi primeiramente encontrado localizada na fração ribossômica / membrana de células HeLa não tratadas (63,9% em pelete) (Fig. 40). Houve um aumento discernível de NMT1 clivada truncado-caspase nas frações citosólicas de células HeLa induzidas para sofrer apoptose com STS ou anti-Fas em conjunto com ciclo-heximida (54% no citossol anú-Fas em células tratadas e de 60% no citosol em STS tratada células) (Figs. 39 e 40). Por outro lado, a maioria dos NMT2 (61,7%) localizada no citosol antes da indução de apoptose (Figs. 39 e 40). No entanto, o maior fragmento NMT2 clivado pela caspase (~ 55 kDa) localizado principalmente para o sedimento de membranas (94,7% nos ratos tratados em-Fas e 80% em STS-tratado) em células apoptóticas (Fig. 39 e 40). Não foi observada a presença do fragmento clivado NMT2 menor (~ 46 kDa) durante nossos fracionamentos, possivelmente porque as células foram induzidas a sofrer apoptose por um período máximo de 5 h.

[00494] Quando as células foram marcadas metabolicamente com alquinilo-miristato antes da indução de apoptose ou não e submetido a fracionamento subcelular, observou-se uma mudança no perfil de miristoilação após a indução da apoptose como pode ser visto na Figura 31 e constatou-se que o pós proteínas localizadas principalmente para membranas PI (00) quando comparados com o citosol (SI 00) (fig. 40) em translação miristoiladas. Isto sugere que a adição de uma porção de miristoílo para estas proteínas pós-tradução miristoiladas parecem ser suficientes para proporcionar a ancoragem na membrana estável.

[00495] Exemplo 38

[00496] Neste exemplo, a Figura 42 ilustra Efeito de 2- hidroximirístico ácido (HMA) sobre a indução de apoptose. As células T de Jurkat foram tratadas com ou sem HMA (1 mM) e a apoptose foi induzida com anti-Fas (150 ng / ml) e ciclo- heximida (5 ug / ml). As células de controle foram tratadas com DMSO. As amostras coletadas em 0, 2, 4, 6 e 8 pontos de tempo h. As células foram lisadas e as amostras foram separadas por SDS-PAGE e imunotransferidas com anticorpos contra, PAK2, NMTl e NMT2 (géis) compósitos de PARP-1.

[00497] A clivagem de PARP-1 ocorreu duas horas mais cedo em células tratadas com HMA IMM e anti-Fas, em comparação com as células tratadas com o miristato de imm de sódio e anti-Fas. Uma tendência semelhante foi também observada nas células expostas a HMA / STS, mas em menor grau do que o que foi observado com anticorpos anti-Fas, na presença de células de AHM / STS que exibiu mais de clivagem de PARP-1 e PAK2 em 2 h após incubação de apoptose de células tratadas com STS e myristate IMM sódio (Fig. 42). Foi também observada uma estimulação semelhante de clivagem de NMTl e NMT2. Isto indica que a inibição das NMTs acelera a indução de apoptose em células. Uma vez que a inibição de NMT potenciou o aparecimento da apoptose, parece que as NMTs iniciam em geral, um papel pro-sobrevivência em células.

[00498] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório descritivo são indicativos do nível dos técnicos versados no assunto à qual pertence esta invenção e são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedidos de patentes fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporada por referência.

[00499] A invenção sendo assim descrita, será óbvio que a mesma pode ser variada de muitas maneiras. Tais variações não devem ser encaradas como um desvio do espírito e do escopo da invenção, e todas essas modificações como seria óbvio para um técnico versado no assunto destinam-se a ser incluídas dentro do escopo das reivindicações seguintes.

Claims (2)

1. Método in vitro para identificar um indivíduo adequado para tratamento com um inibidor da isozima por N- miristoiltransferase 1 (NMT1) caracterizado pelo fato de que o método compreende: realizar uma análise de uma amostra obtida de um indivíduo com um câncer ou suspeita de ter um câncer para determinar se a amostra do dito indivíduo expressa NMT2; em que o tratamento com o referido inibidor NMT1 é indicado quando a quantidade de proteína NMT2 ou ácido nucleico na referida amostra é baixa ou ausente, em comparação com um controle ou quando o referido câncer é deficiente em NMT2; em que o referido câncer é leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica de fase blástica, mieloma das células plasmáticas, Adenocarcinoma Intestinal, carcinoma adenoescamoso misto do pulmão, carcinoma de pequenas células do pulmão, câncer pulmonar, carcinoma esofágico de células escamosas, câncer ósseo, carcinoma do duto da mama, Adenocarcinoma Difuso estomacal, Carcinoma medular de tireoide, carcinoma do trato urinário de células transicionais, mieloma, carcinoma de células claras ovariano, carcinoma de células de transição (câncer de ureter e de bexiga), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma de CLL, carcinoma da mama, adenocarcinoma colorretal, adenocarcinoma pancreático, carcinoma do ovário, carcinoma do pulmão de células não pequenas, osteossarcoma, melanoma, adenocarcinoma gástrico, carcinoma do endométrio, carcinoma escamoso esofágico; e em que a referida amostra foi processada por um tratamento compreendendo tratar a referida amostra com alquinil-miristato e destiobiotina azido-PEG biotina, e a referida análise compreende realizar um ensaio de ligação que compreende colocar a amostra processada em contato com um anticorpo, o qual se liga à proteína miristolatada, ou proteínas miristolatadas marcadas com azido-biotina, dentro da amostra para formar um complexo entre o anticorpo e a proteína miristolatada presente na amostra, o dito ensaio de ligação gerando, pelo menos, um perfil indicativo do referido complexo.

2. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo é um ser humano.