ES2885022T3 - Direccionamiento hacia células madre metastásicas a través de un receptor de ácidos grasos (CD36) - Google Patents

Abstract

Compuesto caracterizado por reducir o inhibir la actividad y/o expresión de CD36, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la metástasis del carcinoma epidermoide bucal (OSCC) en un mamífero.

Description

DESCRIPCIÓN

Direccionamiento hacia células madre metastásicas a través de un receptor de ácidos grasos (CD36)

Campo técnico

El campo técnico es el tratamiento del cáncer y el control de dicha enfermedad. Más específicamente, el centro de atención está en el uso de anticuerpos y otros inhibidores de la actividad o expresión de CD36 para el tratamiento del carcinoma epidermoide bucal (OSCC, oral squamous cell carcinoma), así como la identificación de candidatos para tratamientos eficaces contra dicho cáncer y sus metástasis.

Antecedentes

Las células escamosas son una clase de célula epitelial que recubren varios órganos del cuerpo, entre otros: la epidermis, los labios y la cavidad bucal. El carcinoma epidermoide (SCC, squamous cell carcinoma) es un término general para los cánceres en tales células. Aunque la terminología es la misma, el SCC de diferentes sitios del cuerpo suele ser muy diferente en cuanto a los síntomas, el pronóstico y la respuesta al tratamiento. Esto se describe con detalle en la página web del Instituto Nacional de Salud (http://www.cancer.gov/types/head-andneck/patient/lip-mouth-treatment-pdq) o en la versión profesional del Manual de Merck (https://www.merckmanuals.com/professional/ear,-nose,-and-throat-disorders/tumors-of-the-head-and-neck/oralsquamous-cell-carcinoma). El carcinoma epidermoide bucal (OSCC) es un tipo de cáncer de cabeza y cuello que comienza en las células escamosas de los labios y de la cavidad bucal y es el cáncer más habitual de los labios y de la cavidad bucal. Fumar y beber alcohol son importantes factores de riesgo.

Aproximadamente el 40% de SCC intrabucales comienzan en el suelo de la boca o en las superficies laterales y ventrales de la lengua. Aproximadamente el 38% de todos los carcinomas bucales se producen en el labio inferior; estos suelen ser cánceres relacionados con la exposición solar de la superficie externa. Las células cancerosas pueden diseminarse a tejidos más profundos a medida que crece el cáncer. El tratamiento es mediante cirugía, radiación y/o quimioterapia convencional; aunque la cirugía desempeña un papel más importante en el tratamiento de la mayoría de los cánceres de la cavidad bucal. La tasa de supervivencia global a los 5 años (todos los sitios y estadios combinados) es >50%.

Las lesiones curables tempranas rara vez son sintomáticas, y la prevención de enfermedades mortales requiere la detección temprana mediante cribado. Si el carcinoma de la lengua está localizado (sin la implicación de los ganglios linfáticos), la supervivencia a los 5 años es >50%. Para el carcinoma localizado del suelo de la boca, la supervivencia a los 5 años es mayor del 65%. La metástasis ganglionar disminuye la tasa de supervivencia en aproximadamente un 50%. Las metástasis alcanzan en primer lugar los ganglios linfáticos regionales y después los pulmones. El carcinoma del labio superior tiende a ser más agresivo y metastásico.

Los mecanismos mediante los cuales algunas células tumorales se desprenden de la lesión primaria para colonizar sitios distantes aún se desconocen en gran medida. Los acontecimientos prometastásicos habituales para la mayoría de los tumores sólidos pueden incluir la transición reversible de células tumorales desde un estado epitelial a uno mesenquimatoso, así como sus interacciones con componentes del estroma, tales como la periostina o la tenascina-C, o con células estromales activadas por tumores, tales como pericitos, fibroblastos, células endoteliales, adipocitos o células inmunitarias. Algunos tumores también secretan exosomas que fomentan la metástasis que contienen proteínas, ARNm y microARN para establecer un nicho prometastásico distante. Sin embargo, no se sabe si las lesiones primarias ya contienen subpoblaciones de células con el repertorio de mutaciones para conferir potencial metastásico, o si requieren mutaciones adicionales o cambios epigenéticos para ser capaces de colonizar sitios distantes. De hecho, queda por dilucidar si las células que inician la metástasis son una subpoblación de células madre tumorales, o si estas son dos poblaciones independientes.

Se han identificado células cancerosas de ciclo lento con el potencial de iniciación del tumor primario más alto en mamosferas de cáncer de mama y líneas celulares cultivadas de melanoma, cáncer de próstata y OSCC (Pece et al., 2009; Roesch et al., 2010; Bragado et al., Qin et al., 2012). Los datos in vivo indican que las células tumorales de ciclo lento son las responsables de la recidiva posterior a la quimioterapia en cáncer de colon y glioblastoma (Kreso et al., 2013; Chen et al., 2012).

Hale et al. (2014) notificaron que el glioblastoma contiene una población de células madre cancerosas oncógenas que se renuevan a sí mismas que contribuye a la progresión del glioblastoma y a la resistencia a la terapia. Afirman que las CSC usan selectivamente el receptor eliminador CD36 para fomentar su mantenimiento usando CSC derivadas de pacientes y modelos de xenoinjerto in vivo. Los ensayos proporcionados confirmaron que los fosfolípidos oxidados, que son ligandos de CD36, están presentes en las células de glioblastoma y que la proliferación de las CSC, pero no la de no CSC, aumentaba con la exposición a lipoproteínas de baja densidad oxidadas. El glioblastoma no es un cáncer metastásico, pero la recidiva del tumor se observa con frecuencia después de la resección, radiación y quimioterapia, de modo que la mediana de supervivencia de los pacientes que padecen glioblastoma permanece entre 12 y 18 meses tras el diagnóstico, siendo las lesiones primarias la causa de muerte en la mayoría de los pacientes. Por tanto, es importante entender el mecanismo mediante el cual las CSC responden a las señales del microentorno.

La CD36 (HGNC:1663, EntrezGene:948, Ensembl:ENSG00000135218, OMIM: 173510, UniProtKB: P16671) es una proteína receptora con varias funciones conocidas diferentes, tal como se indica por los diferentes nombres alternativos que recibe: entre otros, se conoce como determinante de agrupación 36, receptor de trombospondina, receptor de colágeno tipo I, antígeno de diferenciación leucocitaria CD36, glicoproteína plaquetaria 4 o translocasa de ácidos grasos. Los sumarios de Entrez Gene y UniProt/SwissProt para el gen CD36, tal como recapitula GeneCards (http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=CD36), describen a la proteína como la cuarta glicoproteína principal de la superficie plaquetaria que sirve como receptor para la trombospondina en plaquetas y diversas líneas celulares. Puesto que las trombospondinas son proteínas ampliamente distribuidas involucradas en una variedad de procesos adhesivos, esta proteína puede tener importantes funciones como molécula de adhesión celular. Se une al colágeno y a la trombospondina, mediando el efecto antiangiogénico de esta última, así como a fosfolípidos aniónicos y ^lD^l oxidadas. Media directamente la citoadherencia de eritrocitos parasitados por Plasmodium falciparum y se une a ácidos grasos de cadena larga y puede funcionar en el transporte y/o como regulador del transporte de ácidos grasos. Es un correceptor para el heterodímero TLR4-TLR6 que fomenta la inflamación en monocitos/macrófagos. Tras la unión al ligando, tal como oxLDL o amiloide-beta 42, induce rápidamente la formación de un heterodímero de TLR4 y TLR6 , que se internaliza y desencadena una respuesta inflamatoria, lo que conduce a la producción dependente de NF-kappa-B de las citocinas CXCL1, CXCL2 y CCL9 a través de la ruta de señalización de MYD88 y de la citocina CCL5 a través de la ruta de señalización de TICAM1, así como la secreción de IL1b. La CD36 también se encuentra en la parte superior de la cascada de señalización que absorbe lípidos a partir del entorno extracelular y desencadena su beta-oxidación para obtener energía en forma de ATP (Coburn et al., 2000; Ibrahimi et al., 1999; Pepino et al., 2014). Geloen et al., 2012, identificaron moléculas químicas pequeñas que bloquean las funciones de absorción de lípidos y unión de CD36. Se notificó que estos inhibidores reducen la deposición lipídica arterial, el tránsito intestinal de ácidos grasos, la concentración en plasma de triglicéridos y glucosa, mejoran la sensibilidad a la insulina, la tolerancia a la glucosa y reducen la concentración en plasma de HbAc1 en modelos de roedor diferentes e independientes. Los autores señalaron a CD36 como diana terapéutica atractiva para el tratamiento de diabetes y ateroesclerosis.

La CD36 ha estado involucrada previamente en el cáncer, pero su implicación y mecanismo de acción no están claros.

Los documentos WO 03/032813 y US 2004/009171 divulgan ensayos en los que se muestra que CD36 es uno de los genes regulados por incremento en el carcinoma de células renales. Aunque no se presentan ensayos para otros tipos de cáncer, en dicha solicitud se presenta CD36 como diana útil para el diagnóstico y/o tratamiento, e incluso la prevención, de determinados cánceres, considerándose también como factor pronóstico del tratamiento del tumor. Se menciona el SCC como uno de los posibles tipos de cáncer en los que puede usarse el tratamiento con anticuerpos contra CD36, o antagonistas tales como ARN antisentido, pero sin proporcionar ninguna evidencia de los cambios de expresión de CD36 en SCC o, particularmente, de la eficacia de los anticuerpos contra CD36 u otros antagonistas para prevenir o tratar cualquier tumor primario o metástasis. Se proponen tumores animales espontáneos para someter a prueba la eficacia de anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas que se sobreexpresan en el carcinoma de células renales según los ensayos mostrados en el documento WO 03/032813 y, dado que es un tumor altamente invasivo y maligno, se propone el SCC bucal felino como modelo adecuado. Sin embargo, de nuevo, tal propuesta se realiza sin proporcionar ejemplos de la utilidad real de dicho enfoque y, además, sin mostrar ninguna evidencia de que cualquiera de los genes sobreexpresados en el carcinoma de células renales también se sobreexprese en el SCC bucal felino y, particularmente, tampoco presenta ningún dato sobre cambios (aumento o disminución) del nivel de expresión de CD36 en el SCC bucal felino ni ninguna evidencia sobre una posible implicación de CD36 en el inicio, el desarrollo o la diseminación de la metástasis en tal tipo de cáncer. Además, se comenta que el SCC bucal felino presenta una baja incidencia de metástasis, pero también se menciona que esto puede ser debido a los cortos tiempos de supervivencia de los gatos con este tumor.

Para el cáncer de mama, algunos autores (DeFillippis et al., 2012) han notificado que la represión de CD36 activa un programa estromal multicelular compartido por una alta densidad mamográfica y los tejidos tumorales, de modo que la disminución/represión de CD36 hace que los tumores sean más agresivos. Muestran que la expresión aumentada de CD36 puede restablecer los fenotipos estromales asociados con tejidos de bajo riesgo.

Los datos disponibles indican que el papel de CD36 en diferentes clases de cáncer, si lo hubiera, podría ser diferente y opuesto dependiendo de la clase de cáncer particular considerada e, incluso, del estadio particular de dicho cáncer. Algunos autores (Balaban et al., 2015) habían sugerido que el carácter multifuncional de CD36 podría estar asociado con el papel diferente de los cambios en la expresión de CD36 dependiendo del tipo de cáncer. Mencionan que la baja expresión génica de CD36 se correlaciona con un mayor grado de metástasis en los cánceres de colon y ovario y con la baja supervivencia libre de recidiva, sin embargo, a la inversa, la expresión de ARNm de CD36 en cáncer de mama se correlaciona inversamente con el potencial metastásico de cinco líneas celulares de cáncer de mama, en las que su expresión es relativamente mayor en líneas celulares menos agresivas y casi ausente en líneas altamente agresivas (ZR-75 y MDA-MB-231). Esta inconsistencia entre tipos de cáncer puede explicarse mediante la multifuncionalidad de CD36. Aunque funciona como transportador de ácidos grasos, la CD36 también está involucrada en la adhesión de colágeno y, por tanto, una menor expresión de CD36 puede conducir a una adhesión celular reducida, proporcionando células cancerosas con un mayor potencial metastásico. Sugieren que la tasa de absorción de ácidos grasos mediada por CD36 en cada caso particular también podría tener una importante implicación en el efecto sobre la progresión del cáncer, y que puede verse influenciada por un microentorno obeso.

Otros grupos han sugerido un papel de los lípidos oxidados en el metabolismo y la funcionalidad de las células cancerosas. En general, se consideran compuestos con un efecto citotóxico (Alghazeer et al., 2008), de modo que una absorción excesiva de lípidos oxidados puede conducir a una viabilidad reducida de células cancerosas e incluso a la apoptosis.

Otros grupos de investigación han comentado la implicación de la absorción y el metabolismo de los lípidos en la progresión del cáncer. En general, se considera que las células cancerosas, que habitualmente son células con una alta tasa de división, tienen un metabolismo energético alterado, de modo que la glucosa y los lípidos se metabolizan de manera diferente que en células normales. Las modificaciones específicas en el metabolismo de los lípidos en células cancerosas no se han identificado con claridad y no se han estudiado en metástasis desarrolladas.

El papel de CD36 y/o el metabolismo de los lípidos en el desarrollo y la progresión de diferentes tipos de cáncer necesitan una aclaración adicional con el fin de usarlos como dianas para las modificaciones que pueden conducir a tratamientos eficaces del cáncer. Mientras tanto, la prevención y la inhibición de la diseminación metastásica de tumores sólidos sigue siendo la siguiente etapa crítica en el tratamiento del cáncer.

A su vez, la búsqueda de dianas eficaces para el tratamiento de OSCC debe continuarse o mejorarse, particularmente para las metástasis procedentes de tumores primarios de OSCC, puesto que aproximadamente el 50% de los pacientes con OSCC desarrollan metástasis ganglionares solas o en combinación con lesiones pulmonares. A menudo, los pacientes ya presentan la metástasis en el momento del diagnóstico del tumor primario en la clínica. Las tasas de supervivencia de los pacientes metastásicos son muy bajas: la mayoría de ellos sucumben a la enfermedad metastásica (Young et al., 2015; Gleber-Netto, et al., 2015) porque el aumento habitual de la intensidad de los tratamientos con radiación parece no ser eficaz en la mayoría de los casos y las terapias de resección rara vez son eficaces cuando se ven afectados los ganglios linfáticos y, de manera más importante, no son aconsejables ni fáciles de realizar cuando han alcanzado los pulmones. Además, la quimioterapia convencional no elimina la metástasis.

Se han identificado pocos factores que desempeñen un papel en la metástasis del OSCC. Sato et al (2003) observaron que la inhibición de CD44v9 aumenta la capacidad de invasión de las células de OSCC. Miyazaki et al (1999) observaron que la sobreexpresión de la cinasa B nm23-H2/NDP en células de OSCC humanas dio como resultado metástasis reducidas en cultivo. En la práctica clínica, la metástasis del OSCC sigue siendo problemática, y las opciones para pacientes con riesgo de metástasis ocultas son la cirugía y/o la quimioterapia (Omura, 2014). Por tanto, sigue siendo necesario hallar un tratamiento apropiado para el control y, si es posible, la remisión de metástasis procedentes de tumores primarios de OSCC, que sigue siendo una necesidad insatisfecha y duradera. La presente invención proporciona una solución a dicho problema.

Sumario

La metástasis es la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer. Para la mayoría de los cánceres humanos, aún se desconoce la identidad de las células que inician y fomentan la metástasis, lo que dificulta la capacidad de desarrollar terapias para prevenir o inhibir la diseminación de células tumorales a sitios distantes. Usando un modelo ortotópico de carcinoma epidermoide bucal (OSCC) humano, los presentes inventores ahora han identificado una subpoblación de células CD44bright dentro de la lesión primaria con el potencial más alto de desarrollar metástasis ganglionar y pulmonar. Esta población es de ciclo lento, expresa altos niveles del receptor de CD36 en la membrana celular y se basa en el metabolismo de los ácidos grasos para prosperar en los entornos ganglionares y bronquioalveolares. Cuando se trasplanta en la cavidad bucal de modelos de ratón, las células CD36+/CD44bright son tan capaces como sus homólogas CD36-/CD44bright de fomentar el inicio y crecimiento del tumor primario, pero son exclusivas en su capacidad de iniciar y fomentar la metástasis. De manera importante, la inhibición de CD36 o bien por ARNhc o bien por anticuerpos neutralizantes altera gravemente el inicio metastásico y la diseminación de muestras de pacientes con OSCC primario y líneas celulares establecidas. Haciendo hincapié adicional en su importancia, la sobreexpresión de CD36 en células derivadas de tumores de escasa diseminación confiere un comportamiento metastásico agresivo. Por tanto, en el presente documento se propone que el direccionamiento hacia células madre metastásicas CD36+ podría proporcionar un medio terapéutico innovador requerido para detener con éxito la diseminación metastásica de tumores, particularmente en OSCC.

En resumen, los inventores han hallado que puede usarse un bloqueante de la actividad y/o expresión de CD36 en el tratamiento del cáncer en un mamífero, en el que el cáncer es carcinoma epidermoide bucal (OSCC). Más preferiblemente, el OSCC está en un estadio en el que se ha desarrollado al menos una metástasis para el tumor primario, metástasis que puede(n) ser en los ganglios linfáticos y/o en los pulmones. Las metástasis en los ganglios linfáticos a tratar también pueden tener otras

La invención es tal como se define en las reivindicaciones. En esencia:

El primer aspecto de la invención se refiere a un compuesto que reduce o inhibe la actividad y/o expresión de CD36, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la metástasis del carcinoma epidermoide bucal (OSCC) en un mamífero.

Por tanto, el compuesto que se proporciona para su uso en el tratamiento de la metástasis del OSCC según la presente invención puede reducir o inhibir la actividad (puede ser un bloqueante de la actividad) o reducir o inhibir la expresión (puede ser un bloqueante de la expresión), o incluso ambos. Por tanto, en una posible realización, el compuesto, que se considera un bloqueante de la actividad y/o expresión de CD36, es un bloqueante de la actividad, es decir, un antagonista de CD36. En otra posible realización, el compuesto, que se considera un bloqueante de la actividad y/o expresión de CD36, es un bloqueante de la expresión de CD36, es decir, un inhibidor de la expresión de CD36.

Cuando el bloqueante es un bloqueante de la actividad, puede ser un anticuerpo, preferiblemente monoclonal. Se prefiere particularmente que el anticuerpo bloquee tanto la unión de CD36 a LDL oxidadas y ácidos grasos como su incorporación en células.

El bloqueante también puede ser un inhibidor de la expresión de CD36, tal como un ARNhc o un ARNi, un ARN de interferencia pequeño, o una molécula de ADN o ARN antisentido, o un análogo de los mismos.

En una posible realización, compatible con todas las anteriores, el mamífero es un ser humano.

Aspectos destacados adicionales de la divulgación:

En el presente documento también se describe un método para identificar un compuesto como candidato para el tratamiento de metástasis del OSCC, que comprende las etapas de:

a. poner en contacto el compuesto con células de ensayo CD36+;

b. comprobar si se produce un efecto relacionado con el bloqueo o agotamiento de CD36;

c. identificar el compuesto como candidato para el tratamiento de metástasis del OSCC si se produce tal efecto. Cuando el método se lleva a cabo in vivo, las células CD36+ serán células de una metástasis, el compuesto se administrará al animal de ensayo para permitir el contacto con las células y el efecto evaluado puede ser una disminución del crecimiento de la metástasis y/o una acumulación de células con gotas lipídicas. Habitualmente, al menos una metástasis estará en los ganglios linfáticos y/o el pulmón.

El método puede llevarse a cabo in vitro, usando cultivos de SCC en los que se ha enriquecido el número de CD36+ mediante clasificación o mediante incubación previa con un medio de cultivo apropiado y el efecto evaluado es el fomento del crecimiento: si se reduce por el compuesto, este se identificará como candidato a fármaco contra la metástasis del OSCC. Por ejemplo, un compuesto candidato se identifica si se observa una acumulación de gotas lipídicas hinchadas.

El método puede llevarse a cabo detectando la señal de lípidos fluorescentes.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Los OSCC contienen una población de células que conservan el marcaje CD44bright que expresan una firma del transcriptoma predominantemente asociada a la metástasis linfática y al metabolismo lipídico. A, Detección de LR-CSC mediante citometría de flujo en xenoinjertos de SCC-25 analizados entre 4-6 semanas después de la inoculación de SCC (n = 6 animales). Los números indican células CD44brightdye+, CD44brightdye- y CD44dim en la ventana representada expresados como porcentajes de SCC GFP+Lin- totales del tumor parental. (n = 3 experimentos independientes). B, Porcentaje de células en división en las poblaciones GFP+CD44+DID+ y GFP+CD44+DID- analizadas mediante la incorporación de BrdU y citometría de flujo. C, Representación de la cuantificación de células en división en las diferentes poblaciones identificadas en B: DID+ frente a DID-, P <0,05; CD44+ frente a CD44-, P <0,05, prueba de la t bilateral (n = 6 experimentos independientes, 3 ratones por experimento). D, Cuantificación global de células CD44brightDye+, CD44brightdye_ y CD44dim de xenoinjertos ^s C^c-pLucGFP detectados con una estrategia de FACS en la que se seleccionaron células individuales viables basándose en que son GFP+ y negativas para el cóctel de linaje (Lin) de anticuerpos (H2KD, CD31 y CD45) para excluir las células de ratón; las células GFP+Lin- se seleccionaron para CD44 y el colorante. E, Análisis de citometría de flujo representativo de la línea celular SCC-25 representada en D; se muestran los porcentajes del tumor parental de SCC GFP+Lin-total.

Figura 2. Validación por RT-qPCR mediante ensayos de expresión génica con TaqMan específicos humanos de genes diferencialmente expresados en las poblaciones CD44+DID+ y CD44+DID-. Los datos se proporcionan como los niveles de expresión relativa. n = 5, P*<0,05, P**<0,005, prueba de la t bilateral.

Figura 3. Las LRC de OSCC expresan altos niveles de CD36, y la modulación de la expresión de CD36 afecta fuertemente a la penetrancia y al crecimiento de metástasis ganglionares. A, Detección de células CD36+CD44bright mediante citometría de flujo de xenoinjertos SCC-25, VDH-00 y FaDu analizados a las 4-6 semanas (n = 8 animales por línea celular). Los números indican células CD44brightCD36bright CD44brightCD36low en la ventana representada, expresados como porcentajes del tumor parental de SCC GFP+Lin- total. Los histogramas muestran la correlación entre la expresión de CD36 y el contenido de DID para cada xenoinjerto. B, Cuantificación de la correlación entre la expresión de CD36 y el contenido de DID para los xenoinjertos SCC-25, JHU-029, Detroit-562, FaDu, VDH-00, VDH-01 y VDH-02 (n = 8 animales por línea celular). Los números indican porcentajes del tumor parental de SCC GFP+Lin- total. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes (n = 3), P = 0,0008, P = 0,03, prueba de la t bilateral. C, D, Monitorización bioluminiscente de tumores PMSCV-EV (vector vacío) y CD36-OE (sobreexpresión) de los xenoinjertos SCC-25 (D) (PMSCV-EV, n = 7; CD36-OE, n = 17) y VDH-00 (D) (PMSCV-EV, n = 7; CD36-OE, n = 8), P <0,0001, prueba de la t bilateral. Los gráficos inferiores muestran la frecuencia de metástasis desarrolladas en ratones expresada como porcentajes, P = 0,0003; P = 0,04 prueba exacta de Fisher bilateral. E, Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) representativa de ganglios linfáticos de los xenoinjertos PMSCV-EV y CD36-OE de SCC-25 en C. F, Representación del nivel de expresión de ARN de CD36 hallado en células de xenoinjertos generados a partir de SCC-25 que sobreexpresa CD36, en relación con el nivel hallado en células de tumores parentales SCC-25. G, Frecuencia de tumores primarios desarrollados (gráfico izquierdo) o metástasis desarrollada (gráfico derecho) de VDH-00 transformadas con el vector vacío PMSCV-EV (barras marcadas con “EV”) o con el vector CD36-OE (barras marcadas con “CD36-OE”. H, Gráficos de barras que representan el flujo de fotones normalizado observado en tumores primarios (gráfico izquierdo) o metástasis (gráfico derecho) de VDH-00 transformadas con el vector CD36-OE (barras marcadas con “CD36-OE”), en relación con el valor observado cuando las células VDH-00 se han transformado con el vector vacío PMSCV-EV (barras marcadas con “EV”). I, Imágenes bioluminiscentes (BLI) y cuantificación (flujo de fotones normalizado) de xenoinjertos PMSCV-EV (vector vacío) y CD36-OE de JHU-029, P = 0,002; P = 0,001; < 0,001; <0,0001, prueba de la t bilateral. J, Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) representativa de tumores primarios y metástasis de xenoinjertos PMSCV-EV y CD36-OE de JHU-029. El recuadro muestra una ampliación del SCC que invade completamente el ganglio linfático en los xenoinjertos CD36-OE (n = 5 animales por grupo). K, Representación del nivel de expresión de ARN de CD36 hallado en células de xenoinjertos generados a partir de SCC-25 que sobreexpresa CD36, en relación con el nivel hallado en células de tumores parentales SCC-25. L, Imágenes bioluminiscentes (BLI) de los xenoinjertos PMSCV-EV (vector vacío) y CD36-OE (sobreexpresión) de SCC-25 (columna izquierda) y JHU-029 (columna derecha), M, Frecuencia de tumores primarios desarrollados (gráfico izquierdo) o metástasis desarrollada (gráfico derecho) de SCC-25 o JHU-029 (tal como se indica sobre las barras) transformadas con el vector vacío PMSCV-EV (barras marcadas con “EV”) o con el vector CD36-OE (barras marcadas con “CD36-OE”). N, Gráficos de barras que representan el flujo de fotones normalizado observado en tumores primarios (gráfico izquierdo) o metástasis (gráfico derecho) de SCC-25 o JHU-029 (tal como se indica sobre las barras) transformadas con el vector vacío PMSCV-EV (barras marcadas con “EV”) o con el vector CD36-OE (barras marcadas con “CD36-OE”) en relación con el valor observado cuando las células SCC-25 se han transformado con el vector vacío PMSCV-EV. PT, tumor primario; LN-Met, metástasis ganglionar; Lung-Met, metástasis pulmonar.

Figura 4. Análisis por citometría de flujo de tumores primarios de los xenoinjertos PMSCV-EV (vector vacío) y CD36-OE (sobreexpresión) de SCC-25 (fila superior), VDH-00 (fila central) o JHU-029 (fila inferior) analizados 4 semanas después de la inyección de SCC (n = 6 animales por grupo). Para SCC-25, también se muestra el análisis correspondiente a la metástasis ganglionar (fila superior, derecha). Los números indican células CD44brightCD36+, CD44brightCD36- y CD44dim (diferenciadas) en la ventana representada, expresados como porcentajes del tumor parental de SCC GFP+Lin- total.

Figura 5. A, Gráfico izquierdo: cuantificación bioluminiscente de metástasis FaDu PLKO y ARNhcCD36 (#98 y #99) 4 semanas después de la inyección de SCC. Los datos se proporcionan como la media y el e.e.m. PLKO, n = 9; ARNhcCD36#98, n = 10; ARNhcCD36#99, n =10; P = 0,05, prueba de Mann-Whitney bilateral. n.s., no significativo. Gráficos derechos: penetrancia de la metástasis en xenoinjertos FaDu PLKO y ARNhcCD36 (#98 y #99) expresada en porcentajes. B. Análisis por citometría de flujo de tumores primarios y metástasis de xenoinjertos FaDu PLKO y ARNhcCD36 (#98 y #99) analizados 4 semanas después de la inyección de SCC. Los números indican células CD44brightCD36+, CD44brightCD36- y CD44dim (diferenciadas) en la ventana representada, expresados como porcentajes del tumor parental de SCC GFP+Lin- total, n = 6 animales por grupo. C. Imágenes representativas de los pulmones de xenoinjertos FaDu PLKO y ARNhcCD36#99 que muestran los nódulos redondeados de SCC metastásico en PLKO ausente en el ARNhcCD36. PLKO, n = 5; ARNhcCD36#99, n = 5. D. Imágenes bioluminiscentes y cuantificación de tumores primarios, metástasis linfática (marcada como LN-Met o metástasis LN) o metástasis pulmonar (marcada como Lung-Met o metástasis Lung) de FaDu PLKO y ARNhcCD36#99; se representa la frecuencia de tumores primarios desarrollados (gráfico superior izquierdo), metástasis ganglionar (gráfico superior central) o metástasis pulmonar (gráfico superior derecho), así como el flujo de fotones normalizado observado en tumores primarios (gráfico inferior izquierdo), metástasis ganglionar (gráfico inferior central) o metástasis pulmonar (gráfico inferior derecho) calculado con relación al valor observado, en cada caso, en casos de PLKO (PLKO, n = 9; ARNhcCD36#99, n = 10), P = 0,02, P = 0,05, prueba de la U de Mann-Whitney bilateral. Los datos se proporcionan como la media y el e.e.m.; PT, tumor primario; LN-Met, metástasis ganglionar; Lung-Met, metástasis pulmonar. E, Razón de señales de bioluminiscencia tumor primario/metástasis ganglionar en los intervalos de 1-3 semanas (T1-T3) y 3-4 semanas (T3-T4) para cada grupo PLKO o ARNhcCD36#99; los datos se proporcionan como la media. F. Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) representativa de ganglios linfáticos metastásicos de PLKO y ARNhcCD36#99. LD, gotas lipídicas. PLKO, n = 5; ARNhcCD36#99, n = 5). G, Imágenes representativas de tumores recogidos 4 semanas después de la inyección de SCC. H, Inmunotinción de metástasis linfática ARNhcCD36. El recuadro muestra gotas lipídicas que rodean las células de SCC GFP+CD44+. I, Contenido de ácidos grasos libres en las gotas lipídicas mostradas en I tal como se determinad mediante inmunotinción con BODIPY-568.

Figura 6. A. Imágenes bioluminiscentes (BLI) y cuantificación de xenoinjertos PLKO y ARNhcCD36 (#98 y #99) de SCC-25. Los datos se proporcionan como la media y el e.e.m. PLKO, n = 9; ARNhcCD36#98, n = 7; ARNhcCD36#99, n = 6; P = 0,02, P = 0,04, prueba de la t bilateral. B. Frecuencia de metástasis desarrollada en cada uno de los grupos en A. P = 0,003, prueba exacta de Fisher; n.s., no significativo. C. Tinción H&E representativa de tumores primarios de xenoinjertos PLKO y ARNhcCD36 (#98 y #99) de SCC-25 que muestra evidencias de diferenciación escamosa con estructuras de perlas de queratina en comparación con mayores niveles de indiferenciación en SCC (en PKLO). PKLO, n = 4; ARNhcCD36#98, n = 4; ARNhcCD36#99, n = 3. te, epitelio de la lengua; kp, perlas de queratina; mt, tejido muscular. D. Análisis por citometría de flujo de tumores primarios de xenoinjertos PLKO y ARNhcCD36 (#98 y #99) de SCC-25. Los números indican células CD44bightCD36+, CD44brightCD36- y CD44dim (diferenciadas) en la ventana representada, expresados como porcentajes del tumor parental de SCC GFP+Lin- total. El panel derecho muestra el cambio en la intensidad de fluorescencia media para cada grupo. n = 5 animales por grupo. E. Imágenes bioluminiscentes (BLI) de xenoinjertos PLKO y ARNhcCD36 (#98 y #99) de SCC-25, acompañadas por la representación de la cuantificación de los tumores primarios o metástasis (gráficos superiores) desarrollados, así como la representación del flujo de fotones normalizado observado en tumores primarios o en metástasis, calculado en cada caso en relación con el valor observado en xenoinjertos PLKO. F. Tinción H&E representativa de tumores primarios de xenoinjertos PLKO y ARNhcCD36#98 que muestran evidencias de la presencia de grandes células hinchadas en la muestra agotada de CD36 mediante la expresión del ARNhc, células que no estaban presentes en la muestra de PKLO.

Figura 7. A. Imágenes bioluminiscentes (BLI) 4 semanas después de la inyección de SCC de xenoinjertos Detroit-562 PLKO y ARNhcCD36 doble (#98 y #99) de ratones alimentados con dieta con alto contenido en grasas (HFD) o dieta de control (CTD). B. Frecuencia de tumores primarios (gráfico izquierdo superior) y metástasis (gráfico derecho superior) desarrollados, junto con el flujo de fotones normalizado observado en los tumores primarios (gráfico izquierdo inferior) y metástasis (gráfico derecho inferior) en cada uno de los grupos en A, (n = 5 animales por grupo). C. Peso promedio (gráfico superior) y glucemia (gráfico inferior) hallados en los ratones alimentados con la dieta de control (círculos; animales PLKO y ARNhcCD36) o dieta con alto contenido en grasas (cuadrados; animales PLKO y ARNhcCD36) en los días desde la inyección indicados debajo de los gráficos. D. Análisis por citometría de flujo de xenoinjertos Detroit-562 PKO y ARNhcCD36#98#99 doble (ratones alimentados con dieta con alto contenido en grasas y dieta de control) analizados 4 semanas después de la inyección de SCC. Los números indican células CD44bightCD36+, CD44brightCD36- y CD44dim (diferenciadas) en la ventana representada, expresados como porcentajes del tumor parental de s Cc GFP+Lin- total. n = 5 animales por grupo.

Figura 8. A. Imágenes bioluminiscentes (BLI) y cuantificación de xenoinjertos Detroit-562 de reorganización al azar y ARNhc-ACSL1 (#936) a las 4 semanas después de la inyección de SCC. P = 0,001, 0,002; prueba de la t bilateral. B. Frecuencia de metástasis desarrollada hacia los ganglios linfáticos en cada uno de los grupos en A. Reorganización al azar, n = 5; ARNhc-ACSL1, n =5. C. Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) representativa de ganglios linfáticos metastásicos de Detroit-562 de reorganización al azar y ARNhc-ACSL1 (#936, n = 3 animales por grupo).

Figura 9. A. Imágenes bioluminiscentes (BLI) y cuantificación (flujo de fotones normalizado hallado en tumores primarios y metástasis y frecuencia de tumor primario y metástasis desarrollados) de xenoinjertos JHU-029 de reorganización al azar y ARNhc-ACSL1 (#936) a las 2 y 4 semanas después de la inyección de SCC. P = 0,001, 0,002; prueba de la t bilateral. También se representa la frecuencia de tumores primarios y metástasis desarrollados hacia los ganglios linfáticos en cada uno de los grupos. Reorganización al azar, n = 5; ARNhc-ACSL1, n =5. B. Representación del cambio en la intensidad de fluorescencia media para los grupos de: tumores primarios de control JHU-029, CD36 en sobreexpresión y tratados con el ARNhc de reorganización al azar (grupo JHU-029 CD36OE/SCR), o CD36 en sobreexpresión y tratados con ARNhc-ACSL1 (JHU-029 CD36OE/ARNhc-ACSL1) C. Gráfico de barras que representa el nivel de expresión de ARN de CD36, en relación con el control, en los grupos CD36OE/SCR y CD36OE/ARNhc-ACSL1 de A y B.

Figura 10. Las células positivas para CD36 son las responsables de inhibir y fomentar la metástasis del OSCC. A, Configuración experimental. B, A los ratones se les inyectaron células Detroit-562 CD44brightCD36+ o CD44brightCD36- pLuc-GFP clasificadas mediante FACS-(n = 10) y se monitorizó el crecimiento tumoral. Los datos se proporcionan como la media y el e.e.m. CD44brightCD36+, n = 7; CD44brightCD36-, n = 7, P <0,05, prueba de la t bilateral. La flecha amarilla indica una mayor afinidad de las células CD36+ inyectadas por el sitio metastásico. C, Análisis por citometría de flujo de tumores de trasplantes secundarios CD36+ y CD36- a las 4 semanas que muestra el restablecimiento de la heterogeneidad original con respecto a la expresión de CD36/CD44. Los números indican las células CD44brightCD36+, CD44brightCD36- y CD44dim en la ventana representada, expresados como porcentajes del tumor parental de SCC GFP+Lin- total. CD44brightCD36+, n = 5; CD44brightCD36-, n = 5. D, Análisis por citometría de flujo y estrategia de clasificación del cultivo conjunto de 2 días in vitro de Detroit-562 y SCC-25 con OP9 (control) o OP9 inducidas a la adipogénesis (OP9 adipogénicas), que muestra el aumento en el porcentaje de células positivas en los cultivo conjuntos adipogénicos. Los números indican CD44brightCD36+ y CD44brightCD36- con respecto a las células de SCC GFP+CD29- totales.

Figura 11. A. Análisis por citometría de flujo de cultivos conjuntos SCC/OP-9, SCC-25/OP-9 adipogénicas y SCC-25/HNCAF (fibroblastos asociados al cáncer de cabeza y cuello). Se cultivaron conjuntamente SCC-25 parental, CD36-OE (sobreexpresión) y ARNhcCD36 (#98#99) de S^c C-25 en las diferentes condiciones. Se analizaron las células después de 2 días de cultivo conjunto. Los números indican células CD36+ en la ventana representada expresados como porcentaje.

Figura 12. A, Análisis por citometría de flujo de células OSCC cultivadas conjuntamente con OP-9 adipogénicas o con ácido palmítico (PA) 0,4 mM. Los histogramas muestran el número normalizado promedio de eventos en función de la intensidad de fluorescencia de CD36 y CD44. B, Ensayo de absorción de ácidos grasos para células SCC-25 no transducidas (como control, CT) o transducidas con CD36wt (sobreexpresión de CD36 de tipo natural), ARNhc CD36 o y CD36Lys164mut (que expresa una CD36 mutada con K164A). C, Monitorización por BLI (imagen bioluminiscente) de trasplantes de células SCC-25 que sobreexpresan CD36wt (tipo natural, n = 10) o CD36Lys164mut (n = 10). La frecuencia de tumores desarrollados se expresa como porcentaje (P = 0,02, prueba exacta de Fisher) y la cuantificación de las señales de BLI se expresa como el flujo de fotones normalizado relativo (P = 0,05, prueba de la t bilateral). Los datos se proporcionan como la media y el e.e.m. D, Análisis por FACS de células de OSCC que sobreexpresan o bien CD36 de tipo natural (wt) o bien mutante (Lys164mut). Los histogramas muestran el número normalizado promedio de eventos en función de la intensidad de fluorescencia de CD36 y CD44. E. Monitorización por BLI de tumores generados a partir de trasplantes de células tratadas con ácido palmítico. F, Monitorización por BLI de tumores generados a partir de células de OSCC primario transducidas con CD36wt (tipo natural) (n = 10) o mutante CD36Lys164 (n = 10). Los datos de BLI en A-C se muestran como la media y el e.e.m. Todos los gráficos de C, E, F muestran la frecuencia de tumores desarrollados y las cuantificaciones de las señales de BLI.

Figura 13. A, Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) representativa de ganglios linfáticos metastásicos de trasplantes de SCC-25-pLucGFP con CD36wt (tipo natural) o CD36Lys164mut (mutante de sitio de unión a ácidos grasos) sobreexpresados. Las líneas discontinuas indican las áreas rodeadas por gotas lipídicas en Lys164mut. B, C, Inmunotinción con caspasa-3 de las metástasis notificadas en A y en ganglios linfáticos metastásicos ARNhc-CD36 FaDu-pLucGFP, que muestran células apoptóticas positivas para casp-3 activadas en la vecindad de las gotas.

Figura 14. A, Niveles de expresión relativa expresados como porcentajes de cuatro poblaciones, CD36+CD44bright, CD36+CD44dim, CD36-CD44bright y CD36-CD44dim, tal como se determina mediante análisis por FACS del tumor primario y las metástasis de las líneas celulares de OSCC SCC-25, JHU-029, Detroit-562 y FaDu y las líneas de carcinoma derivadas de pacientes (PDC) VDH-00, VDH-01 y VDH-02. Los experimentos se repitieron 4 veces. Figura 15. Niveles de expresión relativa de ARNm de CD36, medidos mediante RT-qPCR, de células clasificadas CD36- de SCC-25 cultivadas conjuntamente, o no, durante 2 días con OP9 adipogénicas (Ad.OP9), o de células clasificadas CD36+ de SCC-25 cultivadas conjuntamente con Ad.OP9.

Figura 16. A, Configuración experimental del ensayo de cultivo conjunto e inyección de células de OSCC y OP9 adipogénicas, clasificadas mediante FACS e inyectadas en la cavidad bucal de ratones NSG. B, Monitorización por imágenes bioluminiscentes (BLI) de trasplantes de células inyectadas Detroit-562/OP-9 y SCC-25/OP-9 y clasificadas CD44brightCD36+ y CD44brightCD36- a partir de OSCC cultivados conjuntamente. Las flechas indican la afinidad aumentada de SCC CD36+ por el sitio metastásico. Detroit-562, CD44bri9htCD36+, n = 5; CD44brightCD36-, n = 6 ; SCC-25, CD44bri9htCD36+, n = 5, CD44brightCD36-, n = 3. C, D, Frecuencia de metástasis (C) y tumores primarios (D) desarrollados generados por los grupos CD44brightCD36+ y CD44brightCD36- de Detroit-562 y SCC-25 en comparación con líneas celulares parentales. P = 0,01, P = 0,009, prueba exacta de Fisher bilateral. Detroit-562, CD44bri9htCD36+, n = 5, CD44brightCD36-, n = 6 ; SCC-25, CD44bri9htCD36+, n = 5, CD44brightCD36-, n = 3. E. Cuantificaciones de señales (flujo de fotones normalizado) de tumores primarios generados por células CD44brightCD36+ o CD44brightCD36- clasificadas a partir de la línea celular de o ScC SCC25. F, G, Frecuencia de células que inician la metástasis (MIC: F) y células que inician el tumor (TIC: G) halladas después de la inoculación ortotópica de diluciones limitativas (tal como se indica a la izquierda) de células CD36+CD44bright, CD36-CD44bright y CD44bright, tal como se indica debajo del eje X.

Figura 17. A, Estrategia de FACS para aislar CD36+CD44bright, CD36-CD44bright y CD44bright de células SCC-25 in vitro cultivadas conjuntamente con células OP-9 adipogénicas. Se inyectaron diluciones limitativas en serie de las diferentes poblaciones inmediatamente después de la clasificación FACS. B, C, Frecuencia de células que inician la metástasis (MIC) (B) y Frecuencia de células que inician el tumor (TIC) (C) de las tres poblaciones diferentes en A, tal como se determina mediante análisis estadístico con el software ELDA.

Figura 18. Los anticuerpos bloqueantes de CD36 previenen e inhiben la metástasis de tumores de OSCC. A, Señal bioluminiscente de SCC FaDu tratado previamente in vitro con xenoinjertos de anticuerpo neutralizante anti-CD36 (JC63.1 y FA6.152) o el isotipo de control correspondiente (IgA y IgG1). Los datos se proporcionan como la media y el e.e.m. Anticuerpo anti-CD36 JC63.1, n = 10; IgA, n = 10; anticuerpo anti-CD36 FA6.152, n = 9; IgG1, n = 10, resultados de dos experimentos independientes, P <0,05, prueba de la t bilateral. B, Frecuencia de tumores primarios desarrollados frente a animales libres de tumores en cada uno de los grupos de A. P = 0,03, prueba exacta de Fisher bilateral. C, Frecuencia de metástasis LN desarrolladas en animales que desarrollaron tumores primarios en A. P = 0,01, P = 0,03, prueba exacta de Fisher bilateral. Ninguno de los animales tratados con anticuerpo anti-CD36 desarrolló metástasis hacia los pulmones. D, A los ratones se les inyectaron células FaDu y después se les inyectó el anticuerpo anti-CD36 FA6.152 por vía intraperitoneal cada 3 días. El gráfico muestra la monitorización bioluminiscente de los tumores. Ninguno de los animales tratados con el anticuerpo anti-CD36 FA6.152 desarrolló metástasis. Anticuerpo anti-CD36 FA6.152, n = 3; IgG1, n = 3. E, A los ratones se les inocularon células Detroit-562 y se monitorizaron cada día mediante bioluminiscencia; una vez que apareció la señal metastásica, se trataron los animales por vía intraperitoneal con anticuerpo neutralizante anti-CD36 JC63.1 o isotipo de control cada día. Los gráficos muestran la monitorización por bioluminiscencia de los tumores. Anticuerpo anti-CD36 JC63.1, n = 7; IgA, n = 8; tumor primario, P = 0,009; metástasis P = 0,005, prueba de la t bilateral. F, El gráfico muestra los cambio en veces en la señal de bioluminiscencia entre T1 (inicio del tratamiento) y T3 (punto de tiempo final) dentro de cada uno de los grupos en E. P = 0,002, prueba de la t bilateral. G, Respuesta a la dosis y señales de imágenes bioluminiscentes (BLI) de tumores de ratones tratados diariamente con anticuerpo monoclonal JC63.1 o el control de isotipo IgA correspondiente durante 3 semanas. H, Monitorización de imágenes de bioluminiscencia y frecuencia de tumores primarios (gráfico de barras derecho superior) o metástasis (gráfico de barras derecho inferior) desarrollados de xenoinjertos VDH-02 tratados de la misma manera que la descrita en G. Anticuerpo anti-CD36 JC63.1, n = 5; IgA, n = 5, P = 0,04, prueba de la t unilateral. I, Imágenes representativas de ganglios linfáticos metastásicos de animales tratados diariamente con anticuerpo neutralizante anti-CD36 JC63.1 o un control de IgA, tomados 2,5 semanas después del inicio del tratamiento. La línea discontinua muestra la diferencia de tamaño de los ganglios linfáticos metastásicos entre los grupos. J, Tinción H&E representativa de los tumores notificados en H. Detroit-562, anticuerpo anti-CD36 JC63.1, n = 4; IgA, n = 4; VDH-02, anticuerpo anti-CD36 JC63.1, n = 3; IgA, n = 3. K, Inmunotinción de caspasa-3 activada de ganglios linfáticos metastásicos de trasplantes Detroit-562 de ratones tratados con anticuerpo monoclonal anti-CD36 JC63.1 (10 mg 100 ml1) o con el control de isotipo IgA. L, Peso de los animales después de un periodo de tres semanas de administración diaria de JC63.1 o IgA. La dosis (5, 10 ó 20 mg 100 ml1) se indican entre corchetes.

Figura 19. A, B, Imágenes de BLI (A) y monitorización (B) de ratones C3H/HeJ inmunocompetentes tratados diariamente con JC63.1 monoclonal o IgA. Los gráficos muestran las señales de BLI de los tumores (P = 0,05, prueba de la t bilateral). C, Cambio en veces en la señal de BLI de las metástasis de los animales notificados en C. El 15% de los ratones mostraron la remisión de los acontecimientos metastásicos, en comparación con ratones tratados con IgA de control. Los datos en B-C se proporcionan como la media y el e.e.m.

Figura 20. El agotamiento de CD36 inhibe la diseminación metastásica de células de melanoma y de cáncer de mama. A, Señales de BLI de las metástasis de ratones inoculados por vía intravenosa con líneas celulares transducidas de plucGFP PLKO y ARNhcCD36 de cáncer de mama luminal-A MCF-7 y melanoma 501mel. Los gráficos muestran la proporción relativa de metástasis desarrolladas por grupo. B, Señales de BLI de las metástasis en A.

Figura 21. A. Correlación de la expresión de firma asociada a CD36 y la supervivencia global (izquierda) y supervivencia libre de enfermedad (derecha) en carcinoma epidermoide de pulmón (LUSC) y carcinoma de vejiga (BLCA). B. Correlación de la expresión de CD36 y la supervivencia global en cáncer de mama luminal A (BRCA). En A y B, línea gris más oscura (línea roja en el original), sujetos cuyas células tumorales expresaron una firma (a) o c D36 (b) mayor que la mediana; línea gris más clara (línea verde en el original), aquellos cuyas células tumorales expresaron una firma (a) o CD36 (b) menor que la mediana.

Descripción detallada

En algunos aspectos, la información técnica presentada a continuación puede ir más allá de la estricta divulgación de la invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la presente invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional, que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la invención.

La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, se basa en los hallazgos logrados por los presentes inventores usando un modelo ortotópico de OSCC para estudiar la heterogeneidad del ciclo celular de células tumorales in vivo, tal como describen Myers et al. (2002). Con este modelo, los presentes inventores han identificado una pequeña población de células CD36+ que contribuyen al inicio y crecimiento de tumores de OSCC pero que tienen una alta predisposición a fomentar la metástasis ganglionar.

Los ensayos descritos en los ejemplos de la presente solicitud muestran el efecto de modulación de la expresión/actividad de CD36 sobre el crecimiento de tumores primarios, que se incluye y cuantifica para varios tumores derivados de pacientes y varias líneas celulares establecidas. Puede observarse que algunos tumores bucales primarios responden mejor que otros a la inhibición de CD36, pero la conclusión general hallada por los presentes inventores es que el agotamiento de CD36 endógena in vivo por parte de ARNhc o el bloqueo de la actividad por medio de anticuerpos neutralizantes reduce ligeramente la carga de tumores primarios.

Sin embargo, los presentes inventores han hallado que, en cada tumor individual sometido a prueba, la inhibición de CD36 (tanto por anticuerpos que neutralizan su actividad como por ARNhc) tiene un efecto drástico en cuanto al inicio y la progresión de la metástasis, disminuyendo la penetrancia metastásica y el crecimiento de todas las líneas celulares y tumores derivados de pacientes que han sometido a prueba. Este es un efecto muy sorprendente porque, tal como se ha comentado anteriormente, se había notificado previamente una correlación inversa para la expresión de CD36 con respecto al potencial metastásico de diferentes tumores, y se había hallado que una baja expresión génica de CD36 se correlacionaba con un mayor grado de metástasis en otros cánceres metastásicos, tales como los cánceres de colon y ovario, y su expresión es prácticamente ausente en líneas de cáncer de mama altamente agresivas.

De manera muy importante, el bloqueo de CD36 previene que las células que fomentan la metástasis sobrevivan y prosperen en los ganglios linfáticos y en los pulmones. Este es un hallazgo notable porque las metástasis, y no el crecimiento de tumores primarios (con algunas pocas excepciones tales como el glioblastoma, que no es un cáncer metastásico, produciéndose la muerte de los pacientes antes de que puedan aparecer las metástasis), son la principal causa de muerte de la mayoría de los pacientes que desarrollan cáncer. A menudo, se desconocen los tratamientos específicos para las metástasis y, particularmente, no hay disponible ningún tratamiento específico para las metástasis derivadas del OSCC. Sin embargo, la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, proporciona una opción terapéutica para el tratamiento de OSCC que puede ser un tratamiento preventivo de las metástasis (un tratamiento de un sujeto que tiene un tumor primario de OSCC destinado a prevenir las metástasis), o un tratamiento de mejora de metástasis ya existentes, particularmente en los ganglios linfáticos y/o en los pulmones.

Tras el agotamiento de CD36 endógena, las pequeñas metástasis restantes contienen un gran número de células tumorales diferenciadas y acumulan grandes cantidades de gotas lipídicas, lo que probablemente da como resultado toxicidad lipídica. Por tanto, la causa más probable de muerte celular es una acumulación intracelular excesiva de lípidos, que da como resultado toxicidad lipídica. Los lípidos están más concentrados en el sistema linfático y los ganglios linfáticos que en la circulación (Dixon et al., 2010; Randolph et al., 2014), y la beta-oxidación de lípidos es más energéticamente eficiente en cuanto a moles de ATP por molécula metabolizada. Por tanto, las células CD36+ podrían aprovechar este entorno de nutrientes específico para obtener la alta cantidad de energía que probablemente se requiere para su anclaje y supervivencia en estos sitios distantes del tumor primario.

Muchos tipos de tumores experimentan metástasis a los ganglios linfáticos o a las áreas ricas en lípidos, tales como la médula ósea. Por tanto, la presente solicitud muestra que el direccionamiento hacia CD36 podría proporcionar un medio terapéutico innovador requerido para detener con éxito la diseminación metastásica en pacientes con SCC bucal o, incluso, tal como indica el análisis de datos sin procesar disponibles públicamente realizado por los inventores, otros tipos de tumores, incluyendo los de vejiga, SCC pulmonar, de glándula mamaria luminal e incluso melanomas (véase el ejemplo 5).

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto caracterizado por reducir o inhibir la actividad y/o expresión de CD36 (también denominado bloqueante de la actividad y/o expresión de CD36) para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la metástasis del carcinoma epidermoide bucal (OSCC) en un mamífero. Preferiblemente, para el tratamiento cuando se encuentra en un estadio de metástasis, de modo que hayan aparecido metástasis y exista al menos una metástasis.

En una realización particular, la invención se refiere particularmente al tratamiento de metástasis de los ganglios linfáticos, de modo que una realización de la invención es el tratamiento de una o más metástasis en al menos un ganglio linfático, cuya metástasis puede proceder de un tumor primario de OSCC o de otro tumor primario. El tratamiento de metástasis pulmonares, particularmente metástasis pulmonares del OSCC, también está comprendido dentro del alcance de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término “bloqueante” incluye cualquier compuesto, o sal del mismo, que reduce o elimina la actividad de su diana, en este caso, CD36. El término bloqueante se usa a menudo como sinónimo de antagonista de receptor (particularmente en el caso de bloqueantes alfa, bloqueantes beta y bloqueantes de los canales de calcio), puesto que una reducción o la inhibición completa de la expresión también da lugar a una reducción de la actividad de la proteína no expresada, el término bloqueante, tal como se usa en el presente documento, también abarca aquellos compuestos que inhiben, parcial o completamente, la expresión del gen correspondiente. Por tanto, un compuesto que puede ser un bloqueante adecuado para los fines de la presente invención puede ser una molécula orgánica pequeña, es decir, un molécula de un tamaño comparable a aquellas moléculas orgánicas usadas generalmente en productos farmacéuticos, moléculas orgánicas que pueden ser naturales pero que a menudo se obtienen mediante síntesis química o modificación de moléculas naturales, y que habitualmente presentan un tamaño de hasta aproximadamente 5000 Da, siempre que tal molécula sea capaz de bloquear, reducir o inhibir la actividad y/o expresión de CD36. Sin embargo, el término también abarca moléculas biológicas, fragmentos o análogos de las mismas de tamaños muy diferentes, de nuevo con la condición de que sean capaces de bloquear, reducir o inhibir la actividad y/o expresión de CD36. Los anticuerpos, por ejemplo, que están formados por cuatro cadenas de polipéptido conectadas en algunos puntos mediante enlaces covalentes dando lugar a una única molécula y que a menudo son capaces de bloquear o inhibir la actividad de esos receptores a los que se unen, se incluyen dentro del grupo de compuestos a partir de los cuales puede seleccionarse un bloqueante para su uso según la presente invención, tal como resulta obvio para algunos expertos en la técnica a partir de los ensayos de algunos ejemplos de la presente memoria descriptiva. Otros compuestos biológicos, tales como aquellas moléculas formadas por varias unidades de nucleótidos o análogos de los mismos, particularmente oligonucleótidos o análogos de los mismos, tales como ARNhc, ARNip, o ADN o ARN antisentido, también están abarcados dentro del significado del término bloqueante.

Por tanto, el bloqueante puede ser un inhibidor de la expresión de CD36. Un “inhibidor de la expresión” se refiere a un compuesto natural o sintético que tiene el efecto de inhibir o reducir significativamente la expresión de un gen, un gen que, para los fines de la presente invención, será el gen CD36. Pueden usarse uno o más ARNhc o ARNip. Ambas clases de compuestos son posibles inhibidores bien conocidos de la expresión génica, en el caso de ARNhc, después del procesamiento mediante Drosha, la inclusión del producto de procesamiento en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) mediante DICER y la unión de la hebra antisentido a la secuencia complementaria del ARNm, con escisión del ARNm cuando la complementariedad es perfecta y represión de la traducción del ARNm mediante RISC en otros casos, lo que conduce al silenciamiento de genes diana en cualquiera de los casos. Algunos ensayos mostrados en los ejemplos a continuación se han llevado a cabo con ARNhc, que pueden expresarse a partir de una multiplicidad de vectores, tales como vectores retrovirales/lentivirales de direccionamiento hacia el gen seleccionado, CD36, tal como se ha realizado en los ejemplos de la presente solicitud. También pueden expresarse a partir de otros vectores adecuados, insercionales o no insercionales, bien conocidos para los expertos en la técnica. Disponibles comercialmente hay una variedad de ARNhc para CD36 humana (e incluso para otras especies, tales como ratón) a partir de diferentes proveedores, tales como Sigma-Aldrich, que también proporciona ARNip. Un ARNip (ARN de interferencia pequeño) es un ARN bicatenario pequeño (20­ 25 nucleótidos) que funciona dentro de la ruta de interferencia del ARN e interfiere con la expresión de genes específicos con secuencias de nucleótidos complementarias degradando el ARN después de la transcripción, lo que no da como resultado la traducción. Cuando se usan ARNip, pueden expresarse a partir de vectores administrados al sujeto o pueden administrarse como tal, en composiciones en las que también pueden estar presentes excipientes adecuados, que se seleccionarán dependiendo de la vía de administración prevista. Pueden diseñarse diferentes ARNhc o ARNip con la ayuda de algoritmos y metodologías conocidas, tales como la descrita en, por ejemplo, la página web de Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/rnai/public/resources/rules).

Tal como resultaría obvio para los expertos en la técnica, puede administrarse la terapia antisentido para ese mismo fin, sintetizando una molécula de ARN o ADN, habitualmente un oligonucleótido, o un análogo del mismo, cuya secuencia de bases es complementaria al ARN mensajero del gen y que se unirá a dicho ARN mensajero y lo inactivará, “desconectando” al gen porque las moléculas de ARNm deben ser monocatenarias para su traducción. Cuando se administran oligonucleótidos en una composición, es preferible usar análogos de los mismos, es decir, oligonucleótidos en los que las unidades de nucleótido tienen alguna modificación química en su estructura. Tales modificaciones son habitualmente en el resto de azúcar y/o en el enlace fosfato, e incluye la adición de uno o más restos no nucleotídicos. El interés de tal modificación es que habitualmente hace que la molécula sea más resistente a las nucleasas, tales como: enlaces de fosforotioato habitualmente usados en lugar de los enlaces fosfato; modificaciones en la posición 2' del resto de azúcar tales como las modificaciones 2'-O-metilo o 2'-O-metoxietilo; modificaciones en las que la ribosa presenta un enlace que conecta el oxígeno en 2' con el carbono en 4', bloqueando de ese modo a la ribosa en la conformación 3-endo (LNA: ácidos nucleicos bloqueados); sustitución de la estructura principal de azúcar por una estructura principal que contiene amida, tal como una estructura principal de aminoetilglicina, tal como en ácidos nucleicos peptídicos (p Na ); uso de PMO (ácidos nucleicos en los que el resto ribosa se sustituye por un grupo morfolina); y otras modificaciones bien conocidas para los expertos en la técnica que pueden hallarse revisadas por, por ejemplo, Kole et al. (2012). Modificaciones adicionales, tales como la unión de uno o más restos colesterol en uno o ambos extremos de las moléculas, pueden facilitar la entrada de la molécula en las células. El diseño de moléculas antisentido puede resultar obvio para los expertos en la técnica a partir de la secuencia de la molécula de ARNm de CD36 y de revisiones tales como la de Kole et al. anteriormente mencionada.

Se prefiere que el bloqueante sea un compuesto o una molécula que module la actividad de CD36, antagonizándola o bloqueándola. Podría usarse cualquier antagonista del receptor de CD36, o incluso agonistas inversos. Tal como se usa en el presente documento, un antagonista del receptor es un fármaco o ligando del receptor que bloquea o dificulta respuestas mediadas por agonistas; como los agonistas son los compuestos que se unen a un receptor y activan al receptor para producir una respuesta biológica, los antagonistas, mediante el bloqueo de la acción de los agonistas, también bloquean, inhiben o disminuyen la actividad del receptor. Un agonista inverso es un compuesto que se une al mismo receptor que el agonista pero ejerce el efecto contrario; los agonistas inversos tienen la capacidad de disminuir el nivel constitutivo de activación del receptor en ausencia de un agonista. El compuesto que bloquea o inhibe la actividad de CD36 puede ser un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo específico. También es posible usar análogos o fragmentos de anticuerpos, tales como anticuerpos monocatenarios, fragmentos de dominio variable de cadena sencilla (scFv), fragmentos F(ab')2 (que pueden obtenerse mediante la digestión con pepsina de una molécula de anticuerpo) o fragmentos Fab (que pueden obtenerse mediante la reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2). Pueden usarse anticuerpos humanizados cuando el sujeto es un ser humano.

Puesto que CD36 tiene varias funciones conocidas, el anticuerpo puede seleccionarse de modo que inhiba todas las funciones conocidas de CD36, incluyendo su interacción con trombospondina, colágenos y ácidos grasos (tal como sucede con el anticuerpo FA6.152 usado en los ensayos mostrados en la presente solicitud), o sólo las funciones específicas, como el anticuerpo JC3.1 también usado en los ensayos divulgados en la presente solicitud, que sólo bloquea la absorción de ácidos grasos y LDL oxidadas. Ambos anticuerpos ejercieron el mismo efecto antimetastásico, tal como puede observarse en el ejemplo 4 de la presente solicitud. Cuando se inocularon in vivo, inhibieron significativamente las metástasis en los LN, redujeron la penetrancia de lesiones bucales en un 25-30%, dieron como resultado una reducción significativa del tamaño de tumores primarios y previnieron completamente cualquier crecimiento metastásico en los LN después de haber inoculado por vía oral células tumorales. De manera muy importante, cuando los ratones tratados ya habían desarrollado metástasis en los LN, el tamaño de las metástasis se redujo en más del 80% (mostrando algunas lesiones una remisión completa) después de inyecciones peritoneales diarias de anticuerpos neutralizantes. Las células grandes se hincharon con lípidos acumulados en las metástasis ganglionares de ratones tratados con anticuerpos neutralizantes contra CD36, de manera similar a la atenuación génica mediada por ARNhc de CD36.

Como los resultados indican que el efecto prometastásico de CD36 en OSCC se basa en su capacidad de modular el metabolismo lipídico, en lugar de sus otras funciones conocidas, se prefiere que el anticuerpo seleccionado sea al menos capaz de bloquear o disminuir la absorción de ácidos grasos y oxLDL.

En los ejemplos a continuación, ninguno de los ratones desarrolló efectos secundarios visibles a partir del tratamiento continuo con anticuerpos neutralizantes contra CD36, lo que indica que los ratones o cualquier otro sujeto mamífero que padezca cáncer, tal como un ser humano, tolerará bien una terapia continua con bloqueantes o inhibidores de CD36 en condiciones clínicas, particularmente una terapia con anticuerpos neutralizantes contra CD36. Aun así, con el objetivo de evitar los posibles efectos secundarios resultantes de la interacción con CD36 en otros órganos que afecten, por ejemplo, a la interacción de CD36 con trombospondina, se prefiere que el anticuerpo seleccionado bloquee específicamente la absorción de ácidos grasos y oxLDL y no afecte a otras funciones o interacciones de CD36.

Tal como se muestra en los ensayos mencionados, los anticuerpos pueden administrarse por vía sistémica, por ejemplo, por vía intraperitoneal, y pueden estar en forma de una suspensión apropiada, por ejemplo, una suspensión acuosa, en agua u otro líquido apropiado tal como solución salina.

Cuando el sujeto que va a tratarse es un ser humano, que es una realización preferida de la presente invención, pueden usarse algunos anticuerpos anti-CD36 comerciales o puede prepararse el anticuerpo para su administración a seres humanos. Para los anticuerpos que se han generado en un sistema inmunitario no humano (como aquellos usados en los ensayos de la presente solicitud), tal como en ratones, la humanización puede ser necesaria para permitir su administración a seres humanos, con el fin de evitar reacciones adversas. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos, habitualmente anticuerpos monoclonales, generados inicialmente en una especie no humana y cuyas secuencias de proteína se han modificado para aumentar su similitud con las variantes de anticuerpo producidas de manera natural en humanos, de modo que permanezca una secuencia mínima derivada de las inmunoglobulinas no humanas. Incluso después de la humanización, la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos humanizados es parcialmente distinta a la de los anticuerpos que se producen de manera natural en seres humanos. Los expertos en la técnica conocen varios procedimientos para la humanización de anticuerpos, tal como se ha revisado por, por ejemplo, Almagro y Fransson (2008), incluyendo: humanización a través de la producción de una quimera ratón-humano (Fab de ratón sometido a corte y empalme con Fc humano), quimera que puede humanizarse adicionalmente mediante la alteración selectiva de la secuencia de aminoácidos de la porción Fab; inserción de uno o más segmentos de CDR del “donante” (anticuerpo no humano) sustituyendo a los segmentos correspondientes de un anticuerpo humano, que puede realizarse usando técnicas de ADN recombinante para crear constructos capaces de expresarse en cultivos de células de mamífero, o incluso evitando el uso de mamíferos no humanos creando bibliotecas génicas de anticuerpos habitualmente derivadas de ARN humano aislado de sangre periférica y mostrado por microorganismos o virus (como en la visualización en fagos) o incluso extractos libres de células (como en la visualización en ribosomas), selección del producto intermedio apropiado (habitualmente, fragmentos de anticuerpo tales como Fab o scFv) y obtención de anticuerpos completos, por ejemplo, de nuevo, mediante técnicas de ADN recombinante. Varios documentos de patente se han dedicado a métodos de humanización como, por ejemplo, el documento US6054297, asignado a Genentech; también son referencias útiles los documentos US5225539 y US4816397.

Los expertos en la técnica conocen bien el método de obtención de anticuerpos monoclonales. En general, los anticuerpos contra el receptor de CD36 pueden generarse según métodos conocidos, tales como aquellos mencionados en manuales de laboratorio clásicos como “Antibodies: A Laboratory Manual, segunda edición”, editado por E.A. Greenfield en 2014, administrando la proteína CD36 completa, o un fragmento o epítopo de la misma, a un animal huésped que es diferente del mamífero en el que se busca un efecto terapéutico. En particular, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse y aislarse mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo, tal como la técnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975), la técnica del hibridoma de células B humanas (Cote et al., 1983) o la técnica del hibridoma del VEB (Cole et al., 1985). Alternativamente, tal como se comentó anteriormente, pueden construirse bibliotecas de expresión de Fab y/o scFv para permitir una rápida identificación de fragmentos que tienen la especificidad deseada para el receptor de CD36.

Para el diseño de anticuerpos con una especificidad particular, resulta ventajoso recurrir a la secuencia de referencia del NCBI anotada (NC_000007.14, versión de anotación de Homo sapiens: 107, que es la versión actual del 29 de septiembre de 2015) o UniProtKB P16671, con el fin de elegir, como inmunógeno, si se desea, un dominio o una región particular del anticuerpo que va a seleccionarse como diana o mutarse antes de la generación de los anticuerpos.

Para lograr un efecto terapéutico, el compuesto, que es un bloqueante de la actividad y/o expresión de CD36, se administrará preferiblemente en cantidades terapéuticamente eficaces. Una “dosis eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” es una cantidad suficiente para ejercer un resultado clínico beneficioso o deseado. La determinación precisa de lo que se consideraría una dosis eficaz puede basarse en factores individuales para cada paciente, incluyendo su tamaño, edad, estadio del cáncer y naturaleza del bloqueante (por ejemplo, constructo de expresión, oligonucleótido antisentido, anticuerpo o fragmento del mismo, etc.). Por tanto, los expertos habituales en la técnica pueden determinar fácilmente las dosificaciones a partir de esta divulgación y el conocimiento en la técnica. También pueden administrarse múltiples dosis al sujeto durante un periodo de tratamiento particular, por ejemplo, diariamente, semanalmente, mensualmente, bimestralmente, trimestralmente o semestralmente. En determinadas pautas posológicas, el sujeto recibe una dosis inicial en un primer punto de tiempo que es mayor que una o más dosis posteriores o de mantenimiento.

Los hallazgos comentados en la presente solicitud también abren camino para la identificación de candidatos para fármacos antineoplásicos, particularmente para el tratamiento de metástasis. La validación y selección clásicas de dianas se han realizado usando células en cultivo y evaluando su efecto inhibidor durante la proliferación y la apoptosis en cultivo. Hasta ahora, este enfoque clásico no ha logrado afectar significativamente a la diseminación metastásica de tumores, de modo que, desafortunadamente, muchos fármacos antiproliferativos/proapoptóticos potentes in vitro e in vivo han fracasado en la clínica. En la actualidad, el campo del cáncer ha logrado desarrollar buenos modelos para estudiar y caracterizar la metástasis (incluyendo excelentes ejemplos en melanoma, cáncer de colon, cáncer de mama y, en el presente caso, cáncer bucal humanos), lo que está permitiendo entender el proceso de la metástasis de una manera sin precedentes.

Los presentes inventores también se han esforzado en desarrollar sistemas para seleccionar los mejores candidatos a anticuerpo/compuesto pequeño, aprovechando el hecho de que el mecanismo mediante el cual el agotamiento/bloqueo/inhibición de CD36 da como resultado un efecto muy claro sobre la reducción del crecimiento e inicio de la metástasis se basa en el metabolismo lipídico. Sin desear estar vinculados a ninguna teoría, la inhibición de CD36 parece prevenir la capacidad de las células metastásicas de obtener las grandes cantidades de energía que requieren para sobrevivir en un sitio distante a través del metabolismo lipídico, una fuente de energía que se ve favorecida por la célula tumoral metastásica cuando se colonizan los ganglios linfáticos, un motivo por el que se espera que el mecanismo similar pueda estar implicado en otras metástasis desarrolladas en el ganglio linfático. Por tanto, la presente divulgación también proporciona un método para identificar un compuesto como candidato para el tratamiento de metástasis del OSCC, que comprende las etapas de:

a. poner en contacto el compuesto con células de ensayo CD36+;

b. comprobar si se produce un efecto relacionado con el bloqueo o agotamiento de CD36;

c. identificar el compuesto como candidato para el tratamiento de metástasis del OSCC si se produce tal efecto. Es posible llevar a cabo el método in vivo, tal como se ha llevado a cabo en el ejemplo 4 de la presente solicitud, de modo que las células de ensayo son células de una metástasis, preferiblemente una metástasis ganglionar, que se ha inducido por la inoculación oral de un modelo animal con células tumorales de OSCC, el compuesto entra en contacto las células sometidas a ensayo porque se administra al animal (por ejemplo, por vía intraperitoneal) y el efecto esperado es la reducción del tamaño de la metástasis previamente producida en comparación con el tamaño que tenía antes de la administración del compuesto candidato. Un efecto alternativo sobre CD36 que va a determinarse es la acumulación de grandes células hinchadas con lípidos en las metástasis con respecto a un control, que no ha recibido el compuesto candidato.

También se describe una variante en la que el método puede llevarse a cabo in vitro, en el que las células sometidas a ensayo son células de SCC que se cultivan en un medio que se ha usado previamente para cultivar adipocitos y que aumenta el número de células CD36+ (son suficientes 2-3 días de cultivo de las células de SCC). Con este método, el porcentaje de células CD36+ se vuelve muy similar al que puede detectarse en metástasis ganglionares in vivo. El posible compuesto candidato entra en contacto con tal cultivo y se somete a prueba el fomento del crecimiento con respecto a un control que no se ha puesto en contacto con el compuesto candidato. Si disminuye el fomento del crecimiento, el compuesto se identifica como posible candidato como agente antineoplásico, particularmente contra las metástasis, especialmente metástasis del OSCC.

También se describe una versión alternativa del método in vitro, que se basa en visualizar la acumulación de lípidos en las células de SCC que se han tratado con anticuerpos neutralizantes contra CD36 u otro compuesto candidato. El método aprovecha el uso de sensores de lípidos, tales como el usado en la presente solicitud, que se basa en derivados del fluoróforo conocido como Bodipy. Todas las células absorben Bodipy cuando está en el medio de cultivo, porque simplemente es un lípido fluorescente, pero aquellas que se han tratado con el candidato a agente antineoplásico deben mostrar una clara acumulación de gotas lipídicas hinchadas, tal como se ha observado in vivo, que pudo visualizarse gracias al lípido fluorescente usando la longitud de onda apropiada. Una realización particularmente preferida es una que usa una versión modificada de Bodipy que únicamente se vuelve fluorescente cuando se internaliza en la célula (http://www.moleculardevices.com/reagents-supplies/assay-kits/transporters/qbtfatty-acid-uptake-assay-kit) y que hace que el ensayo sea incluso más limpio.

En cualquiera de las realizaciones, el compuesto que se somete a prueba puede ser un anticuerpo que se usa para tratar a las células con el mismo.

La invención, tal como se define en las reivindicaciones, se ilustra por medio de los siguientes ejemplos y las siguientes figuras.

Ejemplos

Los ensayos divulgados en los ejemplos a continuación se llevaron a cabo usando los siguientes materiales y las siguientes metodologías.

- Estudios en animales.

Los ratones NOD scid gamma (NSG) (NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm1Wjl/SzJ) se adquirieron de Charles River y se cruzaron internamente. Todos los ratones fueron alojados bajo un régimen de ciclos de 12 h de luz/12 h de oscuridad y condiciones SPF, y todos los procedimientos fueron evaluados y aprobados por el CEEA (Comité Ético para la Experimentación Animal) del Gobierno de Cataluña. Para establecer células tumorales derivadas de pacientes, se implantaron tumores por vía subcutánea en los ratones NOD scid gamma inmediatamente después de la resección tumoral del paciente. Una vez que habían crecido los tumores, se recogieron y se disgregaron, y las células tumorales se analizaron mediante FACS y se cultivaron tal como se describe a continuación. Para los experimentos de marcaje con 5-bromo-2-desoxiuridina (BrdU), a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal una dosis única de 100 |ig g_1 de BrdU (Invitrogen) y después se analizaron a las 24 h. Se realizó una inyección intralingual de SCC tal como se describió anteriormente (Oskarsson et al., 2014; Nieman et al., 2011). En resumen, se anestesiaron los ratones mediante una inyección intraperitoneal con una mezcla de 50 mg por kg de ketamina y 0,5 mg por kg de medetomidina y se inyectaron las células de SCC resuspendidas en 30 |il de PBS en la lengua de cada ratón con una aguja BD Ultra-Fine de 6 mm. Para la inyección intravenosa de células, se anestesiaron los ratones con la administración continua de gas isofluorano y se les inyectó mediante inyección retroorbital 100.000 células en 100 |il PBS. Se monitorizó la señal bioluminiscente de la luciferasa en los ratones inmediatamente después de la inyección (T0) y una vez a la semana después de eso con un dispositivo Xenogen IVIS Imaging System-100 (Caliper Life Sciences). En resumen, a los animales se les inyectó mediante inyección retroorbital 50 |il de D-luciferina (Promega) diluida en 1x PBS a 5 mg ml-1. La administración continua de gas isofluorano se proporcionó para garantizar la anestesia de los animales durante la obtención de imágenes. Los datos se cuantificaron con el software Living Image, versión 4.4 (Caliper Life Sciences). Las cuantificaciones se calcularon con píxeles insaturados. Los valores mínimo y máximo de la escala de colores se muestran en las imágenes.

Para las inyecciones intravenosas de la línea celular de mama MCF-7, se implantó por vía subcutánea un gránulo de 17-beta-estradiol (0,18 mg por gránulo, liberación a los 60 días; Innovative Research of America) en hembras NSG de 8 semanas de edad 3 días antes de la inyección intravenosa. Se analizó la BLI para los animales inyectados con MCF-7 y 501mel a las 6 ó 4 semanas posteriores a la inoculación, respectivamente.

Para tatar a los ratones in vivo con anticuerpos neutralizantes anti-CD36, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 100 |il de suero fisiológico que contenía 2,5 |ig de anticuerpo monoclonal neutralizante anti-CD36 FA6.152 (Abcam, ab17044) o 2,5 |ig de la IgG1 correspondiente (IgG1 monoclonal de ratón NCG01, Abcam, ab81032), 100 |j,l de suero fisiológico que contenía 5 ^g, 10 ^g o 20 .^g de anticuerpo monoclonal neutralizante anti-CD36 JC63.1 (C^a YMAN, CAY-10009893-500) o 5 ^g, 10 ^g o 20 ^g de la IgA correspondiente (IgA de ratón, kappa [S107], Abcam, ab37322). Todos los anticuerpos estaban libres de azidas sin compuesto conservante añadido.

Se realizaron experimentos de dietas con alto contenido en grasas alimentando previamente a los ratones durante 7 días antes de inocular a los ratones con las células tumorales y, después de eso, con una dieta 60/Fat Research (TD.06414, Harlan). Se usó una dieta normal para los grupos de control. Para el tratamiento con doxiciclina, los ratones se trataron de manera continua con 50 ^g ml-1 de doxiciclina nueva en el agua de beber que contenía sacarosa al 5% y protegida de la luz. Se midieron los niveles de glucosa una vez a la semana en un momento controlado usando un medidor de glucosa (BAYER ContourRnext).

Para cada experimento, se sacrificaron los ratones al mismo tiempo, una vez que un grupo experimental alcanzó el criterio de valoración compasivo según el protocolo aprobado por el CEEA (4-6 semanas después de la inyección ortotópica tan pronto como los ratones comenzaran a perder peso debido al crecimiento de la lesión bucal), y posteriormente se realizó el análisis celular.

Se recogió el tejido de los animales y se fijó con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 2 ha temperatura ambiente (TA) y después se incrustó en OCT y se congeló a -80°C, o se deshidrató y se incrustó en parafina. Se realizó el estudio toxicológico en el Centro de Histopatología según procedimientos convencionales.

Se recogieron muestras de sangre completa de los ratones a partir de la vena cava inferior y después se procesaron en la Unidad de Toxicología Experimental y Ecotoxicología (pCb) siguiendo procedimientos convencionales.

- Material clínico.

Se obtuvieron muestras biológicas de pacientes del Hospital Vall d’Hebron (Barcelona, España) con el consentimiento informado y la aprobación del Banco de Comités de Tumores del hospital según la normativa ética española. El estudio siguió las pautas de la Declaración de Helsinki, y la identidad de los pacientes y las muestras patológicas permanecieron anónimas en el contexto del estudio.

-Plásmidos.

El retrovirus MSCV-IRES-Luciferasa-GFP fue proporcionado amablemente por el Dr. Johannes Zuber (Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter, Austria) (Kalluri et al., 2006). Se llevaron a cabo experimentos de atenuación génica de CD36 y ACSL1 usando ARNhc lentiviral de direccionamiento hacia el gen seleccionado (Sigma Aldrich y Dharmacon, respectivamente) (véase la tabla 1a a continuación). Se usó una secuencia de ARNhc de no direccionamiento como control (control pLKO.1-TRC; Addgene, plásmido #10879).

Se llevaron a cabo experimentos de CD36-OE (sobreexpresión) clonando ADNc de CD36 en el vector PMSCV lentiviral. Se usó un vector vacío como control.

El constructo mutante CD36Lys164mut (K164A) se realizó usando el kit de 'mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II XL (n.° de catálogo #200521, Agilent Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante, con el par de cebadores K164A Fwd y K164A Rv (véase la tabla 1b a continuación) y el plásmido pMSVCD36OE como molde. La secuencia del plásmido CD36Lys164mut se comprobó mediante secuenciación de Sanger. La secuencia de ADNc y de aminoácidos del receptor de CD36 al nivel de la mutación puntual introducida para generar el mutante de sitio de unión a ácidos grasos CD36Lys164mut son los siguientes:

^{........ TC A CTC ATT AAC. AAG TCA AAA TCT TCT} ...... (SEQ ID NO:6)

S ^L I ^{N K___} s ^K s S (SEQ ID NO:7)

480 490 500

Tabla 1.-ARNhc y cebadores usados junto con los plásmidos

- Cultivo celular.

Todas las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37°C con el 5% CO2. Se hicieron crecer células SCC-25 (ATCCR CRL-168™) y derivadas de pacientes (VDH-00, VDH-01 y VDH-02) en medios de queratinocitos libres de suero (KSFM, GIBCO) complementados con 5 ^g ml-1 de penicilina/estreptomicina, 0,025 mg ml-1 de extracto hipofisario bovino y 0,2 ^g ml-1 de hEGF. Se hicieron crecer células JHU-029 (The Johns Hopkins University) en RPMI (GIBCO) complementado con 5 .^g ml-1 de penicilina/estreptomicina y extracto bovino fetal al 10% (FBS; GIBCO). Se hicieron crecer células FaDu (ATCCR HTB-43™) y Detroit (ATCCR CCL-138™) en EMEM (LONZA) complementado con 5 ^g ml-1 de penicilina/estreptomicina y FBS al 10% (GIBCO). Se hicieron crecer células MCF-7 (ATCCr HTB-22tm) en EMEM (LONZA) complementado con 5 mg ml-1 de penicilina/estreptomicina, 0,01 mg ml-1 de insulina recombinante humana y FBS al 10% (GIBCO). Se hizo crecer la línea celular humana 501mel (proporcionada amablemente por la Dra. Claudia Wellbrock, Centro de Investigación contra el Cáncer de Manchester, Universidad de Manchester, R.U.) en DMEM complementado con 5 mg ml-1 de penicilina/estreptomicina y FBS al 10% (GIBCO). Se hicieron crecer HNACFS (fibroblastos asociados a tumor de cabeza y cuello) en DMEM complementado con 5 mg ml-1 de penicilina/estreptomicina, FBS al 10% (GIBCO) y 1 x complemento G de insulina, transferrina y selenio (Invitrogen). Se cultivaron células OP9 y se diferenciaron en adipocitos tal como se describió anteriormente (Wolins et al., 2006). En resumen, se cultivaron las células y se amplificaron en medio MEM-alfa glutaMAX™ (MEM-a, GIBCO) complementado con FBS al 20% (GIBCO) y 5 mg ml-1 de penicilina/estreptomicina. Para diferenciarlas en adipocitos, se hicieron crecer células OP-9 hasta confluencia y después se cultivaron durante 2 días adicionales en MEM-a complementado con el 15% de sustituto de suero KnockOut™ (GIBCO) y 5 mg ml-1 de penicilina/estreptomicina. Para los experimentos de cultivo conjunto, se sembraron células de SCC (OSCC) sobre OP9 adipogénicas confluentes durante de 12 a 48 h a 37°C con el 5% CO2. Se usaron células PhoenixA y 293T hechas crecer en DMEM/FBS al 10% para la producción de retrovirus y lentivirus, respectivamente, después de la transfección con el método de CaCh. Para la selección, se añadieron 2,5 mg ml-1 de puromicina o 0,3 mg ml-1 de G418 a los medios. Todas las líneas celulares dieron negativo para la contaminación por micoplasma. Para los experimentos de conservación del marcaje, las células se sometieron a tripsinización con tripsina-EDTA al 0,25% (GIBCO), se lavaron dos veces en 1x PBS y se incubaron con VybrantR DID (Molecular Probes, V-22887) a una dilución 1:200 en 1x PBS durante 20 min a 37°C. Después de la incubación, se lavaron las células dos veces con 1x PBS para retirar el colorante en exceso. Cabe destacar que el colorante recubrió de manera homogénea todas las células en cultivo y fue indetectable mediante FACS después de un promedio de ocho divisiones celulares. Para el tratamiento de OSCc con ácido palmítico, se preparó palmitato de sodio (P9767, SIGMA) como una disolución madre 2,5 mM disolviéndola en 1 ml de NaOH 0,1 M y calentando a 80°C hasta que fue transparente. La disolución de ácidos grasos se complejo con BSA libre de ácidos grasos (A7030, SIGMA) en una razón molar ácido graso/BSA de 5:1; en resumen, se disolvieron 0,325 g de BSA en 8 ml de NaCl al 0,9% y se calentó la mezcla hasta 45°C. La disolución transparente de palmitato se añadió gota a gota mediante una pipeta con agitación. La disolución madre final se filtró a 0,45 q, se tomaron alícuotas y se almacenaron a - 20°C. Las células de OSCC que se hicieron crecer en medios libres de suero se trataron in vitro con 0,4 mM de palmitato durante 48 h. Para el tratamiento previo de los anticuerpos, las células se recogieron mediante tripsinización con tripsina-EDTA al 0,25% (GIBCO), se lavaron dos veces en 1x PBS y se incubaron con anticuerpo neutralizante anti-CD36 JC63.1 (CAYMAN, CAY-10009893-500) a 100 .^g ml-1, anticuerpo anti-CD36 FA6-152 a 50 .^g ml-1 (Abcam, ab17044) o los controles de isotipo correspondientes IgA de ratón, kappa (Abcam, ab37322) a 100 .^g ml-1 o IgG1 de ratón NCG01 (Abcam, ab81032) a 50 .^g ml-1, suspendidos en 1x PBS a 37°C durante 2 h. Después se lavaron las células dos veces con 1x PBS para retirar el exceso de anticuerpo. Todos los anticuerpos estaban libres de azidas sin compuesto conservante añadido. Para la inyección intralingual de células de SCC (OSCC), las células cultivadas se sometieron a tripsinización con tripsina-EDTA al 0,25% (GIBCO) diluida en PBS/azul de tripano, se contaron en una cámara Neubauer y se resuspendieron en 1x PBS. Para las células SCC-25 y JHU-029, se inyectaron 100.000 células por ratón; para las células FaDu, Detroit-562 y derivadas de pacientes, se inyectaron 50.000 células por ratón. Para los ensayos de dilución limitante, se inyectaron diluciones en serie (50.000, 20.000, 10.000, 1000 ó 100 células) de células de OSCC CD44bright, CD36+CD44bright o CD36-CD44bright clasificadas inmediatamente después de la clasificación en la lengua de los ratones NSG. Para la inyección intravenosa, se inyectaron 100.000 células en 1x PBS mediante inyección retroorbital. Se monitorizaron los ratones mediante determinación de la bioluminiscencia para determinar la respuesta positiva del tumor primario y/o el crecimiento de la metástasis. La frecuencia de células activas de las células que inician el tumor o células que inician la metástasis se estimó mediante análisis estadístico a los 60 días después de la inyección (criterio de valoración compasivo) usando el software ELDA (análisis por dilución limitante extrema, http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/) (Goel et al., 2013).

El ensayo de absorción de ácidos grasos se realizó usando el kit explorador del ensayo de absorción de ácidos grasos QBT (Molecular Dispositivos), según las instrucciones del fabricante. En resumen, se hicieron crecer células de OSCC en medios acondicionados adipogénicos durante 72 h y se recogieron, y se sembraron en una placa de 96 pocillos, a una densidad de 50.000 células por pocillo, con medios acondicionados adipogénicos 100 mB. Después de 24 h, se privó a las células de suero y se incubaron durante 1 h a 37°C con el 5% CO2. Se leyeron las placas usando un instrumento de fluorescencia Biotek FL600, lectura inferior, sensibilidad media (150), excitación 488/emisión 515 y un valor de corte de filtro de 495 nm.

- Disgregación tumoral a partir de ratones xenoinjertados.

Se aislaron los tumores de los ratones y se retiró el tejido conjuntivo lo máximo posible. Se cortó el tejido en tripsina 1-300 al 0,5% (MP Biomedical) en medio KSFM (GIBCO) en una cortadora de tejidos Mcllwain. Después de la completa homogeneización, se incubaron las muestras a 37°C durante 90 min con agitación. Los homogeneizados se filtraron secuencialmente a través de tamices BD de 100 |im, 70 |im y 40 |im y se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 min a 4°C. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió cada sedimento celular en 1x PBS/FBS quelado con calcio al 4% (Calon et al., 2012) para la tinción de los anticuerpos y el posterior análisis de FACS. - Análisis de clasificación FACS.

Para el análisis de xenoinjertos (trasplantes ortotópicos), se incubaron las muestras durante 45 min a TA con anticuerpo anti-CD36-PercP-EFluor 710 (ref. 46-0369-41, E Bioscience) y anticuerpo anti-CD44-PeCy7 (clon GG-26 de CD44, ref. 560533, BD Pharmigen) a una dilución 1:100 y, para excluir células de ratón contaminantes, un cóctel negativo para la progenie conjugado con biotina que se componía del clone MEC13.3 del anticuerpo anti-CD31 (ref. 553371, BD Pharmigen, dilución 1:200), clon 30-F11 del anticuerpo anti-CD45 (ref. 13-045-81, eBioscience, dilución 1:200), anticuerpo anti-H2Kd (ref. 553564, eBioscience, dilución 1:200) y el cóctel Lin de ratón (ref. 120-003­ 582, MACS Miltinyi Biotech, dilución 1:20). Después de la primera incubación, se lavaron las muestras en 1x PBS/FBS quelado con calcio (Nowak y Fuchs, 2009) y se centrifugaron para la segunda incubación con estreptavidina-Brilliant Violet (BV) 605 (ref. 405229, Biolegend, dilución 1:50) durante 30 min a TA y después se resuspendieron en 1x PBS/FBS quelado con calcio al 4% (Calon et al., 2012) con DAPI a una dilución 1:1000 para el análisis de FACS. Para analizar los experimentos de cultivo conjunto de células de SCC (OSCC) con adipocitos o fibroblastos asociados a tumor, se incubaron las muestras durante 45 min a TA con anticuerpo anti-CD36-PercP-EFluor 710 (ref. 46-0369-41, E Bioscience) así como con un anticuerpo de ratón/rata anti-CD29-APC, clon HMb1-1 (ref. 1002216) para excluir los adipocitos. En cada caso se usaron controles sin teñir y de un solo color. Las muestras se analizaron en un instrumento BD FACSAria FUSION. Para la clasificación FAC^s , se seleccionaron las células basándose en su dispersión directa y lateral excluyendo el residuo celular. Los dobletes y las células muertas se eliminaron mediante DAPI o yoduro de propidio (PI). Se seleccionaron las células positivas para GFP excluyendo las células positivas para Lineage-BV. Se seleccionó esta población para su posterior análisis o directamente para la inyección en la lengua de los ratones.

Se midieron las enzimas de oxidación de ácidos grasos mediante citometría de flujo con el kit de citometría de flujo para humanos de la oxidación de ácidos grasos (Abcam, ab118183), según las especificaciones del fabricante. - Inmunofluorescencia y análisis histológico.

Se permeabilizaron secciones recuperadas de antígenos crioparafinizadas o desparafinizadas (10 min en ebullición de ácido cítrico 0,01 M, pH 6,0) de 8 |im durante 25 min en Triton X-100 al 0,25%/PBS y se bloquearon durante 90 min en gelatina al 0,25%/PBS. Se incubaron anticuerpos primarios durante la noche a 4°C y se incubaron anticuerpos secundarios 2 h a temperatura ambiente en gelatina al 0,25%/PBS. Se tiñeron los núcleos con DAPI (1:5000, Roche) y se montaron los portaobjetos en Mowiol. Los anticuerpos primarios usados fueron anticuerpo de rata anti-CD44 a 1:100 (eBioscience), anticuerpo de conejo anti-caspasa-3 (Abcam, ab13847) y anticuerpo de conejo anti-GFP a 1:1000 (Life Technologies). Se analizaron los colorantes DID (D-7757, Molecular Probes) y DIL (D-3911, Molecular Probes) mediante inmunofluorescencia directa. Los anticuerpos secundarios usados estaban conjugados con Alexa Fluor (R37118, A-11006, A-10042, A-11077, Molecular Probes). Para la visualización de gotas lipídicas neutras, se tiñeron criosecciones congeladas con Bodipy 558/568 C12 (Molecular Probes, D-3835) tal como se describió anteriormente (Spangenburg et al., 2011). Se realizó tinción con hematoxilina y eosina (H&E) según el protocolo convencional. Se adquirieron imágenes usando un dispositivo Nikon E600+Olympus DP72, un dispositivo Leica SPE y un microscopio confocal Leica TCS SP5. En cada caso se seleccionaron imágenes representativas. - Análisis de la expresión génica.

El aislamiento de ARN y la amplificación de ADNc se realizaron tal como describieron Gonzalez-Roca et al. (Gonzalez-Roca et al., 2010). En resumen, se clasificaron las células en tampón de lisis y se purificó el ARN usando perlas magnéticas (perlas RNAClean XP, Agencourt). El ARN se sometió a transcripción inversa y el ADNc se amplificó usando química de amplificación del transcriptoma completo (WTA2, Sigma Aldrich). Para monitorizar la amplificación, se añadió SYBR Green a la reacción; se detuvo cuando la señal de SYBR Green alcanzó una meseta. El ADNc se purificó usando el kit de purificación de PCR Purelink Quick (Invitrogen). El ADNc se marcó usando el kit de ensayo GeneChip Mapping 250^k Nsp (Affymetrix; n.° de catálogo #900766), según las instrucciones del fabricante. Se hibridaron alineamientos Affymetrix PrimeView con 8 mg de ADNc marcado, se lavaron, se tiñeron y se analizaron según el protocolo descrito en el manual de usuario del kit de expresión de 3' IVT GeneChip®. Los alineamientos se analizaron con el analizador GeneChip 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Se calcularon las señales de expresión normalizadas a partir de archivos CEL de Affymetrix usando el algoritmo RMA (Irizarry et al., 2003). Se estimó el Log2 de la expresión en RMA.

Para los microalineamientos de Agilent, se extrajo el ARN total a partir de células clasificadas mediante FACS con el kit RNAClean XP, Agentcourt A63987, siguiendo las instrucciones del fabricante, y se amplificó inmediatamente usando el kit de amplificación del transcriptoma completo TransPlex (Sigma WTA2) para generar el ADNc. Se preparó ADNc marcado con cianina-3 (Cy3) a partir de 500 ng de ADNc bicatenario usando el kit de marcaje enzimático de ADN (Agilent 5190-0449) según las instrucciones del fabricante, seguido de purificación en columna (Amicon 30kDa). La incorporación del colorante y el rendimiento del ADNc se comprobaron con el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. Los alineamientos se analizaron con un analizador Agilent G2539A a una resolución de 3 um y el 100% de PMT. Se extrajeron los datos de intensidad de las hibridaciones individuales y se evaluó la calidad con el software de extracción de características 10.7 (Agilent). Se corrigió el ruido de fondo de los datos sin procesar usando el método normexp. Se aplicó normalización por cuantiles para garantizar comparabilidad entre muestras. Se estimó el log2 de los valores de intensidad normalizador. Las razones relativas en -log2 de DiD-/DiD+, DiD-/CD44dim y DiD+/CD44dim se calcularon respectivamente, y los genes se filtraron basándose en una razón en -log2 DiD-/DiD+ igual o superior a 1,5; P < = 0,005.

Para el análisis de la expresión génica que compara el transcriptoma de células CD36+ y CD36-, todos los análisis se realizaron usando R (Dean y Nielsen, 2007) y Bioconductor (Gentleman et al., 2004). Los microalineamientos de Affymetrix se procesaron usando normalización RMA tal como se implementa en el paquete affy Bioconductor R (Gentleman et al., 2004). Se realizó la anotación usando información del conjunto de sondas proporcionada por Affymetrix en su página web de asistencia de productos (http://www.affymetrix.com/support/ descargada el 19/09/2014). El análisis de expresión diferencial entre muestras CD36+ y CD36- se llevó a cabo al nivel de conjunto de sondas usando estadísticos t moderados mediante contracción empírica de Bayes tal como se implementa en el paquete limma R (Smyth G, 2005). Para hacer eso, se calcularon diferencias emparejadas dentro de réplicas biológicas y se ajustó un modelo lineal a las mismas usando la réplica como covariable (duplicado de funciones Correlation e ImFit) (Smyth G, 2005). Se aplicó la corrección de Benjamini y Hochberg (Benjamini Y, 1995) para el ajuste de contraste múltiple. Se usó análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) (Subramanian et al., 2005) para evaluar el enriquecimiento de un conjunto de genes de metabolismo de ácidos grasos a partir de la colección de conjuntos de genes distintivos proporcionada por la base de datos de firmas moleculares del Broad Institute (MsigDB-H; KEGG FATTY ACID METABOLISM; descargado el 15/07/2015) (Chen et al., 2011). En estos análisis, los datos (conjuntos de sondas) se colapsaron al nivel de gen seleccionando el conjunto de sondas que mostraba la desviación estándar más alta dentro de cada gen. Los genes se clasificaron según el valor absoluto de su estadístico t limma y, por tanto, según los cambios en veces entre condiciones.

También se usó el software Genomatix, versión v3.4 (http://www.genomatix.de/) (Berriz et al., 2003) para el análisis de las rutas y de la ontología génica. Usando el software Genomatix, el análisis de las rutas se basa en el minado de datos de PubMed, refiriéndose a Biocarta, STKE o KEG. Se depositó el conjunto de datos completo en la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (Barrett et al., 2006) y se encuentra accesible con el número de registro GSE72939.

- PCR en tiempo real.

Se realizó PCR en tiempo real usando sondas de expresión génica TaqMan (Applied Biosystems, véase la tabla 2 para la identificación de ensayo correspondiente a cada sonda) y se analizó usando un instrumento de PCR en tiempo real 7900-HT Fast (Applied Biosystems). Se determinaron los niveles de expresión relativa mediante normalización a beta-2-microglobulina (b2m) usando método el AACT.

Tabla 2.- Identificación de ensayo de las sondas Taqman usadas en la RT-PCR

- Análisis bioinformático.

Se descargaron los datos del proyecto TCGA del cbioportal (Gao et al., 2013; Cerami et al., 2012). Se compararon los datos de expresión, calculados como puntuaciones z de ARNm (ARN Seq V2 RSEM, Agilent) con la distribución de expresión de cada tumor de genes que son diploides para este gen consultado. Para el cáncer de mama A luminal se usó la información de estadificación asignada a la 7a edición tal como se notifica en [doi:10.1038/nature11412]. Las subclasificaciones de estadios se colapsaron con los estadios I, II, III y IV. La expresión de la firma del gen se calculó promediando las firmas de todos los genes para cada paciente. Se escalaron tanto las expresiones de C36 como de las firmas antes de ajustar el modelo. Se ajustó un modelo Cox a los datos de supervivencia global y de supervivencia libre de enfermedad con el estadio, el sexo, la edad y el subtipo histológico como covariables. La significación de la asociación entre la expresión y la supervivencia se evaluó con una prueba del cociente de verosimilitudes tal como se implementa en la función R “drop1”.

- Análisis estadístico.

Para todos los experimentos, se determinó el tamaño de muestra adecuado basándose en los resultados de estudios piloto. No se usó ningún método estadístico para determinar el tamaño de la muestra. Todos los animales que cumplían las condiciones experimentales apropiadas durante los procedimientos experimentales se incluyeron en el análisis. Basándose en los resultados de estudios piloto, se usaron grupos homogéneos de machos y hembras de entre 8 y 10 semanas y sus hermanos de la misma camada de control para los estudios experimentales. No se hallaron diferencias estadísticamente con respecto al sexo de los ratones ni con respecto al método de aleatorización que se usó anteriormente descrito. En general, los datos se muestran como la media ± e.e.m. Se analizó la significación estadística usando el software Prism 6 (GraphPad) usando una prueba de la t bilateral, una prueba de la U de Mann-Whitney, una prueba exacta de Fisher o una prueba hipergeométrica. La significación se consideró a P < o igual a 0,05.

- Ejemplo 1.- Identificación de una subpoblación de baja proliferación en OSCC

Se usó un modelo ortotópico de OSCC humano para estudiar la heterogeneidad del ciclo celular de células tumorales in vivo (Myers et al., 2002).

Para determinar si los OSCC albergan una subpoblación de baja proliferación de células cancerosas in vivo, los inventores implantaron en primer lugar células de OSCC humanas a partir de líneas celulares establecidas (SCC-25, FaDu, Detroit-562 y JHU-029) o a partir de muestras de tumor primario (VDH-00, VDH-01 y VDH-02), transducidas con un vector retroviral que expresa luciferasa y la proteína fluorescente verde (Luc-GFP), en la lengua de ratones NOD-SCIDy inmunodeprimidos (NSG). Todas las líneas celulares y las células derivadas de pacientes (PDC) generaron tumores primarios con el 100% de penetrancia, aunque con diferentes cinéticas de crecimiento. La tabla 3 muestra los datos relevantes.

Tabla 3. Generación de tumores primarios a partir de líneas celulares o muestras de tumor implantados

Curiosamente, este modelo ortotópico de OSCC recapituló la diseminación metastásica a los ganglios linfáticos (LN) que se produce en pacientes. Sin embargo, la penetrancia de la colonización de LN entre las diferentes células tumorales fue mucho más variable que el crecimiento de tumores primarios, mostrando algunas células tumorales un potencial metastásico muy alto (FaDu, Detroit-562, VDH-02), intermedio (VDH-01, SCC-25) o bajo (JHU-029, VDH-00). Sólo las células FaDu generaron metástasis pulmonar. Cabe destacar que la capacidad comparativa de estas líneas celulares y las PDC de fomentar la metástasis fue independiente del tamaño de los tumores primarios que desarrollaron.

Para estudiar la heterogeneidad del ciclo celular in vivo, los inventores pulsaron cada línea celular transducida con Luc-GFP y las PDC en cultivo con un colorante fluorescente lipófilo, no tóxico, altamente estable (DID) que se une inespecíficamente a las membranas y se diluye tras la división celular (Yumoto et al., 2014). El colorante recubrió homogéneamente todas las células en cultivo y fue indetectable mediante FACS después de un promedio de ocho divisiones celulares. Cuando se inyectaron por vía ortotópica las PDC o líneas celulares tumorales pulsadas en la cavidad bucal de ratones NSG, los autores observaron un pequeño porcentaje de células que conservaban el marcaje (LRC) a largo plazo, CD44bright, dentro de las lesiones orales generadas (figura 1A). Las LRC también se visualizaron mediante fluorescencia directa dentro de las células tumorales que expresan los niveles más altos de CD44. Los pulsos de BrdU 24 h antes de la recogida de los tumores bucales confirmaron que la población CD44bright/dye+ proliferaba menos in vivo que su análoga CD44bright/dye- (figura 1B). Por tanto, la población CD44bright, previamente conocida por tener el potencial de inicio de tumores más fuerte en OSCC, muestra heterogeneidad del ciclo celular in vivo.

Después se investigaron las firmas moleculares que definen cada población tumoral basándose en su conservación de colorante y expresión de CD44. Los inventores clasificaron mediante FACS las células CD44bright/dye+ (LRC), CD44bright/dye-(no LRC) y CD44dim (masa tumoral diferenciada) a partir de tumores de lengua ortotópicos derivados de SCC-25 y obtuvieron su transcriptoma mediante microalineamientos específicos de humanos. El transcriptoma de las células LRC y dye- fue más similar entre ellas que el que define la población CD44dim diferenciada (figura 1C). Sin embargo, se expresaron diferencialmente un número significativo de genes entre las células LRC y dye-. El análisis de ontología génica (GO) indicó que la firma dye- se caracteriza por inestabilidad cromosómica, transformación celular y neoplasia maligna, y contenían genes involucrados en el ciclo celular y la división celular, tal como se espera una población tumoral altamente proliferativa. Sin embargo, aunque la firma de las LRC también fue indicativa de células de carcinoma, incluyó una sobrerrepresentación de genes asociados a metástasis linfáticas y metástasis de neoplasias malignas, que no estaban presentes en los análogos dye-. La firma incluyó SPARC, TNFSF10, POSTN, PTGES, S100A8 y S100A9, todos ellos notificados como que fomentan la metástasis en otros tipos de tumores. Curiosamente, las LRC se caracterizaron por un gran número de genes relacionados con la respuesta a lípidos y el proceso de metabolismo lipídico, así como con rutas involucradas en la señalización de interleucina-1, molécula de CD36, PPARgamma, MMP, TGFbeta y GTPasas Ras.

La expresión diferencial de varios de estos genes se validó mediante RT-qPCR en cinco réplicas biológicas (figura 2). En conjunto, estos resultados sugieren que las LRC pueden constituir una población prometastásica de células tumorales presente en la lesión bucal primaria.

Las LRC expresaron más de 30 genes involucrados en el metabolismo de ácidos grasos, incluyendo aquellos en la absorción y el transporte de lípidos (CD36, SCL10A1 y ABCA1), beta y alfa-oxidación de ácidos grasos (ACSL1, ACSBG1, PPARy, LIPH, PLA2G4E, PNLIPRP3, PNPLA2, HSD17B2 y FA2H), biosíntesis de lípidos (ACSL1, ACSBG1, FA2H, HSD17B2 y CYP4F3) y almacenamiento de lípidos intracelulares (DGAT2 y SEC14L2). Se eligió el receptor eliminador CD36 para su análisis funcional y mecanístico adicional, puesto que se encuentra en la parte superior de la cascada de señalización que absorbe lípidos a partir del entorno extracelular y desencadena su betaoxidación para obtener energía en forma de ATP (Coburn et al., 2000; Ibrahimi et al., 1999; Pepino et al., 2014). Además, la CD36 es un receptor de superficie celular que traslada ácidos grasos a la célula, de modo que puede usarse como marcador indirecto para detectar y aislar las LRC a partir de los tumores, evitando el uso de colorantes fluorescentes. De hecho, las LRC correspondieron a las células CD36brighVCD44bright dentro de las lesiones bucales primarias en todas las líneas celulares y PDC sometidas a prueba (Detroit-562, JHU-029, SCC-25, FaDu, VDH-00, VDH-01, VDH-02) (figura 3A, en la que se muestran los resultados obtenidos con SCC-25, VDH-00 y FaDu, y figura 3B).

- Ejemplo 2.- Potencial metastásico asociado a la expresión de CD36

A continuación se sometió a prueba si la modulación de la expresión de CD36 afectaría al potencial metastásico in vivo de tumores de OSCC. La sobreexpresión de CD36 en líneas celulares y en PDC con bajo potencial metastásico (SCC-25, VDH-00 y JHU-029) indujo un aumento drástico en su potencial metastásico a los Ln , desde menos del 20% hasta el 75-80% de penetrancia. Además, las metástasis LN generadas por los tumores de OSCC que sobreexpresan CD36 fueron mucho mayores (> 40 veces) que en las células parentales (figura 3C, D, G, H, J, K, M, N).

El crecimiento de tumores primarios también se potenció tras la sobreexpresión de CD36, pero hasta un grado mucho menor que el observado con el crecimiento metastásico (<2 veces) (figura 3C, D, G, H, I, L, M, N). En cambio, el agotamiento de CD36 mediado por ARNhc (figura 5A, B, D, E) afectó ligeramente al crecimiento de tumores primarios en líneas celulares de OSCC altamente metastásicas, pero redujo en gran medida el tamaño de las metástasis en los LN (figura 5D, E, F, G, figura 6A, 6B, 6E, figura 7A-B). Lo más importante, el agotamiento de CD36 mediado por ARNhc redujo significativamente la penetrancia de la metástasis LN en algunas líneas celulares en un 80-100% sin afectar a la capacidad de las células tumorales de iniciar una lesión primaria (figura 6A, 6E, figura 7A-B). Además, el agotamiento de CD36 inhibió en gran medida la capacidad de las células FaDu de colonizar los pulmones (figura 5C, D). El tamaño de las metástasis LN también se redujo en gran medida tras el agotamiento de D36 en todas las líneas tumorales, mientras que el crecimiento de tumores primarios sólo se vio afectado ligeramente en una línea celular, pero no en las demás líneas celulares sometidas a prueba de células de OSCC derivadas de pacientes (figura 5D, 6E, 7B). Curiosamente, el agotamiento de CD36 endógena aumentó el porcentaje de células CD44dim in vivo en todos los tumores estudiados, lo que sugiere que la expresión de CD36 es necesaria para mantener un estado indiferenciado (figura 5B, 6D, 7D).

El análisis histológico de las pocas metástasis LN que crecieron a partir de células agotadas en CD36 presentaron un patrón interesante de grandes células hinchadas (figura 5F). Estas estructuras eran específicas de las metástasis, puesto que no estaban presentes en los tumores bucales generados por células de OSCC agotadas en CD36 (figura 6F). La CD36 no sólo internaliza los ácidos grasos, sino que también es necesaria para desencadenar la beta-oxidación de ácidos grasos en algunos tipos de células y, de hecho, estas estructuras comprendían grandes gotas lipídicas con lípidos no metabolizados, tal como se muestra mediante tinción con el sensor lipídico fluorescente BODIPY (figura 5I). Basándose en esto, y también en la firma de expresión génica que define las LR tumorales que contenían muchos genes involucrados en el metabolismo lipídico, incluyendo la lipogénesis, los inventores plantearon la hipótesis de que las células CD36+ podrían basarse en el metabolismo/oxidación de ácidos grasos para obtener la energía necesaria para colonizar los LN y ejercer su potencial metastásico. La medición de metabolitos intermedios de la oxidación lipídica requiere una purificación muy rápida de un gran número de células que no fue factible con el bajo rendimiento de las células CD36+ aisladas mediante FACS adquiridas de tumores en el presente método in vivo. Se tomaron varios enfoques alternativos para someter a prueba dicha hipótesis.

En primer lugar, mediante análisis global del transcriptoma, se confirmó que las células CD36+/CD44bright, pero no sus análogas CD36-/CD44bright, aisladas de tumores ortotópicos bucales primarios expresaron muchos genes involucrados en la metástasis linfática y el metabolismo lipídico, solapando con la firma dye+ (DID+) que se había obtenido previamente.

En segundo lugar, el agotamiento de ACSL1 (miembro 1 de la familia de cadena larga de acil-CoA sintetasas), que añade un resto acil-CoA a los ácidos grasos para activar su degradación en las mitocondrias (Pepino et al., 2014; Ellis et al., 2010), redujo significativamente el potencial metastásico a los LN de células OSCC, casi hasta el mismo grado que el agotamiento de CD36 (figura 9A-C). Curiosamente, y de manera similar a los resultados obtenidos tras el agotamiento de CD36 endógena, la atenuación génica de ACSL1 no afectó a la absorción de tumores primarios y sólo redujo ligeramente el tamaño de las lesiones bucales, sin embargo redujo en gran medida la penetrancia de las metástasis LN y su tamaño (figura 9A-C). De manera importante, el agotamiento de ACSL1 redujo específicamente el aumento de la penetrancia de la metástasis inducido por la sobreexpresión de CD36 en células tumorales de OSCC escasamente metastásicas, lo que indica que actuó aguas abajo de CD36 (figura 9A, B, C).

Además, se halló que la célula CD36+/CD44bright expresó mayores niveles de proteína de tres enzimas clave involucradas en la beta-oxidación de ácidos grasos, ACADVL, ACADM y HADHA, en comparación con sus análogas CD36-/CD44bright, tal como se determina mediante análisis por FACS.

También se sometió a prueba si aumentar los niveles de lípidos en circulación potenciaría el potencial metastásico a los LN de las células de OSCC de manera dependiente de CD36. Curiosamente, los ratones NSG alimentados con una dieta con alto contenido en grasas desarrollaron tumores bucales sólo ligeramente más grandes pero un número aumentado y metástasis LN más grandes, de manera dependiente de la expresión de CD36 endógena (figura 7A, B). Estos ratones no aumentaron significativamente de peso ni aumentaron su glucemia durante el experimento (figura 7C). De hecho, el aumento del potencial metastásico de OSCC en ratones alimentados con dieta con alto contenido en grasas se correlacionó con un aumento significativo del porcentaje de células CD36+ en las lesiones bucales y metastásicas (figura 7D). Curiosamente, el porcentaje de células CD36+ también aumentó en gran medida cuando las células de OSCC se cultivaron conjuntamente con adipocitos derivados de OP9 maduros, pero no con células parentales OP9 no adipogénicas o con fibroblastos asociados a tumor de SCC, lo que sugiere que la expresión de CD36 endógena en OSCC respondió a los lípidos (figura 12A, B). Para someter a prueba esto directamente, los presentes inventores expusieron las células de OSCC en cultivo durante 2 días con ácido palmítico (PA), un ácido graso reconocido por CD36. La estimulación de OSCC con PA indujo de manera robusta el porcentaje de células CD36+ en cultivo (figura 12A). De manera importante, el PA aumentó significativamente el tamaño y la frecuencia de las metástasis LN de manera completamente dependiente de CD36, sin ningún efecto sobre el crecimiento de tumores primarios. El PA fomentó incluso la metástasis pulmonar en el 10% de ratones inoculados, algo que los inventores nunca habían observado en más de 100 ratones inoculados con células tumorales SCC25 de control (figura 12E).

De manera importante, las células de OSCC que expresan CD36 mutante generaron lesiones primarias con la misma penetrancia que las células de OSCC que presentan CD36 de tipo natural, pero mostraron significativamente menos metástasis y mucho más pequeñas (figura 12C, figura 12F). Se verificó una expresión idéntica de CD36 WT y mutante mediante clasificación FACS (figura 12D). Curiosamente, las metástasis LN generadas por células tumorales de OSCC que expresan el mutante CD36-Lys164Ala contenían grandes gotas lipídicas similares a las formadas tras el agotamiento de CD36 endógena (figura 13A). Puesto que se sabe que CD36 desencadena la betaoxidación de ácidos grasos en algunos casos, esta observación condujo a los inventores a plantear la hipótesis de que la inhibición de CD36 podría conducir a una acumulación de lípidos no metabolizados endógenamente sintetizados. Esta continua acumulación de lípidos daría como resultado, en última instancia, lipotoxicidad metastásica y muerte celular. De hecho, se observó una inmunorreactividad sustancial de la caspasa-3 que rodeaba a estas áreas ricas en gotas lipídicas, tanto en metástasis que expresan el mutante CD36-Lys164Ala como en aquellas agotadas en de CD36 endógena (figura 13B, C).

- Ejemplo 3.- Potencial metastásico de células CD36+

Estos resultados respaldaron el papel de las células positivas para CD36 en el fomento de la metástasis del OSCC al detectar, internalizar y metabolizar lípidos a partir de sus alrededores de manera dependiente de CD36. Puesto que tales conclusiones se basaban hasta ahora en la modulación de la expresión o actividad de CD36, los presentes inventores se preguntaron a continuación si las células CD36+ constituían la población con el potencial metastásico más alto dentro de las lesiones bucales primarias.

En primer lugar, observaron que en todas las líneas celulares de OSCC y PDC sometidas a prueba, las células CD36+/CD44bright siempre estaban enriquecidas en los sitios metastásicos en comparación con las lesiones bucales primarias (figura 15). También se observó que, cuando las células CD36+ y CD36- aisladas de lesiones bucales ortotópicas primarias se inocularon por separado en la cavidad bucal de receptores secundarios, las células CD36+ fueron más rápidas que su análogas CD36- en generar metástasis LN, que también fueron mucho más grandes (figura 10A, B). Curiosamente, aunque a los ratones se les inoculó una población pura de células CD36+, tanto las lesiones bucales como las metástasis macroscópicas generadas por estas mostraron una proporción muy similar de células CD36+/CD44bright, CD36-/CD44bright y CD44dim al tumor bucal original, lo que indica que las células CD36+ pueden restablecer la heterogeneidad de células tumorales in vivo (figura 10C). Los inventores no observaron ninguna diferencia significativa en la capacidad de cualquier de las poblaciones CD36+ o CD36- de generar lesiones bucales primarias (figura 10B). Por tanto, tanto las células CD36+ como las CD36- fueron capaces de generar metástasis aunque con cinéticas muy diferentes. Curiosamente, las lesiones metastásicas que se formaron con una latencia más prolongada en ratones inoculados con células CD36- en comparación con aquellos inoculados con células CD36+ contenían un alto porcentaje de células CD36+, lo que sugiere o bien que las células CD36- pueden convertirse en células CD36+ in vivo o bien que un porcentaje de células clasificadas como CD36- mediante FACS expresan el ARNm de CD36 pero no la proteína. Curiosamente, si bien el cultivo conjunto de células de OSCC parentales con adipocitos derivados de OP9- aumentó significativamente el número de células CD36+, un porcentaje de células tumorales permaneció CD36-(figura 10D, la figura 11); los inventores supusieron que estas células podrían representar la población negativa para CD36 auténtica. De hecho, la expresión de ARNm de CD36 fue significativamente menor en células CD36-, clasificadas a partir de células de OSCC cultivadas conjuntamente con adipocitos, que aquellas aisladas de monocultivos de células de OSCC (figura 15). Por tanto, los inventores clasificaron por FACS las células CD36+ y CD36- a partir de células de OSCC cultivadas conjuntamente con adipocitos y después las inocularon por vía ortotópica por separado a los ratones NSG para evaluar su potencial metastásico (figura 16A). En estas condiciones, las células CD36- no generaron ni una sola metástasis LN, mientras que las células CD36+ formaron metástasis LN incluso con una mayor penetrancia que las células parentales (figura 17B, C, G). Este efecto fue independiente del crecimiento de tumores primarios, ya que tanto las células CD36+ como las CD36- generaron lesiones bucales con el 100% de eficiencia y un tamaño tumoral similar (figura 10B, D). La inoculación ortotópica de diluciones limitativas determinó que aproximadamente 1/3000 células CD36+/CD44bright mostraban potencial metastásico, un aumento de 10 veces en comparación con toda la población CD44bright, tal como puede observarse en la tabla 4 a continuación y en la figura 16F:

Tabla 4: Frecuencia de metástasis y tumores primarios observada después de la inoculación ortotópica de diluciones limitativas

Por otro lado y de manera importante, ambas poblaciones mostraron el mismo potencial de inicio de tumores bucales primarios (figura 16G, figura 17A, C), y las células CD36+/CD44bright fueron sólo ligeramente más oncógenas en la cavidad bucal que sus análogas CD36-/CD44bright, aunque estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (figura 16E, F). Por tanto, considerando que las CD36-/CD44bright fueron incapaces de generar ni una sola metástasis (figura 16C, E), estos resultados indican que las células CD36+/CD44bright constituyen la población de inicio de metástasis en el SCC bucal.

Además, el análisis de la expresión génica de células CD36+ y CD36-, o bien clasificadas a partir de lesiones bucales primarias generadas tras la inoculación de OSCC parentales (Detroit-562) o bien clasificadas a partir de metástasis LN generadas tras la inoculación de células CD36+/CD44bright, indicó que sus firmas de expresión génica eran muy similares. En este sentido, las células CD36+ ubicadas en las metástasis LN también estaban fuertemente definidas por categorías de GO indicativas del metabolismo lipídico, tales como respuesta a los lípidos, regulación dl almacenamiento de lípidos y proceso metabólico de ácidos grasos, o rutas tales como CD36 o PpARgamma, al igual que sus análogas CD36+ ubicada en la lesión bucal. Por tanto, estos resultados indican que cuando se trasplantan, las células CD36+ no sólo son capaces de iniciar la metástasis, sino también de recapitular su heterogeneidad molecular y celular desde el origen primario, constituyendo de ese modo células madre metastásicas auténticas. Por tanto, estos resultados indican que las células CD36+ constituyen la población que inicia la metástasis en SCC bucal.

- Ejemplo 4.- Potencialidad antimetastásica del bloqueo de CD36

Para determinar si el direccionamiento hacia CD36 sería una estrategia antimetastásica factible contra OSCC humanos, los inventores usaron estrategias alternativas con dos anticuerpos neutralizantes anti-CD36 diferentes: uno que inhibe todas las funciones conocidas de CD36, incluyendo su interacción con trombospondina, colágenos y ácidos grasos (FA6.152) y el otro que sólo bloquea la absorción de ácidos grasos y oxLDL (JC63.1) (Kermovant-Duchemin, et al., 2005; Mwaikambo et al., 2006).

En primer lugar, el tratamiento previo de las células de OSCC en cultivo con cualquiera de los anticuerpos bloqueantes sólo redujo ligeramente el tamaño de las lesiones bucales, pero inhibió significativamente las metástasis LN cuando se inocularon in vivo (figura 18A). Además, el tratamiento previo con cualquiera de los anticuerpos redujo la penetrancia de las lesiones bucales en un 25-30% (figura 19B). Sólo el 50% de los ratones inoculados con células de OSCC tratadas previamente con los anticuerpos bloqueantes contra CD36 que albergan tumores primarios presentaron metástasis Ln (figura 11C), lo que destaca aún más el efecto selectivo de CD36 en el fomento de metástasis LN.

Además, el grupo de los inventores trató a los ratones con cualquiera de los anticuerpos por vía intraperitoneal cada 3 días después de la inoculación por vía oral de las células tumorales. Esto dio como resultado una reducción significativa del tamaño de los tumores primarios, sin afectar al número de ratones que desarrollaron tumores primarios e inhibieron por completo el inicio de metástasis, previniendo cualquier crecimiento metastásico en los LN (figura 18D).

Además y lo más importante, cuando los inventores trataron a los ratones que ya habían desarrollado metástasis LN a partir de OSCC y PDC con inyecciones intraperitoneales diarias del anticuerpo neutralizante CD36 (JC63.1), el tamaño de las metástasis LN se redujo en más del 80%-90%, mostrando algunas lesiones (15% de los animales inyectados) una remisión completa de manera dependiente de la dosis del anticuerpo administrado (figura 18A, E-G). Por otro lado, las lesiones bucales no mostraron ninguna diferencia estadísticamente significativa en el tamaño en el punto final (figura 18B, C, E-H). Las células grandes se hincharon con lípidos acumulados en las metástasis LN de ratones tratados con anticuerpos neutralizantes contra CD36, de manera similar a la atenuación génica de CD36 mediada por ARNhc (figura 18J, figura 5F-I) o a los resultados obtenidos tras la expresión del mutante de CD36 defectuoso en cuanto a la internalización de lípidos (figura 13A-C).

El tratamiento con el anticuerpo JC63.1 indujo lipotoxicidad tal como se determinó por la alta inmunorreactividad de caspasa-3 (figura 18K). Puesto que el anticuerpo JC63.1 inhibe específicamente la interacción de CD36 con los ácidos grasos y ejerce el mismo efecto antimetastásico que el anticuerpo neutralizante contra CD36 FA6.152 de amplio espectro, estos resultados indicaron que el efecto prometastásico de CD36 en OSCC se basaba principalmente en su capacidad de modular el metabolismo lipídico, en lugar de sus otras funciones conocidas, sin embargo, no puede descartarse que la inhibición de otras funciones de CD36, tales como su capacidad de interaccionar con trombospondina 1-2, con LDL oxidadas o con colágenos, también puede contribuir al efecto antimetastásico. De hecho, algunos ensayos adicionales indican que la atenuación génica de CD36 reduce significativamente la migración inicial de células de OSCC marcadas con GFP al pulmón, sin afectar a su unión a la cavidad bucal, tal como se determina mediante RT-cPCR de GFP (figura 20). Ninguno de los ratones desarrolló efectos secundarios visibles a partir del tratamiento continuo con anticuerpos neutralizantes contra CD36, en particular, no perdieron peso (figura 18L).

- Ejemplo 5.- CD36 está asociada con la metástasis y un mal pronóstico en tumores humanos

Los presentes inventores analizaron datos disponibles públicamente, pero sin procesar, en bases de datos, buscando más datos sobre CD36 y su correlación con el cáncer. Destacando aún más el importante papel de CD36 en la progresión tumoral, hallaron que la expresión de CD36, o su firma asociada, se correlaciona fuertemente con una baja tasa de supervivencia libre de enfermedad y supervivencia global en pacientes con SCC de pulmón, cáncer de vejiga o cáncer de mama luminal A (figura 21). Además, la amplificación de CD36 se correlaciona específicamente con la metástasis en un gran número de tumores humanos, incluyendo los que son altamente agresivos tales como el melanoma (Nath y Chan, 2016). De hecho, cuando a los ratones NSG se les inoculó por vía intravenosa una línea celular que carece de CD36 de cáncer de mama luminal A (MCF-7) o de melanoma humano (501mel), se observó una reducción significativa tanto en el número como en el tamaño de las metástasis de pulmón, hueso e hígado en comparación con los controles (figura 20A, B).

Bibliografía

Alghazeer R., et al. Cytotoxicity of oxidised lipids in cultured colonal human intestinal cancer cells (caco-2 cells). Toxicology Letters, 180, 202-211. (2008).

Almagro J.C. and Fransson J. Humanization of antibodies. Frontiers in Bioscience 13, 1619-1633 (2008).

Antibodies: A Laboratory Manual, segunda edición, editado por E. A. Greenfield. Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2014.

Balaban S., et al., Obesity and Cancer Progression: Is there a Role of fatty acid metabolism?. BioMed Research International, volumen 2015 (2015), iD de artículo 274585, http://dx.doi.0rg/10.1155/2015/274585.

Barrett, T. y Edgar, R. Gene expression omnibus: microarray data storage, submission, retrieval, and analysis. Methods Enzymol 411, 352-369, doi:10.1016/S0076-6879(06)11019-8 (2006).

Benjamini, Y. H. Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological) 57, 289-300 (1995).

Berriz, G. F., King, O. D., Bryant, B., Sander, C. y Roth, F. P. Characterizing gene sets with FuncAssociate. Bioinformatics 19, 2502-2504 (2003).

Bragado, P. et al. Analysis of marker-defined HNSCC subpopulations reveals a dynamic regulation of tumor initiating properties. PloS one 7, e29974, doi:10.1371/journal.pone.0029974 (2012).

Calon, A. et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer cell 22, 571-584, doi:10.1016/j.ccr.2012.08.013 (2012).

Calon, A. et al. Stromal gene expression defines poor-prognosis subtypes in colorectal cancer. Nature genetics 47, 320-329, doi:10.1038/ng.3225 (2015).

Cao, Z. et al. Angiocrine factors deployed by tumor vascular niche induce B cell lymphoma invasiveness and chemoresistance. Cancer cell 25, 350-365, doi:10.1016/j.ccr.2014.02.005 (2014).

Cerami, E. et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discov 2, 401-404, doi:10.1158/2159-8290.CD-12-0095 (2012).

Chaffer, C. L. y Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science 331, 1559-1564, doi:10.1126/science. 1203543 (2011).

Chen, Q., Zhang, X. H. y Massague, J. Macrophage binding to receptor VCAM-1 transmits survival signals in breast cancer cells that invade the lungs. Cancer cell 20, 538-549, doi:10.1016/j.ccr.2011.08.025 (2011).

Chen, J. et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature 488, 522-526, doi:10.1038/nature11287 (2012).

Coburn, C. T. et al. Defective uptake and utilization of long chain fatty acids in muscle and adipose tissues of CD36 knockout mice. The Journal of biological chemistry 275, 32523-32529, doi:10.1074/jbc.M003826200 (2000).

Cole, S.P.C. et al., in: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96 (1985).

Cote, R. J. et al. Generation of human monoclonal antibodies reactive with cellular antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 80(7), 2026-2030 (1983).

Dean, C. B. and Nielsen, J. D. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing (2008).

DeFilippis, R.A., et al. CD36 repression activates a multicellular stromal program shared by high mammographic density and tumor tissues. Cancer Discov. 2(9):826-39 (2012).

Ellis, J. M. et al. Adipose acyl-CoA synthetase-1 directs fatty acids toward beta-oxidation and is required for cold thermogenesis. Cell metabolism 12, 53-64, doi:10.1016/j.cmet.2010.05.012 (2010).

Gleber-Netto, F. O. et al. Molecular events in relapsed oral squamous cell carcinoma: Recurrence vs secondary primary tumor. Oral oncology 51, 738-744, doi:10.1016/j.oraloncology.2015.04.016 (2015).

Gao, J. et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal 6 , pl1, doi:10.1126/scisignal.2004088 (2013).

Geloen A, et al. CD36 inhibitors reduce postprandial hypertriglyceridemia and protect against diabetic dyslipidemia and atherosclerosis. PLoS One. 7(5):e37633. doi:10.1371/journal.pone.0037633 (2012).

Gentleman, R. C. et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol 5, R80, doi:10.1186/gb-2004-5-10-r80 (2004).

Goel, H. L. y Mercurio, A. M. VEGF targets the tumour cell. Nature reviews. Cancer 13, 871-882, doi:10.1038/nrc3627 (2013).

Gonzalez-Roca, E. et al. Accurate expression profiling of very small cell populations. PLoS One 5, e14418, doi:10.1371/journal.pone.0014418 (2010).

Hale, J.S. et al. Cancer stem cell-specific scavenger receptor 36 drives glioblastoma progression. Stem Cells 32(7): 1756-58 (2014).

Ibrahimi, A. et al. Muscle-specific sobreexpression of FAT/CD36 enhances fatty acid oxidation by contracting muscle, reduces plasma triglycerides and fatty acids, and increases plasma glucose and insulin. The Journal of biological chemistry 274, 26761-26766 (1999).

Irizarry, R. A. et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 4, 249-264, doi:10.1093/biostatistics/4.2.249 (2003).

Kalluri, R. y Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nature reviews. Cancer 6, 392-401, doi:10.1038/nrc1877 (2006). Kermorvant-Duchemin, E. et al. Trans-arachidonic acids generated during nitrative stress induce a thrombospondin-1-dependent microvascular degeneration. Nature medicine 11, 1339-1345, doi:10.1038/nm1336 (2005).

Kohler, G. y Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256, 495-497 (1975).

Kreso, A. et al. Variable clonal repopulation dynamics influence chemotherapy response in colorectal cancer. Science 339, 543-548, doi:10.1126/science.1227670 (2013).

Lai Kuo Chu et al., Blocking TNF-a inhibits angiogenesis and growth of IFIT2-depleted metastatic oral squamous cell carcinoma cells. Cancer Letters. 370. 10.1016/j.canlet.2015.10.016(2015).

Lu, X. et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors. Cancer cell 20, 701-714, doi:10.1016/j.ccr.2011.11.002 (2011).

Miyazaki et al. Sobreexpression of nm23-H2/NDP kinase B in a human oral squamous cell carcinoma cell line results in reduced metastasis, differentiated phenotype in the metastatic site, and growth factor-independent proliferative activity in culture. Clin. Cancer Res. 5(12):4301-4307 (1999).

Nowak, J. A. y Fuchs, E. Isolation and culture of epithelial stem cells. Methods Mol Biol 482, 215-232, doi:10.1007/978-1 -59745-060-7_14 (2009).

Malanchi, l. et al. Interactions between cáncer stem cells and their niche govern metastatic colonization. Nature 481, 85-89, doi:10.1038/nature10694 (2012).

Myers, J. N., Holsinger, F. C., Jasser, S. A., Bekele, B. N. y Fidler, I. J. An orthotopic nude mouse model of oral tongue squamous cell carcinoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 8, 293-298 (2002).

Mwaikambo, B. R., Sennlaub, F., Ong, H., Chemtob, S. y Hardy, P. Activation of CD36 inhibits and induces regression of inflammatory corneal neovascularization. Investigative ophthalmology y visual science 47, 4356-4364, doi:10.1167/iovs.05-1656 (2006).

Nath, A. y Chan, C. Genetic alterations in fatty acid transport and metabolism genes are associated with metastatic progression and poor prognosis of human cancers. SciRep 6, 18669, doi:10.1038/srep18669 (2016).

Nieman, K. M. et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nature medicine 17, 1498-1503, doi:10.1038/nm.2492(2011).

Oskarsson, T., Batlle, E. y Massague, J. Metastatic stem cells: sources, niches, and vital pathways. Cell stem cell 14, 306-321, doi:10.1016/j.stem.2014.02.002 (2014).

Obenauf, A. C. et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature 520, 368-372, doi:10.1038/nature14336 (2015).

Omura; Current status of Aoral cancer treatment strategies: surgical treatments for oral squamous cell carcinoma. Int. J. of Clinical Oncology 149:423-430 (2014).

Oskarsson, T. et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nature medicine 17, 867-874, doi:10.1038/nm.2379(2011).

Pece, S. et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell 140, 62-73, doi:10.1016/j.cell.2009.12.007 (2010).

Peinado, H. et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nature medicine 18, 883-891, doi:10.1038/nm.2753 (2012).

Pepino, M. Y., Kuda, O., Samovski, D. y Abumrad, N. A. Structure-function of CD36 and importance of fatty acid signal transduction in fat metabolism. Annual review of nutrition 34, 281-303, doi:10.1146/annurev-nutr-071812-161220 (2014).

Qin, J. et al. The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration. Cell stem cell 10, 556-569, doi:10.1016/j.stem.2012.03.009 (2012).

Sato et al. Inhibition of CD44v9 upregulates the invasion ability of oral squamous cell carcinoma cells. Oral Oncology 39(1):27-30 (2003).

Spangenburg, E. E., Pratt, S. J., Wohlers, L. M. y Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. J Biomed Biotechnol 2011, 598358, doi:10.1155/2011/598358 (2011). Smyth, G. Limma: linear models for microarray data. In: 'Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor. Springer, Nueva York, 397-420 (2005).

Subramanian, A. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U SA 102, 15545-15550, doi:10.1073/pnas.0506580102 (2005).

Zhang, X. H. et al. Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma. Cell 154, 1060-1073, doi:10.1016/j.cell.2013.07.036 (2013).

Roesch, A. et al. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell 141, 583-594, doi:10.1016/j.cell.2010.04.020 (2010).

Sevenich, L. et al. Analysis of tumour- and stroma-supplied proteolytic networks reveals a brain-metastasispromoting role for cathepsin S. Nature cell biology 16, 876-888, doi:10.1038/ncb3011 (2014).

Ugel, S., De Sanctis, F., Mandruzzato, S. y Bronte, V. Tumor-induced myeloid deviation: when myeloid-derived

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto caracterizado por reducir o inhibir la actividad y/o expresión de CD36, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de la metástasis del carcinoma epidermoide bucal (OSCC) en un mamífero.

2. Compuesto para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho compuesto es para su uso en el tratamiento de la metástasis del OSCC.

3. Compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que las metástasis son metástasis ganglionares y/o metástasis pulmonares.

4. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto es un inhibidor de la actividad de CD36.

5. Compuesto para su uso según la reivindicación 4, en el que dicho compuesto es un anticuerpo, un anticuerpo monocatenario, un scFv, un Fab o un fragmento F(ab')2.

6. Compuesto para su uso según la reivindicación 5, que es un anticuerpo humanizado.

7. Compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que el anticuerpo inhibe la interacción de CD36 con trombospondina, colágenos y ácidos grasos.

8. Compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que el anticuerpo bloquea específicamente la unión de CD36 a LDL oxidadas y ácidos grasos y su incorporación en células.

9. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto es un inhibidor de la expresión de CD36.

10. Compuesto para su uso según la reivindicación 9, en el que el inhibidor de la expresión de CD36 es un ARNhc, un ARNi, un ARNip o un ADN o ARN antisentido.

11. Compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el inhibidor de la expresión de CD36 es un ARNhc.

12. Compuesto para su uso según la reivindicación 11, en el que el ARNhc se administra mediante la administración de un vector de expresión del mismo.

13. Compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que el inhibidor de la expresión de CD36 es un ARNhc seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2.

14. Compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el mamífero es un ser humano.