KR20140146859A

KR20140146859A - 세포 노화 진단용 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140146859A
Application number: KR20130069703A
Authority: KR
Inventors: 이재선; 정승희
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2013-06-18
Filing date: 2013-06-18
Publication date: 2014-12-29
Also published as: KR101508129B1

Abstract

본 발명은 세포 노화 진단용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, PAPSS2 유전자는 세포 노화 진단용 마커로서 역할을 할 수 있어 노화 세포를 진단하는 방법, 세포 노화 유도용 조성물 스크리닝 방법, 세포 노화 억제용 조성물 스크리닝 방법 등에 이용할 수 있다. 또한, 비종양 세포에서 PAPSS2 유전자를 억제할 경우 비종양 세포의 노화를 유도할 수 있다.

Description

세포 노화 진단용 마커 및 이의 용도 {Marker for diagnosing cell senescence and use thereof}

본 발명은 세포 노화 진단용 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

세포복제의 노화(replicative cellular senescence)는 비가역적이며 영구적으로 세포주기를 지연 또는 정지시키는 과정이며, 외인성 또는 내인성 요인의 스트레스 및 손상에 대응하는 세포의 반응으로 인식되며, 베타-갈락토시다제(β-galactosidase)와 같은 유전자 발현의 변형된 패턴을 나타낸다[J. Campisi, F. d'Adda di Fagagna, Cellular senescence: when bad things happen to good cells, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8 (2007):729-740]. 이러한 과정은 텔로미어(telomere)-의존적 기작, 온코진(oncogene)-유도 기작 그리고 ROS 유도 기작에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다[H. Zhang, Molecular signaling and genetic pathway of senescence: its role in tumorigenesis and aging, J. Cell. Physiol. 210 (2007):567-574; M. Ozturk, A. Arslan-Ergul, S. Bagislar, S. Senturk, H. Yuzugullu, Senescence and immortality in hepatocellular carcinoma, Cancer Lett. 286 (2009):103-113]. 세포 노화는 조직의 재생 및 신생 등에 치명적이기 때문에 생명체에 해로운 효과{예를 들어, 조직 노화(tissue aging)}를 유발할 수도 있지만 세포분열이 왕성한 종양세포에서는 영구적인 세포 성장 억제(tumor suppressor)를 유발하기 때문에 이로울 수도 있다(anti- tumorigenesis).

한편, 노화된 세포는 세포의 크기가 커지고 평평해지며, 특정 pH에서 베타-갈락토시다아제 활성을 나타낸다는 일반적인 특징이 있다.(Dimri et al., A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995; Chang et al., A Senescence-like Phenotype Distinguishes Tumor Cells That Undergo Terminal Proliferation Arrest after Exposure to Anticancer Agents, Cancer Res, 59:3761-3767, 1999) 상기의 특징을 이용하여 노화세포의 판별을 위해 가장 일반적으로 베타-갈락토시다아제 염색법을 사용하고 있으나, 이는 효소 활성이 유지되고 있는 살아있는 종양세포에만 적용해야 하며 종양조직의 경우 번거로운 동결절편 방법을 이용해 염색해야한다는 문제점이 있다.

따라서, 세포 노화를 쉽게 판별하기 위해 세포 노화의 일반적인 지표가 될 수 있는 바이오마커가 필요하며, 노화의 마커로 세포 주기 억제에 관여하는 단백질이 일반적으로 사용되고 있으나, 이는 일시적인 세포주기 억제와 세포 노화를 구분하는데 한계가 있다 (Igor B. Roninson, Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment, Cancer Res., 63:2705-2715, 2003). 따라서, 노화 세포의 명백한 판별을 위한 세포노화-특이적 바이오마커의 개발이 절실히 요구되고 있다(J. Campisi, F. d'Adda di Fagagna, Cellular senescence: when bad things happen to good cells, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8 (2007):729-740).

한편, PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2)은 NCBI(미국 국립생물공학정보센터; National Center for Biotechnology Information) Access No. NM_004670 (서열번호 1) 또는 NM_001015880 (서열번호 2)인 유전자로 세포 노화와 관련하여 알려진 바가 없다.

J. Campisi, F. d'Adda di Fagagna, Cellular senescence: when bad things happen to good cells, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8 (2007):729-740. H. Zhang, Molecular signaling and genetic pathway of senescence: its role in tumorigenesis and aging, J. Cell. Physiol. 210 (2007):567-574. M. Ozturk, A. Arslan-Ergul, S. Bagislar, S. Senturk, H. Yuzugullu, Senescence and immortality in hepatocellular carcinoma, Cancer Lett. 286 (2009):103-113. Dimri et al., A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995. Chang et al., A Senescence-like Phenotype Distinguishes Tumor Cells That Undergo Terminal Proliferation Arrest after Exposure to Anticancer Agents, Cancer Res, 59:3761-3767, 1999. Igor B. Roninson, Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment, Cancer Res., 63:2705-2715, 2003.

이에 본 발명자들은 인간 섬유아 세포 (HDF)에서 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자를 억제하는 경우 인간 섬유아 세포 (HDF)의 노화가 유도됨을 확인하고, 세포가 노화됨에 따라 PAPSS2 유전자 발현이 감소됨을 확인함으로써, PAPSS2 유전자 발현 수준을 세포 노화 진단용 마커로 이용할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 세포 노화 진단용 마커 및 이의 용도를 제공하는 데에 있다.

본 발명은 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 세포 노화를 진단하는 마커로서의 용도를 제공한다.

본 발명에서 상기 PAPSS2 유전자는 서열번호 1의 염기서열 (NCBI Access No. NM_004670) 또는 서열번호 2의 염기서열 (NCBI Access No. NM_001015880)을 포함한다. 또한 상기 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 염기서열에서 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열을 포함한다.

본 발명에서 상기 PAPSS2 유전자가 암호화하는 단백질은 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 서열번호 4의 폴리펩티드를 포함한다. 또한 서열번호 3의 폴리펩티드 또는 서열번호 4의 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 치환 또는 삽입된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서 상기 PAPSS2 유전자의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기 위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.

본 발명은 세포 내 PAPSS2 유전자 발현 정도를 평가하는 단계를 포함하는 노화 세포를 진단하는 방법을 제공한다.

상기 세포 내 PAPSS2 유전자 발현의 감소가 세포 노화 진단용 마커일 수 있다.

상기 세포는 개체로부터 분리된 세포일 수 있다. 상기 세포는 포유류로부터 유래한 것일 수 있다. 또한 상기 세포는 인체로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 섬유아 세포 (HDF)일 수 있다.

본 발명은 또한 PAPSS2 유전자에 대한 항체를 포함하는 세포 노화 진단용 키트를 제공한다.

상기 세포 노화 진단용 키트는 당업자에 알려진 종래의 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한 상기 세포 노화 진단용 키트는 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자에 대한 항체 외에도 상기 항체와 시료 간의 반응을 파악하는데 사용되는 예컨대 단백질 칩 등의 적용을 위한 재료를 포함할 수 있다.

또한, 상기 세포 노화 진단용 키트는 전형적으로 동결건조형태의 항체와 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있으며, 상기 항체는 방사종(radionuclides), 형광원(fluorescors), 효소(enzymes) 등에 의해 표지화될 수 있다.

본 발명은 또한 세포 내 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물을 스크리닝하는 단계를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 유전자는 mRNA(messenger Ribonucleic acid)일 수 있다.

또한, 상기 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물은 상기 mRNA를 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA)일 수 있다. 즉, 상기 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물은 PAPSS2 유전자에 대한 mRNA의 발현을 억제할 수 있는 siRNA일 수 있다. 상기 siRNA는 서열번호 5의 센스서열(5'-ACA ACC UGU ACU CUU CCA A-3') 및 이에 상보적인 서열번호 6의 안티센스 서열(5'-UUG GAA GAG UAC AGG UUG U-3')인 이중가닥 siRNA 일 수 있다. 상기 siRNA는 센스서열 및/또는 안티센스서열의 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물은 항체일 수 있다. 상기 항체는 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체, 다클론 항체, 및/또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지의 방법에 의해 직접 제조할 수 있다.

본 발명은 세포 내 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자 발현을 활성화하는 약물을 스크리닝하는 단계를 포함하는 세포 노화 억제용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 PAPSS2 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물을 제공한다.

상기 유전자는 mRNA(messenger Ribonucleic acid)일 수 있다.

또한, 상기 억제제는 상기 mRNA를 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA)일 수 있다. 즉, 상기 PAPSS2 유전자 발현을 억제하는 약물은 PAPSS2 유전자에 대한 mRNA의 발현을 억제할 수 있는 siRNA일 수 있다. 상기 siRNA는 서열번호 5의 센스서열(5'-ACA ACC UGU ACU CUU CCA A-3') 및 이에 상보적인 서열번호 6의 안티센스 서열(5'-UUG GAA GAG UAC AGG UUG U-3')인 이중가닥 siRNA 일 수 있다. 상기 siRNA는 센스서열 및/또는 안티센스서열의 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 억제제는 항체일 수 있다. 상기 항체는 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자가 암호화하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체, 다클론 항체, 및/또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 시판되는 것을 구입하거나 공지의 방법에 의해 직접 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 비종양세포에 PAPSS2 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 비종양세포의 노화 유도 방법을 제공한다.

상기 세포는 인간을 포함한 포유동물의 세포일 수 있다. 또한 상기 세포는 인간을 제외한 포유동물의 세포일 수 있다. 예를 들어, 인간 섬유아 세포 (HDF)일 수 있다.

본 발명은 또한 비종양세포 노화 유도용 조성물의 제조를 위한 PAPSS2 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제의 용도를 제공한다.

PAPSS2 유전자는 세포 노화 진단용 마커로서 역할을 할 수 있어 노화 세포를 진단하는 방법, 세포 노화 유도용 조성물 스크리닝 방법, 세포 노화 억제용 조성물 스크리닝 방법 등에 이용할 수 있다. 또한, 비종양 세포에서 PAPSS2 유전자를 억제할 경우 비종양 세포의 노화를 유도할 수 있다.

도 1은 인간 섬유아 세포주 HDF에 각각 PAPSS2 si 및 Con si 처리한 후 경과 일짜에 따른 상대적인 세포수 변화를 보여주는 도이다.
도 2는 위상차 현미경 관찰 결과를 보여주는 도이다. 도 2에서 위에서부터 아래로 0일, 2일 및 4일은 0일, 2일, 4일째의 노화-관련 베타-갈락토시다아제 염색법으로 염색하기 전 위상차 현미경의 관찰한 사진을 나타내고 맨 아래의 4일은 4일째의 노화-관련 베타-갈락토시다아제 염색법으로 염색 후의 위상차 현미경의 관찰한 결과를 나타낸다.
도 3은 인간 섬유아 세포주 HDF에 각각 PAPSS2 si 및 Con si 처리한 후 날짜별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 인간 섬유아 세포주 HDF에 각각 PAPSS2 si 처리한 후 4일째까지 날짜별로 증가하는 p53 및 p21의 발현과 감소하는 PAPSS2의 발현을 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.
도 5는 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 위상차 현미경으로 관찰한 사진을 보여주는 도이다.
도 6은 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별 활성화된 노화-관련 베타-갈락토시다아제에 특이적인 염색시료를 이용한 염색법을 실시한 후 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 7은 인간 섬유아 세포주 HDF의 계대횟수별로 감소하는 PAPSS2 발현 및 Rb의 인산화를 확인한 웨스턴블럿팅 결과이다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

실시예 1. 트립판 블루 분석법을 이용한 PAPSS2 si 에 의한 세포 증식율 감소 확인

인간 섬유아 세포 (HDF) (ATCC, USA)를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제 (Gibco BRL 사)가 포함된 DMEM 배양 배지 안에서 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 9회 계대배양하였다. 작은 간섭 RNA의 주입 하루 전, 상기와 동일한 조건으로 인간 섬유아 세포 (HDF) (ATCC, USA)를 60 mm 배양접시로 계대배양하였다. 그 후, 2 ㎕의 RNAiMAX (invitrogen, Cat#13778-075)와 OptiMEM®I 배양배지 (Invitrogen, Cat#31985)를 섞고 PAPSS2 유전자에 대한 작은 간섭 RNA {PAPSS2 si; 5'-ACA ACC UGU ACU CUU CCA A-3' (서열번호 5) 및 5'-UUG GAA GAG UAC AGG UUG U-3'(서열번호 6)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임)}를 50 nM의 농도로 세포에 처리하였다(실험군). 6시간 후 배양배지를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ㎍/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM 배양 배지로 교환한 후, 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다.

또한, 상기 인간 섬유아 세포에 비특이적 작은 간섭 RNA{Con si; 5'-CCU ACG CCA CCA AUU UCG U-3'(서열번호 7)과 5'-ACG AAA UUG GUG GCG UAG G-3'(서열번호 8)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2염기(dTdT)가 결합된 상태임}를 처리한 세포주를 대조군으로 하였다. 상기 실험군과 대조군의 상대적인 세포수를 트립판 블루 분석법을 이용하여 관찰하였고 도 1에 나타내었다. 인간 섬유아 세포주에 PAPSS2 유전자에 대한 특이적 작은 간섭 RNA (PAPSS2 si) 또는 비특이적 작은 간섭 RNA (Con si)를 처리한 후 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 1~4 일동안 배양한 후 도 1에 표기된 날짜별로 세포 상층액을 수확하고 트립신을 이용하여 세포를 떼어낸 후 PBS(phosphate buffered saline)로 2차례 세척 후 0.4 % 트립판 블루 (NUNK 사)와 1:1로 혼합한 후 상온에서 5분 동안 방치 후 혈구계수기(hemocytometer; MARIENFELD사) 상에서 트립판 블루에 염색되지 않은 세포의 개수를 세어 0일을 기준으로 하여 상대적인 세포수를 표시하였다. 도 1에서, x축은 PAPSS2 si 및 Con si 처리한 후의 경과시간(일)을 나타내며, y축은 PAPSS2 si 및 Con si 처리하기 직전의 세포수를 기준점(1)으로 PAPSS2 si 및 Con si 처리한 후의 경과시간(일)의 세포수를 계산하여 상대적인 세포수를 나타낸다.

도 1에서 나타난 바와 같이, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여PAPSS2 si를 처리하여 PAPSS2 유전자 발현을 저해한 PAPSS2 si 처리군에서 기간경과에 따른 상대적인 세포수가 적은 것을 확인할 수 있다. 즉, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여PAPSS2 si를 처리하여 PAPSS2 유전자 발현을 저해한 PAPSS2 si 처리군은 세포증식율이 현저히 감소됨을 확인할 수 있다.

실시예 2. 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 이용한 인간 섬유아 세포 HDF 의 PAPSS2 si 에 의한 노화 유도 확인

인간 섬유아 세포주 HDF의 PAPSS2 발현 저해가 초래하는 세포노화를 관찰하기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 준비한 대조군(인간 섬유아 세포주 HDF에 비특이적 작은 간섭 RNA 처리군)과 실험군(인간 섬유아 세포주 HDF에 특이적 작은 간섭 RNA 처리군)에 대하여 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 위의 상기 실시예 1의 대조군(인간 섬유아 세포주 HDF에 비특이적 작은 간섭 RNA 처리군)과 실험군(인간 섬유아 세포주 HDF에 특이적 작은 간섭 RNA 처리군)의 세포를 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 도에 표기된 날짜별로 배양한 후 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.

세포를 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 다시 한 번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액 (1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산 /소듐 포스페이트 (pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 1 ml를 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하였다.

베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 이용하여 염색된 세포의 갯수를 측정하여 전체 세포에 대한 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율(백분율)에 관한 그래프를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 대조군(Con si 처리군)의 경우 검출할 수 있는 범위에 있지 않았다.

도 2에서 나타낸 바와 같이, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여 PAPSS2 si 처리군에서 넓고 편평한 모양의 세포가 노화된 세포의 비율이 높은 것을 확인하였다.

또한, 도 2 및 3에서 나타난 바와 같이, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여 PAPSS2 si를 처리하여 PAPSS2 유전자 발현을 저해한 PAPSS2 si 처리군에서 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율이 증가함을 확인할 수 있다.

따라서, 대조군(Con si 처리군)과 비교하여 PAPSS2 si를 처리하여 PAPSS2 유전자 발현을 저해한 PAPSS2 si 처리군은 시간이 지남에 따라 세포 노화현상이 현저하게 일어남을 확인할 수 있다.

실시예 3. 웨스턴 분석을 이용한 인간 섬유아 세포 HDF 의 PAPSS2 si 에 의한 노화 유도 확인

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 준비한 대조군(인간 섬유아 세포주 HDF에 비특이적 작은 간섭 RNA 처리군)과 실험군(인간 섬유아 세포주 HDF에 특이적 작은 간섭 RNA 처리군)을 도 4에 표기된 날짜별로 PBS로 세척 후 세포 시료를 세포 용해 완충액 (50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na₃VO₄, 10 ㎍/ml 아프로티닌, 2 ㎍/ml 루펩틴)을 사용하여 단백질을 추출하고, 추출한 단백질은 13,200 rpm으로 20분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 브래드포드법 {bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)}을 이용하여 정량하였다. 20㎍의 단백질 2X SDS 로딩 버퍼(60 mm Tris-Cl (pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가해 95℃에서 5분간 가열하고 8% 내지 10% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V로 2시간 전기영동하였다.

전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인은 5% 탈지분유가 함유된 PBS 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-p21 항체 (polyclonal anti-p21 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-PAPSS2 항 (polyclonal anti-PAPSS2 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-액틴(actin) 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-p53 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Leica 사)를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 혹은 항-쥐 항체 (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz 사)를 이용해 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham 사)으로 세포노화여부를 확인하였다.

도 4에서 액틴은 모든 세포에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자(하우스키핑 유전자, housekeeping gene)로 동량의 단백질에 대해 분석되었는지를 보여주는 기준으로 사용되었다.

도 4에서 나타난 바와 같이, PAPSS2 유전자의 발현이 억제될수록 세포 노화의 지표(marker)가 되는 p53, p21은 점진적으로 증가됨을 확인하였다. 따라서, 인간 섬유아 세포의 PAPSS2 유전자 발현을 억제시키면 세포 노화가 일어남을 확인할 수 있다.

실시예 4. 계대 횟수에 따른 복제성 노화 확인

복제성 노화를 연구하기 위하여, 인간 섬유아 세포주 HDF (ATCC, USA) 를 100 mm 배양접시 (SPL 사) 상에서 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진) 과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지 안에서 5%의 CO₂ 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 3~4일 후 HDF 세포가 배양접시에 90 % 이상 가득차면 배양액을 걷어내고 PBS (phosphate buffered saline, PBS (주) 웰진) 10 ml 로 남아있는 배양액을 씻어낸 후 트립신((주) 웰진)을 처리하여 배양접시에 붙어있는 HDF를 걷어내고 그 중 4분의 1의 세포만을 새로운 배양접시에 옮겨 위의 배양배지 안에서 5%의 CO₂ 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 이러한 과정을 한번 거치면 계대횟수 1로 계산하여 10 번 계대배양하면 p10, 20번 계대배양하면 p20, 30번 계대배양하면 p30으로 하여 각각 젊은 세포, 중간-늙은 세포, 늙은 세포로 구분하여 세포노화가 제대로 일어났는지 노화-관련 베타갈락토시다아제 활성 염색을 실시하였다. 상기 염색은 Dimri 등의 방법 (Dimri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:9363-9367, 1995)에 따라 다음과 같이 수행하였다.

베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 또한, 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 이용하여 염색된 세포의 갯수를 측정하여 전체 세포에 대한 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율에 관한 그래프를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 p10 및 p20의 경우 검출할 수 있는 범위에 있지 않았다.

도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 계대 횟수가 증가될수록 노화-관련 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율이 증가함을 확인할 수 있다.

따라서, 계대 횟수가 증가될수록 복제성 노화가 진행됨을 확인할 수 있다.

실시예 5. PAPSS2 유전자의 발현정도의 복제성 노화의 지표( marker )로서의 이용 가능성 확인

복제성 노화를 연구하기 위하여, 인간 섬유아 세포주 HDF (ATCC, USA) 를 100 mm 배양접시 (SPL 사) 상에서 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진) 과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 유니트/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배양 배지 안에서 5%의 CO₂ 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 3~4일 후 HDF 세포가 배양접시에 90 % 이상 가득차면 배양액을 걷어내고 PBS (phosphate buffered saline, PBS (주) 웰진) 10 ml 로 남아있는 배양액을 씻어낸 후 트립신((주) 웰진)을 처리하여 배양접시에 붙어있는 HDF를 걷어내고 그 중 4분의 1의 세포만을 새로운 배양접시에 옮겨 위의 배양배지 안에서 5%의 CO₂ 농도 및 37℃ 온도가 항시 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 이러한 과정을 한번 거치면 계대횟수 1로 계산하여 10 번 계대배양하면 p10, 20번 계대배양하면 p20, 30번 계대배양하면 p30 으로 하였다. 상기 인간 섬유아 세포주를 PBS로 세척 후 세포 시료를 세포 용해 완충액 (50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na₃VO₄, 10 μg/ml 아프로티닌, 2 μg/ml 루펩틴)을 사용하여 단백질을 추출하고, 추출한 단백질은 13,200rpm으로 20분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 브래드포드법 {bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976)}을 이용하여 정량하였다. 20㎍의 단백질 2X SDS 로딩 버퍼(60 mm Tris-Cl (pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가해 95℃에서 5분간 가열하고 8% 내지 10% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V로 2시간 전기영동하였다.

전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인은 5% 탈지분유가 함유된 PBS용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-PAPSS2 항체 (polyclonal anti-PAPSS2 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-액틴 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz 사), pRb의 세린 잔기 중 인산화된 아미노산 807/811만을 특이적으로 인지하는 항 p-pRb 항체 (anti-phospho-pRb Ab, cell signaling 사)를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 또는 항-쥐 항체 (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz 사)를 이용해 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham 사)으로 확인하고 PAPSS2 단백질, 액틴 단백질 및 p-pRb 단백질 발현에 대한 결과를 도 7에 나타냈다.

도 7에서 Actin(액틴)은 모든 세포에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자(하우스키핑 유전자, housekeeping gene)로 동량의 단백질에 대해 분석되었는지를 보여주는 기준으로 사용되었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 계대 횟수가 증가될수록 세포의 복제성 노화의 지표가 될 수 있는 pRb의 인산화가 감소됨을 확인할 수 있다. 또한, 계대 횟수가 증가될수록 PAPSS2 단백질 발현이 감소됨을 확인할 수 있다. 따라서, pRb과 마찬가지로 PAPSS2 단백질 발현 정도가 세포의 복제성 노화의 지표(marker)로 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.

<110> Korea Institute of Radiological & Medical Sciences <120> Marker for diagnosing cell senescence and use thereof <130> P13-036-KNUL <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3859 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(3859) <223> Homo sapiens 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2 (PAPSS2), transcript variant 1, mRNA, Access No. NM_004670 <400> 1 ctaggcggcg gcggccgggt ccccaaggct gggcgctgct tgcggaaccg acggggcgga 60 gaggagcgtg gcgggaggag gagtaggaga agggggctgg tcaagggaag tgcgacgtgt 120 ctgcggagcc tttttatacc tccttcccgg gagtccggca gccgctgctg ctgctgctgc 180 tgctgctgcc gccgccgccg ccgccgtccc tgcgtccttc ggtctctgct cccgggaccc 240 gggctccgcc gcagccagcc agcatgtcgg ggatcaagaa gcaaaagacg gagaaccagc 300 agaaatccac caatgtagtc tatcaggccc accatgtgag caggaataag agagggcaag 360 tggttggaac aaggggtggg ttccgaggat gtaccgtgtg gctaacaggt ctctctggtg 420 ctggaaaaac aacgataagt tttgccctgg aggagtacct tgtctcccat gccatccctt 480 gttactccct ggatggggac aatgtccgtc atggccttaa cagaaatctc ggattctctc 540 ctggggacag agaggaaaat atccgccgga ttgctgaggt ggctaagctg tttgctgatg 600 ctggtctggt ctgcattacc agctttattt ctccattcgc aaaggatcgt gagaatgccc 660 gcaaaataca tgaatcagca gggctgccat tctttgaaat atttgtagat gcacctctaa 720 atatttgtga aagcagagac gtaaaaggcc tctataaaag ggccagagct ggggagatta 780 aaggatttac aggtattgat tctgattatg agaaacctga aactcctgag cgtgtgctta 840 aaaccaattt gtccacagtg agtgactgtg tccaccaggt agtggaactt ctgcaagagc 900 agaacattgt accctatact ataatcaaag atatccacga actctttgtg ccggaaaaca 960 aacttgacca cgtccgagct gaggctgaaa ctctcccttc attatcaatt actaagctgg 1020 atctccagtg ggtccaggtt ttgagcgaag gctgggccac tcccctcaaa ggtttcatgc 1080 gggagaagga gtacttacag gttatgcact ttgacaccct gctagatgat ggcgtgatca 1140 acatgagcat ccccattgta ctgcccgtct ctgcagagga taagacacgg ctggaagggt 1200 gcagcaagtt tgtcctggca catggtggac ggagggtagc tatcttacga gacgctgaat 1260 tctatgaaca cagaaaagag gaacgctgtt cccgtgtttg ggggacaaca tgtacaaaac 1320 acccccatat caaaatggtg atggaaagtg gggactggct ggttggtgga gaccttcagg 1380 tgctggagaa aataagatgg aatgatgggc tggaccaata ccgtctgaca cctctggagc 1440 tcaaacagaa atgtaaagaa atgaatgctg atgcggtgtt tgcattccag ttgcgcaatc 1500 ctgtccacaa tggccatgcc ctgttgatgc aggacactcg ccgcaggctc ctagagaggg 1560 gctacaagca cccggtcctc ctactacacc ctctgggcgg ctggaccaag gatgacgatg 1620 tgcctctaga ctggcggatg aagcagcacg cggctgtgct cgaggaaggg gtcctggatc 1680 ccaagtcaac cattgttgcc atctttccgt ctcccatgtt atatgctggc cccacagagg 1740 tccagtggca ctgcaggtcc cggatgattg cgggtgccaa tttctacatt gtggggaggg 1800 accctgcagg aatgccccat cctgaaacca agaaggatct gtatgaaccc actcatgggg 1860 gcaaggtctt gagcatggcc cctggcctca cctctgtgga aatcattcca ttccgagtgg 1920 ctgcctacaa caaagccaaa aaagccatgg acttctatga tccagcaagg cacaatgagt 1980 ttgacttcat ctcaggaact cgaatgagga agctcgcccg ggaaggagag aatcccccag 2040 atggcttcat ggcccccaaa gcatggaagg tcctgacaga ttattacagg tccctggaga 2100 agaactaagc ctttggctcc agagtttctt tctgaagtgc tctttgatta ccttttctat 2160 ttttatgatt agatgctttg tattaaattg cttctcaatg atgcatttta atcttttata 2220 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<220> <221> mRNA <222> (1)..(3874) <223> Homo sapiens 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2 (PAPSS2), transcript variant 2, mRNA, NM_001015880 <400> 2 ctaggcggcg gcggccgggt ccccaaggct gggcgctgct tgcggaaccg acggggcgga 60 gaggagcgtg gcgggaggag gagtaggaga agggggctgg tcaagggaag tgcgacgtgt 120 ctgcggagcc tttttatacc tccttcccgg gagtccggca gccgctgctg ctgctgctgc 180 tgctgctgcc gccgccgccg ccgccgtccc tgcgtccttc ggtctctgct cccgggaccc 240 gggctccgcc gcagccagcc agcatgtcgg ggatcaagaa gcaaaagacg gagaaccagc 300 agaaatccac caatgtagtc tatcaggccc accatgtgag caggaataag agagggcaag 360 tggttggaac aaggggtggg ttccgaggat gtaccgtgtg gctaacaggt ctctctggtg 420 ctggaaaaac aacgataagt tttgccctgg aggagtacct tgtctcccat gccatccctt 480 gttactccct ggatggggac aatgtccgtc atggccttaa cagaaatctc ggattctctc 540 ctggggacag agaggaaaat atccgccgga ttgctgaggt ggctaagctg tttgctgatg 600 ctggtctggt ctgcattacc agctttattt ctccattcgc aaaggatcgt gagaatgccc 660 gcaaaataca tgaatcagca gggctgccat tctttgaaat atttgtagat gcacctctaa 720 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gaggggctac aagcacccgg tcctcctact acaccctctg ggcggctgga 1620 ccaaggatga cgatgtgcct ctagactggc ggatgaagca gcacgcggct gtgctcgagg 1680 aaggggtcct ggatcccaag tcaaccattg ttgccatctt tccgtctccc atgttatatg 1740 ctggccccac agaggtccag tggcactgca ggtcccggat gattgcgggt gccaatttct 1800 acattgtggg gagggaccct gcaggaatgc cccatcctga aaccaagaag gatctgtatg 1860 aacccactca tgggggcaag gtcttgagca tggcccctgg cctcacctct gtggaaatca 1920 ttccattccg agtggctgcc tacaacaaag ccaaaaaagc catggacttc tatgatccag 1980 caaggcacaa tgagtttgac ttcatctcag gaactcgaat gaggaagctc gcccgggaag 2040 gagagaatcc cccagatggc ttcatggccc ccaaagcatg gaaggtcctg acagattatt 2100 acaggtccct ggagaagaac taagcctttg gctccagagt ttctttctga agtgctcttt 2160 gattaccttt tctattttta tgattagatg ctttgtatta aattgcttct caatgatgca 2220 ttttaatctt ttataatgaa gtaaaagttg tgtctataat taaaaaaaaa tatatatata 2280 tacacacaca catatacata caaagtcaaa ctgaagacca aatcttagca ggtaaaagca 2340 atattcttat acatttcata ataaaattag ctctatgtat tttctactgc acctgagcag 2400 gcaggtccca gatttcttaa ggctttgttt gaccatgtgt ctagttactt gctgaaaagt 2460 gaatatattt tccagcatgt cttgacaacc tgtactcttc caatgtcatt tatcagttgt 2520 aaaatatatc agattgtgtc ctcttctgta caattgacaa aaaaaaaaat ttttttttct 2580 cactctaaaa gaggtgtggc tcacatcaag attcttcctg atattttacc tcatgctgta 2640 caaagcctta atgttgtaat catatcttac gtgttgaaga cctgactgga gaaacaaaat 2700 gtgcaataac gtgaatttta tcttagagat ctgtgcagcc tatttctgtc acaaaagtta 2760 tattgtctaa taagagaagt cttaatggcc tctgtgaata atgtaactcc agttacacgg 2820 tgacttttaa tagcatacag tgatttgatg aaaggacgtc aaacaatgtg gcgatgtcgt 2880 ggaaagttat ctttcccgct ctttgctgtg gtcattgtgt cttgcagaaa ggatggccct 2940 gatgcagcag cagcgccagc tgtaataaaa aataattcac actatcagac tagcaaggca 3000 ctagaactgg aaaagaccac agaaaacaaa gaatccaacc ctttcatctt acaggtgaac 3060 aaactgtgat gatgcacatg tatgtgtttt gtaagctgtg agcaccgtaa caaaatgtaa 3120 atttgccatt attaggaagt gctggtggca gtgaagaagc acccaggcca cttgactccc 3180 agtctggtgc cctgtctaca ccagacaaca caggagctgg gtcagattcc cctcagctgc 3240 ttaacaaagt tcctcgaaca gaaagtgctt acaaagctgc cttctcggat actgaaaggt 3300 cgagttttct gaactgcact gattttattg cagttgaaaa aaaaaaaaag ctattccaaa 3360 gatttcaagc tgttctgaga catcttctga tggctttact tcctgagagg caatgttttt 3420 actttatgca taattcattg ttgccaagga ataaagtgaa gaaacagcac cttttaatat 3480 ataggtctct ctggaagaga cctaaattag aaagagaaaa ctgtgacaat tttcatattc 3540 tcattcttaa aaaacactaa tcttaactaa caaaagttct tttgagaata agttacacac 3600 aatggccaca gcagtttgtc tttaatagta tagtgcctat actcatgtaa tcggttactc 3660 actactgcct ttaaaaaaaa aaaccagcat atttattgaa aacatgagac aggattatag 3720 tgccttaacc gatatatttt gtgacttaaa aaatacattt aaaactgctc ttctgctcta 3780 gtaccatgct tagtgcaaat gattatttct atgtacaact gatgcttgtt cttattttaa 3840 taaatttatc agagtgaaaa aaaaaaaaaa aaaa 3874 <210> 3 <211> 614 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(614) <223> Homo sapiens bifunctional 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2 isoform a protein <400> 3 Met Ser Gly Ile Lys Lys Gln Lys Thr Glu Asn Gln Gln Lys Ser Thr 1 5 10 15 Asn Val Val Tyr Gln Ala His His Val Ser Arg Asn Lys Arg Gly Gln 20 25 30 Val Val Gly Thr Arg Gly Gly Phe Arg Gly Cys Thr Val Trp Leu Thr 35 40 45 Gly Leu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Thr Ile Ser Phe Ala Leu Glu Glu 50 55 60 Tyr Leu Val Ser His Ala Ile Pro Cys Tyr Ser Leu Asp Gly Asp Asn 65 70 75 80 Val Arg His Gly Leu Asn Arg Asn Leu Gly Phe Ser Pro Gly Asp Arg 85 90 95 Glu Glu Asn Ile Arg Arg Ile Ala Glu Val Ala Lys Leu Phe Ala Asp 100 105 110 Ala Gly Leu Val Cys Ile Thr Ser Phe Ile Ser Pro Phe Ala Lys Asp 115 120 125 Arg Glu Asn Ala Arg Lys Ile His Glu Ser Ala Gly Leu Pro Phe Phe 130 135 140 Glu Ile Phe Val Asp Ala Pro Leu Asn Ile Cys Glu Ser Arg Asp Val 145 150 155 160 Lys Gly Leu Tyr Lys Arg Ala Arg Ala Gly Glu Ile Lys Gly Phe Thr 165 170 175 Gly Ile Asp Ser Asp Tyr Glu Lys Pro Glu Thr Pro Glu Arg Val Leu 180 185 190 Lys Thr Asn Leu Ser Thr Val Ser Asp Cys Val His Gln Val Val Glu 195 200 205 Leu Leu Gln Glu Gln Asn Ile Val Pro Tyr Thr Ile Ile Lys Asp Ile 210 215 220 His Glu Leu Phe Val Pro Glu Asn Lys Leu Asp His Val Arg Ala Glu 225 230 235 240 Ala Glu Thr Leu Pro Ser Leu Ser Ile Thr Lys Leu Asp Leu Gln Trp 245 250 255 Val Gln Val Leu Ser Glu Gly Trp Ala Thr Pro Leu Lys Gly Phe Met 260 265 270 Arg Glu Lys Glu Tyr Leu Gln Val Met His Phe Asp Thr Leu Leu Asp 275 280 285 Asp Gly Val Ile Asn Met Ser Ile Pro Ile Val Leu Pro Val Ser Ala 290 295 300 Glu Asp Lys Thr Arg Leu Glu Gly Cys Ser Lys Phe Val Leu Ala His 305 310 315 320 Gly Gly Arg Arg Val Ala Ile Leu Arg Asp Ala Glu Phe Tyr Glu His 325 330 335 Arg Lys Glu Glu Arg Cys Ser Arg Val Trp Gly Thr Thr Cys Thr Lys 340 345 350 His Pro His Ile Lys Met Val Met Glu Ser Gly Asp Trp Leu Val Gly 355 360 365 Gly Asp Leu Gln Val Leu Glu Lys Ile Arg Trp Asn Asp Gly Leu Asp 370 375 380 Gln Tyr Arg Leu Thr Pro Leu Glu Leu Lys Gln Lys Cys Lys Glu Met 385 390 395 400 Asn Ala Asp Ala Val Phe Ala Phe Gln Leu Arg Asn Pro Val His Asn 405 410 415 Gly His Ala Leu Leu Met Gln Asp Thr Arg Arg Arg Leu Leu Glu Arg 420 425 430 Gly Tyr Lys His Pro Val Leu Leu Leu His Pro Leu Gly Gly Trp Thr 435 440 445 Lys Asp Asp Asp Val Pro Leu Asp Trp Arg Met Lys Gln His Ala Ala 450 455 460 Val Leu Glu Glu Gly Val Leu Asp Pro Lys Ser Thr Ile Val Ala Ile 465 470 475 480 Phe Pro Ser Pro Met Leu Tyr Ala Gly Pro Thr Glu Val Gln Trp His 485 490 495 Cys Arg Ser Arg Met Ile Ala Gly Ala Asn Phe Tyr Ile Val Gly Arg 500 505 510 Asp Pro Ala Gly Met Pro His Pro Glu Thr Lys Lys Asp Leu Tyr Glu 515 520 525 Pro Thr His Gly Gly Lys Val Leu Ser Met Ala Pro Gly Leu Thr Ser 530 535 540 Val Glu Ile Ile Pro Phe Arg Val Ala Ala Tyr Asn Lys Ala Lys Lys 545 550 555 560 Ala Met Asp Phe Tyr Asp Pro Ala Arg His Asn Glu Phe Asp Phe Ile 565 570 575 Ser Gly Thr Arg Met Arg Lys Leu Ala Arg Glu Gly Glu Asn Pro Pro 580 585 590 Asp Gly Phe Met Ala Pro Lys Ala Trp Lys Val Leu Thr Asp Tyr Tyr 595 600 605 Arg Ser Leu Glu Lys Asn 610 <210> 4 <211> 619 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(619) <223> Homo sapiens bifunctional 3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2 isoform b protein <400> 4 Met Ser Gly Ile Lys Lys Gln Lys Thr Glu Asn Gln Gln Lys Ser Thr 1 5 10 15 Asn Val Val Tyr Gln Ala His His Val Ser Arg Asn Lys Arg Gly Gln 20 25 30 Val Val Gly Thr Arg Gly Gly Phe Arg Gly Cys Thr Val Trp Leu Thr 35 40 45 Gly Leu Ser Gly Ala Gly Lys Thr Thr Ile Ser Phe Ala Leu Glu Glu 50 55 60 Tyr Leu Val Ser His Ala Ile Pro Cys Tyr Ser Leu Asp Gly Asp Asn 65 70 75 80 Val Arg His Gly Leu Asn Arg Asn Leu Gly Phe Ser Pro Gly Asp Arg 85 90 95 Glu Glu Asn Ile Arg Arg Ile Ala Glu Val Ala Lys Leu Phe Ala Asp 100 105 110 Ala Gly Leu Val Cys Ile Thr Ser Phe Ile Ser Pro Phe Ala Lys Asp 115 120 125 Arg Glu Asn Ala Arg Lys Ile His Glu Ser Ala Gly Leu Pro Phe Phe 130 135 140 Glu Ile Phe Val Asp Ala Pro Leu Asn Ile Cys Glu Ser Arg Asp Val 145 150 155 160 Lys Gly Leu Tyr Lys Arg Ala Arg Ala Gly Glu Ile Lys Gly Phe Thr 165 170 175 Gly Ile Asp Ser Asp Tyr Glu Lys Pro Glu Thr Pro Glu Arg Val Leu 180 185 190 Lys Thr Asn Leu Ser Thr Val Ser Asp Cys Val 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Claims

세포 내 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자 발현 정도를 평가하는 단계를 포함하는 노화 세포를 진단하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 내 PAPSS2 유전자 발현의 감소가 세포 노화 진단용 마커인 노화 세포를 진단하는 방법.
PAPSS2 유전자에 대한 항체를 포함하는 세포 노화 진단용 키트.
세포 내 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자 발현을 억제하는 약물을 스크리닝하는 단계를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물 스크리닝 방법.
세포 내 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자 발현을 활성화하는 약물을 스크리닝하는 단계를 포함하는 세포 노화 억제용 조성물 스크리닝 방법.
인간을 제외한 포유동물의 비종양세포 내 PAPSS2 (3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 세포 노화 유도용 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 포유동물의 비종양 세포의 노화 유도 방법.