KR20190133553A - 자궁경부암 치료용 또는 진단용 조성물 및, 이를 이용한 치료제 스크리닝 및 자궁경부암 진단 방법 - Google Patents

Abstract

키네신 경쇄 4 (Kinesin light chain 4: KLC4) 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 자궁경부암 치료용 약학 조성물 및 진단용 조성물을 제공하며, KLC4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 이용한 자궁경부암 치료 또는 진단 방법을 제공한다.

Description

자궁경부암 치료용 또는 진단용 조성물 및, 이를 이용한 치료제 스크리닝 및 자궁경부암 진단 방법{Composition for treating or diagnosing of cervix cancer, and method for screening the therapeutic agent and diagnosis of cervical cancer using the same}

자궁경부암 치료용 또는 진단용 조성물 및, 이를 이용한 치료제 스크리닝 및 자궁경부암 진단 방법에 관한 것이며, 보다 자세하게는 키네신 경쇄 4 (Kinesin light chain 4: KLC4) 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 이용한 자궁경부암 치료 및 진단에 관한 것이다.

자궁경부암은 자궁을 구성하고 있는 체부(corpus)와 경부(cervix) 중에서, 질에 연결된 자궁경부에 발생하는 악성종양을 말한다. 자궁경부암은 전 세계적으로 여성에게 발병하는 암 중 두 번째로 흔한 암이며, 여성의 암에 의한 사망원인 중 4위에 해당될 정도로 그 수가 매우 방대하다. 또한, 생활 습관의 변화와 환경적 요인으로 인하여 자궁경부암의 발병률이 점차 높아지고 있으며 과거에는 중년층 여성에서 많이 발병하였지만 지금은 20~30대의 젊은 연령층에서의 발병이 높아지고 있는 추세이다. 자궁경부암으로 진단되면 수술하기 전에 임상적으로 질병이 어느 정도 진행되었는지를 나타내는 병기를 결정하기 위한 몇 가지 검사를 시행하게 되는데, 자궁경부암의 병기는 1기부터 4기까지로 구분된다. 치료 후 5년 생존율은 1기 초의 경우 100% 까지도 가능하다. 그러나 1기 말은 80~90%, 2기 초는 70~80%, 2기 말은 60~65%, 3기는 35~45% 정도이고, 4기에 암이 발견되는 경우에는 치료에도 불구하고 5년 생존율이 15% 정도에 불과하다. 즉, 자궁경부암은 조기에 발견될수록 그 생존율이 매우 높음을 알 수 있는바, 그 예방을 위해서는 정기적인 검진을 통해 암을 조기에 발견하려는 노력이 필요하다. 더욱이 발병 초기에는 특별한 자각증상이 없어서 조기 진단을 위해서는 매년 정기적인 검사와 진찰을 받아야 할 필요가 있다. 자궁경부암 진단 방법으로는 자궁경부 세포검사(Pap test), 질확대경 검사(colposcopy), 조직생검(biopsy), 원추 절제술(conization), 인유두종 바이러스 검사(HPV test) 등이 있고, 치료를 위해 수술 또는 동시화학방사선요법이 사용될 수 있으나, 진단 및 치료 방법으로서 충분하지 못하다. 따라서 자궁경부암의 조기 진단 및 자궁경부암 특이적 치료에 관한 연구가 필요하다.

그럼에도 자궁경부암을 진단 및 치료하기 위한 타겟 유전자에 관한 연구는 많이 부족한 것이 현실이며, 예를 들어 특허문헌 1에서는 자궁경부암의 바이오 마커로서 특이적으로 메틸화되는 유전자를 기술하나, 본 발명에서와 같이 KLC4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 대상으로 자궁경부암 치료 및 진단에 관해서는 연구되지 않았다. 이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 정상인에 비하여 자궁경부암 환자에서 KLC4 유전자의 발현이 높은 것을 확인하고 KLC4의 기능을 규명하였으며, KLC4의 발현을 억제하여 자궁경부암을 진단 및 치료하는 기술을 개발하였다.

한국등록특허 제10-1255768호

일 양상은 자궁경부암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

다른 일 양상은 자궁경부암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 일 양상은 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

다른 일 양상은 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 자궁경부암을 진단 및 치료하기 위한 타겟 유전자를 발굴하기 위한 연구를 통해 정상인에 비하여 자궁경부암 예컨대 자궁경부 편평상피암(cervical squamous cell carcinoma: CSCC) 환자에서는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 높은것으로 확인하였다(oncomine database). 또한, 상기 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자가 자궁경부암과 관련한 주요한 인자임을 확인하였고, KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제함에 따라 자궁경부암을 치료 및 진단할 수 있는 신규한 용도를 제공한다.

일 양상은 키네신 경쇄 4 (Kinesin light chain 4: KLC4) 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 자궁경부암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

용어 "KLC4(Kinesin light chain 4)"는 Class I MHC 매개성 항원가공 및 항원제시 과정에 관여하는 단백질을 의미한다. 상기 KLC4를 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: NM_001289034, NP_001275963 등).

용어 "발현 또는 활성을 억제하는 물질"은 유전자에서 발현되어 생산되는 전사체 또는 단백질의 생성을 억제할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 물질은 유전자에 결합하여 전사수준에서 억제하는 전사인자; 전사되어 합성된 전사체에 결합하여 전사체를 분해하는 miRNA, siRNA, shRNA 등의 간섭 RNA; 발현된 단백질과 결합할 수 있는 항체, 앱타머, 안타고니스트일 수 있다.

용어 "간섭 RNA(interfering RNA)"는 유전자의 활성을 억제하는 RNAi를 유발시킬 수 있는 이중가닥 RNA를 의미한다. 상기 간섭 RNA는 KLC4의 발현을 억제할 수 있는 miRNA, siRNA, shRNA 등이 될 수 있는데, 상기 간섭 RNA는 KLC4의 mRNA를 분해하고 그 결과 유전자의 발현을 억제할 수 있기만 하면 어떠한 형태의 것도 가능한데, 예를 들면, 화학합성 또는 생화학적 합성 또는 생체내 합성에 의해 수득되는 물질일 수 있다.

용어 "마이크로 RNA(microRNA: miRNA)"는 다양한 생물학적 과정의 중요한 조절자로서 작은 미인식 RNA 분자로 구성되며 표적유전자 번역 억제와 mRNA 분해를 통해 포스터-전자조절을 제어하는 물질을 지칭한다. 상기 microRNA는 주로 표적 mRNA의 3'UTR에 결합하여 mRNA의 분해를 촉진하거나 mRNA의 번역을 저해함에 따라 여러 생물체에서 단백질의 발현을 음성 조절한다.

용어 "작은 간섭 RNA(siRNA)"는 때론 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA) 또는 억제 RNA(silencing RNA)로 지칭되며, 예컨대 상기 물질은 KLC4의 발현을 억제하는 서열번호 1의 siRNA일 수 있다.

상기 siRNA RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 "짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA:shRNA)"라 지칭한다. 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다.

용어 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 말한다. 상기 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다. 상기 항체는 KLC4 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있고, 일 예로서 KLC4 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 그의 일부가 될 수 있다.

용어 "앱타머(aptamer)"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮을 수 있다. 상기 앱타머는 KLC4 단백질에 결합함으로써 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 물질일 수 있다.

용어 "안타고니스트(antagonist)"는 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 분자를 의미하며, 수용체의 리간드와 함께 사용하는 경우에 상기 리간드의 작용을 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 안타고니스트는 KLC4 단백질의 활성을 억제하는 분자라면 제한 없이 포함하며, 일 예로 KLC4 단백질에 결합하여 활성을 억제하는 분자를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.

일 구체예에서 상기 KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질은 하기 서열번호 1의 siRNA일 수 있다.

서열번호	서열 (5'→ 3')
1 (KLC4 siRNA)	5'- CCA GAA UAA GUA UAA GGA AUU -3'

일 구체예에서 상기 KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 자궁경부암 세포주에 처리하였을 때 미토콘드리아의 기능 장애가 일어나며 자궁경부 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.

자궁은 체부(corpus)와 경부(cervix)로 구성되는데, 용어 "자궁경부암(uterine cervical cancer)"은 질에 연결된 자궁경부에 발생하는 악성종양을 말한다. 상기 자궁경부암은 자궁경부 편평상피세포암(cervical squamous cell carcinoma: CSCC)일 수 있다.

상기 KLC4의 자궁경부 조직에서의 과발현은 자궁경부암 특히 자궁경부 편평상피세포암에서 특이적으로 나타날 수 있다.

상기 KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제는 암세포주에서 미토콘드리아 기능 장애에 의한 것일 수 있다.

용어 "미토콘드리아 기능 장애"는 정상적인 세포에서 나타나는 미토콘드리아의 생물학적 활성이 감소된 상태로서 예를 들어, 미토콘드리아 효소 활성의 감소, 전자전달계(electron transport chain) 활성 감소, 막전위 감소, 활성산소종(reactive oxygen species) 생산의 증가, 미토콘드리아 단편화(mitochondria fragmentaion), 칼슘 조절장애, 및 미토콘드리아 DNA (mtDNA)의 돌연변이 현상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

용어 "치료(treatment)"는 증상의 완화, 질환 또는 손상 정도의 감소, 악화되지 않는 질환의 유지, 질환진행의 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화, (일부 또는 완전한) 완화를 포함한다. 또한, 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 질환의 상태와 비교하여 호전된 상태를 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질병의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교하여 원하지 않는 질병의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다.

일 구체예에서 상기 미토콘드리아 기능 장애는 칼슘 조절장애에 의한 것일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 미토콘드리아 기능 장애는 KLC4 발현 억제에 의하여 미토콘드리아 내부로 칼슘의 유입을 조절하지 못함으로써 유발되는 것일 수 있다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 단백질의 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 함량은 총 약학 조성물에 대하여 0.01 내지 50 중량%일 수 있으며, 대상 개체의 특성, 상태, 사용 목적을 고려하여 적절하게 조절할 수 있다. 상기 약학 조성물은 대상 개체의 특성, 상태, 사용 목적을 고려하여 1일 1회 내지 수회 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한 상기 약학 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

다른 일 양상은 키네신 경쇄 4 (Kinesin light chain 4: KLC4) 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 자궁경부암 치료용 진단용 조성물을 제공한다.

상기 물질은 KLC4 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머 또는 안타고니스트일 수 있으며, 구체적인 설명 및 예시는 상술한 바와 같다.

상기 물질은 KLC4 유전자로부터 발현되는 mRNA의 수준을 측정하는데 사용되는 프라이머일 수 있다.

일 구체예는 상기 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트일 수 있다. 용어 "진단키트"는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들어 단백질 발현 수준을 측정하는 물질이 항체인 경우, 상기 진단키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단키트일 수 있다. 이러한 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합) 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

상기 키트는 KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 검출할 수 있는 시약, 예컨대 상기 KLC4 단백질 또는 유전자를 mRNA 수준에서 검출할 수 있는 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 단백질 수준에서 검출할 수 있는 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드 또는 보조인자, 또는 질량분광분석기 검출용 시약일 수 있다. 예를 들어 상기 상기 mRNA 수준에서 검출할 수 있는 시약은 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법 또는 노던 블랏에 사용되는 시약일 수 있다.

다른 일 양상은 자궁경부암 치료후보 물질을 자궁경부암 조직에 처리하여 KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정한 발현 또는 활성 수준을 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 KLC4 단백질 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

용어, "치료후보 물질"은 자궁경부암을 치료할 수 있는 물질을 제한 없이 포함하나, 일 예로 화합물, siRNA, 안티센스올리고뉴클레오티드, 항체, 항암제, 방사선 물질 등일 수 있다.

상기 측정은 자궁경부암 발암단계(carcinogenesis)에서 측정될 수 있다. 용어 "발암단계"는 자궁 상피가 악성으로 변환되는 단계를 의미한다. KLC4 의 발현 정도의 측정은 발암단계뿐 아니라 자궁경부암 예후를 진단하는 단계에서도 측정될 수 있다.

다른 일 양상은 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및

상기 측정한 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 KLC4 단백질 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 상기 진단은 자궁경부암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 자궁경부암의 발병 여부를 확인하는 것일 수 있다. 상기 진단 대상이 되는 자궁경부암은 구체적으로는 자궁경부 편평상피세포암일 수 있다.

용어 "진단하고자 하는 개체"는 자궁경부암이 이미 발생한 대상 또는 자궁경부암을 갖기 쉬운 대상을 포함하며, 포유동물일 수 있다. 구체적인 포유동물은, 예를 들면, 인간, 인간이 아닌 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 및 소를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

용어 "생물학적 시료"는 인체나 포유동물로부터 얻어지는 모든 고형 또는 액상의 시료, 예컨대, 특정 장기 유래의 조직, 오줌, 타액, 전혈, 혈장 또는 혈청 시료를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 생물학적 시료는 자궁경부암 조직일 수 있으며, 예를 들어 자궁경부 편평상피세포암 조직일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "약 (about)", 또는 대략 (approximately)" 등의 표현은 언급하는 값이 어느 정도 변할 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 값은 10%, 5%, 2%, 또는 1%로 변할 수 있다. 어떤 구체예에서, 상기 값은 5%, 2%, 또는 1%로 변할 수 있다. 예를 들어, "약 5 (about 5)"는 4.5 및 5.5 사이, 4.75 및 5.25 사이, 또는 4.9 및 5.1 사이, 또는 4.95 및 5.05 사이의 임의의 값을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어, "가진다", "가질 수 있다", "포함한다", 또는 "포함할 수 있다" 등의 표현은 해당 특징(예: 수치, 또는 성분 등의 구성요소)의 존재를 가리키며, 추가적인 특징의 존재를 배제하지 않는다. 또한, 본 명세서에서 특별히 문맥상 지시된 것이 아니라면 단수형은 복수형도 또한 포함한다. 다른 식으로 정의된 것이 아니라면 본 명세서에 사용하는 모든 기술적 및 과학적 용어는 이 발명이 속한 업계의 통상의 기술자가 보통 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 모순이 될 경우, 본 명세서가 조절할 것이다.

키네신 경쇄 4 (Kinesin light chain 4: KLC4) 단백질 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자를 타겟으로 하여 자궁경부암을 치료 또는 진단할 수 있으며, 이를 이용하여 자궁경부암 치료제를 스크리닝하는 방법 및 자궁경부암을 진단하는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 정상인 대비 자궁경부 편평상피세포암(CSCC) 환자에서의 KLC4 mRNA 량에 관한 통계 값을 나타낸다(p < 0.001).
도 2는 세포형광 염색 결과 자궁경부암 세포(SiHa cell) 내 KLC4의 분포 위치를 나타낸다. 도 2(a)는 SiHa cell에서 DAPI 형광물질로 염색한 핵의 위치를 나타낸다. 도 2(b)는 SiHa cell에서 KLC4에 결합할 수 있는 이차 항체를 처리한 결과를 나타낸다. 도 2(c)는 SiHa cell에 미토콘드리아 마커인 Mitotracker Red를 처리한 결과를 나타낸다. 도 2(d)는 도 2(a), 도 2(b) 및 도 2(c)의 중첩된 이미지를 나타낸다.
도 3(a) 및 도 3(b)는 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4을 처리하지 않은 대조군(siCon)(a) 및 siKLC4을 처리한 실험군(b)을 Mitotracker Red/Green으로 염색하고 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 도 3(c)는 상기 대조군 및 실험군에서의 미토콘드리아 손상률(%)값을 산출한 결과를 나타낸다.
도 4(a)는 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4을 처리하지 않은 대조군(siCon) 및 siKLC4을 처리한 실험군의 세포 모양을 관찰할 사진이다. 도 4(b)는 상기 대조군 및 실험군에서의 마커를 면역블롯팅(immunoblotting)을 통하여 확인한 결과를 나타낸다. 도 4(c)는 상기 대조군 및 실험군에서 AnnexinV/PI 염색(staining) 및 유세포 분석기를 통하여 세포 사멸을 확인한 결과를 나타낸다. 도 4(d)는 상기 대조군 및 실험군에서의 세포사멸률(%)값을 산출한 결과를 나타낸다.
도 5(a)는 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4을 처리하지 않은 대조군(siCon) 및 siKLC4을 처리한 실험군에 칼슘 흡수(uptake) 억제제(Rethenium Red ; RR)를 처리함으로써 확인한 미토콘드리아의 손상률(%)을 나타낸다. 도 5(b)는 상기 실험군에서 AnnexinV/PI 염색(staining)을 통하여 확인한 세포사멸률(%)을을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 온코민 데이타베이스 및 통계 분석

온코민 데이타베이스 (Oncomine database) 사용에 관하여는 종래의 방법에 따랐다(Rhodes et al, 2004). KLC4의 유전자 발현데이터를 온코민 웹사이트 (Oncomine website, www.oncomine.org)로부터 검색하였다. 정상과 암조직 사이의 KLC4 발현에서의 차이점을 나타낸 데이터가 산출되었다.

도 1은 정상인 (n=5) 대비 자궁경부 편평상피세포암(CSCC ; n=40) 환자에서의 KLC4의 mRNA 량에 관한 통계 값을 나타낸다. 도 1에서와 같이, 정상인 대비 자궁경부 편평상피세포암(CSCC) 환자에서는 KLC4 mRNA가 증가 되었음이 확인되었다. 상기 값은 통계적으로 유의하였다(p < 0.001).

실시예 2: 자궁경부암 세포(SiHa cell) 내 KLC4의 분포위치 확인

1) 자궁경부암세포주(SiHa)의 배양

ATCC로부터 자궁경부암세포주(SiHa)를 입수하고, 세포에 필요한 다양한 성장인자들이 포함되어있는 배지(10% FBS를 포함하는 DMEM 배지)를 이용하여, 상기 SiHa 세포주를 섭씨 37도, 5 % CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. 실시예 3 내지 5에서도 동일한 자궁경부암 세포주를 사용하였다.

2) 세포 형광염색

세포를 커버 슬라이드 위에 배양한 다음, 10 %의 중성포르말린으로 10분 동안 고정시키고 염색 전에 PBS로 세척하였다. 0.2% Triton X-100으로 침투화(permeabilization) 시킨후 4% 소혈청알부민(bovine serum albumin: BSA)으로 블로킹(blocking) 하였다. 인산 완충 용액(phosphate based saline: PBS) 및 0.1 % Triton X-100를 포함하는 용액에 1:100 비율로 희석한 KLC4 안티바디(sigma)를 섭씨 4℃에서 12시간 반응시켰다. PBS로 세척 후, 이차 항체로서 형광물질이 붙은 항체(invitrogen, alexa fluor 488)를 1:500 비율로 희석하여 섭씨 25도에서 2시간 반응시켰다. 핵을 염색하기 위하여 DAPI 형광물질을 PBS로 1:1000비율로 희석하여 섭씨 25℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후, PBS 용액을 세척 후 글리세롤을 한 방울 떨어뜨린 후 커버 슬라이드(cover slide)를 덮고 공초점 현미경으로 관찰하였다.

도 2는 세포형광 염색 결과 자궁경부암 세포(SiHa cell) 내 KLC4의 분포 위치를 나타낸다. 도 2(a)는 SiHa cell에서 DAPI 형광물질로 염색한 핵의 위치를 나타낸다. 도 2(b)는 SiHa cell에서 KLC4에 결합할 수 있는 이차 항체를 처리한 결과를 나타낸다. 도 2(c)는 SiHa cell에 미토콘드리아 마커인 Mitotracker Red를 처리한 결과를 나타낸다. 도 2(d)는 도 2(a), 도 2(b) 및 도 2(c)의 중첩된 이미지를 나타낸다.

도 2에서와 같이 자궁경부암 세포(SiHa cell)에서 KLC4를 형광염색하였을 때 미토콘드리아 마커인 Mitotracker Red와 같은 위치에 발견됨을 확인하였다. 또한 이로부터 KLC4는 세포내에서 미토콘드리아에 강하게 위치하는 것을 규명하였다.

실시예 3: KLC4 조절을 통한 미토콘드리아 기능 장애 검증 (1)

실시예 2에서 배양한 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4(서열번호 1)(CCA GAA UAA GUA UAA GGA AUU)을 처리하였다(실험군, siKLC4). siKLC4을 처리하지 않은 자궁경부암 세포와 비교하였다(대조군, siCon). 미토콘드리아의 기능 장애를 분석하기 위하여 대조군 및 실험군 세포에 Mitotracker Red/Green으로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다.

도 3(a) 및 도 3(b)는 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4을 처리하지 않은 대조군(siCon)(a) 및 siKLC4을 처리한 실험군(b)을 Mitotracker Red/Green으로 염색하고 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸다. 도 3(a) 및 도 3(b)에서와 같이 정상의 미토콘드리아를 가진 세포는 Mitotracker Red/Green가 모두 그래프에서 우측 상단에 같이 나타나느 반면에, 손상된 미토콘드리아를 가진 세포는 Mitotracker Green은 동일하게 우측 상단에 나타나지만 FL2 파장 (Mitotracker Red)이 네가티브(negative)로 나타나며 이에 따라 Mitotracker Red의 경우 우측하단에 나타나고, 그래프에서 정상 세포에 비하여 아래쪽에서 염색된 세포가 검출되는 것을 확인할 수 있다.

도 3(c)는 상기 대조군 및 실험군에서의 미토콘드리아 손상률(%)값을 산출한 결과를 나타낸다. 도 3(c)에서와 같이, 대조군에 비하여 siKLC4을 처리한 실험군에서는 손상된 미토콘드리아의 비율(%)이 약 12배 증가함을 알 수 있다.

상기 도 3에서와 같이 KLC4를 억제 시 미토콘드리아의 기능 장애가 일어남을 확인하였다.

실시예 4: KLC4 조절을 통한 미토콘드리아 기능 장애 검증 (2)

1) 자궁경부암세포주(SiHa)의 세포 모양 변화 관찰

자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4를 lipofectamine RNAimax를 사용하여 세포 내로 형질감염(transfection) 시킨 후 전자현미경으로 세포 모양의 변화를 관찰하였다. 도 4(a)는 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4을 처리하지 않은 대조군(siCon) 및 siKLC4을 처리한 실험군의 세포 모양을 관찰할 사진이다. 도 4(a)에서와 같이 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4을 처리하지 않은 대조군(siCon)과 비교하여 siKLC4을 처리한 실험군에서는 세포 모양의 변화가 관찰되었다.

2) 면역블롯팅(immunoblotting)

대조군(siCon)과 실험군(siKLC4) 내 단백질을 관찰하기 위해 150mM 염화나트륨(sodium chloride), 40mM Tris-Cl (pH 8.0), 0.1% NP-40로 이루어진 용액에 세포를 용해시킨 시료를 만들었다. 이 시료들을 도데실황산나트륨(sodium dodecyl sulfate: SDS)이 포함된 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis: PAGE)로 전기영동을 수행한 후, 면역블롯(웨스턴블롯)을 수행하였다. 전기영동으로 분리된 단백질들을 PVDF 멤브레인에 옮기고, 그 후 면역블롯팅 방법으로 해당 단백질들의 발현량을 분석하였다. 도 4(b)는 상기 대조군 및 실험군에서의 마커를 면역블롯팅(immunoblotting)을 통하여 확인한 결과를 나타낸다. 도 4(b)에서와 같이 대조군과 비교하여 실험군에서는 세포사멸 마커인 cleaved-PARP가 증가됨을 알 수 있다.

3) 유세포 분석

상기 대조군(siCon)과 실험군(siKLC4)을 Annexin V와 PI로 염색한 후 유세포 분석기로 세포사멸의 정도를 측정하였다. 도 4(c)는 상기 대조군 및 실험군에서 AnnexinV/PI 염색(staining) 및 유세포 분석기를 통하여 세포 사멸을 확인한 결과를 나타낸다. 도 4(c)에서와 같이 대조군과 비교하여 실험군에서는 세포 사멸이 증가하였음을 알 수 있다. 상기 분석을 3회 반복하여 그 결과를 그래프로 나타내었다. 도 4(d)는 이에 따라 산출된 상기 대조군 및 실험군에서의 세포사멸률(%)값의 결과를 나타낸다.

도 4의 결과로부터 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 KLC4의 발현을 억제하면 세포사멸 마커인 Cleaved-PARP가 증가함을 확인하였다. 또한, 이와 동일하게 Annexin V/PI staining에서도 세포사멸을 유발하는 것을 확인하였다.

실시예 5: KLC4 발현 억제는 미토콘드리아 기능 장애에 기인한 세포사멸 검증

KLC4 발현 억제가 미토콘드리아 기능 장애에 기인함을 확인하기 위하여 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4을 처리하지 않은 대조군(siCon) 및 siKLC4을 처리한 실험군에 칼슘 흡수(uptake) 억제제(Rethenium Red ; RR)를 처리하였다.

도 5(a)는 자궁경부암 세포(SiHa cell)에 siKLC4을 처리하지 않은 대조군(siCon) 및 siKLC4을 처리한 실험군에 각각 칼슘 흡수(uptake) 억제제(Rethenium Red ; RR)를 처리함으로써 확인한 미토콘드리아의 손상률(%)을 나타낸다. 도 5(a)에서와 같이, siKLC4을 처리한 실험군에는 미토콘드리아의 손상률(%)이 감소하여, siKLC4을 처리에 의해 미토콘드리아의 손상을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.

도 5(b)는 상기 실험군에서 AnnexinV/PI 염색(staining)을 통하여 확인한 세포사멸률(%)을 나타낸다. 도 5(b)에서와 같이, siKLC4을 처리한 실험군에는 세포사멸률(%)이 감소하였음을 알 수 있다.

도 5의 결과로부터 미토콘드리아 칼슘 uptake 억제제 (Ruthenium Red ; RR)을 처리하여 손상된 미토콘드리아를 감소 시켰을 때 세포 사멸도 같이 감소함을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Composition for treating or diagnosing of cervix cancer, and method for screening the therapeutic agent and diagnosis of cervical cancer using the same <130> PN121575 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KLC4 siRNA <400> 1 ccagaauaag uauaaggaau u 21

Claims (14)

1. 키네신 경쇄 4 (Kinesin light chain 4: KLC4) 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는 자궁경부암 치료용 약학 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 KLC4 단백질의 활성을 억제하는 항체, 앱타머 또는 안타고니스트인 것인 약학 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 miRNA, siRNA 또는 shRNA인 것인 약학 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 KLC4의 발현을 억제하는 서열번호 1의 siRNA인 것인 약학 조성물.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 KLC4의 발현 억제는 미토콘드리아 기능 장애에 의한 것인 약학 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 자궁경부암은 자궁경부 편평상피세포암(cervical squamous cell carcinoma: CSCC)인 것인 약학 조성물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
8. KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 것인 자궁경부암 진단용 조성물.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 물질은 KLC4 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머 또는 안타고니스트인 것인 진단용 조성물.
10. 청구항 8에 있어서, 상기 물질은 KLC4 유전자로부터 발현되는 mRNA의 수준을 측정하는데 사용되는 프라이머인 것인 진단용 조성물.
11. 청구항 8의 진단용 조성물을 포함하는 자궁경부암 진단용 키트.
12. 자궁경부암 치료후보 물질을 자궁경부암 조직에 처리하여 KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정한 발현 또는 활성 수준을 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 KLC4 단백질 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 치료제 스크리닝 방법.
13. 진단하고자 하는 개체의 생물학적 시료로부터 KLC4 단백질의 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정한 발현 또는 활성 수준을 정상 대조군 시료의 KLC4 단백질 활성 또는 KLC4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 자궁경부암 진단을 위한 정보제공방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 생물학적 시료를 자궁경부암 조직인 것인 방법.

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