EP1537144A1 - Verfahren zur identifizierung von inhibitoren in vivo - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von inhibitoren in vivo

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Publication number
EP1537144A1
EP1537144A1 EP03748011A EP03748011A EP1537144A1 EP 1537144 A1 EP1537144 A1 EP 1537144A1 EP 03748011 A EP03748011 A EP 03748011A EP 03748011 A EP03748011 A EP 03748011A EP 1537144 A1 EP1537144 A1 EP 1537144A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
lymphangiogenesis
tumor
vegf
inhibitors
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03748011A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jonathan Sleeman
Jaya Krishnan
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Original Assignee
Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Karlsruhe GmbH filed Critical Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Publication of EP1537144A1 publication Critical patent/EP1537144A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying inhibitors in vivo which slow down and / or inhibit the formation of metastases and / or tumor-induced lymphangiogenesis, and a selection system therefor and the use thereof.
  • angiogenesis In the adult body, the process of angiogenesis, the formation of new vessels, only plays a minor physiological role.
  • angiogenesis is critical to the spread of cancer in a mammalian body. For a malignant tumor to spread in the organism, it must first induce angiogenesis.
  • angiogenesis is used exclusively to describe the formation of new blood vessels.
  • Vascular formation also includes lymphangiogenesis, the formation of lymphatic vessels.
  • lymphangiogenesis the formation of lymphatic vessels.
  • Angiogenesis and lymphangiogenesis is the property that they are initiated and / or intensified by the tumor itself.
  • the cancer cells can penetrate the fine capillaries and reach other organs via the blood or lymph channels.
  • the increased entry of the tumors into the vessels is due to their increased
  • Dense vessels formed by angiogenesis and / or lymphangiogenesis This also paves the way for the dreaded spread of tumor cells: they can leave the primary tumor via the fine vessels and settle elsewhere as metastases.
  • the critical point in recording and describing tumor progression is the determination of the metastatic potential.
  • malignant cells can spread through the lymphatic vessels at least in the initial phase (J.SIeeman et al., In Recent Results Cancer Research, 157, 55-81, 2000). This spread is increased if the tumor can stimulate lymphangiogenesis.
  • Angiogenesis and lymphangiogenesis are induced by growth factors, which include, for example, vascular endothelial growth factors (VEGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factors
  • This receptor, VEGFR-3 is a tyrosine kinase receptor that regulates lymphangiogenesis and is activated by the two subtypes VEGF-C and VEGF-D. If a tumor can produce VEGF-C and / or VEGF-D, the distribution and thus spread of tumor cells through the lymph channels is significantly increased.
  • VEGFR-2 angiogenesis-regulating receptor VEGFR-2
  • This ability is based on a central, homologous domain of the two growth factors VEGF-C and VEGF-D.
  • Two groups of researchers managed to stop the spread of cancer in mice by blocking lymphangiogenesis in the tumor tissue. Both were able to block this process of lymphangiogenesis with antibodies against the two growth factors VEGF-C and VEGF-D and inhibit the growth of the tumors.
  • the animal models known from the prior art have the disadvantage that, owing to the lack of an immune system in nude and SCID mice, the tumor cannot interact with the immune system of the host organism. This differentiates tumor growth and metastasis from that in an immune-competent host body. Likewise, side effects that would normally be triggered by an immune response of the organism are not recorded in an organism with an immune deficiency. In this context, the term side effect is not only to be understood in the medical sense as an undesirable effect on a pharmaceutical, but also includes all other effects that differ from the initial state.
  • the object of the present invention is therefore to provide a simple, efficient method for identifying inhibitors of metastasis formation and / or tumor-induced lymphangiogenesis in vivo, which no longer has the disadvantages known from the prior art.
  • Lymphangiogenesis regulating cell receptor VEGFR-3 can be selected.
  • tumor-induced or tumor-related means that lymphangiogenesis is directly correlated and / or proportional to metastasis formation, or vice versa.
  • inhibitors are active ingredients which activate the
  • VEGFR-3 is activated by both VEGF-C and VEGF-D and the number of external parameters in the screening according to the invention should be as small as possible, a VEGF-C mutant according to Sequ. ID No. 1 used. Through a mutation at position 152, the exchange of cysteine for another amino acid, VEGF-C loses the ability to activate VEGFR-2 and thus becomes the specific growth factor for the receptor VEGFR-3 (V. Kirkin et al., Eur J. Biochem., 268, 5530-5540, 2001).
  • the genetically modified growth factor ⁇ N ⁇ C ⁇ / EGF-C / Cys152Ser can be expressed in cells which do not or have a weak tendency to form metastases. As a result, no "own" endogenous growth factors which induce lymphangiogenesis can be expressed by these cells.
  • the growth factor ⁇ N ⁇ C / VEGF-C / Cys152Ser in NM-081, 1-AS, G, BDX-2, CREF, CREF-WT, CREF-WT-T24 cells be expressed. As is clear from FIG.
  • the cell lines mentioned above are suitable for expression of growth factors inducing angiogenesis and / or lymphangiogenesis, since they endogenously express neither VEGF-C nor VEGF-D.
  • the growth factor ⁇ N ⁇ C / VEGF-C / Cys152Ser can be expressed in NM-081 cells.
  • Immune-competent, syngenetic rats or mice are preferably used as animal models.
  • Wistar Furth rats (NM-081), BDX rats (AS cells), Copenhagen rats (G cells) and / or F344 rats (CREF cells) are particularly preferably used.
  • the simple and clear decision about the effect of the screened inhibitors is an advantage of the method according to the invention, in which the metastasis formation and / or the tumor-related lymphangiogenesis can be determined as a criterion. That means that only the criterion, in other words the "final" parameter, is examined, which is ultimately of decisive importance for the selection of new active substances.
  • tumor-induced lymphangiogenesis in the animal model can be determined with the aid of a dye that specifically stains the lymphatic vessels.
  • the dye Evan's Blue can preferably be used in the animal model.
  • the lymphatic vessels can also be detected using immunohistochemical methods, using specific markers for lymphatic endothelial cells such as LYVE-1, VEGFR-3 or Prox-1.
  • Another advantage of the invention is that only the specific activation of VEGFR-3 is determined as the primary parameter. This minimizes the number of factors that could falsify the result, such as the activation of VEGFR-2 and thus induction of angiogenesis.
  • An additional advantage of the present invention is the use of cells which do not or have a weak tendency to form metastases, in which the growth factor ⁇ N ⁇ C ⁇ EGF-C / Cys152Ser can be expressed. Stable expression should preferably take place. External factors that would falsify a result, such as the expression of competing growth factors, can thus be eliminated.
  • immunocompetent animals in the present invention is also of particular advantage. On the one hand, a falsification of results can be reduced to a minimum, since the tumor progression corresponds to that of tumors not intentionally induced, on the other hand, all reactions of the organism, such as side effects on the active substances used in the screening, can be immediately detected.
  • the present invention further provides a system for screening inhibitors for their property of inhibiting or preventing metastasis and tumor-induced lymphangiogenesis, consisting of an immunocompetent animal model with cells which have no or poor tendency to form metastases and which have stable ⁇ N ⁇ C VEGF- C / Cys152Ser, according to Sequ. ID No. Express 1.
  • This system and the method according to the invention are suitable for the investigation of antibodies, agonists, competitive and non-competitive antagonists.
  • the method is also suitable for examining all classes of substances for their properties to block lymphangiogenesis, block the entry of tumors into lymphatic vessels and thereby suppress metastasis.
  • the advantages are based on screening in a closed system, namely in an immunocompetent animal model.
  • the tumor progression and / or lymphangiogenesis is determined on the basis of the administration of an inhibitor which, according to the invention, prevents the activation of the receptor VEGFR-3. This means that the focus is on capturing the final parameter, the end result. In other words, whether tumor progression and / or lymphangiogenesis can be determined - yes or no.
  • other parameters that can influence different intermediate stages are not important. For example, according to the invention it is not relevant how the inhibitor acts, whether as an antibody, agonist or antagonist or on the basis of which Intermediate stages lead to blocking of tumor progression and / or lymphangiogenesis. This eliminates possible disruptions or falsifications of the result.
  • FIG. 3 An example of the determination of lymphangiogenesis is shown in FIG. 3.
  • the method according to the invention is used to identify new inhibitors which slow down and / or inhibit the formation of metastases and / or tumor-induced lymphangiogenesis.
  • the inhibitors according to the invention have many of the following properties:
  • the cells were kept in culture according to SIeeman et al., Oncogene 18, 4485-4494, 1999.
  • the transfection was carried out using Tfx50 from Promega with an expression vector containing DNDC ⁇ EGF-C / Cys152Ser from the rat according to Sequ. ID No 1 in a pSecTag plasmid (Invitriogen) or with pSecTag alone.
  • the transfected cells were selected with hygromycin (300 ⁇ g / ml).
  • DNDCWEGF-C / Cys152Ser in the NM-081 cell was detected in a Western blot using cell lysates and a VEDF-C specific antibody 2634 (Kirkin et al.). An additional check was made by amplifying VEGF-C using RT-PCR. For further experiments those two clones with the highest üNDC / VEGF-C / Cys152Ser expression according to Werstem blotting were used. Clones which were transfected only with the pSecTag plasmid served as control.
  • RNA was prepared from frozen material, cells and tumor (Hofmann et al., J. Cell. Sei. 111, 1673-1684, 1998).
  • the Northern blots were carried out using 1% agarose-formaldehyde gel and 50 ⁇ g polyadenylated RNA as described in Hofmann et al. described.
  • the blots were examined with high stringency, using VEGF-C (GenBank accessiom no. AF010302), VEGF- D (GenBank accessiom no. AY032728) and GAPDH (PstI fragment of the plasmid pGAPDH).
  • the blots were drawn off in 0.1% SDS at 100 ° C. and exposed to a film in order to ensure the complete removal of the sample.
  • identical samples with RNA from BRL3A cells and mammalian tissue were added to each blot in order to achieve an equilibration of the signal intensity of all blots.
  • the cell samples (5x10 5 cells in PBS) were injected subcutaneously into Wistar Furth rats. The animals were examined regularly until the tumor growth reached the legal upper limit. They either died beforehand or were killed. An autopsy was then performed to determine the number and size of the tumors and metastases in the lymph nodes and other organs.
  • Tumor cells (1x10 6 ) were injected into the skin between the inguinal and axillary lymph nodes. After the tumors reached 0.5-2.0 cm in size, the animals were sacrificed and the tumors were exposed under the skin.
  • the dye 2.5 mg / ml Evan's Blue in PBS
  • the injection of dye was continued until all the lymphatic vessels between the groin and armpit area were marked were, even those that did not penetrate the tumor. Then those lymphatic vessels that penetrated the tumor were counted
  • Fig. 3 A: Determination of the lymphangiogenesis by staining the lymphatic vessels with the dye Evan's Blue in Wistar Furth rats which received NM-081 cells with ⁇ N ⁇ C7VEGF-C / Cys152Ser under the control of pSecTag (VEGF-S Cys # 1, VEGF-C Cys # 2 ) were injected.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren in vivo, welche die Metastasenbildung und/oder die tumorinduzierte Lymphangiogenese verlangsamen und/oder hemmen, dadurch gekennzeichnet, daß die Inhibitoren bezüglich ihrer Wirkung auf die spezifische Aktivierung in vivo des die Lymphangiogenese regulierenden Zellrezeptors VEGFR-3 selektioniert werden.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren in vivo
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren in vivo, welche die Metastasenbildung und/oder die tumorinduzierte Lymphangiogenese verlangsamen und/oder hemmen, sowie ein Selektionssystem hierfür und dessen Verwendung.
Im erwachsenen Körper spielt der Prozeß der Angiogenese, der Gefäßneubildung, nur noch eine geringe physiologische Rolle. Für die Ausbreitung von Krebs in einem Säugerkörper ist die Angiogenese jedoch von entscheidender Bedeutung. Für eine Verbreitung eines malignen Tumors im Organismus muß dieser zunächst die Angiogenese induzieren.
Im folgenden wird der Begriff der "Angiogenese" ausschließlich zur Beschreibung der Blut efäßneubildung verwendet.
Zu der Gefäßneubildung gehört auch die Lymphangiogenese, die Bildung von Lymphgefäßen. Diese stand jedoch, betreffend die Forschung, lange
Zeit im Schatten der Angiogenese. Gemeinsam der Gefäßneubildung,
Angiogenese und Lymphangiogenese, ist die Eigenschaft, daß sie durch den Tumor selbst initiiert und/oder verstärkt werden.
Aufgrund der vom Tumor induzierten wachstumsfördernden Faktoren bilden sich neue Gefäße, Blut- und Lymphgefäße, in der Peripherie der
Tumore. Die Krebszellen können in die feinen Kapillaren eindringen und so über die Blut- oder Lymphbahnen in andere Organe gelangen. Der verstärkte Eintritt der Tumore in die Gefäße beruht auf deren erhöhter
Dichte durch die Angiogenese und/oder Lymphangiogenese gebildeten Gefäße. Damit ist auch der gefürchteten Streuung der Tumorzellen der Weg geebnet: über die feinen Gefäße können sie den Primärtumor verlassen und sich andernorts als Metastasen ansiedeln.
Demgemäß ist der kritische Punkt in einer Erfassung und Beschreibung der Tumorprogression die Bestimmung des metastatischen Potentials. Interessant für die klinische Anwendung ist die Tatsache, daß sich maligne Zellen zumindest in der Anfangsphase über die Lymphgefäße verbreiten können (J.SIeeman et al., in Recent Results Cancer Research, 157, 55-81 , 2000). Diese Verbreitung wird verstärkt wenn der Tumor die Lymphangiogenese stimulieren kann.
Die Angiogenese und die Lymphangiogenese werden durch Wachstumsfaktoren induziert, zu denen zum Beispiel auch die vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF, vascular endothelial growth factor) gehören. Zwei Subtypen der VEGF-Familie, VEGF-C und VEGF-D, binden einen Rezeptor, der fast ausschließlich auf Lymphendothelzellen vorkommt. Dieser Rezeptor, VEGFR-3, ist ein Tyrosin-Kinase-Rezeptor welcher die Lymphangiogenese reguliert und wird von den beiden Subtypen VEGF-C und VEGF-D aktiviert. Wenn ein Tumor VEGF-C und/oder VEGF-D produzieren kann, ist die Verteilung und somit Verbreitung von Tumorzellen durch die Lymphbahnen wesentlich erhöht.
Beide können unter Umständen allerdings auch den die Angiogenese regulierenden Rezeptor VEGFR-2 aktivieren (V. Kirkin et al., in Eur. J. Biochem., 268, 5530-5540, 2001). Diese Fähigkeit beruht auf einer zentralen, homologen Domäne der beiden Wachstumsfaktoren VEGF-C und VEGF-D. Zwei Forschergruppen ist es gelungen, die Ausbreitung von Krebs bei Mäusen zu stoppen, indem sie im Tumorgewebe die Lymphangiogenese blockierten. Beide konnten mit Antikörpern gegen die beiden Wachstumsfaktoren VEGF-C und VEGF-D diesen Prozess Lymphangiogenese blockieren und das Wachstum der Tumore hemmen. Stacker et al. beschreibt in einer Publikation (Nat Med, 7, 186-189, 2001) die Hemmung sowohl des Wachstums als auch der Ausbreitung der Tumore in immuninkompetenten Nacktmäusen (SCID-Mäuse) durch Behandlung mit Antikörper der das VEGF-D-Molekül blockiert. Den Nacktmäusen wurden Tumorzellen gespritzt, die eine erhöhte Menge des Wachstumsfaktor VEGF-D freisetzten. Dadurch entwickelten sich Geschwülste aus den VEGF-D-Zellen, die deutlich mehr Lymphgefäße als die Tumoren in einer Vergleichsgruppe aufwiesen. Ein anderes Team, Skobe et al., zeigen in einem in Nature Medicine, 7, 192-198, 2001 , veröffentlichten Beitrag, daß in einem zu Stacker et al. analogen Verfahren die Lymphangiogenese in Nacktmäusen sich durch die Gabe eines Antikörpers für VEGF-C stoppen lässt. Des weiteren wurde auch von Yanyi et al. (J Exp Clin Cancer Res, 20, 419-28,2001), Karpanen et al. ( Cancer Research, 61, 1786-1790, 2001) und von Mattila et al. (Int J Cancer, 98, 946-51 ,2002) der Zusammenhang zwischen der Aktivierung von VEGFR-3 durch VEGF-C und der Lymphangiogenese in immuninkompetenten Nacktmäusen nachgewiesen.
Bisher wurden lediglich von Mandriota et al. (EMBO Journal, 20, 672-682. 2001) ähnliche Experimente im Tiermodell bei Mäusen ohne Immundefizienz durchgeführt. Dabei wurden doppelt transgene Mäuse verwendet, eine Kreuzung aus transgenen Mäusen, die VEGF-C in •- Zellen des endokrinen Pankreas unter der Kontrolle des Ratten-Insulin- Promotors (Rip) exprimieren und transgenen Rip1Tag2-Mäusen, die von •- Zelllen ausgehende Pankreastumore entwickeln.
Bisher wurden allerdings sehr wenige Medikamente zugelassen, oder ist nur von wenigen bekannt, daß eine klinische Prüfung zur Zeit durchgeführt wird. Von den darin enthaltenen Wirkstoffen wurden die meisten nur zufällig gefunden und identifiziert. Ein Großteil davon sind bekannte, im Körper anzutreffende Proteine. Ein Nachteil ist allerdings, daß sie diese Substanzen aufgrund ihres natürliche Vorkommens auch eine Vielzahl anderer Funktionen im Organismus erfüllen.
Um Wirkstoffe für eine effiziente Hemmung der Metastasenbildung und/oder der tumorinduzierten Lymphangiogenesis zu finden ist ein Verfahren zur Identifiziereung solcher Stoffe in vivo notwendig. Ein Tiermodell könnte das Screening einer großen Anzahl von möglichen Verbindungen auf ihre Eignung erlauben und dabei gleichzeitig die Erfassung eventueller Nebenwirkungen ermöglichen.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Tiermodelle haben jedoch den Nachteil, daß aufgrund des fehlenden Immunsystems in Nackt- und SCID- Mäusen keine Wechselwirkung des Tumors mit dem Immunsystem des Wirtorganismus stattfinden kann. Damit unterscheidet sich das Tumorwachstum und die Metastasierung von jenem in einem immunkompetenten Wirtskörper. Ebenso werden in einem Organismus mit einer Immundefizienz Nebenwirkungen, die normalerweise durch eine Immunantwort des Organismus ausgelöst wären, nicht erfaßt. In diesem Zusammenhang ist der Begriff Nebenwirkung nicht nur in medizinischem Sinne, als unerwünschte Wirkung auf ein Pharmakon zu verstehen, sondern beinhaltet auch alle anderen Wirkungen die von dem Ausgangszustand abweichen.
Andere aus dem Stand der Technik bekannten Tiermodelle bieten lediglich die Möglichkeit zu einem sehr aufwendigen Screening-Verfahren, bei dem zum Beispiel doppelt trangene Tieren aus Kreuzungen eingesetzt werden müssen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein einfaches, effizientes Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der Metastasenbildung und/oder der tumorinduzierten Lymphangiogenese in vivo zur Verfügung zu stellen, das die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile nicht mehr aufweist.
Um eindeutige und sofort verwendbare Ergebnisse zu erzielen, muß mit einem solchen Verfahren einerseits möglichst wenige primäre Parameter zeitgleich untersucht werden können und andererseits darf es nur von einer minimalen Anzahl äußerer Faktoren abhängig sein.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Inhibitoren bezüglich ihrer Wirkung auf die spezifische Aktivierung in vivo des die
Lymphangiogenese regulierenden Zellrezeptors VEGFR-3 selektioniert werden.
Tumorinduziert oder tumorbedingt bedeutet im Sinne der Erfindung, daß die Lymphangiogenese unmittelbar mit der Metastasenbildung korreliert und/oder proportional ist, beziehungsweise umgekehrt. Erfindungsgemäß sind Inhibitoren Wirkstoffe, welche die Aktivierung des die
Lymphangiogenese regulierenden Zellrezeptors VEGFR-3 verhindern. Da VEGFR-3 sowohl von VEGF-C als auch von VEGF-D aktiviert wird und die Zahl der äußeren Parameter bei dem erfindungsgemäßen Screening möglichst klein sein soll, wird eine VEGF-C Mutante gemäß Sequ. ID No. 1 eingesetzt. Durch eine Mutation an Position 152, den Austausch von Cystein gegen eine andere Aminosäure, verliert VEGF-C die Fähigkeit zur Aktivierung von VEGFR-2 und wird so zum spezifischen Wachstumsfaktor für den Rezeptor VEGFR-3 (V. Kirkin et al., in Eur. J. Biochem., 268, 5530-5540, 2001). Somit werden erfindungsgemäß vorzugsweise die Stoffe bezüglich ihrer Wirkung auf die Hemmung der spezifischen Aktivierung in vivo des die Lymphangiogenese regulierenden Zellrezeptoren VEGFR-3 durch den gentechnisch veränderten Wachstumsfaktor ΔNΔCΛ EGF-C/Cys152Ser, gemäß Sequ. ID No. 1 , untersucht werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann der gentechnisch veränderte Wachstumsfaktor ΔNΔCΛ/EGF-C/Cys152Ser in nicht oder schwach zur Bildung von Metastasen neigenden Zellen exprimiert werden. Dadurch können von diesen Zellen keine "eigenen", endogenen, die Lymphangiogenese induzierenden Wachstumsfaktoren exprimiert werden. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung kann der Wachstumsfaktor ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser in NM-081-, 1-AS-, G-, BDX-2-, CREF-, CREF- WT-, CREF-WT-T24-Zellen exprimiert werden. Wie aus Fig. 1 deutlich wird, eignen sich die oben genannten Zellinien für eine Expression die Angiogenese und/oder Lymphangiogenese induzierender Wachstumsfaktoren, da sie endogen weder VEGF-C noch VEGF-D exprimieren. In einer besonders bevorzugten Ausführung der Erfindung kann der Wachstumsfaktor ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser in NM-081 -Zellen exprimiert werden. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die in vivo Untersuchungen in einem immunkompententen, syngenetischen Tiermodell durchgeführt werden kann. Durch das intakte Immunsystem der Tiere findet eine .normale' Wechselwirkung des Tumors mit dem Immunsystem statt. Damit ist eine Tumorprogression gewährleistet, die der Entwicklung der natürlichen, also nicht absichtlich induzierten Tumoren entspricht. Bevorzugt werden als Tiermodell immunkompentente, syngenetische Ratten oder Mäuse eingesetzt. Besonders bevorzugt werden Wistar Furth Ratten (NM-081), BDX-Ratten (AS-Zellen), Kopenhagen Ratten (G-Zellen) und/oder F344 Ratten (CREF-Zellen) eingesetzt.
Ferner ist die einfache und eindeutige Entscheidung über die Wirkung der gescreenten Inhibitoren ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, in dem als Kriterium die Metastasenbildung und/oder die tumorbedingte Lymphangiogenese bestimmt werden kann. Das heißt, es wird lediglich das Kriterium, mit anderen Worten der .finale' Parameter, untersucht, das letztlich für die Auswahl neuer Wirkstoffe von entscheidender Bedeutung ist.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die tumorinduzierte Lymphangiogenese im Tiermodell mit Hilfe eines spezifisch die Lymphgefäße färbenden Farbstoffs bestimmt werden. Dafür kann bevorzugt im Tiermodell der Farbstoffs Evan's Blue eingesetzt werden. Alternativ dazu können die Lymphgefäße auch mit Hilfe immunhistochemischer Verfahren nachgewiesen werden, mittels spezifischer Marker für lymphatische Endothelzellen wie zum Beispiel LYVE-1 , VEGFR-3 oder Prox-1. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, daß als primärer Parameter lediglich die spezifische Aktivierung von VEGFR-3 bestimmt wird. So wird die Anzahl der Faktoren die das Ergebnis verfälschen könnten, wie zum Beispiel die Aktivierung von VEGFR-2 und damit Induktion der Angiogenese, minimiert.
Ein zusätzlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung nicht oder schwach zur Bildung von Metastasen neigenden Zellen, in denen der Wachstumsfaktor ΔNΔCΛ EGF-C/Cys152Ser exprimiert werden kann. Bevorzugt sollte eine stabile Expression erfolgen. So können äußere Faktoren, die ein Ergebnis verfälschen würden, wie die Expression konkurrierender Wachstumsfaktoren, ausgeschaltet werden.
Von besonderem Vorteil ist auch der Einsatz immnunkompetenter Tiere in der vorliegenden Erfindung. Einerseits kann dadurch eine Ergebnisverfälschung auf ein Minimum reduziert werden, da die Tumorprogression jener von nicht absichtlich induzierten Tumoren entspricht, andererseits können alle Reaktionen des Organismus, wie zum Beispiel Nebenwirkungen auf die beim Screening eingesetzten Wirkstoffe, sofort erfaßt werden.
Eine Verfälschung der Ergebnisse wird auch dadurch vermieden, daß als Kriterium lediglich die für die Auswahl von Wirkstoffen entscheidenden finalen Parameter, nämlich die Metastasenbildung und/oder die tumorinduzierte Lymphangiogenese bestimmt werden.
Die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse beweisen, daß die oben genannte Aufgabe durch das erfindungsgemäße Verfahren erfüllt wird, das die beschriebenen Vorteile aufweist. Wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren sind weniger die einzelnen, oben genannten Komponenten des Systems sondern der gesamte Aufbau, also die Kombination der Komponenten, da nur so unverfälschte Ergebnisse gewährleistet werden. Demgemäß ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein System zum Screening von Inhibitoren auf ihre Eigenschaft, die Metastase und tumorinduzierte Lymphangiogenese zu hemmen oder zu verhindern, bestehend aus einem immunkompetenten Tiermodell mit nicht oder schwach zur Bildung von Metastasen neigenden Zellen, die stabil ΔNΔC VEGF-C/Cys152Ser, gemäß Sequ. ID No. 1 exprimieren.
Dieses System und das erfindungsgemäße Verfahren sind zur Untersuchung von Antikörper, Agonisten, kompetitiven und nichtkompetitiven Antagonisten geeignet. Ebenso ist das Verfahren zur Untersuchung sämtlicher Stoffklassen auf ihre Eigenschaft zur Blockierung der Lymphangiogenesis, Blockierung des Eintritts von Tumoren in Lymphgefäße und dadurch Unterdrückung der Metastase, geeignet.
Die Vorteile basieren auf dem Screening in einem geschlossenen System, nämlich in einem immunkompetenten Tiermodell. Ausgehend von der Verabreichung eines Inhibitors, der erfindungsgemäß die Aktivierung des Rezeptors VEGFR-3 verhindert, wird die Tumorprogression und/oder Lymphangiogenese bestimmt. Somit erfolgt eine Konzentration auf die Erfassung des finalen Parameters, des Endergebnisses. Mit anderen Worten, ob Tumorprogression und/oder Lymphangiogenese festzustellen ist- ja oder nein. Dagegen sind weitere Parameter, die einen Einfluß auf verschiedene Zwischenstufen haben können, nicht von Bedeutung. Zum Beispiel ist erfindungsgemäß nicht relevant wie der Inhibitor wirkt, ob als Antikörper, Agonisten oder Antagonisten oder aufgrund welcher Zwischenstufen es zu einer Blockierung der Tumorprogression und/oder Lymphangiogenese komt. Dadurch werden mögliche Störungen oder Verfälschungen des Ergebnisses ausgeschaltet.
Ein Beispiel für die Bestimmung der Lymphangiogenese ist in Fig. 3 dargestellt.
Demgemäß wird das erfindungsgemäße Verfahrens zur Identifizierung neuer Inhibitoren welche die Metastasenbildung und/oder die tumorinduzierte Lymphangiogenese verlangsamen und/oder hemmen verwendet.
Ferner kann es auch verwendet werden, um die Auswirkung von verschiedenen Inhibitoren gleichzeitig oder von Inhibitoren in Kombination mit anderen Wirkstoffen auf die Hemmung der Lymphangiogenese und/oder Metastasenbildung zu untersuchen.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren haben vielfältige
Anwendungsmöglichkeiten. Denkbar ist es beispielsweise, diese Inhibitoren zukünftig im Anschluß an eine herkömmliche Chemo- oder Strahlentherapie oder an einen chirurgische Eingriff einzusetzen. Eine langfristige Nachbehandlung mit solchen-lnhibitoren kann Tumorrückfällen oder Metastasen wirksam entgegenwirken. Auch eine Kombination von Inhibitoren mit niedrig dosierten Krebsmedikamenten wäre denkbar.
Eine Anwendung der erfindungsgemäßen Inhibitoren in Therapien ist besonders bei Behandlungen zu empfehlen, bei denen das Risiko eines klinischen, chirurgischen Eingriffs zu hoch ist oder zu hohe Kosten entstehen. Des weiteren ist ein solcher Einsatz auch bei Tumoren zu empfehlen, bei denen bezüglich des metastatischen Potentials ein großer Unsicherheitsfaktor besteht.
Beispiele:
1. Transfektion der NM-081 -Zellen:
Die Zellen wurden in Kultur gehalten gemäß SIeeman et al., Oncogene 18, 4485-4494, 1999. Die Transfektion wurde durchgeführt mittels Tfx50 von Promega mit einem Expressionsvektor enthaltend DNDCΛ EGF- C/Cys152Ser aus der Ratte gemäß Sequ. ID No 1 in einem pSecTag Plasmid (Invitriogen) oder mit pSecTag allein. Die transfizierten Zellen wurden mit Hygromycin (300 μg/ml) selektioniert. Die Expression von DNDCWEGF-C/Cys152Ser in den NM-081-Zelle wurde im Western Blot mittels Zellysaten und einem VEDF-C spezifischen Antikörper 2634 nachgewiesen (Kirkin et al.). Eine zusätzliche Überprüfung erfolgte durch die Amplifikation von VEGF-C mittels RT-PCR. Für weitere Experimente wurden jene zwei Klone mit der gemäß Werstem-Blotting größten üNDC/VEGF-C/Cys152Ser-Expression verwendet. Als Kontrolle dienten Klone die nur mit dem pSecTag Plasmid transfiziert wurden.
2. RNA-Präparation und Northern Blot
Das Zellgewebe wurde geerntet, in PBS gewaschen und tiefgefroren. Aus tiefgefrorenem Material, Zellen und Tumor, wurde polyadenylierte RNA präpariert (Hofmann et al., J. Cell. Sei. 111 , 1673-1684, 1998), Die Northern Blots wurden unter Verwendung von 1%-igem Agarose- Formaldehydgel und 50 μg polyadenylierte RNA durchgeführt, wie in Hofmann et al. beschrieben. Die Blots wurden unter hoher Stringenz untersucht, mittels VEGF-C (GenBank accessiom no. AF010302), VEGF- D (GenBank accessiom no. AY032728) und GAPDH (Pstl-Fragment des Plasmids pGAPDH). Zwischen den einzelnen Untersuchungen wurden die Blots in 0.1%-igem SDS bei 100°C abgezogen und einem Film exponiert um die komplette Entfernung der Probe zu sichern. Als Positiv-Kontrolle wurden identische Proben mit RNA aus BRL3A Zellen und Säugergewebe bei jedem Blot hinzugefügt, um eine Äqulibrierung der Signalintensität aller Blots zu erreichen.
3. in vivo Experimente:
Die Zellproben (5x105 Zellen in PBS) wurden Wistar Furth Ratten subkutan injiziert. Die Tiere wurden regelmäßig untersucht bis das Tumorwachstum die gesetzlich festgelegte Obergrenze erreichte. Entweder sie verstarben vorher oder sie wurden getötet. Anschließend wurde eine Autopsie durchgeführt und so die Anzahl und die Größe der Tumore und der Metastasen in den Lymphknoten und anderen Organen bestimmt.
4. Visualisierung der Lymphgefäße in vivo mit Evan 's Blue Farbstoff:
Tumorzellen (1x106) wurden Ratten in die Haut zwischen dem inguinalen und dem axillaren Lymphknoten injiziert. Nachdem die Tumore eine Größe von 0.5-2.0 cm erreichten, wurden die Tiere getötet und die Tumore unter der Haut freigelegt. Der Farbstoff (2.5 mg/ml Evan's Blue in PBS) wurden zur inguinalen Seite des Tumors hin an mehreren Stellen in die Haut injiziert (ca. 20-50 μl in einem Abstand von 1.5 cm vom Tumor entfernt). Die Injektion von Farbstoff wurde so lange fortgeführt bis alle Lymphgefäße zwischen der Leisten- und der Achselgegend markiert waren, auch jene die nicht in den Tumor eindringen. Anschließend wurden jene Lymphgefäße gezählt, die in den Tumor eindringen
Legende:
Fig. 1 :
Northern Blot Analyse der Expression von VEGF-C und VEGF-D verschiedener Rattentumor-Zellinien aus Gewebekultur. Als Kontrolle wird die Expression von GAPDH dargestellt ebenso die RNA Molekülmarker. Von allen Zellinien wird das metastatische Potential angegeben. Die Klassifizierung der Matastase erfolgt in Abhängigkeit der Tendenz zur spontanen Metastasierung wie folgt: - : keine Metastasen
+ : weniger als 25% der Tiere zeigen Metastasen ++ : 25-75% der Tiere zeigen Metastasen +++ : mehr als 75% der Tiere zeigen Metastasen N : keine Daten
Fig. 2:
Bestimmung des metastatischen Potential von Tumoren stammend von NM-081-Zellen stabil transfiziert mit pSecTag (clone #1, clone #2) im Vergleich zu stabil transfizierten von NM-081 -Zellen mit ΔNΔC/VEGF- C/Cys152Ser unter der Kontrolle von pSecTag (VEGF-S Cys #1 , VEGF-C Cys #2). Die Daten stellen Mittelwerte aus jeweils 8 Versuchstieren dar (n=8) und wurden gemäß Beispiel 3 gesammelt.
Fig. 3: A: Bestimmung der Lymphangiogenese durch Färbung der Lymphgefäße mit dem Farbstoff Evan's Blue bei Wistar Furth Ratten, denen NM-081- Zellen mit ΔNΔC7VEGF-C/Cys152Ser unter der Kontrolle von pSecTag (VEGF-S Cys #1, VEGF-C Cys #2) injiziert wurden.
B: Bestimmung der Lymphangiogenese durch Färbung der Lymphgefäße mit dem Farbstoff Evan's Blue bei Wistar Furth Ratten, denen NM-081- Zellen stabil transfiziert mit pSecTag (clone #1 , clone #2) injiziert wurden.
C: Vergleich der Anzahl der Lymphgefäße induziert durch die oben genannte Klone von NM-081 -Zellen.

Claims

Anspüche
1. Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren in vivo, welche die Metastasenbildung und/oder die tumorinduzierte Lymphangiogenese verlangsamen und/oder hemmen, dadurch gekennzeichnet, daß die Inhibitoren bezüglich ihrer Wirkung auf die spezifische Aktivierung in vivo des die Lymphangiogenese regulierenden Zellrezeptors VEGFR-3 selektioniert werden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inhibitoren mittels des gentechnisch veränderten Wachstumsfaktors
ΔNΔCΛ EGF-C/Cys152Ser, gemäß Sequ. ID No. 1 selektioniert werden.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der gentechnisch veränderte Wachstumsfaktor ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser in nicht oder schwach zur Bildung von Metastasen neigenden Zellen exprimiert wird.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der gentechnisch veränderte Wachstumsfaktor ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser in NM-081-Zellen exprimiert wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß als Kriterium die Metastasen und/oder die tumorbedingte Lymphangiogenese bestimmt wird
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die tumorbedingte Lymphangiogenese mit Hilfe eines spezifisch die Lymphgefäße färbender Farbstoff bestimmt wird.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die tumorbedingte Lymphangiogenese mit Hilfe des Farbstoffs Evann's Blue bestimmt wird.
8. System zur Identifizierung von Inhibitoren, welche die Metastase und/oder tumorinduzierte Lymphangiogenese verlangsamen und/oder hemmen umfassend nicht oder schwach zur Bildung von Metastasen neigende Zellen, die stabil ΔNΔC/VEGF-C/Cys152Ser, gemäß Sequ.
ID No. 1 exprimieren.
9. Verwendung des Systems nach Anspruch 8 zur Identifizierung von Inhibitoren welche die Metastasenbildung und/oder die tumorinduzierte
Lymphangiogenese verlangsamen und/oder hemmen.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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TWI362940B (en) * 2005-03-31 2012-05-01 Gen Hospital Corp A use of agonist and/or antagonist of hgf/hgfr activity

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2002060950A2 (en) * 1994-11-14 2002-08-08 Ludwig Institute For Cancer Research Flt4(vegfr-3) as a target for tumor imaging and anti-tumor therapy
DE19652815C2 (de) * 1996-12-18 1999-11-11 Karlsruhe Forschzent Mittel zur Identifizierung und Therapie metastasierender Tumore
US20040265804A1 (en) * 2000-07-25 2004-12-30 Oliver Von Stein Method for identifying metastatic tumor cells
WO2002029087A2 (en) * 2000-10-02 2002-04-11 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Use of lymphangiogenic agents to treat lymphatic disorders

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