NO173336B - Fremgangsmaate til isolering av basalmembranproteiner fra human- eller animalvev og anvendelse av det oppnaadde protein - Google Patents

Fremgangsmaate til isolering av basalmembranproteiner fra human- eller animalvev og anvendelse av det oppnaadde protein Download PDF

Info

Publication number
NO173336B
NO173336B NO88881111A NO881111A NO173336B NO 173336 B NO173336 B NO 173336B NO 88881111 A NO88881111 A NO 88881111A NO 881111 A NO881111 A NO 881111A NO 173336 B NO173336 B NO 173336B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
basement membrane
membrane proteins
human
proteins
tissue
Prior art date
Application number
NO88881111A
Other languages
English (en)
Other versions
NO881111L (no
NO173336C (no
NO881111D0 (no
Inventor
Dietrich Brocks
Rubert Timpl
Mats Paulsson
Original Assignee
Hoechst Ag
Max Planck Gesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag, Max Planck Gesellschaft filed Critical Hoechst Ag
Publication of NO881111D0 publication Critical patent/NO881111D0/no
Publication of NO881111L publication Critical patent/NO881111L/no
Publication of NO173336B publication Critical patent/NO173336B/no
Publication of NO173336C publication Critical patent/NO173336C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S261/00—Gas and liquid contact apparatus
    • Y10S261/88—Aroma dispensers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/82—Subcellular parts of microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/961—Chemistry: molecular biology and microbiology including a step of forming, releasing, or exposing the antigen or forming the hapten-immunogenic carrier complex or the antigen per se
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • External Artificial Organs (AREA)
  • Shaping By String And By Release Of Stress In Plastics And The Like (AREA)
  • Tires In General (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Basalmembranproteiner isoleres fra menneskelig eller dyrisk vev i vandig oppløsning i nærvær av en chelat-danner som funksjonsegnede proteiner i relativt store mengder. Ved hjelp av disse proteiner kan det fremstilles høyspesifike antistoffer som anvendes til immunologisk bestemmelse av disse proteiner.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for isolering av basalmembranproteiner fra human- eller animalvev.
Oppfinnelsen angår også anvendelsen av de oppnådde proteiner.
Laminin, nidogen og BM40 er glykoproteiner, som tilskrives en nøkkelrolle i organisasjonen av basalmembraner og ved vekselvirkning av celler med basalmembraner [Paulsson, M. et al. "Eur. J. Biochem." 161, 455-464 (1986), R. Timpl. M. Dziadek, "Int. Rev. Exp. Pathol." 29, 1-112 (1986)]. Således understøtter laminin utvekst av neuritter fra neuronene av perifere nerver [Edgar D. et al., "EMBO" J. 3, 1463-1467
(1984)] og deres regenerasjon in situ [Madison et al. "Exp. Neurol." 88, 767-772 (1985)].
En bred anvendelse av disse proteiner hindres hittil frem for alt ved at det ikke står noen egnede fremgangsmåter til disposisjon, hvormed disse proteiner kan isoleres på skånende måte fra humant vev. Den av Risteli og Timpl ["Biochem. J." 193, 749-755 (1981)] omtalte fremgangsmåte behandler isoler-ingen av det proteaseresistente lamininfragment Pl fra humanplasenta. Dette fragment inneholder ikke mere enn for vekselvirkning med nerver og tumorceller viktige Domen 8. Ved hjelp av den av Timpl et al. ["J. Biol. Chem." 254, 9933-9937 (1979)] omtalte fremgangsmåte til fremstilling av laminin fra tumorvev kan fra humanplasenta ikke solubiliseres noe laminin og fra tumorvev får man ifølge denne fremgangsmåte bare små utbytter.
Ifølge von Ohno et al. ["Biochem. Biophys. Res. Com." 112, 1091-1098 (1983)] og Wewer et al. ["J. Biol. Chem." 258, 12654-12660 (1983)] omtalte fremgangsmåte krever man enten denaturerte betingelser eller proteolyse for å ekstrahere signifikante mengder av laminin eller laminin-bruddstykker fra vevet. Også nidogen eller BM40 kan hittil bare isoleres under denaturerende betingelser [Dziadek et al., "Eur. J. Biochem." 161, 455-464 (1985), Paulsson et al., "Eur. J. Biochem." 156, 467-478 (1986)].
Med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er nå mulig å over-vinne disse ulemper og på skånende måte å isolere biologisk aktivt material. Overraskende kan man fra vandig oppløsning i nærvær av en gelatdanner ekstrahere intakte basalmembranproteiner og også i større mengder enn tidligere mulig.
Foreliggende oppfinnels angår således en fremgangsmåte for isolering av basalmembranproteiner fra human- eller animalvev, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at
a) det gjennomføres en forekstrasjon av det basalmembran-holdige vev med en buffer som bibeholder den naturlige
konformasjon til basalmembranproteiner samt proteaseinhibitorer; og b) det gjennomføres en ekstrahering, under tilsetning av 1 til 500 mM chelatdannende polysyrer, av basalmembranproteinene fra human- eller animalvev ved hjelp av en buffer som bibeholder den naturlige konformasjon av basalmembranproteiner samt proteaseinhibitorer og chelatdannere.
Oppfinnelsen angår også anvendelsen av de ved denne fremgangsmåte oppnådde basalmembranproteiner til fremstilling av høyspesifikke antisera eller antistoffer og dermed til bestemmelse av basalmembranproteiner i kroppsvæsker og vevekstrakter.
I det følgende forklares oppfinnelsen detaljert, spesielt i de fortrukkede utførelsesformer. Videre defineres oppfinnelsen i patentkravene.
Ved hjelp av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan alle humane eller animalsk vevtyper, hvori det befinner seg basalmembranproteiner, for eksempel humanplasenta, humant eller animalsk tumorvev eller nyrene, ekstraheres. Det kan i første rekke gjennomføres en forekstrahering. Vev må induseres i en for basalmembranproteiner fysiologisk buffer i nærvær av proteaseinhibitorer og sentrifugeres. Under behandling fjernes oppløslige proteiner fortrinnsvis lett, for eksempel serumproteiner og cytoplasmatiske proteiner av vevet. Vevresten opptas så igjen i en fysiologisk buffer og homogeniseres og ekstraheres i nærvær av proteaseinhibitorer og chelatdannende stoffer. Egnede chelatdannere er organiske polysyrer som for eksempel EDTA, EGTA og citrat. Ekstraher-ingen gjennomføres under tilsetning av 1-500 mmol av chelatdanneren, fortrinnsvis 10-50 mmol, hensiktsmessig under avkjøling ved 0-15°C, fortrinnsvis 4-10°C. Ved høyere temperatur er en ekstrahering også ennå mulig, den følges imidlertid da av forstyrrende avbygningsreaksjoner. Ekstraktene inneholder de ønskede basalmembranproteiner. Spesielt foretrukket isoleres ifølge oppfinnelsen BM40, nidogen og laminin, delvis som ikke-kovalent kompleks.
De enkelte proteiner ekstraheres fra ekstraktet ved moleky-lar siktkromatograf i på egnede søyler som dekstran, spesielt allyldekstran, kryssbundet med N,N'-metylenbisacrylamid eller agarose. Finrensningen av basalmembranproteinet foregår, alt efter proteinet, på fortrinnsvis svak basiske ionebyttere med efterfølgende molekylsiktkromatografi, respektivt ytterligere rensning på agarose- eller sepharose-søyler.
På denne måte kan det isoleres mengder av intakte basalmembranproteiner, som ikke oppnås med vanlig isoleringsfrem-gangsmåter.
De oppdelte rensede basalmembranproteiner kan da anvendes som antigen til fremstilling av høyspesifik antisera eller som antistoffer. Dette foregår på vanlig måte ved subkutan eller intramuskulær injeksjon på forsøksdyr, fortrinnsvis på kaniner. Hensiktsmessig arbeides det derved i nærvær av komplett Freund's adjuvans. Det kan anvendes de i disse tilfeller vanlige antigendoser. Den foretrukkede dose på kaniner er 0,5 til 1 mg pr. dyr. Det dannede antiserum fremstilles derefter på den for fagfolk kjente måte og kan anvendes som sådan. Det er også mulig, på forhånd å rense de i serumet tilstedeværende antistoffer. En foretrukket metode hertil er affinitetskromatografi.
Det med hjelp av de rensede basalmembranproteiner fremstilte høyspesifike antiserum muliggjør bestemmelsen av basalmembranproteiner i kroppsvæske, som for eksempel serum, urin etcetra og vevekstrakter under anvendelse av de i og for seg kjente immunologiske påvisningsmetoder.
Det kan ved disse bestemmelser anvendes såvel de kjente radio-immun-analyse-(RIA)-varianter som også enzym-immun-analyse-varianter og analoge fremgangsmåter.
Den for den immunologiske bestemmelse nødvendige markering av antigenet kan foregå på for proteinmarkering kjente metoder. Det blir fortrinnsvis radioaktiv-, enzym- eller fluorescens-markert. I tilfelle den radioaktive markering anvendes som radionuklid fortrinnsvis jod 125. Markeringen kan deretter foregå etter den kjente kloramin T-metoden ("Int. Arch. Allergy" 429, 185, 1966).
Ved disse påvisningsreaksjoner konkurrerer det markerte basalmembranprotein på kjent måte om antistoffet, således at i det dannede antigen-antistoffkompleks er mengden av markert antigen desto mindre, jo mere markerte antigener som er inneholdt i prøven som skal bestemmes. Det kan enten anvendes markering av komplekser, for eksempel radioaktivi-teten eller enzymaktiviteten eller markering av det overstå-ende efter adskillelse av antigen-antistoffkomplekset, for ved hjelp av en vurderingskurve, som ble oppstilt ved hjelp av prøver er kjent innhold av basalmembranprotein, å fastslå den inneholdte mengde antigen i prøven som skal undersøkes. Fortrinnsvis bestemmes markering i kompleks.
En foretrukket utførelsesform av metoden ifølge oppfinnelsen består i, å gjennomføre separeringen med det spesifike antiserum dannede antigen-antistoff-komplekset ved hjelp av et annet antistoff. Fortrinnsvis anvendes dertil et mot Immunglobulin G av den for fremstilling av det spesifikke antiserum anvendte dyretyper rettet antistoff. Separeringen av antigen-antistoff-komplekset fra oppløsningen kan foregå ved vanlige metoder som felling, sentrifugering eller frafiltrering. Alternativt bindes antiserumet respektivt det andre antistoff på en fast bærer. Efter separering av antigen-antistoff-komplekset bestemmes da den i komplekset inneholdte respektivt den i oppløsning gjenblivende radioak-tivitet eller annen markering.
Enzym-immun-analyse-variantene til bestemmelse av basalmembranprotein kan også gjennomføres således at antistoffet mot immunglobulin G av den angjeldende dyretype, for eksempel av kaniner, er enzymmarkert. Ved denne type av enzym-immun-analyse bestemmes den efter dannelse av antigen-antistoff-komplekset gjenblivende del av anti-basalmembranproteinseru-met, idet man binder disse til bærerbundne basalmembranprotein og derefter bringer det hele til reaksjon med enzymmark-erte antistoffer mot immunglobulin G av kaniner. Mengden av bundet enzymmarkert antistoff bestemmes derefter ved måling av enzymreaksjonen og er indirekte proporsjonalt den ukjente mengde av basalmembranproteinet i prøven.
Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av noen eksempler.
Eksempel 1
Isolering av basalmembranproteinene laminin, nidogen og BM40.
EHS-tumorceller injiseres subkutant på C57Bl-mus [Orkin et al., "J. Exp. Med." 145, 204 (1977 )]. Efter 10-14 dager høstes tumoren og det derefter rensede vevmaterial lagres ved
-20° C. 75 g av den frosne tumor ble homogenisert i 1
minutter i 1,5 liter 0,15 M NaCl, 0,05 M tris-HCl (pH 7,4)
(TBS) med 0,05 mM f enylmetansulf onylf luorid (PMSF) og N-etylmaleimid (NEM). Efter sentrifugering ved 8 000 omdrei-ninger pr. minutt i et tidsrom på 20 minutter plasseres supernatanten og resten homogeniseres igjen i 375 ml av den ovennevnte buffer under tilsetning av 10 mM EDTA og omrøres i 1 time i kjølerom. Ekstraktet som ble utvunnet efter sentrifugeringen, ble enten anvendt videre med en gang eller lagret ved -20°C. Utbytte og renhet av det ønskede produkt kan økes ytterligere hvis ekstraheringstrinnene blir gj entatt.
En alikvot mengde av TBS-EDTA-ekstraktet has over en agarose-(Biogel A5m) eller en sepharose Cl-6B-søyle (3 x 135 cm), som er ekvilibrert i TBS med 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF og 0,5 mM NEM. Derved kom det til oppspaltning i 3 til 4 fraksjone-ringsområder. Det først med utlukkelsesvolumene eluerte material inneholder laminin-nidogen-kompleks og fritt laminin, i følgende fraksjoner inneholdt fritt nidogen i intakt (MG 150 KD) og delvis nedbygget form (MG 130, 100 KD). Deretter eluerer BM 40.
Rensingen av laminin foregikk i første rekke på en svakt basisk ionebytter (DEAE cellulose) med 2 M urinstoff i 0,05 M Tris/HCl (pH 8,6) under tilsetning av proteaseinhibitorer. Det elueres ved hjelp av en lineær NaCl-gradient (0 til
0,04 M). Ved dette trinn fjernes forstyrrende forurensninger fra proteoglykan og nukleinsyrer. Laminin befris til slutt ved kromatografi på sepharose C1-4B i 2 M guanidinklorid (pH 7,4) for resterende nidogen og mindre proteiner.
Rensningen av nidogen foregår i første rekke på DEAE-cellulose og sepharose CI4-B som beskrevet ved laminin. Ytterligere rensningstrinn, hvis nødvendig, omfatter kromatografi på CM-cellulose med 2 M urinstoff 0,02 M Na-acetat (pE 4,8) og kryssbundet allyldekstran (sepharcryl S200) med 0,2 M NH4HCO3.
Den ytterligere rensing av BM 40 foregår likeledes på DEAE-cellulose med 2 M urinstoff 0,05 M tris (pH 8,6) ved eluering ved hjelp av en lineær NaCl-gradient (0-0,4 M NaCl). BM 40 eluerer ved 0,2-0,25 M NaCl og renses endelig efter konsen-trering over sepharcryl S200 med 0,2 M NH4HCO3.
Tabellen viser for eksempel, at med den skånende ekstrahering ekstraheres det mengder av intakt basalmembranproteiner, for eksempel EHS-tumor, som ikke kan oppnås ved de vanlige fremgangsmåter.
Eksempel 2
Fremstilling av det markerte antigen.
25 >jg av det ifølge eksempel 1 isolerte basalmembranprotein markeres med 0,5 mCi jod 125 efter kloramin T-metoden og ubundet jod fjernes ved dialyse eller gelfiltrering på en polyacrylamidgel (for eksempel "Biogel P2", Pharmacia Fine Chemicals Inc. ).
Eksempel 3
Gjennomføring av den immunologiske bestemmelse.
Alle de for den immunologiske bestemmelse nødvendige trinn gjennomføres i nærvær av 0,04$ av et ikke-ionisk detergens, for eksempel "Tween" 20, et polyetoksylert sorbitmonolaurat. Bindingskurver bestemmes med 1 ng markert, ifølge eksempel 1 isolerte basalmembranprotein. Konsentrasjonen av basalmembranprotein i en ukjent prøve av serum eller andre kroppsvæsker bestemmes i følgende inhibisjonsprøver.
En bestemt mengde av det spesifikke antistoff eller antiserum forinkuberes med den ukjente prøve i 16 timer ved 4°C og efter tilsetning av 1 ng markert antigen inkuberes det hele ytterligere i 8 timer ved 4°C. Derefter tilsettes et overskudd av antistoff mot kanin-immunoglobulin G, og efter ytterligere 16 timer ved 4°C, separeres det i immunkomplekset bundne antigen ved sentrifugering. Inhibisjonsaktiviteten av den ukjente prøve sammenlignes med aktiviteten av en standardkonsentrasjon av ikke-markert antigen.
Eksempel 4
Fremstilling av antiserumet.
Kaniner immuniseres med 0,5 til 1 mg fra det ifølge eksempel 1 isolerte basalmembranprotein pr. dyr, idet antigenoppløs-ningen, blandet med et likt volum komplett Freund's Adjuvans, injiseres subkutant eller intramuskulært. 4 uker efter den første injeksjon injiseres en tilsvarende mengde antigenopp-løsning blandet med komplett Freund's Adjuvans, subkutant eller intramuskulært. 4 til 8 uker efter den andre injeksjon tas blod og fra dette fås antiserum efter koagulering.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte til isolering av basalmembranproteiner fra human- eller animalvev, karakterisert ved at a) det gjennomføres en forekstrasjon av det basalmembran-holdige vev med en buffer som bibeholder den naturlige konformasjon til basalmembranproteiner samt proteaseinhibitorer; og b) det gjennomføres en ekstrahering, under tilsetning av 1 til 500 mM chelatdannende polysyrer, av basalmembranproteinene fra human- eller animalvev ved hjelp av en buffer som bibeholder den naturlige konformasjon av basalmembranproteiner samt proteaseinhibitorer og chelatdannere.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ekstraheres under tilsetning av EDTA eller EGTA.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det ekstraheres under tilsetning av 10 til 50 mM av chelatdannere.
4 . Anvendelse av det ifølge et eller flere av kravene 1 til 3 oppnådde basalmembranprotein til fremstilling av høyspesi-fikke antisera eller antistoffer og dermed til bestemmelse av basalmembranproteiner i kroppsvæsker og vevekstrakter.
NO881111A 1987-03-13 1988-03-11 Fremgangsm}te til isolering av basalmembranproteiner fra human- eller animalvev og anvendelse av det oppn}dde protein NO173336C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19873708198 DE3708198A1 (de) 1987-03-13 1987-03-13 Verfahren zur isolierung von basalmembranproteinen aus menschlichen und tierischen geweben

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO881111D0 NO881111D0 (no) 1988-03-11
NO881111L NO881111L (no) 1988-09-14
NO173336B true NO173336B (no) 1993-08-23
NO173336C NO173336C (no) 1993-12-01

Family

ID=6323001

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO881111A NO173336C (no) 1987-03-13 1988-03-11 Fremgangsm}te til isolering av basalmembranproteiner fra human- eller animalvev og anvendelse av det oppn}dde protein

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5147782A (no)
EP (1) EP0282018B1 (no)
JP (1) JP2532559B2 (no)
AT (1) ATE124706T1 (no)
DE (2) DE3708198A1 (no)
DK (1) DK173677B1 (no)
ES (1) ES2074983T3 (no)
FI (1) FI99114C (no)
IE (1) IE67563B1 (no)
NO (1) NO173336C (no)
PT (1) PT86944B (no)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5541076A (en) * 1988-12-12 1996-07-30 Bard Diagnostic Sciences, Inc. Methods for determining the invasiveness of a bladder tumor
US5512657A (en) * 1988-12-12 1996-04-30 Bainbridge Sciences, Inc. Detection of complexes which include basement membrane components as diagnostic of cancer and other diseases
CA2109088A1 (en) * 1991-04-26 1992-10-27 Emanuel Calenoff Methods to detect and treat diseases caused by bacterial allergens
NZ524868A (en) 2003-03-21 2005-09-30 Velvet Antler Res New Zealand Process for purifying low molecular weight proteins from tissue in situ
NZ526157A (en) * 2003-05-27 2006-01-27 Velvet Antler Res New Zealand Method for the extraction of deer antler and use of the extract therefrom
US20070190165A1 (en) * 2005-10-21 2007-08-16 Brey Eric M Tissue-specific basement membrane gels
WO2013162828A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Use of cpg oligonucleotides co-formulated with an antibiotic to accelarate wound healing

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2923583A1 (de) * 1979-06-11 1980-12-18 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur immunologischen bestimmung von basalmembranmaterial und hierfuer geeignete neue basalmembranfragmente
US4628027A (en) * 1982-05-19 1986-12-09 Molecular Engineering Associates, Ltd. Vitro diagnostic methods using monoclonal antibodies against connective tissue proteins
DE3511199A1 (de) * 1985-03-28 1986-10-02 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur immunologischen bestimmung von heparansulfat-proteoglykan, verfahren zur herstellung bzw. reinigung von dafuer geeignetem heparansulfat-proteoglykan aus basalmembran-haltigen geweben
JPH01155757A (ja) * 1987-12-11 1989-06-19 Nec Corp 可変不在転送解除方式

Also Published As

Publication number Publication date
DK135688A (da) 1988-09-14
EP0282018A3 (en) 1990-01-24
EP0282018A2 (de) 1988-09-14
NO881111L (no) 1988-09-14
PT86944B (pt) 1992-05-29
EP0282018B1 (de) 1995-07-05
JPS63243098A (ja) 1988-10-07
DK173677B1 (da) 2001-06-11
IE67563B1 (en) 1996-04-17
FI99114B (fi) 1997-06-30
JP2532559B2 (ja) 1996-09-11
FI881122A0 (fi) 1988-03-10
FI99114C (fi) 1997-10-10
IE880729L (en) 1988-09-13
NO173336C (no) 1993-12-01
US5147782A (en) 1992-09-15
FI881122A (fi) 1988-09-14
PT86944A (pt) 1988-04-01
DE3708198A1 (de) 1988-09-22
ES2074983T3 (es) 1995-10-01
NO881111D0 (no) 1988-03-11
DE3854096D1 (de) 1995-08-10
ATE124706T1 (de) 1995-07-15
DK135688D0 (da) 1988-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4340581A (en) Process for the immunological determination of basal membrane material and new basal membrane suitable therefor
Sharp et al. Characterization of the 1, 4-dihydropyridine receptor using subunit-specific polyclonal antibodies: Evidence for a 32,000-Da subunit
Coulter et al. Enzyme immunoassay for the rapid clinical identification of snake venom
US4312853A (en) Radioimmunological determination of procollagen (type III) and procollagen peptide (type III)
Marquardt et al. Isolation and immunological characterization of human glomerular basement membrane antigens
AU6834894A (en) Assay for cardiac troponin i
Wick et al. Characterization of antibodies to basement membrane (type IV) collagen in immunohistological studies
Langeland A Clinical and Immunological Study of Allergy to Hen's Egg White: II, Antigens in Hen's Egg White Studied by Crossed Immunoelectrophoresis (CIE)
Salabe et al. Radioimmunoassay for Human Antithyroglobulin Antibodies I. The Relationship Between Tanned Cell Haemagglutination and a Double Antibody Technique
Micklem et al. Analysis of C3-receptor activity on human B-lymphocytes and isolation of the complement receptor type 2 (CR2)
Gogolin-Ewens et al. Characterization of a sheep trophoblast-derived antigen first appearing at implantation
NO173336B (no) Fremgangsmaate til isolering av basalmembranproteiner fra human- eller animalvev og anvendelse av det oppnaadde protein
Campbell et al. Characterization of precursor and secreted forms of human angiotensinogen.
JP3245052B2 (ja) Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドに対する抗体およびそれを用いるアッセイ法
US4798800A (en) Process for isolating human globular domain NC1 of basal membrane collagen from human tissue
Von Schenck et al. Interference of immunoglobulins in two glucagon radioimmunoassays.
Bassett et al. STUDIES ON HUMAN ANTIBODIES: III. Amino Acid Composition of Four Antibodies from One Individual
Bowman et al. Novel urinary fragments from human basement membrane collagen.
Okamoto et al. Evidence in patients with systemic lupus erythematosus of the presence of antibodies against RNA-dependent DNA polymerase of baboon endogenous virus.
Dzau et al. Characterization of antibodies to canine renal renin. Studies of interspecies homology of renin using antibodies as probe.
Gilden et al. A technique for the elution of cell‐surface antibody from human brain tissue
Hunneyball et al. Fragmentation of human IgG by a new protease isolated from the basidiomycete Armillaria mellea.
Groth et al. Purification and characterisation of ovine C4: evidence for two molecular forms in ovine plasma
Lazarus et al. Immunochemical cross-reactivity between intact purified myelin basic protein (MBP) and the synthetic encephalitogenic peptide S49
JPS585661A (ja) 前立腺酸ホスフアタ−ゼアイソザイムの定量方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees

Free format text: LAPSED IN SEPTEMBER 2003