DE3586628T2

DE3586628T2 - In vitro-nachweis von gastrointestinalem krebs.

Info

Publication number: DE3586628T2
Application number: DE8585902944T
Authority: DE
Inventors: William Linnane
Original assignee: Mucan Diagnostics Pty Ltd
Current assignee: Viewheights Pty Ltd Melbourne Victoria Au
Priority date: 1984-06-25
Filing date: 1985-06-21
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2005-06-22
Also published as: DE3586628D1

Description

Diese Erfindung betrifft in erster Linie Verfahren und Systeme zur Diagnose von Muzinkrebs, insbesondere Krebs des Gastrointestinaltrakts sowie Krebs der Brust, Lunge, des Magens, des Eierstocks und dergleichen.
Die Sterblichkeit aufgrund von Krebs des Intestinaltrakts liegt an zweiter Stelle nur hinter dem Lungenkrebs bei Männern und dem Brustkrebs bei Frauen. Obwohl diesen Krankheiten viel Aufmerksamkeit geschenkt wurde, hat sich die Sterblichkeitsziffer in den letzten Jahren nicht signifikant verringert. Für das Auftreten einer Verbesserung in den Überlebenskurven ist ein früher Nachweis essentiell. Zu manchen Zeiten erzeugen Krebszellen Substanzen, die in gesunden Individuen nicht nachweisbar sind oder nur in sehr geringen Konzentrationen auftreten. Dieses Merkmal kann zur Entwicklung innovativer Diagnosetechniken verwendet werden. Tests, die auf den Nachweis dieser mit Krebs assoziierten Substanzen gerichtet sind, sind eine große Hilfe bei der Unterscheidung zwischen Individuen mit Krebs im Vergleich zu gesunden Individuen.
Das karzinoembryonale Antigen (CEA) ist das am ausführlichsten erforschte Antigen, das mit Gastrointestinalkrebs assoziiert ist, und es ist sogar das am meisten untersuchte aller Tumor-assoziierten Antigene. Dieses Antigen kommt im humanen fötalen Gastrointestinaltrakt vor, ist aber im normalen adulten Dickdarm nicht mehr oder nur in sehr geringen Konzentrationen vorhanden. CEA wurde zuerst in menschlichen Kolonkarzinomen von Gold und Freedman 1965 nachgewiesen&sup9;. CEA war im Blut solcher Krebspatienten vorhanden und wurde daher anfänglich als onkofötales Antigen angesehen, was große Hoffnungen für die Frühdiagnose von Krebs des menschlichen Verdauungssystems ergab. Anschließend wurde gezeigt, daß der Test auf CEA im Blut nicht spezifisch genug ist, um für die Frühdiagnose von Gastrointestinalkrebs von Wert zu sein, da es oft in einer Zahl von nicht-neoplastischen Krankheiten einschließlich Raucherbronchitis und Leberkrankheit erhöht ist¹&sup0;. Beispielsweise zeigen 10% der normalen Population falsch positive Ergebnisse in dem Sinne, daß diese Individuen erhöhte CEA-Konzentrationen im Blut aufweisen, obwohl sie nicht Krebs oder sogar benigne Tumoren haben. Zweitens ist CEA oft sogar in Patienten mit ziemlich großen Tumoren nicht nachweisbar¹¹&supmin;¹³, d. h. es gibt eine erhebliche falsch negative Rate (etwa 50% der Patienten mit Gastrointestinalkrebs zeigen keine erhöhten CEA-Konzentrationen im Blut). Trotz dieser Begrenzungen ist der CEA-Test noch von beträchtlichem Wert bei der voroperativen Einstufung und der nachoperativen Behandlung von Krebspatienten. CEA-Test stellen etwa 40% der gegenwärtigen Krebstests dar.
Alpha-Fetoprotein (AFP) ist ein weiteres onkofötales Antigen, das in hohen Konzentrationen im Fötus, aber nicht in normalen Erwachsenen auftritt. Erhöhte Blutkonzentrationen an AFP kommen in Patienten mit primärem Leberkrebs, sekundären Tumoren der Leber, dem Großteil von Fällen einiger Typen von Hodenkrebs (Teratom), aber auch bei toxischer Leberschädigung und Zirrhose. Trotz dieser offensichtlich begrenzten Nützlichkeit stellt AFP etwa 20% der gegenwärtigen durchgeführten Krebstests dar.
Vor kurzem wurden Radioimmuntests auf Basis monoklonaler Antikörper für die Messung des Tumor-assoziierten Antigens CA 19-9TM kommerziell erhältlich¹&sup4;&supmin;¹&sup9;. Dieser CA 19-9TM-Test soll eine hohe Sensitivität und Spezifität für alle Stadien von Pankreaskrebs besitzen, hinsichtlich des Nachweises von Kolorektalkrebs scheint dieser Test eine geringe Sensitivität aufzuweisen.
1980 wurde ein neues Muzinglykoproteinantigen aus einem Krebs des Dickdarms isoliert¹. Diese Substanz kommt auch in normalem adultem Dünndarm vor und wurde daher "Dünndarm-Muzinantigen" (SIMA) bezeichnet. Es wurde gezeigt, daß SIMA ein onkofötales Antigen ist, da man es beim 8 bis 12 Wochen alten Fötus im Gastrointestinaltrakt verteilt findet, es aber zum Zeitpunkt der Geburt unter normalen Umständen nirgendwo anders als im Dünndarm nachweisbar ist. SIMA tritt aber bei Krebs von vielen Teilen des Gastrointestinaltrakts und anderer Organe auf. Eine weitere Muzinsubstanz, die als "Dickdarm-Muzinantigen" (LIMA) bezeichnet wird, wurde ebenfalls aus normalem Dickdarm isoliert. Es wurde gezeigt, daß auch LIMA ein onkofötales Antigen ist und in unterschiedlichem Ausmaß von einer Reihe von Karzinomen erzeugt wird. Ausführliche immunhistologische Untersuchungen haben gezeigt, daß sich LIMA antigenisch von SIMA unterscheidet und beide ebenfalls von CEA verschieden sind. Diese Darm-assoziierten Muzinantigene wurden auch in manchen Tumoren des Magens, der Gallenblase, der Lunge, der Brust und des Eierstocks sowie in prämalignen Erkrankungen der oben genannten Organe nachgewiesen (Ref. 1 bis 8).
In Tabelle 1 sind Ergebnisse einer immunhistochemischen Anfärbung von normalen fötalen und adulten Geweben und Karzinomen verschiedener Organe unter Verwendung monoklonaler und polyklonaler Anti-SIMA- und Anti-LIMA-Antikörper gezeigt. Tabelle 1 Zusammenfassung der SIMA- und LIMA-Verteilung in humanen Geweben - immunhistochemische Untersuchungen Fötale Gewebe (8-40 Wochen) SIMA LIMA Magen Dünndarm Dickdarm 8-12 Wochen 13-40 Wochen Normale adulte Gewebe Magen Dünndarm Dickdarm Gallenblase Eierstock Brust Lungenkarzinom Karzinome Kolonkarzinom Magenkarzinom Eierstock-Karzinom Gallenblasenkarzinom Brustkarzinom Lunge
Es wurde jetzt zum erstenmal festgestellt, daß SIMA und LIMA trotz des hohen Molekulargewichts dieser Muzinglykoproteine im Blutserum eines hohen Anteils von Patienten mit Dickdarmkrebs durch Verwendung diagnostischer Antikörpertests nachgewiesen werden können. SIMA und LIMA treten in den Blutseren von gesunden Kontrollpersonen nicht in meßbaren Mengen oder in sehr geringen Mengen auf. Anfängliche Untersuchungen mit einer kleinen Gruppe von Fällen zeigen bereits, daß die Kombination von SIMA- und LIMA-Tests zum Nachweis von etwa 80 % von Patienten mit Kolorektalkrebs verwendet werden kann, während die Verwendung von CEA-Tests alleine nur etwa 56% solcher Karzinome entdeckt. Diese SIMA-und LIMA-Tests sind auch sensitiver als CEA-Tests beim Nachweis von Karzinomen der Stadien B und C (Duke's Klassifizierung). Weiterhin kann LIMA im Blut eines hohen Anteils von Patienten mit einer ulzerativen Kolitis des Dickdarms nachgewiesen werden. Solche Patienten entwickeln üblicherweise Dickdarmkrebs. Auf ähnliche Weise können SIMA und LIMA zum Nachweis des Vorhandenseins von vorkanzerösen Zuständen verwendet werden.
Wie in dieser Beschreibung verwendet, werden die Bezeichnungen SIMA und LIMA nicht nur eingesetzt, um die im folgenden ausführlicher beschriebenen Muzinantigene, sondern auch Teile davon, die damit antigenisch verwandt sind und die in physiologischen Fluids, insbesondere Blutserum oder Plasma vorkommen, zu bezeichnen.
Gemäß vorliegender Erfindung wird eine in vitro Diagnosemethode zum Nachweis des Vorkommens von Krebszellen oder anderer Muzinantigene erzeugender Zellen in einem Patienten bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt des Tests einer Probe eines physiologischen Fluids umfaßt, das aus dem Patienten entnommen wird, um darin die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Muzinantigens nachzuweisen, dadurch gekennzeichnet, daß eine dem Patienten entnommene Blut-, Blutserumoder Blutplasmaprobe auf das Vorhandensein von SIMA und/oder LIMA in der Probe getestet wird.
Vorzugsweise umfaßt das Verfahren die Schritte des Kontaktierens der dem Patienten entnommenen Probe mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen SIMA und/oder LIMA oder Fragmenten derartiger Antikörper oder Antikörpern oder Fragmenten davon, die mit einem zur Abgabe eines erkennbaren Signals fähigen Marker versehen sind, und des Nachweisens des Vorliegens der Bindung der Antikörper oder deren Fragmente oder der markierten Antikörper oder deren Fragmente an das entsprechende Antigen.
In noch einem anderen Gesichtspunkt wird ein in vitro Diagnosekit oder ein System zum Nachweis des Vorhandenseins von Krebszellen oder anderer Muzinantigene erzeugender Zellen in einem Patienten bereitgestellt, wobei der Kit oder das System monoklonale Antikörper oder Fragmente davon umfaßt, die zur Immunreaktion mit SIMA und/oder LIMA fähig sind, die in einer Blut-, Blutserum- oder Blutplasmaprobe enthalten sind, die dem Patienten entnommen worden ist, zusammen mit einem Indikatormittel zum Nachweis des Vorhandenseins einer Immunreaktion zwischen den Antikörpern oder deren Fragmenten und SIMA und/oder LIMA.
In einer besonderen Ausführungsform dieses Gesichtspunkts der Erfindung enthält das diagnostische System weiterhin eine Komponente, die an einen festen Träger gekoppelt ist, wobei die Komponente entweder (i) SIMA und/oder LIMA oder (ii) die zur Immunreaktion mit SIMA und/oder LIMA fähigen Antikörper enthält.
Dieser Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung umfaßt eine Anzahl von Ausführungsformen, die unterschiedliche Formen von Indikatormitteln verwenden. In einem Gesichtspunkt der Erfindung umfaßt das Indikatormittel einen Marker, der ein nachweisbares Signal liefern kann, wobei der Marker an die zur Immunreaktion mit SIMA und/oder LIMA fähigen Antikörper gebunden ist. In einem anderen Gesichtspunkt umfaßt das Indikatormittel jedoch einen Marker, der ein nachweisbares Signal liefern kann, wobei der Marker an sekundäre Antikörper gebunden ist, wobei die sekundären Antikörper gegen die zuerst genannten Antikörper erzeugt werden und das Auftreten der Immunreaktion durch Bindung an die zuerst genannten Antikörper zeigen. In einem weiteren Gesichtspunkt kann das Indikatormittel Staphylococcus Protein A einen daran gebundenen Marker umfassen. Die in jeder dieser Ausführungen verwendeten Marker können bekannte Enzyme, radioaktive Elemente, fluoreszierende Chemikalien oder Verbindungen wie etwa Biotin umfassen.
Die Verwendung von Immuntests auf SIMA und LIMA ermöglicht den Nachweis dieser Muzinantigene in allen Stadien des Kolorektalkrebses. Diese Ergebnisse demonstrieren daher, daß dieses System potentiell nützlicher und wertvoller als die oben diskutierten CA 19-9TM oder CEA-Tests ist.
Obwohl die vorliegende Erfindung in erster Linie auf den Nachweis von Muzinkarzinomen gerichtet ist, wird auch ersichtlich, daß die Immuntests auf SIMA und LIMA beim Nachweis von Entzündungskrankheiten wie ulzerativer Kolitis oder Magengeschwüren sowie beim Nachweis von präkanzerösen Zuständen nützlich sind.
Wie aus der obigen Beschreibung ersichtlich ist, können die hier bezeichneten Muzinantigene SIMA und LIMA zuerst durch die Quelle charakterisiert werden, aus der sie (unter Verwendung von im folgenden detailliert beschriebenen Methoden) isoliert werden. Eine weitere Charakterisierung und Identifizierung dieser Antigene kann durch Verwendung polyklonaler und monoklonaler Anti-SIMA- und Anti-LIMA-Antikörper und durch immunhistochemische Techniken unter Verwendung von z. B. "kompetitiven" Immunassaytechniken erfolgen, um Antigenaktivität durch Hemmung der Bindung von Anti-SIMA- oder Anti- LIMA-Antiseren an spezifische Gastrointestinalgewebe nachzuweisen.
Weitere Einzelheiten der vorliegenden Erfindung werden im folgenden diskutiert. Es ist jedoch anzumerken, daß Immuntests auf SIMA und/oder LIMA gemäß vorliegender Erfindung ein hochsensitives Diagnoseinstrument zum Nachweis von Krebszellen oder anderen Muzinantigen erzeugenden Zellen in einem Patienten bereitstellen, insbesondere bei der präoperativen Behandlung von Krebspatienten, um einen Hinweis über das Ausmaß der Tumorbelastung zu erhalten, und um einen Basiswert für die postoperative Nachtherapie von chirurgisch oder durch eine andere Methode (z. B. Radiotherapie, Chemotherapie) behandelten Patienten zu erhalten, um eine Wiedererkrankung in einem behandelbaren Stadium zu entdecken oder die Wirksamkeit der Behandlung zu überwachen. Bei solchen Anwendungsformen kann das Diagnosesystem gemäß vorliegender Erfindung anfänglich mit Immunotests auf CEA oder andere bekannte, Tumor-assoziierte Antigene kombiniert werden, die gegenwärtig in diesen Situationen verwendet werden. Weiterhin können die SIMA/LIMA (gegebenenfalls in Kombination mit CEA) Diagnosesysteme zur Musterung von Populationen mit hohem Risiko für das Auftreten von Intestinalkrebs verwendet werden, z. B. Patienten mit ulzerativer Kolitis oder Magengeschwüren, einem Bereich, wo nach anfänglichen Tests gefunden wurde, daß CEA- Diagnosesysteme alleine keinen diagnostischen Nutzen besitzen.
In den zur vorliegenden Erfindung führenden Arbeiten wurden unterschiedliche monoklonale Antikörper durch Immunisierung von Mäusen mit aus Dickdarmkrebs extrahierten Muzinpräparationen erzeugt. Die immunhistochemische Anfärbung von Geweben wurde zur Klassifizierung von 5 dieser monoklonalen Antikörper als Anti-SIMA (Reaktion mit Dickdarmkrebs und normalen Dünndarm) und 5 als Anti-LIMA (Reaktion mit Dickdarmkrebs und normalen Dickdarm) verwendet. Immunchemische Analysen zeigten, daß die Affinitäten der Antikörper in jeder Klasse um einen Faktor bis zu 100 variieren.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erzeugung und Charakterisierung von Muzinantigenen, gegenwärtig bei der Erzeugung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern gegen SIMA und LIMA verwendete Methoden und die Anwendung dieser monoklonalen Antikörper bei in vitro Diagnosemethoden gemäß vorliegender Erfindung zum Nachweis des Vorhandenseins von Krebs oder anderer Muzinantigen erzeugender Zellen in einem Patienten.

Beispiel 1

A. Reinigung und Charakterisierung von Muzinantigenen

Muzine wurden aus chirurgischen Proben extrahiert, die durch Exzision von Kolorektalkrebsgewebe erhalten wurden. Bereiche von normalem Dickdarm distal zum Tumor wurden aus Gewebe erhalten, das man mit den Tumoren entfernt hatte, und sie wurden durch Lichtmikroskopie zur Bestätigung ihres normalen Aussehens vor der Verwendung untersucht. Proben von normalem Zwölffingerdarm, Leerdarm und Dickdarm wurden auch bei einer Autopsie von Unfallopfern erhalten. Muzine wurden aus Proben von Kolonkrebs (LIMA und SIMA), normalem Dickdarm (LIMA) oder normalem Zwölffingerdarm oder Leerdarm (SIMA) durch die im folgenden erläuterten Prozeduren extrahiert.
Die für die Immunisierung von Mäusen zur Erzeugung monoklonaler Antikörper und Musterung verwendete Muzinpräparation wurde aus einer Krebsprobe hergestellt, die histologisch als "teilweise muzinöses" Adenokarzinom des Sigmoidkolon diagnostiziert wurde. Die Gewebeprobe (etwa 5 g) wurde in kleine Stücke geschnitten, dann in 10 Volumina 4M Guanidinhydrochlorid mit 24 mM EDTA, 10 mM N-Ethylmaleimid und 1 mM Benzamidin HCl homogenisiert. Nach einer Zentrifugation für 20 Minuten bei 20.000 g wurde das Pellet mit frischem Guanidinhydrochlorid reextrahiert. Das Muzin in den vereinigten Überständen wurde dann auf eine Dichte von 1,35 g/ml mit Caesiumchlorid eingestellt und für 64 Stunden bei 105.000 g zentrifugiert. Der resultierende Gradient wurde in 6 gleiche Fraktionen aufgeteilt, die in der Dichte von 1,25 bis 1,55 g/ml reichten. Jede Fraktion wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und auf Protein (modifizierter Bradford-Test) und Hexose 21, sowie auf Antigenaktivität durch Bestimmung ihrer Fähigkeit zur Hemmung einer spezifischen Immunfluoreszenzmarkierung von Gastrointestinalgeweben durch Anti-SIMA- und Anti-LIMA-Antikörper und durch Immuntests unter Verwendung monoklonaler Antikörper (siehe unten für Einzelheiten) getestet. Die die höchste Antigenaktivität enthaltende Fraktion wird erneut auf CsCl-Gradienten fraktioniert und die Fraktionen wie oben beschrieben getestet.

(i) LIMA

LIMA wurde in den 2 oder 3 Bodenfraktionen des Gradienten mit einer Dichte von 1,34 bis 1,55 g/ml gefunden. Die LIMA-Präparationen waren polydispers, sie wurden aber üblicherweise in der höchsten Antigenaktivität bei etwa 1,4 ± 0,08 gefunden. Die Antigenaktivität, der Hexose- und Proteingehalt jeder Fraktion einer typischen dritten CsCl-Gradientenzentrifugation einer LIMA-Präparation sind in Fig. 1a gezeigt. Die Hexose-/Proteinverhältnisse (Gewicht/Gewicht) für die Fraktionen 2 und 3 waren 0,5 bzw. 0,25. Die Peaks von Hexose, Protein und Antigenaktivität fielen nicht zusammen, Fraktion 3 enthielt den Großteil der Antigenaktivität. Die Gesamtausbeute von LIMA aus einem typischen Experiment, bestimmt durch Enzym-gekoppelte Immuntests (EIA) ist etwa 35% von dem, das in einem Gewebehomogenisat vorliegt. Die Gesamtreinigung von LIMA ist in der Größenordnung eines Faktors 1000. SIMA wird üblicherweise in LIMA-Präparationen aus normalem Dickdarm nicht gefunden. Die erfolgreiche Verwendung von LIMA-Präparationen bei Sandwich-Immuntests (wo der gleiche monoklonale Antikörper mehr als einmal an das Molekül binden muß) zeigt, daß die antigene Determinante, die durch die monoklonalen Antikörper erkannt wird, mindestens zweimal auf dem Molekül wiederholt werden muß.
Das hohe Molekulargewicht von LIMA wurde durch seine Unfähigkeit zum Eindringen in 7%-ige Polyacrylamid-Elektrophoresegele gezeigt. Weitere Untersuchungen unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie zeigten, daß das im Leervolumen von Sepharose 6B (die globuläre Proteine im ungefähren Molekulargewichtsbereich: 1·10&sup4; - 4·10&sup6; und Dextrane mit dem Molekulargewicht: 10&sup4; - 10&sup6; auftrennt - Spezifikationen im Katalog von Pharmacia) und Sepharose 2B (fraktioniert globuläre Proteine im Molekulargewichtsbereich 7·10&sup4; - 4·10&sup7; und Dextrane im Bereich: 10&sup5; - 2·10&sup7;) eluiert. Eine Gelchromatographie von LIMA auf einer Sephacryl 1000 Säule (1 cm ·65,5 cm), die in 10 mM Phosphat gepufferter Salzlösung eluiert wurde (trennt Dextrane im Molekulargewichtsbereich: 5 ·10&sup5; - 10&sup8; auf), ist in Fig. 2a gezeigt. Der Hauptanteil der LIMA-Antigenaktivität war in dieser Matrix enthalten und eluierte als breiter Peak, der auf die Polydispersität der LIMA-Präparation hinweisen mag. Einen ähnlichen Polydispersitätsgrad sieht man bei vielen anderen Proteoglykanmolekülen und er kann z. B. durch Variationen in der Struktur oder einer Aggregation hervorgerufen werden, die das Molekulargewicht, aber nicht die Antigenität solcher Moleküle beeinflussen.
Zur besseren Abschätzung der Größe von LIMA wurde eine Anzahl von Präparationen einer Ultrazentrifugation auf Glyceringradienten (10% bis 20%) unterworfen, um die Sedimentationskoeffizienten zu bestimmen (Beckman SW 50 Ti Rotor, 22.000 UPM · 15 h oder 42.000 UPM · 5 h bei 4ºC). Die Gradienten wurden fraktioniert und jede Fraktion wurde in einem Sandwich-Test auf Antigenaktivität getestet. Ein typischer LIMA Gradient ist in Fig. 3a gezeigt. Aus diesen und anderen Versuchen wurden gewichtete, gemittelte s-Werte gemäß der folgenden Gleichung bestimmt:
worin ω die Winkelgeschwindigkeit ist, t die Zentrifugationsdauer (Stunden) ist, Ro der Rotationsradius bis zur Spitze des Gradienten ist und Rt der gewichtete, gemittelte Radius ist, an den der Antigenitätspeak gewandert ist. Die aus mehreren unterschiedlichen Experimenten berechneten mittleren s-Werte waren 9,5 ± 1,5.
LIMA wurde einer Anzahl unterschiedlicher physikalischer, chemischer und enzymatischer Behandlungen unterworfen, um weitere Information über die Art des Antigens zu erhalten. Diese sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die Antigenität von LIMA in einem Sandwich-Test war gegenüber einer Lagerung von mindestens 1 Monat bei 40ºC oder für bis zu 5 Minuten bei 100ºC stabil. Ein Kochen für 10 Minuten oder länger bewirkte in einen 40%-igen Aktivitätsverlust. Diese Stabilität von LIMA gegenüber einem Kochen läßt vermuten, daß dieses Antigen ein stark glykosyliertes Molekül ist, und daß das Epitop ein Kohlehydrat umfaßt oder davon geschützt wird. Eine alkalische Behandlung von LIMA zur Spaltung O-glykosidischer Bindungen zwischen Kohlehydraten und Protein wurde bei unterschiedlichen Konzentrationen von KOH durchgeführt: 0,01 M, 0,05 M, 0,10 M, 0,25 M, 0,50 M (bei 4ºC für 2, 4 oder 16 h), wonach 85%, 70%, 70%, 55% bzw. 45% Antigenaktivität nach der Behandlung zurückblieben. Der Zusatz eines Nukleophils wie etwa 2-Mercaptoethanol (0,1 M) ermöglichte eine Durchführung der β-Eliminierungsreaktion unter milderen Bedingungen (0,01 M KOH bei 4ºC für 4 Stunden) mit einem resultierenden Verlust von 55% der Antigenaktivität. Zusätzlich zu dem aus der alkalischen Behandlung von LIMA resultierenden teilweisen Verlust der Antigenaktivität zeigte eine Analyse auf Glyceringradienten eine signifikante Verringerung beim gewichteten, gemittelten s-Wert (5,5), was auf ein verringertes Molekulargewicht hinweist (Fig. 3a). Eine versuchte Reduzierung von LIMA (in 6 M Guanidin HCl, 0,5 M Tris pH 8,1, 0,002 M EDTA, 10 mM Dithiotreitol bei 50ºC für 2 Stunden, 4 Stunden oder 16 Stunden, gefolgt von einer Alkylierung mit 0,4 M Jodessigsäure bei 4ºC über Nacht) hatte keine signifikante Wirkung auf die Antigenaktivität.
Zur Bestimmung der chemischen Natur des LIMA-Antigens wurden Spaltungsexperimente mit einer Anzahl hochgereinigter Enzyme durchgeführt. Nach Behandlung wurden die Proben für 5 Minuten gekocht oder neutralisiert (Pepsin), um die Enzyme vor dem Immuntest zu inaktivieren. Weder Pepsin noch Clostripain (bei unterschiedlichen Enzymkonzentrationen getestet, mit LIMA für 2, 4 oder 16 h inkubiert) zeigten eine signifikante Wirkung auf die Antigenaktivität von LIMA (Tabelle 2). Eine Spaltung von LIMA mit Papain (0,1 oder 1,0 mg/ml) bewirkte einen signifikanten Verlust von Antigenaktivität, wobei nur 20% Aktivität nach 2-, 4- oder 16-stündiger Spaltung bei Test in einem Sandwich-Test zurückblieben. Bei Test in einem kompetitiven ELISA (wo der Test nicht von der Multivalenz von Epitopen auf dem Antigen abhängig ist) war die nach 2-stündiger Spaltung mit Papain zurückbleibende Aktivität 75%, nach 4 Stunden 65% und 16 Stunden 35%. Dies läßt vermuten, daß unter den milden Bedingungen der Papain-Spaltung LIMA zu Fragmenten abgebaut wird, von denen die meisten nur ein Epitop besitzen und daher nicht in einem Sandwich-Test nachgewiesen werden, die aber in einem kompetitiven Test nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis zeigt, daß das Antigen ein Ausmaß an Empfindlichkeit gegen Papain hat, aber im wesentlichen gegen Pepsin und Clostripain beständig ist.

(ii) SIMA

SIMA wurde in 2 oder 3 Fraktionen des Gradienten mit einer Dichte zwischen 1,29 und 1,45 g/ml gefunden. Die SIMA-Präparationen waren polydispers, aber der Großteil an Antigenaktivität wurde üblicherweise bei einer Dichte von 1,38 ± 0,05 gefunden. Die Antigenaktivität, der Hexose- und Proteingehalt jeder Fraktion einer typischen dritten CsCl-Gradientenzentrifugation einer SIMA-Präparation sind in Fig. 1b gezeigt. Die Hexose-/Proteinverhältnisse (Gewicht/Gewicht) für die Fraktionen 3 und 4, in denen der Hauptteil der Antigenaktivität auftritt, waren 1,5 bzw. 0,3. Die Ausbeute von SIMA aus einer typischen Kolonkrebsprobe ist um 40%, wie durch EIA bestimmt wurde. Die durch diese Prozeduren erreichte Reinigung ist um etwa den Faktor 1000, ähnlich wie bei der Reinigung von LIMA. Es wurde gefunden, daß die meisten Kolorektalkrebsgewebe im beträchtlichen Ausmaß LIMA sowie SIMA enthalten, während Extrakte aus Proben von normalem Zwölffingerdarm und Leerdarm SIMA, aber kein nachweisbares LIMA enthielten. LIMA konnte aus "SIMA"-Präparationen, die aus einer Kolorektalkrebsprobe stammten, durch Leiten der gemischten Muzinextrakte über eine monoklonale Anti-LIMA-Antikörper-Affinitätssäule entfernt werden. Die Identifizierung von SIMA in der Präparation beruht auf der Reaktion mit monoklonalen Antikörpern und der Hemmung einer Immunfluoresenzmarkierung des Dünndarms durch polyklonale oder monoklonale Antikörper. Wie für LIMA beschrieben weist die Verwendung von SIMA in einem Sandwich- Immuntest auf das Vorhandensein eines wiederholten Epitops auf dem Antigenmolekül hin.
Wie im Falle von LIMA drang SIMA nicht in 7%-ige Polyacrylamid-Elektrophoresegele ein. Eine Analyse durch Gelfiltration auf einer Sepharose 2B Säule (1,5 cm·7 cm), eluiert in 25 mM Tris pH 8,0 mit 4 M Guanidin HCl, zeigte jedoch, daß SIMA im Gel enthalten und polydispers war, wobei es in einer Anzahl von Peaks eluierte (Fig. 4) und ein viel geringeres Molekulargewicht als LIMA besaß. SIMA wurde auch über eine Sephacryl 1000 Säule laufen gelassen und eluierte wiederum als breiter Peak mit einem viel geringeren Molekulargewicht als die LIMA-Gesamtpräparation (siehe Fig. 2a und b).
Die s-Werte wurden für eine Anzahl von SIMA-Präparationen in 10 bis 20%-igen Glyceringradienten wie oben für LIMA beschrieben, bestimmt. Ein typischer SIMA-Gradient ist in Fig. 3b gezeigt. Dies bedeutet, daß der aus einer Anzahl von Experimenten berechnete s-Wert 4,8 ± 1,4 war, was viel geringer als die Werte für LIMA ist.
Es wurde gefunden, daß SIMA gegenüber einer alkalischen Behandlung und Kochen stabiler als LIMA war. Es wurde keine signifikante Änderung in der Antigenaktivität beobachtet, wenn die oben für die alkalische Behandlung von LIMA beschriebenen Bedingungen verwendet wurden. Zusätzlich wurde die SIMA-Antigenaktivität nicht nennenswert durch Kochen für 5 Minuten beeinflußt und nach einem Kochen für 10 Minuten gingen nur 6% der Aktivität verloren (siehe Tabelle 2).
SIMA wurde mit einer Anzahl hochgereinigter Enzyme wie oben für LIMA beschrieben, gespalten (Tabelle 2). Clostripain hatte keine Wirkung auf die Antigenaktivität von SIMA, wie in einem Sandwich EIA getestet wurde. Eine Spaltung von SIMA mit Papain für 2 Stunden hatte keine Wirkung, während 50% der Antigenaktivität nach einer 16-stündigen Spaltung verlorengingen. Eine Pepsinspaltung von SIMA resultierte in einem 70 %-igen Verlust an Antigenaktivität, was im Kontrast zu LIMA steht, das gegen Pepsin resistent war (10 ug/ml Pepsin bei Raumtemperatur über Nacht). Tabelle 2 Wirkungen verschiedener Abbauprozeduren auf Muzinantigene Behandlung Prozent zurückbleibende Aktivität nach der Behandlung LIMA SIMA Kochen (10 min) alkalische Behandlung Pepsinspaltung Papainspaltung 2 h Papainspaltung 16 h Clostripainspaltung Disulfidreduzierung nicht durchgeführt
In die Muzinreinigungsprozedur können eine Anzahl von Verfeinerungen wie folgt eingeführt werden:
1. Behandlung mit Perchlorsäure (1 M) und Natriumacetat und Erhitzen bei 70ºC oder Kochen für 5 Minuten kann ebenfalls zur Anreicherung der Reinheit der Muzinpräparationen verwendet werden.
2. Es wurde gezeigt, daß eine wiederholte CsCl Gradienten-Ultrazentrifugation die Reinheit der Muzinpräparation merkbar (bis zu 10-fach) verbessert.
3. Die Affinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern kann auf zwei Arten verwendet werden: Erstens z. B. durch Verwendung von monoklonalen Anti-LIMA zur Entfernung von LIMA aus einer SIMA-Präparation (und umgekehrt) und zweitens durch Verwendung einer Adsorption und Elution von Muzin (SIMA) auf monoklonalen Anti-SIMA, um SIMA von anderen kontaminierenden Proteinen zu reinigen.
4. Muzinantigene können auch durch die Verwendung von Lectinsäulen, Gelelektrophorese, Ionenaustauscheroder Gelfiltrationschromatographie aus normalen oder Krebsgeweben gereinigt werden.
Die verschiedenen Schritte bei der Reinigung von Muzinpräparationen werden durch kompetitive Immunhistochemie und EIA unter Verwendung polyklonaler und monoklonaler Antikörpertests zur Bestimmung der SIMA- und LIMA-Zusammensetzung der Präparationen verfolgt.

B. Erzeugung polyklonaler Antiseren

Das in diesen Untersuchungen verwendete polyklonale Anti- SIMA-Antiserum war dasjenige, das von Ma et al (1980)¹ in Kaninchen erzeugt worden war. Ein polyklonales Antiserum, das LIMA erkennt, wurde nach ähnlichen Techniken, umfassend die Immunisierung von Kaninchen mit Muzinpräparationen erzeugt, die nach Ma et al (1980)¹ aus normalen Dickdarm extrahiert worden waren. Diese Art von Antiseren wurde anfänglich zur Verfolgung der Muzin-Reinigungsschritte verwendet, obwohl sie relativ unspezifisch und kreuzreagierend war. Aus hochgereinigtem SIMA und LIMA hergestellte polyklonale Antiseren können bei im folgenden beschriebenen "zweiseitigen" Sandwich-Immuntests verwendet werden.

C. Herstellung von monoklonalen Antikörpern

Immunisierungsvorschrift:

Weibliche, etwa 8 Wochen alte Balb/C-Mäuse wurden mit etwa 50 ug einer teilweise gereinigten Krebs-Muzinpräparation in 4 subkutanen und einer intraperitonealen Injektion, zuerst in vollständigem Freund'schen Adjuvans, und anschließend etwa 4 Wochen später mit einer ähnlichen Serie von Injektionen in unvollständigem Adjuvans immunisiert. Etwa 12 Tage nach der zweiten Immunisierung wurde den Mäusen über die Schwanzvene Blut entnommen, und die Antikörpertiter im Serum wurden durch ELISA bestimmt. Drei Wochen nach der zweiten Immunisierung wurde den Mäusen mit hohen Serumtitern Auffrischungsinjektionen durch intraperitoneale Injektionen von 10 ug einer Krebs-Muzinpräparation in PBS an vier aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht, am fünften Tag folgte die Tötung der Tiere, Entfernung der Milz und eine übliche Zellfusion mit Maus-Myelom-Linien.

Zellfusion, Hybridomzüchtung, Klonierung:

Eine Milz-Zellsuspension wurde aus der Milz einer immunisierten Maus durch vorsichtiges Rühren in einer physiologischen Phosphatpufferlösung (GKN) hergestellt. 10&sup8; Milzzellen wurden mit 5·10&sup7; Myelomzellen [X63 Ag 8.6.5.3] (bezogen von T. Stahelin, Hoffman LaRoche, Basel, Schweiz) gemäß der Standardprozedur fusioniert. Milzzellen und Myelomzellen wurden in 50%-igem PEG-4000 (GC Qualität) vermischt, das langsam über 60 Sekunden zugegeben wurde. Nach Stehenlassen für 90 Sekunden wurden die in PEG suspendierten Zellen langsam mit 7 ml GKN-Lösung (über 5 Minuten zugegeben) verdünnt und anschließend in RPMI 1640 Medium mit 10%- fötalem Kälberserum, Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin auf etwa 300 ml verdünnt. Die verdünnte Zellsuspension wurde dann in 288 Löcher von 24 Loch-Mehrfachplatten mit 10&sup5; peritonealen Makrophagen pro Loch verteilt. Das Medium wurde nach etwa 7 Tagen und danach wie gemäß dem Zellwachstum erforderlich, gewechselt.
Nach einer Musterung durch EIA wurden die Antikörper gegen Muzine sekretierenden Hybridome zweimal durch limitierende Verdünnung in Mikrotiterplatten mit peritonealen Makrophagen kloniert. Zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern in großem Maßstab wurden die Antikörper-sekretierenden Hybridome als Ascitestumoren in 8 bis 12 Wochen alten Mäusen kultiviert, die 1 bis 7 Tage zuvor mit 0,5 ml intraperitoneal injiziertem Pristan vorbereitet worden waren. Ascitesflüssigkeit wurde 2 bis 4 Wochen nach Injektion der Zellen gesammelt und bei -20ºC aufbewahrt. Aus der Ascitesflüssigkeit wurden Immunglobuline, je nach Erfordernis, durch Protein A-Sepharose-Affinitätschromatographie gereinigt.

Hybridommusterung

(i) EIA

Löcher von Polystyrol-Mikrotiterplatten wurden mit einer Krebsmuzin-Rohpräparation (10 ug/ml) in HCO&sub3;&supmin;/CO&sub3;« Puffer pH 9,6) für 3 Stunden bei 37ºC beschichtet. Die Löcher wurden dann viermal in PBS/Tween gewaschen. Die Überstände der Hybridomkultur wurden 1 Stunde lang in den Löchern inkubiert, dann viermal mit PBS/Tween gewaschen. Anschließend wurden die Löcher mit alkalischer Phosphatase-gekoppeltem Schaf-Anti-Maus-Immunglobulin inkubiert. Nach Waschen mit PBS/Tween und anschließend mit destilliertem Wasser wurde p-Nitrophenylphosphat als Substrat zugesetzt und positive Löcher (die auf Überstände mit Antikörpern gegen Muzine hinwiesen) wurden als diejenigen identifiziert, die das gelbe Produkt p-Nitrophenol enthielten.

(ii) Fluoreszenz-Immunhistochemie

"Positive" Hybridome, die beim EIA durch die Musterung in der ersten Runde identifiziert wurden, wurden anschließend durch Immunofluoreszenztechniken auf die Fähigkeit der erzeugten monoklonalen Antikörper zur Markierung spezifischer Zellen oder Gewebe in histologischen Schnitten normaler und kanzeröser Gastrointestinalorgane getestet. Die Überstände der Hybridomkulturen wurden auf Gewebeschnitten auf Objektträgern inkubiert. Nach Blockierung spezifischer Bindungsstellen mit einer Rinderserumalbuminlösung wurden die Gewebe mit Fluorescein-konjugiertem Kaninchen-Anti- Maus-Immunglobulin inkubiert. Überschüssiger markierter Antikörper wurde durch Waschen entfernt, und der Gewebeschnitt wurde durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von UV oder einer Anregung mit Blau in einem engen Bandbereich untersucht.
Unter Verwendung der obigen Techniken wurden 5 monoklonale Anti-SIMA-Antikörper (die mit normalen Dünndarmmuzin und Kolorektalkrebs-Muzin reagierten) und 5 monoklonale Anti- LIMA-Antikörper (die mit normalem Dickdarm und Kolorektalkrebsmuzinen reagierten) identifiziert.

Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern

Die Subklasse der Antikörper wurde unter Verwendung von Enzym-gekoppelten Anti-IgG und Anti-IgM-Antikörpern (CSL) bestimmt. Es wurde gefunden, daß alle monoklonalen Antikörper zur IgG-Subklasse gehörten.
Zur vollständigen Charakterisierung der monoklonalen Antikörper wurden ihre relativen Affinitäten durch zwei Methoden bestimmt. Zuerst wurde gereinigtes IgG für jeden monoklonalen Antikörper durch Protein A-Sepharose-Affinitätschromatographie gewonnen. Dann wurde das gereinigte IgG durch EIA titriert und die Titrationskurven (Reaktion beim EIA gegenüber der Proteinkonzentration) als Maß der relativen Affinitäten der Antikörper verglichen. Zweitens wurde ein kompetitiver EIA entwickelt (siehe unten). Die relativen Affinitätskonstanten wurden unter Verwendung einer SIMA-Präparation als Inhibitor bei den monoklonalen Anti-SIMA-Antikörpern und einer LIMA-Präparation als Inhibitor für die monoklonalen Anti-LIMA-Antikörper berechnet. Die Berechnung der relativen Affinitätskonstanten erfolgte auf Basis der folgenden Gleichung:
Bei der Konzentration an Antigen (Muzin), die eine 50%-ige Hemmung in einem kompetitiven EIA ergibt, wäre die Konzentration von freiem und gebundenem Antikörper gleich, d. h. [Ab] = [AbAg]. Daher ist die relative Affinitätskonstante Ka = 1/[Ag]. Die auf diesen Berechnungen basierenden Daten sind in Tabelle 3 gezeigt. Da die wirklichen Antigenkonzentrationen geringer sein können (wenn die Präparationen nicht 100 %-ig rein und andere kontaminierende Proteine vorhanden sind), sind die Werte für Ka Minimalwerte und können tatsächlich höher liegen. Tabelle 3 Antikörper relative Affinitätskonstante (l/mol) monoklonale Anti-SIMA monoklonale Anti-LIMA
Die Methode von Friguet et al (1983)²&sup0; wurde zur Bestimmung verwendet, ob einerseits alle monoklonalen Anti-SIMA und andererseits alle monoklonalen Anti-LIMA an dieselben Antigendeterminanten auf den SIMA- bzw. LIMA-Molekülen binden. Unter Verwendung limitierender Antigenmengen als Plattenbeschichtung werden alle Antikörper einzeln und in allen möglichen Paaren titriert. Es wurde gefunden, daß alle bei den gegenwärtigen Experimenten erzeugten monoklonalen Antikörper an dieselben oder an überlappende antigene Determinanten auf dem Molekül binden.

Beispiel 2 In vitro diagnostische Immuntests

Zwei zum Nachweis von zirkulierendem Muzin in Blutproben entwickelte Immuntests werden im folgenden erläutert:

A. Kompetitiver ELISA

(i) Die bei diesem Test erfolgenden Schritte sind in Fig. 5 veranschaulicht. Vorversuche zeigten, daß das heparinisiertem oder EDTA-behandeltem oder unbehandeltem Blut zugesetzte Muzin in verdünntem Plasma oder Serum vollständig rückgewonnen und quantifiziert werden konnte. Unverdünntes Plasma oder Serum, das beim Immuntest zugesetzt wurde, verursachte eine Störung, obwohl keine Wirkung auf Tests (siehe wäßrige Puffer) unter Verwendung von 1 : 10 verdünntem Plasma beobachtet wurde. Eine Serie von Blutproben aus Patienten mit Kolorektalkrebs, Patienten mit ulzerativer Kolitis und gesunden Kontrollpersonen wurde daher unter Verwendung eines kompetitiven ELISA auf SIMA und LIMA getestet. Plasma aus gesunden Individuen, das zugesetztes SIMA oder LIMA enthielt, wurde als Standard verwendet. Hohe Konzentrationen an SIMA und/oder LIMA wurden in 13/23 (etwa 60%) der Patienten mit verschiedenen Stadien von Kolorektalkrebs nachgewiesen und hohe Konzentrationen an LIMA (aber nicht SIMA) wurden in 4/5 Fällen von ulzerativer Kolitis nachgewiesen. Weder SIMA noch LIMA wurde in Blutproben aus 7 gesunden Kontrollpersonen nach dieser Methode nachgewiesen.
(ii) Um zu bestimmen, ob Muzin bei geringeren Konzentrationen nachweisbar war, wurde eine Methode zur Extraktion und Konzentrierung von Muzin aus Plasmaproben entwickelt. Serum- oder Plasmaproben wurde ein gleiches Volumen an 2 M Perchlorsäure (PCA) für 15 Minuten bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Proben wurden 2 Minuten lang bei 8000 g zentrifugiert, die Überstände entfernt und die Pellets zweimal im ursprünglichen Probenvolumen an PBS gewaschen, vermischt und wie zuvor zentrifugiert. Den vereinigten Überständen wurde PBS bis zu einem 10-fachen Endvolumen des ursprünglichen Probenvolumens zugesetzt. Anschließend wurden die Proben in Minicon B15 Konzentratoren (MW-Ausschluß 15.000, Amicon Co.) 10-fach konzentriert/dialysiert. Dann wurden die Proben auf das 10-fache ursprüngliche Probenvolumen verdünnt und 50-fach konzentriert. Der resultierende PCA-Extrakt war 1/5 des ursprünglichen Probenvolumens. Diese Probe wurde anschließend wie zuvor beschrieben durch einen kompetitiven ELISA getestet. Plasmaproben aus gesunden Freiwilligen mit unterschiedlichen Konzentrationen an zugesetztem und durch die obige Prozedur mitgeführtem Muzin wurden als Standards verwendet. Die Ergebnisse für SIMA-Tests von Proben aus 39 Patienten mit Kolorektalkrebs, 2 Patienten mit Brustkrebs, 5 Patienten mit ulzerativer Kolitis und 7 Kontrollpersonen zeigte, daß SIMA- Antigenaktivität bei manchen Kontrollpatienten in geringen Konzentrationen und bei allen, bis auf 2 der Krebspatienten in höheren Konzentrationen nachweisbar war. 60% der Proben aus Patienten mit Kolorektalkrebs des Stadiums B (definiert als solche Karzinome mit keiner offenkundigen Ausbreitung in andere Organe), 91 % des Stadiums C (definiert als solche Karzinome mit nachweisbaren Metastasen in lokalen Lymphknoten) und 86% des Stadiums D (disseminierter Krebs mit Ausbreitung zu entfernten Organen wie etwa der Leber) enthielten im Vergleich mit dem Kontrollbereich erhöhte Muzinkonzentrationen. SIMA wurde ebenfalls in einer Blutprobe nachgewiesen, die von einem Patienten mit Kolorektalkrebs im Stadium A und 2 Patienten mit Brustkrebs erhalten wurde.
LIMA-Tests sind nur mit verdünnten Serumproben, ohne die bei den SIMA-Tests verwendeten Konzentrierungs/Dialyseschritte durchgeführt worden. Nur ein geringer Anteil von Patienten mit frühen Stadien von Kolorektalkrebs enthielt nachweisbares LIMA - 11% im Stadium B, 29% im Stadium C, aber ein hoher Anteil (67%) von Krebspatienten im Stadium D hatte erhöhte LIMA-Serumkonzentrationen. Ein sehr hoher Anteil (80%) von Patienten mit ulzerativer Kolitis zeigte sogar bei diesem relativ unempfindlichen Test hohe Konzentrationen an zirkulierendem LIMA. So könnte dieser LIMA- Test beim Nachweis von Entzündungskrankheiten im Dickdarm von Nutzen sein.

B. Sandwich-Immuntest

Die oben beschriebenen monoklonalen Antikörper können ebenfalls in einem Sandwich-Immuntest verwendet werden.
Diese Art von Test weist eine Anzahl von Vorteilen bei der Verbesserung der Sensitivität des Test auf und umfaßt weiterhin weniger Schritte als der oben beschriebene kompetitive Inhibierungstest. Überdies ist das "Signal" in einem Sandwich-Immuntest (z. B. unter Verwendung von Radioaktivität oder einer Enzym-markierten Antikörperfarbe im Loch) direkt mit der Muzinantigenkonzentration proportional, was eine Berechnung und Verwertung der Ergebnisse gegenüber einem kompetitiven Inhibierungstest stark vereinfacht.
Der Test umfaßt eine feste, mit dem monoklonalen Antikörper beschichtete Oberfläche, um das Muzinmolekül zu immobilisieren, und den gleichen (mit ¹²&sup5;I oder einem Enzym) markierten monoklonalen Antikörper, um das Vorhandensein von an den Beschichtungsantikörper gebundenem Muzin nachzuweisen (siehe Fig. 6).

a. Einzelheiten eines SIMA- oder LIMA-Radioimmuntests (RIA) (Fig. 6)

1. Löcher von HA-Millititerplatten (Millipore Corporation, USA) werden mit Protein A-gereinigtem monoklonalen Antikörper IgG (etwa 10 ug/ml), verdünnt in Beschichtungspuffer (Natriumcarbonat/Bicarbonat- Puffer pH 9,6, 50 ul pro Loch), beschichtet. Die Platten werden für 3 bis 5 Stunden bei 37ºC inkubiert.
2. Zu 100 ul der Serumproben oder Standards werden 200 ul 0,2 M Natriumacetat pH 5,0 gegeben und auf 70 ± 1ºC für 15 Minuten erhitzt, dann für 10 Minuten bei 9000 g zentrifugiert. Die Standards enthalten 0, 1,5, 5,0, 15, 50, 150 und 500 U/ml SIMA oder LIMA, das einen von gesunden Freiwilligen bezogenen, vereinigten Serum zugesetzt worden ist.
3. Dann wird ein ¹²&sup5;I-markierter, in PBS mit 1% RSA verdünnter monoklonaler Antikörper dem Acetatextrakt- Überstand (etwa 0,1 uCi plus 100 ul Überstand) zugesetzt und für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.
4. Beschichtete Löcher der Millititerplatten werden anschließend viermal mit PBS/Tween gewaschen und die Platten werden 30 Minuten lang mit 1% RSA in PBS bei 37ºC blockiert.
5. Nach dem Blockieren werden die Platten dreimal mit PBS/Tween gewaschen. Mit ¹²&sup5;I-markierten Antikörpern vorinkubierte Proben (50 ul pro Loch in jeweils zwei Löchern) werden anschließend in die Löcher gegeben und über Nacht bei 4ºC inkubiert.
6. Nach der Inkubation über Nacht werden die Löcher fünfmal mit PBS/Tween gewaschen, trockengetupft, und die Filter am Boden jedes Lochs werden herausgenommen und einem Gamma-Zähler gezählt.
SIMA- und LIMA-Konzentrationen werden als willkürliche Einheiten (Units)/ml ausgedrückt, die relativ zum Proteingehalt eines Referenzstandards von SIMA oder LIMA bestimmt wurden.
Es wurde eine Anzahl von Experimenten durchgeführt, um die Verläßlichkeit und Reproduzierbarkeit des Sandwich-Tests zu bewerten. Tabelle 4 zeigt die Variation, die zwischen Dreifach-Bestimmungen in einem typischen Test von Kontrollserum erhalten wird. Für die Serumtests von SIMA ist die Variabilität bei Konzentrationen von 1,5 U/ml am höchsten (cv = 10%), wo die Tests als nicht verläßlich angesehen werden (daher werden allen Werten < 5 U/ml SIMA keine spezifischen Werte angegeben). Für Serumkonzentrationen von 5 bis 500 U/ml SIMA ist die Variabilität zwischen den Tests 5,6% oder geringer. Tabelle 4 Variabilität eines SIMA-Radioimmunassay zwischen einzelnen Tests mittlere SIMA-Konzentration (U/ml) Standardabweichung c. v. (%)

b. Einzelheiten eines LIMA-Enzymimmuntests (EIA) (Fig. 7)

1. Polystyrol-Mikrotiterplatten (Nunc Immunoplates) werden mit monoklonalem Anti-LIMA-Antikörper IgG (z. B. aus der Hybridoma-Zellinie 2C3) in Bicarbonatpuffer für 3 Stunden bei 37ºC beschichtet. Die Platten werden zweimal in Waschpuffer (PBS/Tween/Natriumazid, pH 7,2 bis 7,6) gewaschen, dann abgetropft.
2. 50 ul Blockierungslösung (Rinderserumalbumin, gelöst in PBS mit Natriumazid, pH 7,4) wird in jedes Loch der Platte gegeben und bei 37ºC für 1 Stunde inkubiert.
3. Zu 100 ul LIMA-Standardlösung (LIMA-Standard, gelöst in normalem Humanserum mit Natriumazid, um Antigenkonzentrationen von 0, 1,5, 5, 15, 50, 150 und 500 Einheiten/ml zu ergeben) oder Serumproben werden 200 ul Acetat-Extraktionspuffer (0,2 M Natriumacetat, pH 5,9 mit Natriumazid) gegeben, für 15 Minuten auf 70 ± 1ºC erhitzt. Dann wird auf Raumtemperatur abgekühlt und 10 Minuten bei 10.000 g in einem Ausschwingrotor zentrifugiert.
4. Die Mikrotiterplatten werden dreimal mit Waschpuffer gewaschen und abgetropft.
5. 50 ul Überstand aus Acetat/Hitze-behandelten Standards oder Serumproben werden in jedes Loch (2 Löcher pro Probe) gegeben. Die Platte wird für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert.
6. Die Mikrotiterplatten werden viermal mit Waschpuffer gewaschen, dann abgetropft.
7. 50 ul alkalische Phosphatase-konjugierter, 1 : 300 in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 1% Rinderserumalbumin verdünnter monoklonaler Antikörper werden pro Loch zugegeben. Es wird für 1,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Es wird viermal in Waschpuffer, dreimal in destilliertem Wasser gewaschen, dann abgetropft. 100 ul Substrat (p-Nitrophenylphosphat), das in einer Konzentration von 2 mg/ml in einem Substratverdünnungspuffer (0,2 M Natriumcarbonat/Bicarbonat-Puffer mit 0,1 M Magnesiumchlorid) verdünnt ist, werden pro Loch zugegeben. Es wird für 20 Minuten bei 37ºC inkubiert.
8. 100 ul Enzymreaktions-Stoplösung (0,5 M Natriumhydroxid) werden pro Loch zugesetzt.
9. Die optische Dichte bei 405 nm wird in einem geeigneten Mikrotiterplatten-Meßgerät abgelesen.

Bewertung des Testergebnisses

(i) Man konstruiert eine Standardkurve, indem man die für jeden LIMA-Standard erhaltene optische Dichte (an der Y-Achse) gegen die entsprechende LIMA-Konzentration (die X-Achse) anträgt.
(ii) Unter Verwendung der mittleren optischen Dichte für jede Serumprobe wird die entsprechende LIMA-Konzentration in Einheiten/ml aus der Standardkurve bestimmt.
Wenn die Probe eine weitere Verdünnung (d. h. LIMA- Konzentration > 150 U/ml) erfordert, um einen Wert zu ergeben, der auf der Standardkurve abgelesen werden kann, muß der aus der Standardkurve erhaltene Wert mit dem geeigneten Verdünnungsfaktor multipliziert werden, um die LIMA-Konzentration im Serum zu ergeben.
Ein Beispiel ist in Tabelle 5 angegeben und Fig. 8 wurde aus den Daten in Tabelle 5 konstruiert. Tabelle 5 Probe Optische Dichte doppelt mittel LIMA-Konzentration Standard Probe
Ein Beispiel der Reproduzierbarkeit des obigen LIMA-EIA ist in Tabelle 6 gezeigt, aus der die Variation hervorgeht, die zwischen Dreifach-Bestimmungen in einem Test von Serumproben mit unterschiedlichen LIMA-Konzentrationen erhalten wird. Die Variabilität ist am höchsten für Werte von weniger als 1,5 U/ml (Variationskoeffizient 10%) oder für Werte von mehr als 150 U/ml (c.v. 12%). Serumkonzentrationen außerhalb dieser Grenzen (d. h. < 2 oder > 150 U/ml) werden daher als unzuverlässig angesehen. Proben mit > 150 U/ml LIMA sollten daher verdünnt und erneut getestet werden. Tabelle 6 Mittlere LIMA-Konzentration U/ml Standardabweichung U/ml C. V. (%)

c. Klinische Ergebnisse

Die folgende Tabelle 7 stellt eine Zusammenfassung von Ergebnissen für Proben aus Patienten mit unterschiedlichen Krankheiten und aus gesunden Kontrollpersonen dar, wobei die Ergebnisse von SIMA und LIMA RIA (siehe auch oben) und CEA-Serumtests gezeigt sind, um die Anzahl von Proben zu vergleichen, die nur für SIMA, nur für LIMA, nur für CEA oder alle Kombinationen dieser drei Marker positiv waren. Tabelle 7: Zusammenfassung der Ergebnisse aus klinischen Versuchen Diagnose Gesamtzahl von Patienten Anzahl von Patienten, in denen Tumorantigene gefunden wurden SIMA LIMA SIMA LIMA SIMA+CEA LIMA+CEA SIMA+LIMA+CEA CEA Alle negativ KOLON Krebs Kolonkatarrh ZWÖLFFINGERDARM Geschwür DÜNNDARM malignes Lymphom MAGEN Krebs - präoperativ - postoperativ - Behandlung unbekannt Geschwür malignes Lymphom OESOPHAGUS Gastritis Krebs Tabelle 7 (Fortsetzung): Zusammenfassung der Ergebnisse aus klinischen Versuchen Diagnose Gesamtzahl von Patienten Anzahl von Patienten, in denen Tumorantigene gefunden wurden SIMA LIMA SIMA LIMA SIMA+CEA LIMA+CEA SIMA+LIMA+CEA CEA Alle negativ GALLENBLASE Krebs Cholecystits/Gallensteine PANKREAS Krebs LUNGE Krebs BRUST Krebs malignes Lymphom akute lymphozytische Leukämie GESUNDE KONTROLLEN
In dieser Tabelle wurden LIMA-Konzentrationen ≥ 10 U/ml als positiv angesehen, CEA-Werte ≥ 10 wurden als positiv angesehen. Für SIMA-Serumkonzentrationen wurde ≥ 25 U/ml als positiv für Patienten angesehen. Gesunde Kontrollproben wurden als positiv angesehen, bei denen einer oder mehrere von wiederholten Test ≥ 20 U/ml war.

C. Andere Immuntest-Prozeduren

Eine Variation des obigen "zweiseitigen" Immuntests wäre die Verwendung eines polyklonalen Anti-Muzin-Antiserums (z. B. in Kaninchen oder Schafen erzeugt), um die Festphase zu beschichten. Dies würde die Verwendung eines oder mehrerer unmarkierter monoklonaler Antikörper als "zweiten" Antikörper beim Test ermöglichen, gefolgt von einem Nachweis des monoklonalen Maus-Antikörpers mit einem markierten Kaninchenoder Schaf-Anti-Maus-Antikörper. Dieses System (oder umgekehrt: monoklonaler Antikörper für die Beschichtung der Festphase und polyklonale Antiseren für den Nachweis) könnte eine bessere Amplifizierung von positiven Signalen gegenüber einem einzigen direkt markierten monoklonalen Antikörper ergeben.
Es sollte auch angemerkt werden, daß die vorliegende Erfindung die Verwendung eines fluorogenen Enzymsubstrats wie etwa 4-Methylumbelliferyl (4MU)-phosphat (für alkalische Phosphatase) oder 4MU-β-D-Galactosid (für β-Galactosidase) bei den Sandwich-Immuntests umfaßt. Es würde der gleiche Enzym-gekoppelte monoklonale Antikörper als bei der oben beschrieben kolorimetrischen Methode verwendet. Der erwartete Sensitivitätsanstieg wäre etwa 10-fach. Andere bekannte Nachweissysteme wie etwa Protein A, Avidin-Biotin etc. können ebenfalls eingesetzt werden. Bei Verwendung von markiertem Protein A als Nachweissystem in diesen Sandwich-Immuntests wäre dann der Festphasen-Beschichtungsantikörper (ob monoklonal oder polyklonal) ein F(ab)-Fragment und der Nachweisantikörper ein intaktes Molekül mit dem Fc-Segment. Es könnte eine Anzahl unterschiedlicher Festphasen bei diesen Systemen neben Mikrotiterlöchern verwendet werden, wie etwa Körner verschiedener Typen. Weiterhin können Membranen als adsorptionsfähige Oberflächen für Binde-Antigene eingesetzt werden.

REFERENZEN

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Claims

1. Verfahren zur in-vitro-Diagnose zum Nachweis von Krebszellen oder anderen Muzinantigene produzierenden Zellen in einem Patienten, wobei das Verfahren das Testen einer dem Patienten entnommenen Probe einer physiologischen Flüssigkeit auf das Auftreten von Muzinantigenen umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß eine dem Patienten entnommene Blut-, Blutserum- oder Blutplasmaprobe auf die Anwesenheit von Dünndarm-Muzinantigenen (SIMA) und/oder Dickdarm- Muzinantigenen (LIMA) in der Probe getestet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit Antikörpern gegen SIMA und/oder LIMA oder deren Fragmente in Kontakt gebracht und das Binden der Antikörper oder ihrer Fragmente an die entsprechenden Antigene nachgewiesen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit gegen SIMA und/oder LIMA oder deren Fragmente gerichteten Antikörpern, die mit einem zur Abgabe eines erkennbaren Signale fähigen Markers versehen ist, in Kontakt gebracht wird, und das Binden der 90 markierten Antikörper oder ihrer Fragmente an ihre entsprechenden Antigene nachgewiesen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper monoklonale Antikörper sind.

5. Verfahren nach Ansprüchen 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper oder ihre Fragmente mit einem Enzym oder einem Radioisotop markiert sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Schritte:

(i) Binden der Antikörper von SIMA und/oder LIMA oder ihrer Fragmente an einen festen Träger;

(ii) in-Kontakt-bringen der Probe mit dem festen Träger und

(iii) Nachweisen von in der Probe vorliegenden entsprechenden Antigenen, die an die mit dem festen Träger verbundenen Antikörper oder deren Fragmente gebunden sind.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Verfahrensstufe, in der das Vorliegen gebundener, entsprechender Antigene nachgewiesen wird, umfaßt:

(iv) das in-Kontakt-bringen des festen Trägers mit Antikörpern von SIMA und/oder LIMA oder ihren Fragmenten, die mit einem zur Abgabe eines erkennbaren Signale fähigen Markers versehen sind; und

(v) Nachweisen des Bindens von den markierten Antikörpern oder ihren Fragmenten an korrespondierende Antigene, die an den festen Träger gebunden sind.

8. In-vitro-Diagnosekit oder -system zum Nachweis von Krebszellen oder anderen Muzinantigene produzierende Zellen in einem Patienten, wobei der Kit oder das System dadurch gekennzeichnet sind, daß sie monoklonale Antikörper oder ihre Fragmente, die zu einer Immunreaktion mit SIMA und/oder LIMA fähig sind, die in einer vom Patienten entnommenen Blut-, Blutserum- oder Blutplasmaprobe enthalten sind, zusammen mit einer Indikatorvorrichtung umfassen, die das Auftreten einer Immunreaktion zwischen den Antikörpern oder ihren Fragmenten und SIMA und/oder LIMA anzeigt.

9. Kit oder System nach Anspruch 8, die darüberhinaus dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen festen Träger umfassen, an den die Antikörper oder ihre Fragmente gebunden sind.

10. Kit oder System nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Indikatorvorrichtung einen Marker umfaßt, der in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu geben, wobei der Marker an die Antikörper oder deren Fragmente gebunden ist.

11. Kit oder System nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Indikatorvorrichtung einen Marker umfaßt, der in der Lage ist, ein nachweisbares Signal zu geben, wobei der Marker an zweite Antikörper gebunden ist, die gegen die erstgenannten Antikörper gerichtet sind, und die durch Binden an die erstgenannten Antikörper das Auftreten der Immunreaktion anzeigen.

12. Kit oder System nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker ein Enzym oder ein Radioisotop ist.