KR920010296B1 - 위장암의 체외 진단방법 - Google Patents

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Description

위장암의 체외 진단방법

본 발명은 뮤신 생산성 암종(mucinous cancers), 특히 위장관(gastro-intestinal tract)의 암뿐만 아니라 흉부, 폐, 위 및 난소등의 암을 진단하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.

남성의 경우, 장관의 암에 의한 사망율은 폐암 다음으로 많고, 여성의 경우 흉부암 다음으로 많다. 이러한 증상에 대해 많은 주의가 집중되었음에도 불구하고 이로인한 사망율은 현재에도 거의 감소되고 있지 않은 상황이다. 조기 진단은 생존율을 높이는데 필수적이다. 때때로 암세포들은 건강한 사람의 체내에서 서의 검출할 수 없을 정도의 극소량의 물질을 생산한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 특징을 이용하여 새로운 진단기술을 개발시킬 수 있다. 암-관련 물질을 검출할 목적으로 실시되는 시험방법들은 건강한 사람과 암에 걸린 사람사이의 차이점에 착안한 것들이다.

태아성암항원(CEA)은 위장계통암과 연관되어 가장 많이 조사된 항원이며, 모든 종양과 연관된 항원중에서도 가장 많이 연구되어 왔다. 상기 항원은 인간의 태아기적 위장관에는 존재하지만 정상적인 어른이 결장에는 존재하지 않으며 있더라도 아주 극소량 존재한다.

CEA는 1965년 골드와 프리드만 (9)에 의해 최초로 인간의 결장암(colonic cancers)에 존재함이 밝혀졌다. CEA는 상기와 같은 암 환자의 혈액내에 존재하며, 따라서 인체 소화계의 암에 대한 조기 진단에 커다란 희망을 주는 태아종양 항원으로서 주목되었다. 그러나 그후, 혈액내에 함유된 CEA를 분석하는 방법은 위장계통의 암에 대한 조기진단 목적의 실험으로 특이성이 없음이 판명되었는데, 그 이유는 끽연자들의 기관지와 간의 질환을 포함하는 다수의 비-종양형(non-neoplastic)질환에서는 CEA가 종종 증가되기 때문이다(10). 그 예로서 정상적인 사람중 10%는 이들이 암환자가 아니거나 종양의 초기중세를 갖지 않았음에도 불구하고 혈액내에 CEA 농도가 증가되는 현상을 나타냄으로서, 상기 시험법에서 잘못된 양성반응을 나타낸다. 때때로 매우 큰 종양을 가진 환자에게 조차도 CEA를 검출할 수 없는 경우가 있으며(11-13), 따라서 잘못된 음성 반응율이 매우 크다(위장 계통의 암환자중 약 50%는 혈액내의 CEA 농도 증가를 나타내지 않는다). 그러나 이러한 제한효소에도 불구하고, CEA 분석방법은 암환자의 수술전 평가와 수술후 관리시 주로 고려되는 방법이다. CEA 분석방법은 현재 암 테스트의 약 40%를 차지하고 있다.

알파페토프로테인(AFP)은 태아에게는 고농도로 존재하지만 정상적인 성인에게는 없는 또 다른 태아성종양항원이다. 원발성 간암, 속발성 간 종양 및 어떤 형태의 고환암(테라토마)을 지닌 대부분의 환자에 있어서 뿐만 아니라 또한 중독성 간 손상과 경변증에서도 AFP의 혈중농도가 증가된다. 이와같이 효용도면에서 사실상 상단한 단점을 지니고 있음에도 불구하고, AFP는 현재 시행되는 암 시험법의 약 20%를 차지하고 있다.

최근에, 종양-관련 항원 CA 19-9^TM을 측정하기 위한, 모노클로날 항체에 의한 방사 면역 정량법(Radioimmunoassays)이 상업적으로 유용해졌다.(14-19).

이 CA 19-9^TM분석 방법은 모든 단계의 췌장암에 대하여 고감도 및 특이성을 갖는다고 알려져있지만, 결장직장암(colorectal cancer)의 검출에 있어서 상기 분석 방법은 감도가 매우 낮은 것으로 밝혀졌다.

1980년에는 대장암으로 부터 새로운 뮤신 당단백질 항원이 분리되었다(1).

상기 물질은 또한 정상적인 성인의 소장에서도 존재하므로, “소장 뮤신 항원”(small intestine mucinantigen=SIMA)이라고 명명되었다.

SIMA는 태아성종양 항원인 것으로 밝혀졌는데, 그 이유는 8-12주 경과된 태아의 모든 위장관에서 발견되지만 일단 출생후에는 정상적인 경우 소장외에서는 검출되지 않는다는 것 때문이며 대부분의 위장관 및 다른 기관의 암에서 발견된다. “대장 뮤신 항원” LIMA)으로 명명된 또 다른 뮤신 물질도 역시 정상적인 대장으로 부터 분리되었다. LIMA도 역시 태아성 종양항원이며, 다수의 암에 의해 광범위하게 생산된다. 광범위한 면역 조직학적 연구에 따르면 LIMA는 항원적으로 SIMA와 별개의 것이며, 이들은 모두 CEA와도 명확히 다른것임이 밝혀졌다. 이들과 같은 장과 관련된 뮤신항원들은 위, 담낭, 폐, 흉부 및 난소에 대한 몇몇 종양뿐아니라 이들 기관들의 전암성 상태(premalignant condition)에서도 검출된다. (참고문허 1-8).

항-SIMA와 항-LIMA 모노클로날항체 및 폴리클로날항체를 사용하여 정상적인 태아와 성인의 조직, 및 여러 기관의 암에 대한 면역 조직 화학적 염색실험을 실시한 결과를 하기표 1에 수록하였다.

[표 1]

뮤신성 당단백질들인 SIMA와 LIMA가 고분자량을 갖고 있음에도 불구하고, 이당단백질들은 진단용 항체분석 방법에 의해 다수의 대장 암환자의 혈청중에서 검출할 수 있다는 것이 발견되었다. SIMA와 LIMA는 건강한 대조군의 혈청에서는 측정가능할 정도로는 발견되지 않았고, 발견되더라도 아주 극소량이었다. 초기 소규모 연구에서도 이미 SIMA 시험법 및 LIMA 시험법을 조합한 시험방법의 결장직장암을 지닌 환자의 약 80%를 검출하는데 사용될 수 있으며, 반면에 CEA 시험법만으로는 같은 환자의 단 56% 만을 검출할 수 있음이 밝혀졌다. 이들 SIMA와 LIMA 분석방법은 B와 C단계(듀크의 분류기준)의 암을 검출하는데 있어서도 CEA 분석방법에 비하여 감응도가 크다. 더우기, LIMA는 결장의 궤양성 대장염을 지닌 대부분의 환자의 혈액내에서도 검출할 수 있다. 이와같은 환자들은 통상 대장암으로 진행된다. 이와 유사하게 SIMA와 LIMA는 전-암적 상태(pre-cancerous states)의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와같이, SIMA와 LIMA라는 용어는 하기에 더욱 상세히 설명되는 상기 뮤신 항원뿐만 아니라 이것과 항원적으로 관련되어 있으며, 생리학적 유체, 특히 혈청과 형장내에 존재하는 상기 항원의 일부를 모두 의미하는 것이다.

본 발명에 의해, 환자내의 뮤신 항원을 생산하는 암세포 또는 다른 세포의 존재여부를 검출하는 실험실적 검출방법이 제공되며, 본 발명은 환자로 부터 생리학적 유체 샘플을 취하고, 그 샘플내에 SIMA 및/또는 LIMA가 존재하는지 여부를 검출하기 위하여 상기 샘플을 테스트하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 상기 방법은 환자로 부터 채취한 생리학적 유체샘플을 SIMA 및/또는 LIMA에 대한 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 또는 상기 항체의 단편 또는 검출 가능한 시그날을 제공할 수 있는 라벨을 사용하여 표지시킨 상기 항체 또는 그의 단편과 접촉시킨뒤, 상기 항체 또는 그들의 단편 또는 상기 라벨된 항체 또는 그들의 단편이 그들과 대응되는 항원과 결합했는지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다.

이러한 진단방법에 사용하기에 특히 바람직한 생리학적 유체는 혈액, 혈청 또는 혈장등이다.

또 다른 목적으로는, 뮤신 항원을 생산하는 암세포 또는 기타 세포가 환자내에 존재하는지를 검출하기 위한 실험실적 진단용 키트(kit) 또는 시스템을 제공하는 것인데, 이때 상기 키트 또는 시스템은 환자로 부터 채취한 생리학적 유체 샘플내에 SIMA 및/또는 LIMA가 존재하는지를 검출하기 위한 수단을 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적은 환자로 부터 채취한 혈액 또는 혈청과 같은 생리학적 유체 샘플내에 SIMA 및/또는 LIMA가 존재하는 지를 검출하기 위한 실험실적 진단용 키트 또는 시스템을 제공하는 것인데, 이때 상기 키트 또는 시스템은 SIMA 및/또는 LIMA와 면역반응을 할 수 있는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 또는 그의 단편과 함께, 이 항체와 이들에 대응되는 항원사이에 면역 반응이 존재함을 알려주는 인디케이터 수단을 함유하고 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 (ⅰ) SIMA 및/또는 LIMA 또는 (ⅱ) SIMA 및/또는 LIMA와 면역반응을 할 수 있는 항체중 어느하나를 포함하는 성분을 고체지지체에 연결된 상태로 함유하는 진단 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명은 상이한 형태의 인디케이터 수단을 이용한 여러가지 구체예를 포함한다. 본 발명의 한 가지 구체예에 있어서, 상기 인디케이터 수단은 검출 가능한 시그널을 제공할 수 있는 라벨로 구성되어 있는데, 상기 라벨은 SIMA 및/또는 LIMA와 면역 반응을 할 수 있는 상기 항체에 결합되어 있다. 그러나 다른 구체예에서, 이들 인디케이터 수단은 검출 가능한 시그날을 제공할 수 있는 라벨을 포함하며, 이때 이들 라벨은 2차 항체에 결합되어 있고, 이 2차 항체는 상기 언급된 1차항체에 대해 생성된 것으로 상기 언급된 1차 항체와 결합함으로서 상기 면역 반응이 존재함을 나타내준다. 또 다른 구체예에서, 상기 인디케이터 수단은 라벨이 결합된 포도상구균성 단백질 A(Staphy lococcalProtein A)를 포함한다.

상기 여러 구체예에서 사용된 라벨은 공지된 효소, 방사성 원소, 형광성 화학물질 또는 비오틴과 같은 화합물을 포함한다.

SIMA와 LIMA에 대한 면역 분석법을 사용함으로서 결장직장암의 모든 단계에서 이들 뮤신 항원들을 검출할 수 있다. 따라서, 이들 시스템이 상술된 CA19-9^TM또는 CEA 분석법보다 더욱 가치있고 유용성이 있다는 것이 알려졌다.

본 발명의 일차적으로는 뮤신성암의 검출에 그 목적을 두고 있지만, SIMA와 LIMA에 대한 면역 분석법이, 궤양성 대장염 또는 위궤양과 같은 염증성 증상뿐만 아니라 전-암성 상태의 검출에도 유용하다는 것이 알려졌다.

전술한 설명에서도 명백히 알 수 있듯이, 본원에서 언급된 뮤신 항원 SIMA와 LIMA는 일단 그들이 분리되어진 제공원에 따라 특징지울 수 있다(하기 상세하게 설명된 방법에 의하여). 이들 항원의 또 다른 특성 규명 및 동정은 모노클로날 또는 폴리클로날 항-SIMA와 항-LIMA 항체를 사용하고, 그리고 면역조직 화학적 방법, 즉 특정 위장조직에 대한 항-SIMA 또는 항-LIMA 항 혈청의 결합을 억제함으로서 항원성 활성을 검출하는 “경쟁적(competitive)” 면역 분석법과 같은 방법을 사용하여 실시할 수 있다.

본 발명에 대한 상세한 설명은 하기에 논의될 것이다.

본 발명에 의한 SIMA 및/또는 LIMA의 면역 분석 방법은 환자내의 암세포 또는 다른 뮤신 항원 생산세포의 검출을 위한 고감도의 진단기구를 제공하는데, 특히 수술전의 암환자의 종양정도를 확인하고, 외과적 수술 또는 그밖의 어떠한 방법(예, 방사능 요법, 화학요법)으로 처리된 후의 환자에 대해 치료 가능한 상태로의 회복효과 또는 치료효과를 모니터하기 위한 기본 평가자료를 얻기 위하여 사용된다. 이와같은 응용분야에 있어서, 본 발명의 진단시스템은 먼저 CEA 또는 그 밖의 공지된 종양 관련항원에 대한 면역 분석법을 병행하여 실시할 수 있으며 이는 관련 분야에서 최근 실시중이다. 또한 SIMA/LIMA(임의로 CEA와 병용하여) 진단 시스템은 초기 실험후, CEA 진단 시스템만 으로는 진단 학적으로 이상이 없는 것으로 나타난 궤양성 대장염 또는 위궤양의 환자들과 같이 위장계 암으로서의 진행 위험성이 큰 모집단을 스크리닝하는데 사용된다.

본 발명에 있어서, 대장암으로 부터 추출된 뮤신 제제로 쥐를 면여과시켜 각종 모노클로날 항체를 제조하였다. 조직에 대한 면역조직 화학적 염색방법으로 상기 모노클로날 항체중 5개는 항-SIMA(대장암 및 정상적인 소장과 반응함), 그리고 5개는 항-LIMA(대장암 및 정상적인 대장과 반응함)로 분류하였다. 면역 화학 분석 결과 상기 항체들의 친화력은 각 부류에 있어서 100배 정도로 다양하다.

다음의 실시예들은 본 발명에 의항 뮤신항원의 제조방법 및 특성 규명, SIMA와 LIMA에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 제조하기 위하여 사용되는 방법, 그리고 환자내의 암세포 또는 그 외의 뮤신 항원 생산 세포를 검출하기 위한 실험실적 진단방법에 상기 모노클로날 항체를 사용하는 방법을 예시한 것이다.

A. 뮤신항원의 정제와 그 특성 규명

결장직장암 조직을 외과수술로 절단하여 얻은 표본으로 부터 뮤신을 추출하였다. 상기 종양제거시 함께 제거된 정상적인 조직중 상기 종양 부위에서 가장 먼곳에 있는 정상적인 대장 부분을 채취하여, 그들의 정상적인 외관을 확인하기 위하여 광현미경으로 검사했다. 정상적인 십이지장, 공장 및 결장은 사고로 인한 사체부검시 얻었다. 하기 방법에 의하여 결장암의 샘플(LIMA와 SIMA), 정상적인 대장의 샘플(LIMA) 또는 정상적인 십이지장 또는 공장의 샘플(SIMA)로 부터 뮤신을 추출하였다.

모노클로날 항체를 제조하고 스크리닝할 목적으로 쥐를 면역화 시키기 위해 사용되는 뮤신 제제는 조직학적으로 S 자형 결장의 “부분적 뮤신성” 선암으로 진단된 암표본으로 부터 제조되었다. 이 조직 표본(약 5g)를 작은 조각으로 자른뒤, 24mM EDTA, 10mM N-에틸 말레이미드와 1mM 벤즈아미딘 HC1을 함유하는 4M 구아니딘 염화수소 10배 부피량중에 상기 조각을 넣고 균질화(homogenized)하였다. 20,000×g에서 20분간 원심분리한 뒤, 얻어진 펠릿(pellet)을 새로운 구아니딘 염화수소를 사용해 재 추출하였다. 혼주 상청액중에 있는 뮤신은 염화세슘을 사용해 1.35b/ml의 밀도를 갖도록 조절한 뒤 105,000×g에서 64시간동안 원심분리하였다. 얻어진 그레디언트(gradient)를 1.25에서 1.55g/ml 범위의 밀도를 갖는 6개의 동일한 분획분들 (fractions)로 분리하였다. 각각의 분획분들을 증류수에 대하여 투석하고, 그후 단백질과 헥소오즈 21에 대한 분석(변형된 브랫포드 분석법)을 실시하고, 또한 항-SIMA화 항-LIMA항체에 의한 위장조직의 특이적인 면역형광 염색의 억제능을 측정함으로써 항원 활성을 분석하였으며, 그리고 모노클로날 항체를 사용한 면역 정량법에 의해 항원 활성을 분석하였다(이하 상세한 설명을 참고바람). 높은 항원 활성을 갖는 분획분을 CsC1 그레디언트 상에서 재분획한뒤, 각 분획분들을 상기와 같이 다시 분석하였다.

(ⅰ) LIMA

LIMA는 1.34 재지 1.55g/ml 사이의 밀도를 갖는 그레디언트의 하부 2 또는 3의 분획분에서 발견되었다. LIMA 제제는 다중 분석되어있으나 대개 약 1.4±0.08에서 가장 높은 항원활성을 나타내었다. LIMA 제제를 전형적인 3차 CsC1 그레디언트 원심분리하여 얻어진 각 분획분들에 대해 항원활성, 헥소오즈와 단백질 함량을 시험한 결과를 제1a도에 나타내었다. 분획분 2와 3의 헥소오즈/단백질 비율(wt/wt)는 각각 0.5와 0.25이었다. 헥소오즈, 단백질과 항원 활성의 최대점들 (peaks)이 일치하지는 않았다; 분획분 3이 대부분의 항원활성을 포함하고 있었다. 효소-결합된 면역 분석법(EIA)에 의해 측정한 바에 따르면 전형적인 실험에서 LIMA의 총 수율은 조직 마쇄물에 존재하는 양의 약 35%이다.

LIMA의 전반적인 정제도는 1000-배 정도였다. 정상적인 대장으로 부터 얻어진 LIMA 표본에서 SIMA는 일반적으로 검출되지 않는다. 샌드위치 면역분석법(여기에서 똑같은 모노클로날 항체가 한분자에 한번이상 결합해야 한다)에 LIMA 제제를 성공적으로 사용할 수 있다는 사실로 부터 상기 모토클로날 항체에 의하여 인식된 항원 결정인자가 한 분자상에 최소한 두번 반복되어 존재한다는 것을 알 수 있다.

LIMA는 7% 폴리아크릴아미드 전기 영동용 겔내로 투과 되지 못하기 때뭉에 고분자량을 갖는다는 사실이 확인되었다. 겔 여과 크로마토그래피를 사용한 연구결과, 세파로즈 6B(분자량이 약 1×10⁴-4×10⁶범위의 소구성단백질과 분자량이 10⁴-10⁶인 덱스트란을 분리함-Pharmacia 카달로그 규격일람)와 세파로즈 2B(분자량이 7×10⁴-4×10⁷인 소구성단백질과 분자량이 10⁵-2×10⁷인 덱수트란을 분류함)의 공극 부피(void volume)에서 LIMA 항원의 용출된다는 것을 알 수 있었다.

제2a도에는 10mM의 인산염-완충 식염수로 용출시킨 세파크필 1000컬럼(1cm×65.5cm : 분자량 5×10⁵-10⁸의 덱스트란을 분리함) 상에서의 LIMA의 겔-크로마토그라피 결과를 나타내었다. LIMA 항원 활성의 대부분은 상기 매트릭스내에 포함되어 있었으며, 넓은 피크(peak)로 용출되는 양상을 보아 LIMA 제제가 다중 분산성을 갖고 있음을 알 수 있다. 그외의 많은 프로테오 글리칸 분자들 (proteoglycan molecules)에서도 유사한 정도의 다중분산성이 관찰되었는데, 이것은 분자량에 영향을 주는 응집성 또는 구조적 다양성에 의한것일뿐 이와같은 분자들의 항원성의 차이로 인한것은 아니다.

LIMA의 크기를 더욱 바람직하게 측정하기 위하여, 다수의 표본들을 글리세롤그레디언트(10% 내지 20%) 상에서 초원심분리시켜 (벡크만 SW 50Tirotor, 22,000rpm×15시간 또는 42,000rpm×5시간, 4℃) 침강계수를 측정하였다.

그레디언트를 분획해내고, 각 분획분들을 샌드위치 분석법으로 항원 활성에 대해 분석하였다. 전형적인 LIMA 그레디언트를 제3a도에 나타내었다.

이것과 그외의 작업으로 부터, 얻어진 중량 평균된 S 값은 다음의 방정식에 의하여 결정되었다;

상기식에서 w는 각속도, t는 원심분리한 시간(시), Ro는 상기 그레디언트 상부까지의 회전반경, Rt는 항원성의 최대치가 이동한 반경의 중량 평균값이다. 여러가지 상이한 실험에 의해 계산된 평균값 S는 9.5±1.5였다.

LIMA 항원의 특성에 대한 더 많은 정보를 얻기 위하여 이 항원에 대해 다수의 상이한 물리적, 화학적 및 효소적 처리가 행하여졌는데 그 결과는 표 2에 수록하였다. 샌드위치 분석법에 의하면, LIMA의 항원성은 40℃에서 최소한 1달간 저장에 대하여 안정하였으며 100℃에서 약 5분 정도안정했다. 10분또는 그 이상 비등시키면, 40%의 활성이 감소되었다. 비등에 대한 LIMA의 이와같은 안정성은 이 항원이 광법위하게 글리코실화된 분자임을 위미하며, 그 에피토프가 탄수화물을 함유하거나 또는 탄수화물에 의해 보호되어 있다는 것을 의미한다. 탄수화물과 단백질 사이의 0-글리코사이드 결합을 절단시키기 위한 LIMA의 알칼리 처리는 다양한 농도의 KOH : 0.01M, 0.05M, 0.10M, 0.25M, 0.50M(4℃에서 2,4 또는 16시간동안)에서 행하여졌는데, 처리후 각각 85%, 70%, 70%, 55% 및 45%의 항원활성이 남아있었다. 2-메트캅토에탄올 (0.1M)과 같은 친핵성 물질을 첨가함으로서 완만한 조건(0.01M KOH, 4℃에서 4시간동안) 하에서 β-제거반응을 용이하게 실시할 수 있으며, 그 결과 55%의 항원활성이 손실되었다. LIMA를 알칼리 처리하면 항원활성이 일부 감소되는 것외에, 글리세롤 그레디언트 상에서 분석한 결과 중량평균 값 S가 현저하게 감소 되었음을 알 수 있으며 (5.5), 이는 분자량이 감소되었음을 의미한다(제3a도).

LIMA를 환원(50℃ 하에 6M 구아니딘 HC1, 0.5M 트리스 pH 8.1, 0.002M EDTA, 10mM 디티오트레이톨중에서 2,4 또는 16시간, 그후 4℃에서 0.4M 요오드아세트산으로 하룻밤동안 알킬화) 시킨 결과 그의 항원 활성에 커다란 영향을 미치지 않았다.

고도로 정제된 다수의 효소를 사용한 분해실험(digestion experiments)은 LIMA 항원의 화학적 특성을 측정하기 위하여 실시된 것이다. 효소 처리후, 면역 분석 하기전에 사용된 효소를 불활성화 시키기 위하여 샘플들을 중화(펩신) 시키거나 5분간 비등시켰다. 펩신이나 클로스트리파인 모두 (2,4 또는 16시간 동안 LIMA를 여러 농도의 효소와 함께 항온보존하여 실험하였음) LIMA의 항원 활성에 어떠한 뚜렷한 영향을 주지 못함이 밝혀졌다(표 2). LIMA를 파파인으로 분해한 후 (0.1 또는 1.0mg/ml) 샌드위치 분석하면 2.4 또는 16시간 분해후 단지 20%의 활성이 남는것으로 보아 항원활성이 현저히 손실된다는 것을 알 수 있다. 경쟁적 ELISA로서 분석하였을때(본 분석 방법은 항원상에 존재하는 다가의 에피토프에 대하여 의존하지 않는다), 파파인으로 2시간동안 분해한후 잔류한 활성은 75%, 4시간후에는 65%, 그리고 16시간 후에는 35%이었다. 상기 사실은 완만한 조건하에서 파파인으로 분해하면, LIMA는 대부분이 오직 하나의 에피토프만을 갖는 분체들로 분해되며, 따라서 이런 분체들은 샌드위치 분석법으로 검출되지 않고 경쟁적인 분석법으로만 검출되게 된다는 것을 의미한다.

상기 결과로 부터 상기 항원이 어느 정도 파파인에 대해서는 감응도를 갖지만 펩신과 클로스트리파인에 대하여는 저항성이 있음을 확인할 수 있다.

(ⅱ) SIMA

SIMA는 1.29와 1.45g/ml 사이의 밀도를 갖는 그레디언트중 2 또는 3의 분획분에서 발견되었다. SIMA 표본은 다중분산성을 갖지만 그 항원 활성의 대부분은 1.38±0.05의 밀도에서 발견되었다. SIMA 표본을 전형적인 3차 CaC1 그레디언트 원심분리하여 얻어진 각 분획분에 대해, 그 항원활성, 헥소오즈와 단백질함량을 측정한 결과를 제1b도에 도시하였다. 대부분의 항원 활성이 나타나는 제3과 4분획분에서는 헥소오즈/단백질 (wt/wt) 비율은 각각 1.5와 0.3이었다.

전형적인 결장암 표본으로 부터의 SIMA의 수율은 EIA로 측정한 결과 약 40%이었다.

이와같은 방법들을 사용해 얻어진 정제성도는 약 1000배 정도이며 이것은 SIMA의 정제도와 비슷하다. 대부분의 결장직장암 조직은 다량의 LIMA 뿐만 아니라 SIMA도 함유하고 있다는 것이 알려졌는데, 정상적인 십이지장과 공장 샘플로 부터 얻어진 추출물의 경우 SIMA는 함유하지만 LIMA는 검출되지 않았다. LIMA와 SIMA가 혼합된 뮤신 추출물들을 항-LIMA 모노클로날 항체 친화컬럼을 통과시킴으로써, 결장직장암 표본으로 부터 얻어진 “SIMA”제제로 부터 LIMA를 제거할 수 있다. 이 표본내의 SIMA의 존재는 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체에 의한 소장의 면역형광염색의 억제반응 및 모노클로날 항체와의 반응을 기초로 동정할 수 있다.

LIMA에 대하여 이미 설명한 바와같이, 샌드위치 면역 분석법에 SIMA를 사용한 결과 항원분자상에 반복된 에피토프가 존재한다는 것을 알 수 있었다.

LIMA의 경우에서와 마찬가지로, SIMA도 7%의 폴리아크릴아미드 전기영동용겔에 침투하지 않았다. 그러나 4M 구아니딘 HC1을 함유하는 25mM 트리스(pH8.0)로 용출시킨 세파로즈 2B 칼럼(1.5cm×7cm)상에서의 겔 여과에 의한 분석결과, SIMA가 겔내에 포함되어 있으며, 다수의 피크를 용출시키는 (제4도) 다중분산성을 갖고, LIMA에 비해 매우적은 분자량을 갖고 있음이 확인되었다. SIMA를 세파크릴 1000컬럼상에 적용시켰을때도, 전반적으로 LIMA 제제 보다도 훨씬 적은 분자량을 갖는 넓은 피크 양상으로 용출되었다(제2a도와 (b)도를 비교)

LIMA에서 상술한 바와같이, 10% 내지 20% 글리세롤 그레디언트상에서 다수의 SIMA 제제에 대해 S값을 측정하였다. 전형적인 SIMA 그레디언트를 제3b도에 나타내었다. 다수의 실험에 의한 평균값 S는 4.±1.4인데, 이것은 LIMA에 비하여 매우 적은 값이다.

SIMA는 LIMA보다 알칼리처리 및 비등에 대하여 훨씬 더 안정하다는 것이 밝혀졌다. 상기 LIMA의 알칼리처리에 사용된 것과 같은 조건을 사용하여 처리한 후에도 SIMA 항원 활성에 있어 뚜렷한 변화는 관찰되지 않았다. 또한, SIMA의 항원 활성은 5분간 비등시켰을 때에도 큰 영향을 받지 않았으며 10분간 비등시킨 뒤에도 단지 6% 활성손실이 나타났을 뿐이다(표 2 참고).

LIMA에 대해 상술한 바와같이 고도의 정제된 다수의 효소로 SIMA를 분해하였다(표 2).

샌드위치 EIA에 의한 분석에 따르면, 클로스트리파인(colostripain)은 SIMA의 항원 활성에 전혀 영향을 미치지 않았다. 2시간동안 파파인으로 SIMA를 분해시켜도 전혀 영향을 받지 않았으나, 16시간동안 분해한뒤에는 약 50%의 활성 손실이 발생되었다. SIMA를 헵신 으로 분해하면 그의 항원활성이 약 70% 손실되었는데, 이것은 LIMA가 펩신에 대한 저항성을 갖는것과는 대조되는 결과이다. (실온에서 하룻밤 10μg/ml의 펩신 사용)

[표 2]

하기와 같은 많은 정제단계가 본 발명의 뮤신의 정제 관정에 사용될 수 있다 :

1. 과염소 산(1M), 소듐 아세테이트로의 처리 및 70℃에서의 가열, 또는 분간의 비등방법이 뮤신 제조물의 순도를 높이기 위해 서용될 수 있다.

2. 반복 CaC1 그레디언트 초원심 분리가 뮤신 제조물의 순도를 현저하게 (10배가량) 증가시킨다는 것이 입증되었다.

3. 모노클로날 항체 친화성 크로마토그래피는 두가지 방법으로 사용될 수 있는데, 첫째 예를들면, SIMA 제제로 부터 LIMA를 제거하기 위해 항-LIMA 모노크로날을 사용하여(그 반대 방법도 가능하다), 둘째로, 다른 오염 단백질로 부터 SIMA를 정제하기 위해 항-SIMA 모노크로날 상에 뮤신 (SIMA)을 흡착 및 융출시킨다.

4. 뮤신 항원들은 렉틴 컬럼, 겔 전기영동, 이온 교환 또는 겔 여과 크로마토 그래피를 사용하여 정상 조직 및 암 조직으로 부터 정제할 수 있다. 뮤신 제조물의 정제 과정을 구성하는 여러단계들은 폴리클로날항체 및 모노클로날 항체를 사용하는경쟁적 면역 조직 화학적 분석법 및 EIA 방법을 사용하여 상기 제조물중의 SIMA와 LIMA 조성을 측정함으로써 모니터 된다.

B. 폴리클로날 항혈청의 제조방법.

이 연구에 사용되는 항-SIMA 폴리클로날 항혈청은 Ma 등에 의해 (1980)¹토끼에서 생산된것이다. LIMA를 인식하는 폴리클로날 항혈청은, 정상의 대장으로 부터 추출된 뮤신 제조물로 토끼를 면역화시키는 것을 포함하는 Ma 등에 의한 방법 (1980)¹과 유사한 방법으로 제조했다. 이러한 유형의 항혈청은 비교적 비-특이성이며 교차 반응성이 있기는 하지만 뮤신 정제 단계를 모니터 하기 위해 최초로 사용되었다.

그 순도의 SIMA와 LIMA로 부터 제조된 폴리클로날 항혈청은 하기에 설명되는 “두개-부위(two-site)” 샌드위치 면역 분석법에 사용되었다.

C. 모노클로날 항체의 제조 방법.

[면역화 스케쥴]

약 8주령 암컷의 Bald/C 쥐를 각 쥐마다 약 50μg의 부분적으로 정제된 암 뮤신 제조물로 4회 피하주사, 그리고 1회 복강내 주사처리하여 면역시켰으며, 이때 처음에는 완전한 프로인드 보강제로, 그리고 약 4주후에는 상기와 동일한 주사방법을 사용하되 불완전 보강제의 주사액을 사용해 면역시켰다.

이차 면역 후 약 12일째에, 쥐의 꼬리 정맥에서 체혈하고 혈청항체 역가를 ELISA 방법으로 측정했다. 이차 면역하고 3주일후에, 고 혈청 역가를 갖는 쥐들에게 4일간 연속으로 PBS 중의 암 뮤신 제조물 10μg을 복강내 주사하여 추가항원 자극시키고, 5일째 되는날 치사시켜 비장을 제거하여, 쥐 골수종라인과 통상의 세포융합을 실시한다.

세포 융합, 하이브리도마 증식, 클로닝 :

인산염-완충 생리학적(GKN) 용액중에서 면역시킨 쥐의 비장을 가볍게 타이징(찢어가름) 하여 비장세포 현탁액을 제조했다. 표준 방법에 따라 10⁸비장세포를 5×10⁷골수종 세포[×63Ag 8.6.5.3] (T.Stahelin, Hoffman La Roche, Basel, Swizerland로 부터 입수함)와 융합시켰다. 비장 세포화 골수종 세포에 50% PEG-4000(GC 등급)를 60초간 서서히 가하면서 혼합했다.

90초간 정치시킨뒤, PEG 중에 현탁된 세포들을 7ml GKN 용액(5분간 첨가시킴)으로 서서히 희석하고, 그뒤 10% 태아 송아지 혈청, 히포크산틴, 아미노프테린과 티미딘을 함유하는 RPMI 1640 배지로 약 300ml로 희석했다. 희석된 세포 현탁액을 각 웰당 10⁵복강 대식 세포를 함유하는 24-웰 멀티-디쉬의 288개웰에 분산시켰다.

약 7일후 배지를 교환하고 그후 세포 증식에 따라 필요한 만큼 배지를 교환했다.

EIA에 의한 선별후에, 뮤신에 대한 항체를 분비하는 하이브리드도마를 복감 대식세포가 함유된 마이크로타이터디쉬내에서 한계 희석함으로써 2회 클론화시켰다. 모노클로날 향체를 대규모로 생산하기 위하여, 0.5ml의 프리시탄(Pristane)을 1-7일전에 복강내에 주입하여 사전초의 항원 자극시킨 8-12주령의 쥐에서 항체-분비성 하이브리도마를 복수 종양상태로 증식시켰다. 세포를 주입한지 2-4주후, 복수액을 수거하여 -20℃에서 저장했다. 면역 글로불린은 단백질 A-세파로즈 친화성 크로마토그래피 방법을 사용해 복수액으로부터 정제했다.

[이브리도마 스크리닝]

(ⅰ) EIA

폴리스티렌 마이크로타이머 플레이트의 웰들을 3시간동안 37℃에서 조악한 암 뮤신 제조물 (HCO₃ ^-/CO₃ ^-완충제(pH 9.6)에 10μg/ml)로 피복시켰다. 그후 웰을 PBS/Tween으로 4회 세척했다.

이 웰내에서 하이브리도마 배양 상청액을 1시간동안 항온 배양한후 PBS/Tween으로 4회 세척했다. 웰을 알칼리 포스파타제-결합된 양(sheep)의 항-마우스 면역글로불린과 함께 배양했다. PBS/Tween으로 세척한후, 증류수로 다시 세척하고, p-니트로페닐 포스페이트를 기질로서 첨가하고, 양성인 웰(뮤신에 대한 항체를 함유하는 상청액을 의미함)은 황색생성물, 즉 p-니트로페놀을 함유하는 것을 기준으로 동정했다.

(ⅱ) 형광 면역 조직화학법

상기 EIA 방법으로 일차스크리닝되어 동정된 “양성”하이브리도마들을, 이들로부터 생성된 모노크로날 항체가 정상 위장 기관의 조직 단편과 암성 위장기관의 조직 단편에서 특정 세포나 조직을 착색시키는 능력이 있는지에 대하여 면역 형광법으로 스크리닝했다. 하이브리도마 배양 상청액을 슬라이드상에서 조직 단편과 함께 배양시켰다. 과량의 표지된 항체는 세척하여 제거하고, 조직단편을 U-V 또는 협소-밴드 블루 여기 방법(narrow-band blue excitation)을 사용하여 형광 검경으로 조사했다.

상기 방법을 사용하여, 5개의 항-SIMA 모노클로날 항체(정상의 소장 뮤신 및 결장직장암 뮤신과 반응함)와 5개의 항-LIMA 모노크로날 항체(정상의 대장과 결장 직장암 뮤신과 반응함)을 동정했다.

[모노클로날항체의 특성 규명]

상기 항체들을 효소-커플린 항-IgG 항체와 항-IgM 항체(CSL)를 사용하여 어느 아군에 속하는지를 결정했다. 모든 모노클로날 항체들이 IgG 아군에 속하는 것으로 밝혀졌다.

이 모노클로날 항체의 특성을 완전히 규명하기 위하여, 그들의 상대적인 친화도를 두가지 방법으로 측정했다. 첫째, 단백질 A-세파로즈 친화성 크로마토그래피로 각 모노클로날 항체에 대하여 정제된 IgG를 얻었다. 정제된 IgG를 EIA 방법으로 역가를 측정하고, 그 적정곡선 (EIA 방법에서 단백질 농도에 대한 반응)을 해당항체의 상대적 친화도의 측정치로 비교했다. 둘째는, 경제적 EIA를 실시했다(하기 참조). 상대적 친화 상수는 항-SIMA 모노클로날 항체의 경우 억제제로서 SIMA 제조물을 사용하고, 항-LIMA 모노클로날 항체의 경우 억제제로서 LIMA 제조물을 사용하여 계산했다. 상대적 친화상수의 계산은 하기식에 의한다 :

경쟁적 EIA에서 50%억제를 나타내는 항원(뮤신)의 농도에서, 유리항체 및 결합항체의 농도를 서로같다. 즉 [Ab]=[AbAg]이다. 그러므로, 상대적 친화상수

이다. 이 계산에 의한 데이타는 표 3에 나타내었다. 실제의 항원 농도는 보다 더 낮을수도 있기 때문에(만일 제조물이 100% 순수하지 않고 다른 오염 단백질이 존재할 경우), Ka의 값은 최소 값이며, 사실은 보다더 클 수 있다.

[표 3]

Friguet등의 방법(1983)²⁰을 사용하여, 항-SIMA 모노클로날과 항-LIMA 모노클로날이 각각 SIMA와 LIMA 분자상의 동일한 항원 결정인자에 결합하였는지를 검사했다. 한계량의 항원-피복 플레이트를 사용하여 각항체의 역가를 개별적으로, 그리고 모든 가능한 조합(pairing)상태로 측정했다. 이 실험에서 생성된 모든 모노클로날들은 상기 해당 분자상의 동일한 또는 중복된 항원 결정인자에 결합하는것으로 밝혀졌다.

[실시예 2]

[체외(in vitro)진단 면역분석법]

혈액 샘플중에 순환하는 뮤신을 검출하기 위해 개발된 두가지 면역분석법을 이하에 제시한다 :

A. 경쟁적 ELISA

(ⅰ) 이분석법을 구성하는 각 단계들을 제5도에 나타내었다. 예비 실험결과 헤파린 처리 또는 EDTA 처리 또는 비처리된 혈액에 가해진 뮤신은 모두 회수될 수 있으며 희석된 혈장 또는 혈청중에서 정량될 수 있음이 확인되었다. 이 면역 분석법에 가해진 비희석 혈장 또는 혈청은 간섭을 일으키지만, 1/10희석된 혈장을 사용하더라도 분석상에 별다른 효과는 관찰되지 않는다(cf. 수성 완충제). 결장 직장암 환자,, 궤양성 대장염 환자와 건강한 대조용 인체로부터 얻어진 일련의 혈액 샘플을 경쟁적 ELISA를 사용하여 SIMA와 LIMA에 대하여 분석했다. SIMA 또는 LIMA를 첨가시킨, 건강체로 부터 얻어진 혈장을 표준 물질로 사용했다. 고 농도의 SIMA 및/또는 LIMA가 여러 단계의 결장직장암 환자들 23명중 13명(약 60%)에서 검출되었고, 고농도의 LIMA(SIMA는 아님)가 궤양성 대장염 환자 5명중 4명에게서 검출되었다. 7명의 건강한 대조용 인체들로 부터 얻어진 혈액 샘플에서는 이 방법으로 SIMA 또는 LIMA를 전혀 검출할수 없었다.

(ⅱ) 뮤신이 저 농도에서 검출될 수 있는지를 측정하기 위하여, 혈장 샘플로 부터 뮤신을 추출하고 농축하기 위한 방법을 고안했다. 동 부피의 2m과 염소산(PCA)을 15분간 실온에서 혈청 또는 혈장 샘플에 가했다. 이 샘플들을 8,000xg에서 2분간 원심분리하여, 상청액을 제거하고, 그 펠릿을 원 샘플부피의 2배량에 해당하는 PBS로 세척하여 혼합하고, 상기와같이 원심분리 시켰다. PBS를 합친 상청액에 가하여 최종 부피가 원 샘플부피의 10배가 되게 한다. 이 샘프들을 Minicon B 15농축기(MW 한계치(=cut-off)15,000, Amicon Co.)에서 10배로 농축/투석했다. 그후, 이 샘플을 원샘플의 10배로 희석하고 50배로 농축시켰다. 그 결과 얻어진 PCA 추출물은 원샘플 부피의 1/5이 되었다. 이 샘플을 전술한 바와같은 경쟁적 ELISA 방법으로 분석했다. 건강한 개체로 부터 얻어진 혈장 샘플에 여러가지 농도로 뮤신을 첨가하고 상기 과정으로 처리한후, 얻어진 혈장샘플을 표준 물질로사용했다. 결장직장암 환자 39명과 유방암 환자 2명, 궤양성 대장암 환자 5명 및 대조군 7명으로부터 채취한 샘플에 대해 SIMA 분석을 실시한 결과, SIMA 항원 활성이 일부 대조군에서 저농도로 검출될 수 있으며 암환자중 2명을 제외한 모든 환자에게 고농도로 검출된다는 것을 알았다. 단계 B(다른 기관으로 전이되지 않은 단계)의 결장직장암 환자로 부터의 샘플 60%, 단계 C(국소 림프절에서 검출 가능한 전이 현상이 나타난 단계)로 부터의 91%, 단계 D(간과 같은 먼 기관으로 암이 확산된 유포단계)로 부터 86%가 대조군에 비하여 고농도의 뮤신을 함유하고 있었다. 단계 A의 결직장암 환자 1명과 유방암 환자 2명으로 부터 얻은 혈액 샘플에서 SIMA가 또한 검출되었다.

LIMA 분석은 SIMA 분석에서 사용된 농축/투석의 단계없이, 희석된 혈청 샘플에 대해서만 실시되었다. 초기 결장 직장암의 환자중 소수만이 측정가능한 LIMA를 함유하고 있었는데, 즉 단계 B의 11%와 단계 C의 29%가 함유하고 있었고, 단계 D의 암 환자의 경우 상당수(67%)가 고농도의 LIMA를 갖고 있었다. 궤양성 대장암 환자중 많은 수의 환자(80%)가 비교적 감도가 낮은 이 분석법으로는 고농도의 순환성 LIMA가 존재한다는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로, 이 LIMA 분석법은 염증성의 대장 질환을 검출하는데 의미있는 중요한 것이다.

B. 샌드위치 면역분석법

상기 상술한 모노클로날 항체가 또한 샌드위치 면역 분석법에서 사용될 수 있다. 이 분석방법은 분석의 감도를 증가시키는 것외에도, 전술한 경쟁적 억제 분석법에서 보다더 적은 반응단계를 포함하는등 많은 장점을 가지고 있다. 또한, 샌드위치 면역분석법에서 “시그널”(예, 웰내에서 방사능활성 또는 효소-표지된 항체-색상을 이용한)은 뮤신 항원 농도에 정비례하며, 이로써 경쟁적 억제분석 법과 비교해 볼때 얻어진 결과의 계산 및 처리과정이 상당히 간단해 지는 장점을 갖고 있다.

이 분석 방법은 뮤신 분자를 고정시키기 위해 모노클로날 항체로 피복한 고체 표면과 피복된 항체에 결합한 뮤신의 존재를 검출하기 위한 상기와 동일한 표지된(¹²⁵I 또는 효소로)모노클로날 항체를 포함한다.(제6도참조).

a. SIMA 또는 LIMA 방사면역분석법(RIA)에 관한 상세설명(제6도)

1. 밀리타이터 HA플레이들(Millipore Corporation, USA)를 사용하는 경우, 웰들은 코팅완충제(소듐 카르보네이트/바이카르보네이트 완충제 pH 9.6, 각 웰당 50μl)로 희석된 단백질 A-정제된 모노클로날항체 IgG(약 10μg/ml)로 피복시킨다. 플레이트들을 3-5시간동안 37℃에서 항은 보존시킨다.

2. 100μl의 혈청 샘플 또는 표준물질에, 200μl의 0.2M소듐 아세테이트(pH 5.0)를 가하고, 70±1℃에서 15분간 가열한후 9,000xg로 10분간 원심분리한다. 상기 표준 물질은 건강한 인체에서 얻어진 혼주 혈청중에서 제조된 것으로 0,1.5,5.0,15,50,150과 500μ/ml의 SIMA 또는 LIMA를 함유하고 있다.

3. 1% BSA가 함유된 PBS로 희석한¹²⁵I-표지된 모노클로날 항체를 아세테이트 추출물 상청액(약 0.1μCi+100μl상청액)에 가하고, 37℃에서 1시간동안 배양한다.

4. 상기 마이크로타이터 플레이트의 피복된 웰들을 PBS/Tween으로 4회 세척하고 그 플레이트를 30분간 37℃에서 PBS중의 1% BSA로 차단시킨다.

5. 차단후, 그 플레이트를 PBS/Tween으로 3회 세척한다.¹²⁵I-표지된 항체와 함께 예비배양시킨 샘플(두벌의 웰에서 각 웰당 50μl)을 그 상기 웰에 가하고, 하룻밤동안 4℃에서 배양시켰다.

6. 하룻밤동안 배양한후, 그 웰을 PBS/Tween으로 5회 세척하고, 얼룩 건조(blotted dry)시킨후, 각 웰의 바닥에서 그 여과지를 펀치제거 하여서 감마-계수기로 계측한다.

SIMA와 LIMA농도는 SIMA와 LIMA표준 물질의 단백질 함량에 대해 결정된 임의적인 유닛/ml 단위로 표시한다.

샌드위치 분석법의 신뢰도와 재현성을 평가하기 위하여 많은 실험들이 실시되었다. 표 4에는 대조용 혈청을 전형적으로 분석했을때 삼회 중복 측정시 얻어진 변이 정도를 나타내었다. SIMA의 혈청 분석에 있어서, 그 변이 성은 1.5μ/ml의 농도에서 최고(cv=10%)가 되는데, 이때 그 분석은 신뢰도가 없는 것으로 간주한다(그러므로 5μ/ml이하의 SIMA에 대한 모든 값에는 특별한 의미가 없다). 5 내지 500U/ml SIMA의 혈청 농도에 대하여, 분석질시 회차간의 변이정도는 5.6%이하이다.

[표 4]

b. LIMA 효소 면역분석법(EIA)의 상세설명(제7도)

1. 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Nunc Immuoplates)를 바이카르보네이트 완충제중의 항-LIMA 모노클로날항체 IgG(예, 하이브리도마셀 라인 2C3으로 부터 얻은것)로 3시간동안 37℃에서 피복한다. 이 플레이트를 세척완충제(PBS/Tween/소듐아지드, pH 7.2-7.6)로 2회 세척하고 배수시킨다.

2. 50μl의 차단 용액(소듐 아지드를 함유하는 PBS중에 용해된 송아지 혈청 알부민, pH 7.4)를 플레이트의 각 웰에 가하고 37℃에서 1시간동안 항온보존시킨다.

3. 100μl의 LIMA 표준용액(소듐 아지드를 함유하며, 1ml당 0,1.5,5,15,50,150과 500유니트의 항원 농도가 되도록 표준 LIMA를 정상 인체 혈청에 용해시킨 것) 또는 혈청 샘플에 200μl의 아세테이트 추출 완충제(소듐아지드를 함유하는 0.2M 소듐 아세테이트 pH 5.0)를 가하고, 70±1℃에서 15분간 가열한다. 실온으로 냉각시키고 10,000xg로 10분간 스윙아웃로터(Swing out rotor)에서 원심분리한다.

4. 마이크로타이터 플레이트를 세척 완충제로 3회 세척하고 배수시킨다.

5. 아세테이트/가열-처리된 표준 샘플 또는 혈청 샘플로부터 상청액 50μl를 취해 각 웰(각 샘플당 2개웰)에 가한다. 이 플레이트를 37℃에서 1시간동안 배양한다.

6. 마이크로타이터 플레이트를 세척완충제로 4회 세척한후 배수시킨다.

7. 각 웰에 50μl의 알카리 포스파타제-결합된 항-LIMA모노클로날 항체를 가하고 1%소 혈청 아부민을 함유하는 포스페이트 완충 식염수로 1 : 300으로 희석한다. 37℃에서 1.5시간 동안 배양시킨다. 세척 완충액으로 4회, 증류수로 3회 세척한 후 배수시킨다. 각 웰에 기질 희석 완충제(0.1M의 염화 마그네슘을 함유하는 0.2M의 소듐 카르보네이트/바이카르보네이트 완충제)1ml당 2mg의 농도로 용해시킨 기질(p-니트로페닐 포스페이트)100μl를 가한다. 37℃에서 20분간 배양한다.

8. 각 웰에 100μl의효소 반응 정지 용액(0.05M 수산화나트륨)을 가한다.

9. 적합한 마이크로타이터 플레이트 판독기내의 405nm에서 광학 밀도를 측정한다.

[시험과결과의 평가]

(ⅰ) 각 LIMA 표준 물질에 대해 얻어진 광학밀도(Y축)을 상응 LIMA 농도(X축)에 대하여 그래프화함으로써 표준 곡선을 작성한다.

(ⅱ) 각 혈청 샘플에 대한 평균 광학 밀도를 사용하여, 상기 표준 곡선으로 부터, LIMA의 해당 농도를 유닛/ml 단위로 측정한다.

표준 곡선상에서 판독할 수 있는값을 얻기 위해서 샘플을 부가적으로 희석할 필요가 있다면(즉, LIMA농도＞150U/ml인 경우)혈청내의 실제 LIMA 농도를 얻기 위해서는 표준 곡선에서 얻어진 값에 적합한 희석률을 곱해야 한다. 한예를 표 5에 제시하며, 제8도는 표 5의 데이타에 의해 작성되었다.

[표 5]

상기 LIMA EIA의 재현성에 관한 한예를 표 6에 제시하였으며, 이 표로 부터 상이한 양의 LIMA를 함유한 혈청 샘플의 분석에서 삼회 측정했을때 각 측정회차 사이에 변이성이 관찰됨을 알 수 있다. 이 변이성(Variability)은 1.5u/ml(변이계수 10%)이하의 값 또는 150u/ml(c.v.12%)이상의 값에서 최대가 된다. 그러므로, 이 범위 밖의 혈청 농도(즉, ＜2 또는 ＞150u/ml)는 신뢰도가 없는 것으로 사료된다. 따라서 150μ/ml 이상의 LIMA를 함유하는 샘플은 희석하여 재 분석해야 한다.

[표 6]

c. 임상결과

하기 표 7은 여러 질병의 환자로부터 얻은 샘플과 건강한 대조인으로부터 얻은 샘플에 대한 SIMA와 LIMA RIA(상기 a참조) 및 CEA 혈청 분석의 결과를 나타낸 것으로서, 이는 SIMA 단독, LIMA 단독, CEA단독 또는 이들 물질이 임의의 조합상태로 동시에 존재하여 양성을 나타내는 샘플의 수를 비교할 목적으로 실험한 결과이다.

[표 7]

이 표에서, LIMA 농도≥10u/ml를 양성으로 판정하고, CEA값≥10을 양성으로 판정했다. SIMA 혈청 농도≥25μ/ml일때 양성으로 판정했다. 건강한 대조군 샘플은 1회 이상 반복 분석했을 때 ≥20μ/ml인 경우 양성으로 판정했다.

C. 기타 면역분석 과정

상기 “2-부위(two-site)”면역분석에 대한 변형 방법으로 고체상을 피복하기 위해 폴리클로날 항-뮤신 항혈청(예, 토끼 또는 양에서 생성됨)이 사용될 수 있다. 이로서 분석 “이차”항체로서 비표지된 모노클로날 항체를 사용한 후, 표지된 토끼 또는 양의 항-마우스 항체로 마우스 모노클로날을 검출할 수 있다.

이 시스템(또는 그 역으로 : 고체상-피복에는 모노클로날 항체를 사용하고, 검출에는 폴리클로날 혈청을 사용)은 하나의 모노클로날 항체를 직접 표지한 경우에 비해 양성의 시그널이 더 증폭되어 제공될 수 있다.

본 발명은 샌드위치 면역분석법에서 4-메틸움벨리페릴(4MU)-포스페이트 같은 형광 발생소원 효소 기질(알카리 포스파타제에 대하여) 또는 4MU-β-D-갈락토시드(β-갈락토시다제에 대하여)와 같은 형광 발생소원 효소 기질을 사용하는 방법을 포함한다. 전술한 색도계 방법에서 사용한 것과 동일한 효소결합된 모노클로날 항체를 사용할 수도 있다. 감도는 약 10배로 증가될 수 있다. 단백질 A, 아비딘-비오틴등과 같은 다른 공지된 검출시스템이 사용될 수 있다. 이 샌드위치 면역분석법에서 검출시스템으로 표지된 단백질 A가 사용될 경우에, 고체 상 피복용 항체(모노클로날 항체이든지 폴리클로날 항체이든지간에)는 F(ab) 분체(fragment)이며, 검출용 항체는 Fc 단편(segment)을 함유하는 완전하 분자일 것이다.

마이크로타이터 웰뿐만 아니라 여러 형태의 비이드(bead)와 같은 많은 상이한 고체상에 이 시스템에서 사용될 수 있다. 또한, 결합 항원에 대한 흡착표면으로서 막(멤브레인)이 사용될 수 있다.

[참고문헌]

Claims (15)

1. 환자로부터 채취된 생리학적 유체의 샘플내에 SIMA, LIMA 또는 SIMA와 LIMA가 존재하는지를 검출하기 위해 상기 샘플을 피검하는 단계를 포함하는, 뮤신 항원을 생산하는 암세포 또는 기타 세포의 존재를 검출하기 위한 체외 진단 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 샘플이 환자로부터 채취된 혈액, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 샘플을 SIMA에 대한 항체, LIMA에 대한 항체 또는 SIMA에 대한 항체와 LIMA에 대한 항체 또는 그것의 단편과 접촉시키는 단계, 그리고 이 항체 또는 그것의 단편이 상응하는 항원과 결합하였는지를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 샘플을 검출성 시그널을 제공할 수 있는 라벨로 표지된, SIMA에 대한 항체, LIMA에 대한 항체 또는 SIMA에 대한 항체 및 LIMA에 대한 항체 또는 그것의 단편과 접촉시키는 단계, 그리고 상기 표지된 항체 또는 그것의 단편이 상응하는 항원과 결합하였는지를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 그것의 단편이 효소 또는 방사성 동위원소로 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, (ⅰ) SIMA에 대한 항체, LIMA에 대한 항체 또는 SIMA에 대한 항체 및 LIMA에 대한 항체 또는 그것의 단편을 고체 지지체에 연결시키는 단계; (ⅱ) 상기 샘플을 상기 고체 지지체와 접촉시키는 단계; (ⅲ) 상기 고체지지체에 연결된 항체 또는 그 단편에 상기 샘플내의 상응 항원이 결합되어 있는지를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 상응 항원이 결합되어 있는지를 검출하는 단계는 (ⅳ) 검출성 시그널을 제공할 수 있는 라벨로 표지된 SIMA에 대한 항체, LIMA에 대한 항체 또는 SIMA에 대한 항체 및 LIMA에 대한 항체와 상기 고체 지지체를 접촉시키고; (ⅴ) 상기 고체지지체에 결합된 상응항원에 상기 표지된 항체 또는 그의 단편이 결합했는지를 검출하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 환자로부터 채취된 생리학적 유체 샘플내에 SIMA, LIMA 또는 SIMA와 LIMA가 존재하는지를 검출함으로써 뮤신항원을 생산하는 암세포 또는 기타세포가 환자내에 존재하는 지를 검출하기 위한 체외진단용 키트로서, 이키트는 상기 SIMA, LIMA 또는 SIMA 및 LIMA와 면역 반응할 수 있는 항체 또는 그의 단편, 그리고 이 항체 또는 그의 단편과 상기 샘플내에 존재하는 항원 사이에서 면역반응이 존재함을 표시해주는 인디케이터 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 체외진단용 키트.
10. 제9항에 있어서, 상기 항체 또는 그것의 단편은 고체 지지체에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
11. 제9항에 있어서, 상기 인디케이터 수단은 상기 항체 또는 그것의 단편에 결합되어 검출성 시그널을 제공할 수 있는 라벨을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
12. 제9항에 있어서, 상기 인디케이터 수단은 검출성 시그널을 제공할 수 있는 라벨을 포함하며, 이 라벨은 상기 일차 항체에 대하여 유발된 이차 항체에 결합되어, 상기 일차 항체와 결합함으로써 면역반응이 발생하였음을 표시해주는 것을 특징으로 하는 키트.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 라벨은 효소 또는 방사성 동위원소인 것을 특징으로 하는 키트.
14. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 그것의 단편이 효소 또는 방사성 동위원소로 표지된 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 키트.

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