DK170005B1 - In vitro diagnostisk fremgangsmåde og sæt eller system til detektering af forekomst af kræftceller eller andre mucinantigenproducerende celler hos en patient - Google Patents

Description

i DK 170005 B1

Opfindelsen angår in vitro diagnostisk fremgangsmåde og sæt eller system til detektering af forekomst af kræftceller eller andre mucinantigenproducerende celler hos en patient.

5 Dødeligheden på grund af kræft i mave-tarmkanalen regnes som nummer 2 efter lungekræft hos mænd og brystkræft hos kvinder. Selv om der er ofret megen opmærksom på disse forhold, er dødeligheden ikke blevet væsentligt reduceret i de senere år. Tidlig detektion er væsentlig for, at der skal indtræffe en forbedring af overlevelses-10 tallene. Kræftceller producerer undertiden stoffer, som ikke kan detekteres, eller som kun findes i meget små mængder i sunde individer. Dette særkende kan anvendes til udvikling af innovative diagnosemetoder. Prøver rettet mod detektering af disse til kræft knyttede stoffer er af stor hjælp ved differentieringen mellem 15 individer med cancer og sunde individer.

Det carcinoembryone antigen (CEA) er det mest vidtudforskede antigen, der er knyttet til kræft i mave-tarmkanalen, og ganske givet det mest studerede af alle tumorforbundne antigener. Dette 20 antigen forekommer i det humane fosters mave-tarmkanal, men forekommer ikke eller kun i ringe omfang i den normale colon hos voksne. CEA blev første gang påvist ved human tyktarmskræft af Gold q og Freedman i 1965 . CEA forekom i blodet hos sådanne kræftpatienter, og det blev derfor først betragtet som et oncoføtalt 25 antigen, hvilket gav stort håb om tidlig diagnose af kræft i det humane fordøjelsessystem. Efterfølgende har det vist sig, at analyse for CEA i blodet ikke er specifik nok til at være af værdi for den tidlige diagnose af kræft i mave-tarmkanalen, fordi det ofte er forhøjet ved flere ikke-neoplastiske tilstande omfattende bronkitis 5° hos rygere og leversygdom^. For eksempel udviser 10% af den normale population falske positive resultater for så vidt som, at disse individer har forhøjede CEA-indhold i blodet, selv om de ikke har kræft og end ikke godartede tumorer. For det andet er CEA ofte ikke 11-13 målelig i patienter med selv ret store tumorer , det vil sige, 35 at der er en betydelig falsk negativ hyppighed (ca. 50% af patienterne med kræft i mave-tarmkanalen udviser ikke forøget CEA-indhold i blodet). På trods af disse begrænsninger er CEA analyser dog stadig af betydelig værdi ved præoperativ vurdering og postoperativ behandling af kræftpatienter. CEA-analyser udgør ca.

2 DK 170005 B1 40¾ af gængse prøver for kræft.

Alfa-føtalprotein (AFP) (eng.: alpha fetoprotein) er et andet oncoføtalt antigen, der findes i høje koncentrationer i fostret men 5 ikke i normale voksne. Forøgede blodkoncentrationer af AFP forekommer i patienter med primær leverkræft, sekundære levertumorer og i hovedparten af tilfældene af visse typer testi kel kræft (teratoma); men også ved toksisk leverbeskadigelser og cirrhose. På trods af denne tilsyneladende begrænsede anvendelighed, repræsen-10 terer AFP ca. 20% af de gængse, udførte prøver for kræft.

For nylig er monoklonalt antistofbaserede radioimmunanalyser til

TM

bestemmelse af det tumorforbundne antigen CA 19-9 blevet

14-19 TM

kommercielt tilgængelige . Denne CA 19-9 analyse påstås at 15 have stor følsomhed og specificitet for alle stadier af kræft i pancreas, men med hensyn til påvisning af colorectal kræft synes denne analyse at have lav sensitivitet.

I 1980 blev et nyt mucinglucoproteinantigen isoleret fra kræft i 20 tyktarmen1. Dette stof forekommer også i normal tyndtarm hos voksne, og er derfor blevet kaldt "tyndtarmsmucinantigen" (SIMA) (eng.: "small intestine mucin antigen"). SIMA viste sig at være et oncoføtalt antigen, idet det i 8-12 uger gamle fostre findes overalt i hele mave-tarmkanal en, på fødselstidspunktet er det under normale 25 forhold ikke længere påviseligt andre steder end i tyndtarmen, men SIMA findes i kræft fra mange dele af mave-tarmkanal en og andre organer. Et andet mucinstof omtalt som "tyktarmsmuci nantigen" (LIMA) (eng.: "large intestine mucin antigen") er også blevet isoleret fra normal tyktarm. LIMA har også vist sig at være et oncoføtalt antigen 30 og produceres i varierende omfang af flere kræfttyper. Omfattende immunohistologiske undersøgelser har vist, at LIMA er antigent forskellig fra SIMA, og begge er også forskellige fra CEA. Disse * tarmforbundne mucinantigener er også blevet påvist i visse tumorer fra maven, galdeblæren, lunge, bryst og ovarium, såvel som ved 35 præmaligne forhold i ovennævnte organer, (referencerne 1-8).

Resultater fra immunohistokemisk farvning under anvendelse af anti-SIMA og anti-LIMA monoklonale og polyklonale antistoffer fra normalt fostervæv og væv fra voksne og kræft fra forskellige organer 5 3 DK 170005 B1 er vist i tabel 1.

TABEL 1 Oversigt over SIMA og LIMA fordeling i humane væv - immunohistokemiske undersøgelser.

Fostervæv 18-40 uger I SIMA LIMA

mave + + tyndtarm + tyktarm 8-12 uger + 10 13-40 uger - +

Normale, fuldt udviklede væv mave tyndtarm + I5 tyktarm - + galdeblære ovarium bryst lungecarcinom - + 20 kræft coloncarcinom + + mavecarcinom + + ovariumcarcinom + + 25 galdeblærecarcinom + + brystcarcinom + lunge - +

For første gang er det nu blevet opdaget, at på trods af den høje 30 molekylvægt af disse mukøse glycoproteiner kan SIMA og LIMA detekteres i blodserum fra en stor del af patienter med tyktarmskræft ved brug af diagnostiske antistofanalyser. SIMA og LIMA findes ikke i målelige mængder eller findes i meget små mængder i blodsera fra sunde kontrolpersoner. Indledende undersøgelser omfat-33 tende en lille gruppe af tilfælde viser allerede, at kombinationen af SIMA- og LIMA-prøver kan anvendes til detektering af ca. 80% af patienterne med colorectal kræft, hvorimod anvendelse af CEA-prøver alene kun detekterer ca. 56% af sådanne kræfttilfælde. Disse SIMA-og LIMA-analyser er også mere følsomme end CEA-analyser ved 4 DK 170005 B1 detektering af B og C kræftstadier (Duke's klassifikation). Ydermere kan LIMA påvises i blodet fra en stor del af patienter med ulcerøs colitis i colon. Sådanne patienter udvikler hyppigt tyktarmskræft.

Ligeledes kan SIMA og LIMA anvendes til detektering af forekomst af 5 præcancerøse tilstande. *

Betegnelserne SIMA og LIMA anvendes i nærværende beskrivelse ikke kun til at betegne de mucinantigener, der er beskrevet mere detaljeret nedenfor, men også dele deraf, som antigent er forbundne 10 hertil, og som kan forekomme i fysiologiske væsker, navnlig blodserum eller plasma.

Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der således en in vitro diagnostisk fremgangsmåde til detektering af forekomst af 15 kræftceller eller andre celler, der producerer mucinantigener, hos en patient, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en prøve af fysiologisk væske, der er udtaget fra patienten, undersøges til detektering af forekomst eller fravær af tyndtarmsmucinantigen (SIMA) og/eller tyktarmsmucinantigen (LIMA) i prøven.

20

Fremgangsmåden omfatter fortrinsvis, at en prøve af en fysiologisk væske, der er udtaget fra patienten, kontaktes med monoklonalt eller polyklonalt antistof til SIMA og/eller LIMA eller fragmenter af antistoffet, eller med antistoffet eller fragmenter heraf mærket med 25 et mærkningsmiddel, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart signal, og at forekomst af binding af antistoffet eller fragmenter heraf, eller af det mærkede antistof eller fragmenter heraf, til det korresponderende antigen detekteres.

30 Særligt foretrukne fysiologiske væsker til anvendelse ved disse diagnostiske fremgangsmåder er blod, blodserum eller plasma.

Opfindelsen angår også et in vitro diagnostisk sæt eller system til detektering af forekomst af kræftceller eller andre celler, der 35 producerer mucinantigener, hos patienter, hvilket sæt eller system er ejendommeligt ved, at det omfatter midler til detektering af forekomst af tyndtarmsmucinantigen (SIMA) og/eller tyktarmsmucin-antigen (LIMA) i en prøve af en fysiologisk væske udtaget fra patienten.

5 DK 170005 B1 I et særligt aspekt af opfindelsen tilvejebringes der et in vitro diagnostisk sæt eller system til detektering af forekomst af SIMA og/eller LIMA i en prøve af en fysiologisk væske, såsom blod eller blodserum, udtaget fra patienter, hvilket sæt eller system omfatter 5 monoklonale eller polyklonale antistoffer, der er i stand til immunreaktion med SIMA og/eller LIMA eller fragementer heraf, tillige med indikatormidler til indikering af forekomst af en immunreaktion mellem antistofferne og deres korresponderende antigener.

10 I en særlig udførelsesform for dette aspekt af opfindelsen omfatter diagnosesystemet yderligere en komponent, der er bundet til en fast bærer, hvilken komponent omfatter enten (i) SIMA og/eller LIMA, eller (ii) antistoffer, der er i stand til immunreaktion med SIMA 15 og/eller LIMA.

Dette aspekt af den foreliggende opfindelse omfatter et antal af udførelsesformer, der udnytter forskellige former for indikatormidler. I et aspekt af opfindelsen omfatter indikatormidlet et 20 mærkningsmiddel, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart signal, hvilket mærkningsmiddel er bundet til de antistoffer, der er i stand til immunreaktion med SIMA og/eller LIMA. I et andet aspekt omfatter indikatormidlerne imidlertid et mærkningsmiddel, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart signal, hvilket 25 mærkningsmiddel bindes til andre antistoffer, og disse andre antistoffer er frembragt med førstnævnte antistoffer og indikerer forekomst af immunreaktionen ved binding til førstnævnte antistoffer. Ved et yderligere aspekt kan indikatormidlerne omfatte Staphylococ-protein A med et hertil bundet mærkningsmiddel. De 50 anvendte mærkningsmidler kan i enhver af disse udførelsesformer omfatte kendte enzymer, radioaktive grundstoffer, fluorescerende kemikalier eller forbindelser, såsom biotin.

Anvendelsen af immunanalyser for SIMA og LIMA har gjort det muligt 55 detektere disse mucinantigener i alle stadier af colorectal kræft. Disse resultater godtgør derfor dette system som værende potentielt

TM

mere anvendeligt og værdifuldt end de ovenfor omtalte CA 19-9 -eller CEA-analyser.

6 DK 170005 B1

Selv om den foreliggende opfindelse primært er rettet mod detektering af mukøs kræft, vil det også forstås, at immunanalyser for SIMA og LIMA er af værdi ved detektion af betændelsestilstande, såsom ulcerøs colitis eller mavesår, såvel som ved detektion af præ-5 cancerøse stadier.

Som det fremgår af foranstående beskrivelse, kan de heri omtalte * mucinantigener SIMA og LIMA for det første karakteriseres ved den kilde, fra hvilken de er isoleret (ved anvendelse af metoder 10 beskrevet i detaljer nedenfor). Yderligere karakterisering og identificering af disse antigener kan opnås ved anvendelse af polyklonale og monoklonale anti-SIMA- og anti-LIMA-antistoffer og ved immunohistokemiske metoder, hvorved der for eksempel benyttes "kompetitiv" immunanalyseteknik til detektering af antigen aktivitet I5 ved inhibering af bindingen af anti-SIMA- eller anti-LIMA-antisera til specifikke mave-tarmkanalvæv.

Yderligere detaljer ved den foreliggende opfindelse vil blive omtalt nedenfor. Det skal dog bemærkes, at immunanalyser for SIMA og/eller 20 LIMA ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringer et meget følsomt diagnostisk værktøj til detektering af kræftceller eller andre mucinantigenproducerende celler hos en patient, navnlig ved den præoperative undersøgelse af kræftpatienter med henblik på opnåelse af en indikation af omfanget af tumorbelastningen og for at 25 opnå en basisvurdering af postoperativ efterbehandling af kirurgisk behandlede patienter eller af patienter, der er behandlet på en hvilken som helst anden måde (for eksempel radioterapi og kemoterapi), med henblik på detektering af tilbagefald til et behandleligt stadium eller til overvågning af behandlingens 30 effektivitet. Ved sådanne anvendelser kan diagnosesystemet ifølge den foreliggende opfindelse til at begynde med kombineres med immunanalyser for CEA eller andre kendte tumorforbundne antigener, s hvilke for tiden anvendes i disse situationer. Ydermere kan SIMA/ LIMA-diagnosesystemer (eventuelt i kombination med CEA) anvendes til 35 screening af populationer med stor risiko for udvikling af tarmkræft, for eksempel patienter med ulcerøs colitis eller mavesår, et område hvor CEA diagnosesystemer alene efter indledende forsøg har vist sig ikke at have nogen diagnostisk værdi.

7 DK 170005 B1

Ved arbejdet, der førte til den foreliggende opfindelse, blev adskille!ige monoklonale antistoffer frembragt ved vaccination af mus med mucinpræparater ekstraheret fra tyktarmskræft. Immunohis-tokemisk farvning af væv blev anvendt til at klassificere 5 af disse 5 monoklonale antistoffer som anti-SIMA (reagerende med tyktarmskræft og normal tyndtarm) og 5 som anti-LIMA (reagerende med tyktarmskræft og normal tyktarm). Immunokemiske analyser viste, at affiniteten af antistofferne varierede med så meget som 100 gange i hver klasse.

10 De efterfølgende eksempler illustrerer fremstillingen og karakteriseringen af mucinantigener, fremgangsmåder, der for tiden anvendes ved fremstilling af polyklonale og monoklonale antistoffer til SIMA og LIMA og anvendelsen af disse monoklonale antistoffer i in vitro diagnostiske metoder til detektering af forekomst af kræft eller 15 andre mucinantigenproducerende celler i en patient ifølge med den foreliggende opfindelse.

EKSEMPEL 1 20 A. Oprensning og karakterisering af mucinantigener.

Muciner blev ekstraheret fra operationsprøver opnået ved udskæring af colorectalt kræftvæv. Områder af normal tyktarm længst væk fra tumoren blev opnået fra væv fjernet sammen med tumorerne, og blev 25 undersøgt ved lysmikroskopi til bekræftelse af deres normale udseende forud for anvendelse. Prøver af normal duodenum, jejunum og colon blev også opnået ved obduktion af ulykkesofre. Muci ner blev ekstraheret fra prøver af colonkræft (LIMA og SIMA), normal tyktarm (LIMA) eller normal duodenum eller jejunum (SIMA) ved de nedenfor 50 beskrevne fremgangsmåder.

Det til vaccination af mus til produktion af monoklonalt antistof og screening anvendte mucinpræparat blev fremstillet ud fra en cancerprøve diagnostiseret histologisk som en "delvis mucøs" adenocarcinom 35 fra sigmoide colon. Vævsprøven (på ca. 5 g) blev skåret i små stykker, derefter homogeniseret i 10 volumen af 4 molær guanidinhydrochlorid indeholdende 24 mM EDTA, 10 mM N-ethylmalein-syreimid og 1 mM benzamidin HC1. Efter centrifugering ved 20.000 x g i 20 min. blev småkuglerne reekstraheret med frisk 8 DK 170005 B1 guanidinhydrochlorid. Mucinet i de forenede supernatanter blev derefter justeret til en vægtfylde på 1,35 g/ml med cæsiumchlorid og centrifugeret ved 105.000 x g i 64 timer. Den resulterende gradient blev separeret i 6 lige store fraktioner varierende i vægtfylde fra 5 1,25 til 1,55 g/ml. Hver fraktion blev dialyseret mod destilleret vand og analyseret for protein (modificeret Bradford analyse) og hexose 21, såvel som for antigen aktivitet ved bestemmelse af dets » evne til at forhindre specifik immunfluorescerende farvning af mave-tarmkanalvæv ved anti-SIMA- og anti-LIMA-antistoffer og ved immunanalyser, der benytter monoklonale antistoffer (se detaljer nedenfor). Fraktionen indeholdende den højeste antigene aktivitet refraktioneres med CsCl gradienter, og fraktionerne analyseres som skrevet ovenfor.

15 fil LIMA

LIMA blev fundet i bunden af 2 eller 3 fraktioner af gradienten med en densitet på 1,34 til 1,55 g/ml. LIMA præparaterne var polydisperse men fandtes almindeligvis med højeste antigenaktivitet 20 på ca. 1,4 + 0,08. Antigen aktivitet, hexose- og proteinindhold for hver fraktion af en typisk tredje CsCl-gradientcentrifugering af et LIMA-præparat er vist i fig. la. Hexose/proteinforholdene (vægt/vægt) for fraktionerne 2 og 3 var 0,5 henholdsvis 0,25.

Toppene for hexose, protein og antigen aktivitet var ikke sammen-25 faldende; fraktion 3 indeholdt størstedelen af den antigene aktivi tet. Det totale udbytte af LIMA fra et typisk eksperiment er, bestemt ved enzymforbundne immunanalyser (EIA), på ca. 35% af det, der forekommer i et vævshomogenat. Den totale oprensning af LIMA er af størrelsesordenen 1000 gange. SIMA detekteres normalt ikke i LIMA 30 præparater fra normal tyktarm. Den vellykkede anvendelse af LIMA præparater i Hsandwich"-immunanalyser (hvor det samme monoklonale antistof skal bindes mere end en gang til molekylet) indicerer, at i den antigene determinant, som genkendes af de monoklonale antistoffer, må gentages mindst to gange på molekylet.

35

Den høje molekylvægt af LIMA indiceres af dets manglende evne til at trænge ind i 7% polyacrylamidelektrophoresegeler. Yderligere undersøgelser med anvendelse af gel fil treringskromatografi viste, at LIMA-antigenet eluerede i porevolumenet af Sepharose 6B (som 9 DK 170005 B1 adskiller gi obulære proteiner i det omtrentlige molekylvægtsområde: 1 x 10^ - 4 x 10®, og dextraner med molekylvægten: 10^ - 10® -

Pharmacia katalog specifikationer) og Sepharose 2B (fraktionerer 4 7 globulære proteiner med molekylvægtsområde fra 7 x 10 til 4 x 10 , 5 og dextraner i området: 10® - 2 x 10^). Gel kromatografi af LIMA på Sephacryl 1000 kolonne (1 cm x 65,5 cm) elueret i 10 mM phosphatpuf-ferjusteret saltopløsning (adskiller dextraner i molekylvægts-

C O

området: 5 x 10 - 10') er vist i fig. 2a. Hovedparten af LIMA- antigen aktivitet var inkluderet i denne matrix og blev elueret som 10 en bred top, hvilket kan indicere polyd ispers i tet af LIMA præparatet. En lignende grad af polydispersitet ses ved mange andre proteo-glycanmolekyler og kan opstå, for eksempel ved variationer i strukturen eller aggregering, som påvirker molekylvægten men ikke antige-niciteten af sådanne molekyler.

15

For bedre at kunne bestemme størrelsen af LIMA, blev et antal præparater underkastet ultracentrifugering i glycerol gradienter (10% til 20%) for at opnå en bestemmelse af sedimentationskoefficienterne (Beckamn $W 50 Ti rotor, 22.000 opm x 15 t eller 42.000 opm x 5 t 20 ved 4°C). Gradienterne blev fraktioneret, og hver fraktion analyseret for antigen aktivitet ved en "sandwich" analyse. En typisk LIMA-gradient er vist i 3a. Fra disse og andre gennemløb blev de vægtede gennemsnitlige s-værdier bestemt ved følgende ligning: 25 $ In Rt - In Ro χ 1013 u2 x t 3600 hvor 1 betegner vinkelhastigheden, t betegner centrifugeringstiden (timer), Ro er omdrejningsradius for toppen af gradienten og Rt er 30 den vægtede gennemsnitlige radius til hvilken toppen for antigenici-tet havde bevæget sig. Den gennemsnitlige s-værdi beregnet ud fra adskillige forskellige forsøg var 9,5 + 1,5.

LIMA blev underkastet et antal forskellige fysiske, kemiske og 35 enzymatiske behandlinger med henblik på opnåelse af yderligere information omkring naturen af antigenet; disse er opsummeret i tabel 2. Antigeniciteten af LIMA i en "sandwich"-analyse var stabil ved opbevaring i mindst 1 måned ved 40°C eller i op til 5 min. ved 100°C. Kogning i 10 min. eller længere resulterede i 40% tab af 10 DK 170005 B1 aktivitet. Denne stabilitet af LIMA ved kogning tyder på, at antigenet kan være et stærkt glycosyleret molekyle, og at epitopen involverer eller beskyttes af kulhydrater. Alkalisk behandling af LIMA til spaltning af O-glycosidiske bindinger mellem kulhydrater og 5 protein blev udført med forskellige koncentrationer af KOH: 0,01 M, 0,05 M, 0,10 M, 0,25 M og 0,50 M (ved 4°C i 2, 4 eller 16 timer), efter hvilke behandlinger 85%, 70%, 70%, 55% henholdsvis 45% af den * antigene aktivitet var tilbage. Tilsætning af en nucleophil, såsom 2-mercaptoethanol (0,1 M) muliggjorde, at Ø-eliminationsreaktionen 10 kunne foregå under mildere betingelser (0,01 M KOH, ved 4°C i 4 timer) med et resulterende tab på 55% af den antigene aktivitet. Ud over det delvise tab af antigen aktivitet forårsaget af al kalibehandl ingen af LIMA udviste analyser på glycerolgradienter en væsentlig reduktion af den vægtede gennemsnitlige s-værdi (5,5), 15 hvilket indicerer en formindsket molekylvægt (fig. 3a). Forsøg på reduktion af LIMA (i 6 molær guanidin-HCl, 0,5 M Tris pH 8,1, 0,002 M EDTA, og 10 mM dithiothreitol ved 50°C i 2 timer, 4 timer eller 16 timer fulgt af alkylering med 0,4 M iodoeddikesyre ved 4°C natten over) havde ingen væsentlig effekt på den antigene aktivitet.

20

Omsætningsforsøg med et antal stærkt oprensede enzymer blev udført med henblik på bestemmelse af den kemiske natur af LIMA-antigenet.

Efter behandling blev prøverne kogt i 5 min. eller neutraliseret (pepsin) for at inaktivere enzymerne forud for en analyse. Hverken 25 pepsin eller cl ostri pain (afprøvet på adskillelige enzymkoncentrationer inkuberet med LIMA i 2, 4 eller 16 timer) udviste nogen væsentlig virkning på den antigene aktivitet af LIMA (tabel 2).

Papainfordøjelse (0,1 eller 1,0 mg/ml) af LIMA resulterede i et væsentligt tab af antigen aktivitet med kun 20% resterende aktivitet efter 2, 4 eller 16 timers fordøjelse, når den blev undersøgt med en "sandwich"-analyse. Ved analyse med en kompetitiv ELISA (hvor analysen ikke afhænger af multi valensen af epitoper på antigenet) var den tilbageblevne aktivitet efter 2 timers fordøjelse med papain 75%, efter 4 timer - 65% og efter 16 timer - 35%. Dette indebærer, 35 at under milde forhold af papainfordøjelse kan LIMA degraderes til fragmenter, hvoraf de fleste kun har en epi top og derfor ikke kan måles i en "sandwich"-analyse, men måles med en kompetitiv analyse.

Dette resultat beviser, at antigenet er noget følsom for papain, men er stort set resistent over for pepsin og clostripain.

DK 170005 B1 π

Ml) SIMA

SIMA blev fundet i 2 eller 3 fraktioner af gradienten med en vægtfylde på mellem 1,29 og 1,45 g/ml. SIMA-præparaterne var polydis-5 perse, men hovedparten af den antigene aktivitet blev almindeligvis fundet ved en vægtfylde på 1,38 + 0,05. Den antigene aktivitet, hexose- og proteinindholdet i hver fraktion af en typisk tredje CsCl-gradientcentrifugering af et SIMA-præparat er vist i fig. Ib. Hexose/proteinforholdene (vægt/vægt) for fraktionerne 3 og 4, i 10 hvilke hovedparten af den antigene aktivitet forekommer, var 1,5 henholdsvis 0,3. Udbyttet af SIMA fra en typisk colonkræftprøve er på ca. 40%, bestemt ved EIA. Den oprensning, der opnås ved disse fremgangsmåder, er på ca. 1000 gange, hvilket svarer til oprensningen af LIMA. De fleste colorectalekræftvæv blev fundet at inde-15 holde væsentligt LIMA såvel som SI^A, hvorimod ekstrakter fra prøver af normal duodenum og jejunum indeholdt SIMA men intet detekterbart LIMA. LIMA kunne fjernes fra "SIMA" præparater, der var opnået fra en colorectal kræftprøve, ved at lede de blandede mucinekstrakter gennem en anti-LIMA monoklonalantistofaffinitetskolonne. Identifika-20 tionen af SIMA i præparatet er baseret på reaktion med monoklonale antistoffer og i nhi bering af immunoflourescerende farvning af tyndtarm med polyklonale og monoklonale antistoffer. Som beskrevet for LIMA indicerer brugen af SIMA i en "sandwich"-immunanalyse tilstedeværelsen af en gentaget epitop på antigenmolekylet.

25

Som tilfældet var med LIMA, ville SIMA ikke trænge gennem 7% polyacrylamide! ektroforesegel er. Dog viste analyser ved gelfiltrering på Sepharose 2B kolonne (1,5 cm x 7 cm), elueret med 25 mM Tris pH 8,0 indeholdende 4 M guanidin-HCl, at SIMA blev inkluderet i gelen og 30 var polydispers, elueredes ud i et antal toppe (fig. 4) og havde en meget mindre molekylvægt end LIMA. SIMA blev også undersøgt på en Sephacryl 1000 kolonne og igen elueret som en bred top af meget lavere molekylvægt end det generelle LIMA-præparat (sammenlign med fig. 2a og b).

35 s-Værdier blev bestemt for et antal SIMA-præparater i 10% til 20% glycerolgradienter som beskrevet ovenfor for LIMA. En typisk SIMA-gradient er vist i fig. 3b. Den gennemsnitlige s-værdi beregnet ud fra et antal eksperimenter var 4,8 + 1,4, hvilket er meget mindre 12 DK 170005 B1 end værdierne for LIMA.

SIMA blev fundet at være mere stabil over for alkalisk behandling og kogning end LIMA. Der blev ikke observeret nogen væsentlig 5 forandring i antigen aktivitet ved anvendelse af betingelser som beskrevet ovenfor for den alkaliske behandling af LIMA. Ydermere blev den antigene aktivitet af SIMA ikke væsentligt påvirket af kogning i 5 min., og kun 6% af aktiviteten gik tabt efter kogning i 10 min. (se tabel 2).

10 SIMA blev fordøjet med et antal af stærkt oprensede enzymer som beskrevet ovenfor for LIMA (tabel 2). Clostripain havde ingen virkning på den antigene aktivitet af SIMA ifølge sandwich-EIA-analyse. Fordøjelse af SIMA med papain i 2 timer havde ingen virk-15 ning, hvorimod 50% af den antigene aktivitet gik tabt efter 16 timers fordøjelse. Pepsi nfordøjelse af SIMA resulterede i 70% tab af den antigene aktivitet, hvilket skal ses i kontrast til LIMA, som var resistent over for pepsin (10 jig/ml pepsin ved stuetemperatur natten over).

20 TABEL 2 Virkning af forskellige nedbrydningsmetoder på mucinanti-gener

Behandling Procent tilbagebleven aktivitet efter behandling 25

LIMA SIMA

Kogning (10 min.) 60 94

Alkalisk behandling 45 100

Pepsi nfordøjelse 100 30 50 Papainfordøjelse 2 t 20 100

Papainfordøjelse 16 t 20 50

Cl ostripainfordøjelse 100 100

Di sulfidreduktion 100 ikke udført 35 Et antal oprensninger kan indføres i mucinoprensningsmetoden, som følger: 1. Perchlorsyre (1 M), behandling med natriumacetat og opvarmning til 70°C eller kogning i 5 min. kan også anvendes 13 DK 170005 B1 til at berige renheden af mucinpræparaterne.

2. Gentagen CsCl-gradientultracentrifugering (op til 10 gange) har vist sig at forbedre renheden af mucinpræparatet 5 markant.

3. Monoklonalt antistofaffinitetskromatografi kan anvendes på to måder: for det første for eksempel ved anvendelse af anti-LIMA-monoklonaler til fjernelse af LIMA fra et SIMA- 10 præparat (og vice versa); og for det andet ved anvendelse af adsorption og eluering af mucin (SIMA) ud i anti-SIMA-monoklonaler til rensning af SIMA fra andre kontaminerende proteiner.

4. Mucinantigener kan også oprenses fra normale- og cancerøse væv ved anvendelse af lectin-kolonner, gelelektroforese, ionbytning eller gel filtreringskromatografi.

De forskellige trin i oprensningen af mucinpræparaterne overvåges 20 ved kompetitiv immunohistokemi og EIA unde anvendelse af polyklonale og monoklonale antistoffer til bestemmelse af præparaternes prøvning med SIMA- og LIMA-sammensætning.

B. Fremstilling af polyklonalt antisera 25

Det polyklonale, anti-SIMA antiserum, der blev anvendt ved disse undersøgelser, blev frembragt i kaniner ifølge Ma et al. (1980)*. Polyklonalt antiserum, der genkender LIMA, blev fremstillet ved lignende metoder involverende vaccination af kaniner med mucin-30 præparater ekstraheret fra normal tyktarm ifølge Ma el al (1980)1. Denne type antisera blev til at begynde med, selv om den er relativt non-specifik og kryds-reaktiv, anvendt til overvågning af mucinop-rensningstrinnene. Polyclonale antisera fremstillet fra højt oprenset SIMA og LIMA kan anvendes i "to-steds" "sandwich"-immun-35 analyser som beskrevet nedenfor.

14 DK 170005 B1 C. Fremstilling af monoklonale antistoffer Vaccinationsskema: 5 Balb/C hunmus, ca. 8 uger gamle, blev vaccineret med ca. 50 /tg per mus af delvis oprenset kræftmucinpræparat ved 4 subcutane og en intraperitoneal indsprøjtninger til at begynde med i Freund's komplette adjuvans og ca. 4 uger senere fulgt af et lignende sæt af injektioner i ikke-komplette adjuvans. Omtrent 12 dage efter den 10 anden vaccination blev musene åreladt fra haleåren, og serumantistoftitre blev bestemt ved ELISA. Tre uger efter den anden vaccination blev mus med en høj serumtiter givet forstærkende injektioner ved intraperitoneale injektioner af 10 βg af kræftmuc in præparat i PBS i fire dage i træk, efterfulgt den femte 15 dag af aflivning af dyret, fjernelse af milten og traditionel cellefusion med muserygmarvsstrenge.

Cellefusion.hvbridomvækst oa kloning: 20 En miltcellesuspension blev fremstillet af milten fra en vaccineret mus ved let udrøring i fysiologisk phosphatstødpudeopløsning (GKN).

o 10 miltceller blev blandet med 5 x 107 rygmarvsceller [X63 Ag 8.6.5.3] (opnået fra T. Stahelin, Hoffman La Roche, Basel, Schweiz) ifølge standardfremgangsmåden. Hil tceller og rygmarvsceller blev 25 blandet i 50% PEG-4000 (GC kvalitet) ved langsom tilsætning over 60 sekunder. Efter henstand i 90 sekunder blev cellerne suspenderet i PEG langsomt fortyndet med 7 ml GKN-opløsning (tilsat over 5 min), derefter fortyndet til ca. 300 ml i RPMI 1640 medium indeholdende 10% føtalt kalveserum, hypoxanthin, aminopterin og thymidin. Den 30 fortyndede cellesuspension blev derefter dispergeret i 288 brønde c fra 24-multi brøndsskåle indeholdende 10 peritoneale makrofager per brønd. Mediet blev skiftet efter ca. 7 dage eller derefter som krævet i overensstemmelse med cellevækst.

35 Efter screening ved EIA blev hybridomaer, der sekreterede antistoffer mod mucin, klonet 2 gange ved begrænset fortynding i mi kroti terskåle indeholdende peritoneale makrofager. Ved fremstilling i stor skala af monoklonale antistoffer, blev antistofsekreterende hybridomer dyrket som ascitiske tumorer i 8-12 15 DK 170005 B1 uger gamle mus behandlet 1-7 dage tidligere med 0,5 ml Pristan indsprøjtet intraperitonealt. Ascitesvæske blev opsamlet 2 til 4 uger efter injektion af cellerne og opbevaret ved -20°C. Immunoglobuliner belv oprenset fra ascitesvæsken som påkrævet ved 5 protein A-sepharose affinitetkromatografi.

Hvbridomscreeninq.

(i) EIA. Brønde af polystyrenmikrotiterplader blev dækket med

10 ubehandlet kræftmucinpræparat (10 /ig/ml i HCOj/COj'puffer, pH

9,6) i 3 timer ved 37°C. Brøndene blev derefter vasket 4 gange i PBS/Tween. Hybridomkultursupernatanter blev inkuberet i brøndene i en time og derefter vasket 4 gange med PBS/ Tween. Brøndene blev derefter inkuberet med fåre-anti-museimmunoglo-15 bulin bundet til alkalisk phosphatase. Efter vaskning med PBS/Tween efterfulgt af destilleret vand blev p-nitrofenyl-phosphat tilsat til substratet og positive brønde (indikerende supernatanter indeholdende antistoffer til mucin) blev identificeret som dem, der indeholdt det gule produkt, 20 p-nitrofenol.

(ii) Fluorescens-immunohistokemi. "Positive" hybridomer, identificeret ved den første screeningsrunde i EIA, blev derefter screen-et ved immunofluorescensmetoder for evnen hos de fremstillede 25 monoklonale antistoffer til at farve specifikke celler eller væv i histologiske snit af normal- og canecrøse mave-tarmkanal-organer. Hybridomakultursupernatanter blev inkuberet på vævssnit på præparatglas. Efter blokering af ikke-specifikke bindingssteder med okseserumalbuminopløsning, blev vævene 50 inkuberet med fluorescein-konjugeret kanin-anti-museimmuno- globul in. Overskydende mærket antistof blev fjernet ved vaskning, og vævssnittene blev undersøgt ved fluorescens-mikroskopi anvendende U-V- eller smal båndsbiåeksitation.

55 Under anvendelse af ovenstående metoder blev der identificeret 5 anti-SIMA monoklonale antistoffer (reagerende med normal tyndtarms-mucin og colorectalt kræftmucin) og 5 anti-LIMA monoklonale antistoffer (reagerende med normal tyktarm og colorectalt kræftmucin).

16 DK 170005 B1

Karakterisering af monoklonale antistoffer

Undergruppen af antistofferne blev bestemt ved anvendelse af enzymkoblede anti-IgG og anti-IgM antistoffer (CSL). Alle mono-5 klonale antistoffer blev fundet at være fra IgG-undergruppen.

Til fuldstændig karakterisering af de monoklonale antistoffer blev deres relative affiniteter målt ved to metoder. For det første blev der for hvert monoklonalt antistof opnået oprenset IgG ved protein 10 A-sepharoseaffinitetskromatografi. Det oprensede IgG blev derefter titreret ved EIA, og titreringskurverne (reaktion i EIA versus proteinkoncentration) sammenlignes som et mål for de relative affiniteter af antistofferne. For det andet blev en kompetitiv EIA udviklet (se nedenfor). De relative affinitetskonstanter blev 15 beregnet ved anvendelse af SIMA-præparat som inhibitor i forbindelse med med anti-SIMA monoklonale antistoffer, og LIMA som inhibitor til anti-SIMA monoklonale antistoffer. Beregning af de relative affinitetskonstanter baseredes på følgende ligning: 20 Ab + Ag ^ --AbAg

Ka = [AbAg]_ [Ab] [Ag] 25 Ved den koncentration af antigen (mucin), som frembringer 50% inhibering i en kompetitiv EIA, vil koncentrationen af frit og bundet antistof være den samme, det vil sige [Ab] * [AbAg]. Derfor er den relative affinitetskonstant Ka = l/[Ag]. Data baseret på disse beregninger er vist i tabel 3. Idet de virkelige anti genkon -30 centrationer kan være lavere (hvis præparaterne ikke er 100% rene og andre kontaminerede proteiner er tilstede), er værdierne for Ka minimumsværdier og kan faktisk være større.

35 17 DK 170005 B1 TABEL 3

Antistof Relativ affinitetskonstant Π/mol) 5 Anti-SIMA monoklonale: 4D1 4,2 x 1010 4C2 3,3 x 1010 3C5 2,4 x 1010 4D3 1,6 x 1010 10 2A1 1,0 x 1010

Anti-LIMA monoklonale: 3B4 2,4 x 10i0 3D4 1,5 x 1010 3C3 8,9 x 109 15 2D3 2,8 x 109 2C3 2,4 x 1010

Friguet et al's metode (1983)20 blev anvendt til bestemmelse af, hvorvidt hver af anti-SIMA monoklonalerne på den ene side og 2° anti-LIMA monoklonalerne på den anden side blev bundet til de samme antigene determinanter på SIMA- henholdsvis LIMA-molekylerne. Ved anvendesle af grænsemængder af antigen til dækning af pladen, titreres hvert antistof individuelt og ved alle mulige paringer.

Alle monoklonaler fremstillet ved indeværende eksperimenter blev 25 fundet at binde de samme eller overlappende antigene determinanter på molekylet.

EKSEMPEL 2 In vitro diagnostiske immunanalyser 30 To immunanalyser udviklet til detektion af cirkulerende mucin i blodprøver beskrives nedenfor:

A. Kompetitiv ELISA

35 (i) De i i denne analyse involverede trin er illustreret i fig. 5.

Indledende eksperimenter viste, at muciner, der blev sat til heparin- eller EDTA-behandlet eller ubehandlet blod, kunne alle genfindes og mængdebestemmes i fortyndet plasma eller serum. Ufortyndet plasma eller serum sat til immunanalysen forårsagede DK 170005 Bl 18 interferens, medens der ikke observeredes nogen effekt på analyserne (sammenlignet med vandige puffere) ved anvendelse af plasma fortynet 1/10. En serie af blodprøver fra colorectale kræftpatienter, patienter med ulcerøs colitis og sunde kontrol -5 personer blev derfor analyseret for SIMA og LIHA ved anvendelse af kompetitiv ELISA. Plasma fra sunde individer indeholdende tilsat SIMA eller LIMA blev anvendt som standard. Høje indhold af SIMA og/eller LIMA blev målt i 13/23 (ca. 60%) af patienterne med forskellige stadier af colorectal kræft, og høje 10 indhold af LIMA (men ikke SIMA) blev målt i 4/5 tilfælde af ulcerøs colitis. Hverken SIMA eller LIMA blev målt i blodprøver fra de 7 sunde kontrolpersoner ved denne metode.

(ii) I overensstemmelse med bestemmelsen af hvorvidt mucin kunne detekteres ved lave indhold, blev der udtænkt en fremgangsmåde 15 til ekstrahering og koncentrering af mucin fra plasmaprøver. Et ligeligt volumen af 2 M perchlorsyre (PCA) blev sat til serumeller plasmaprøver i 15 min. ved stuetemperatur. Prøverne blev centrifugeret ved 8000 x g i 2 min., supernatanterne blev fjernet og småkuglerne vasket i 2 gange det oprindelige prøve-20 volumen af PBS, blandet og centrifugeret som før. PBS blev sat til de kombinerede supernatanter til et endeligt volumen af 10 gange det originale prøvevolumen. Prøverne blev koncentreret/-dialyseret 10 gange i Minicon B15 concentratorer (Molekylvægtsgrænse på 15.000, Amicon Co.). Prøverne blev derefter fortyndet 25 til 10 gange det oprindelige prøvevolumen og koncentreret 50 gange. Det resulterende PCA ekstrakt havde 1/5 af det originale prøvevolumen. Denne prøve blev derefter analyseret ved kompetitiv ELISA, som beskrevet tidligere. Plasmaprøver fra sunde, frivillige forsøgspersoner med forskellige koncentrationer af 30 tilsat mucin, der gennemgik den samme procedure som beskrevet ovenfor, blev anvendt som standarder. Resultaterne fra SIMA-analyser på prøver fra 39 patienter med colorectal kræft, 2 patienter med brystkræft, 5 patienter med ulcerøs colitis og 7 kontrolpersoner viste, at SIMA antigen aktivitet kunne måles 33 ved lave indhold hos visse kontrolpatienter og i højere indhold i alle med undtagelse af 2 af kræftpatienterne. 60% af prøverne fra patienter med stadie B colorectalkræft (defineret som de kræfttilfælde med ingen tydelig spredning til andre organer), 91% fra stadie C (defineret som de kræfttilfælde med målelige 19 DK 170005 B1 metastaser i lokale lymfeknuder) og 86% fra stadie D (udbredt kræft med spredning til fjerntliggende organer, såsom leveren) indeholdt forhøjede mucinindhold sammenlignet med kontrol rækken. SIMA blev også målt i en blodprøve opnået fra en 5 patient med stadie A colorectal kræft og 2 patienter med brystkræft.

LIMA analyser er kun blevet udført på fortyndede serumprøver uden de koncentrat!ons/dialysetrin, der blev anvendt i SIMA 10 analyserne. Kun en lille del af patienterne med tidlige stadier af colorectal kræft indeholdt måleligt LIMA - 11% af stadie B, 29% af stadie C men en større del (67%) af stadie D kræftpatienter havde forhøjede serum-LIMA-indhold. En meget stor del (80%) af patienter med ulcerøs colitis viste høje indhold af cirkulerende LIMA, endog ved denne relativt ufølsomme analyse. Derfor kan denne LIMA analyse være af værdi ved måling af tyktarmsbetændelsessygdom.

B. llSandwich"-immunanalvse 20

De ovenfor beskrevne monoklonale antistoffer kan også anvendes i en "sandwich"-immunanalyse.

Disse typer af analyse har et antal fordele ved forbedring af 25 følsomheden af analysen og ved yderligere at involvere færre trin end den kompetitive inhiberingsanalyse beskrevet ovenfor. Ydermere er "signalet" i en "sandwich"-immunanalyse (for eksempel anvendende radioaktivitet eller en enzymmærket antistoffarve i brønden) direkte proportional med mucinantigenkoncentrationen, hvilket i høj grad 20 simplificerer beregningen og behandlingen af resultaterne ved sammenligning med kompetitiv inhiberingsanalyse.

Analysen omfatter en fast overflade, der er dækket med monoklonalt antistof til immobilisering af mucinmolekylet, og det samme monoklo-25 nåle antistof mærket (med *2®I eller et enzym) til måling af tilstedeværelsen af mucin bundet til det dækkede antistof (se fig.

6).

20 DK 170005 B1 а. Detaljer af SIHA- eller LIMA-radio immun analyse (RIAHfia. 6) 1. Brønde, hvis mil!ititer-HA-plader (Millipore Corporation, USA) er dækket med protein-A-oprenset mol okl onalt antistof IgG (ca.

5 10 /ig/ml) fortyndet i dækpuffer (natriumcarbonat/bicarbonatbuf- fer pH 9,6, 50 /il per brønd). Pladerne inkuberes i 3-5 timer ved 37°C.

2. Tilsæt 200 /il 0,2 M natriumacetat, pH 5,0, til 100 μΐ serum- 10 prøve eller standarder og opvarm til 70 + 1°C i 15 min. og centrifuger derefter ved 9.000 x g i 10 min. Standarderne indeholder 0, 1,5, 5,0, 15, 50, 150 og 500 /im/ml SIMA eller LIMA fremstillet i forenet serum opnået fra sunde frivillige forsøgspersoner.

15 125 3. I-mærket monoklonalt antistof fortyndet i PBS indeholdende 1% BSA tilsættes derefter til acetatekstraktsupernatanten (ca.

0,1 /iCi og 100 /il supernatant) og inkuberes ved 37°C i 1 time.

2(5 4. Dækkede brønde af millititerplader vaskes derefter 4 gange med PBS/Tween, og pladerne blokeres i 30 min. med 1% BSA i PBS ved 37°C.

5. Efter blokering vaskes pladerne 3 gange med PBS/Tween. Prøver 25 (50 /il per brønd i duplikerede brønde) præinkuberes med 125 I-mærkede antistoffer, sættes derefter til brøndene og inkuberes natten over ved 4°C.

б. Efter inkubering natten over vaskes brøndene 5 gange med 20 PBS/Tween, trykkes tørre, og filtrene ved basis af hver brønd prikkes ud og tælles i en gammatæller.

SIMA- og LIMA-indhold udtrykkes som arbitrære enheder/ ml, der er bestemt i forhold til proteinindholdet af en referencestandard af 35 SIMA og LIMA.

Et antal eksperimenter er blevet udført i overensstemmelse med en evaluering af pålideligheden og reproducerbarheden af "sandwich"-analysen. Tabel 4 viser variationer opnået mellem tredob- 21 DK 170005 B1 beltbestemmelser i en typisk analyse af kontrol serum. For serumanalyser af SIMA er variationen højest (cv = 10%) ved indhold på 1,5 μ/ml, hvor analyserne ikke regnes for pålidelige (derfor gives alle værdier < 5 μ/ml SIMA ikke specifikke værdier). For serumindhold på 5 5 til 500 U/ml SIMA er analyseafvigelsen på 5,6% eller mindre.

TABEL 4: ANALYSEAFVIGELSER MELLEM SIMA-RADIOIMMUNANALYSER 10 Gennemsnitlige SIMA-koncentration Standard afvigelse c.v.(%) (U/ml) 1,5 0,15 10,0 15 5,0 0,12 2,3 50 2,4 4,7 150 8,4 5,6 500 17,0 3,4 20 b. Detaljer fra LIMA-enzvmimmunanalvse (ETA! ffia. 71 1. Polystyrenmi krotiterplader (Nunc Immunoplader) dækkes med anti-LIMA monoklonalt antistof IgG (for eksempel fra 25 hybridom cellelinie 2C3) i bicarbonatpuffer i 3 timer ved 37°C. Plader vaskes to gange i vaskepuffer (PBS/Tween/ natriumazid, pH 7,2-7,6), der derefter løber af.

2. 50 μΐ Blokeringsopløsning (okseserumalbumin opløst i PBS

30 indeholdende natriumazid, pH 7,4) sættes til hver brønd på pladen og inkuberes ved 37°C i 1 time.

3. Sæt 200 μΐ af acetatekstraktionsbuffer (0,2 M natriumacetat pH 5,0 indeholdende natriumazid) eller serumprøver til 100 35 μΐ standard LIMA-opløsning (standard LIMA opløst i normalt humanserum indeholdende natriumazid for at få antigenkoncentrationer på 0, 1,5, 5, 15, 50, 150 og 500 enheder pr. ml) og opvarm til 70 + 1°C i 15 min. Afkøl til stuetemperatur og centrifuger ved 10.000 x g i 10 min. i en sving-ud 22 DK 170005 B1 centrifuge.

4. Vask mikrotiterpladerne 3 gange med vaskepuffer og lad det løbe af.

5 5. Tilsæt 50 /il supernatant fra acetat/varmebehandlede standarder eller serumprøver til hver brønd (2 brønde per prøve). Inkuber pladerne ved 37°C i 1 time.

10 6. Vask mikrotiterpladerne 4 gange med vaskepuffer og lad det løbe af.

7. Tilsæt pr. brønd 50 /il alkalisk phosphatasekonjugeret anti-LIMA-monoklonalt antistof fortyndet 1:300 i phosphat- 15 pufret saltopløsning indeholdende 1% okseserumalbumin.

Inkuber ved 37°C i 1½ time. Vask 4 gange i vaskepuffer og 3 gange i destilleret i vand og lad det løbe af. Sæt til hver brønd 100 /il af substrat (p-nitrofenylphosphat) opløst i en koncentration på 2 mg/ml i substratfortyndingspuffer (0,2 M

20 natriumcarbonat/bicarbonatpuffer indeholdende 0,5 M magne- siumchlorid). Inkuber ved 37°C i 20 min.

8. Tilsæt til hver brønd 100 /il enzymreakt ionsstoppende opløsning (0,5 M natriumhydroxid).

25 9. Aflæs optisk tæthed ved 405 nm i en egnet mi krotiterp!ade-læser.

Evaluering af forsøgsresultater.

30 (i) Fremstil en standardkurve ved at plotte den gennemsnitlige optiske tæthed opnået for hver LIMA-standard (på y-aksen) mod den korresponderende LIMA-koncentration (x-aksen).

35 (ii) Bestem ved anvendelse af den gennemsnitlig optiske tæthed for hver serumprøve den korresponderende koncentration af LIMA i enheder pr. ml fra standardkurven.

Hvis prøven kræver yderligere fortynding (for eksempel ved 23 DK 170005 B1 LIMA-koncentrationer på over 150 U/ml) for at give en værdi, som kan aflæses på standardkurven, så må værdien opnået fra standardkurven multipliceres med den behørige fortyndingsfaktor for at afgive LIMA-koncentrationen i serum.

5

Et eksempel er givet i tabel 5, og fig. 8 er fremstillet fra data i tabel 5.

TABEL 5.

10

TYPISKE DATA TIL FREMSTILLING AF EN STANDARD KURVE OPTISK TÆTHED

Dobbelt- LIMA-Kon-

Prøve bestemmelse Gennemsnit centration

Standard 1 0,012 0,010 0,011 0 20 2 0,037 0,025 0,031 1,5 3 0,106 0,117 0,112 5 4 0,293 0,340 0,316 15 5 0,655 0,702 0,678 50 6 1,057 1,138 1,097 150 25 7 1,281 1,345 1,313 500

Eksempel 1 0,607 0,633 0,620 40 2 0,445 0,446 0,445 23 0,868 0,893 0,881 88 30 _

Et eksempel på reproducerbarheden af ovenstående LIMA EIA er anført i tabel 6, der viser afvigelserne opnået mellem tredobbeltbestem-35 melser i en analyse af serumprøver indeholdende forskellige mængder af LIMA. Afvigelsen er størst for værdier mindre end 1,5 U/ml (variationskoefficienter på 10%) eller værdier større end 150 U/ml (c.v. 12%). Serumindhold uden for disse grænser (for eksempel <2 eller >150 U/ml) betragtes derfor som upålidelige. Prøver 24 DK 170005 B1 indeholdende >150 U/nil LIMA bør derfor fortyndes og genanalyseres.

TABEL 6.

5 VARIATION MELLEM LIME EIA-ANALYSER

t

Gennemsnitlig LIMA-Koncentration Standardafgivelse C.V.

U/ml U/ml (%) 10 _ 1,5 0,15 10 5 0,30 6 50 3,0 6 15 150 7,0 5 500 6,0 12 c. Kliniske resultater 20

Nedenstående tabel 7 sammenfatter resultaterne af prøver fra patienter med forskellige sygdomme og fra sunde kontrolpersoner, og viser resultaterne fra SIMA- og LIMA-RIA (se afsnit a.) og CEA-serum-analyser med det formål at sammenligne antallet af prøver, der var 25 positive for SIMA alene, LIMA alene, CEA alene eller en af kombinationerne af disse tre markører.

30 35 ! 25 DK 170005 B1 ro σ>

<D

c O)

— O LO

< in ro r- ϊ- <

LU

Ur- ^ o < •O P Σ _ Q) ·— LO s_ _! < CL aj + UJ Γ0

0 £ < U

LL I Σ + tu 0) 10

* V

* > z ϋ ϋ -° < < * s- Σ f.

Φ — u C C -J + LO Γ- S φ 1 .?

P

2 ® < <

^ * i S

< i LO + U a

D

<Λ Έ £ 9 < <

α r I I

Q£ (0 -J Γ- rj *“ > <u O £ L_ .S> < O ^ 2 — 2 — o (/) Li _l r* r~ r-

To < > c i

O < </) ^ V- r- CO

£_ 0)

P

P C

2 7δ .2 fgS S " * co ~ ^ ° p Ό

^ C

c-i i J, p ™ p * c ^ S p z ίο m ffi aj « 3 ^ -> 8 Z 3 £ fec^ujaSaS^? LU c O £ c 9¾ 9σ>α CD O) —i a> o 0 3 ^ H E ^ to . w w SJ X! < .2 Ou-5 3 - > co > < 2 > o > u e

f Q U ^ 8 Ω D Ι-Σ-Ι SapapoiO

® 26 DK 170005 B1 ro ^ σ» 9- <ϋ o C p ,,, « ju o — m t-cl m co <*> < r- t <

UJ

υ o <

•a % I

w * _J <

*2 i S

Ox < U

u_ o 2 + 4-1 ·“ lu <u in * o 52 > z ® _i -° < < * *. Σ ju

ro — O

< c -J + <" S <u U- Π) U.

s ® < <

< i i V

J 3

D

if) Έ £ ° < < £ I i 0£ t/) -J t—

ω lT

> (D

O C

1- .2 < O ro i

«Λ Qi J

s, < III Φ

> c I

O < 10 t— r- r-CVlr-CVl L.

V

P

P c mm.® £ p p o c ro r- h U Q. LO N « t- r- 00 UJ \ if) o: .2 D W ,-P U) ·· _ CD _j +J r < ^ S i<.£ co Ϊ ro uj _1 -{± o ^ S IS UJ u to κ 111 LU S C i. §, q. Ω- jr £ Ω £ ro ro U £ CD £ 5 ϊ S1 8 » ε o ti æ -! « o s z 1 z 1 <o .2 .= ro > enrol- < u £ ro < t- D t- hu- Ω ΩΣ-Ι 0 * CD * U σι 0. X J i 5 27 DK 170005 B1 +3 ro D) © c Φ < - w £ £ © . & © Jr 5 > < '55 ©

tu O ~Z

U Γ- α “ E οι o c “ o * 2 S © cn Q- Π3 π o < i ° «i t; 1 t t W t_ _| < -Q o α © + uj Q X c O S < U ° a, \ U- φ S + ΛΙΙ ® 3 UJ © (0 £. C _ * Ό .5! 3 ® (Λ > Ό w All z 5 8 o t “J -O < < > U. $_ ri , 5 uj I Ό.

< S ^ ¥ - ί f * æ S u ϊ i u- Vj Dl ID >

r O O

CC „ Q. i~ LU ?< < c ° h i 2 * ξ E £ < ! 5 V 5 a i ^3 ? S « 2 - Al I ti fl, (Λ u O) 5 uj o 4C u ro £* r/ > 5 2 φ t- O) I I I i Φ 2 Οί,ω-Ι r- © xi c UJ U > _ © > © c ε 01 O ri f © I- ® < < D Φ o % i ? s 5= t/) °· “* CO OJ O All L.

^ ro < > t- ® UJ 2 5 » II Ϊ > c i z 2 o < if) 00 _ S s s > ϋ ·- w ro “ +* E > L g 2 S g s ®

I ro I Ό < S

ti ^ in h ro α rom « °°°0)^å

ό S © I

r z O +. n 8 a O ό “ > fe g ->ra O h C .C -1 v- « ω «> £ 0) ujS c £ £ §> f. * « J Q ^ ^ w © 2 < Jr ,2 ^ ® »o > ^ 3 3CCiu οωβί ?£ q £D .* Σ J < S " tOhZ u.aj3 28 DK 170005 B1 C. Andre immunanalvsefremganqsmåder.

En variation af føromtalte "to-steds" immunanalyse ville være at anvende et polyklonalt anti-mucinantiserum (for eksempel produceret 5 i kaniner eller får) til dækning af den faste fase. Det ville muliggøre anvendelse af umærket monoklonalt antistof (antistoffer) som det "andet" antistof i analysen efterfulgt af detektion af musemonoklonalen med et mærket kanin- eller fåre-anti-museantistof. Dette system (eller vice versa monoklonalt antistof til fastfasedæk-10 ning og polyklonalt antisera til detektion) kan tilvejebringe bedre forstærkning af positive signaler, end når et monoklonalt antistof mærkes direkte.

Det skal også bemærkes, at den foreliggende opfindelse omfatter 15 anvendelse af et fluorogent enzymsubstrat, såsom 4-methylumbelli- ferylphosphat (4MU-phosphat) (til alkalisk phosphatase) eller 4MU-j5-D-galactosid (til /J-galactosidase) i "sandwich"-immunanalyser.

Der vil blive anvendt det samme enzymforbundne monoklonale antistof som det, der anvendes i den ovenfor beskrevne kolometriske metode.

20 Den forventede forøgelse i følsomhed vil være på ca. 10 gange. Andre kendte detektionssystemer, såsom protein A, avidin-biotin, etc., kan også anvendes. Hvis mærket protein A anvendes som detektionssystem i disse "sandwich"-immunanalyser, vil det fastfasedækkende antistof (hvad enten det er monoklonalt eller polyklonalt), være et F(ab)-25 fragment og detektorantistoffet et intakt molekyle indeholdende

Fc-segment. Ud over mi kroti terbrøndene kan der anvendes et antal forskellige faste faser i disse systemer, såsom kugler af forskellige slags. Ydermere kan membraner anvendes som adsorptive overflader til bindende antigener.

30 LITTERATURLISTE.

1. Ma, J., De Boer, W., Ward, H.A. & Nairn, R.C. (1980). "Another Oncofoetal Antigen in Colonic Carcinoma" Br.J.Cancer 41 35 325-328.

2. Pihi, E., Nairn, R.C., Huges, E.S.R., Cuthbertson, A.J. & Rollo, A.J. (1981). "Mucinous Colorectal Carcinoma: Immunopa-thology and Prognosis" Pathology 11 439-447.

29 DK 170005 B1 3. De Boer, W., Ma, J., Rees, J.W. & Nayman, J. (1981). "Inappropriate mucin production in gall bladder metaplasia and neoplasia - an immunohistological study" Histopatholoav 5 295-303. (1981).

5 4. De Boer, W., Ma, 0. & Nayman, J. (1981). "Intestine-associated antigens in ovarian tumours: An immunohistological study" Pathology 13 547-555.

10 5. Ma, J., De Boer, W. & Nayman, J. (1982). "The presence of oncofoetal antigens in large bowel carcinoma". Aust.& N.Z. Jour nal of Surgery 52 30-34.

6. Ma, J., De Boer, W. & Nayman, J. (1982). "Intestinal mucinous substances in gastric intestinal metaplasia and carcinoma studied by immunofluorescence". Cancer 49 1664-1667.

7. Ma, J., Handley, C.J. & De Boer, W. (1983). "An ovarian tumour specific mucin antigen - immuniohistological and biochemical 20 studies" Pathology lj> 385-391.

8. Nayman, J., De Boer, W. & Ma, J. (1983). "Inappropriate mucin production in Endodermal carcinoma - one point of view".

Japanese Journal of Surgery 13 317-323.

25 9. Gold, P. og Freedman, S.O. (1965). Specific careino-embryonic antigens of the human digestive system. J.Exoed.Med.. 122. 467-481.

30 10. Mackay, I.R. (1979). In. Immunodiagnosis of Cancer, Herberman and Mclntire (eds), Marcel Dekker, N.Y. 255.

11. Cuthbertson, A.M., Huges, E.S.R., Nairn, R.C. Nind, A.P.P. og Pihl, E. (1981). CEA testing: Is it useful in colorectal cancer? Med. J. Australia. 170.

35 12. Cuthertson, A.M., Huges, E.S.R., Nairn, R.C. Nind, A.P.P. og Pihl, E. (1981). CEA testing in colorectal cancer. Med. J. Australia. 201.

30 DK 170005 B1 13. Pihi, E., McNaughtan, J., Ma, J., Ward, H.A. og Nairn, R.C.

(1980). Immunohistol ogical patterns of carcinoembyronic antigen in colorectal carcinoma. Correlation with staging and blood levels. Pathology. 12, 7-13.

5 14. Herlyn, H., Steplewski, Z., Herlyn, D., og Koprowski, I. Colorectal carcinoma - specific antigen: Detection by means of monoclonal antibodies. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:1438, 1979.

10 15. Koprowski, B., Herlyn, H., Steplewski, Z. & Sears, H.F.,

Specific antigen in serum of patients with colon carcinoma. Science 212:53, 1981.

16. Magnani, J., Brocklaus, M., Smith, D., Ginsburg, V., Blaszcyk, 15 M., Mitchell, D., Steplewski, A. & Koprowski, H. A monoclonal antibody defined antigen of colon carcinoma. Science. 212:55. 1981.

17. Devillano, B. og coll. Radioimmunometric Assay for a Monoclonal 2° Antibody defined Tumor Markers CA 19-9™. Clin.Chem. 29 : 549-552. 1983.

18. Sears, H., Herlyn, J., Delvillano, B., Steplewski, Z. & Koprowski, H. A clinical evaluation of patients with colorectal 25 cancer. Clinical Immunology. 2, : 141, 1982.

19. Magnani, J., Steplewski, Z., Koprowski, H., & Ginsburg, V.

Identification of the gastrointestinal and pancreatic cancer-associated antigen detected by monoclonal antibody 19-9 in the sera of patients as a mucin. Cancer Research : 43, 5489-5492, 1983.

20. Friguet, B., Djavadi-Ohaniance, L, Pages, J., Bussaro, A., &

Godlberg, M. A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for 25 testing whether monoclonal antibodies recognise the same antigenic site. Application to hybridomas specific for the j82-subunit of E.coli tryptophan synthase. J. Immunol. Methods : 351-358, 1983.

5 31 DK 170005 B1 21. Trerelyan, W.E. og Harrison, J.S., Studies in yeast metabolism.

I. Fractionation and microdetermination of cell carbohydrates. Biochem J. 50 : 298-303, 1952.

10 15 20 25 30 35

Claims (14)

1. In vitro diagnostisk fremgangsmåde til detektering af forekomst af kræftceller eller andre mucinantigenproducerende celler hos en 5 patient, kendetegnet ved, at en prøve af en fysiologisk væske, der er udtaget fra patienten undersøges, til detektering af forekomst af tyndtarmsmucinantigen (SIHA) og/eller tyktarmsmucin- * antigen (LIMA) i denne prøve.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøven er en prøve af blod, blodserum eller blodplasma, der er udtaget fra patienten.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøven 15 kontaktes med antistoffer til SIMA og/eller LIMA eller fragmenter heraf, og at forekomst af binding af disse antistoffer eller fragmenter heraf til deres korresponderende antigener detekteres.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at prøven 20 kontaktes med antistoffer til SIMA og/eller LIMA eller fragmenter heraf, der er mærket med et mærkningsmiddel, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart signal, og at forekomst af binding af disse mærkede antistoffer eller fragmenter heraf til deres korresponderende antigener detekteres. 25

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3 eller 4, k e n d e t e gn e t ved, at antistofferne er monoklonale antistoffer.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, 4 eller 5, kendete gn et ved, 30 at antistofferne eller fragmenter heraf mærkes med et enzym eller en radioisotop.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at den omfatter: 35 (i) kobling af antistoffer til SIMA og/eller LIMA eller fragmenter heraf til en fast bærer; (ii) kontaktning af prøven med den faste bærer; og (iii) detektering af forekomst i prøven af korresponderende DK 170005 B1 antigener, som er bundet til antistofferne eller fragmenter heraf, der er koblet til den faste bærer.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at 5 detekteringen af forekomst af bundne korresponderende antigener omfatter: (iv) kontaktning af den faste bærer med antistoffer til SIMA og/eller LIMA eller fragmenter heraf mærket med et 10 mærkningsmiddel, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart signal, og (v) detekterering af bindingen af de mærkede antistoffer eller fragmenter heraf til korresponderende antigen, som er bundet til den faste bærer. 15

9. In vitro diagnostisk sæt eller system til detektering af forekomst af kræftceller eller andre mucinantigenproducerende celler hos en patient, k e n d e t e g n e t ved, at sættet eller systemet omfatter midler til detektering af forekomst af tyndtarmsmucin- 20 antigen (SIMA) og/eller tyktarmsmucinantigen (LIMA) i en prøve af en fysiologisk væske fra patienten.

10. Sæt eller system ifølge krav 9, kendete gn et ved, at det omfatter antistoffer, der er i stand til immunreaktion med SIMA 25 og/eller LIMA eller fragmenter heraf, sammen med indikatormidler til indicering af forekomst af en immunreaktion mellem antistofferne eller fragmenter heraf og deres korresponderende antigener.

11. Sæt eller system ifølge krav 10, k e n d e t e gn e t ved, at 30 det yderligere omfatter en fast bærer, der har antistofferne eller fragmenter heraf bundet til sig.

12. Sæt eller system ifølge krav 10, k e n d e t e gn e t ved, at indikatormidlerne omfatter et mærkningsmiddel, der er i stand til at tilvejebringe et detekterbart signal, hvilket mærkningsmiddel er bundet til antistofferne eller fragmenter heraf.

13. Sæt eller system ifølge krav 10, k e n d e t e gn e t ved, at indikatormidlerne omfatter et mærkningsmiddel, der er i stand til at DK 170005 B1 tilvejebringe et detekterbart signal, hvilket mærkningsmiddel er bundet til andre antistoffer, som frembragt mod førstnævnte antistoffer, og indicerer forekomst af immunreaktionen ved binding til førstnævnte antistoffer. 5

14. Sæt eller system ifølge krav 12 eller 13, k e n d et e g n e t ved, at mærkningsmidlet er et enzym eller en radioisotop. 10 15 20 25 30 35