JPH03137566A - 血液中の白血球およびヘモグロビンの測定用試薬 - Google Patents

血液中の白血球およびヘモグロビンの測定用試薬

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JPH03137566A
JPH03137566A JP1275280A JP27528089A JPH03137566A JP H03137566 A JPH03137566 A JP H03137566A JP 1275280 A JP1275280 A JP 1275280A JP 27528089 A JP27528089 A JP 27528089A JP H03137566 A JPH03137566 A JP H03137566A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野コ 本発明は、血液試料中の白血球およびヘモグロビンを測
定する為の試薬に関するものである。
[従来の技術および発明が解決しようとする課題]血液
試料中の白血球数およびヘモグロビンを測定することは
、白血病や貧血症等の臨床診断にとって極めて重要であ
る。
白血球数の測定においては、顕微鏡観察による視算法が
基本の方法となっている。
しかし、視算法においては、Ti1rk液等で赤血球を
溶血させ、白血球を染色した後、計算板上の白血球を一
個一個数える必要がある。そのため、非常に手間と時間
が必要である。
ところで、血液試料中の白血球数の測定においては、自
動血液分析装置による方法も広く行われている。自動血
液分析装置による白血球数の測定は、赤血球溶解剤を添
加することにより血液試料中の赤血球を溶解させ、主と
して白血球のみが残った白血球測定用試料を作製するこ
とによって行われる。白血球測定用試料は、自動血液分
析装置内の検出部に設けられた細い通路または細孔を通
過させられる。このとき、−個一個の白血球に対応して
検出部で発生される電気的または光学的信号を検出する
ことにより白血球数がカウント(計数)される。
また、近年では、得られる信号の強度の差によって白血
球をさらに顆粒球、単球、リンパ球などのクラスに分類
し、カウントする装置も実現されている。この装置を用
いれば、上記の視算法よりも遥かに簡便に白血球を分類
・計数することができる。
一方、ヘモグロビンの測定においては、血液中のヘモグ
ロビンを、フェリシアン化カリウムおよびシアンを含有
する溶解試薬の作用によりシアンメトヘモグロビン(H
iCN)に転化させ、特定波長の吸光度を測定する方法
(シアンメトヘモグロビン法)が−船釣に行われている
。自動血液分析装置においても、そのまま利用できるこ
とによりシアンメトヘモグロビン法または、それに準じ
た方法が採用されている。
ところが、シアンメトヘモグロビン法においては毒物で
あるシアンを用いているため、試薬の取扱に危険が伴う
、また、測定後の廃液は、次亜塩素酸ナトリウムなどを
用いてシアンを分解した後に廃棄する必要があり、廃液
処理に煩わしさがある。
そのため、血液中のヘモグロビンをオキシヘモグロビン
(HbO□)に転化させ、特定波長の吸光度を測定する
方法(オキシヘモグロビン法)も行われるようになって
きている。オキシヘモグロビン法においては、シアンを
使用しないため、試薬の取板に危険もなく、廃液処理に
煩わしさもない。
しかし、オキシヘモグロビン法においては、メトヘモグ
ロビン含量の高い血液試料は正しく測定できないという
問題を有する。これは、メトヘモグロビンがオキシヘモ
グロビンに転化しないためである0例としてコントロー
ル血液を使ってメトヘモグロビン含量を変化させた場合
の、オキシヘモグロビン法と本発明の実施例1との測定
結果の比較データ〈表1)を示す。コントロール血液は
自動血液分析装置の精度管理用物質として使用されるも
のであるが、一般に、低温で保存する場合には問題ない
が、常温以上で保存すると、血中ヘモグロビンがしだい
にメトヘモグロビンへ転化してしまう、したがって表1
に見られるように、22℃で保存したコントロール血液
をオキシヘモグロビン法で測定した場きには、ヘモグロ
ビン総量のうちメトヘモグロビンへ転化した分が測定で
きなくなり、数日後の測定値は初期値よりもしだいに低
値を示すようになる。
この問題を解決する方法として、大域らによって、中性
緩衝液(pH7,2)中にドデシル硫酸ナトリウムまた
は、等量でラウリル硫酸ナトリウム(SLS)(アニオ
ン性界面活性剤)およびトリトンX−100(ノニオン
性界面活性剤)を含有してなるヘモグロビン測定用試薬
が、クリニカル・バイオケミストリー(CIin、 B
 iochem、 > 15巻83(1982)に教示
されている。
この方法では、メトヘモグロビンの影響を受けることな
く、血液中のヘモグロビン濃度を測定でき、しかも、シ
アンを含まないので廃液処理の煩わしさもない。
しかし、この方法では、ヘモグロビン測定と同時に白血
球を測定することができない。
また、特開昭61−148369公報「シアニドを含ま
ないヘモグロビン試薬」において、イオン性界面活性剤
を使ってヘモグロビンを測定する試薬が公開されている
が、この試薬でもヘモグロビン測定と同時に白血球を測
定することができない。
以上のように、従来の技術では、シアンを含まない試薬
で、ヘモグロビン測定と同時に白血球を測定し、さらに
、メトヘモグロビン含量の高い血液試料のヘモグロビン
を正しく測定することはできなかった。
[課題を解決するための手段] 上述の従来技術における問題点を解決するために本発明
者等は鋭意研究の結果、以下のような試薬を創製するに
至った。
すなわち、以下の条件を満たす、血液中の白血球の算定
およびヘモグロビン濃度を測定するための試薬であって
、シアンを含まないことを特徴とする試薬である: i) 血液中の赤血球を溶血し、ヘモグロビンを変性さ
せうる濃度の四級アンモニウム塩(式a)あるいは、ピ
リジニウム塩(式b)の組成物よりなる群の中から選ば
れたカチオン系界面活性剤の少なくとも1種類を含むこ
と。
式a (式中R1:    Cm−C2゜アルキル基アルケニ
ル基 又はアルキニル基 R2、RzおよびR4:C1〜C6アルキル基アルゲニ
ル基 又はアルキニル基 X−: 陰イオン基) 式b (式中1=7〜19の整数 X−; 陰イオン基) ii)式C〜eのカチオン、ノニオン、両性界面活性剤
あるいはfに示すようなヘモグロビン中のヘムを酸化さ
せうる酸化剤よりなる群の中から選ばれた少なくとも1
種類を含むこと。
式C (式中R1:   C,〜c2゜アルキル基アルケニル
基 又はアルキニル基 R2およびR3:   c、〜C,アルキル基アルケニ
ル基 又はアルキニル基 X−: 陰イオン基) 式d R,−R2−(CH,CH20)。−H(式中R,: 
   C,〜c2゜アルキル基アルケニル基 又はアルキニル基 n   : 10〜50の整数) 式e 2 ! R,−N”  −CH2CO0 3 (式中R+ :      Ca 〜C20アルキル基
R2およびR3:  c、〜C,アルアルキル基アルケ
ニ ル基アルキニル基) f−−一亜硝酸イオン、キノン体、アロキサン、メチレ
ン青、アニリン、アセトアニリド、ニトロベンゼン、ア
セトフェネチジン、ニトロトルエン、スルフォンアミド
、フェニルヒドラジン、アスコルビン酸、アミンフェノ
ール 1ii)  pHの範囲が3.0〜9.0の溶液である
こと。
iv)  前記四級アンモニウム塩総濃度が、0.1〜
15.0./lの範囲にあること。
V) 前記ピリジニウム塩総濃度が、0.1〜15.0
g/i’の範囲にあること。
vi)  前記酸化剤総濃度が、0.5〜10.0g/
4の範囲にあること。
vii )  前記ノニオン性界面活性剤総濃度が、0
゜1〜15.0./i’の範囲にあること。
vii)’ 前記両性界面活性剤総濃度が、0.1〜1
5.0゜/1の範囲にあること。
ix)  前記カチオン性界面活性剤総濃度が、0.1
〜15.09#の範囲にあること。
上記試薬中の成分aないしfを適宜組合せることにより
、白血球を例えばリンパ球;単球、好酸球、好塩基球;
好中球など2つあるいは3つに分画することもできる。
本発明の試薬の組成例は次のようなものがある。
組成例1 亜硝酸ナトリウム リン酸緩衝剤 塩化ナトリウム 精製水 組成例2 亜硝酸ナトリウム リン酸緩衝剤 塩化ナトリウム 精製水 組成例3 濃度範囲 0.5〜10.0!? 1715〜17608 1.0〜10.0.。
1 濃度範囲 0.5〜10.0゜ 1/15〜1/608 1、O〜io、o。
1 濃度範囲 クロライド(四級アンモニウム塩) 亜硝酸ナトリウム         0.5〜10.0
.。
!J ン酸viWr 剤1/15〜1760M塩化ナト
リウム           1.0〜io、og精製
氷                  11組成例1
〜3は、四級アンモニウム塩で赤血球を溶血し、かつヘ
モグロビンを変性させ、さらに、ヘムの酸化剤として亜
硝酸ナトリウムを加えておくことによってヘモグロビン
の変性を早め、安定化させたものである。
また、組成例2では、ノニオン性界面活性剤を加えるこ
とにより、白血球を2つに分画できるようにしたもので
あり、組成例3では、四級アンモニウム塩を2種類組み
合わせることにより、白血球を2つ以上に分画できるよ
うにしたものである。
特許請求の範囲で記載している四級アンモニウム塩の総
濃度とは、組成例3の場合には、ラウリルトリメチルア
ンモニウムクロライドの濃度とセチルトリメチルアンモ
ニウムクロライドの濃度を加えた0、31〜12.0.
の濃度範囲のことを意味する。
組成例4 濃度範囲 ラウリルトリメチルアンモニウム クロライド 0.5〜io、o。
リン酸緩衝剤 塩化ナトリウム 精製水 組成例5 1/15〜1760M 1.0〜10.0.。
1 濃度範囲 リン酸緩衝剤 塩化ナトリウム 精製水 組成例6 1715〜1760M 1.0〜10.0g 1 濃度範囲 リン酸緩衝剤 塩化ナトリウム 精製水 組成例7 1715〜1/5ON 1.0〜to、oy 1 濃度範囲 ラウリルピリジニウムクロ    0,5〜10.0゜
ライト(ピリジニウム塩) ラウリルジメチルアミノ     0.5〜10.0゜
酢酸ベタイン リン酸緩衝剤          1715〜1/2O
N塩化ナトリウム         1.0〜10.O
f精製水                11組成例
4においては、四級アンモニウム塩と両性界面活性剤と
の組合せ、組成例5においては、四級アンモニウム塩と
ノニオン性界面活性剤との組合せ、組成例6においては
、四級アンモニウム塩とカチオン性界面活性剤との組合
せ、組成例7においては、ピリジニウム塩と両性界面活
性剤との組合せによって、ヘモグロビンを変性し、安定
化させたものである。
なお、各成分の濃度を調整することにより、白血球を2
つ以上の集団に分けることも可能である。
組成例1〜7において、リン酸緩衝剤は液のpHを3.
0〜9.0に調整するためのものであり、好ましいpH
範囲は5.0〜8.0である。pHが3.0以下になる
と、白血球へのダメージが大きくなり白血球測定が困難
となる。また、pHが9.0以上になるとヘモグロビン
の経時安定性が悪くなる。塩化ナトリウムは電気伝導度
を自動血液分析装置にて測定できるレベルに調整するた
めのものである。
特許請求の範囲に示されている各成分の濃度は、他の希
釈液等を必要とせず、試薬の中に血液を加えるだけで測
定できるような状態の時の濃度を示しているが、希釈液
と溶解試薬を一定の比率で混合してヘモグロビンや白血
球を測定するような従来からある装置に使用する場合に
は、装置の混合比率にあわせて、各界面活性剤等の成分
濃度を変えることも可能である。その場合には、特許請
求の範囲に示されている各成分の濃度は、希釈液と溶解
試薬を混合した液における濃度を表す。
[作用] 本発明によると、 i)ヘモグロビンと白血球の測定が1つの試料で可能で
あり、 ii)メトヘモグロビン含量の高い血液試料も正しく測
定でき、 1ii)  Lかも、シアンを含まないので、廃液処理
の煩h Lさのない試薬が提供できる。
さらに、この試薬を自動血液分析装置に用いた場合、ヘ
モグロビン測定用検出部と白血球測定用検出部を別々に
持つ必要はなく、また、流体系も二系列にする必要がな
くなる為、装置が簡単でコストも安くなる。
[実施例] 本発明は、以下の実施例によってより詳しく説明される
が、それらに限定されるものではない。
実施例1 下記組成の試薬を調製した。
濃度 ミリスチルトリメチルアンモニウム  0.7gブロマ
イド 亜硝酸ナトリウム 1.4g (電気伝導度を13付近に調整) 精製水               11第1図に、
従来法[E−4000(東亜医用電子株式会社製)にて
測定コによる白血球数測定結果と実施例1の試薬による
白血球数測定結果との相関図を示す、相関係数r=0.
996、回帰直線y・1.013に−0,673と非常
に高い相関を示している。
第2図に、従来法[オキシヘモグロビン法]によるヘモ
グロビン値測定結果と実施例1の試薬によるヘモグロビ
ン値測定結果との相関図を示す、相関係数r=0.99
9、回帰直線y□1.o04x−0,027と非常に高
い相関を示している。
表1に示すようにメトヘモグロビン量が増えたために、
オキシヘモグロビン法によるヘモグロビン測定値が低下
した場合でも、実施例1の試薬によるヘモグロビン測定
値は変化が見られず一定の値を示す。
なお、表1のオキシヘモグロビン法による初期値と実施
例1の試薬による初期値とに差が見られえるのは、最初
から血中ヘモグロビンの一定量がメトヘモグロビンに転
化しているコントロール血液を使用したためである。
表1 コントロール血液測定結果(オキシヘモグロビン
法v3実施例1) オキシヘモ 実施例1の試薬 グロビン法 による測定 初期値    17゜Oy/l    18.1g#2
2℃、3日保存 16.5g#    18.hp#2
2℃、7日保存  16.Oy/1’    18.h
/4実施例2 下記組成の試薬を調製した。
精製水             11実施例3 下記組成の試薬を調製した。
ラウリルトリメチルアンモニウム  3.2゜クロライ
ド セチルトリメチルアンモニウム   0.29クロライ
ド 亜硝酸ナトリウム         1.4gリン酸M
tll剤           1725M(pH6) 塩化ナトリウム          適量(電気伝導度
を13付近に調整) 精製水              11第3〜5図に
それぞれ実施例1〜3の試薬を使った時の白血球粒度分
布を示す。第3〜5図において、縦軸は血球の相対度数
を表し、横軸は自動血液分析装置によって血球を測定し
たときに得られる血球信号の相対強度(すなわち血球の
大きさ)を表す、実施例1の試薬を用いた場合には、第
3図に示すように白血球は単峰の粒度分布を示す。実施
例2の試薬を用いた場きには、第4図に示すように白血
球は領域Aと領域Bの2つに分かれた粒度分布を示す、
領域Aはリンパ球の集団であり、領域Bはリンパ球以外
の白血球の集団である。実施例3の試薬を用いた場合に
は、第5図に示すように白血球は領域A、領領域と領域
りの3つに分かれた粒度分布を示す、領域Aはリンパ球
の集団、領域Cは単球、好酸球、好塩基球の集団、領域
りは好中球の集団である。
[発明の効果] 以上より、本発明の試薬によれば、従来と同じ測定値が
得られる上に i)ヘモグロビンと白血球が同時に測定でき、しかも白
血球を分画することもできる。
ii)  シアン等の毒物を含まないので、廃液処理の
必要がなくなる。
iii )  メトヘモグロビン含量の高い血液試料も
正しく測定できる。
という効果が奏せられる。
さらに、測定装置が簡単になり、コストが安くなる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、従来法[E−4000(東亜医用電子株式会
社製)にて測定]による白血球数測定結果と実施例1の
試薬による白血球数測定結果との相関を示すグラフであ
り;相関係数r=0.996、回帰直線y・1.013
x−0,673と非常に高い相関を示している。 第2図は、従来法[オキシヘモグロビン法コによるヘモ
グロビン値測定結果と実施例1の試薬によるヘモグロビ
ン値測定結果との相関を示すグラフであり;m間係数r
=0.999、回帰直線y・1.004に−0,027
と非常に高い相関を示している。 第3〜5図はそれぞれ実施例1〜3の試薬を使った時の
白血球粒度分布を示すグラフであり、第3〜5図におい
て、縦軸は血球の相対度数を表し、横軸は自動血液分析
装置によって血球を測定したときに得られる血球信号の
相対強度(すなわち血球の大きさ)を表す、第4図に示
す領域Aはリンパ球の集団であり、領域Bはリンパ球以
外の白血球の集団である。第5図に示す領域Aはリンパ
球の集団、領域Cは単球、好酸球、好塩基球の集団、領
域りは好中球の集団である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、以下の条件を満たす、血液中の白血球の算定および
    ヘモグロビン濃度を測定するための試薬であって、シア
    ンを含まないことを特徴とする試薬。 i)血液中の赤血球を溶血し、ヘモグロビンを変性させ
    うる濃度の四級アンモニウム塩(式a)あるいは、ピリ
    ジニウム塩(式b)の組成物よりなる群の中から選ばれ
    たカチオン系界面活性剤の少なくとも1種類を含むこと
    。 式a ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中R_1:C_8〜C_2_0アルキル基アルケニ
    ル基 又はアルキニル基 R_2、R_3およびR_4:C_1〜C_8アルキル
    基アルケニル基 又はアルキニル基 X^−:陰イオン基) 式b ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中n:7〜19の整数 X^−:陰イオン基) ii)式c〜eのカチオン、ノニオン、両性界面活性剤
    あるいはfに示すようなヘモグロビン中のヘムを酸化さ
    せうる酸化剤よりなる群の中から選ばれた少なくとも1
    種類を含むこと。 式c ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中R_1:C_8〜C_2_0アルキル基アルケニ
    ル基 又はアルキニル基 R_2およびR_3:C_1〜C_8アルキル基アルケ
    ニル基 又はアルキニル基 X^−:陰イオン基) 式d R_1−R_2−(CH_2CH_2O)_n−H(式
    中R_1:C_8〜C_2_0アルキル基アルケニル基 又はアルキニル基 R_2:▲数式、化学式、表等があります▼、又はCO
    O n:10〜50の整数) 式e ▲数式、化学式、表等があります▼ (式中R_1:C_8〜C_2_0アルキル基R_2お
    よびR_3:C_1〜C_8アルキル基アルケニル基 又はアルキニル基) f−−−亜硝酸イオン、キノン体、アロキサン、メチレ
    ン青、アニリン、アセトアニリド、ニトロベンゼン、ア
    セトフェネチジン、ニトロトルエン、スルフォンアミド
    、フェニルヒドラジン、アスコルビン酸、アミノフェノ
    ール iii)pHの範囲が3.0〜9.0の溶液であること
    。 iv)前記四級アンモニウム塩総濃度が、0.1〜15
    .0g/lの範囲にあること。 v)前記ピリジニウム塩総濃度が、0.1〜15.0g
    /lの範囲にあること。 vi)前記酸化剤総濃度が、0.5〜10.0g/lの
    範囲にあること。 vii)前記ノニオン性界面活性剤総濃度が、0.1〜
    15.0g/lの範囲にあること。 viii)前記両性界面活性剤総濃度が、0.1〜15
    .0g/lの範囲にあること。 ix)前記カチオン性界面活性剤総濃度が、0.1〜1
    5.0g/lの範囲にあること。2、四級アンモニウム
    塩よりなる群の中から選ばれた少なくとも2種類を含み
    、その総濃度が0.1〜12.0g/lの範囲にあり、
    f群から選ばれた少なくとも1種類の酸化剤を含み、白
    血球を少なくとも2つに分画することができる請求項1
    の試薬。 3、四級アンモニウム塩よりなる群の中から選ばれた少
    なくとも1種類を含み、その総濃度が0.1〜12.0
    g/lの範囲にあり、ノニオン性界面活性剤よりなる群
    の中から選ばれた少なくとも1種類を含み、ノニオン性
    界面活性剤の総濃度が0.1〜12.0g/lの範囲に
    あり、f群の中から選ばれた少なくとも1種類の酸化剤
    を含み、酸化剤の総濃度が0.5〜10.0g/lの範
    囲にあり、白血球を少なくとも2つに分画できる請求項
    1の試薬。 4、四級アンモニウム塩よりなる群の中から選ばれた少
    なくとも1種類を含み、総濃度が0.1〜12.0g/
    lの範囲にあり、両性界面活性剤よりなる群の中から選
    ばれた少なくとも1種類を含み、両性界面活性剤総濃度
    が、0.1〜12.0g/lの範囲にあり、白血球を少
    なくとも2つに分画することができる請求項1の試薬。 5、四級アンモニウム塩よりなる群の中から選ばれた少
    なくとも1種類を含み、総濃度が1.0〜10.0g/
    lの範囲にあり、ノニオン性界面活性剤よりなる群の中
    から選ばれた少なくとも1種類を含み、ノニオン性界面
    活性剤総濃度が、0.1〜12.0g/lの範囲にあり
    、白血球を少なくとも2つに分画することができる請求
    項1の試薬。 6、四級アンモニウム塩よりなる群の中から選ばれた少
    なくとも1種類を含み、四級アンモニウム塩の総濃度が
    1.0〜12.0g/lの範囲にあり、カチオン性界面
    活性剤よりなる群の中から選ばれた少なくとも1種類を
    含み、カチオン性界面活性剤総濃度が0.1〜5.0g
    /lの範囲にあり、白血球を少なくとも2つに分画する
    ことができる請求項1の試薬。 7、四級アンモニウム塩よりなる群の中から選ばれた少
    なくとも2種類を含み、四級アンモニウム塩の総濃度が
    2.2〜5.0g/lの範囲にあり、f群の中から選ば
    れた少なくとも1種類の酸化剤を含み、酸化剤の総濃度
    が0.5〜10.0g/lの範囲にあり、白血球を3つ
    に分画することができる請求項1の試薬。 8、四級アンモニウム塩よりなる群の中から選ばれた少
    なくとも1種類を含み、四級アンモニウム塩の総濃度が
    1.0〜10.0g/lの範囲にあり、ピリジニウム塩
    よりなる群の中から選ばれた少なくとも1種類を含み、
    ピリジニウム塩の総濃度が1.0〜5.0g/lの範囲
    にあり、白血球を3つに分画することができる請求項1
    の試薬。 9、四級アンモニウム塩よりなる群の中から選ばれた少
    なくとも1種類を含み、四級アンモニウム塩の総濃度が
    3.0〜12.0g/lの範囲にあり、ノニオン性界面
    活性剤よりなる群の中から選ばれた少なくとも1種類を
    含み、ノニオン性界面活性剤総濃度が1.0〜12.0
    g/lの範囲にあり、白血球を3つに分画することがで
    きる請求項1の試薬。10、四級アンモニウム塩よりな
    る群の中から選ばれた少なくとも1種類を含み、四級ア
    ンモニウム塩の総濃度が1.0〜10.0g/lの範囲
    にあり、両性界面活性剤よりなる群の中から選ばれた少
    なくとも1種類を含み、両性界面活性剤総濃度が0.1
    〜10.0g/lの範囲にあり、白血球を3つに分画す
    ることができる請求項1の試薬。
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