JP2003344387A

JP2003344387A - 赤血球溶血剤、白血球分類用試薬および試薬

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Publication number: JP2003344387A
Application number: JP2002149378A
Authority: JP
Inventors: Masami Ito; 正美伊東; Katsuhiro Tsuchiya; 勝寛土屋
Original assignee: Nippon Koden Corp
Current assignee: Nippon Koden Corp
Priority date: 2002-05-23
Filing date: 2002-05-23
Publication date: 2003-12-03
Anticipated expiration: 2022-05-23
Also published as: JP3997538B2

Abstract

(57)【要約】【課題】赤血球から溶出したヘモグロビンを安定化さ
せ、ヘモグロビン量（濃度等）を測定することができる
溶血剤を提供する。また、白血球ヒストグラム上分類で
きる白血球分類用試薬を提供する。【解決手段】赤血球溶血剤としてあるいは白血球分類
用試薬として、それぞれに適した濃度、ｐＨの範囲で第
４級アンモニウム塩とアミノ硫酸とを含有させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液試料中のヘモ
グロビン量（濃度等）の測定の血液試料中の赤血球を溶
血させる溶血剤および白血球を分類するための白血球分
類用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、血液中の血球をその粒径によ
って赤血球、白血球、血小板等に識別して、各血球数を
測定するための自動血球計数器が知られている。粒径が
近いものがある赤血球と白血球を識別するために、溶血
剤を用いて赤血球を溶血させている。赤血球を溶血させ
るとヘモグロビンが溶出するために白血球数とヘモグロ
ビン濃度の測定が可能となる。

【０００３】例えば、特公平３−５８０６７号（アメリ
カ特許第４，３４６，０１８号）では、第４級アンモニ
ウム塩とシアン化合物を含有する試薬が開示されてい
る。第４級アンモニウム塩は赤血球を溶解し白血球ヒス
トグラムを作成するのに有効な成分であり、シアン化合
物はヘモグロビンを安定化させる作用があり安定してヘ
モグロビン濃度を測定するのに有効な成分であることは
よく知られている。

【０００４】しかし、シアンメトヘモグロビン法で用い
られるシアン化合物は、循環器系症状・呼吸器症状等の
中毒症状をもたらす毒性の強い毒物である。したがっ
て、シアン化合物を生産および使用する際の取り扱いに
は十分注意が必要である。また、シアンメトヘモグロビ
ン法による測定後に排出される廃液中のシアン化合物を
無害な化合物に分解する必要がある。そのために、取り
扱い上の問題や、処理コストの問題があった。さらにシ
アン化合物であるので長期保存ができない等保存性の問
題があった。

【０００５】この問題を解決するために、シアン化合物
を含有しない溶血剤が開発されてきている。特表平１１
−５０７７３３号（アメリカ特許第５，６８６，３０８
号）は、血液中の白血球の鑑別式決定のための試薬およ
び方法が開示されている。この試薬はエトキシル化長鎖
アミン化合物とｐＨを調整する酸および高張アルカリ安
定化試薬を含有しているので、ｐＨが２．０〜３．６に
限定され、白血球の膨張を抑制するためのアルカリ安定
化試薬を添加して中和しなければならないという制約が
ある。

【０００６】特許第２８３６８６５号にもシアン化合物
を含有しない試薬が開示されている。ここでは、血液中
の赤血球を溶解し、ヘモグロビンを変成させうる濃度の
第四級アンモニウム塩、ヘモグロビン中のヘムを酸化さ
せうる酸化剤等を含有する試薬が開示されている。しか
しながら、この試薬では、メトヘモグロビンを安定化す
る成分を含まないために、試料作成後、ヘモグロビン値
が経時的に変化するという問題がある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、自然
環境、人体への影響を有する化学物質の抑制を図ること
により、赤血球溶血剤、白血球分類用試薬の生産、使用
における危険性を低減し、効率かつ安全な作業環境を創
造することにある。さらに本発明の目的は、血液試料へ
の試薬添加後、測定中の白血球、ヘモグロビンの経時的
変化を抑制し、白血球数の測定、ヘモグロビン濃度の測
定を安定かつ再現性よく行うことができ、かつ保存性の
よい赤血球溶血剤、白血球分類用試薬を提供することに
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この目的を達成するため
に、血液中の赤血球を溶血させる赤血球溶血剤は、アミ
ド硫酸を含むことを特徴とする（請求項１）。

【０００９】または、血液中の赤血球を溶血させる赤血
球溶血剤は、第４級アンモニウム塩と、アミド硫酸とを
含むことを特徴とする（請求項２）。

【００１０】さらに、第４級アンモニウム塩は、ラウリ
ルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリ
メチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれ
か一方を含むことを特徴とする（請求項３）。

【００１１】さらに、赤血球溶血剤は、希釈液によりｐ
Ｈ１〜７に調整されることを特徴とする（請求項４）。
さらに好適には、赤血球溶血剤は、希釈液によりｐＨ２
〜４に調整されていることを特徴とする（請求項５）。

【００１２】さらに、アミド硫酸は、検査血液１μＬに
対し、０．０２〜２ｍｇの割合で混合する濃度であるこ
とを特徴とする（請求項６）。さらに、好適には、アミ
ド硫酸は、検査血液１μＬに対し、０．１〜１ｍｇの割
合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項
７）。

【００１３】また、白血球を分類するための白血球分類
用試薬は、アミド硫酸を含むことを特徴とする（請求項
８）。

【００１４】または、白血球を分類するための白血球分
類用試薬は、第４級アンモニウム塩とアミド硫酸とを含
むことを特徴とする（請求項９）。

【００１５】さらに、第４級アンモニウム塩は、ラウリ
ルトリメチルアンモニウムクロライドまたはセチルトリ
メチルアンモニウムクロライドのうち少なくともいずれ
か一方を含むことを特徴とする（請求項１０）。

【００１６】さらに、白血球分類用試薬は、希釈液によ
りｐＨ５〜９に調整されることを特徴とする（請求項１
１）。さらに、好適には、白血球分類用試薬は、希釈液
によりｐＨ６〜８に調整されることを特徴とする（請求
項１２）。

【００１７】さらに、アミド硫酸は、検査血液１μＬに
対し、０．０２〜２ｍｇの割合で混合する濃度であるこ
とを特徴とする（請求項１３）。さらに好適には、アミ
ド硫酸は、検査血液１μＬに対し、０．１〜１ｍｇの割
合で混合する濃度であることを特徴とする（請求項１
４）。

【００１８】または、血液中の赤血球を溶血させ、溶血
後のヘモグロビンを安定化させるとともに、白血球を分
類するための試薬において、アミド硫酸を含むことを特
徴とする（請求項１５）。

【００１９】または、血液中の赤血球を溶血させ、溶血
後のヘモグロビンを安定化させるとともに、白血球を分
類するための試薬において、第４級アンモニウム塩と、
アミド硫酸とを含むことを特徴とする（請求項１６）。

【００２０】さらに、その試薬は、希釈液によりｐＨ５
〜７に調整されることを特徴とする（請求項１７）。

【００２１】さらに、その試薬において、アミド硫酸
は、検査血液１μＬに対し、０．０２〜２ｍｇの割合で
混合する濃度であることを特徴とする（請求項１８）。
さらに好適には、アミド硫酸は、検査血液１μＬに対
し、０．１〜１ｍｇの割合で混合する濃度であることを
特徴とする（請求項１９）。

【００２２】

【発明の実施の形態】血液を、塩化ナトリウム等により
血液と等張であるリン酸緩衝液（希釈液）で希釈し、ア
ミド硫酸を含有する試薬Ａ〜Ｌとアミド硫酸を含有しな
い比較例１それぞれに添加した場合の希釈血液に試薬を
混合した後の試薬各成分の検査血液（希釈前血液）１μ
Ｌに対する重量とヘモグロビン吸光変化率の実験データ
を示す。なお、実験は、血液希釈液に試薬を添加して２
０秒から１３０秒まで１０秒おきに吸光度を計測した。
ヘモグロビン吸光度変化率は、添加２０秒後の吸光度を
基準としている。ヘモグロビン吸光度を計測するために
使用した波長は、５４０ｎｍと５５５ｎｍである。ま
た、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドとセチ
ルトリメチルアンモニウムクロライドはいずれも第４級
アンモニウム塩である。

【００２３】また、血液をリン酸緩衝液で希釈し、それ
をアミド硫酸を含有する試薬Ａ〜Ｊ（成分は表示されて
いる）それぞれに添加し、インピーダンス法により測定
した血球サイズによる白血球ヒストグラムの形で得た実
験データを図１に示す。

【００２４】なお、リン酸水素二ナトリウム、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタンは試薬のｐＨを調整
するために添加したものである。このリン酸水素二ナト
リウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの添
加量を変えることにより、リン酸緩衝液による希釈、試
薬添加後のｐＨの値を種々に変え、ｐＨ値に対するヘモ
グロビン吸光度変化率および白血球分類度合いを検討す
る。

【００２５】

【表１】

【００２６】

【表２】

【００２７】

【表３】

【００２８】

【表４】

【００２９】

【表５】

【００３０】

【表６】

【００３１】

【表７】

【００３２】

【表８】

【００３３】

【表９】

【００３４】

【表１０】

【００３５】

【表１１】

【００３６】

【表１２】

【００３７】

【表１３】

【００３８】血液中のヘモグロビン濃度を測定するにあ
たり、計測誤差を最小限にするためには、血液希釈液に
溶血剤を添加した後に測定されるヘモグロビン吸光度の
時間経過による変化が最小限であることが必要である。
そして、ヘモグロビン吸光度の時間経過による変化は、
溶血剤添加後約１３０秒の間で、約±１．０％の範囲で
あることが望ましい。

【００３９】この点、第４級アンモニウム塩は含まれて
いるがアミド硫酸が含まれていない溶血剤である比較例
１の結果は、溶血剤添加後１３０秒の間でのヘモグロビ
ン吸光度は±１．０％を越えている。一方、第４級アン
モニウム塩とアミド硫酸の双方が含まれている試薬Ａ，
Ｂ，Ｋ，Ｌでは、吸光度変化は約±１．０％の範囲であ
り、良好な結果が得られていることがわかる。

【００４０】本願発明者はこのように多くの実験を行っ
た結果、ヘモグロビン吸光度の時間経過による変化が少
ない結果が得られる適切な成分のアミド硫酸の濃度範囲
は０．１〜１０．０重量％である。これは、検査血液１
μＬに対し、アミド硫酸０．０２〜２ｍｇの割合で混合
することになる。さらに、より好適には、アミド硫酸の
濃度範囲は、０．５〜５．０重量％である。これは、検
査血液１μＬに対し、アミド硫酸０．１〜１ｍｇの割合
で混合することになる。このような溶血剤を、塩化ナト
リウム等により血液に等張な希釈液であるリン酸緩衝液
ないしトリス緩衝液により血液を希釈した血液希釈液に
添加すれば安定したヘモグロビン濃度測定を行うことが
できるのである。このとき、リン酸緩衝液希釈後ｐＨ
は、１〜７が適切な範囲であり、より好適にはｐＨ２〜
４が望ましい。

【００４１】各血球サイズによる白血球ヒストグラムに
おいて、横軸の血球サイズに対して縦軸の分布度数が広
く分布している程、白血球の分類が詳細にできることに
なる。そこで、図１の白血球ヒストグラムＡ，Ｂを見れ
ば、横軸の血球サイズが小さく狭い範囲に分布してお
り、白血球分類が困難である。白血球ヒストグラムＪに
おいても、若干分布が小体積側へシフトしており、正確
な分類値を求めることができない。

【００４２】本願発明者はこのようにして多くの実験を
行った結果、白血球ヒストグラム上、分布度数が白血球
分類のために適度に分布するのは、ｐＨが５〜９が適切
な範囲であり、より好適にはｐＨ６〜８が望ましい。

【００４３】さらには、以上から、アミド硫酸と第４級
アンモニウム塩（ラウリルトリメチルアンモニウムクロ
ライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド）を
含有する赤血球溶血剤は、ｐＨ５〜７、アミド硫酸の濃
度を０．１〜１０重量％が適切であり、好適には０．５
〜５．０重量％の範囲で適切に調整することにより、リ
ンパ球、単球、顆粒球に分類でき、白血球分類用試薬と
しても適切な試薬となることがわかる。これは結果とし
て、検査血液１μＬに対し、それぞれ、アミド硫酸０．
０２〜２ｍｇ、より好適には０．１〜１ｍｇの割合で混
合することになる。

【００４４】なお、検査血液は、先にリン酸緩衝液と混
合し次に赤血球溶血剤と混合するようにしてもよい。結
果として検査血液は適切なｐＨ範囲に調整されることに
なる。あるいは検査血液を、リン酸緩衝液により予め希
釈された赤血球溶血剤に混合するようにしてもよい。予
め希釈された赤血球溶血剤であれば、その状態でｐＨが
調整されていることになる。

【００４５】

【発明の効果】以上、詳述したように本発明に係る赤血
球溶血剤によれば、赤血球から溶出したヘモグロビンを
安定化させ、ヘモグロビン量（濃度等）を測定すること
ができる。また、本発明に係る白血球分類用試薬は、白
血球ヒストグラム上白血球を分類できるように可能なら
しめるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施の形態の試薬Ａ〜Ｊによる白血球
分類の実験データを示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G045 AA02 AA07 BB01 BB02 BB41 BB51 CA01 CA02 CA11 DA51 GC10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】血液中の赤血球を溶血させる赤血球溶血
剤において、アミド硫酸を含むことを特徴とする赤血球溶血剤。
【請求項２】血液中の赤血球を溶血させる赤血球溶血
剤において、第４級アンモニウム塩と、アミド硫酸とを含むことを特徴とする赤血球溶血剤。
【請求項３】請求項２に記載の赤血球溶血剤におい
て、前記第４級アンモニウム塩は、ラウリルトリメチルアン
モニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウ
ムクロライドのうち少なくともいずれか一方を含むこと
を特徴とする赤血球溶血剤。
【請求項４】請求項１乃至請求項３のうちいずれか１
つに記載の赤血球溶血剤において、赤血球溶血剤は、希釈液によりｐＨ１〜７に調整される
ことを特徴とする赤血球溶血剤。
【請求項５】請求項１乃至請求項３のうちいずれか１
つに記載の赤血球溶血剤において、赤血球溶血剤は、希釈液によりｐＨ２〜４に調整される
ことを特徴とする赤血球溶血剤。
【請求項６】請求項１乃至請求項５のうちいずれか１
つに記載の赤血球溶血剤において、前記アミド硫酸は、検査血液１μＬに対し、０．０２〜
２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする赤
血球溶血剤。
【請求項７】請求項１乃至請求項５のうちいずれか１
つに記載の赤血球溶血剤において、前記アミド硫酸は、検査血液１μＬに対し、０．１〜１
ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする赤血
球溶血剤。
【請求項８】白血球を分類するための白血球分類用試
薬において、アミド硫酸を含むことを特徴とする白血球分類用試薬。
【請求項９】白血球を分類するための白血球分類用試
薬において、第４級アンモニウム塩と、アミド硫酸とを含むことを特徴とする白血球分類用試
薬。
【請求項１０】請求項９に記載の白血球分類用試薬に
おいて、前記第４級アンモニウム塩は、ラウリルトリメチルアン
モニウムクロライドまたはセチルトリメチルアンモニウ
ムクロライドのうち少なくともいずれか一方を含むこと
を特徴とする白血球分類用試薬。
【請求項１１】請求項８乃至請求項１０のうちいずれ
か１つに記載の白血球分類用試薬において、白血球分類用試薬は、希釈液によりｐＨ５〜９に調整さ
れることを特徴とする白血球分類用試薬。
【請求項１２】請求項８乃至請求項１０のうちいずれ
か１つに記載の白血球分類用試薬において、白血球分類用試薬は、希釈液によりｐＨ６〜８に調整さ
れることを特徴とする白血球分類用試薬。
【請求項１３】請求項８乃至請求項１２のうちいずれ
か１つに記載の白血球分類用試薬において、前記アミド硫酸は、検査血液１μＬに対し、０．０２〜
２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする白
血球分類用試薬。
【請求項１４】請求項８乃至請求項１２のうちいずれ
か１つに記載の白血球分類用試薬において、前記アミド硫酸は、検査血液１μＬに対し、０．１〜１
ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする白血
球分類用試薬。
【請求項１５】血液中の赤血球を溶血させ、溶血後の
ヘモグロビンを安定化させるとともに、白血球を分類す
るための試薬において、アミド硫酸を含むことを特徴とする試薬。
【請求項１６】血液中の赤血球を溶血させ、溶血後の
ヘモグロビンを安定化させるとともに、白血球を分類す
るための試薬において、第４級アンモニウム塩と、アミド硫酸とを含むことを特徴とする試薬。
【請求項１７】請求項１５または請求項１６に記載の
試薬において、前記試薬は、希釈液によりｐＨ５〜７に調整されること
を特徴とする白血球分類用試薬。
【請求項１８】請求項１５乃至請求項１７のうちいず
れか１つに記載の試薬において、前記アミド硫酸は、検査血液１μＬに対し、０．０２〜
２ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする試
薬。
【請求項１９】請求項１５乃至請求項１７のうちいず
れか１つに記載の試薬において、前記アミド硫酸は、検査血液１μＬに対し、０．１〜１
ｍｇの割合で混合する濃度であることを特徴とする試
薬。